Детерминанты ответа раковой опухоли на иммунотерапию

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны молекулярные детерминанты ответа раковой опухоли на иммунотерапию, а также системы и инструменты для идентификации и/или характеристики раковых опухолей, склонных отвечать на иммунотерапию. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 80 ил., 5 табл., 5 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[1] В данной заявке заявлен приоритет по каждой из: предварительной заявки на патент США, серийный номер 61/923183, поданной 2 января 2014 года, предварительной заявки на патент США, серийный номер 62/066034, поданной 20 октября 2014 года, предварительной заявки на патент США, серийный номер 62/072893, поданной 30 октября 2014 года, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[2] Иммунотерапия рака предполагает воздействие на раковые клетки иммунной системой пациента. Регулирование и активация Т-лимфоцитов зависит от передачи сигналов с помощью Т-клеточного рецептора, а также сигнальных рецепторов, которые обеспечивают положительные или отрицательные сигналы для активации. Иммунные ответы, генерируемые Т-клетками, контролируются уравновешиванием костимулирующих и ингибирующих сигналов, называемых иммунными контрольными точками.

[3] Иммунотерапия с применением ингибиторов иммунных контрольных точек является революционным прорывом в лечении рака. Например, у некоторых пациентов с меланомой при наличии метастазов появилась замечательная возможность долгосрочного контроля за заболеванием с помощью антител анти-CTLA4 и анти-PD1.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[4] Настоящее изобретение содержит открытие того факта, что вероятность положительного ответа на иммунотерапию рака можно спрогнозировать. Настоящее изобретение дополнительно включает открытие, которое заключается в том, что раковые клетки могут иметь скрытые соматические мутации, приводящие к образованию неоэпитопов, которые распознаются иммунной системой пациента как чужеродные. Идентификация одного или более неоэпитопов в раковом образце пригодна для выявления пациентов с раком, которые могут положительно отвечать на иммунотерапию, в частности, лечение модулятором иммунной контрольной точки.

[5] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы выявления субъекта, который может отвечать на лечение модулятором иммунной контрольной точки.

[6] В некоторых вариантах реализации изобретения способы включают этапы обнаружения соматической мутации в раковом образце от субъекта и определение субъекта как кандидата на лечение модулятором иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект определяется как таковой, который может положительно отвечать на лечение модулятором иммунной контрольной точки.

[7] В некоторых вариантах реализации изобретения обнаружение соматической мутации включает секвенирование одного или более экзомов из ракового образца. В некоторых вариантах реализации изобретения соматическая мутация включает неоэпитоп, распознаваемый Т-клеткой.

[8] В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитоп обладает большей аффинностью связывания с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) по сравнению с соответствующим эпитопом, который не имеет мутации.

[9] В некоторых вариантах реализации изобретения соматическая мутация включает неоэпитоп, содержащий тетрамер, который не экспрессируется в том же типе клеток, не имеющих соматической мутации.

[10] В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитоп имеет общую консенсусную последовательность с инфекционным агентом. В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитоп имеет общую консенсусную последовательность с бактерией. В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитоп имеет общую консенсусную последовательность с вирусом.

[11] В некоторых вариантах реализации изобретения соматическая мутация включает неоэпитоп, содержащий тетрамер согласно Таблице 1.

[12] В некоторых вариантах реализации изобретения раковый образец представляет собой или содержит меланому.

[13] В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки взаимодействует с одним или более из следующих элементов: цитотоксическим Т-лимфоцитарным антигеном 4 (CTLA4), программирующим гибель 1 (PD-1) или его лигандами, геном активации лимфоцитов-3 (LAG3), В7-гомологом 3 (В7-Н3), В7-гомологом 4 (В7-Н4), индоламин (2,3)-диоксигеназой (IDO), аденозиновым рецептором А2а, неуритином, аттенюатором В- и Т-лимфоцита (BTLA), иммуноглобулиноподобным рецептором-киллером (KIR), Т-клеточным иммуноглобулином и содержащим муциновый домен белком 3 (TIM-3), индуцируемым Т-клеточным костимулятором (ICOS), CD27, CD28, CD40, CD137 или их комбинациями.

[14] В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки представляет собой или содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки представляет собой ипилумимаб. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки представляет собой или содержит тремелимумаб. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки представляет собой или содержит ниволумаб. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки представляет собой или содержит ламбролизумаб. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки представляет собой или содержит пембролизумаб.

[15] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы выявления субъекта, который может отвечать на лечение модулятором иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы выявления субъекта, который может отвечать на лечение модулятором иммунной контрольной точки, при этом субъект ранее не получал иммунотерапию против рака.

[16] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы для обнаружения соматической мутации в раковом образце от субъекта и определения субъекта как несоответствующего кандидата для лечения модулятором иммунной контрольной точки.

[17] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы выявления субъекта, у которого может развиваться одно или более аутоиммунных осложнений при лечении модулятором иммунной контрольной точки.

[18] В некоторых вариантах реализации изобретения аутоиммунное осложнение представляет собой или включает энтероколит, гепатит, дерматит (в том числе токсический эпидермальный некролиз), нейропатию и/или эндокринопатию.

В некоторых вариантах реализации изобретения аутоиммунное осложнение представляет собой или включает гипотериоз.

[19] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы

определения того, имеет ли субъект рак, содержащий соматическую мутацию, причем такую соматическую мутацию, которая включает неоэпитоп, содержащий тетрамер согласно Таблице 1, и выбора лечения рака для субъекта с применением модулятора иммунной контрольной точки.

[20] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы лечения субъекта модулятором иммунной контрольной точки, причем у субъекта ранее был диагностирован рак с одной или более соматическими мутациями, при этом одна или более соматических мутаций содержат неоэпитоп, распознаваемый Т-клеткой.

[21] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы повышения эффективности лечения рака модулятором иммунной контрольной точки, включающие этап выбора субъекта для получения терапии, у которого диагностирован рак с одной или более соматическими мутациями, содержащими неоэпитоп, распознаваемый Т-клеткой.

[22] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются усовершенствования способов лечения рака с применением модуляторов иммунной контрольной точки, при этом усовершенствование включает применение терапии к субъекту, у которого диагностирован рак с одной или более соматическими мутациями, содержащими неоэпитоп, распознаваемый Т-клеткой. В некоторых вариантах реализации изобретения долгосрочный клинический эффект наблюдается после лечения блокаторами CTLA-4 (например ипилимумабом или тремелимумабом).

[23] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы лечения рака, выбранного из группы, состоящей из карциномы, саркомы, миеломы, лейкоза или лимфомы, при этом способы включают этап лечения с применением модулятора иммунной контрольной точки субъекту, у которого диагностирован рак с одной или более соматическими мутациями, содержащими неоэпитоп, распознаваемый Т-клеткой. В некоторых вариантах реализации изобретения рак представляет собой меланому. В некоторых вариантах реализации изобретения рак представляет собой немелкоклеточный рак легких (НМКРЛ)

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[24] Следующие фигуры представлены только с целью иллюстрации целях и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

[25] Фигура 1 (состоящая из Фигур 1А-1С) демонстрирует парные сканограммы до и после лечения у пациентов с долгосрочным клиническим эффектом от терапии (Фигура 1А, 1/2/2011 и 8/26/2013); (Фигура 1В, 9/6/2011 и 1/14/2013) и отсутствием эффекта/прогрессированием заболевания (Фигура 1С, 8/13/2009 и 1/9/2010).

[26] Фигура 2 (состоящая из Фигур 2A-2I) демонстрирует мутационный профиль опухолей у пациентов с различным клиническим эффектом от лечения ипилимумабом. Фигура 2А демонстрирует мутационную нагрузку (количество несинонимичных мутаций на экзом), распределенную в зависимости от клинического эффекта. Фигура 2В демонстрирует взаимосвязь между мутационной нагрузкой и клиническим эффектом от ипилимумаба. LB - группа с долгосрочным клиническим эффектом; NB - группа с минимальным клиническим эффектом или его отсутствием; p=0,01 (2-сторонний t-тест сравнения медиан Манна-Уитни для анализа различий в медианной мутационной нагрузке между пациентами с долгосрочным клиническим эффектом и его отсутствием). Фигура 2С демонстрирует степень транзиций (Ti) и трансверсий (Tv) по клиническим подгруппам. Фигура 2D демонстрирует нуклеотидные изменения в группе изобретения и группе валидации. Мутационный спектр согласуется с более ранними исследованиями генома меланомы.19 На Фигуре 2Е изображена кривая Каплана-Мейера общей выживаемости пациентов в группе изобретения с количеством несинонимичных кодирующих мутаций на экзом, больше или меньше 100 (р=0,041 по логранговому критерию). Фигура 2F демонстрирует взаимосвязь между мутационной нагрузкой и клиническим эффектом от ипилимумаба. LB-группа с долгосрочным клиническим эффектом; NB-группа с минимальным клиническим эффектом или его отсутствием; р=0,01 (2-сторонний t-тест сравнения медиан Манна-Уитни для анализа различий в медианной мутационной нагрузке между пациентами с долгосрочным клиническим эффектом и его отсутствием). На Фигуре 2G изображена кривая Каплана-Мейера общей выживаемости пациентов в группе изобретения с количеством несинонимичных кодирующих мутаций на экзом, больше или меньше 100 (р=0,041 по логранговому критерию). На Фигуре 2Н изображена кривая Каплана-Мейера общей выживаемости пациентов в группе изобретения с количеством несинонимичных кодирующих мутаций на экзом, больше или меньше 100 (р=0,010 по логранговому критерию). Фигура 21 демонстрирует степень транзиций (Ti) и трансверсий (Tv) по клиническим подгруппам.

[27] Фигура 3 (состоящая из Фигур 3А-3Н) демонстрирует, что характерный профиль неоэпитопа определяет клинический эффект ипилимумаба. Представляющие интерес неоэпитопы идентифицировали с помощью мутационного анализа, как описано в разделе "Дополнительные способы". На Фигуре 3А изображена тепловая карта представляющих интерес тетрапептидных неоэпитопов у пациентов с долгосрочным клиническим эффектом (LB) или с минимальным клиническим эффектом либо его отсутствием (NB) в группе изобретения (n=25). Каждый ряд представляет собой неоэпитоп. Красная линия указывает на характерный тетрапептидный профиль, ассоциированный с ответом. Точные тетрапептиды, хромосомные локусы и нонамеры дикого и мутантного типа, в котором они возникают, приведены в Таблице 4 и на Фигуре 19. Фигура 3В демонстрирует ту же информацию для группы валидации (n=15). На Фигуре 3С изображена кривая Каплана-Мейера для группы изобретения в зависимости от положительного (синяя линия) или отрицательного (красная линия) неоэпитопного профиля, за исключением изолированных не отвечающих на лечение опухолей. P<0,0001 по логранговому критерию для пациентов с профилем по сравнению с пациентами без профиля. Фигура 3D демонстрирует те же данные для группы валидации. р=0,049 по логранговому критерию. На Фигуре 3Е изображена тепловая карта представляющих интерес тетрапептидных неоэпитопов у пациентов с долгосрочным клиническим эффектом (LB) или с минимальным клиническим эффектом либо его отсутствием (NB) в группе изобретения (n=25). Каждый ряд представляет собой неоэпитоп. Красная линия указывает на характерный тетрапептидный профиль, ассоциированный с ответом. Точные тетрапептиды, хромосомные локусы и нонамеры дикого и мутантного типа, в котором они возникают, приведены в Таблице 4 и на Фигуре 19. Фигура 3F демонстрирует ту же информацию для группы валидации (n=15). На Фигуре 3G изображена кривая Каплана-Мейера в группе изобретения в зависимости от положительного (синяя линия) или отрицательного (красная линия) характерного неоэпитопного профиля, за исключением изолированных не отвечающих на лечение опухолей. Р<0,0001 по логранговому критерию для пациентов с профилем по сравнению с пациентами без профиля. Фигура 3Н демонстрирует те же данные для группы валидации. р=0,049 по логранговому критерию.

[28] Фигура 4 (состоящая из Фигур 4A-4F) демонстрирует активацию Т-клеток неоэпитопами у пациентов, получающих лечение ипилимумабом. Фигура 4А иллюстрирует разнообразие генерации неоэпитопов в зависимости от геномного местоположения. Неоэпитопы от трех репрезентативных пациентов LB-группы приведены в зависимости от геномного местоположения. Представляющие интерес неоэпитопы с определенным профилем могут быть получены с помощью различных генов. Хромосомные местоположения неоэпитопов нанесены вдоль оси абсцисс. Высота пика указывает на то, как много пациентов совместно имеют эту аминокислотную последовательность в группе изобретения и группе валидации. Фигура 4В иллюстрирует типовую тетрапептидную подпоследовательность Toxoplasma gondii. В каждом отдельном случае нонамер, содержащий мутацию, может прогнозированно связываться и быть представленным индивидуальным для каждого пациента HLA. Фигура 4С демонстрирует ответ полифункциональной Т-клетки на TESPFEQHI по сравнению с ответом на пептид дикого типа TKSPFEQHI. Фигура 4D демонстрирует двойной положительный ((ИФН-γ и ФНО-α) CD8+ Т-клеточный ответ на TESPFEQHI по сравнению с ответом на пептид дикого типа TKSPFEQHI и увеличение ИФН-γ+ Т-клеток в динамике. Фигура 4Е демонстрирует двойной положительный (ИФН-γ и ФНО-α) CD8+ Т-клеточный ответ на GLEREGFTF по сравнению с ответом на пептид дикого типа GLERGGFTF и иллюстрирует увеличение пептид-специфических Т-клеток через 24 недели после начала лечения ипилимумабом по сравнению с исходным уровнем. Фигура 4F иллюстрирует типовую тетрапептидную подпоследовательность немедленно-раннего эпитопа цитомегаловируса человека. В каждом отдельном случае нонамер, содержащий мутацию, может прогнозированно связываться и быть представленным индивидуальным для каждого пациента HLA.

[29] Фигура 5 демонстрирует алгоритм анализа для группы изобретения, в котором мутации с охватом менее или равным 10Х были исключены, а представляющие интерес мутации с охватом менее 35Х исследованы вручную с помощью интегрированного устройства визуального просмотра геномики (IGV).

[30] Фигура 6 (состоящая из Фигур 6A-6D) демонстрирует репрезентативный

перечень наиболее часто мутировавших генов в каждой клинической подгруппе. Представляющие интерес мутации были валидированы ортогональным методом секвенирования, таким как секвенирование Ion Torrent и MiSeq. Фигура 6А демонстрирует репрезентативный перечень рекуррентно мутировавших генов в группе изобретения и группе валидации. Фигура 6В демонстрирует распределение типов мутаций по образцам в группе изобретения и группе валидации. Фигура 6С демонстрирует репрезентативный перечень рекуррентно мутировавших генов в группе изобретения и группе валидации. Фигура 6D демонстрирует распределение типов мутаций по образцам в группе изобретения и группе валидации.

[31] Фигура 7 (состоящая из Фигур 7A-7F) демонстрирует драйверы и мутационные нагрузки у пациентов с долгосрочным клиническим эффектом и минимальным клиническим эффектом или его отсутствием. Фигура 7А демонстрирует возникновение мутаций в известных меланомных драйверных генах в опухолях каждой клинической группы в общей группе изобретения. Фигура 7В демонстрирует мутации в известных меланомных драйверных генах в опухолях каждой клинической группы в общей группе валидации. Фигура 7С демонстрирует ряд экзонных миссенс-мутаций в образце в группе валидации. Фигура 7D демонстрирует сравнение медианных значений экзонных миссенс-мутаций в образце в группе валидации. Фигура 7Е демонстрирует мутационные нагрузки подгрупп пациентов без каких-либо рентгенологических признаков заболевания (NED), с контролем заболевания в течение более 6 месяцев (продолжающимся для всех, кроме одного пациента), с контролем заболевания в течение менее 6 месяцев и при отсутствии ответа на лечение (NR). р=0,03 для различия между пациентами с NED и пациентами без ответа (2-сторонний t-тест сравнения медиан Манна-Уитни). Фигура 7F демонстрирует мутационные нагрузки подгрупп пациентов без каких-либо рентгенологических признаков заболевания (NED), с контролем заболевания в течение более 6 месяцев (продолжающимся для всех, кроме одного пациента), с контролем заболевания в течение менее 6 месяцев и при отсутствии ответа на лечение (NR). р=0,03 для различия между пациентами с NED и пациентами без ответа (2-сторонний t-тест сравнения медиан Манна-Уитни).

[32] На Фигуре 8 представлен анализ процесса функционирования неоэпитопа. Все этапы выполняли для прогнозируемого дикого типа и мутанта. Прогнозирование МНС класса I осуществляли с помощью NetMHCv3.4 и/или RANKPEP. Прогнозирование иммуногенности Т-клеток осуществляли с помощью программы IEDB, маскирующей HLA-специфические аминокислоты (http://tools.immunepitope.org/immunogenicity/).

[33] Фигура 9 (состоящая из Фигур 9А-9С) демонстрирует репрезентативные сканограммы пациентов из группы изобретения до и после лечения. Фигура 9А демонстрирует две области одного пациента (5/1/08 и 5/30/13) без рентгенологических признаков заболевания. Фигура 9В демонстрирует сканограммы пациентов с клиническим эффектом длительностью более 6 месяцев. Верхняя часть от 9/6/11 и 1/14/13. Нижняя часть от 9/19/07 и 1/15/09. Фигура 9С демонстрирует fTom сканограммы пациентов без ответа на лечение. Верхняя часть от 5/27/10 и 12/21/10. Нижняя часть от 3/3/11 и 11/18/11.

[34] Фигура 10 (состоящая из Фигур 10A-10K) демонстрирует анализ пептидов в группе изобретения и группе валидации. Фигура 10А демонстрирует мутантный пептид во всех образцах в группе изобретения, который с большей долей вероятности, чем соответствующий пептид дикого типа, связывает МНС класса I. Фигура 10В демонстрирует мутантный пептид во всех образцах в группе валидации, который с большей долей вероятности, чем соответствующий пептид дикого типа, связывает МНС класса I. Фигуры 10С и 10D демонстрируют частоту аминокислот в общих тетрапептидах в LB- и NB-группах. Высота каждой буквы отражает частоту данной аминокислоты в этом положении. Фенилаланин (F) не наблюдали в положениях 3 и 4 в группе NB. Фигура 10E демонстрирует известные антигены, тетрапептиды которых содержат подпоследовательность, распределенные по клиническим группам. Консервативные тетрапептидные неоэпитопы содержат подпоследовательности антигенов из инфекционных патогенов с признаками активации Т-клеток in vitro. Фигура 10F демонстрирует подпоследовательности MART-1 и EKLS. Фигура 10G демонстрирует мутантный пептид во всех образцах в группе изобретения, который с большей долей вероятности, чем соответствующий пептид дикого типа, связывает МНС класса I. Фигура 10H демонстрирует мутантный пептид во всех образцах в группе валидации, который с большей долей вероятности, чем соответствующий пептид дикого типа, связывает МНС класса I. Фигуры 101 и 10J демонстрируют частоту аминокислот в общих тетрапептидах в LB- и NB-группах. Высота каждой буквы отражает частоту данной аминокислоты в этом положении. Фигура 10K демонстрирует известные антигены, тетрапептиды которых содержат подпоследовательность, распределенные по клиническим группам. Консервативные тетрапептидные неоэпитопы содержат подпоследовательности антигенов из инфекционных патогенов с признаками активации Т-клеток in vitro.

[35] Фигура 11 демонстрирует ответ полифункциональной CD8 Т-клетки, обнаруженный в пептидных пулах А, В, и С на неделе 60 в образце крови. Замороженные РВМС от пациента CR1509, CR9699 и CR9306 оттаивали и повторно стимулировали пептидным пулом А, В и С соответственно, как описано в разделе "Способы". Внутриклеточное цитокиновое окрашивание (ICS) проводили на день 10 в соответствии со следующими условиями: отсутствие стимуляции (отрицательный контроль), стафилококковый энтеротоксин В (SEB, положительный контроль) и соответствующий пептидный пул. Репрезентативная точечная диаграмма CD8+ИФН-γ+, CD8+ИФН-γ+ФНО-α+ и CD8+ИФН-γ+CD107a+ Т-клеток приведена на Фигуре 11А (пул А для пациента CR1509), Фигуре 11В (пул В для пациента CR9699) и Фигуре 11С (пул С для пациента CR9306). Фигура 11D демонстрирует процент двойных положительных клеток CD8+ИФН-γ, ФНО-α, CD-107a и MIP-1β при стимуляции мутантным пептидом GLEREGFTF по сравнению с пептидом дикого типа GLERGGFTF.

[36] На Фигуре 12 приведена блок-схема алгоритма моделирования для проверки нулевой гипотезы о том, является ли характерный профиль результатом различного набора данных, либо пермутации фактических данных, либо моделированного набора данных.

[37] Фигура 13 демонстрирует, что ни мутантные, ни дикие типы пептидов не вызывали ответов CD8+ ИФН-γ у трех здоровых доноров.

[38] Фигура 14 демонстрирует, что генерация неоантигенов может находиться в зависимости от геномного местоположения. Неоантигены от трех репрезентативных пациентов LB-группы приведены в зависимости от геномного местоположения. Представляющие интерес неоэпитопы с характерным профилем получали в различных генах. Хромосомные местоположения неоэпитопов нанесены вдоль оси абсцисс. Высота пика указывает на то, как много пациентов совместно имеют эту аминокислотную последовательность в группе изобретения и группе валидации. Тетрапептиды были кодированы с помощью мутаций в различных генах по всему геному.

[39] На Фигуре 15 представлен анализ экзомного процесса для группы валидации.

[40] На Фигуре 16 представлены опухолевые биопсии, окрашенные для выявления LCA (общего лейкоцитарного антигена), CD8 и FOXP3. Согласно Фигуре 16А, у пациентов, не имеющих клинического эффекта (NB; А-Е), по сравнению с теми, у которых регистрировался долгосрочный эффект (LB; F-J), не отмечали достоверной разницы в процентном количестве клеток, окрашенных LCA (В, G, 200-кратное увеличение, конец стрелки указывает на положительные клетки), CD8 (С, Н, 200-кратное увеличение, конец стрелки указывает на положительные клетки) или FOXP3 (D, I, 200-кратное увеличение, конец стрелки указывает на положительные клетки). Опухоли пациентов как из группы NB, так и группы LB, характеризуются некрозом (Е, J, 100-кратное увеличение), а процент опухолей, характеризующихся некрозом, достоверно различается (Р=0,034) между группами (O), тем не менее, этот вывод зависит от включения одного резко отклоняющегося значения (при его исключении Р=0,683). Согласно Фигуре 16В, наблюдается достоверное увеличение (р=0,028) отношения CD8 : FOXP3 (C) в группе LB по сравнению с группой NB. LCA (общий лейкоцитарный антиген) определялся выше в группе LB, но без статистической значимости.

[41] На Фигуре 17 приведена подробная характеристика пациентов группы валидации.

[42] На Фигуре 18 представлены несинонимичные экзонные мутации в опухоли в группе изобретения и группе валидации.

[43] Фигура 19 демонстрирует окружение, гены и локусы для тетрапептидов в ответном профиле.

[44] Фигура 20 демонстрирует экспрессию генов, кодирующих мутации, приводящие к наличию тетрапептидов в ответном профиле, полученном от набора данных TCGA RNA-seq. После исключения опухолей с отсутствием экспрессии, для каждого гена приведено среднее значение SEM. Если ген не экспрессируется ни в одном образце, указан ноль.

[45] На Фигуре 21 приведена локализация образца, размер образца и тип биопсии для каждого образца от пациента.

[46]

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[47] Для упрощения понимания настоящего изобретения ниже будут даны определения некоторым терминам. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что определения некоторых терминов могут быть приведены в других местах настоящего описания и/или будут понятны из контекста.

[48] Введение. В данном контексте термин "введение" относится к введению композиции субъекту. Введение может быть осуществлено любым подходящим способом. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения введение может быть бронхиальным (включая бронхиальную инсталляцию), буккальным, энтеральным, внутрикожным, внутриартериальным, внутрикожным, внутрижелудочным, интрамедуллярным, внутримышечным, интраназальным, внутрибрюшинным, интратекальным, внутривенным, внутрижелудочковым, через слизистую оболочку, назальным, пероральным, ректальным, подкожным, сублингвальным, местным, трахеальным (включая трахеальную инсталляцию), трансдермальным, вагинальным и витреальным.

[49] Аффинность. Как известно в данной области техники, "аффинность" - это мера прочности, с которой определенный лиганд связывается со своим партнером. Аффинность может быть измерена различными способами. В некоторых вариантах реализации изобретения аффинность измеряется с помощью количественного анализа. В некоторых таких вариантах реализации изобретения связывающая концентрация партнера может быть установлена так, чтобы быть выше концентрации лиганда, тем самым имитируя физиологические условия. В некоторых альтернативных или дополнительных вариантах реализации изобретения связывающая концентрация партнера и/или концентрация лиганда могут изменяться. В некоторых таких вариантах реализации изобретения аффинность можно сравнивать с эталоном в сопоставимых условиях (например, концентрации).

[50] Аминокислота. В данном контексте термин "аминокислота", в его самом широком смысле, относится к любому соединению и/или веществу, которые могут быть включены в полипептидную цепь. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота имеет общую структуру H2N-C(H)(R)-COOH. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота представляет собой природную аминокислоту. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота представляет собой синтетическую аминокислоту; в некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота представляет собой d-аминокислоту; в некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота представляет собой l-аминокислоту. Термин "стандартная аминокислота" относится к любой из двадцати стандартных l-аминокислот, которые обычно встречаются в природных пептидах. Термин "нестандартная аминокислота" относится к любой аминокислоте, отличающейся от стандартных аминокислот, независимо от того, является она синтезированной или получена из природного источника. В данном контексте термин "синтетическая аминокислота" охватывает химически модифицированные аминокислоты, включая, но не ограничиваясь ими, соли, производные аминокислот (такие как амиды) и/или замещения. Аминокислоты, включая карбокси- и/или аминоконцевые аминокислоты в пептидах, могут быть модифицированы с помощью метилирования, амидирования, ацетилирования, защитных групп и/или замещения другими химическими группами, что может изменять период полувыведения пептида из крови без отрицательного воздействия на их активность. Аминокислоты могут принимать участие в дисульфидной связи. Аминокислоты могут содержать одну из посттрансляционных модификаций, таких как ассоциации с одним или более химическим компонентом (например, метальные группы, ацетатные группы, ацетильные группы, фосфатные группы, формильные молекулы, изопреноидные группы, сульфатные группы, молекулы полиэтиленгликоля, липидные молекулы, углеводные молекулы, молекулы биотина и т.д.). Термин "аминокислота" используется взаимозаменяемо с термином "аминокислотный остаток" и может относиться к свободной аминокислоте и/или аминокислотному остатку пептида. Из контекста, в котором используется данный термин, будет понятно, относится он к свободной аминокислоте или к остатку пептида.

[51] Антительный агент. В данном контексте термин "антительный агент» относится к агенту, который специфически связывается с определенным антигеном. В некоторых вариантах реализации изобретения термин охватывает любой полипептид с иммуноглобулиновыми структурными элементами, достаточными для осуществления специфического связывания. Пригодные антительные агенты включают, но не ограничиваются ими, человеческие антитела, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, конъюгированные антитела (т.е. антитела, конъюгированные или слитые с другими белками, радиоизотопными метками, цитотоксинами), иммунофармацевтические средства на основе модульного белка малого размера (Small Modular ImmunoPharmaceuticals ("SMIPs™"), одноцепочечные антитела, верблюжьи антитела и фрагменты антител. В данном контексте термин "антительный агент" также включает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, однодоменные антитела (например однодоменные антитела акулы (например, IgNAR или их фрагменты)), мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, пока они проявляют необходимую биологическую активность. В некоторых вариантах реализации изобретения термин охватывает сшитые пептиды. В некоторых вариантах реализации изобретения термин охватывает один или более антителоподобных связывающих пептидомиметиков. В некоторых вариантах реализации изобретения термин охватывает один или более антителоподобных связывающих каркасных белков. В некоторых вариантах реализации изобретения термин охватывает монотела и аднектины. Во многих вариантах реализации изобретения антительный агент представляет собой или содержит полипептид, аминокислотная последовательность которого включает один или более структурных элементов, известных специалисту в данной области техники как области, определяющие комплементарность (CDR); в некоторых вариантах реализации изобретения антительный агент представляет собой или содержит полипептид, аминокислотная последовательность которого включает по меньшей мере одну CDR (например, по меньшей мере одну CDR тяжелой цепи и/или по меньшей мере одну CDR легкой цепи), которая по существу идентична выявляемой в эталонном антителе. В некоторых вариантах реализации изобретения включенная CDR является по существу идентичной с эталонной CDR в том аспекте, что она идентичная либо в последовательности, либо содержит от 1 до 5 аминокислотных замен по сравнению с эталонной CDR. В некоторых вариантах реализации изобретения включенная CDR является по существу идентичной с эталонной CDR в том аспекте, что она характеризуется по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с эталонной CDR. В некоторых вариантах реализации изобретения включенная CDR является по существу идентичной с эталонной CDR в том аспекте, что она характеризуется по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с эталонной CDR. В некоторых вариантах реализации изобретения включенная CDR является по существу идентичной с эталонной CDR в том аспекте, что по меньшей мере одна аминокислота в пределах включенной CDR удалена, добавлена или замещена по сравнению с эталонной CDR, но включенная CDR имеет аминокислотную последовательность, которая в других отношениях идентична с аминокислотной последовательностью эталонной CDR. В некоторых вариантах реализации изобретения включенная CDR является по существу идентичной с эталонной CDR в том аспекте, что 1-5 аминокислот в пределах включенной CDR удалены, добавлены или замещены по сравнению с эталонной CDR, но включенная CDR имеет аминокислотную последовательность, которая в других отношениях идентична с эталонной CDR. В некоторых вариантах реализации изобретения включенная CDR является по существу идентичной с эталонной CDR в том аспекте, что по меньшей мере одна аминокислота в пределах включенной CDR замещена по сравнению с эталонной CDR, но включенная CDR имеет аминокислотную последовательность, которая в других отношениях идентична с аминокислотной последовательностью эталонной CDR. В некоторых вариантах реализации изобретения включенная CDR является по существу идентичной с эталонной CDR в том аспекте, что 1-5 аминокислот в пределах включенной CDR удалены, добавлены или замещены по сравнению с эталонной CDR, но включенная CDR имеет аминокислотную последовательность, которая в других отношениях идентична с эталонной CDR. В некоторых вариантах реализации изобретения антительный агент представляет собой или содержит полипептид, аминокислотная последовательность которого включает структурные элементы, известные специалистам в этой области техники как вариабельный домен иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации изобретения антительный агент представляет собой полипептидный белок, имеющий связывающий домен, который является гомологичным или в значительной степени гомологичным с иммуноглобулин-связывающим доменом.

[52] Полипептид антитела. В данном контексте термины "полипептид антитела", "антитело" или "антигенсвязывающий фрагмент", которые могут быть использованы взаимозаменяемо, относятся к полипептидам(-у), способным связываться с эпитопом. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид антитела представляет собой антитело полной длины, а в некоторых вариантах реализации изобретения - меньше, чем полной длины, но включающее по меньшей мере один сайт связывания (содержащий по меньшей мере одну, а более предпочтительно по меньшей мере две последовательности со структурой "вариабельных областей" антитела). В некоторых вариантах реализации изобретения термин "полипептид антитела" включает любой белок, имеющий связывающий домен, который является гомологичным или в значительной степени гомологичным с иммуноглобулин-связывающим доменом. В конкретных вариантах реализации изобретения термин "полипептиды антитела" охватывает полипептиды, имеющие связывающий домен, который характеризуется по меньшей мере 99% идентичностью с иммуноглобулин-связывающим доменом. В некоторых вариантах реализации изобретения "полипептид антитела" представляет собой любой белок, имеющий связывающий домен, который характеризуется по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичностью с иммуноглобулин-связывающим доменом, например эталонным иммуноглобулин-связывающим доменом. Включенный "полипептид антитела" может иметь аминокислотную последовательность, идентичную последовательности антитела, которое встречается в природном источнике. Полипептиды антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены любыми доступными способами, включая, например, выделение из природного источника или библиотеки антител, рекомбинантную продукцию в системе хозяина или с ее помощью, химический синтез и т.д., или их комбинации. Полипептид антитела может быть моноклональным или поликлональным. Полипептид антитела может быть представителем любого класса иммуноглобулинов, в том числе любого человеческого класса: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело может быть представителем иммуноглобулинов класса IgG. В данном контексте термины "полипептид антитела" или "специфическая часть антитела" используются взаимозаменяемо и относятся к любому производному антитела, которое обладает способностью связываться с эпитопом, представляющим интерес. В некоторых вариантах реализации изобретения "полипептид антитела" представляет собой фрагмент антитела, который сохраняет по меньшей мере значительную часть специфической связывающей способности полноразмерного антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, Fv, диатела dsFv и фрагменты Fd. В альтернативном или дополнительном варианте фрагмент антитела может содержать множество цепей, которые связаны друг с другом, например, посредством дисульфидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид антитела может быть человеческим антителом. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептиды антитела могут быть гуманизированными. Гуманизированные полипептиды антитела могут включать химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или полипептиды антитела (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. В большинстве случаев гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело реципиента), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменяются остатками из CDR нечеловеческих видов (антитело донора), таких как мышь, крыса или кролик, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В конкретных вариантах реализации изобретения полипептиды антитела для использования согласно настоящему изобретению связываются с определенными эпитопами молекул иммунных контрольных точек.

[53] Антиген. "Антиген" представляет собой молекулу или отдельную единицу, с которой связывается антитело. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген представляет собой или содержит полипептид или его часть. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген представляет собой часть инфекционного агента, который распознается антителами. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген представляет собой агент, который вызывает иммунный ответ; и/или (ii) агент, который связывается с рецептором Т-клетки (например, когда представлен молекулой МНС) или с антителом (например, полученным с помощью В-клетки) при воздействии или введении в организм. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген вызывает гуморальный ответ (например, включая продукцию антиген-специфических антител) в организме; в некоторых альтернативных или дополнительных вариантах реализации изобретения антиген вызывает клеточный ответ (например, с участием Т-клеток, рецепторы которых специфически взаимодействуют с антигеном) в организме. Специалистам в данной области техники будет понятно, что определенный антиген может вызывать иммунный ответ у одного или нескольких представителей организма-мишени (например, у мышей, кроликов, приматов, людей), но не у всех представителей вида организма-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген вызывает иммунный ответ по меньшей мере у около 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% представителей вида организма-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген связывается с антителом и/или Т-клеточным рецептором и может вызывать или не вызывать определенную физиологическую реакцию в организме. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген, например, может связываться с антителом и/или Т-клеточным рецептором in vitro, независимо от того, происходит такое взаимодействие in vivo или нет. В большинстве случаев антиген может представлять собой или включать любое химическое соединение, такое как, например, малая молекула, нуклеиновая кислота, полипептид, углевод, липид, полимер [в некоторых вариантах реализации изобретения не являющийся биологическим полимером (например, не являющийся нуклеиновой кислотой или аминокислотным полимером)] и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген представляет собой или содержит полипептид. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген представляет собой или содержит гликан. Обычным специалистам в данной области техники будет понятно, что в большинстве случаев антиген может быть в изолированной или в чистой форме, или в качестве альтернативного варианта - в неочищенной форме (например, вместе с другими материалами, например, в экстракте, таком как клеточный экстракт, или другом относительно неочищенном препарате антиген-содержащего источника). В некоторых вариантах реализации изобретения антигены, используемые согласно настоящему изобретению, представлены в неочищенной форме. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген представляет собой или содержит рекомбинантный антиген.

[54] Приблизительно. В данном контексте термин "приблизительно" или "около" применительно к одному или более значениям, представляющим интерес, относится к значению, которое является сходным с установленным эталонным значением. В некоторых вариантах реализации изобретения термин "приблизительно" или "около" относится к диапазону значений, попадающих в пределы 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше в любом направлении (больше или меньше) установленного эталонного значения, если не указано или не очевидно иное из контекста (кроме случаев, когда такое количество будет превышать 100% от возможного значения).

[55] Комбинированная терапия. В данном контексте термин "комбинированная терапия" относится к тем ситуациям, в которых два или более различных фармацевтических агента вводятся в перекрывающихся режимах, вследствие чего субъект одновременно подвергается воздействию обоих агентов. При использовании комбинированной терапии два или более различных агента могут вводиться одновременно или последовательно. Это введение в комбинации может включать одновременное введение двух или более агентов в единой лекарственной форме, одновременное введение в отдельных лекарственных формах, а также раздельное введение. То есть два или более агента могут быть совмещены вместе в единой лекарственной форме и введены одновременно. В альтернативном варианте два или более агента могут вводиться одновременно, причем агенты представлены в отдельных составах. В другом альтернативном варианте первый агент может вводиться только с последующим одним или более дополнительными агентами. В отдельном протоколе введения два или более агента могут вводиться с интервалом несколько минут, или несколько часов, или несколько дней.

[56] Сопоставимый. В данном контексте термин "сопоставимый" используется для описания двух (или более) совокупностей условий, обстоятельств, индивидуумов или популяций, которые достаточно сходны друг с другом, чтобы обеспечить сравнение полученных результатов или наблюдаемых явлений. В некоторых вариантах реализации изобретения сопоставимые совокупности условий, обстоятельств, индивидуумов или популяций характеризуются множеством по существу идентичных характеристик и одной или небольшим количеством неоднотипных характеристик. Обычным специалистам в данной области техники будет понятно, что совокупности обстоятельств, индивидуумов или популяций являются сопоставимыми друг с другом, если имеют достаточное количество и тип по существу идентичных характеристик, чтобы гарантировать разумный вывод о том, что различия в полученных результатах или наблюдаемых явлениях, в условиях различных совокупностей обстоятельств, индивидуумов или популяций либо вместе с ними, вызваны или являются показателем неоднотипности этих характеристик, которые различаются. Специалистам в данной области техники будет понятно, что относительное выражение, используемое в данном описании (например, усиленный, активированный, сниженный, ингибированный и т.д.), как правило, относится к сравнениям, осуществленным при сопоставимых условиях.

[57] Консенсусная последовательность. В данном контексте термин "консенсусная последовательность" относится к коровой последовательности, которая вызывает или регулирует физиологическое явление (например, иммунный ответ). Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что раковая клетка, которая имеет общую "консенсусную последовательность" с антигеном инфекционного агента, имеет общую часть аминокислотной последовательности, которая влияет на аффинность связывания антигена с молекулой МНС (либо непосредственно, либо аллостерически), и/или облегчает распознавание Т-клеточными рецепторами. В некоторых вариантах реализации изобретения консенсусная последовательность представляет собой тетрапептид. В некоторых вариантах реализации изобретения консенсусная последовательность представляет собой нонапептид. В некоторых вариантах реализации изобретения длина консенсусной последовательности составляет от четырех до девяти аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения длина консенсусной последовательности составляет более девяти аминокислот.

[58] Диагностическая информация. В данном контексте диагностическая информация или информация для применения в диагностике представляет собой любую информацию, которая пригодна для определения того, имеет ли пациент заболевание или состояние, и/или для классификации заболевания или состояния в фенотипическую категорию или любую категорию, имеющую значение в отношении прогноза заболевания или состояния, или вероятного ответа на лечение (или лечения в целом, или какого-либо определенного лечения) заболевания или состояния. Аналогичным образом, диагностика относится к предоставлению диагностической информации любого типа, включая, но не ограничиваясь этим, информацию о том, есть ли у субъекта вероятность заболевания или состояния (такого как рак), данные о течении, стадии или характеристике заболевания или состояния, которое проявляется у субъекта, информацию, связанную с природой или классификацией опухоли, информацию, связанную с прогнозом, и/или информацию, полезную для выбора соответствующего лечения. Выбор лечения может включать выбор определенного терапевтического (например, химиотерапевтического) агента или иного способа лечения, такого как хирургический, радиационный и т.д., выбор тактики лечения относительно того, следует приостановить или продолжать терапию, выбор относительно схемы применения (например, частота или уровень одной или более доз определенного терапевтического агента либо комбинации терапевтических агентов) и т.д.

[59] Схема применения. В данном контексте термин "схема применения" (или "терапевтический режим") представляет собой совокупность разовых доз (обычно более одной), которые вводят субъекту по отдельности, как правило, разделенными периодами времени. В некоторых вариантах реализации изобретения данный терапевтический агент имеет рекомендуемую схему применения, которая может включать одну или более доз. В некоторых вариантах реализации изобретения схема применения включает множество доз, которые отделены друг от друга периодом времени одинаковой длины; в некоторых вариантах реализации изобретения схема применения включает множество доз и по меньшей мере два разных периода времени, разделяющих отдельные дозы. В некоторых вариантах реализации изобретения схема применения представляет собой или коррелирует с желаемым терапевтическим результатом при применении всей популяции пациентов.

[60] Положительный ответ. В данном контексте термин "положительный ответ" относится к ослаблению симптомов, полной или частичной ремиссии либо другому улучшению патофизиологии заболевания. Симптомы ослабляются, если один или более симптомов определенного заболевания, нарушения или состояния уменьшаются по силе (например, интенсивности, тяжести и т.д.) и/или частоте. Для большей ясности, замедление развития определенного симптома считается одной из форм снижения частоты этого симптома. Многие онкологические пациенты с более мелкими опухолями не имеют никаких симптомов. Не предполагается, что настоящее изобретение ограничено только теми случаями, когда устраняются симптомы. Настоящее изобретение, в частности, предполагает лечение, в результате которого один или более симптомов ослабляются, хотя и не полностью устраняются (при этом состояние субъекта "улучшается"). В некоторых вариантах реализации изобретения положительный ответ фиксируется, если определенный терапевтический режим проявляет статистически значимый эффект при введении всей соответствующей популяции; демонстрация определенного результата у конкретного индивидуума может не потребоваться. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения определенный терапевтический режим устанавливается для того, чтобы иметь положительный ответ, когда применение режима коррелирует с соответствующим желаемым эффектом.

[61] Гомология. В данном контексте термин "гомология" относится к общей связанности между полимерными молекулами, например между молекулами нуклеиновых кислот (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК) и/или между полипептидными молекулами. В некоторых вариантах реализации изобретения полимерные молекулы считаются "гомологичными" друг другу, если их последовательности являются идентичными по меньшей мере на 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. В некоторых вариантах реализации изобретения полимерные молекулы считаются "гомологичными" друг другу, если их последовательности являются сходными по меньшей мере на 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%.

[62] Идентичность. В данном контексте термин "идентичность" относится к общей связанности между полимерными молекулами, например между молекулами нуклеиновых кислот (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК) и/или между полипептидными молекулами. Расчет процента идентичности двух последовательностей нуклеиновых кислот может осуществляться, например, путем совмещения двух последовательностей с целью оптимального сравнения (например, для оптимального совмещения пропуски могут быть введены в одну или обе (первую и вторую) последовательности нуклеиновых кислот, а неидентичными последовательностями для целей сравнения можно пренебречь). В некоторых вариантах реализации изобретения длина последовательности, совмещенной для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по существу 100% длины эталонной последовательности. Затем сравниваются нуклеотиды в соответствующих нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято тем же нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в данном положении. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, общих для последовательностей, принимая во внимание количество пропусков и длину каждого пропуска, который должен быть введен для оптимального совмещения двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть достигнуто с использованием математического алгоритма. Например, процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определен с помощью алгоритма Майерса и Миллера (CABIOS, 1989, 4: 11-17), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0) с использованием таблицы веса остатков РАМ120, штрафа за длину пропуска 12 и штрафа пропуска 4. В альтернативном варианте процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определить с использованием программы GAP в пакете программного обеспечения GCG с матрицей NWSgapdna.CMP.

[63] Модулятор иммунной контрольной тонки. В данном контексте термин "модулятор иммунной контрольной точки" относится к агенту, который непосредственно или опосредованно взаимодействует с иммунной контрольной точкой. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки усиливает иммунный эффекторный ответ (например, цитотоксический Т-клеточный ответ), например, путем стимуляции положительного сигнала для Т-клеточной активации. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки усиливает иммунный эффекторный ответ (например, цитотоксический Т-клеточный ответ), например, путем ингибирования отрицательного сигнала для Т-клеточной активации (например, дезингибированием). В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки препятствует сигналом для Т-клеточной анергии. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки уменьшает, устраняет и предотвращает иммунную толерантность к одному или более антигенам.

[64] Долгосрочный клинический эффект. В целом термин "долгосрочный клинический эффект" относится к желаемому клиническому исходу, например, наблюдаемому после применения определенного лечения или терапии, представляющей интерес, который сохраняется в течение клинически значимого периода времени. Приводя лишь один из примеров, следует отметить, что в некоторых вариантах реализации изобретения долгосрочный клинический эффект терапии рака представляет собой или включает (1) отсутствие признаков заболевания ("NED", например, при рентгенографической оценке) и/или (2) стабильность либо уменьшение интенсивности заболевания. В некоторых вариантах реализации изобретения клинически значимый период времени составляет по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев или более. В некоторых вариантах реализации изобретения клинически значимый период времени составляет по меньшей мере шесть месяцев. В некоторых вариантах реализации изобретения клинически значимый период времени составляет по меньшей мере 1 год.

[65] Маркер. В данном контексте термин "маркер" относится к агенту, наличие или уровень которого является характеристикой определенной опухоли или ее метастазирования. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения термин относится к продукту экспрессии гена, который характерен для определенной опухоли, подкласса опухоли, стадии опухоли и т.д. В некоторых альтернативных или дополнительных вариантах реализации изобретения наличие или уровень определенного маркера коррелирует с активностью (или уровнем активности) определенного сигнального пути, например, что может быть характерным для определенного класса опухолей. Статистическая значимость наличия или отсутствия маркера может варьироваться в зависимости от определенного маркера. В некоторых вариантах реализации изобретения обнаружение маркера является высокоспецифичным в том аспекте, что отражает высокую вероятность того, что опухоль относится к определенному подклассу. Такая специфичность может происходить за счет чувствительности (т.е. отрицательный результат может возникнуть, даже если опухоль представляет собой такую опухоль, которая прогнозируемо экспрессировала бы маркер). С другой стороны, маркеры с высокой степенью чувствительности могут быть менее специфичными по сравнению с маркерами с более низкой чувствительностью. Согласно настоящему изобретению пригодный маркер не должен различать опухоли определенного подкласса с точностью до 100%.

[66] Модулятор. Термин "модулятор" используется для обозначения вещества, присутствие которого в системе, обладающей активностью, представляющей интерес, коррелирует с изменением уровня и/или характера этой активности по сравнению с наблюдениями при иных сопоставимых состояниях, когда модулятор отсутствует. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор представляет собой активатор в том аспекте, что при его наличии активность повышается по сравнению с наблюдениями при прочих сопоставимых состояниях, когда модулятор отсутствует. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор представляет собой ингибитор в том аспекте, что при его наличии активность снижается по сравнению с иными сопоставимыми состояниями, когда модулятор отсутствует. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор взаимодействует непосредственно с объектом-мишенью, активность которого представляет интерес. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор взаимодействует опосредованно (т.е. непосредственно с промежуточным агентом, который взаимодействует с объектом-мишенью) с объектом-мишенью, активность которого представляет интерес. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор влияет на уровень объекта-мишени, представляющего интерес; в некоторых альтернативных или дополнительных вариантах реализации изобретения модулятор влияет на активность объекта-мишени, представляющего интерес, не затрагивая уровень объекта-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор влияет как на уровень, так и на активность объекта-мишени, представляющего интерес, вследствие чего наблюдаемое различие в активности не полностью объясняется или соизмеримо с наблюдаемым различием в уровне.

[67] Неоэпитоп. Под термином "неоэпитоп" в данной области техники понимают эпитоп, который появляется или развивается у субъекта после воздействия или возникновения определенного явления (например, развития или прогрессирования определенного заболевания, нарушения или состояния, например инфекции, рака, стадии рака и т.д.). В данном контексте неоэпитоп является тем элементом, наличие и/или уровень которого коррелирует с воздействием или возникновением явления. В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитоп является тем элементом, который активирует иммунный ответ против клеток, экспрессирующих его (например, на соответствующем уровне). В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитоп является тем элементом, который активирует иммунный ответ, тем самым убивая или иным образом разрушая клетки, которые его экспрессируют (например, на соответствующем уровне). В некоторых вариантах реализации изобретения соответствующее явление, которое приводит к активации неоэпитопа, представляет собой или включает соматическую мутацию в клетке. В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитоп не экспрессируется в нераковых клетках до уровня и/или способом, который активирует и/или поддерживает иммунный ответ (например, иммунный ответ, достаточный для экспрессирования неоэпитопа раковыми клетками-мишенями).

[68] Отсутствие клинического эффекта. В данном контексте термин "отсутствие клинического эффекта" используется для обозначения отсутствия определяемого клинического эффекта (например, в ответ на проведение определенной терапии или лечения, представляющих интерес). В некоторых вариантах реализации изобретения отсутствие клинического эффекта означает отсутствие статистически значимых изменений в каком-либо определенном симптоме или признаке определенного заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения отсутствие клинического эффекта относится к изменению одного или более симптомов или признаков заболевания, нарушения или состояния, которое длится в течение только короткого периода времени, такого как, например, менее чем около 6 месяцев, менее чем около 5 месяцев, менее чем около 4 месяцев, менее чем около 3 месяцев, менее чем около 2 месяцев, менее чем около 1 месяца или меньше.

[69] Пациент. В данном контексте термин "пациент" или "субъект" относится к любому организму, которому могут вводить указанную композицию, например, в экспериментальных, диагностических, профилактических, косметических или терапевтических целях. Типичные пациенты представляют собой животных (например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, не относящиеся к человеку приматы и люди). В некоторых вариантах реализации изобретения пациентом является человек. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент имеет одно или более нарушений или состояний или предрасположен к ним. В некоторых вариантах реализации изобретения у пациента проявляется один или более симптомов нарушения или состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения у пациента было диагностировано одно или более нарушений или состояний. В некоторых вариантах реализации изобретения нарушение или состояние представляет собой или включает рак или наличие одной или более опухолей. В некоторых вариантах реализации изобретения нарушение или состояние представляет собой метастатический рак.

[70] Полипептид. В данном контексте термин "полипептид" в целом представляет собой последовательность по меньшей мере двух аминокислот, прикрепленных друг к другу пептидной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид может включать по меньшей мере 3-5 аминокислот, каждая из которых прикреплена к другим с помощью по меньшей мере одной пептидной связи. Обычным специалистам в данной области техники будет понятно, что полипептиды иногда включают "ненатуральные" аминокислоты или другие вещества, которые, тем не менее, в некоторых случаях способны к интеграции в полипептидную цепь.

[71] Прогностическая и предвещающая информация. В данном контексте термины "прогностическая" и "предвещающая" информация используются взаимозаменяемо для обозначения любой информации, которая может использоваться для обозначения любого аспекта течения заболевания или состояния либо при отсутствии, либо при наличии лечения. Такая информация может включать, но не ограничивается этим, ожидаемую среднюю продолжительность жизни пациента, вероятность того, что пациент выживет в течение заданного интервала времени (например, 6 месяцев, 1 год, 5 лет и т.д.), вероятность того, что пациент излечится от болезни, вероятность того, что заболевание пациента будет характеризоваться ответом на определенную терапию (при этом реакция может быть определена любым из множества способов). Прогностическая и предвещающая информация включена в широкую категорию диагностической информации.

[72] Белок. В данном контексте термин "белок" относится к полипептиду (т.е. последовательности по меньшей мере двух аминокислот, соединенных друг с другом пептидной связью). Белки могут включать фрагменты, отличающиеся от аминокислот (например, это могут быть гликопротеины, протеогликаны и т.д.), и/или могут быть иным образом обработаны или модифицированы. Обычным специалистам в данной области техники будет понятно, что "белок" может быть полной полипептидной цепью, которая продуцируется клеткой (с сигнальной последовательностью или без нее), или может быть их составляющей частью. Обычным специалистам в данной области техники будет понятно, что белок может иногда включать более чем одну полипептидную цепь, например, соединенную одной или более дисульфидными связями или связанную другими способами. Полипептиды могут содержать L-аминокислоты, D-аминокислоты или то и другое, и могут содержать любую из множества модификаций аминокислот или аналогов, известных в данной области техники. Пригодные модификации включают, например, концевое ацетилирование, амидирование, метилирование и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения белки могут содержать природные аминокислоты, неприродные аминокислоты, синтетические аминокислоты и их комбинации. Термин "пептид", как правило, используется для обозначения полипептида, имеющего длину менее чем около 100 аминокислот, менее чем около 50 аминокислот, менее чем 20 аминокислот, или менее чем 10 аминокислот.

[73] Эталонный образец. В данном контексте эталонный образец может включать, но не ограничиваясь этим, любой или все из следующих элементов: клетку или клетки, часть ткани, кровь, сыворотку, асцитическую жидкость, мочу, слюну, а также другие жидкости организма, выделения или экскременты. Термин "образец" также включает любой материал, полученный в результате обработки такого образца. Производные образцы могут включать нуклеотидные молекулы или полипептиды, выделенные из образца или полученные путем воздействия на образец методами, такими как амплификация или обратная транскрипция мРНК и т.д.

[74] Ответ. В данном контексте термин "ответ на лечение" может относиться к любому благоприятному изменению в состоянии субъекта, которое происходит в результате лечения или коррелирует с ним. Такое изменение может включать стабилизацию состояния (например, предотвращение ухудшения, которое имело бы место при отсутствии лечения), облегчение симптомов состояния и/или оптимизацию возможностей лечения состояния и т.д. Это может относиться к ответу субъекта или ответу опухоли. Ответ опухоли или субъекта может быть измерен согласно широкому спектру критериев, включая клинические критерии и объективные критерии. Методы оценки ответа включают, но не ограничиваются этим, клиническое обследование, позитронно-эмиссионную томографию, рентгенологическую КТ грудной клетки, МРТ, ультразвуковое исследование, эндоскопию, лапароскопию, определение наличия или уровня опухолевых маркеров в образце, полученном от субъекта, цитологию и/или гистологическое исследование. С помощью многих из этих методов предпринимаются попытки определить размер опухоли или иным образом определить общую опухолевую массу. Способы и руководящие принципы оценки эффективности лечения обсуждаются в Therasse et. al., "New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors", European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada,, J. Natl. Cancer Inst., 2000, 92(3):205-216. Точные критерии ответа могут быть выбраны любым соответствующим способом при условии, что при сравнении групп опухолей и/или пациентов группы для сравнения будут оцениваться на основании аналогичных или сопоставимых критериев для определения уровня ответа. Обычный специалист в данной области техники сможет выбрать соответствующие критерии.

[75] Образец. В данном контексте образец, полученный от субъекта, может включать, но не ограничиваясь этим, любой или все из следующих элементов: клетку или клетки, часть ткани, кровь, сыворотку, асцитическую жидкость, мочу, слюну, а также другие жидкости организма, выделения или экскременты. Термин "образец" также включает любой материал, полученный в результате обработки такого образца. Производные образцы могут включать нуклеотидные молекулы или полипептиды, выделенные из образца или полученные путем воздействия на образец методами, такими как амплификация или обратная транскрипция мРНК и т.д.

[76] Специфическое связывание. В данном контексте термины "специфическое связывание" либо "специфический для" или "специфический к" относятся к взаимодействию (обычно нековалентному) между целевым объектом (например, белком-мишенью или полипептидом-мишенью) и связующим агентом (например, антителом, таким как предлагаемое антитело). Как будет понятно обычным специалистам, взаимодействие считается "специфическим", если оно имеет преимущество при наличии альтернативных взаимодействий. Во многих вариантах реализации изобретения взаимодействие, как правило, зависит от наличия определенного структурного элемента молекулы-мишени, такого как антигенная детерминанта или эпитоп, распознаваемые связывающей молекулой. Например, если антитело является специфическим для эпитопа А, наличие полипептида, содержащего эпитоп А, или наличие свободного немеченого А в реакционной смеси, содержащей как свободный меченый А, так и антитело к нему, уменьшит количество меченого А, который связывается с антителом. Следует понимать, что специфичность не должна быть абсолютной. Например, в данной области техники хорошо известно, что многочисленные антитела вступают в перекрестную реакцию с другими эпитопами в дополнение к тем, которые присутствуют в молекуле-мишени. Такая перекрестная реактивность может быть приемлемой в зависимости от применения, для которого настоящее антитело будет использоваться. В конкретных вариантах реализации изобретения антитело, специфическое для рецепторных тирозинкиназ, имеет менее чем 10% перекрестную реактивность с рецепторной тирозинкиназой, связанной с ингибиторам протеазы (например, ACT). Обычный специалист в данной области техники сможет выбрать антитела, обладающие достаточной степенью специфичности для надлежащего функционирования в каждом конкретном применении (например, для обнаружения молекулы-мишени, для терапевтических целей и т.д.). Специфичность может быть оценена в контексте дополнительных факторов, таких как аффинность связывания молекулы с молекулой-мишенью по сравнению с аффинностью связывания молекулы с другими мишенями (например, конкурентами). Если связывающая молекула проявляет высокую аффинность к молекуле-мишени, то желательным является обнаружение и низкой аффинности к не-

[77] Стадия рака. В данном контексте термин "стадия рака" относится к качественной или количественной оценке степени прогрессирования рака. Критерии, используемые для определения стадии рака, включают, но не ограничиваются ими, размер опухоли и степень метастазирования (например, локализованное или отдаленное).

[78] Субъект. В данном контексте термин "пациент" или "субъект" относится к любому организму, к которому варианты реализации настоящего изобретения могут быть применены или введены, например, в экспериментальных, диагностических, профилактических и/или терапевтических целях. Типичные субъекты представляют собой животных (например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, отличные от человека приматы и люди; насекомые; черви и т.д.).

[79] По существу. В данном контексте термин "по существу" относится к качественному состоянию проявления полного или практически полного объема или степени характеристики или свойства, представляющих интерес. Обычному специалисту в области биологии будет понятно, что биологические и химические явления редко, если это вообще случается, доходят до завершения и/или протекают полностью либо достигают или отклоняются от абсолютного результата. Следовательно, термин "по существу" в данном контексте направлен на то, чтобы охватить возможное отсутствие полноты, присущее многим биологическим и химическим явлениям.

[80] Страдающий от. У индивидуума, который "страдает от" заболевания, нарушения или состояния (например, рака), диагностировано заболевание, нарушение или состояние и/или проявляется один или более его симптомов. В некоторых вариантах реализации изобретения у индивидуума, который страдает от рака, есть рак, но нет проявлений каких-либо симптомов рака и/или рак не был диагностирован.

[81] Предрасположенный. У индивидуума, который "предрасположен к" заболеванию, нарушению или состоянию (например, раку), существует риск развития заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения у индивидуума, который предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию, нет проявлений каких-либо симптомов заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения у индивидуума, который предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию, не диагностировано заболевание, нарушение или состояние. В некоторых вариантах реализации изобретения индивидуум, который предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию, представляет собой индивидуума, у которого проявляются состояния, ассоциированные с развитием заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения риск развития заболевания, нарушения или состояния представляет собой риск популяционного уровня.

[82] Клетки-мишени или ткани-мишени. В данном контексте термины "клетка-мишень" или "ткань-мишень" относятся к любой клетке, ткани или организму, которые поражены состоянием, описанным в настоящем документе, и подлежат лечению, или любой клетке, ткани или организму, в которых экспрессируется белок, вовлеченный в состояние, описанное в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки-мишени, ткани-мишени или организмы-мишени включают те клетки, ткани или организмы, в которых присутствует обнаруживаемый уровень передачи сигналов и/или активности иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки-мишени, ткани-мишени или организмы-мишени включают те клетки, ткани или организмы, в которых проявляется патология, симптом или признак, ассоциированные с заболеванием.

[83] Терапевтический режим. В данном контексте термин "терапевтический режим" относится к любому способу, применяемому для частичного или полного облегчения, улучшения, ослабления, ингибирования, предотвращения, задержки развития, уменьшения тяжести и/или уменьшения частоты одного или более симптомов либо признаков определенного заболевания, нарушения и/или состояния. Термин может включать лечение или комплекс методов лечения, направленных на достижение определенного эффекта, например, уменьшение или устранение неблагоприятного состояния или заболевания, такого как рак. Лечение может включать введение одного или более соединений либо одновременно, последовательно, либо в разное время, на протяжении аналогичных или разных периодов времени. В альтернативном или дополнительном варианте лечение может включать воздействие радиацией, химиотерапевтическими агентами, гормональную терапию или хирургическую операцию. Кроме того, "схема лечения" может включать генетические методы, такие как генная терапия, генная абляция или другие методы, известные снижением экспрессии определенного гена или трансляции мРНК генного происхождения.

[84] Терапевтический агент. В данном контексте фраза "терапевтический агент" относится к любому агенту, который при введении субъекту оказывает терапевтический эффект и/или вызывает желаемый биологический и/или фармакологический эффект.

[85] Терапевтически эффективное количество. В данном контексте термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству агента (например, модулятору иммунной контрольной точки), который вызывает терапевтический эффект у субъекта, получающего лечение, при приемлемом соотношении польза/риск, применимом к любому медицинскому лечению. Терапевтический эффект может быть объективным (т.е. измеряемым определенным тестом или маркером) или субъективным (т.е. субъект указывает на эффект или чувствует его). В частности, термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству терапевтического агента или композиции, эффективному для лечения, облегчения или предотвращения целевого заболевания или состояния, либо для достижения определяемого терапевтического или профилактического эффекта, например, облегчения симптомов, ассоциированных с заболеванием, предотвращения или замедления развития заболевания и/или снижения тяжести либо частоты симптомов заболевания. Терапевтически эффективное количество обычно вводят согласно схеме применения, которая может включать множество разовых доз. Для любого конкретного терапевтического агента терапевтически эффективное количество (и/или соответствующая разовая доза в эффективной схеме применения) может варьироваться, например, в зависимости от пути введения, от комбинации с другими фармацевтическими агентами. Также конкретное терапевтически эффективное количество (и/или разовая доза) для любого конкретного пациента может зависеть от различных факторов, включая нарушение, подлежащее лечению, и тяжесть этого нарушения; активность конкретного применяемого фармацевтического агента; конкретную применяемую композицию; возраст, массу тела, состояние здоровья, пол и рацион питания субъекта; время введения, путь введения и/или скорость экскреции или метаболизма применяемого конкретного слитого белка; продолжительность лечения; и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.

[86] Лечение. В данном контексте термин "лечение" (также "лечить" или "обработка") относится к любому введению вещества (например, предлагаемой композиции), применяемому для частичного или полного облегчения, улучшения, ослабления, ингибирования, задержки развития, уменьшения тяжести и/или снижения частоты одного или более симптомов, признаков и/или причин определенного заболевания, нарушения и/или состояния (например, рака). Такое лечение может получать субъект, у которого нет признаков соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния, и/или субъект, у которого проявляются лишь ранние признаки заболевания, нарушения и/или состояния. В альтернативном или дополнительном варианте такое лечение может получать субъект, который имеет один или более установленных признаков соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения лечение может получать субъект, у которого было диагностировано соответствующее заболевание, нарушение и/или состояние. В некоторых вариантах реализации изобретения лечение может получать субъект, имеющий один или более факторов предрасположенности, которые статистически коррелирует с повышенным риском развития соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния.

[87] Дикий тип. В данном контексте термин "дикого типа" имеет свое иллюстративно-описательное значение, которое относится к элементу, имеющему структуру и/или активность, выявляемую в природе в "нормальном" (в отличие от мутантного, болезненного, измененного и т.д.) состоянии или контексте. Обычным специалистам в данной области техники понятно, что гены и полипептиды дикого типа часто существуют во множестве различных форм (например, аллелях).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НЕКОТОРЫХ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[88] Настоящее изобретение содержит открытие, что высокая мутационная нагрузка и соматические неоэпитопы, образованные в результате опухолевых мутаций, способствуют противоопухолевому иммунному ответу модуляторов иммунной контрольной точки.

[89] Кроме того, настоящее изобретение четко демонстрирует, что неоэпитопы в раковых клетках ассоциированы с повышенной аффинностью связывания с молекулами МНС класса I и/или улучшенным распознаванием цитотоксическими Т-клетками.

[90] Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются способы обнаружения соматических неоэпитопов, присутствующих в раковых клетках, и/или установления ассоциации между такими неоэпитопами и ответом на иммунотерапию. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы и/или реагенты для выявления пациентов с раком, которые могут положительно отвечать на иммунотерапевтическое лечение (например, с применением модулятора иммунной контрольной точки) и/или для отбора пациентов для получения такой иммунотерапии. В альтернативных или дополнительных вариантах реализации настоящего изобретения предлагаются способы и/или реагенты для лечения пациентов модулятором иммунной контрольной точки, которые были определены как имеющие рак, содержащий соматический неоэпитоп.

Соматические мутации

[91] Соматические мутации включают изменения ДНК в незародышевых клетках и обычно встречаются в раковых клетках. Обнаружено, что некоторые соматические мутации в раковых клетках приводят к экспрессии неоэпитопов, что в некоторых вариантах реализации изобретения изменяет распознавание фрагмента последовательности аминокислот со "своих" на "чужеродные". Согласно настоящему изобретению раковая клетка содержит "чужеродный" антиген, который может вызывать иммунный ответ, направленный против раковых клеток. Иммунные ответы против раковых клеток можно повысить при помощи модулятора иммунной контрольной точки. Настоящее изобретение демонстрирует, что раковые заболевания, экспрессирующие неоэпитопы, могут быть более чувствительны к терапии модулятором иммунной контрольной точки. Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются стратегии оптимизации терапии рака путем предоставления возможности выявления и/или выбора конкретных пациентов для получения терапии (или отказа от терапии). В настоящем изобретении также предлагаются методы для определения неоэпитопов или их комплексов, наличие которых служит показателем определенного клинического исхода, представляющего интерес (например, чувствительности к терапии, например, с применением конкретного модулятора иммунной контрольной точки, и/или риска развития определенного нежелательного побочного эффекта терапии). Настоящее изобретение определяет и/или допускает определение одного или более "профилей" неоэпитопов, ассоциированных с эффективным (или нежелательным) ответом на терапию модулятором иммунной контрольной точки.

[92] В некоторых вариантах реализации изобретения соматическая мутация приводит к формированию неоантигена или неоэпитопа. Кроме того, настоящее изобретение демонстрирует существование неоэпитопов, возникающих в результате соматической мутации, присутствие которых ассоциировано с определенным ответом на терапию модулятором иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитоп представляет собой или содержит тетрапептид, например, что способствует повышению аффинности связывания с молекулами МНС класса I и/или распознаванию клетками иммунной системы (т.е. Т-клетками) как "чужеродных". В некоторых конкретных вариантах реализации изобретения соматическая мутация включает неоэпитоп, содержащий тетрапептид согласно Таблице 1. В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитоп имеет общую консенсусную последовательность с антигеном из инфекционного агента.

[93] В некоторых вариантах реализации изобретения профиль неоэпитопа, представляющего интерес согласно настоящему изобретению, представляет собой или содержит неоэпитоп или их комплекс, присутствие которого в образце опухоли коррелирует с определенным клиническим исходом. Настоящее описание демонстрирует эффективное определение такого профиля неоэпитопа. В некоторых вариантах реализации изобретения пригодный профиль представляет собой или содержит один или более консенсусных тетрапептидных соматических неоэпитопов, приведенных в Таблице 1; в некоторых вариантах реализации изобретения пригодный профиль представляет собой или содержит один или более тетрапептидных соматических неоэпитопов, подчеркнутых в Таблице 2; в некоторых вариантах реализации изобретения пригодный профиль представляет собой или содержит один или более нонамерных пептидов, приведенных в Таблице 2. В некоторых вариантах реализации изобретения пригодный профиль представляет собой или содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 7-, 71, 72, 73, 74, 75 или более неоэпитопов. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются методы для определения и/или обнаружения профилей неоэпитопов, особенно тех, которые относятся к терапии с применением модулятора иммунной контрольной точки.

[94] Кроме того, настоящее изобретение демонстрирует определение неоэпитопов или профилей неоэпитопов, присутствие которых ассоциировано с определенным ответом или характеристикой ответа (например, восприимчивостью к терапии или риском побочного эффекта) на терапию модулятором иммунной контрольной точки. В конкретных Примерах, представленных в настоящем документе, такое определение достигается посредством сравнения информации о генетической последовательности из первого множества опухолевых образцов, при этом первое множество содержит образцы, которые имеют общие характеристики ответа на терапию модулятором иммунной контрольной точки, с полученной информацией из второго множества опухолевых образцов, при этом второе множество содержит образцы, которые не имеют общих характеристик ответа, но в остальном сопоставимы с таковыми из первого набора, вследствие чего сравнение определяет элементы генетической последовательности, присутствие которых ассоциировано или коррелирует с общей характеристикой ответа. Настоящее описание четко показывает, что повышение мутационной нагрузки может коррелировать с характеристикой ответа (например, с восприимчивостью к терапии), но также показывает, что такая повышенная мутационная нагрузка, взятая отдельно, не может быть полноценным фактором для прогнозирования характеристики ответа. Данное описание показывает, что, когда такая соматическая мутация генерирует неоэпитопы, может быть определен пригодный профиль неоэпитопа, ассоциированного с характеристикой ответа. В настоящем изобретении предлагаются конкретные методы для определения и использования таких профилей.

[95] В некоторых вариантах реализации изобретения раковая клетка, содержащая неоэпитоп, выбирается из карциномы, саркомы, меланомы, миеломы, лейкоза или лимфомы. В некоторых вариантах реализации изобретения раковая клетка, содержащая неоэпитоп, представляет собой меланому. В некоторых вариантах реализации изобретения раковая клетка, содержащая неоэпитоп, представляет собой немелкоклеточный рак легких.

Модуляция иммунных контрольных точек

Иммунные контрольные точки относятся к ингибирующих путям иммунной системы, которые ответственны за поддержание аутотолерантности и модуляции длительности и амплитуды физиологических иммунных реакций.

Некоторые раковые клетки извлекают выгоду из регуляторных путей иммунных контрольных точек как основного механизма иммунной резистентности, особенно в отношении Т-клеток, которые являются специфическими для опухолевых антигенов. Например, некоторые раковые клетки могут избыточно экспрессировать один или более белков иммунной контрольной точки, ответственных за ингибирование цитотоксического Т-клеточного ответа. Таким образом, модуляторы иммунных контрольных точек можно вводить для преодоления ингибирующих сигналов и обеспечения и/или усиления иммунной атаки на раковые клетки. Модуляторы иммунных контрольных точек могут способствовать иммунному клеточному ответу на раковые клетки путем снижения, ингибирования или устранения передачи сигналов с помощью отрицательных регуляторов иммунного ответа (например, CTLA 4) или могут стимулировать либо усиливать передачу сигналов положительных регуляторов иммунного ответа (например, CD28).

Иммунотерапевтические агенты, нацеленные на модуляторы иммунных контрольных точек, могут вводиться для стимуляции иммунной атаки на раковые клетки-мишени. Иммунотерапевтические агенты могут представлять собой или включать антительные агенты, которые нацелены на модуляторы иммунных контрольных точек (например, являются специфическими для них). Примеры иммунотерапевтических агентов включают антительные агенты, нацеленные на один или более элементов из: CTLA-4, PD-1, PD-L1, GITR, ОХ40, LAG-3, KIR, TIM-3, CD28, CD40 и CD137.

Конкретные примеры антительных агентов могут включать моноклональные антитела. Доступны определенные моноклональные антитела, нацеленные на модуляторы иммунных контрольных точек. Например, ипилумимаб нацелен на CTLA-4; тремелимумаб нацелен на CTLA-4; пембролизумаб нацелен на PD-1, и т.п.

Выявление неоэпитопов

[96] Раковые заболевания могут подвергаться скринингу для выявления неоэпитопов с использованием любого из множества известных методов. В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитопы или их экспрессия обнаруживаются на уровне нуклеиновой кислоты (например, в ДНК или РНК). В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитопы или их экспрессия обнаруживаются на уровне белка (например, в образце, содержащем полипептиды из раковых клеток, при этом образец может представлять собой или содержать полипептидные комплексы или другие структуры высшего порядка, включая, но не ограничиваясь этим, клетки, ткани или органы).

[97] В некоторых вариантах реализации изобретения один или более неоэпитопов обнаруживаются с помощью полноэкзомного секвенирования. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более неоэпитопов обнаруживаются с помощью иммунологического анализа. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более неоэпитопов обнаруживаются с помощью микроматричного анализа. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более неоэпитопов могут быть обнаружены с помощью массово-параллельного экзомного секвенирования. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более неоэпитопов могут быть обнаружены с помощью геномного секвенирования. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более неоэпитопов могут быть обнаружены с помощью РНК-секвенирования. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более неоэпитопов могут быть обнаружены с помощью стандартного ДНК- или РНК-секвенирования. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более неоэпитопов могут быть обнаружены с помощью масс-спектрометрии.

[98] В некоторых вариантах реализации изобретения один или более неоэпитопов могут быть обнаружены с помощью секвенирования нового поколения (ДНК и/или РНК). В некоторых вариантах реализации изобретения неоэпитопы нового поколения или их экспрессия могут быть обнаружены с помощью геномного секвенирования, геномного ресеквенирования, целевых секвенирующих панелей, транскриптомного профилирования (РНК-Seq), ДНК-белковых взаимодействий (ChIP-секвенирования) и/или определения эпигеномной характеристики. В некоторых вариантах реализации изобретения повторное секвенирование генома пациента может использоваться, например, для обнаружения геномных вариаций.

[99] В некоторых вариантах реализации изобретения один или более неоэпитопов могут быть обнаружены с помощью таких методов, как ELISA, Вестерн-блоттинг, иммунологический анализ, масс-спектрометрия, микроматричный анализ и т.д.

[100] Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же значение, которое обычно подразумевается обычным специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то, что на практике или при тестировании настоящего изобретения могут быть использованы способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, далее будут описаны пригодные способы и материалы.

Способы лечения

[101] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы выявления пациента с раком, который может положительно отвечать на лечение модулятором иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы выявления пациента с раком, который может положительно отвечать на лечение модулятором иммунной контрольной точки, и лечение пациента модулятором иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы лечения модулятором иммунной контрольной точки пациента с раком, который ранее был определен как способный положительно отвечать на лечение модулятором иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы выявления пациента с раком, положительный ответ на лечение у которого с применением модулятора иммунной контрольной точки маловероятен, и установление нецелесообразность лечения пациента модулятором иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы выявления пациента с раком, у которого может развиваться одно или более аутоиммунных осложнений при лечении модулятором иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются способы лечения иммуносупрессантами пациента с раком, у которого ранее была определена возможность развития одного или более аутоиммунных осложнений при лечении модулятором иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации изобретения иммуносупрессант вводят пациенту перед или одновременно с модулятором иммунной контрольной точки.

Введение модуляторов иммунных контрольных точек

[102] Согласно некоторым способам настоящего изобретения модулятор иммунной контрольной точки вводится или вводился индивидууму. В некоторых вариантах реализации изобретения лечение модулятором иммунной контрольной точки применяется в качестве монотерапии. В некоторых вариантах реализации изобретения лечение модулятором иммунной контрольной точки применяется в комбинации с одним или более дополнительными видами терапии.

[103] Обычным специалистам в данной области техники будет понятно, что соответствующие составы, показания и схемы применения, как правило, анализируются и утверждаются государственными регулирующими органами, такими как Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств в Соединенных Штатах. Например, Пример 5 представляет определенную утвержденную информацию относительно схемы применения ипилумимаба, анти-CTL-4 антитела. Во многих вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки вводят согласно настоящему изобретению в соответствии с таким утвержденным протоколом. Тем не менее, в данном описании предлагаются определенные методы для выявления, характеристики и/или выбора конкретных пациентов, которым целесообразно вводить модуляторы иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах реализации изобретения полученная информация, приведенная в настоящем описании, позволяет проводить дозирование данного модулятора иммунной контрольной точки с большей частотой и/или более высокими индивидуальными дозами (например, из-за пониженной чувствительности и/или частоты либо интенсивности нежелательных эффектов) относительно рекомендованных или утвержденных на основе популяционных исследований, которые включают как отдельных индивидуумов, определенных согласно настоящему описанию (например, экспрессирующих неоэпитопы), так и других индивидуумов. В некоторых вариантах реализации изобретения полученная информация, приведенная в настоящем описании, позволяет проводить дозирование данного модулятора иммунной контрольной точки с меньшей частотой и/или меньшими индивидуальными дозами (например, из-за повышенной чувствительности) относительно рекомендованных или утвержденных на основе популяционных исследований, которые включают как отдельных индивидуумов, определенных согласно настоящему описанию (например, экспрессирующих неоэпитопы), так и других индивидуумов.

[104] В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной системы вводят в виде фармацевтической композиции, которая также содержит физиологически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция является стерильной. Во многих вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция составлена для определенного способа введения.

[105] Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, воду, растворы солей (например, NaCl), солевой раствор, буферный солевой раствор, спирты, глицерин, этанол, гуммиарабик, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, желатин, углеводы, такие как лактоза, амилоза или крахмал, сахара, такие как маннит, сахароза или другие, декстроза, магния стеарат, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, парфюмерное масло, сложные эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.д., а также их комбинации. При необходимости фармацевтический препарат может включать один или более вспомогательных агентов (например, смазывающие вещества, консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, соли для влияния на осмотическое давление, буферы, окрашивающие, вкусовые и/или ароматические вещества и тому подобное), которые не оказывают отрицательного воздействия при реакции с активными соединениями или не препятствуют их активности. В некоторых вариантах реализации изобретения используется водорастворимый носитель, пригодный для внутривенного введения.

[106] В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция или лекарственный препарат, при необходимости, может содержать некоторое количество (как правило, незначительное количество) смачивающих или эмульгирующих агентов и/или pH-буферных агентов. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, таблетки, пилюли, капсулы, препарат с замедленным высвобождением или порошок. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде суппозитория с обычными связующими веществами и носителями, такими как триглицериды. Пероральные лекарственные формы могут включать стандартные носители, такие как фармацевтические категории маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, поливинилпирролидона, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.д.

[107] В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может быть приготовлена в соответствии с обычными процедурами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для введения человеку. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения композиция для внутривенного введения, как правило, представляет собой раствор в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости композиция может также включать солюбилизирующий агент и местный анестетик для уменьшения боли в месте инъекции. Как правило, ингредиенты поставляются либо раздельно, либо в смеси друг с другом в виде разовой лекарственной формы, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше с указанием количества активного агента. В случае, когда композиция предназначена для введения путем инфузии, она может быть разлита в инфузионный флакон, содержащий воду стерильной фармацевтической категории, солевой раствор или смесь декстроза/вода. В случае, когда композицию вводят путем инъекции, ампула со стерильной водой для инъекций или солевым раствором может предоставляться таким образом, что ингредиенты могут быть смешаны перед введением.

[108] В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки может быть представлен в нейтральной форме; в некоторых вариантах реализации изобретения он может быть представлен в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные со свободными аминогруппами, такими как, полученные при реакции с участием соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, образованные со свободными карбоксильными группами, такими как, полученные при реакции с участием гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламино этанола, гистидина, прокаина и т.д.

[109] Фармацевтические композиции, предназначенные для использования согласно настоящему изобретению, могут быть введены любым подходящим способом. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическую композицию вводят подкожно. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическую композицию вводят путем прямого введения в ткани-мишени, такие как сердце или мышцы (например, внутримышечно), или нервную систему (например, путем непосредственной инъекции в мозг; интравентрикулярно; интратекально). В некоторых альтернативных или дополнительных вариантах реализации изобретения фармацевтическую композицию вводят парентерально, трансдермально или через слизистую оболочку (например, перорально или интраназально). При необходимости одновременно может использоваться более чем один способ введения.

[110] Модуляторы иммунных контрольных точек (или композиции, или лекарственный препарат, содержащий модулятор иммунной контрольной точки) можно вводить отдельно или в сочетании с другими модуляторами иммунных контрольных точек. Термин "в сочетании с" указывает на то, что первый модулятор иммунной контрольной точки вводят до, приблизительно в одно и то же время или после другого модулятора иммунной контрольной точки. Например, первый модулятор иммунной контрольной точки может быть смешан в композиции, содержащей один или более различных модуляторов иммунных контрольных точек, и, таким образом, может вводиться одновременно; в альтернативном варианте агент можно вводить одновременно, без смешивания (например, путем "совмещенной" доставки агента на внутривенную линию, с помощью которой также вводят модулятор иммунной контрольной точки, или наоборот). В другом примере модулятор иммунной контрольной точки можно вводить отдельно (например, без смешивания), но в течение короткого промежутка времени (например, в пределах 24 часов) от введения модулятора иммунной контрольной точки.

[111] В некоторых вариантах реализации изобретения субъектам, получающим модуляторы иммунных контрольных точек, вводят один или более иммунодепрессантов. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более иммунодепрессантов вводят для уменьшения, ингибирования или предотвращения нежелательного аутоиммунного ответа (например, энтероколита, гепатита, дерматита (включая токсический эпидермальный некролиз), нейропатии и/или эндокринопатии), например, гипотиреоза. Типичные иммунодепрессанты включают стероиды, антитела, иммуноглобулиновые слитые белки и тому подобное. В некоторых вариантах реализации изобретения иммунодепрессант ингибирует активность В-клеток (например, ритуксимаб). В некоторых вариантах реализации изобретения иммунодепрессант представляет собой ложный полипептидный антиген.

[112] В некоторых вариантах реализации изобретения модуляторы иммунных контрольных точек (или композиция, или лекарственное средство, содержащее модуляторы иммунных контрольных точек) вводят в терапевтически эффективном количестве (например, в количестве дозы и/или в соответствии со схемой применения, которая, как было показано, при введении соответствующей популяции была достаточной для лечения рака, например, способствуя ослаблению симптомов, связанных с раком, предотвращению или замедлению развития рака, и/или также уменьшению тяжести либо частоты симптомов рака). В некоторых вариантах реализации изобретения долгосрочный клинический эффект наблюдается после лечения модуляторами иммунных контрольных точек, включая, например, блокаторы CTLA-4, такие как ипилумимаб или тремелимумуб и/или другие агенты. Обычным специалистам в данной области техники будет понятно, что доза, которая будет терапевтически эффективной для лечения рака у данного пациента, может зависеть, по меньшей мере до некоторой степени, от природы и степени рака и может быть определена с помощью стандартных клинических методов. В некоторых вариантах реализации изобретения для определения оптимальных диапазонов доз могут необязательно использоваться один или более анализов in vitro или in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения определенная доза, используемая для лечения конкретного индивидуума, может зависеть от способа введения, степени рака и/или одного или более других факторов, которые будут признаны значимыми по мнению лечащего врача с учетом состояния пациента. В некоторых вариантах реализации изобретения эффективные дозы могут быть экстраполированы от кривых зависимости «доза-эффект», полученных in vitro или из тестовых модельных систем на животных (например, как описано в U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, and Center for Drug Evaluation and Research in "Guidance for Industry: Estimating Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers", Pharmacology and Toxicology, July 2005.).

[113] В некоторых вариантах реализации изобретения терапевтически эффективное количество модулятора иммунной контрольной точки может составлять, например, более чем около 0,01 мг/кг, более чем около 0,05 мг/кг, более чем около 0,1 мг/кг, более чем около 0,5 мг/кг, более чем около 1,0 мг/кг, более чем около 1,5 мг/кг, более чем около 2,0 мг/кг, более чем около 2,5 мг/кг, более чем около 5,0 мг/кг, более чем около 7,5 мг/кг, более чем около 10 мг/кг, более чем около 12,5 мг/кг, более чем около 15 мг/кг, более чем около 17,5 мг/кг, более чем около 20 мг/кг, более чем около 22,5 мг/кг или более чем около 25 мг/кг веса тела. В некоторых вариантах реализации изобретения терапевтически эффективное количество может составлять около 0,01-25 мг/кг, около 0,01-20 мг/кг, около 0,01-15 мг/кг, около 0,01-10 мг/кг, около 0,01-7,5 мг/кг, около 0,01-5 мг/кг, около 0,01-4 мг/кг, около 0,01-3 мг/кг, около 0,01-2 мг/кг, около 0,01-1,5 мг/кг, около 0,01-1,0 мг/кг, около 0,01 -0,5 мг/кг, около 0,01-0,1 мг/кг, около 1-20 мг/кг, около 4-20 мг/кг, около 5-15 мг/кг, около 5-10 мг/кг веса тела. В некоторых вариантах реализации изобретения терапевтически эффективное количество составляет около 0,01 мг/кг, около 0,05 мг/кг, около 0,1 мг/кг, около 0,2 мг/кг, около 0,3 мг/кг, около 0,4 мг/кг, около 0,5 мг/кг, около 0,6 мг/кг, около 0,7 мг/кг, около 0,8 мг/кг, около 0,9 мг/кг, около 1,0 мг/кг, около 1,1 мг/кг, около 1,2 мг/кг, около 1,3 мг/кг, около 1,4 мг/кг, около 1,5 мг/кг, около 1,6 мг/кг, около 1,7 мг/кг, около 1,8 мг/кг, около 1,9 мг/кг, около 2,0 мг/кг, около 2,5 мг/кг, около 3,0 мг/кг, около 4,0 мг/кг, около 5,0 мг/кг, около 6,0 мг/кг, около 7,0 мг/кг, около 8,0 мг/кг, около 9,0 мг/кг, около 10,0 мг/кг, около 11,0 мг/кг, около 12,0 мг/кг, около 13,0 мг/кг, около 14,0 мг/кг, около 15,0 мг/кг, около 16,0 мг/кг, около 17,0 мг/кг, около 18,0 мг/кг, около 19,0 мг/кг, около 20,0 мг/кг веса тела или более. В некоторых вариантах реализации изобретения терапевтически эффективное количество составляет не более чем около 30 мг/кг, не более чем около 20 мг/кг, не более чем около 15 мг/кг, не более чем около 10 мг/кг, не более чем около 7,5 мг/кг, не более чем около 5 мг/кг, не более чем около 4 мг/кг, не более чем около 3 мг/кг, не более чем около 2 мг/кг, или не более чем около 1 мг/кг веса тела или меньше.

[114] В некоторых вариантах реализации изобретения вводимая доза для конкретного индивидуума изменяется (например, увеличивается или уменьшается) в динамике, в зависимости от потребностей индивидуума.

[115] В еще одном примере насыщающая доза (например, начальная более высокая доза) терапевтической композиции может быть введена в начале курса лечения с последующим введением уменьшенной поддерживающей дозы (например, последующей более низкой дозы) терапевтической композиции.

[116] Не желая быть связанными какой-либо теорией, предполагается, что насыщающая доза может очистить начальное, и в некоторых случаях массивное, накопление нежелательных веществ (например, жировых веществ и/или опухолевых клеток и т.д.) в тканях (например, в печени), а поддерживающие дозы могут отсрочить, уменьшить или предотвратить накопление жировых веществ после начального очищения.

[117] Следует принять во внимание, что количество насыщающей и поддерживающей дозы, интервалы и продолжительность лечения могут быть определены любым доступным способом, таким как проиллюстрированные в настоящем документе и известные в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения количество насыщающей дозы составляет около 0,01-1 мг/кг, около 0,01-5 мг/кг, около 0,01-10 мг/кг, около 0,1-10 мг/кг, около 0,1-20 мг/кг, около 0,1-25 мг/кг, около 0,1-30 мг/кг, около 0,1-5 мг/кг, около 0,1-2 мг/кг, около 0,1-1 мг/кг или около 0,1-0,5 мг/кг веса тела. В некоторых вариантах реализации изобретения количество поддерживающей дозы составляет около 0-10 мг/кг, около 0-5 мг/кг, около 0-2 мг/кг, около 0-1 мг/кг, около 0-0,5 мг/кг, около 0-0.4 мг/кг, около 0-0,3 мг/кг, около 0-0,2 мг/кг, около 0-0,1 мг/кг веса тела. В некоторых вариантах реализации изобретения насыщающую дозу вводят индивидууму через регулярные промежутки определенного периода времени (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более месяцев) и/или заданное количество доз (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 или более доз), за которыми следуют поддерживающие дозы. В некоторых вариантах реализации изобретения поддерживающая доза составляет от 0 до 2 мг/кг, около 0-1,5 мг/кг, около 0-1,0 мг/кг, около 0-0,75 мг/кг, около 0-0,5 мг/кг, около 0-0,4 мг/кг, около 0-0,3 мг/кг, около 0-0,2 мг/кг или около 0-0,1 мг/кг веса тела. В некоторых вариантах реализации изобретения поддерживающая доза составляет около 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8 или 2,0 мг/кг веса тела. В некоторых вариантах реализации изобретения поддерживающие дозы вводят в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более месяцев. В некоторых вариантах реализации изобретения поддерживающие дозы вводят в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более лет. В некоторых вариантах реализации изобретения поддерживающие дозы вводят неопределенный срок (например, пожизненно).

[118] Терапевтически эффективное количество модулятора иммунной контрольной точки можно вводить в виде одноразовой дозы или с интервалами, в зависимости от характера и степени рака, и на постоянной основе. В данном контексте термин "введение с интервалом" указывает на то, что терапевтически эффективное количество вводят периодически (в отличие от одноразовой дозы). Интервал может быть определен стандартными клиническими методами. В некоторых вариантах реализации изобретения модулятор иммунной контрольной точки вводят один раз в два месяца, ежемесячно, два раза в месяц, один раз в три недели, один раз в две недели, еженедельно, два раза в неделю, три раза в неделю или ежедневно. Интервал введения для одного индивидуума не должен быть фиксированным интервалом, но может изменяться в динамике, в зависимости от потребностей и степени улучшения состояния индивидуума.

[119] В данном контексте термин "один раз в два месяца" означает введение один раз в два месяца (то есть один раз каждые два месяца); термин "ежемесячно" означает введение один раз в месяц; термин "один раз в три недели" означает введение один раз в три недели (то есть один раз каждые три недели); термин "один раз в две недели" означает введение один раз в две недели (то есть один раз каждые две недели); термин "еженедельно" означает введение один раз в неделю; и термин "ежедневно" означает введение один раз в день.

[120] Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей модулятор иммунной контрольной точки, как описано в настоящем документе, в контейнере (например, флаконе, бутылке, пакете для внутривенного введения, шприце и т.д.) с этикеткой, содержащей инструкции по введению композиции для лечения рака.

ПРИМЕРЫ

[121] Следующие примеры приведены, с целью описания для специалистов с обычной квалификацией в данной области, как сделать и использовать способы и композиции согласно изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы считают своим изобретением.

Обзор

[122] Блокада иммунных контрольных точек представляет собой новую терапевтическую парадигму, в результате которой достигаются долгосрочные противоопухолевые эффекты у пациентов с метастатической меланомой, немелкоклеточным раком легкого и другими типами опухолей, но при этом факторы, определяющие ответ пациента на терапию, остаются неизученными.^1-5 Это один из наиболее важных нерешенных вопросов в области иммунотерапии рака. Полностью человеческие моноклональные антитела ипилимумаб и тремелимумаб блокируют цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4 (CTLA-4), что приводит к активации Т-клеток.^4,6 Пембролизумаб представляет собой препарат, который нацелен на рецептор запрограммированной гибели клетки 1 (PD-1) как средство для лечения метастатической меланомы. Ряд исследований установили корреляционные связи между результатами лечения ипилимумабом и количеством лимфоцитов периферической крови, антиген-специфическим иммунитетом, маркерами активации Т-клеток,^7,8 "воспалительной" микросредой^9-12 и содержанием клонотипов TCR высокой частоты.⁶⁹

[123] Однако неизвестно, определяет ли генетический профиль опухоли ответ на блокаду CTLA-4 (например, при лечении ипилимумабом). Предметом исследования была взаимосвязь между генетическим профилем опухоли, мутационной нагрузкой и эффективностью лечения. Иммуногенность в результате несинонимичных меланомных мутаций показана в модели мыши,¹³ а антигенное разнообразие меланомных опухолей человека моделировалось in silico.¹⁴ Для анти-CTLA-4 эффективности необходимы ослабление эффекторной и хелперной функции Т-клеток и истощение популяции регуляторных Т-клеток ^15-17, как и истощение популяции регуляторных Т-клеток¹⁸, в то же время никакой взаимосвязи между определенным типом HLA и клиническим эффектом не наблюдалось.²⁶ Меланомы имеют наибольшую мутационную нагрузку (от 0,5 до более чем 100 мутаций на мегабазу) из любых солидных опухолей.^19-20 Исследования показали, что соматические мутации могут привести к образованию неоэпитопов^21,22, которые могут служить в качестве неоантигенов в доклинических моделях и у пациентов.^23-25 Гипотеза о том, что ответ на ипилумумаб определяется геномом опухолевой клетки, является релевантной. Предыдущие исследования продемонстрировали отсутствие взаимосвязи между определенным типом HLA и ответом на ипилимумаб.²⁶ В этом исследовании изучается, определяет ли генетический профиль опухоли клинический ответ на блокаду CTLA-4 (например, при лечении агентами, такими как ипилимумаб или тремелимумаб).¹⁸

[124] Чтобы исследовать эту гипотезу, в группе изобретения мы провели полноэкзомное секвенирование ДНК из опухоли и соответствующей нормальной крови 25 пациентов, получавших лечение ипилимумабом (Таблица 3), после чего проанализировали дополнительно еще 39 опухолей в качестве валидации, пять из которых были пролечены тремелимумабом. Мы обнаружили, что более высокая мутационная нагрузка коррелировала с сильным клиническим эффектом от применения блокаторов CTLA-4 (например, при лечении ипилимумабом или тремелимумабом), но, взятая отдельно, не была полноценным фактором для его прогнозирования. Между тем, мутации в опухолях у пациентов с клиническим эффектом от применения блокаторов CTLA-4 включали совместные соматические неоэпитопы. В этом исследовании мы демонстрируем генетическую основу клинического ответа на ингибирование иммунной контрольной точки и определяем профиль неоэпитопов, лежащий в основе ответа на терапию.

[125] Специалистам в этой области техники при ознакомлении с настоящим описанием будет понятно, что конкретные примеры, которые включены в него, являются репрезентативными и не ограничивающими. Например, специалисты в данной области техники при анализе данных ответа на терапию ипилимумабом при меланоме, как это детально приводится ниже, представляют доказательства концепции и устанавливают, что с помощью профилей мутаций неоэпитопов можно прогнозировать ответ на применение модуляторов иммунных контрольных точек. Обычные специалисты в данной области техники при прочтении настоящего описания смогут оценить и понять, что указанный принцип широко применим при раке и в терапии модуляторами иммунных контрольных точек.

Пример 1. Мутационный профиль меланом у пациентов с различными клиническими эффектами от лечения ипилимумабом.

[126] Этот пример иллюстрирует анализ генетического профиля рака и демонстрирует его эффективность при определении соответствующих признаков пациентов, которые положительно или слабо отвечают на лечение модулятором иммунной контрольной точки. Пример детально иллюстрирует анализ пациентов с меланомой, получавших блокаторы CTLA-4 (например, ипилимумаб), и определяет типовые генетические характеристики у таких пациентов.

[127] Пациенты с меланомой, получавшие блокаторы CTLA-4, демонстрируют эффект улучшения общей выживаемости и различные ответы.^1,27-29 Исходные характеристики пациентов представлены в Таблице 3.

[128] В настоящее исследование были включены пациенты с долгосрочным клиническим эффектом или без него. В данном случае мы определяем долгосрочный клинический эффект, если (1) у пациентов рентгенологически не выявляется заболевание (NED) (при применении блокаторов CTLA-4 в качестве монотерапии или в комбинации с резекцией изолированного стабильного или не отвечающего на лечение поражения); либо (2) пациенты имеют признаки стабильного или уменьшенного в объеме патологического процесса в течение >6 месяцев. Мы определяем отсутствие клинического эффекта при наличии роста опухоли на каждой сканограмме после начала лечения (отсутствие эффекта или ответа), либо временного клинического эффекта или ответа длительностью <6 месяцев (минимальный эффект) (репрезентативные сканограммы, Фигура 1А-С и Фигуры 9А-С).

[129] Для определения генетического профиля ответа на блокаторы CTLA-4 мы проанализировали ДНК опухоли и соответствующей ДНК крови с помощью полноэкзомного секвенирования. В группе изобретения мы сгенерировали 6,4 ГБ отображенных последовательностей, с более чем 90% целевой последовательности, охваченной по меньшей мере глубиной 10Х и средним экзомным охватом 103Х (Фиг. 5). Результаты группы валидации изображены на Фигуре 15. Широкий диапазон мутационных нагрузок среди образцов (Фиг. 2А и 2В), повторные и драйверные мутации (Фиг. 6А и 6С) согласуются с данными литературы.^30-34

[130] В группах изобретения и валидации отмечалось аналогичное соотношение транзиций к трансверсиям (Фиг. 2С, 21), а также типы мутаций и нуклеотидные изменения (Фиг. 2D и Фиг. 6В и 6D).¹⁹ У всех респондеров (пациентов с ответом на лечение) или пациентов, у которых отмечался клинический эффект, ни один ген не был универсально мутированным. Мутации в известных повторных меланомных драйверных генах наблюдались в каждой группе (Фиг. 7А и 7В), а ответы регистрировались в меланомах с разнообразием драйверных мутаций.³⁵

Пример 2. Соматические неоэпитопы, ассоциированные с эффективностью лечения

[131] Этот пример демонстрирует, что соматические неоэпитопы ассоциируются с эффективностью лечения модулятором иммунной контрольной точки, и, кроме того, определяет профиль неоэпитопа, связанного с ответом на определенный типичный модулятор (т.е. ипилимумаб).

[132] Показатель мутационной нагрузки коррелирует с клиническим эффектом, но, взятый отдельно, является недостаточным для прогнозирования исхода.

[133] Мы предположили, что увеличение мутационной нагрузки в метастатических меланомных образцах, возможно, коррелирует с ответом на блокаду CTLA-4 (например, при лечении такими агентами, как ипилимумаб, тремелимумаб и т.д.). В группе изобретения отмечалось достоверное различие в мутационной нагрузке между пациентами с долгосрочным клиническим эффектом (LB) и пациентами с минимальным клиническим эффектом или его отсутствием (NB) при применении блокаторов CTLA-4 (Фиг. 2В, критерий Манна-Уитни, p=0,013), а также в группе валидации (Фиг. 7С и 7D, критерий Манна-Уитни, p=0,009). В группе изобретения мутационная нагрузка коррелировала с повышением общей выживаемости (Фиг. 2Е, логранговый критерий, p=0,041) и имела тенденцию к повышению выживаемости в группе валидации (Фиг. 2Е и Фиг. 2Н). Последняя группа включала восемь не отвечающих на лечение опухолей, резецированных от пациентов, которые достигли системного контроля над заболеванием иным способом, что может искажать результаты анализа взаимосвязи между мутационной нагрузкой и выживаемостью. Дополнительное деление на четыре клинические категории является признаком дозозависимого эффекта в группе изобретения (Фиг. 7Е). Эти данные указывают на то, что высокая мутационная нагрузка коррелирует с клиническим эффектом от блокаторов CTLA-4 (например, ипилимумаба), но, взятая отдельно, не является достаточным фактором для прогнозирования клинического ответа, так как есть опухоли с высокой мутационной нагрузкой, которые не отвечали на лечение.

[134] Соматические неоэпитопы, характерные для опухолевого ответа, ассоциируются с анти-CTLA-4 эффективностью.

[135] Представление МНС класса I и распознавание цитотоксическими Т-клетками необходимы для активности ипилимумаба.¹⁵ Поскольку мутационная нагрузка, взятая как отдельный фактор, не объясняет клинический ответ на ипилимумаб, мы предположили, что различный терапевтический ответ можно прогнозировать наличием специфических опухолевых неоантигенов. Для идентификации таких неоэпитопов был разработан соответствующий последним научным достижениям биоинформативный алгоритм включающий прогнозирование связывания молекул МНС класса I, моделирования связывания Т-клеточного рецептора, анализа типа HLA, индивидуального для каждого пациента, и гомологии эпитопов (Фиг. 8 и Способы).

[136] Представление опухолевого антигена молекулами МНС класса I имеет решающее значение для распознавания Т-клетками.^36,37 Мы создали вычислительный алгоритм для перевода всех несинонимичных миссенс-мутаций в мутантные пептиды и пептиды дикого типа (NASeek, Способы и Фиг. 8). Мы исследовали, приведет ли подмножество соматических неоэпитопов к изменению силы связывания пептида с молекулами МНС с использованием типов HLA, индивидуальных для каждого пациента. Вначале мы сравнили общую антигенную тенденцию всех мутантных пептидов с пептидами дикого типа. Интересно, что в совокупности мутантные пептиды предположительно связывали МНС класса I с более высокой аффинностью, чем соответствующие пептиды дикого типа (Фиг. 10А и 10В, Фиг. 10F и 10G).

[137] Используя только пептидные последовательности, предположительно связывающиеся с МНС класса I (IC 50≤500 нМ), мы искали консервативные фрагменты последовательности аминокислот, общие для множества опухолей, сосредоточив внимание на тетрапептидах. Они используются в моделировании филогении генома, поскольку относительно редко выявляются в белках и, как правило, отражают функцию.³⁸ Для идентификации консенсусных последовательностей мы использовали стандартное машинное изучение, иерархическую кластеризацию и анализ происхождения профилей. Мы определили ряд тетрапептидных последовательностей, общих для ответивших на терапию пациентов, но полностью отсутствующих у не ответивших. (Фиг. 3А и 3В). В недавно опубликованной очень значимой статье было продемонстрировано, что короткие аминокислотные подпоследовательности содержат консервативные области на всех антигенах, распознаваемых Т-клеточным рецептором (TCR).³⁹ Распознавание эпитопов рецепторами TCR стимулировалось консенсусными тетрапептидами, при этом тетрапептиды в пределах перекрестно реагирующих эпитопов TCR были необходимы и пригодны для стимуляции антигенности и пролиферации Т-клеток. Существуют убедительные доказательства того, что такая длина полипептида достаточна для стимуляции распознавания рецепторами TCR.^40-42

[138] Тетрапептиды могут формировать ядро нонапептидов, представляемых молекулами МНС класса I Т-клеткам, или могут быть расположены латерально.⁴³ Тетрапептиды используются в моделировании филогении генома, поскольку относительно редко выявляются в белках и, как правило, отражают функцию. Мы работали с группой изобретения для создания прогностического профиля представляющих интерес неоэпитопов. Тетрапептиды, общие для каждой группы (представляющие интерес неоэпитопы), включали 101 тетрапептид, общий исключительно для пациентов с клиническим эффектом в группе изобретения. Этот факт также независимо наблюдался в группе валидации (Фиг. 3А, 3В, 3Е и 3F и Фиг. 12). Эта группа определяет профиль неоэпитопов, ассоциированных с ответом на блокаду CTLA-4 (например, при лечении ипилимумабом) (Фиг. 3А и 3В, красная линия), что имело высокую статистическую значимость (p<0,001, точный критерий Фишера).

[139] Важно отметить, что общие для всех тетрапептидные неоэпитопы не всегда возникали в результате более высокой мутационной нагрузки. Например, пациент NB ("нереспондер") из группы изобретения с наибольшим числом мутаций (SD 7357 с 1028 мутациями) не имел какого-либо общего для всех тетрапептидного профиля (Фиг. 3А). Эта концепция была повторно продемонстрирована в группе валидации, в которой опухоли даже более чем с 1000 мутациями (NR9521 и NR4631) не отвечали на терапию (Фиг. 3В и Фиг. 7С). Анализ моделирования с использованием пяти различных моделей показал, что наш профиль имел высокую статистическую значимость и, взятый отдельно, с малой вероятностью определялся бы случайно (p<0,001 для способов a-d и р+0,002 для способа е) (Фиг. 12). Высокая мутационная нагрузка была связана с увеличением вероятности, но не гарантировала образование неоэпитопов, ассоциированных с клиническим эффектом. Консенсусный анализ показал, что неоэпитопы не были случайными. Частоты аминокислот, которые составляют тетрапептиды в группе с клиническим эффектом, отличались от тех, которые наблюдались в группе без клинического эффекта (Фиг. 10С, 10D, 101 и 10J).

[140] Профили неоэпитопов, полученные из группы изобретения, строго коррелировали с выживаемостью в группе валидации (Фиг. 3С и 3D, p<0,0001)_ и были более эффективными в распозновании результата, чем мутационная нагрузка (Фиг. 2D, 2В, 2Е, 2Н). Мы проанализировали независимую группу пациентов с меланомой, получавших ипилимумаб (n=15), имея их опухолевые ткани, соответствующую кровь и профили, валидированные в этом независимом множестве (Фиг. 3D).

[141] Эти тетрапептиды были кодированы с помощью мутаций в различных генах по всему геному (Фиг. 4А, Фиг. 14, Фигура 19 и Таблица 4). Используя данные RNASeq из Геномного атласа рака (TCGA), мы подтвердили, что гены, несущие наши соматические неоэпитопы, широко экспрессируются в меланоме. В некоторых случаях изменение аминокислоты в результате соматической мутации приводило к изменению самого тетрапептида. В других случаях мутантная аминокислотабыла независима от тетрапептида и измененного связывания МНС, как было описано.^38,40,44-46

Кроме того, представляющие интерес неоэпитопы, общие для каждой клинической группы, были проанализированы с использованием базы данных иммунных эпитопов (IEDB). Эта наиболее полная база данных экспериментально подтвержденных, опубликованных и отобранных антигенов использовалась для разработки алгоритмов идентификации антигенов с высокой точностью.²³ Мы обнаружили, что представляющие интерес неоэпитопы, общие для пациентов с клиническим эффектом, соответствовали гораздо большему количеству вирусных и бактериальных антигенов в IEDB по сравнению с другими клиническими группами (Фиг. 10E, Фиг. 10K).

[142] Например, анализ, представленный в Таблице 5 и на Фигуре 21, демонстрирует, что тетрапептидная подпоследовательность ESSA является общей для пациентов, имеющих клинический эффект (см. также Фиг. 4F), и соответствует немедленно-раннему эпитопу цитомегаловируса человека (MESSAKRKMDPDNPD). Кроме того, тетрапептидная подпоследовательность LL KK может быть общей для пациентов из группы LB; эта подпоследовательность соответствует определенной антигенной части гранулярного антигена Toxoplasma gondii (RSFKDLLKK, Фиг. 4В).^47,48 Эти данные свидетельствуют о том, что неоэпитопы у пациентов с сильным клиническим эффектом от блокады CTLA-4 (например, пациенты с сильным ответом на ипилимумаб и тремелимумаб) могут напоминать эпитопы из патогенных организмов, распознавать которые направлены Т-клетки.

[143] Используя метод полноэкзомного секвенирования, мы охарактеризовали все прогнозируемое антигенное пептидное пространство (см. Способы). Для дополнительного валидации нашего исследования мы "заново открыли" антиген меланомы, распознаваемый Т-клетками (MART-1, также известный как MelanA), экспериментально подтвержденный меланоцитарный антиген (Фиг. 10F).^37,49-51 EKLS, общий для полных и долгосрочных "респондеров", включает центральные аминокислоты эпитопа MART-1 МНС класса II и фосфо-сериновый фрагмент, имеющий важное значение для распознавания Т-клеточным рецептором (TCR).^51,52

Пример 3. Анализ иммуногенных пептидов in vitro

[144] Этот пример демонстрирует валидацию иммуногенных пептидов in vitro.

[145] Перевод секвенирования нового поколения в валидацию пептидных прогнозирований in vitro оказался непростым заданием даже для специалистов, с очень низким опубликованным коэффициентом валидаций.²⁴ Анализы in vitro затруднены вследствие недостаточности материала от пациента, чувствительности сохраненных клеток к процессу замораживания/оттаивания, низкой частоты выявления анти-неоантигенных Т-клеток в материале от пациента и очень низкой чувствительности Т-клеток in vitro в отсутствие комплекса иммуногенной микросреды in vivo.

[146] С помощью нашей системы мы попытались оптимизировать прогнозирование за счет интеграции нескольких подходов с высокой пропускной способностью (Фиг. 8). На основании нашего алгоритма прогнозирования мы сгенерировали пулы пептидов и проводили анализы активации Т-клеток у пациентов, имевших достаточное количество лимфоцитов (см. Способы). Положительные пулы наблюдались у 3 из 5 пациентов (Фиг. 11А-С). Мы идентифицировали точные пептиды для пациентов с нормальными характеристиками мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Мы обнаружили полифункциональный Т-клеточный ответ на пептид TESPFEQHI у пациента CR9306 (Фиг. 4С) по сравнению с его аналогом дикого типа TKSPFEQHI. Этот ответ достигал максимума на 60 неделе после начала лечения (Фиг. 4D). У здоровых доноров Т-клеточные ответы не регистрировались (Фиг. 13). Этот пептид имел прогностическую аффинность МНС класса I для В4402 равную 472 нМ по сравнению с 18323 нМ для TKSPFEQHI. ESPF является распространенным тетрапептидом, обнаруживаемым в профиле ответа, и представляв собой подпоследовательность (положения 176-179) эпитопа р27 большого вируса гепатита D дельта (PESPFA и ESPFAR).^53,54 TESPFEQHI происходит от мутации в FAM3C (c.A577G; p.K193E), при этом ген в высокой степени экспрессируется в меланоме.

[147] Мы также обнаружили, что пептид GLEREGFTF вызывал полифункциональный Т-клеточный ответ у пациента CR0095 (Фиг. 4Е и Фиг. 11D) по сравнению с диким типом GLERGGFTF. Этот ответ достигал максимума на 24 неделе после лечения (Фиг. 4Е). GLEREGFTF возникает из-за мутации в CSMD1 (c.G10337A; p.G3446E), который также экспрессируется в высокой степени в меланоме и имеет 80% гомологии с известным антигеном Burkholderhia pseudomallei (номер ссылки IEDB: 1027043). Важно отметить, что отсутствие Т-клеточной активации не может исключать данного неоантигена, поскольку все анализы in vitro имеют ограниченную чувствительность, как описано выше.

Пример 4. Материалы и способы для Примеров 1-3

[148] В данном примере представлены подробные материалы и способы для работы, описанной в настоящем документе в примерах 1-3.

[149] Мы получали опухолевую ткань от пациентов с меланомой, которые лечились ипилимумабом. Эти образцы были от пациентов, получавших лечение ипилимумабом, у которых определяли долгосрочный клинический эффект (LB) или минимальный клинический эффект/отсутствие эффекта (NB). Полноэкзомное секвенирование проводили на этих опухолях и соответствующих нормальных образцах крови. Соматические мутации и представляющие интерес соматические неоантигены, полученные из этих мутаций, были идентифицированы и охарактеризованы.

Данные пациентов

[150] Карты были рассмотрены независимо двумя исследователями для определения клинической подгруппы и других параметров групп изобретения и валидации. Общая выживаемость рассчитывалась как разница между датой смерти или исключения и первой дозой анти-CTLA4 терапии (ипилимумаб в группе изобретения или ипилимумаб или тремелимумаб в группе валидации). Все пациенты в группе изобретения имели IV стадию меланомы и получали лечение в период между 2006 и 2012 годом; образцы собирали в период между 2007 и 2012 годом. Пациенты в группе валидации получали лечение в период между 2006 и 2013 годом; образцы собирали в период между 2005 и 2013 годом. Пациенты либо получали коммерческий ипилимумаб (Yervoy), либо участвовали в клинических исследованиях, включая NCT00796991, NCT00495066, NCT00920907, NCT00324155, NCT00162123, NCT0140045, NCT00289640; NCT00495066, NCT00636168, NCT01515189, NCT00086489 и NCT00471887. Пациенты получали различные дозы и схемы ипилимумаба: 3 или 10 мг/кг, а 2 пациента дополнительно получали дакарбазин или вемурафебин (см. Фигуру 17). Четыре пациента в группе валидации получали тремелимумаб в дозе 10 мг/кг × 6 (1 пациент) или 15 мг/кг × 4 (3 пациента). Трое из этих 4 пациентов имели заболевание в стадии IIIC; у всех остальных включенных пациентов была стадия М1а-с. В исследование включались пациенты, которые имели ДНК, выделенную из замороженной ткани для анализа, получили по меньшей мере 2 дозы ипилимумаба и имели одну рентгенографическую оценку по меньшей мере через 12 недель после первого лечения. Два пациента в группе LB имели изолированное поражение, резецированное в целях выздоровления пациентов. Одно прогрессирующее поражение (CR7623) секвенировали в обучающем множестве. В группе валидации 8 опухолей представляют собой поражения у пациентов, не отвечающих на лечение, которые в других отношениях имели долгосрочный клинический эффект. Они включают CRNR4941, LSDNR1650, CRNR2472, LSDNR1120, CRNR0244, LSDNR9298, LSDNR3086 и PR03803. Все опухоли, которые прогрессировали, подвергаются молекулярному анализу как опухоли "без клинического эффекта".

[151] Данные пациентов, полученные в исследовании, были собраны в серии таблиц, детализирующих следующее: клинические характеристики пациентов в группе валидации; подробные клинические характеристики пациентов в группе изобретения; перечень мутаций в группе изобретения; локусы, для которых прогностический пептид, возникающий вследствие мутации, имеет аффинность связывания менее 500 нм по NetMHCv3.4; TCGA RNASeq для профиля; контекст, гены и локусы для тетрапептидов в профиле ответа; перечень мутаций в группе валидации; типы HLA в группе изобретения и группе валидации; и локализация, размер и тип образца.

Выделение ДНК и полноэкзомное секвенирование

[152] Первичные образцы опухоли и соответствующие нормальные образцы (периферической крови) были получены после письменного информированного согласия в соответствии с утвержденными протоколами экспертного совета организации (IRB). Все образцы получены путем эксцизионной биопсии или резекции четко видимых повреждений. Все образцы характеризовались высокой насыщенностью опухолевых клеток. Образцы быстро замораживали в жидком азоте после хирургической резекции или биопсии и хранили при -80°С. Готовили срезы, окрашенные гематоксилином и эозином; диагноз подтверждал врач-дерматопатолог. ДНК экстрагировали с использованием мини-набора QIAamp DNA и мини-набора QIAamp DNA blood (Qiagen).

[153] Экзонный захват осуществляли с использованием набора SureSelect Human All Exon 50MB (Agilent). Обогащенные бибилиотеки экзомов секвенировали на платформе HiSeq 2000 (Illumina) до >100Х охвата (MSKCC Genomics Core and Broad Institute, Кембридж, Массачусетс). Осуществляли выравнивание, рекалибровку исходного показателя качества и удаление дублирующего считывания; исключали зародышевые варианты; аннотировали мутации и оценивали вставки/делеции, как описано ранее (Фиг. 9А).⁷⁰ Образцы с охватом опухоли ≤10Х были исключены. Средне-достоверные считывания (11-34Х) анализировали вручную с помощью интегрированного устройства визуального просмотра геномики (IGV) v2.1.⁷¹ Коэффициент валидации для секвенирования представляющих интерес мутаций составил 97% для охвата 10Х и выше.⁷⁰ Сравнение среднего количества мутаций между клиническими группами проводили с использованием критерия Фишера.

[154] Экспрессию генов TCGA RNASeq нормировали с помощью RSEM и рассчитывали среднюю экспрессию для опухолей, экспрессирующих этот ген (см. Фигуру 18).

Типирование HLA

[155] Типирование HLA проводили в лаборатории типирования MSKCC HLA или в Центре крови Нью-Йорка, используя либо метод полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфическими праймерами (PCR-SSP) от низкой до средней разрешающей способности, либо метод типирования на основе последовательности SeCore HLA с высокой разрешающей способностью (HLA-SBT) (Invitrogen). Для типирования и подтверждения HLA также использовали ATHLATES (http://www.braodinstitute.org/scientific-community/science/projects/viral-genomics/athlates)⁷².

Анализ иммуногенности

[156] Был создан биоинформатический инструмент, названный NAseek. Эта программа выполняет две функции: трансляция последовательностей, окружающих каждую мутацию, и сравнение полученных пептидов на предмет гомологии. Во-первых, NAseek транслировал все мутации в экзомах таким образом, что образовывались последовательности 17 аминокислот для предсказанного дикого типа и мутанта, с аминокислотой, полученной в результате мутации, расположенной по центру. Для оценки связывания МНС класса 1, нонамеры дикого типа и мутантные нонамеры, содержащие тетрапептиды, общие для полных "респондеров", вводили в NetMHC v3.4 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) или RANKPEP (http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html) для типов HLA, индивидуальных для каждого пациента, с использованием метода скользящего окна. Мы использовали метод скользящего окна, а также расположение измененных аминокислот в нонапептидах. Эти программы генерировали прогнозированную силу связывания МНС I класса. Нонамеры, которые прогнозируемо будут представлены индивидуальными для каждого пациента молекулами МНС класса I, затем оценивали на предмет сходства друг с другом. Логотипную карту аминокислотных частот разрабатывали с использованием Weblogo (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi) с параметрами по умолчанию. Высота букв отражает относительную частоту соответствующей аминокислоты в этом положении. Для того, чтобы дополнительно сократить перечень до прогностических нонамеров для тестирования in vitro, нонамеры также оценивали на предполагаемое связывание с Т-клеточным рецептором с использованием предиктора иммуногенности IEDB с индивидуальными для каждого пациента типами HLA (http://tools.immuneepitope.org/immunogenicity/) или CTLPred (http://www.imtech.res.in/raghava/ctlpred/).

[157] Для оценки Т-клеточной активации и гомологии с антигенами известных патогенов, сохраненные тетрапептиды анализировали с помощью базы данных иммунных эпитопов (www.iedb.org) и оценивали как субпоследовательности иммуногенов в базе данных на предмет положительного Т-клеточного ответа в хозяине Homo sapiens. Мы исключили пептиды с непрогнозируемым Т-клеточным ответом или обладающие исключительно чужеродными или аллергенными свойствами. "Профили неоантигенов" генерировали из нонамеров, содержащих пептиды, общие для пациентов с долгосрочным клиническим эффектом (см. Таблицу 4 и Фигуру 19). Для сравнения суммарного количества общих тетрапептидов в группе LB с группой NB использовали критерий хи-квадрат. Стандартные способы вывода профиля с использованием бесконтрольной иерархической кластеризации с последующей логистической регрессией использовали для определения прогностических моделей, основанных только на данных группы изобретения. Модели были основаны на непоколебимом правиле, что все тетрапептиды должны определяться по меньшей мере дважды в группе изобретения и любой тетрапептид, определяющийся менее трех раз, должен содержать общую подпоследовательность известного антигена, продемонстрированного in vitro, для активации Т-клеточного ответа. Лучшее соответствие профилей затем применяли к группе валидации.

[158] Мы провели тщательный анализ модели/пермутации, чтобы продемонстрировать, что неоантигенный профиль с очень малой вероятностью является результатом случайности. Для оценки нулевой гипотезы о том, что профиль определялся из-за случайности, проанализировали 5 различных имитационных моделей, три с новыми наборами данных и два с использованием пермутаций нашего набора данных. Моделирование выполняли с использованием (a) нонамеров, взятых из базы данных SwissProt, (b) мутаций из набора данных меланомы TCGA, (c) случайно сгенерированных нонамеров, (d) перераспределения мутаций, обнаруженных в наших данных, и (e) переупорядочения 9 аминокислот в пределах каждого нонамера, которые прогнозируемо должны быть представлены в нашем наборе данных. В каждой модели нонамеры были распределены случайным образом и пропорционально нашим данным (например, если реальный образец содержал 150 нонамеров, которые прогнозируемо должны связывать МНС класса I, то "виртуальный" образец составлял 150 нонамеров). Затем проводили анализ моделирования с применением той же итеративной модели, что и для фактических показателей, применяемых для этого виртуального набора данных, с повторением данного процесса 1000 раз и записью частоты профилей большей по сравнению с фактическим профилем, с целью определения значения p. Значение p рассчитывали как долю итераций с профилями больше, чем правильно классифицированные сегрегации клинических групп, разделенных на 1000 итераций.

[159] Внутриклеточное цитокиновое окрашивание (ICS)

[160] Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) от 5 пациентов с меланомой, получавших ипилимумаб, собирали в различные моменты времени согласно организационным протоколам, утвержденным IRB. Для этих пациентов синтезировали представляющие интерес неоантигенные пептиды, идентифицированные с помощью полноэкзомного/транскриптомного анализа (GenScript, Пискатауэй, Нью-Джерси). 2,5×10⁶ образцов РВМС, взятых у пациентов, культивировали с 2,5×10⁶ облученных аутологичных РВМС, активированных пулами, содержащими от 30 до 50 пептидов на пул в среде RPMI 1640 с 10% пулом человеческой сыворотки (PHS), дополненной цитокинами IL-15 (10 нг/мл) и IL-2 (10 МЕ/мл). Среду меняли каждый день, и на день 10 собирали клетки.⁷³ Клетки стимулировали добавлением неоантигенных пептидов в присутствии Брефелдина А и Монензина (BD Bioscience) в течение 6 часов. Затем клетки окрашивали следующими антителами: Pacific Blue-CD3 (клон OKT3), APC-AF750-CD8 (клон SK1, eBioscience) и ECD-CD4 (клон SFC12T4D11, Beckman Coulter). После последующего промывания и пермеабилизации клетки окрашивали следующими антителами: PE-Cy5-CD107a (клон Н4А3), APC-IL-2 (клон MQ1-17H12), PE-MIP-1β (клон D21-1351), FITC-ИФН-γ (клон В27) (BD Pharmingen) и РЕ-Cy7-ФНО-α (клон МАВ11 eBioscience). Данные были получены с помощью проточного цитометра CYAN и программного обеспечения Summit (Dako Cytomation California Inc., Карпинтерия, Калифорния). Анализ потока проводили с использованием программного обеспечения FlowJo v9.7.5 (TreeStar, Inc.). При возможности пулы, которые приводили к индукции цитокинового ответа по сравнению с контролем без стимуляции, деконволюировали на составляющие их отдельные пептиды. Вышеуказанный процесс повторяли для отдельных пептидов и сравнивали с соответствующим прогностическим нонамером дикого типа. Стафилококковый энтеротоксин В (SEB) служил в качестве положительного контроля для Т-клеточных ответов.

[161] Иммуногистохимия

[162] Микропрепараты, окрашенные иммуногистохимически и гематоксилином и эозином, сканировали с использованием сканера для микропрепаратов Aperio. После идентификации всех некротических областей, содержащихся в микропрепарате, с помощью программного обеспечения для визуализации Aperio определяли процент опухолевого некроза. Иммуноокрашенные микропрепараты количественно анализировались врачом-дерматопатологом вслепую с использованием алгоритмов визуализационного анализа Aperio (ядерного и цитоплазматического v9), вручную калибровались и верифицировались для каждого конкретного случая. Насчитывали минимум 3000 клеток на каждый случай, представляя сумму трех репрезентативных областей с результатами, регистрируемыми как количество иммуноокрашенных положительных клеток на общее количество клеток, подсчитанных с учетом клеток, ограниченных участками опухоли. Срезы окрашивали следующими антителами: LCA (1 нг/мкл, DAKO, Clone2B11 + PD7/26), CD8 (0,5 нг/мкл, DAKO, Clone С8/144В) и Foxp3 (2,5 нг/мкл, Abcam, Clone 236А/Е7).

[163] Статистические методы

[164] Для сравнения несинонимичной экзонной мутационной нагрузки между клиническими группами (LB и NB в группе изобретения и группе валидации соответственно) использовали тест Манна-Уитни. Для сравнения кривых Каплана-Мейера для общей выживаемости в группе изобретения и группе валидации использовали логранговый критерий. Как было описано выше, анализ моделирования проводили с нулевой гипотезой о том, что все тетрапептиды в равной мере участвуют в развитии клинического эффекта, с целью определения, является ли обнаруженный нами профиль размера случайностью.

Пример 5. Лечение ипилумимабом

[165] В этом примере приведены рекомендации по лечению рака (меланомы) иммунотерапевтическими антителами (ипилумимаб), утвержденные Управлением по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств Соединенных Штатов для лечения метастатической меланомы. В некоторых вариантах реализации изобретения долгосрочный клинический эффект наблюдается после лечения ипилимумабом. Согласно настоящему изобретению, изложенный в данном примере протокол в некоторых вариантах реализации изобретения может быть пригодным для применения одному или более субъектам, которые идентифицированы как имеющие соматическую мутацию.

[166] YERVOY™ (ипилимумаб) Раствор для инъекций, для внутривенной инфузии, Первичное одобрение в США: 2011 год.

[167] ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: ИММУНООПОСРЕДОВАННЫЕ НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ

[168] См. полную инструкцию по медицинскому применению препарата для детального ознакомления с особым предупреждением.

[169] YERVOY может привести к серьезным и смертельным иммуноопосредованным нежелательным реакциям за счет активации и пролиферации Т-клеток. Эти иммуноопосредованные реакции могут затрагивать любую систему; однако наиболее распространенные тяжелые иммуноопосредованные нежелательные реакции - это энтероколит, гепатит, дерматит (включая токсический эпидермальный некролиз), нейропатия и эндокринопатия. Большинство этих иммуноопосредованных реакций первоначально проявлялись во время лечения; однако меньшее количество возникало по истечении от нескольких недель до нескольких месяцев после прекращения лечения препаратом YERVOY.

[170] Окончательно прекратите лечение YERVOY и начните системное введение высоких доз кортикостероидов для купирования тяжелых иммуноопосредованных реакций. (2.2)

[171] Оценивайте пациентов на наличие признаков и симптомов энтероколита, дерматита, нейропатии и эндокринопатии и анализируйте данные биохимического исследования, включая функциональные показатели печени и щитовидной железы в исходном состоянии и перед введением каждой дозы. (5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5)

[172] ----------------------------------ПОКАЗАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ-------------------------------

[173] YERVOY представляет собой антитело, блокирующее человеческий цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4 (CTLA-4), и показан для лечения неоперабельной или метастатической меланомы. (1)

[174] -------------------------------ДОЗЫ И СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ-------------------------------

- YERVOY 3 мг/кг вводят внутривенно в течение 90 минут каждые 3 недели, в общей сложности четыре дозы. (2.1)

- Окончательно прекратите лечение при развитии тяжелых нежелательных реакций. (2.2)

[175] ПОЛНАЯ ИНСТРУКЦИЯ ПО МЕДИЦИНСКОМУ ПРИМЕНЕНИЮ ПРЕПАРАТА

[176] ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: ИММУНООПОСРЕДОВАННЫЕ НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ

[177] YERVOY может привести к серьезным и смертельным иммуноопосредованным нежелательным реакциям за счет активации и пролиферации Т-клеток. Эти иммуноопосредованные реакции могут затрагивать любую систему; однако наиболее распространенные тяжелые иммуноопосредованные нежелательные реакции - это энтероколит, гепатит, дерматит (включая токсический эпидермальный некролиз), нейропатия и эндокринопатия. Большинство этих иммуноопосредованных реакций первоначально проявлялись во время лечения; однако меньшее количество возникало по истечении от нескольких недель до нескольких месяцев после прекращения лечения препаратом YERVOY.

[178] Окончательно прекратите лечение YERVOY и начните системное введение высоких доз кортикостероидов для купирования тяжелых иммуноопосредованных реакций. [См. Дозы и способ применения (2.2)]

[179] Оценивайте пациентов на наличие признаков и симптомов энтероколита, дерматита, нейропатии и эндокринопатии и анализируйте данные биохимического исследования, включая функциональные показатели печени и щитовидной железы в исходном состоянии и перед введением каждой дозы. [См. Предупреждения и меры предосторожности (5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5)]

[180] 1 ПОКАЗАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ

[181] YERVOY (ипилимумаб) показан для лечения неоперабельной или метастатической меланомы.

[182] 2 ДОЗЫ И СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

[183] 2.1 Рекомендуемая доза

[184] Рекомендуемая доза YERVOY составляет 3 мг/кг, вводимая внутривенно в течение 90 минут каждые 3 недели, в общей сложности четыре дозы.

[185] 2.2 Модификации рекомендуемой дозы

Не вводите запланированную дозу YERVOY при развитии любых умеренных иммуноопосредованных нежелательных реакций или симптоматической эндокринопатии. Пациентам с полным или частичным купированием нежелательных реакций (0-1 степени), которые получают менее 7,5 мг преднизолона или эквивалента в сутки, возобновляют лечение препаратом YERVOY в дозе 3 мг/кг каждые 3 недели до введения всех 4 запланированных доз или по истечении 16 недель от первой дозы в зависимости от того, что наступит раньше.

[186] Окончательно прекратите лечение YERVOY при наступлении любого из следующих событий:

- Стойкие умеренные нежелательные реакции или невозможность уменьшить дозу кортикостероидов до 7,5 мг преднизолона или эквивалента в сутки.

- Невозможность завершить полный курс лечения в течение 16 недель после введения первой дозы.

- Тяжелые или опасные для жизни нежелательные реакции, включая любую из приведенных ниже:

[187] Колит с болью в животе, лихорадка, кишечная непроходимость или признаки перитонита; увеличение частоты стула (7 или более по сравнению с исходным уровнем), недержание кала, необходимость внутривенной гидратации в течение более 24 часов, желудочно-кишечные кровотечения и перфорация желудочно-кишечного тракта

[188] Аспартатаминотрансфераза (ACT) и аланинаминотрансфераза (АЛТ) >5 раз превышающие верхнюю границу нормы или общий билирубин >3 раз превышающий верхнюю границу нормы

[189] Синдром Стивенса-Джонсона, токсический эпидермальный некролиз или сыпь, осложненная изъязвлением кожи на всю ее толщину, некротические, буллезные или геморрагические проявления

[190] Тяжелая двигательная или сенсорная нейропатия, синдром Гийена-Барре, миастения гравис

[191] Тяжелые иммуноопосредованные реакции с участием любой системы органов (например, нефрит, пневмонит, панкреатит, неинфекционный миокардит)

[192] Иммуноопосредованное заболевание глазное, которое не отвечает на топическую иммуносупрессивную терапию

[193] 2.3 Приготовление и введение

- Не встряхивайте продукт.

- Перед парентеральным введением визуально проверяйте препараты на наличие твердых частиц и изменение цвета. Отбракуйте флакон, если раствор мутный, есть выраженное изменение цвета (раствор может иметь бледно-желтый цвет) или чужеродные твердые частицы, не принимая во внимание полупрозрачно-белые аморфные частицы.

[194] Приготовление раствора

- Выдержите флаконы при комнатной температуре приблизительно 5 минут перед приготовлением раствора для инфузии.

- Наберите необходимый объем YERVOY и перенесите в пакет для внутривенной инфузии.

- Разведите 0,9% раствором хлорида натрия для инъекций, ФСША, или 5% декстрозой для инъекций, ФСША, чтобы получить разведенный раствор с конечной концентрацией в пределах от 1 мг/мл до 2 мг/мл. Смешайте разведенный раствор путем осторожного переворачивания.

- Храните разведенный раствор не более 24 часов в холодильнике (от 2°С до 8°С, от 36°F до 46°F) или при комнатной температуре (от 20°С до 25°С, от 68°F до 77°F).

- Выбрасывайте частично использованные флаконы или пустые флаконы YERVOY.

[195] Инструкции по введению

- Не смешивайте YERVOY или не вводите в виде инфузии с другими лекарственными средствами.

- Промывайте линию для внутривенного введения 0,9% раствором хлорида натрия, ФСША, или раствором 0,5% декстрозы для инъекций, ФСША, после каждой дозы.

- Вводите разведенный раствор в течение 90 минут через линию для внутривенного введения, содержащую стерильный, апирогенный, встроенный фильтр с низким показателем связывания с белками.

[196] 3 ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ И ДОЗИРОВКА

[197] 50 мг/10 мл (5 мг/мл). 200 мг/40 мл (5 мг/мл).

[198] 4 ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ

[199] Отсутствуют.

[200] 5 ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

YERVOY может привести к серьезным и смертельным иммуноопосредованным реакциям за счет активации и пролиферации Т-клеток.

Эквиваленты

[201] Следует понимать, что настоящее изобретение, будучи охарактеризованным вместе с его подробным описанием, предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем изобретения, который определяется объемом приложенной формулы изобретения. Другие аспекты изобретения, преимущества и модификации находятся в пределах объема приложенной формулы изобретения.

[202] и не участвует в общей характеристике ответа при анализе множества опухолевых образцов; поэтому мы анализировали опухоль и соответствующую ДНК крови с помощью полноэкзомного секвенирования. В группе изобретения мы сгенерировали 6,4 ГБ отображенных последовательностей с более чем 90% целевой последовательности, охваченной по меньшей мере глубиной 10Х и средним экзомным охватом 103Х (Фиг. 5). Широкий диапазон мутационных нагрузок среди образцов (Фиг. 2А и 2В) и повторные мутации (Фиг. 6А) согласуются с данными литературы.

[203] Мы исследовали, приведет ли подмножество соматических неоэпитопов к изменению силы связывания пептида с молекулами МНС с использованием типов HLA, индивидуальных для каждого пациента. Вначале мы сравнили общую антигенную тенденцию всех мутантных пептидов с пептидами дикого типа. Интересно, что в совокупности мутантные пептиды прогнозируемо связывали МНС класса I с более высокой аффинностью, чем соответствующие пептиды дикого типа (Фиг. 10А и 10В).

ССЫЛКИ НА ПУБЛИКАЦИИ

1. Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med 2010; 363:711-23.

2. Wolchok JD, Kluger H, Callahan MK, et al. Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med 2013; 369:122-33.

3. Prieto PA, Yang JC, Sherry RM, et al. CTLA-4 blockade with ipilimumab: long-term follow-up of 177 patients with metastatic melanoma. Clin Cancer Res 2012; 18:2039-47.

4. Hamid O, Robert C, Daud A, et al. Safety and tumor responses with lambrolizumab (anti-PD-1) in melanoma. N Engl J Med 2013; 369:134-44.

5. Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N Engl J Med 2012; 366:2443-54.

6. Postow MA, Callahan MK, Wolchok JD. The antitumor immunity of ipilimumab: (T-cell) memories to last a lifetime? Clin Cancer Res 2012; 18:1821-3.

7. Carthon ВС, Wolchok JD, Yuan J, et al. Preoperative CTLA-4 blockade: tolerability and immune monitoring in the setting of a presurgical clinical trial. Clin Cancer Res 2010; 16:2861-71.

8. Ku GY, Yuan J, Page DB, et al. Single-institution experience with ipilimumab in advanced melanoma patients in the compassionate use setting: lymphocyte count after 2 doses correlates with survival. Cancer 2010; 116:1767-75.

9. Ji RR, Chasalow SD, Wang L, et al. An immune-active tumor microenvironment favors clinical response to ipilimumab. Cancer Immunol Immunother 2012; 61:1019-31.

10. Harlin H, Meng Y, Peterson AC, et al. Chemokine expression in melanoma metastases associated with CD8+ T-cell recruitment. Cancer Res 2009; 69:3077-85.

11. Gajewski TF, Louahed J, Brichard VG. Gene signature in melanoma associated with clinical activity: a potential clue to unlock cancer immunotherapy. Cancer J 2010; 16:399-403.

12. Hamid О, Schmidt H, Nissan A, et al. A prospective phase II trial exploring the association between tumor microenvironment biomarkers and clinical activity of ipilimumab in advanced melanoma. J Transl Med 2011; 9:204.

13. Castle JC, Kreiter S, Diekmann J, et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 2012; 72:1081-91.

14. Srivastava N, Srivastava PK. Modeling the repertoire of true tumor-specific МНС I epitopes in a human tumor. PLoS One 2009; 4:e6094.

15. Peggs KS, Quezada SA, Chambers CA, Korman AJ, Allison JP. Blockade of CTLA-4 on both effector and regulatory T cell compartments contributes to the antitumor activity of anti-CTLA-4 antibodies. J Exp Med 2009; 206:1717-25.

16. Chambers CA, Kuhns MS, Allison JP. Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) regulates primary and secondary peptide-specific CD4(+) T cell responses. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:8603-8.

17. Chambers CA, Sullivan TJ, Truong T, Allison JP. Secondary but not primary T cell responses are enhanced in CTLA-4-deficient CD8+ T cells. Eur J Immunol 1998; 28:3137-43.

18. Simpson TR, Li F, Montalvo-Ortiz W, et al. Fc-dependent depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells co-defines the efficacy of anti-CTLA-4 therapy against melanoma. J Exp Med 2013.

19. Alexandrov LB, Nik-Zainal S, Wedge DC, et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature 2013; 500:415-21.

20. Lawrence MS, Stojanov P, Polak P, et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature 2013; 499:214-8.

21. Segal NH, Parsons DW, Peggs KS, et al. Epitope landscape in breast and colorectal cancer. Cancer Res 2008; 68:889-92.

22. Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity 2004; 21:137-48.

23. Matsushita H, Vesely MD, Koboldt DC, et al. Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting. Nature 2012; 482:400-4.

24. van Rooij N, van Buuren MM, Philips D, et al. Tumor Exome Analysis Reveals Neoantigen-Specific T-Cell Reactivity in an Ipilimumab-Responsive Melanoma. J Clin Oncol 2013.

25. Tran E, Turcotte S, Gros A, et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science 2014; 344:641-5.

26. Wolchok JD, Weber JS, Hamid O, et al. Ipilimumab efficacy and safety in patients with advanced melanoma: a retrospective analysis of HLA subtype from four trials. Cancer Immun 2010; 10:9.

27. Wolchok JD, Neyns B, Linette G, et al. Ipilimumab monotherapy in patients with pretreated advanced melanoma: a randomised, double-blind, multicentre, phase 2, dose-ranging study. Lancet Oncol 2010; 11:155-64.

28. O'Day SJ, Maio M, Chiarion-Sileni V, et al. Efficacy and safety of ipilimumab monotherapy in patients with pretreated advanced melanoma: a multicenter single-arm phase II study. Ann Oncol 2010; 21:1712-7.

29. Robert C, Thomas L, Bondarenko I, et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med 2011; 364:2517-26.

30. Gartner JJ, Parker SC, Prickett TD, et al. Whole-genome sequencing identifies a recurrent functional synonymous mutation in melanoma. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110:13481-6.

31. Furney SJ, Turajlic S, Fenwick K, et al. Genomic characterisation of acral melanoma cell lines. Pigment Cell Melanoma Res 2012; 25:488-92.

32. Wei X, Walia V, Lin JC, et al. Exome sequencing identifies GRIN2A as frequently mutated in melanoma. Nat Genet 2011; 43:442-6.

33. Berger MF, Hodis E, Heffernan TP, et al. Melanoma genome sequencing reveals frequent PREX2 mutations. Nature 2012; 485:502-6.

34. Krauthammer M, Kong Y, Ha BH, et al. Exome sequencing identifies recurrent somatic RAC1 mutations in melanoma. Nat Genet 2012; 44:1006-14.

35. Hodis E, Watson IR, Kryukov GV, et al. A landscape of driver mutations in melanoma. Cell 2012; 150:251-63.

36. Almunia C, Bretaudeau M, Held G, et al. Bee Venom Phospholipase A2, a Good "Chauffeur" for Delivering Tumor Antigen to the МНС I and МНС II Peptide-Loading Compartments of the Dendritic Cells: The Case of NY-ESO-1. PLoS One 2013; 8:e67645.

37. Ray S, Chhabra A, Chakraborty NG, et al. MHC-I-restricted melanoma antigen specific TCR-engineered human CD4+ T cells exhibit multifunctional effector and helper responses, in vitro. Clin Immunol 2010; 136:338-47.

38. Stuart GW, Moffett K, Leader JJ. A comprehensive vertebrate phylogeny using vector representations of protein sequences from whole genomes. Mol Biol Evol 2002; 19:554-62.

39. Birnbaum ME, Mendoza JL, Sethi DK, et al. Deconstructing the Peptide-МНС Specificity of T Cell Recognition. Cell; 157:1073-87.

40. Morita D, Yamamoto Y, Suzuki J, Mori N, Igarashi T, Sugita M. Molecular requirements for T cell recognition of N-myristoylated peptides derived from the simian immunodeficiency virus Nef protein. J Virol 2013; 87:482-8.

41. Rahman AK, Herfst CA, Moza B, et al. Molecular basis of TCR selectivity, cross-reactivity, and allelic discrimination by a bacterial superantigen: integrative functional and energetic mapping of the SpeC-Vbeta2.1 molecular interface. J Immunol 2006; 177:8595-603.

42. Binkowski ТА, Marino SR, Joachimiak A. Predicting HLA class I non-permissive amino acid residues substitutions. PLoS One 2012; 7:e41710.

43. Piepenbrink KH, Blevins SJ, Scott DR, Baker BM. The basis for limited specificity and MHC restriction in a T cell receptor interface. Nat Commun 2013; 4:1948.

44. Aleksic M, Dushek O, Zhang H, et al. Dependence of T cell antigen recognition on T cell receptor-peptide MHC confinement time. Immunity 2010; 32:163-74.

45. Insaidoo FK, Borbulevych OY, Hossain M, Santhanagopolan SM, Baxter TK, Baker BM. Loss of T cell antigen recognition arising from changes in peptide and major histocompatibility complex protein flexibility: implications for vaccine design. J Biol Chem 2011; 286:40163-73.

46. Sliz P, Michielin O, Cerottini JC, et al. Crystal structures of two closely related but antigenically distinct HLA-A2/melanocyte-melanoma tumor-antigen peptide complexes. J Immunol 2001; 167:3276-84.

47. Cong H, Mui EJ, Witola WH, et al. Human immunome, bioinformatic analyses using HLA supermotifs and the parasite genome, binding assays, studies of human T cell responses, and immunization of HLA-A*1101 transgenic mice including novel adjuvants provide a foundation for HLA-A03 restricted CD8+ T cell epitope based, adjuvanted vaccine protective against Toxoplasma gondii. Immunome Res 2010; 6:12.

48. Tan TG, Mui E, Cong H, et al. Identification of T. gondii epitopes, adjuvants, and host genetic factors that influence protection of mice and humans. Vaccine 2010; 28:3977-89.

49. Wong R, Lau R, Chang J, et al. Immune responses to a class II helper peptide epitope in patients with stage III/IV resected melanoma. Clin Cancer Res 2004; 10:5004-13.

50. Ekeruche-Makinde J, Clement M, Cole DK, et al. T-cell receptor-optimized peptide skewing of the T-cell repertoire can enhance antigen targeting. J Biol Chem 2012; 287:37269-81.

51. Li Y, Depontieu FR, Sidney J, et al. Structural basis for the presentation of tumor-associated MHC class II-restricted phosphopeptides to CD4+ T cells. J Mol Biol 2010; 399:596-603.

52. Voelter V, Rufer N, Reynard S, et al. Characterization of Melan-A reactive memory CD8+ T cells in a healthy donor. Int Immunol 2008; 20:1087-96.

53. Wang JG, Jansen RW, Brown EA, Lemon SM. Immunogenic domains of hepatitis delta virus antigen: peptide mapping of epitopes recognized by human and woodchuck antibodies. J Virol 1990; 64:1108-16.

54. Poisson F, Baillou F, Dubois F, Janvier B, Roingeard P, Goudeau A. Immune response to synthetic peptides of hepatitis delta antigen. J Clin Microbiol 1993; 31:2343-9.

55. Monach PA, Meredith SC, Siegel CT, Schreiber H. A unique tumor antigen produced by a single amino acid substitution. Immunity 1995; 2:45-59.

56. Dubey P, Hendrickson RC, Meredith SC, et al. The immunodominant antigen of an ultraviolet-induced regressor tumor is generated by a somatic point mutation in the DEAD box helicase p68. J Exp Med 1997; 185:695-705.

57. Noguchi Y, Chen YT, Old LJ. A mouse mutant p53 product recognized by CD4+ and CD8+ T cells. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:3171-5.

58. Ikeda H, Ohta N, Furukawa K, et al. Mutated mitogen-activated protein kinase: a tumor rejection antigen of mouse sarcoma. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:6375-9.

59. Matsutake T, Srivastava PK. The immunoprotective MHC II epitope of a chemically induced tumor harbors a unique mutation in a ribosomal protein. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:3992-7.

60. Allen PM, Matsueda GR, Evans RJ, Dunbar JB, Jr., Marshall GR, Unanue ER. Identification of the T-cell and la contact residues of a T-cell antigenic epitope. Nature 1987; 327:713-5.

61. Abrahmsen L, Dohlsten M, Segren S, Bjork P, Jonsson E, Kalland T. Characterization of two distinct MHC class II binding sites in the superantigen staphylococcal enterotoxin A. EMBO J 1995; 14:2978-86.

62. Sant'Angelo DB, Robinson E, Janeway CA, Jr., Denzin LK. Recognition of core and flanking amino acids of MHC class II-bound peptides by the T cell receptor. Eur J Immunol 2002; 32:2510-20.

63. Anderson MW, Gorski J. Cutting edge: TCR contacts as anchors: effects on affinity and HLA-DM stability. J Immunol 2003; 171:5683-7.

64. Donermeyer DL, Weber KS, Kranz DM, Allen PM. The study of high-affinity TCRs reveals duality in T cell recognition of antigen: specificity and degeneracy. J Immunol 2006; 177:6911-9.

65. Postow MA, Luke JJ, Bluth MJ, et al. Ipilimumab for patients with advanced mucosal melanoma. Oncologist 2013; 18:726-32.

66. Luke JJ, Callahan MK, Postow MA, et al. Clinical activity of ipilimumab for metastatic uveal melanoma: A retrospective review of the Dana-Farber Cancer Institute, Massachusetts General Hospital, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, and University Hospital of Lausanne experience. Cancer 2013; 119:3687-95.

67. Del Vecchio M, Di Guardo L, Ascierto PA, et al. Efficacy and safety of ipilimumab 3 mg/kg in patients with pretreated, metastatic, mucosal melanoma. Eur J Cancer 2013.

68. Srivastava PK, Duan F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunol Immunother 2013; 62:967-74.

69. Cha E, Klinger M, Hou Y, et al. Improved survival with T cell clonotype stability after anti-CTLA-4 treatment in cancer patients. Sci Transl Med 2014; 6:238ra70.

70. Ho AS, Kannan K, Roy DM, et al. The mutational landscape of adenoid cystic carcinoma. Nat Genet 2013; 45:791-8.

71. Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol 2011; 29:24-6.

72. Liu C, Yang X, Duffy B, et al. ATHLATES: accurate typing of human leukocyte antigen through exome sequencing. Nucleic Acids Res 2013; 41:e142.

73. Lin Y, Gallardo HF, Ku GY, et al. Optimization and validation of a robust human T-cell culture method for monitoring phenotypic and polyfunctional antigen-specific CD4 and CD8 T cell responses. Cytotherapy 2009; 11:912-22.

1. Способ лечения рака у субъекта, включающий:

(i) определение или обнаружение, имеет ли субъект один или более неоэпитоп, где каждый неоэпитоп содержит (а) тетрапептидную последовательность, которая является консервативной областью на всех антигенах, распознаваемых Т-клеточным рецептором (TCR), и (б) консенсусную последовательность, общую с антигеном из инфекционного агента; и

(ii) введение или обеспечение указанному субъекту анти-CTLA4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, в случае присутствия одного или более неоэпитопов, при обнаружении на стадии определения (i).

2. Способ по п. 1, в котором указанный рак определен как содержащий указанный один или более неоэпитоп путем проведения полногеномного или полноэкзомного секвенирования для раковой опухоли, причем указанный один или более неоэпитоп обладает каждой из следующих характеристик:

(i) соматическая мутация;

(ii) связывается с МНС класса I субъекта с IC50, меньшей или равной 500 нМ.

3. Способ по п. 1, в котором указанное антитело выбрано из группы, состоящей из ипилимумаба и тремелимумаба.

4. Способ по п. 1, в котором указанный один или более неоэпитоп распознается иммунной системой субъекта как чужеродный.

5. Способ по п. 1, в котором тетрапептид выбран из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, указанных в Таблице 1 ниже:

6. Способ по п. 1, в котором указанный один или более неоэпитоп имеет высокую степень сходства с последовательностью бактериального антигена.

7. Способ по п. 1, в котором указанный один или более неоэпитоп имеет высокую степень сходства с последовательностью вирусного антигена.

8. Способ по п. 1, в котором указанный рак выбран из группы, состоящей из карциномы, саркомы, миеломы, лейкемии и лимфомы.

9. Способ по п. 1, в котором указанный рак презентирует в МНС класса I указанный один или более неоэпитоп.

10. Способ по п. 1, в котором указанный один или более неоэпитоп содержит по меньшей мере одну соматическую мутацию.

11. Способ по п. 1, в котором указанный один или более неоэпитоп связывается с МНС класса I субъекта с IC50, меньшей или равной 500 нМ.

12. Способ по п. 1, в котором указанное антитело представляет собой ипилимумаб.

13. Способ по п. 1, в котором указанное антитело представляет собой тремелимумаб.

14. Способ по п. 1, в котором указанный рак определен как содержащий указанный один или более неоэпитоп путем проведения полногеномного или полноэкзомного секвенирования для раковой опухоли.

15. Способ по п. 1, в котором указанный один или более неоэпитоп обладает каждой из следующих характеристик:

(i) один или более неоэпитоп содержит соматическую мутацию;

(ii) один или более неоэпитоп связывается с МНС класса I субъекта с IC50, меньшей или равной 500 нМ;

(iii) один или более неоэпитоп содержит тетрапептид который является консервативной областью на всех антигенах, распознаваемых Т-клеточным рецептором (TCR); и

(iv) один или более неоэпитоп имеет общую консенсусную последовательность с антигеном из инфекционного агента.

16. Способ по п. 1, в котором указанный один или более неоэпитоп содержит по меньшей мере одну соматическую мутацию и связывается с МНС класса I субъекта с IC50, меньшей или равной 500 нМ.

17. Способ по п. 1, причем способ включает:

(i) определение или обнаружение рака как содержащего указанный один или более неоэпитоп, каждый из которых включает указанный тетрапептид и указанную консенсусную последовательность, путем проведения полногеномного или полноэкзомного секвенирования для раковой опухоли;

(ii) введение указанному субъекту анти-CTLA4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; и

(iii) введение указанному субъекту указанного одного или более неоэпитопа.

18. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение указанному субъекту указанного одного или более неоэпитопа.

19. Способ по п. 18, в котором указанные один или более неоэпитопы представляют собой пептиды.

20. Способ по п. 18, в котором указанные один или более неоэпитопы представляют собой нуклеотиды.

21. Способ по п. 1, дополнительно включающий определение, имеет ли указанный субъект по меньшей мере 300 несинонимичных мутаций на экзосому.

22. Способ лечения рака у субъекта, включающий:

(i) введение или обеспечение субъекту анти-CTLA4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где

(ii) предварительно было определено, что субъект имеет один или более неоэпитоп, где указанный один или более неоэпитоп содержит (а) тетрапептидную последовательность, которая является консервативной областью на всех антигенах, распознаваемых Т-клеточным рецептором (TCR), и (б) консенсусную последовательность, общую с антигеном из инфекционного агента.