Способ извлечения стволовых клеток костного мозга с применением способа культивирования с субфракционированием и их пролиферации

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к культивированию стволовой клетки с субфракционированием. Способ включает культивирование клеток костного мозга, выделенных от индивидуума, перенос только супернатанта в новую емкость и культивирование указанного супернатанта. Затем осуществляют отделение супернатанта и культивирование в сосуде для культивирования при 37°С в течение 1-3 часов, повторное культивирование супернатанта при 37°С в течение 12-36 часов от 2 до 3 раз, и культивирование супернатанта при 37°С в течение 24-72 часов. Каждый супернатант переносят в новый сосуд для культивирования для повторного культивирования. Затем в конечном сосуде получают моноклональную стволовую клетку и инокулируют ее в среду для культивирования при плотности клеток от 50 до 1000 клеток/см² для культивирования указанной клетки. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 10 з.п. ф-лы, 5 табл., 26 ил., 3 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка основывается и испрашивает приоритет на основании заявки на патент Республики Корея №10-2017-0146906, поданной 06 ноября 2017 года в Корейское ведомством по интеллектуальной собственности, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящее изобретение относится к способу культивирования стволовой клетки с субфракционированием и способу пролиферации моноклональной стволовой клетки, полученной с применением указанного способа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Стволовые клетки обладают потенциалом к росту в тканях всех 210 органов тела человека, которые можно заставить бесконечно делиться и дифференцироваться в клетки целевых органов посредством подходящей манипуляции. Благодаря таким характеристикам стволовые клетки представляют собой новые перспективные терапевтические агенты. Кроме того, ожидается, что стволовые клетки являются подходящими для применения вследствие высокой возможности лечения ими трудноизлечимых заболеваний, таким образом осуществляется лечение различных заболеваний, таких как лейкоз, остеопороз, гепатит, болезнь Паркинсона, сенильная деменция (старческое слабоумие) и ожог.

[0004] Тем не менее, для стволовых клеток все еще существует ряд ограничений, поскольку их трудно получить в больших масштабах. Хотя способ получения стволовых клеток из замороженных эмбриональных клеток может считаться эффективным, по-прежнему существует много разногласий с этической точки зрения. Для того чтобы разрешить такие задачи, было проведено много исследований для получения стволовых клеток с применением метода переноса ядра соматической клетки или стволовых клеток взрослого организма. Исследования с использованием стволовых клеток взрослого организма проводятся более активно по сравнению с исследованиями с использованием эмбриональных стволовых клеток. Стволовые клетки взрослого организма присутствуют в различных органах, таких как центральная нервная система и костный мозг, и участвуют в развитии органа во время периода роста и восстановления после повреждения. Таким образом, их можно получить из различных участков, таких как костный мозг, селезенка и жировые клетки. Тем не менее костный мозг является наиболее распространенным источником. Между тем, получать клетки однородной формы на постоянной основе затруднительно, хотя мезенхимальные стволовые клетки выделяют и культивируют из числа многих видов клеток костного мозга. Таким образом, проводятся исследования, направленные на решение таких задач.

[0005] Все еще широко используется способ разделения с применением способа по Friedenstein et al., который представляет собой способ, в котором на начальной стадии деления выделяют только мононуклеарные клетки, прикрепленные к сосуду для культивирования, применяя способ, называемый фиколл-пак (Ficoll-paque). Однако такие способы приводят к возникновению непостоянных клеточных характеристик, и не приводят к образованию одиночной группы клеток, поскольку мезенхимальные стволовые клетки присутствуют совместно с другими мононуклеарными клетками. По этой причине было разработано несколько исследований для получения более идентичных клеток. В способе по Luria et al. выделяли все клетки, прикрепленные ко дну сосуда для культивирования, однако недостатком указанного способа являлся тот факт, что с его помощью можно было выделять другие стволовые клетки, а не мезенхимальные стволовые клетки (Luria et al., Transfusion, 11:345-349,1971). В способе по Simmons et al. использовали антитело, применяя специфичное антитело против Sca-1 и STRO-1 помимо поверхностных антигенов мезенхимальных стволовых клеток, тем самым обеспечивая постоянную проблему высокой стоимости и контаминации (Simmons et al., Blood, 78: 55-62, 2002). Способ по Hung et al. представляет собой способ разделения мезенхимальных стволовых клеток с применением различия в размере клеток, который также обладает недостатком, заключающимся в том, что чистота мезенхимальных стволовых клеток не является постоянной, и могут и могут присутствовать примеси других стволовых клеток (Hung et al., Stem cell, 20: 249-258, 2002).

[0006] Для того, чтобы решить вышеуказанные задачи, авторы настоящего изобретения впервые изобрели способ выделения стволовых клеток, названный «способ культивирования с субфракционированием» (subfractionation culturing method). Авторы настоящего изобретения подали заявку на патент Республики Корея №10-2006-0075676 в отношении указанного способа, и по указанной заявке было принято решение о выдаче патента. Способ культивирования с субфракционированием можно проводить при более низкой стоимости по сравнению с другими способами. Кроме того, отсутствует проблема контаминации, и моноклональные мезенхимальные стволовые клетки (MSC) можно эффективно получать без возможных примесей других стволовых клеток. Таким образом, указанный способ обладает большим преимуществом по сравнению с другими способами получения стволовых клеток.

[0007] Авторы настоящего изобретения разработали новый способ культивирования с субфракционированием (SCM) с получением моноклональных MSC, полученных из одной мышиной клетки и одной человеческой клетки, при котором отсутствует необходимость в центрифугировании или ферментативном разложении. Принцип указанного способа культивирования с субфракционированием заключается в выделении MSC, основанном на плотности клеток и их способности прикрепляться к планшету для культивирования. [0008] Тем не менее, несмотря на преимущество указанного способа, способ культивирования с субфракционированием обладает ограничениями, при которых трудно быстро получить группу моноклональных мезенхимальных стволовых клеток. Это связано с тем, что для массового производства моноклональных MSC, которые будут применять в качестве конечного продукта, указанный способ требует создания рабочего банка клеток, который применяют для осуществления способа получения конечного продукта, для получения таким образом достаточного количества моноклональных мезенхимальных стволовых клеток, и для такого способа необходима культура 10-12 пассажа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Настоящее изобретение было создано с целью улучшения способа культивирования с субфракционированием для индуцирования быстрой пролиферации моноклональных стволовых клеток. Таким образом, авторы настоящего изобретения обнаружили, что пониженная плотность культуры моноклональных стволовых клеток и использование обогащенной антиоксидантом среды для культивирования индуцировали эффективное увеличение скорости пролиферации клеток. Таким образом, авторы настоящего изобретения совершили настоящее открытие.

[0010] Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение способа культивирования с субфракционированием и способа пролиферации стволовых клеток, который улучшает традиционные способы культивирования с субфракционированием в данной области техники.

[0011] Пример варианта реализации настоящего изобретения обеспечивает способ культивирования стволовой клетки с субфракционированием и ее пролиферации, причем указанный способ включает стадии 1) культивирования клеток костного мозга, выделенного от индивидуума; 2) переноса только супернатанта согласно стадии 1) в новую емкость и культивирования указанного супернатанта; 3) отделения только супернатанта согласно стадии 2), культивирования указанного супернатанта в сосуде для культивирования при 37°С в течение от 1 до 3 часов, повторного культивирования супернатанта при 37°С в течение 12-36 часов от 2 до 3 раз, затем культивирования указанного супернатанта при 37°С в течение от 24 до 72 часов, при котором каждый супернатант переносят в новый сосуд для культивирования для повторного культивирования; 4) получения моноклональной стволовой клетки в конечном сосуде для культивирования; и 5) инокуляции указанной моноклональной стволовой клетки в среду для культивирования при плотности клеток от 50 до 1000 клеток/см² для культивирования указанной клетки.

[0012] Согласно способу культивирования стволовых клеток с субфракционированием и их пролиферации в примерах вариантов реализации настоящего изобретения преимуществом является то, что моноклональные стволовые клетки могут быть получены быстро без контаминации, и что большое количество требуемых моноклональных стволовых клеток может быть получено за короткий период времени в результате быстрой пролиферации, применяя их таким образом для получения терапевтических агентов, представляющих собой стволовые клетки.

[0013] Вышеприведенное краткое описание изобретения приведено только в качестве примера, и никоим образом не предназначено для ограничения настоящего изобретения. В дополнение к иллюстративным аспектам, вариантам реализации и признакам, описанным выше, дополнительные аспекты, варианты реализации и признаки будут очевидны исходя из чертежей и последующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0014] На ФИГ. 1 показана схема способа культивирования с субфракционированием для выделения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека;

[0015] На ФИГ. 2 показаны полученные при помощи микроскопа результаты морфологических изменений мезенхимальных стволовых клеток в зависимости от плотности культуры клеток и пассажа культуры клеток;

[0016] На ФИГ. 3А показаны результаты FACS-анализа (анализ сортировки клеток с активированной флуоресценцией) размера клеток и зернистости мезенхимальных стволовых клеток в показателях среднего прямого светорассеяния (FSC) в зависимости от плотности культуры клеток и пассажа культуры клеток (*р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,005);

[0017] На ФИГ. 3В показаны результаты FACS-анализа (анализ сортировки клеток с активированной флуоресценцией) размера клеток и зернистости мезенхимальных стволовых клеток в показателях среднего бокового светорассеяния (SSC) в зависимости от плотности культуры клеток и пассажа культуры клеток (*р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,005);

[0018] На ФИГ. 4 показаны результаты подтверждения того, подвергаются ли клетки старению после окрашивания мезенхимальных стволовых клеток на определение бета-галактозидазы (бета-гал-окрашивание), при котором варьируют плотность культуры клеток и пассажи культуры клеток;

[0019] На ФИГ. 5 показаны результаты ПЦР с обратной транскрипцией генов пассажей Р15 и Р16, которые представляют собой связанные со старением гены, и PCNA, который представляет собой маркер пролиферации, полученные после культивирования мезенхимальных стволовых клеток 15 пассажа при варьировании плотности культуры клеток;

[0020] На ФИГ. 6 показаны результаты подтверждения способности мезенхимальных стволовых клеток к пролиферации через показатели времени удвоения популяции (PDT) и уровня удвоения популяции (PDL) в зависимости от плотности культуры клеток и пассажа культуры клеток (*р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,005);

[0021] На ФИГ. 7 показаны результаты подтверждения способности мезенхимальных стволовых клеток к дифференцировке в зависимости от плотности культуры клеток и пассажа культуры клеток (*р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,005);

[0022] На ФИГ. 7А показаны результаты подтверждения способности мезенхимальных стволовых клеток к дифференцировке в липоциты путем гистологического окрашивания с применением Oil red О в зависимости от плотности культуры клеток и клеточной культуры; [0023] На ФИГ. 7В показаны результаты количественного определения уровня гистологического окрашивания, описанного на ФИГ. 7А;

[0024] На ФИГ. 7С показаны результаты подтверждения способности мезенхимальных стволовых клеток к дифференцировке в остеогенные клетки путем гистологического окрашивания с применением ализарин красного S в зависимости от плотности культуры клеток и пассажа культуры клеток;

[0025] На ФИГ. 7D показаны результаты количественного определения уровня гистологического окрашивания, описанного на ФИГ. 7С;

[0026] На ФИГ. 8А показано суммарное образование активных форм кислорода (АФК) мезенхимальными стволовыми клетками в зависимости от плотности культуры клеток и пассажа культуры клеток;

[0027] На ФИГ. 8В показаны результаты кометного анализа на определение повреждения ДНК, вызванного суммарным образованием АФК, в зависимости от плотности культуры клеток и пассажа культуры клеток (*р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,005);

[0028] На ФИГ. 9 показаны результаты измерения концентрации 8-OHdG (8-гидроксидезоксигуанозина) для подтверждения степени повреждения ДНК в результате образования АФК в зависимости от плотности культуры клеток и пассажа культуры клеток (*р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,005);

[0029] На ФИГ. 10 показаны результаты подтверждения изменений способности клеток к пролиферации, полученных культивированием мезенхимальных стволовых клеток 11-15 пассажа в условиях только высокой плотности (HD) и высокой плотности + аскорбиновой кислоты (HD + АА);

[0030] На ФИГ. 11 показаны результаты сравнения уровней АФК, образованных в результате культивирования мезенхимальных стволовых клеток 11-15 пассажа в условиях только высокой плотности (HD) и высокой плотности + аскорбиновой кислоты (HD + АА) (*р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,005);

[0031] На ФИГ. 12 представлена схема, показывающая эксперимент для улучшения способа культивирования с субфракционированием;

[0032] На ФИГ. 13 показаны результаты подтверждения скорости пролиферации клеток, при которой моноклональные мезенхимальные стволовые клетки SCM01, полученные способом культивирования с субфракционированием, инокулируют при плотности 1000 или 4000 клеток/см², и указанные клетки культивируют с применением среды для культивирования LG-DMEM и α-МЕМ с антиоксидантом или без него;

[0033] На ФИГ. 13А показаны изменения числа клеток в зависимости от 1 пассажа (Р1) до 5 пассажа (Р5) каждой экспериментальной группы;

[0034] На ФИГ. 13В показаны результаты определения PDT и PDL каждой экспериментальной группы;

[0035] На ФИГ. 14 показаны результаты подтверждения скорости пролиферации клеток, при которой моноклональные мезенхимальные стволовые клетки SCM02, полученные способом культивирования с субфракционированием, инокулируют при плотности 1000 или 4000 клеток/см², и указанные клетки культивируют с применением среды для культивирования LG-DMEM и α-МЕМ с антиоксидантом или без него;

[0036] На ФИГ. 14А показаны изменения числа клеток в зависимости от 1 пассажа (Р1) до 5 пассажа (Р5) каждой экспериментальной группы

[0037] На ФИГ. 14В показаны результаты определения PDT и PDL каждой экспериментальной группы;

[0038] На ФИГ. 15 показаны результаты подтверждения скорости пролиферации клеток, при которой моноклональные мезенхимальные стволовые клетки SCM03, полученные способом культивирования с субфракционированием, инокулируют при плотности 1000 или 4000 клеток/см², и указанные клетки культивируют с применением среды для культивирования LG-DMEM и α-МЕМ с антиоксидантом или без него;

[0039] На ФИГ. 15А показаны изменения числа клеток в зависимости от 1 пассажа (Р1) до 5 пассажа (Р5) каждой экспериментальной группы

[0040] На ФИГ. 15В показаны результаты определения PDT и PDL каждой экспериментальной группы;

[0041] На ФИГ. 16 показаны результаты подтверждения скорости пролиферации клеток, при которой моноклональные мезенхимальные стволовые клетки SCM04, полученные способом культивирования с субфракционированием, инокулируют при плотности 1000 или 4000 клеток/см², и указанные клетки культивируют с применением среды для культивирования LG-DMEM и α-МЕМ с антиоксидантом или без него;

[0042] На ФИГ. 16А показаны изменения числа клеток в зависимости от 1 пассажа (Р1) до 5 пассажа (Р5) каждой экспериментальной группы

[0043] На ФИГ. 16В показаны результаты определения PDT и PDL каждой экспериментальной группы;

[0044] На ФИГ. 17 показаны результаты подтверждения скорости пролиферации клеток, при которой моноклональные мезенхимальные стволовые клетки SCM05, полученные способом культивирования с субфракционированием, инокулируют при плотности 1000 или 4000 клеток/см², и указанные клетки культивируют с применением среды для культивирования LG-DMEM и α-МЕМ с антиоксидантом или без него;

[0045] На ФИГ. 17А показаны изменения числа клеток в зависимости от 1 пассажа (Р1) до 5 пассажа (Р5) каждой экспериментальной группы

[0046] На ФИГ. 17В показаны результаты определения PDT и PDL каждой экспериментальной группы;

[0047] На ФИГ. 18 показаны результаты подтверждения скорости пролиферации клеток, при которой моноклональные мезенхимальные стволовые клетки SCM06, полученные способом культивирования с субфракционированием, инокулируют при плотности 1000 или 4000 клеток/см², и указанные клетки культивируют с применением среды для культивирования LG-DMEM и α-МЕМ с антиоксидантом или без него;

[0048] На ФИГ. 18А показаны изменения числа клеток в зависимости от 1 пассажа (Р1) до 5 пассажа (Р5) каждой экспериментальной группы

[0049] На ФИГ. 18В показаны результаты определения PDT и PDL каждой экспериментальной группы;

[0050] На ФИГ. 19 показаны результаты подтверждения скорости пролиферации клеток, при которой моноклональные мезенхимальные стволовые клетки SCM07, полученные способом культивирования с субфракционированием, инокулируют при плотности 1000 или 4000 клеток/см², и указанные клетки культивируют с применением среды для культивирования LG-DMEM и α-МЕМ среда с антиоксидантом или без него;

[0051] На ФИГ. 19А показаны изменения числа клеток в зависимости от пассажа с 1 (Р1) по 5 (Р5) каждой экспериментальной группы

[0052] На ФИГ. 19В показаны результаты определения PDT и PDL каждой экспериментальной группы;

[0053] На ФИГ. 20 показаны результаты подтверждения скорости пролиферации клеток, при которой моноклональные мезенхимальные стволовые клетки SCM08, полученные способом культивирования с субфракционированием, инокулируют при плотности 1000 или 4000 клеток/см², и указанные клетки культивируют с применением среды для культивирования LG-DMEM и α-МЕМ с антиоксидантом или без него;

[0054] На ФИГ. 20А показаны изменения числа клеток в зависимости от 1 пассажа (Р1) до 5 пассажа (Р5) каждой экспериментальной группы

[0055] На ФИГ. 20 В показаны результаты определения PDT и PDL каждой экспериментальной группы;

[0056] На ФИГ. 21 показаны результаты подтверждения скорости пролиферации клеток экспериментальной группы, в которой применяют среду LG-DMEM без антиоксиданта, и плотность указанных клеток варьируют на уровне 1000 или 4000 клеток/см²;

[0057] На ФИГ. 22 показаны результаты подтверждения PDT и PDL экспериментальной группы, в которой применяют среду LG-DMEM без антиоксиданта, и плотность указанных клеток варьируют на уровне 1000 или 4000 клеток/см²;

[0058] На ФИГ. 23 показаны результаты подтверждения скорости пролиферации клеток экспериментальной группы, в которой применяют среду α-МЕМ с антиоксидантом, и плотность указанных клеток варьируют на уровне 1000 или 4000 клеток/см²;

[0059] На ФИГ. 24 показаны результаты подтверждения PDT и PDL экспериментальной группы, в которой применяют среду α-МЕМ с антиоксидантом, и плотность указанных клеток варьируют на уровне 1000 или 4000 клеток/см²;

[0060] На ФИГ. 25 показаны результаты подтверждения скорости пролиферации клеток экспериментальной группы, в которой плотность указанных клеток фиксируют на уровне 1000 клеток/см², а средой для культивирования является среда LG-DMEM или α-МЕМ; и

[0061] На ФИГ. 26 показаны результаты подтверждения PDT и PDL экспериментальной группы, в которой плотность указанных клеток фиксируют на уровне 1000 клеток/см², а средой для культивирования является среда LG-DMEM или α-МЕМ.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0062] В нижеследующем подробном описании изобретения приведена ссылка на прилагаемые чертежи, которые являются частью настоящего изобретения. Примеры вариантов реализации, описанные в подробном описании изобретения, чертежах и формуле изобретения, не являются ограничивающими. Можно использовать другие варианты реализации, и можно произвести другие изменения без отступления от сущности или объема представленного в настоящем документе объекта изобретения.

[0063] Настоящее изобретение обеспечивает способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток с субфракционированием и их пролиферации.

[0064] Способ согласно настоящему изобретению улучшает традиционные способы культивирования с субфракционированием, и обладает тем преимуществом, что моноклональные стволовые клетки, предпочтительно моноклональные мезенхимальные стволовые клетки, можно быстро получить без контаминации, и большое количество требуемых моноклональных стволовых клеток можно получить за короткий период времени в результате быстрой пролиферации моноклональных стволовых клеток, предпочтительно моноклональных мезенхимальных стволовых клеток.

[0065] Далее настоящее изобретение описано более подробно.

[0066] Настоящее изобретение обеспечивает способ культивирования стволовой клетки с субфракционированием и ее пролиферации, причем указанный способ включает стадии 1) культивирования клеток костного мозга, выделенного от индивидуума; 2) переноса только супернатанта согласно стадии 1) в новую емкость и культивирования указанного супернатанта; 3) отделения только супернатанта согласно стадии 2), культивирования указанного супернатанта в сосуде для культивирования при 37°С в течение от 1 до 3 часов, повторного культивирования супернатанта при 37°С в течение 12-36 часов от 2 до 3 раз, затем культивирования указанного супернатанта при 37°С в течение от 24 до 72 часов, при котором каждый супернатант переносят в новый сосуд для культивирования для повторного культивирования; 4) получения моноклональной стволовой клетки в конечном сосуде для культивирования; и 5) инокуляции указанной моноклональной стволовой клетки в среду для культивирования при плотности клеток от 50 до 1000 клеток/см² для культивирования указанной клетки.

[0067] Стадии 1) - 3) можно осуществить таким же образом, что и в способе культивирования с субфракционированием, описанным в заявке на патент Республики Корея №10-2006-0075676, и полное содержание заявки на патент Республики Корея №10-2006-0075676 может быть включено в настоящее описание посредством ссылки.

[0068] Применяемый в настоящем документе термин «способ культивирования с субфракционированием» относится к способу выделения стволовых клеток в зависимости от специфической (относительной) плотности, что указывает в этом случае на процесс, при котором костный мозг человека извлекают и культивируют в среде для культивирования клеток, затем получают только супернатант, переносят его в сосуд для культивирования с обработкой или без обработки последнего покрывающим агентом и культивируют, а затем процессы, описанные выше, повторяют несколько раз. Такой способ культивирования с субфракционированием характеризуется многократным получением и культивированием супернатанта без центрифугирования. Предпочтительно, чтобы моноклональные стволовые клетки, предпочтительно моноклональные мезенхимальные стволовые клетки, можно было в конечном итоге получить без контаминации другими клетками.

[0069] Культивирование на стадиях 2) и 3) осуществляют при 37°С в течение 4 часов или менее, предпочтительно в течение 1-3 часов, более предпочтительно в течение от 1 часа 30 минут до 2 часов 30 минут. Повторное культивирование осуществляют при 37°С в течение 4 часов или менее (предпочтительно в течение 1-3 часов, более предпочтительно от 1 часа 30 минут до 2 часов 30 минут), затем культивирование повторяют 2 или 3 раза при 37°С в течение 12-36 часов (предпочтительно в течение 18-30 часов). Дальнейшее культивирование осуществляют при 37°С в течение 24-72 часов (предпочтительно в течение 36-60 часов). Каждый супернатант можно переносить в новый сосуд для культивирования для проведения следующего эксперимента. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения краткое описание способа выделения выглядит следующим образом.

[0070] Культивированные клетки образуются в виде групп моноклональных клеток. Такие группы моноклональных клеток можно выделить и субкультивировать. Настоящее изобретение включает стадию 5) культивирования для быстрого сбора моноклональных стволовых клеток в больших количествах, которые можно получить способом культивирования с субфракционированием.

[0071] Стадия 5) представляет собой процесс инокуляции моноклональных стволовых клеток в среду для культивирования при плотности клеток 1000 клеток/см² или меньшей, предпочтительно от 50 до 1000 клеток/см².

[0072] Культура может предпочтительно представлять собой культуру 1-5 пассажа. Настоящее изобретение может индуцировать быструю пролиферацию моноклональных стволовых клеток, так что можно быстро получить конечный продукт. Кроме того, маточный банк клеток (МСВ) можно получить при помощи культуры 1-5 пассажа.

[0073] В случае, когда плотность моноклональных стволовых клеток согласно настоящему изобретению превышает 1000 клеток/см², так что моноклональные стволовые клетки культивируют при высокой плотности 4000 клеток/см² как в традиционном способе, способность указанных клеток к пролиферации можно заметно снизить, можно изменить маркеры мезенхимальных стволовых клеток, и можно исключить способность к дифференцировке. Таким образом, моноклональные стволовые клетки, полученные способом культивирования с субфракционированием, можно культивировать при низкой плотности или средней плотности, то есть при плотности клеток 1000 клеток/см² или меньшей, предпочтительно при плотности клеток от 50 до 1000 клеток/см², более предпочтительно при плотности клеток 1000 клеток/см².

[0074] В случае, когда моноклональные мезенхимальные стволовые клетки культивируют при плотности клеток 1000 клеток/см² или меньшей, способность клеток к пролиферации остается на чрезвычайно высоком уровне в течение длительного периода культивирования по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками, культивированными при высокой плотности 4000 клеток/см². Таким образом, данный способ обеспечивает то преимущество, что большое количество требуемых моноклональных клеток можно быстро получить без повторения большого числа пассажей. Кроме того, в случае, когда моноклональные мезенхимальные стволовые клетки культивируют при вышеуказанной плотности клеток, указанные клетки обладают тем преимуществом, что их ДНК может оказаться менее поврежденной, а сами они будут менее старыми, эффективно сохраняя таким образом способность стволовых клеток к дифференцировке. Таким образом, моноклональные мезенхимальные стволовые клетки можно быстро и незамедлительно получать с превосходными свойствами стволовых клеток.

[0075] Среда, применяемая в настоящем изобретении, может включать среду без антиоксиданта, среду, обогащенную антиоксидантом, или среду, содержащую антиоксидант.

[0076] Среда без антиоксиданта может, но не ограничиваться ею, включать среду DMEM. При необходимости антиоксидант можно дополнительно добавить к среде для проведения культивирования. При необходимости для проведения культивирования можно применять среду α-МЕМ, содержащую антиоксидант.

[0077] Антиоксиданты согласно настоящему изобретению могут включать, без ограничений, антиоксиданты, которые можно применять в культурах клеток. Они могут включать по меньшей мере одно выбранное из группы, состоящей из глутатиона, цистеина, цистеамина, убихинола, бета-меркаптоэтанола и аскорбиновой кислоты. Когда указанную среду обогащают антиоксидантом, указанный антиоксидант можно добавлять в концентрации от 10 до 50 мкг/мл, предпочтительно от 10 до 30 мкг/мл и более предпочтительно 25 мкг/мл.

[0078] В одном варианте реализации настоящего изобретения среду DMEM, более предпочтительно среду LG-DMEM, применяют в качестве среды без антиоксиданта, а среду α-МЕМ применяют в качестве среды, содержащей аскорбиновую кислоту в качестве антиоксиданта.

[0079] Между тем, согласно способу настоящего изобретения пролиферация моноклональных стволовых клеток может происходить очень эффективно, таким образом исключается процесс получения рабочего банка клеток (WCB) с применением МСВ. Это приводит к более простому способу по сравнению с традиционным способом культивирования с субфракционированием, в котором WCB необходимо получать после получения МСВ.

[0080] Культуру стадии 5) согласно настоящему изобретению можно охарактеризовать как культуру, полученную культивированием при плотности клеток 1000 клеток/см² или меньшей на 1-5 пассаже. Предпочтительно моноклональные стволовые клетки инокулируют и культивируют в среде при плотности клеток от 50 до 1000 клеток/см² в 1 пассаже. После пролиферации клеток, моноклональные стволовые клетки инокулируют и культивируют в среде при плотности клеток 1000 клеток/см² или меньшей в 2-5 пассаже, более предпочтительно от 700 до 1000 клеток/см² и еще более предпочтительно 1000 клеток/см².

[0081] В настоящем изобретении можно применять среду с антиоксидантом в качестве среды для культивирования. В указанную среду для культивирования можно добавить гентамицин в качестве антибиотика.

[0082] Мезенхимальные стволовые клетки, полученные способом согласно настоящему изобретению, в конечном итоге могут представлять собой мезенхимальные стволовые клетки 5-10 пассажа, предпочтительно мезенхимальные стволовые клетки 6-8 пассажа. Это более низкое число пассажей по сравнению с традиционным процессом, результатом которого являются мезенхимальные стволовые клетки, полученные по меньшей мере на 10-12 пассаже, свидетельствует о том, что плотность инокуляции клеток контролируют для легкого получения большого числа мезенхимальных стволовых клеток с быстрой пролиферацией при низком числе пассажей.

[0083] Полученные мезенхимальные стволовые клетки могут представлять собой не только моноклональные стволовые клетки, полученные способом культивирования с субфракционированием, но и также мезенхимальные стволовые клетки, эффективно сохраняющие свою способность к дифференцировке. В частности, моноклональные стволовые клетки, культивируемые при плотности клеток 1000 клеток/см² или меньшей, могут эффективно сохранять способность к дифференцировке в костную клетку по сравнению с теми клетками, которые культивировали при высокой плотности в более, чем 1000 клеток/см².

[0084] Далее настоящее изобретение будет подробно описано с приведением Примеров.

[0085] Следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и не ограничивают содержание настоящего изобретения.

[0086] Пример 1. Анализ мезенхимальных стволовых клеток в зависимости от плотности клеток

[0087] Для того, чтобы обеспечить дополнительный улучшенный способ культивирования стволовых клеток с субфракционированием и их пролиферации по сравнению со способом культивирования с субфракционированием, описанным в заявке на патент Республики Корея №10-2006-0075676, плотность клеток и среду для культивирования варьировали в условиях культивирования. Соответственно, сравнивали и анализировали характеристики полученных мезенхимальных стволовых клеток.

[0088] В экспериментах, как это показано ниже, плотности культуры клеток моноклональных мезенхимальных стволовых клеток (MSC), полученных способом культивирования с субфракционированием, варьировали на уровне 50 мкл/см² (низкая плотность), 1000 клеток/см² (средняя плотность) и 4000 клеток/см² (высокая плотность), анализируя таким образом характеристики указанным клеток.

[0089] 1.1 Подтверждение морфологических изменений MSC в зависимости от плотности клеток

[0090] Сначала эксперименты проводили для подтверждения морфологических изменений MSC в зависимости от плотности клеток в долгоживущей культуре. MSC 5 пассажа (Р5), 10 пассажа (Р10) и 15 пассажа (Р15) применяли для создания условий долгоживущей культуры. MSC инокулировали в среду DMEM в условиях низкой плотности, средней плотности и высокой плотности соответственно. После этого морфологические изменения клеток наблюдали через микроскоп для определения того, являлись ли стволовые клетки состарившимися. Результаты показаны на ФИГ. 2.

[0091] Как показано на ФИГ. 2, размер клетки и морфологическая картина пассажей Р5 и Р10 различались в зависимости от плотности клеток. В частности, в пассаже Р15, культивированном в условиях высокой плотности, наблюдали плоские и увеличенные MSC. Такая морфологическая форма указывает на обычное старение MSC, которое подтверждает, что контроль за плотностью клеток в долгоживущей культуре приводит к контролю старения MSC.

[0092] 1.2 Подтверждение размера и зернистости MSC в зависимости от плотности клеток

[0093] Для того, чтобы дополнительно подтвердить изменения стволовых клеток в зависимости от плотности клеток, размер клеток и зернистость, которые, как известно, увеличены в состарившихся клетках, анализировали с применением FACS-анализа. Таким образом, результаты показаны на ФИГ. 3.

[0094] Как показано на ФИГ. 3, существенная разница в размере клеток пассажа Р5 отсутствовала, однако в пассаже Р10 и Р15 наблюдали значительные различия в зависимости от плотности клеток. В частности, размеры клеток в Р10 и Р15 были значительно увеличены в условиях культивирования с высокой плотностью клеток, что таким образом способствовало дополнительному старению клеток. Аналогичным образом, зернистость клеток также значительно увеличивалась по мере увеличения плотности клеток во всех пассажах. Следовательно, контроль за плотностью клеток MSC в долгоживущей культуре может быть фактором для контроля за старением клеток. Кроме того, плотность культуры клеток уменьшают для улучшения морфологических изменений в позднем пассаже.

[0095] 1.3 Подтверждение старения MSC в зависимости от плотности культивированных клеток

[0096] Анализ окрашивания на определение бета-галактозидазы (бета-гал-окрашивание) осуществляли для подтверждения того, являлись ли морфологические изменения, подтвержденные в Примерах 1.1 и 1.2, фактически зависимым от старения явлением для MSC, при этом в результате анализа могут избирательно окрашиваться стареющие клетки, и ПЦР с обратной транскрипцией проводили для сравнения экспрессии связанных со старением генов пассажей Р15, Р16 и гена PCNA, маркера пролиферации. Результаты показаны на ФИГ. 4 и 5 соответственно.

[0097] Как показано на ФИГ. 4, в Р5 и Р10 не происходило окрашивание состарившихся клеток при всех плотностях клеток, но в Р15 происходило окрашивание состарившихся клеток, которое заметно увеличивалось по мере увеличения плотности клеток. Как показано на ФИГ. 5, в Р15 экспрессия генов CDK-ингибиторов Р15 и Р16, которые представляют собой связанные со старением гены, повышалась по мере увеличения плотности клеток, а содержание PCNA, который является маркером пролиферации, уменьшалось.

[0098] Эти результаты показывают, что морфологические изменения MSC связаны со старением MSC, и что путем манипуляции с плотностью клеток можно контролировать старение MSC.

[0099] 1.4 Подтверждение изменения способности MSC к пролиферации в зависимости от плотности культуры клеток

[00100] Известно, что способность MSC к пролиферации постепенно уменьшается по мере того, как клетки субкультивируют и подвергают старению. Поэтому способность к пролиферации можно применять в качестве критерия для подтверждения старения MSC. Таким образом, способность MSC к пролиферации в зависимости от плотности культуры клеток сравнивали во время долгоживущей культуры клеток. Способность каждой клетки к пролиферации определяли путем вычисления скорости пролиферации в зависимости от каждого из пассажей, применяя число клеток, которые первоначально были инокулированы, и число клеток, которые были получены после культивирования. Результаты показаны в Таблице 1 и на ФИГ. 6.

[00101]

[00102] Как показано в Таблице 1, кратность увеличения составляла 88,4, 34,3 и 16,4 в Р5, Р10 и Р15 соответственно, в MSC, культивированных при низкой плотности. Между тем, кратность увеличения в MSC, культивированных при средней плотности, составляла 8,5, 4,9 и 3,1 в Р5, Р10 и Р15 соответственно. Кроме того, кратность увеличения составляла 3,0, 1,9 и 1,1 в Р5, Р10 и Р15 соответственно в MSC, культивированных при высокой плотности. Как показано на ФИГ. 6, значения PDT и PDL также изменяются схожим образом, что и показатель кратности увеличения. Эти результаты свидетельствуют о том, что способность MSC к пролиферации можно сохранить за счет снижения плотности клеток в долгоживущей культуре MSC, и что даже при работе с одной и той же субкультурой старение MSC можно ингибировать, а продолжительность жизни MSC можно увеличивать.

[00103] 1.5 Подтверждение изменения потенциала MSC к дифференцировке в зависимости от плотности культуры клеток

[00104] Потенциалы к дифференцировке в зависимости от культур Р5-Р15 сравнивали для подтверждения того, влияет ли плотность клеток культуры на указанную способность стволовых клеток. Была подтверждена способность стволовых клеток дифференцироваться в адипоциты и остеоциты. Качественный и количественный анализ проводили при каждом пассаже и величине плотности. В частности, для получения среды для дифференцировки адипоцитов, в среду для культивирования DMEM с высоким содержанием глюкозы добавляли NCS (сыворотка новорожденного теленка) (Gibco), 10^-7 моль дексаметазона (Sigma), 0,5 мМ IBMX (Sigma), 10 мкг/мл инсулина (Sigma) и 100 мкМ индометацина (Sigma), а затем проводили указанный эксперимент.После 7-дневной дифференцировки, дифференцировку подтверждали гистохимическим окрашиванием с применением Oil red О. После гистохимического окрашивания с применением Oil red О, проводили элюирование изопропиловым спиртом и измеряли при 500 нм и количественно анализировали.

[00105] Получали среду для дифференцировки остеокластов и ее применяли, добавляя ФБС (Gibco), 50 мкг/мл аскорбинового 2-фосфата (Sigma), 10^-8 моль дексаметазона (Sigma) и 10 мМ β-глицерофосфата (Sigma) к среде α-МЕМ. После 21-дневной дифференцировки, дифференцировку подтверждали гистохимическим окрашиванием с применением ализарин красного S. После гистохимического окрашивания с применением ализарин красного S, проводили элюирование 10% уксусной кислотой, измеряли при 405 нм и количественно анализировали. Способность к дифференцировке в адипоциты и способность к дифференцировке в остеокласты подтверждали так, как это описано выше. Результаты показаны на ФИГ. 7.

[00106] Как показано на ФИГ. 7, потенциал к дифференцировке в адипоциты в целом понижался по мере увеличения пассажа, однако разница в зависимости от плотности не была очевидной. С другой стороны, потенциал к дифференцировке в остеокласты значимо снижался в группе культуры Р15 в условиях высокой плотности. Эти результаты показывают, что потенциал MSC к дифференцировке в остеокласты может лучше сохраняться при культивировании при низкой плотности клеток.

[00107] 1.6. Анализ профиля антигена MSC в зависимости от плотности культуры клеток

[00108] Эксперименты проводили для подтверждения того, влияет ли плотность культуры клеток на экспрессию антигена стволовых клеток. Проводили проточную цитометрию для подтверждения изменений при экспрессии положительного и негативного антигена в зависимости от каждого пассажа и плотности культуры. Результаты показаны в Таблице 2.

[00109]

[00110] Как показано в Таблице 2, изменение экспрессии негативного маркера не было явно очевидным, однако уровень экспрессии некоторых положительных маркеров изменялся в зависимости от плотности культуры клеток даже в том же самом пассаже. В частности, CD105 и CD146 продемонстрировали заметное понижение уровня экспрессии по мере увеличения плотности культуры клеток. Кроме того, экспрессия CD73, как правило, значительно понижалась по мере увеличения плотности культуры на Р10 или более высоком пассаже. В частности, когда клетки культивировали при высокой плотности на Р15, уровень экспрессии большинства положительных маркеров значительно снижался. Кроме того, CD73, CD105 и CD105 показали негативную экспрессию. Таким образом, культивирование клеток при низкой плотности клеток может быть критическим фактором.

[00111] 1.7 Сравнение образования АФК и повреждения ДНК в зависимости от плотности культуры клеток

[00112] Известно, что уменьшение функции мезенхимальных стволовых клеток ассоциируют с повреждением ДНК. В частности, повреждение ДНК, индуцированное АФК, которые представляют собой активные виды кислорода, как известно, способствует старению MSC. Таким образом, для подтверждения того, отличалось ли суммарное образование АФК от вызываемого ими повреждения ДНК, проводили анализ интенсивности флуоресценци для сравнения общего количества АФК в клетке в зависимости от пассажа и плотности культуры клеток. Кометный анализ проводили для подтверждения степени повреждения ДНК. Результаты показаны на ФИГ. 8.

[00113] Как показано на ФИГ. 8, суммарное образование АФК, как правило, увеличивалось по мере увеличения плотности культуры клеток во всех пассажах. В частности, образование АФК значительно увеличивалось в пассаже Р10 и Р15 (см. ФИГ. 8А). В кометном анализе данные классифицировали от СС1 с самым слабым повреждением ДНК до СС5 с самым тяжелым повреждением ДНК. СС5 с самым тяжелым повреждением ДНК демонстрировали значительное увеличение по мере увеличения плотности культуры клеток. С другой стороны, СС1, как правило, значительно уменьшались по мере увеличения плотности клеток (см. ФИГ. 8В).

[00114] Кроме того, для подтверждения того, вызвали ли АФК повреждение ДНК, был проведен эксперимент для подтверждения концентрации 8-OHdG, который мог идентифицировать повреждение ДНК, вызванное АФК. Анализ на определение 8-OHdG проводили следующим образом. 50 мкл образца ДНК, собранного из каждой клетки, помещали на покрытый в виде конъюгата 8-OHdG планшет и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем к планшету добавляли антитело против 8-OHdG, и указанную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехразовой промывки в каждую лунку добавляли конъюгат вида вторичное антитело-фермент и указанную смесь инкубировали при комнатной температуре еще 1 час. После трехразовой промывки добавляли раствор субстрата и указанную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. В конце к этой смеси добавляли останавливающий раствор. Интенсивность поглощения измеряли при 450 нм. Результаты показаны на ФИГ. 9.

[00115] Как показано на ФИГ. 9, по мере увеличения плотности культуры клеток, значительно и увеличивалась концентрация 8-OHdG в группе Р15, в которой повреждение ДНК было самым тяжелым. Эти результаты показывают, что АФК, образуемые в условиях культуры клеток высокой плотности, вызывали усиление повреждения ДНК, способствуя таким образом старению MSC.

[00116] Эти результаты показывают, что понижение плотности культуры клеток может играть роль в защите MSC от повреждения ДНК, которое вызывается увеличением образования АФК MSC.

[00117] 1.8 Подтверждение способности MSC к пролиферации и образованию АФК в зависимости от обработки антиоксидантом

[00118] Для подтверждения того, влияют ли АФК, образуемые в условиях культуры клеток высокой плотности, на пролиферацию MSC, проводили эксперимент по исключению АФК. 25 мкг/мл аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта добавляли в среду для культивирования в условиях культуры клеток высокой плотности на Р11-Р15. Затем между этими двумя группами сравнивали кратность увеличения пролиферации. Результаты показаны на ФИГ. 10.

[00119] Как показано на ФИГ. 10, кратность увеличения составляла 2,6, 1,9 и 1,6 на P11-Р15 в условиях культуры высокой плотности. По мере роста числа пассажей, уменьшалась способность к пролиферации, и в результате начиналось старение. Тем не менее обработка антиоксидантом индуцировала сохранение способности к пролиферации на высоком уровне в приблизительно 50% во всех пассажах. В группе обработки антиоксидантом увеличение кратности роста составляло 3,8, 2,9 и 2,5 в Р11-Р15 соответственно. Способность к пролиферации оставалась высокой даже в Р15.

[00120] В конечной точке Р15 уровни АФК подтверждали в двух группах клеток: только в условиях культуры высокой плотности и в условиях культуры высокой плотности + обработки антиоксидантом. Результаты показаны на ФИГ. 11.

[00121] Как показано на ФИГ. 11, уровень АФК также понижался при условии, при котором пролиферация увеличивалсь в результате обработки аскорбиновой кислотой в качестве антиоксиданта. Таким образом, культивирование MSC предпочтительно осуществляют при низкой плотности клеток, а не при высокой плотности клеток. Образование АФК, индуцированное культурой клеток высокой плотности, исключали применением антиоксиданта, что приводило таким образом к увеличению способности MSC к пролиферации. Другими словами, АФК в условиях высокой плотности ингибирировали способность MSC к пролиферации. По мере уменьшения плотности клеток, снижалось и образование АФК, и стимулировалась способность MSC к пролиферации.

[00122] В заключение, эти результаты свидетельствуют о том, что контроль за плотностью клеток в условиях культивирования при плотности 1000 клеток/см² или меньшей важен для сохранения способности моноклональных мезенхимальных стволовых клеток, полученных способом культивирования с субфракционированием, к пролиферации и культивированию. Культура с антиоксидантом ингибирует окислительный стресс, индуцированный культурой клеток, эффективно способствуя таким образом пролиферации MSC.

[00123] Пример 2. Подтверждение улучшенного способа культивирования с субфракционированием

[00124] Пример 1 подтвердил, что контроль за плотность клеток и добавление антиоксиданта могут являться ключевыми факторами при культивировании MSC, полученных способом культивирования с субфракционированием. Таким образом, эксперименты проводили для сравнения способности отдельной колонии MSC к пролиферации и их влияния на получение клеток при изменении плотности культуры клеток моноклональных мезенхимальных стволовых клеток, полученных традиционным способом, способом культивирования с субфракционированием, описанным в заявке на патент Республики Корея №10-2006-0075676, и с применением среды для культивирования, содержащей аскорбиновую кислоту в качестве антиоксиданта.

[00125] В описанной выше заявке на патент Республики Корея №10-2006-0075676 описано, что моноклональные клетки переносят в лунки в количестве 100-600 клеток на лунку и затем культивируют при плотности 4000 клеток на см² в своей субкультуре.

[00126] В частности, настоящее усовершенствование обеспечивает способ культивирования клеток для корректировки числа клеток до 1000 на см² в 1 пассаже (Р1), индуцирующий эффективную пролиферацию клеток. Кроме того, в субкультуре после 2 пассажа (Р2) клетки высевают в лунки в количестве 1000 клеток или меньшем, которое является показателем низкой плотности. Их сравнивают с влиянием культуры клеток с количеством клеток 4000. Кроме того, среду α-МЕМ, содержащую антиоксидант, и среду LG-DMEM, не содержащую антиоксиданта, применяют в качестве среды для культивирования клеток, сравнивая таким образом влияния пролиферации клеток.

[00127] Экспериментальные группы для подтверждения влияния улучшенного способа культивирования с субфракционированием показаны в Таблице 3. Улучшенные процессы схематически показаны на ФИГ. 12.

[00128]

[00129] Линии клеток разделяли способом культивирования с субфракционированием, которые обозначены как SCM01-SCM08 соответственно.

[00130] 2.1 Подтверждение эффекта пролиферации в зависимости от плотности линии клеток и среды

[00131] Клетки культивировали с применением линий клеток SCM01-SCM08. Для подтверждения эффекта пролиферации клеток в зависимости от субкультуры вплоть до 5 пассажа (Р5) сравнивали число клеток, время удвоения популяции (PDT) и уровень удвоения популяции (PDL). Результаты показаны на ФИГ. 13-20.

[00132] Как показано на ФИГ. 13-20, эффект пролиферации клеток всех экспериментальных групп, инокулированных и культивируемых при плотности клеток 1000 клеток на см², превосходил эффект пролиферации клеток экспериментальных групп, инокулированных и культивируемых при плотности клеток 4000 клеток на см². Кроме того, даже в той же группе с плотностью в 1000 клеток экспериментальная группа 1000-альфа, культивируемая в среде α-МЕМ, содержащей аскорбиновую кислоту в качестве антиоксиданта, проявляла более значительный эффект пролиферации клеток, чем другие группы.

[00133] 2.2 Сравнение эффекта пролиферации в зависимости от плотности линии клеток

[00134] Для более точного сравнения скорости пролиферации в зависимости от числа культивируемых клеток, LG-DMEM и α-МЕМ соответственно определяли в качестве сред для культивирования, а плотность инокуляции устанавливали на уровне 1000 и 4000 клеток соответственно. Соответствующим образом сравнивали эффект пролиферации клеток. Результаты показаны на ФИГ. 21-24.

[00135] Как показано на ФИГ. 21, в случае, когда линии клеток от SCM01 до SCM08, инокулированные при плотности 1000 клеток/см², культивировали в среде LG-DMEM, скорость пролиферации клеток пассажей Р2-Р5 была значительно выше, чем у группы, инокулированной при плотности 4000 клеток/см². Скорость пролиферации группы, инокулированной при плотности 1000 клеток/см², была по меньшей мере от 3,08 до по меньшей мере 48,50 раз выше по сравнению с группой, инокулированной при плотности 4000 клеток/см² в 5 пассаже (Р5). Далее, как показано на ФИГ. 22, значение PDT было также ниже или аналогично значению PDT при инокуляции клеток с плотностью 4000 клеток/см² в каждой линии клеток, а значение PDL было выше, чем при инокуляции клеток с плотностью 4000 клеток/см² во всех линиях клеток.

[00136] Кроме того, как показано на ФИГ. 23, в случае, когда все линии клеток SCM01-SCM08, культивированные в среде α-МЕМ, инокулировали и культивировали при плотности 1000 клеток/см², наблюдали тенденции, аналогичные тенденциям экспериментальных групп со средой DMEM. Скорость пролиферации группы, инокулированной при плотности 1000 клеток/см², была по меньшей мере от 6,32 до не более 85,63 раз выше по сравнению с группой, инокулированной при плотности 4000 клеток/см² в 5 пассаже (Р5). Далее, как это показано на ФИГ. 24, значение PDT было также ниже или аналогично значению PDT при инокуляции клеток с плотностью 4000 клеток/см² во всех линиях клеток, а значение PDL было выше, чем значение PDL при инокуляции клеток с плотностью 4000 клеток/см² при инокуляции во всех линиях клеток.

[00137] Эти результаты показывают, что инокуляция клеток при плотности 1000 клеток/см² или меньшей может индуцировать быструю пролиферацию моноклональных мезенхимальных стволовых клеток по сравнению с инокуляцией линии клеток с высокой плотностью 4000 клеток на см².

[00138] 2.3 Сравнение эффекта пролиферации в зависимости от среды для культивирования

[00139] Пример 2.2 подтвердил, что культура с плотностью 1000 клеток/см² продемонстрировала превосходный эффект пролиферации по сравнению с культурой с плотностью 4000 клеток/см². Таким образом, эксперимент проводили для сравнения эффекта пролиферации клеток при установлении числа клеток на уровне 1000 клеток/см², и среду варьировали в качестве переменного фактора. Таким образом, эффект пролиферации дополнительно подтверждали в зависимости от условий среды для культивирования. Указанные результаты показаны на ФИГ. 25 и 26.

[00140] Как показано на ФИГ. 25, скорости пролиферации клеток сравнивали между средами α-МЕМ и DMEM. Результаты показали, что скорость пролиферации группы с применением α-МЕМ была по меньшей мере в 1,77-6,3 раза выше по сравнению со скоростью группы с применением LG-DMEM. Кроме того, как это показано на ФИГ. 26, PDT было низким во всех группах со средой α-МЕМ, a PDL увеличивался во всех группах со средой α-МЕМ.

[00141] Эти результаты свидетельствуют о том, что эффективность пролиферации клеток можно максимизировать путем культивирования клеток с применением среды, содержащей антиоксидант, в дополнение к манипуляции с плотностью инокуляции клеток в 1000 клеток или меньшей на см² и культурой клеток от 2 пассажа (Р2) до 5 пассажа (Р5).

[00142] Пример 3. Определение процесса улучшения

[00143] Описанные выше примеры подтвердили, что контроль за плотностью клеток и добавление антиоксиданта могут быть важными факторами при культивировании MSC. На основе традиционного способа культивирования с субфракционированием, описанного в заявке на патент Республики Корея №10-2006-0075676, процесс улучшения проводили путем изменения плотности культуры клеток и условий среды для эффективного получения одиночной колонии мезенхимальных стволовых клеток. Все данные представлены в нижеследующей Таблице 4 (условия культивирования с применением среды DMEM) и Таблице 5 (условия культивирования с применением среды α-МЕМ).

[00144]

[00145]

[00146] Более конкретно, процесс культивирования с субфракционированием и пролиферацию культуры мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга согласно настоящему изобретению, осуществляли следующим образом.

[00147] Донору костного мозга проводили анестезию бедра анестетиками для местного применения. Затем костный мозг собирали, прокалывая бедренную кость иглой. 14 мл модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (DMEM, GIBCO-BRL, Life-технологии, MD, США), содержащей 20% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина, и 1 мл костного мозга человека помещали в 100-миллилитровый сосуд для культивирования, и смесь культивировали в инкубаторе для роста клеток в атмосфере 5% СО₂ при 37°С в течение 2 часов. После культивирования сосуд для культивирования слегка наклоняли в одну сторону, и в новый сосуд переносили только супернатант из указанного сосуда для культивирования одновременно, не допуская перелива прикрепленных к дну клеток.

[00148] Аналогичную процедуру повторяли еще раз, и полученный культуральный раствор переносили в сосуд для культивирования (Becton Dickinson), дно которого было покрыто коллагеном, и культивировали при 37°С в течение 2 часов. Культуральный раствор переносили в новый сосуд, покрытый коллагеном. Через 24 часа культуральный раствор переносили в новую емкость. Затем повторно через 24 часа культуральный раствор переносили в новый сосуд. В конечном итоге через 48 часов культуральный раствор переносили в новый сосуд. Затем визуально подтверждали, что оставшиеся клетки выросли и что произошла их адгезия ко дну сосуда для культивирования. Можно было предположить, что клетки, которые могут «дойти» до этой стадии через процесс культивирования с субфракционированием, будут намного мельче, чем другие клетки. Примерно через 10-14 дней клетки образовывали одиночную колонию. Указанные группы моноклональных клеток обрабатывали трипсином для их выделения. Затем указанные клетки переносили в 6-луночный сосуд для культивирования при плотности 50-200 клеток/см². Клетки культивировали в инкубаторе для роста клеток в атмосфере 5% СО₂ при 37°С в течение 4-5 дней. Затем, когда рост клеток составлял приблизительно 80%, клетки обрабатывали смесью 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА (GIBCO-BRL), получая таким образом клетки. Затем указанные клетки переносили в сосуд для культивирования объемом 75 см² и субкультивировали.

[00149] В случае, когда клетки культивировали при плотности клеток, которую уменьшали до 1000 клеток/см² на раннем 2-5 пассаже, при этом другие процедуры регулировали схожим образом, способность к пролиферации и характеристики стволовых клеток MSC сохранялись на превосходном уровне с индуцированием эффективной пролиферации даже в том же самом пассаже. В частности, в случае, когда клетки культивировали при пониженной плотности клеток, описанной выше, можно было исключить процесс получения рабочего банка клеток (WCB) MSC, который требуется в традиционном процессе, эффективно сокращая таким образом время образования клеток. В частности, в случае, когда снижается число пассажей, можно получить в большом количестве менее состарившиеся клетки. Ожидается, что такие клетки применяют в качестве терапевтического агента для достижения превосходного терапевтического эффекта.

[00150] Кроме того, когда среду α-МЕМ, обогащенную антиоксидантом, применяют в качестве среды для культивирования, обработка антиоксидантом может эффективно уменьшать вызываемый АФК стресс, индуцированный в культуре клеток высокой плотности, и восстанавливать способность клеток MSC к пролиферации, значительно сокращая таким образом число пассажей клеток и способствуя быстрому и стабильному получению отдельных колоний MSC в свежем состоянии без старения, которое сохраняет характеристики MSC.

[00151] Таким образом, культура клеток низкой плотности позволяет не только получать число клеток в молодой культуре, упрощая таким образом процесс их получения, но и также получать нестареющие клетки с сохранением интактных характеристик MSC в долгоживущей культуре. Таким образом, это приводит к получению высококачественных стволовых клеток. Соответственно, ожидается, что такие клетки являются чрезвычайно подходящими для крупномасштабной технологии производства для разработки клеточного терапевтического агента.

[00152] Из вышесказанного будет понятно, что различные варианты реализации настоящего изобретения описаны в настоящем документе для иллюстративных целей, и что можно произвести различные модификации, не выходя за пределы объема и сущности настоящего изобретения. Соответственно, различные варианты реализации, описанные в настоящем документе, не предназначены для ограничения настоящего изобретения, при этом истинный объем и сущность указаны в нижеследующей формуле изобретения.

1. Способ культивирования стволовой клетки с субфракционированием и ее пролиферации, причем указанный способ включает стадии:

1) культивирования клеток костного мозга, выделенного от индивидума;

2) переноса только супернатанта со стадии 1) в новую емкость и культивирования указанного супернатанта;

3) отделения только супернатанта со стадии 2), культивирования указанного супертананта в сосуде для культивирования при 37°С в течение 1-3 часов, повторного культивирования супернатанта при 37°С в течение 12-36 часов от 2 до 3 раз, затем культивирования супернатанта при 37°С в течение 24-72 часов, причем каждый супернатант переносят в новый сосуд для культивирования для повторного культивирования;

4) получения моноклональной стволовой клетки в конечном сосуде для культивирования; и

5) инокуляции указанной моноклональной стволовой клетки в среду для культивирования при плотности клеток от 50 до 1000 клеток/см² для культивирования указанной клетки.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культура согласно стадии 5) представляет собой культуру 1-5 пассажа.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культура согласно стадии 5) получена инокуляцией указанной моноклональной стволовой клетки в среду для культивирования при плотности клеток 1000 клеток/см².

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная среда для культивирования согласно стадии 5) обогащена антиоксидантом.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанный антиоксидант добавлен в концентрации от 10 мкг/мл до 30 мкг/мл.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная среда для культивирования согласно стадии 5) представляет собой среду DMEM или среду α-МЕМ.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культура согласно стадии 5) получена на 1 пассаже инокуляцией указанной моноклональной стволовой клетки в указанную среду для культивирования при плотности клеток от 50 до 1000 клеток/см² для культивирования указанной клетки.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культура согласно стадии 5) получена на 2-5 пассаже инокуляцией указанной моноклональной стволовой клетки в указанную среду для культивирования при плотности клеток от 700 до 1000 клеток/см² для культивирования указанной клетки.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная среда для культивирования согласно стадии 5) обогащена гентамицином.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная стволовая клетка, полученная указанным способом, представляет собой стволовую клетку 5-10 пассажа.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная стволовая клетка, полученная указанным способом, обладает способностью к дифференцировке в остеоциты.