Способ измерения концентрации мономерного с-реактивного белка на поверхности форменных элементов крови

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для измерения концентрации мономерного С-реактивного белка на поверхности форменных элементов крови. Для этого применяют метод цитофлоуриметрии. Используют два антитела к С-реактивному белку, одно из которых реагирует с эпитопами, представленными только на нативном С-реактивном белке. Второе реагирует как с эпитопами, представленными на нативном, так и на мономерном С-реактивном белках. При этом каждое антитело конъюгируется с отдельным цитофлуорохромом. Сигналы, получаемые от каждого цитофлуорохрома, регистрируются на отдельных каналах одновременно. Регистрируют сигнал от цитофлуорохрома, конъюгированного с селективным антителом к нативному С-реактивному белку. Регистрируют сигнал от цитофлуорохромов обоих антител. Регистрируют сигнал от цитофлуорохрома, конъюгированного с перекрестным антителом к нативному и мономерному С-реактивному белку. На основании полученных данных вычисляют концентрацию мономерного С-реактивного белка. Изобретение обеспечивает повышение эффективности и чувствительности способа измерения концентрации мономерного С-реактивного белка у пациентов. 2 пр.

 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к способу измерения концентрации мономерного С-реактивного белка (СРБ) на поверхности форменных элементов крови, их микрочастиц и микровезикул, и может быть использовано для измерения концентраций мономерного С-реактивного белка у пациентов с острыми и хроническими воспалительными заболеваниями, заболеваниями сердечно-сосудистой системы, онкологическими заболеваниями и иными заболеваниями, при которых наблюдается повышение концетрации С-реактивного белка в крови.

Белки группы пентраксинов синтезируются в печени человека под действием интерлейкина-6, выделяемого моноцитами в ответ на воспалительную активацию. Пентраксины являются белками острой фазы воспаления. У человека основным пентраксином является С-реактивный белок. В плазме крови здорового человека его концентрация составляет 0.062-8.2 мг/л, период полувыведения 15 часов. Многократное повышение его концентрации, в сотни и тысячи раз, наблюдается при всех видах воспалительных заболеваний, с пиковым повышением концентрации в течение 48 часов после начала заболевания. При воспалении диагностически значимым считается повышение концентрации выше 8 мг/л. Повышение концентрации выше пороговой нормы, однако менее выраженное, чем при остром течении заболевания, наблюдается при хронических воспалительных заболеваниях. Доказано, что С-реактивный белок является маркером повышенного риска неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, в первую очередь с различными формами атеросклеротического поражения сосудов. Повышение концентрации С-реактивного белка выше пороговой нормы характерного для онкологических заболеваний, хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта, таких как язвенные болезни, болезнь Крона, и некоторых других заболеваний, при которых происходит активация иммунного ответа.

В организме человека С-реактивный белок представлен в двух формах. Нативный С-реактивный белок, непросредственно секретируемый печенью в кровоток, является пентамером, состоящим из 5 одинаковых субъединиц массой 23 кДа. Нативный С-реактивный белок инертен, не обладает выраженными провоспалительными свойствами, хорошо растворим в плазме крови. В области локального воспаления при контакте с активированными моноцитами, лейкоцитами, тромбоцитами, а также их микрочастицами и микровезикулами, нативный С-реактивный белок связывается с фосфатидилхолином мембран активированных клеток, их микрочастиц и микровезикул, и проходит диссоциацию на 5 отдельных субъединиц, являющихся мономерным С-реактивным белком. Мономерный С-реактивный белок нерастворим в плазме крови и остается связанным с мембранами воспалительно активированных клеток, их микрочастиц и микровезикул. Мономерный С-реактивный белок обладает выраженными провоспалительными свойствами, в частности, способностью активировать тромбоциты, лейкоциты, моноциты при контакте с ними, вызывать выброс провоспалительных цитокинов и отрицательно заряженных микрочастиц. Мономерный С-реактивный белок откладывается в стенке сосудов в месте локального воспаления, в некротическом ядре атеросклеротических бляшек, с преимущественной локализацией в местах скопления макрофагов и неоваскуляризации. Мономерный С-реактивный белок откладывается в бета-амилоидных бляшках у пациентов с болезнью Альцгеймера.

Известен способ исследования крови на С-реактивный белок с использованием антител.

(Патент CN106699884A, С07K 16/18. опубл. 24.05.2017 г.)

Недостаток данного способа заключается в том, что они используют два антитела, одно высокочувствительное, другое высокоспецифичное к СРБ, не разделяя его на мономер и нативный белок. Далее смотрят с помощью высокочувствительного антитела, есть ли вообще белок в пробе. Поскольку высокочувствительное антитело способно реагировать перекрестно с другими белками, добавляется еще то, которое реагирует только с СРБ, но не с другими белками, но оно менее чувствительно, чем первое.

Рутинное измерение концентрации С-реактивного белка в клинических лабораторных условиях проводится с помощью антител к С-реактивному белку методом иммуноферментного анализа, нефелометрии, турбидиметрии или цитофлоуриметрии. Поскольку растворенный в плазме крови С-реактивный белок вследствие малого размера невозможно зарегистрировать методами, основанными на интенсивности света, прошедшего через суспензию, образованную исследуемым материалом, а к таковым методам относятся все методы измерения С-реактивного белка, применяются латексные микрочастицы, имеющие достаточный размер для регистрации с помощью упомянутых методов. Применяемые латексные микрочастицы покрыты антителами к С-реактивному белку, что позволяет связывать растворенный в плазме крови белок. Для подтверждения наличия связывания С-реактивного белка с латексными микрочастицами применяются антитела, конъюгированные с цитофлуорохромом, которые связываются с уже находящимся на поверхности латексных микрочастиц С-реактивным белком. В результате этого так называемого «сендвич-метода» образуется трехслойная структура, с одной стороны которой находится латексная микрочастица, с другой стороны антитело, конъюгированное с цитофлуорохромом, а в центре располагается исследуемая молекула С-реактивного белка.

(Медицинские лабораторные технологии. Рук-во по клинической лабораторной диагностике, под ред. А.И. Карпищенко, т.2, М., изд. Гр. «Гэотар-Медиа», 2013, с. 71)

Однако, все известные в настоящее время антитела к С-реактивному белку обладают либо селективной реактивностью к эпитопам нативного С-реактивного белка, представленными только тогда, когда белок находится в кровотоке в виде 5 соединенных субъединиц, либо перекрестной реактивностью к эпитопам как нативного С-реактивного белка, так и к эпитопам мономерного С-реактивного белка, открывающимся только после процесса диссоциации нативного С-реактивного белка. В настоящее время отсутствуют антитела, имеющие селективную реактивность к эпитопам мономерного С-реактивного белка.

Задачей изобретения является создание эффективного и высокочувствительного способа измерения концентрации мономерного С-реактивного белка на поверхности форменных элементов крови для дальнейшего использования в клинической практике в ранней диагностике широкого спектра воспалительных процессов, мониторинга эффективности терапии различных заболеваний и оценки рисков сосудистых патологий.

Технический результат заключается в повышении эффективности и чувствительности способа.

Это достигается тем, что в заявляемом способе измерения концентрации мономерного С-реактивного белка на поверхности форменных элементов крови с использованием антител методом цитофлоуриметрии, согласно изобретению, используют два антитела к С-реактивному белку, одно из которых реагирует с эпитопами, представленными только на нативном С-реактивном белке, обеспечивая его селективность по отношению к нативному С-реактивному белку, а второе реагирует как с эпитопами, представленными на нативном С-реактивном белке, так и на мономерном С-реактивном белке, обеспечивая его перекрестную реактивность по отношению к нативному и мономерному С-реактивным белкам, при этом каждое антитело конъюгируется с отдельным цитофлуорохромом, а сигналы, получаемые от каждого цитофлуорохрома, регистрируются на отдельных каналах, каждый из которых соответствует определенному цитофлуорохрому, чем достигается различение конъюгированных с цитофлуорохромами антител, при этом регистрация сигнала на всех каналах цитофлуориметра происходит одновременно, в результате чего регистрируют три группы событий: 1 - события, соответствующие сигналу от цитофлуорохрома, конъюгированного с селективным антителом к нативному С-реактиному белку; 2 - события, имеющие сигнал от цитофлуорохромов обоих антител, относятся к нативному С-реактивному белку; 3 - события, соответствующие сигналу от цитофлуорохрома, конъюгированного с перекрестным антителом к нативному и мономерному С-реактивному белку, но не имеющие сигнала в области, соответствующей сигналу от цитофлуорохрома селективного антитела к С-реактивному белку, относятся к мономерному С-реактивному белку. Осуществление способа.

Измерение концентрации мономерного С-реактивного белка на поверхности форменных элементов крови, их микрочастиц и микровезукул возможно с использованием двух антител к С-реактивному белку, что является предметом настоящего изобретения. Для исследования необходим высокоточный проточный цитофлуориметр, способный регистрировать изменение интенсивности света, проходящего через суспензию, содержащую микрочастицы и микровезикулы размером от 100-150 мкм. Поскольку мономерный С-реактивный белок находится в кровотоке только связанным с мембранами клеток, микрочастиц и микровезикул и не обладает способностью к растворению в плазме крови, постольку применения латексных микрочастиц для выполнения проточной цитофлоуриметрии не требуется.

С целью регистрации мономерного С-реактивного белка в одной исследуемой пробе применяется два антитела:

1) антитело с селективной реактивностью к нативному С-реактивному белку, имеющему пентамерную структуру; при этом эпитоп, с которым связывается селективное антитело, присутствует только при наличии четвертичной (нативной) пентамерной структуры белка; с помощью этого антитела возможно вывить только нативный С-реактивный белок, поскольку любые изменения в структуре белка лишат белок присутствовавшего на нем эпитопа;

2) антитело с перекрестной реактивностью к эпитопу нативного С-реактивного белка и к эпитопу, представленному непосредственно на мономерных субъединицах С-реактивного белка; это антитело связывается как с нативным белком, так и с измененным мономерным С-реактивным белком; применение этого антитела не позволяет различить нативный С-реактивный белок и мономерный С-реактивный белок.

Для выполнения проточной цйтофлоуриметрии каждое из антител конъюгируется с отдельным цитофлуорохромом. Применяя два антитела одновременно, возможно выделить три группы событий, зарегистрированных проточным цитофлуориметром: 1) группа событий, в которой регистрируется сигнал цитофлуорохрома, конъюгированного с селективным антителом к нативному С-реактивному белку, но отсутствует сигнал цитофлуорохрома, конъюгированного с антителом с перекрестной реактивностью к нативному и мономерному С-реактивному белку; 2) группа событий, в которой регистрируется сигнал обоих цитофлуорохромов, как конъюгированного с селективным антителом к нативному С-реактивному белку, так и конъюгированного с антителом с перекрестной реактивностью к нативному и мономерному С-реактивному белку; 3) группа событий, в которой регистрируется сигнал цитофлуорохрома, конъюгированного с антителом с перекрестной реактивностью к нативному и мономерному С-реактивному белку, но отсутствует сигнал цитофлуорохрома, конъюгированного с антителом с селективной реактивностью к нативному С-реактивному белку. В последней группе событий регистрация сигнала от антитела, которое связывает как нативный, так и мономерный С-реактивный белок, говорит о вероятном наличии обоих форм белка. Однако отсутствие сигнала от антитела, селективно связывающего нативный С-реактивный белок, говорит об отсутствии нативного С-реактивного белка в этой группе.

Таким образом, с помощью двух антител исключается наличие нативного С-реактивного белка и подтверждается наличие мономерного С-реактивного белка.

Примеры применения заявляемого способа в клинической практике.

1. Больной К. обратился с жалобами на кашель в утренние часы. При рентгенографии органов грудной клетки значимых отклонений от нормы не выявлено. С целью уточнения воспалительного характера состояния пациента, выполнено исследование высокочувствительного С-реактивного белка, давшее отрицательный результат. Поскольку исследование мономерного С-реактивного белка обладает более высокой точностью, выполнено измерение концентрации мономерного С-реактивного белка на поверхности форменных элементов крови, их микрочастиц и микровезукул с использованием селективного антитела к нативному С-реактивному белку и антитела с перекрестной реактивностью к нативному и мономерному С-реактивному белку. Выявлено повышение концентрации мономерного С-реактивного белка, что свидетельствует о слабо протекающем воспалительном процессе. Таким образом, у пациента необходимо исключить обострение хронической болезни легких.

2. Больная Д. поступила в стационар с жалобами на давящие боли за грудиной при физической нагрузке. При коронароангиографии выявлено атеросклеротическое поражение коронарных артерий, не подходящее по своей выраженности для ангиопластики со стентированием. Пациентке рекомендована медикаментозная терапия, в том числе коррекция профиля липидов с помощью статинов. С помощью рекомендованной для пациентки дозы статинов удалось достигнуть снижения концентрации липидов в крови до целевых значений. Для решения вопроса о необходимости дальнейшего усиления терапии статинами, что снижает риски осложнений сердечно-сосудистых заболеваний, но повышает риски развития побочных эффектов от приема препарата, с целью оценки возможных рисков осложнений сердечно-сосудистого заболевания, выполнено исследование высокочувствительного С-реактивного белка, давшее отрицательный результат. Поскольку исследование мономерного С-реактивного белка обладает более высокой точностью, выполнено измерение концентрации мономерного С-реактивного белка на поверхности форменных элементов крови, их микрочастиц и микровезукул с использованием селективного антитела к нативному С-реактивному белку и антитела с перекрестной реактивностью к нативному и мономерному С-реактивному белку. Выявлена нормальная концентрация мономерного С-реактивного белка, что свидетельствует о низком риске осложнений сердечно-сосудистого заболевания, в связи с чем пациентке оставлена прежняя доза препарата, от усиления терапии статинами решено воздержаться.

Таким образом, учитывая то, что именно мономерная форма С-реактивного белка вовлечена в развитие воспалительного ответа, измерение мономерной формы С-реактивного белка позволит обеспечить дальнейшее повышение точности и эффективности диагностического метода. Применение предложенного способа позволяет, используя уже доступные антитела к С-реактивному белку и измерительные приборы, которые применяются в условиях клинических диагностических лабораторий, решить проблему измерения мономерной формы С-реактивного белка, которая ранее оставалось нерешенной.

Способ измерения концентрации мономерного С-реактивного белка на поверхности форменных элементов крови с использованием антител методом цитофлоуриметрии, отличающийся тем, что используют два антитела к С-реактивному белку, одно из которых реагирует с эпитопами, представленными только на нативном С-реактивном белке, чем обеспечивается его селективность по отношению к нативному С-реактивному белку, а второе реагирует как с эпитопами, представленными на нативном С-реактивном белке, так и на мономерном С-реактивном белке, чем обеспечивается его перекрестная реактивность по отношению к нативному и мономерному С-реактивным белкам, при этом каждое антитело конъюгируется с отдельным цитофлуорохромом, а сигналы, получаемые от каждого цитофлуорохрома, регистрируются на отдельных каналах, каждый из которых соответствует определенному цитофлуорохрому, чем достигается различение конъюгированных с цитофлуорохромами антител, при этом регистрация сигнала на всех каналах цитофлуориметра происходит одновременно, и в результате определяют три группы событий: 1 - события, соответствующие сигналу от цитофлуорохрома, конъюгированного с селективным антителом к нативному С-реактивному белку; 2 - события, имеющие сигнал от цитофлуорохромов обоих антител; 3 - события, соответствующие сигналу от цитофлуорохрома, конъюгированного с перекрестным антителом к нативному и мономерному С-реактивному белку, но не имеющие сигнала в области, соответствующей сигналу от цитофлуорохрома селективного антитела к С-реактивному белку, относятся к мономерному С-реактивному белку.