Способ получения молочной кислоты

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения молочной кислоты предусматривает внесение бактерий рода Lactobacillus в питательную среду, содержащую рассиропную, отстерилизованную свекловичную мелассу, сточные воды, предварительно очищенные с помощью биомассы Chlorella vulgaris при заданных соотношениях компонентов, и культивирование молочнокислых бактерий в течение 24-35 часов, при температуре 37-50°С, начальном уровне рН 6,5-7,5, при перемешивании 50-80 об/мин, аэрации суспензии на стадии накопительного культивирования газовоздушной смесью 60-80 л/ч с последующим обеспечением анаэробных условий в течение 24-35 ч. Причем в питательной среде используют сточные воды, очищенные до содержания внеклеточных метаболитов, моль/л: водорастворимые витамины В2, В12 - 10^-4-10^-7, растворимые полисахариды (галактоза, арабиноза, галактоза, ксилоза) - 10^-4-10^-6, свободные жирные кислоты (стеариновая, олеиновая, линолевая, линоленовая) - 10^-5-10^-7, полипептиды, свободные аминокислоты - 10^-5-10^-6, вещества фенольной природы (флавоноиды) - 10^-6-10^-7, фитогормон: индолил-3-уксусная кислота - 10^-5-10^-6. Изобретение позволяет повысить выход молочной кислоты. 1 ил., 5 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологических процессов и производств, в частности, к способам культивирования биомассы бактерий.

Известен способ культивирования молочнокислых бактерий на основе штамма ((Lactobacillus delbrueckii В-8744» (Патент на изобретение РФ №2283345, МПК С12Р 7/56, C12N 1/20, 2006 г). Способ предусматривает использование питательных сред с органическими формами азота (дрожжевой экстракт, пептон, пшеничные зародыши), в качестве источников углерода используются сусло, солодовые ростки, сахар. Питательная среда настаивается 1 ч при температуре 50°С, после чего вносится двухсуточная культура молочнокислых бактерий. Колбы термостатируются при 50°С, их содержимое периодически перемешивается. Способ обеспечивает выход лактата кальция 146,0 г/л после 50 ч брожения, что соответствует общей продуктивности процесса 2,92 г/(л⋅ч) и выходу молочной кислоты 93,9%.

Недостатком данного способа является относительно невысокий выход молочной кислоты, а также то, что при его реализации требуется использование в качестве источников азота и углерода дорогостоящих органических веществ.

.

Известен способ получения молочной кислоты (Патент на изобретение №1243354 РФ, МПК С12Р 7/56, 2002 год), предусматривающий выращивание продуцирующего ее штамма бактерий Lactobacillus delbriickii в сахаросодержащей питательной среде до максимального накопления целевого продукта, нейтрализацию сброженного раствора карбонатом кальция при нагревании, последующую очистку и выделение. С целью ускорения процесса очистки и улучшения качества продукта, в сброженный раствор после нейтрализации карбонатом кальция дополнительно вводят активную кремневую кислоту в количестве 60-80 мг/л и уделяют образовавшийся осадок в поле центробежных сил при факторе разделения 3500-4500, а надосадочную жидкость перед выделением целевого продукта подвергают омагничиванию в поле с магнитной индукцией 0,01-0,15 Тл. Способ обеспечивает выход лактата кальция 146,0 г/л после 50 ч брожения, что соответствует общей продуктивности процесса 2,92 г/(л⋅ч) и выходу молочной кислоты 93,9%.

Недостатком данного способа также является относительно невысокий выход молочной кислоты и использование дорогостоящих компонентов питательной среды (источники углерода и азота).

Известен способ получения молочной кислоты (Патент на изобретение №2306340 РФ, МПК С12Р 7/56, C12N 1/20, 2007 год), предусматривающий сбраживание сахарсодержащей питательной среды молочнокислыми бактериями Lactobacillus delbrueckii в присутствии обработанных молочной кислотой солодовых ростков и нейтрализацию образующейся молочной кислоты мелом, причем в питательную среду дополнительно вводят мел в количестве 60% от общего количества мела, рассчитанного для нейтрализации молочной кислоты, дрожжевой экстракт и питательные соли (сульфаты магния, марганца и железа, цитрат аммония, одно- и двухзамещенные фосфаты калия). Обработку солодовых ростков в количестве 12-15 г/л проводят водой, подкисленной молочной кислотой до рН 4,0-5,0 и ферментным препаратом ксилоглюканофоетидином в количестве, соответствующем 200-600 ед./л ксиланазной активности, в качестве молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii используют штамм Lactobacillus delbrueckii ВКПМ В-8744 в возрасте 48-72 ч, а для нейтрализации образующейся молочной кислоты через 24 ч от начала процесса брожения вносят оставшиеся 40% мела. Продуктивность процесса составляет 2,96 г/(л⋅ч) лактата кальция. Выход молочной кислоты на стадии брожения от исходного сахара составляет 94,6%.

Недостатком данного способа также является относительно невысокий выход молочной кислоты и использование дорогостоящих компонентов питательной среды (источник азота - солодовые ростки, сульфаты магния, марганца и железа, цитрат аммония, одно- и двухзамещенные фосфаты калия).

Наиболее близким к предлагаемому решению является способ получения молочной кислоты (Патент на изобретение №2177036 РФ, МПК С12Р 7/56, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:225, C12R 1:46, 2001 год). Данный способ получения молочной кислоты из городских твердых отходов, предусматривает ферментацию молочнокислых бактерий, причем, сначала из городских твердых отходов удаляют шины, крупные части черных и цветных металлов, пластмассы и стекла и получают целлюлозный компонент, который затем измельчают и обрабатывают его разбавленной серной кислотой при 40-100°С, растворяя тем самым оставшиеся тяжелые металлы и получая растворимый и нерастворимый компоненты. После этого отделяют растворимый компонент от нерастворимого компонента, затем высушивают полученный нерастворимый компонент, обрабатывают его при массовом соотношении "концентрированная серная кислота : нерастворимый компонент" - 1:1 и получают частично гидролизованную смесь. Далее разбавляют полученную частично гидролизованную смесь водой при 80-100°С, после этого перемешивают полученную разбавленную смесь при 100°С и получают разложившийся материал. Затем удаляют твердые вещества из полученного разложившегося материала и получают фильтрат, разделяют фильтрат на раствор, содержащий кислоту, и раствор, содержащий сахар, потом концентрируют раствор, содержащий сахар, до 1-20% концентрации сахара, доводят рН полученного концентрированного раствора, содержащего сахар, до 4,5-7,5, после чего ферментируют полученный раствор молочнокислыми бактериями и получают раствор, содержащий молочную кислоту.

Недостатком данного способа является необходимость предварительной многостадийной обработки сырья для получения достаточного выхода молочной кислоты, что приводит к усложнению технологического процесса и его удорожанию.

Задачей изобретения является получение культуральной жидкости с повышенным содержанием молочной кислоты.

Решение технической задачи достигается за счет создания стрессовых условий культивирования молочнокислых бактерий рода Lactobacillus на предварительно обеззараженных сточных водах, содержащих комплекс внеклеточных метаболитов.

Между отличительными признаками и достигаемым техническим результатом существует следующая причинно - следственная связь.

Технический результат достигается тем, что создание стрессовых условий обеспечивается анаэробными условиями культивирования молочнокислых бактерий, а накопление комплекса внеклеточных метаболитов в питательной среде обеспечивается при обеззараживании загрязненных сточных вод путем культивирования на них микроводорослей вида Chlorella vulgaris.

Муниципальные сточные воды, поступающие с городских очистных сооружений и содержащие азот в виде катионов аммония 30-60 мг/л, фосфор в виде фосфат-анионов в концентрации 10-40 мг/л, нефтепродукты в концентрации 1-3 мг/л, катионы цинка - 0,01-0,09 мг/л, меди - 0,01-0,2 мг/л, общее микробное число: 5-20 млн кл/мл, очищаются и обеззараживаются с применением микроводорослей вида Chlorella vulgaris и используются в качестве основы питательной среды для культивирования. После обеззараживания состав вод становится следующим: азот в виде катионов аммония 1,5 мг/л, фосфор в виде фосфат-анионов в концентрации 3,5 мг/л, нефтепродукты в концентрации 0,01 мг/л, катионы цинка - 0,001-0,009 мг/л, меди - 0,001-0,02 мг/л, общее микробное число: 0,3 млн кл/мл.

Культивирование молочнокислых бактерий для биосинтеза молочной кислоты заключается в создании благоприятных условий в обеззараженных муниципальных сточных водах: температуры 37-50°С, начального уровня рН 6,5-7,5, интенсивности перемешивания 50-80 оборотов в минуту, интенсивности аэрации суспензии микроводорослей Chlorella vulgaris на стадии накопительного культивирования газовоздушной смесью 60-80 л/ч, подачей посевного материала - молочнокислых бактерий рода Lactobacillus в количестве 10% об. по отношению к питательной среде. При этом последовательно осуществляются стадии культивирования биомассы клеток молочнокислых бактерий на предварительно обеззараженных сточных водах, содержащих комплекс внеклеточных метаболитов при аэрации суспензии и создания стрессовых условий для стимулирования накопления молочной кислоты.

Длительность последовательных стадий культивирования прироста биомассы и создания стрессовых условий составляют 24-35 часов каждая.

В подаваемой питательной среде (табл. 1) присутствуют очищенные с помощью микроводорослей от химических и биологических контаминантов сточные воды, содержащие в своем составе внеклеточные метаболиты: водорастворимые витамины (В₂, В₁₂), растворимые полисахариды (галактоза, арабиноза, ксилоза) свободные жирные кислоты (стеариновая, олеиновая, линолевая, линоленовая), и полипептиды, аминокислоты, вещества фенольной природы (флавоноиды), фитогормон - индолил-3-уксусная кислота (табл. 2).

В качестве посевного материала для биосинтеза молочной кислоты используются бактерии рода Lactobacillus (штамм Lactobacillus delbrueckii L-3) Lactobacillus delbrueckii L-20, Lactobacillus delbrueckii B-8744, приведенные в табл. 3-5 и на рис. 2-4.

Культивирование молочнокислых бактерий осуществляется на питательной среде (содержание редуцирующих сахаров 5%), основой которой является очищенная микроводорослями рода Chlorella vulgaris сточная вода, при аэрации газовоздушной смесью в течение 24-35 часов. Это позволяет обеспечить максимальный прирост биомассы за счет активного поглощения бактериями редуцирующих сахаров, присутствующих в питательной среде и достижение максимально возможной концентрации бактерий в суспензии. Создание стрессовых условий в течение последующих 24-35 часов активирует процесс молочнокислого брожения и позволяет обеспечить накопление максимального количества молочной кислоты.

Использование в качестве посевного материала молочнокислых бактерий рода Lactobacillus и питательной среды приведенного в табл. 1 состава при наличии метаболитов, приведенных в табл. 2, позволяет обеспечить продуктивность по молочной кислоте до 3,45 г/(л⋅ч).

Подтверждением эффективности предлагаемого метода являются результаты культивирования, приведенные в табл. 3. и на рис. 1.

Рисунок 1 - кинетика накопления молочнокислых бактерий рода Lactobacillus

Полученные данные позволяют заключить, что предлагаемый способ культивирования молочнокислых бактерий позволяет получить культуральную жидкость с повышенным содержанием молочной кислоты.

Способ получения молочной кислоты, предусматривающий внесение молочнокислых бактерий рода Lactobacillus в питательную среду, содержащую в г/л: рассиропную, отстерилизованную свекловичную мелассу - 600, сточные воды, предварительно очищенные с помощью биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris в течение 4-7 суток - 200 и дистиллированную воду - 200; культивирование молочнокислых бактерий в течение 24-35 часов при температуре 37-50°С, начальном уровне рН 6,5-7,5, интенсивности перемешивания 50-80 об/мин, аэрации на стадии накопительного культивирования газовоздушной смесью 60-80 л/ч с последующим обеспечением анаэробных условий в течение 24-35 часов, при этом в питательной среде используют сточные воды, очищенные до содержания внеклеточных метаболитов, моль/л: водорастворимые витамины В2, В12 - 10^-4-10^-7, галактоза, арабиноза, ксилоза - 10^-4-10^-6, жирные кислоты - стеариновая, олеиновая, линолевая, линоленовая - 10^-5- 10^-7, полипептиды, свободные аминокислоты - 10^-5-10^-6, вещества фенольной природы - флавоноиды - 10^-6-10^-7, индолил-3-уксусная кислота - 10^-5-10^-6.