Активируемые антитела, которые связываются с рецептором эпидермального фактора роста, и способы их применения

Авторы патента:

ВАСИЛЬЕВА Ольга (US)

ДЕНУАЕР Люк Ролан (US)

СЭЙДЖЕРТ Джейсон Гэри (US)

ЛЮ Шоучунь (US)

ЛОУМАН Генри Бернард (US)

МЕНЕНДЕС Элизабет-Эдна Мэри (US)

УЭСТ Джеймс Уилльям (US)

G01N33/57492 - Исследование или анализ материалов особыми способами, не отнесенными к предыдущим группам

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

G01N2333/71 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

C12P21/08 - моноклональные антитела

C12N15/63 - введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии

C12N15/13 - иммуноглобулины

C07K2317/56 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

C07K16/46 - гибридные иммуноглобулины (гибриды иммуноглобулина с пептидом, не являющимся иммуноглобулином C07K 19/00)

C07K16/2863 - Иммуноглобулины, например моноклональные или поликлональные антитела

C07K16/28 - против рецепторов, клеточных поверхностных антигенов или клеточных поверхностных детерминантов

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

A61K47/6849 - Лекарственные препараты, отличающиеся используемыми неактивными ингредиентами, например носителями, инертными добавками

A61K39/3955 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

Владельцы патента RU 2713121:

САЙТОМКС ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. (US)

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено активируемое антитело, которое в активированном состоянии связывает рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), включающее антитело, маскирующий фрагмент, который в нерасщепленном состоянии ингибирует связывание антитела с EGFR, и расщепляемый фрагмент, который функционирует в качестве субстрата для протеазы. Также рассмотрены: нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело; вектор; способы получения активируемого антитела; способ лечения или задержки прогрессии нарушения, связанного с EGFR; способ ингибирования ангиогенеза; способ обнаружения присутствия или отсутствия расщепляемого агента и EGFR; способ и набор для идентификации или уточнения популяции больных для лечения нарушения, связанного с EGFR; применение активируемого антитела в производстве лекарственного средства. Активируемое антитело по настоящему изобретению обладает пониженной токсичностью и может найти дальнейшее применение в терапии. 11 н. и 59 з.п. ф-лы, 23 ил., 9 табл., 12 пр.

В этой заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 61/639796, поданной 27 апреля 2012 г.; предварительной заявки США № 61/662204, поданной 20 июня 2012 г.; предварительной заявки США № 61/749220, поданной 4 января 2013 г.; предварительной заявки США № 61/749529, поданной 7 января 2013 г., и предварительной заявки США № 61/763237, поданной 11 февраля 2013 г.; каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в целом к активируемым антителам, которые специфически связываются с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), к конъюгированным активируемым антителам, которые специфически связываются с EGFR, и к способам получения и применения этих активируемых антител против EGFR и/или конъюгированных активируемых антител против EGFR в различных терапевтических, диагностических и профилактических целях.

Известный уровень техники

Для лечения некоторых заболеваний доказана эффективность методов терапии, основанных на антителах, но в некоторых случаях токсичность, обусловленная распространенной экспрессией мишени, ограничивает их терапевтическую эффективность. Кроме того, для лекарств на основе антител характерны другие ограничения, такие как быстрое выведение из кровотока после введения.

В области терапии на основе малых молекул разработаны стратегии обеспечения пролекарствами активного химического соединения. Такие пролекарства вводят в относительно неактивной (или значительно менее активной) форме. После введения пролекарство метаболизируется in vivo в активное соединение. Такие стратегии, основанные на пролекарствах, могут обеспечить повышенную селективность лекарственного средства в отношении предназначенной мишени и уменьшить побочные эффекты.

Таким образом, в области терапии на основе антител существует постоянная потребность в антителах, которые имитируют желаемые характеристики пролекарства для малой молекулы.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к активируемым антителам, включающим антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), соединенным с маскирующим фрагментом (MM) так, что связь с MM снижает способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с EGFR. В предпочтительном варианте осуществления MM соединен через последовательность, включающую субстрат протеазы, например, протеазы, которая локализуется совместно с EGFR в области лечения индивидуума. Активируемые антитела против EGFR, предлагаемые в настоящем описании, стабильны в кровотоке, активируются в областях, предназначенных для лечения и/или диагностики, но не в нормальной, т.е. здоровой ткани, и при активации проявляют способность связываться с EGFR, которая, по меньшей мере, сопоставима со способностью соответствующего немодифицированного антитела.

В настоящем изобретении предлагаются конъюгированные активируемые антитела, включающие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), соединенные с маскирующим фрагментом (MM) так, что связь с MM снижает способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с EGFR, и где активируемое антитело конъюгируют с одним или более дополнительными агентами. В предпочтительном варианте осуществления конъюгированных активируемых антител MM соединен через последовательность, включающую субстрат протеазы, например, протеазы, которая локализуется совместно с EGFR в области лечения индивидуума. Конъюгированные активируемые антитела против EGFR, предлагаемые в настоящем описании, стабильны в кровотоке, активируются в областях, предназначенных для лечения и/или диагностики, но не в нормальной, т.е. здоровой ткани, и при активации проявляют способность связываться с EGFR, которая, по меньшей мере, сопоставима со способностью соответствующего немодифицированного антитела.

Изобретение относится к способам лечения, профилактики и/или задержки наступления или прогрессии, или облегчения симптома состояния, например, заболевания или нарушения, связанного с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR, например, нарушения, связанного с EGFR, у индивидуума с использованием терапевтической молекулы, например, активируемых антител, которые в активированном состоянии связываются с EGFR, и/или конъюгированных активируемых антител, которые в активированном состоянии связываются с EGFR, в частности активируемых антител и/или конъюгированных активируемых антител, которые при активации связывают и нейтрализуют или иным образом ингибируют, по меньшей мере, одну биологическую активность EGFR и/или опосредованные EGFR пути передачи сигнала.

Активируемые антитела, описанные в данном документе, в активированном состоянии связываются с EGFR и включают (i) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (AB), которые специфически связываются с EGFR, где AB представляет собой цетуксимаб или его производное; (ii) маскирующий фрагмент (MM), который ингибирует связывание AB активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с EGFR; и (с) расщепляемый фрагмент (CM), соединенный с АВ, где CM представляет собой полипептид, который функционирует в качестве субстрата протеазы.

В некоторых вариантах осуществления MM имеет равновесную константу диссоциации связывания с AB, которая выше равновесной константы диссоциации связывания AB с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления MM имеет равновесную константу диссоциации связывания с AB, которая не выше равновесной константы диссоциации связывания AB с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления MM не мешает связыванию AB или не конкурирует с AB активируемого антитела в расщепленном состоянии за связывание с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления протеаза локализуется в ткани совместно с EGFR, и протеаза расщепляет СМ активируемого антитела, когда активируемое антитело подвергается воздействию протеазы. В некоторых вариантах осуществления протеаза является неактивной или значительно менее активной в тканях, которые существенно не экспрессируют EGFR. В некоторых вариантах осуществления протеаза неактивна или существенно менее активна в здоровых, например, непораженных тканях.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-MM.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает линкерный пептид между MM и CM.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает линкерный пептид между СМ и AB.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает первый линкерный пептид (LP1) и второй линкерный пептид (LP2), и где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: ММ-LP1-CM-LP2-AB или AB-LP2-CM-LP1-MM. В некоторых вариантах осуществления два линкерных пептида не обязательно должны быть идентичными друг другу.

В некоторых вариантах осуществления AB при связывании с EGFR имеет равновесную константу диссоциации около 100 нМ или менее.

В некоторых вариантах осуществления MM представляет собой полипептид, состоящий из приблизительно от 2 до 40 аминокислот в длину, например, не превышающий 40 аминокислот в длину.

В некоторых вариантах осуществления последовательность полипептида MM отличается от последовательности EGFR, и последовательность полипептида MM не более чем на 50% идентична любому природному партнеру связывания AB.

В некоторых вариантах осуществления СМ расположен в активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела с EGFR снижается с возникновением равновесной константы диссоциации, которая, по меньшей мере, в 20 раз выше, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления СМ расположен в активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела с EGFR снижается с возникновением равновесной константы диссоциации, которая, по меньшей мере, в 100 раз выше, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления СМ расположен в активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела с EGFR снижается с возникновением равновесной константы диссоциации, которая, по меньшей мере, в 200 раз выше, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления присоединение MM снижает способность AB связываться с EGFR таким образом, что константа диссоциации (K_d) связывания AB, соединенного с ММ, с EGFR, по меньшей мере, в 20 раз выше, чем K_d связывания АВ, не соединенного с ММ, с EGFR. В некоторых вариантах осуществления присоединение MM снижает способность AB связываться с EGFR таким образом, что К_d связывания AB, соединенного с ММ, с EGFR, по меньшей мере, в 100 раз выше, чем K_d связывания АВ, не соединенного с ММ, с EGFR. В некоторых вариантах осуществления присоединение MM снижает способность AB связываться с EGFR таким образом, что К_d связывания AB, соединенного с ММ, с EGFR, по меньшей мере, в 1000 раз выше, чем K_d связывания АВ, не соединенного с ММ, с EGFR. В некоторых вариантах осуществления присоединение MM снижает способность AB связываться с EGFR таким образом, что К_d связывания AB, соединенного с ММ, с EGFR, по меньшей мере, в 10000 раз выше, чем K_d связывания АВ, не соединенного с ММ, с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления СМ представляет собой полипептид, состоящий из до 15 аминокислот в длину.

В некоторых вариантах осуществления в присутствии EGFR MM снижает способность AB связываться с EGFR, по меньшей мере, на 90%, когда CM не расщеплен, по сравнению с расщепленным СМ при тестировании in vitro с использованием анализа с заменой мишени, такого как, например, анализ, описанный в публикациях РСТ №№ WO 2009/025846 и WO 2010/081173.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с EGFR. В некоторых вариантах осуществления антитело или его иммунологически активный фрагмент, которые связываются с EGFR, представляют собой моноклональное антитело, домен антитела, одну цепь, Fab-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент, scFv, scab, dAb, один домен тяжелой цепи антитела и один домен легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления такое антитело или его иммунологически активный фрагмент, которые связываются с EGFR, представляют собой мышиное, гибридное, гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело, которое в активированном состоянии связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (AB), которые специфически связываются с EGFR, где AB включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 68; маскирующий фрагмент (MM), который ингибирует связывание AB активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с EGFR, где маскирующий фрагмент включает аминокислотную последовательность CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14); и расщепляемый фрагмент (CM), соединенный с АВ, где CM представляет собой полипептид, который функционирует в качестве субстрата протеазы, и где СМ включает аминокислотную последовательность LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13), где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело, которое в активированном состоянии связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (AB), которые специфически связываются с EGFR, где AB включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 68; маскирующий фрагмент (MM), который ингибирует связывание AB активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с EGFR, где маскирующий фрагмент включает аминокислотную последовательность CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14); и расщепляемый фрагмент (CM), соединенный с АВ, где CM представляет собой полипептид, который функционирует в качестве субстрата протеазы, и где СМ включает аминокислотную последовательность LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13), где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающей SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающей SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающей SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления СМ является субстратом фермента, выбранного из группы, состоящей из uPA, легумаина и MT-SP1. В некоторых вариантах осуществления фермент включает uPA. В некоторых вариантах осуществления фермент включает легумаин. В некоторых вариантах осуществления фермент включает МТ-SP1.

В некоторых вариантах осуществления СМ включает аминокислотную последовательность LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13).

В некоторых вариантах осуществления MM имеет не более 25% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR. В некоторых вариантах осуществления MM имеет не более 10% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления MM включает аминокислотную последовательность CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14).

В некоторых вариантах осуществления LP1 включает аминокислотную последовательность GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 23).

В некоторых вариантах осуществления LP2 включает аминокислотную последовательность GSSGT (SEQ ID NO: 24) или GSSG (SEQ ID NO: 37).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR подвергается действию uPA или MT-SP1 и расщепляется ими таким образом, что в активированном или расщепленном состоянии активированное антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 69. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR подвергается действию легумаина и расщепляется им таким образом, что в активированном или расщепленном состоянии активированное антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 70.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело также включает агент, конъюгированный с AB. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой терапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой противоопухолевый агент. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой токсин или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой вещество, выбранное из группы, указанной в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой доластатин. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой ауристатин или его производное. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой ауристатин Е или его производное. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой монометилауристатин E (MMAE). В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой мейтансиноид или производное мейтансиноида. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой DM1 или DM4. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой дуокармицин или его производное. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой калихеамицин или его производное.

В некоторых вариантах осуществления агент конъюгируют с AB через линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер выбран из группы, состоящей из линкеров, представленных в таблицах 2 и 3.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает также поддающуюся определению часть молекулы. В некоторых вариантах осуществления поддающаяся определению часть представляет собой диагностический агент. В некоторых вариантах осуществления поддающаяся определению часть представляет собой конъюгируемый регистрируемый реагент. В некоторых вариантах осуществления поддающаяся определению часть представляет собой, например, производное флуоресцеина, такое как флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает также сигнальный пептид. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид конъюгирован с активируемым антителом через спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер конъюгирован с активируемым антителом в отсутствие сигнального пептида. В некоторых вариантах осуществления спейсер соединен непосредственно с MM активируемого антитела. В некоторых вариантах осуществления спейсер включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает спейсер с последовательностью QGQSGQ (SEQ ID NO: 38), соединенный непосредственно с последовательностью MM CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14) при структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-MM-CM-AB. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает спейсер, соединенный непосредственно с последовательностью ММ, и включает аминокислотную последовательность QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59) при структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-ММ-CM-AB.

В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 5 дней при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 4 дня при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 3 дня при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 2 дня при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 24 часа при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 20 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 18 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 16 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 14 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 12 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 10 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 8 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 6 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 4 часа при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 3 часа при введении в организм.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR является моноспецифичным. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR является мультиспецифичным, например, в качестве неограничивающего примера, биспецифичным или триспецифичным. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR составляют в виде части молекулы про-биспецифичного стимулятора работы Т-клеток (BITE). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR составляют в виде части Т-клетки, модифицированной прогибридным рецептором антигена (CAR) или другим сконструированным рецептором.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело, которое в активированном состоянии связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (AB), которые специфически связываются с EGFR, где AB включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 68; маскирующий фрагмент (MM), который ингибирует связывание AB активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с EGFR, где маскирующий фрагмент включает аминокислотную последовательность CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14); и расщепляемый фрагмент (CM), соединенный с АВ, где CM представляет собой полипептид, который функционирует в качестве субстрата протеазы, и где СМ включает аминокислотную последовательность LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13), где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело, которое в активированном состоянии связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (AB), которые специфически связываются с EGFR, где AB включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 68; маскирующий фрагмент (MM), который ингибирует связывание AB активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с EGFR, где маскирующий фрагмент включает аминокислотную последовательность CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14); и расщепляемый фрагмент (CM), соединенный с АВ, где CM представляет собой полипептид, который функционирует в качестве субстрата протеазы, и где СМ включает аминокислотную последовательность LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13), где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления его антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab-фрагмента, F(ab')₂-фрагмента, scFv и scAb.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает сочетание тяжелых и легких цепей, выбранных из группы, состоящей из: тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; и тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 68.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления AB имеет равновесную константу диссоциации связывания с EGFR приблизительно 100 нМ или менее.

В некоторых вариантах осуществления MM имеет равновесную константу диссоциации связывания с AB, которая выше, чем равновесная константа диссоциации связывания AB с EGFR. В некоторых вариантах осуществления MM не мешает связыванию AB активируемого антитела в расщепленном состоянии или не конкурирует с ним за связывание с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления MM представляет собой полипептид, состоящий из не более 40 аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления последовательность полипептида MM отличается от EGFR, и последовательность полипептида MM не более чем на 50% идентична любому природному партнеру связывания AB. В некоторых вариантах осуществления MM имеет не более 25% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR. В некоторых вариантах осуществления MM имеет не более 10% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления СМ представляет собой полипептид, состоящий из до 15 аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления СМ является субстратом фермента, выбранного из группы, состоящей из uPA, легумаина и MT-SP1. В некоторых вариантах осуществления фермент включает uPA. В некоторых вариантах осуществления фермент включает легумаин. В некоторых вариантах осуществления фермент включает МТ-SP1. В некоторых вариантах осуществления протеаза локализована в ткани совместно с EGFR, где протеаза расщепляет СМ активируемого антитела, когда активируемое антитело подвергается воздействию протеазы.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает линкерный пептид между MM и CM. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает линкерный пептид между CM и AB. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает первый линкерный пептид (LP1) и второй линкерный пептид (LP2), и активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-LP1-CM-LP2-AB или AB-LP2-CM-LP1-MM. В некоторых вариантах осуществления два линкерных пептида не обязательно должны быть идентичны друг другу.

В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (GS)_n, (GGS)_n, (GSGGS)_n (SEQ ID NO: 15) и (GGGS)_n (SEQ ID NO: 16), где n представляет собой целое число, по меньшей мере, единицу. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGSG (SEQ ID NO: 17), GGSGG (SEQ ID NO: 18), GSGSG (SEQ ID NO: 19), GSGGG (SEQ ID NO: 20), GGGSG (SEQ ID NO: 21) и GSSSG (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах осуществления LP1 включает аминокислотную последовательность GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 23). В некоторых вариантах осуществления LP2 включает аминокислотную последовательность GSSGT (SEQ ID NO: 24) или GSSG (SEQ ID NO: 37).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR подвергается действию uPA или MT-SP1 и расщепляется ими таким образом, что в активированном или расщепленном состоянии активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 69. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR подвергается действию легумаина и расщепляется им таким образом, что в активированном или расщепленном состоянии активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 70.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает также агент, конъюгированный с AB. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой терапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой противоопухолевый агент. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой токсин или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой агент, выбранный из группы, представленной в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой доластатин. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой ауристатин или его производное. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой ауристатин Е или его производное. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой монометилауристатин E (MMAE). В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой мейтансиноид или производное мейтансиноида. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой DM1 или DM4. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой дуокармицин или его производное. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой калихеамицин или его производное.

В некоторых вариантах осуществления агент конъюгирован с AB через линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер выбран из группы, состоящей из линкеров, представленных в таблицах 2 и 3.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает также регистрируемый компонент. В некоторых вариантах осуществления регистрируемым компонентом является диагностический агент. В некоторых вариантах осуществления регистрируемым компонентом является конъюгируемый детектируемый реагент. В некоторых вариантах осуществления регистрируемым компонентом является, например, производное флуоресцеина, такое как изотиоцианат флуоресцеина (ФИТЦ).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает также сигнальный пептид. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид конъюгирован с активируемым антителом через спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер конъюгирован с активируемым антителом в отсутствие сигнального пептида. В некоторых вариантах осуществления спейсер соединен непосредственно с MM активируемого антитела. В некоторых вариантах осуществления спейсер включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает спейсер с последовательностью QGQSGQ (SEQ ID NO: 38), соединенный непосредственно с последовательностью MM CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14) при структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-ММ-CM-AB. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает спейсер, соединенный непосредственно с последовательностью ММ, и включает аминокислотную последовательность QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59) в структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-ММ-CM-AB.

Настоящее изобретение также относится к конъюгированным активируемым антителам, которые в активированном состоянии связываются с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), и они включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (AB), которые специфически связываются с EGFR; маскирующий фрагмент (MM), который ингибирует связывание AB активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с EGFR; расщепляемый фрагмент (CM), соединенный с АВ, где CM представляет собой полипептид, который функционирует в качестве субстрата протеазы, и цитотоксический агент.

В некоторых вариантах осуществления AB представляет собой цетуксимаб или его производное.

В некоторых вариантах осуществления конъюгированных активируемых антител, их антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab-фрагмента, F(ab')₂-фрагмента, scFv, scAb, dAb, одного домена тяжелой цепи антитела и одного домена легкой цепи антитела.

В некоторых вариантах осуществления AB конъюгированного активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB конъюгированного активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела AB имеет равновесную константу диссоциации связывания с EGFR приблизительно 100 нМ или менее.

В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела MM имеет равновесную константу диссоциации связывания с AB, которая является более высокой, чем равновесная константа диссоциации связывания AB с EGFR. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела MM не мешает AB активируемого антитела в расщепленном состоянии или не конкурирует с ним за связывание с EGFR. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела MM представляет собой полипептид, состоящий из не более 40 аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела полипептидная последовательность MM отличается от EGFR, и полипептидная последовательность MM не более чем на 50% идентична любому природному партнеру связывания AB. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела MM имеет не более 25% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела MM имеет не более 10% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR. В некоторых вариантах осуществления активируемого конъюгированного антитела MM включает аминокислотную последовательность CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14).

В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела CM представляет собой полипептид, состоящий до 15 аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела СМ является субстратом фермента, выбранного из группы, состоящей из uPA, легумаина и MT-SP1. В некоторых вариантах осуществления фермент включает uPA. В некоторых вариантах осуществления фермент включает легумаин. В некоторых вариантах осуществления фермент включает МТ-SP1. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела CM включает аминокислотную последовательность LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13).

В некоторых вариантах осуществления конъюгированное активируемое антитело включает линкерный пептид между MM и CM. В некоторых вариантах осуществления конъюгированное активируемое антитело включает линкерный пептид между CM и AB. В некоторых вариантах осуществления конъюгированное активируемое антитело включает первый линкерный пептид (LP1) и второй линкерный пептид (LP2), и где конъюгированное активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: ММ-LP1-CM-LP2-AB или AB-LP2-CM-LP1-MM. В некоторых вариантах осуществления два линкерных пептида не обязательно должны быть идентичны друг другу.

В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела, по меньшей мере, один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (GS)_n, (GGS)_n, (GSGGS)_n (SEQ ID NO: 15) и (GGGS)_n (SEQ ID NO: 16), где n представляет собой целое число, по меньшей мере, единицу. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела, по меньшей мере, один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGSG (SEQ ID NO: 17), GGSGG (SEQ ID NO: 18), GSGSG (SEQ ID NO: 19), GSGGG (SEQ ID NO: 20), GGGSG (SEQ ID NO: 21) и GSSSG (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела LP1 включает аминокислотную последовательность GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 23). В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела LP2 включает аминокислотную последовательность GSSGT (SEQ ID NO: 24) или GSSG (SEQ ID NO: 37).

В некоторых вариантах осуществления цитотоксический агент, включенный в конъюгированное активируемое антитело, представляет собой агент, который конъюгируются с AB. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела агент представляет собой терапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой противоопухолевый агент. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела агент представляет собой токсин или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела агент представляет собой агент, выбранный из группы, представленной в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела агент представляет собой доластатин. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой ауристатин или его производное. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой ауристатин Е или его производное. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела агент представляет собой монометилауристатин Е (ММАЕ). В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой мейтансиноид или производное мейтансиноида. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой DM1 или DM4. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой дуокармицин или его производное. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой калихеамицин или его производное.

В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела агент конъюгируют с AB через линкер. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела линкер представляет собой расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела линкер выбран из группы, состоящей из линкеров, представленных в таблицах 2 и 3.

В некоторых вариантах осуществления конъюгированное активируемое антитело включает также регистрируемый компонент. В некоторых вариантах осуществления конъюгированного активируемого антитела регистрируемым компонентом является диагностический агент. В некоторых вариантах осуществления регистрируемым компонентом является конъюгируемый детектируемый реагент. В некоторых вариантах осуществления регистрируемым компонентом является, например, производное флуоресцеина, такое как флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ).

В некоторых вариантах осуществления конъюгированное активируемое антитело включает также сигнальный пептид. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид конъюгирован с конъюгированным активируемым антителом через спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер конъюгируют с конъюгированным активируемым антителом в отсутствие сигнального пептида. В некоторых вариантах осуществления спейсер соединен непосредственно с MM конъюгированного активируемого антитела. В некоторых вариантах осуществления спейсер включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает спейсер с последовательностью QGQSGQ (SEQ ID NO: 38), соединенный непосредственно с последовательностью MM CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14) в структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-ММ-CM-AB. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает спейсер, соединенный непосредственно с последовательностью MM и включает аминокислотную последовательность QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59) в структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-ММ-CM-AB.

В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 5 дней при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 4 дня при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 3 дня при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 2 дня при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 24 часа при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 20 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 18 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 16 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 14 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 12 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 10 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 8 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 6 часов при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 4 часа при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления период полужизни конъюгированного активируемого антитела в сыворотке составляет, по меньшей мере, 3 часа при введении в организм.

В некоторых вариантах осуществления конъюгированное активируемое антитело против EGFR является моноспецифичным. В некоторых вариантах осуществления конъюгированное активируемое антитело против EGFR является мультиспецифичным, например, в качестве неограничивающего примера, биспецифичным или триспецифичным. В некоторых вариантах осуществления конъюгированное активируемое антитело против EGFR составляют в виде части молекулы про-биспецифичного стимулятора работы Т-клеток (BITE). В некоторых вариантах осуществления конъюгированное активируемое антитело против EGFR составляют в виде части Т-клетки, модифицированной прогибридным рецептором антигена (CAR) или другим сконструированным рецептором.

Изобретение также относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей активируемое антитело против EGFR, описанное в данном документе, а также к векторам, которые включают эти выделенные последовательности нуклеиновой кислоты. Изобретение относится к способам получения активируемого антитела с помощью культивирования клетки в условиях, которые приводят к экспрессии активируемого антитела, где клетка включает такой вектор.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует ММ, который имеет равновесную константу диссоциации связывания с AB, которая является более высокой, чем равновесная константа диссоциации связывания AB с EGFR. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует ММ, который имеет равновесную константу диссоциации связывания с AB, которая не выше, чем равновесная константа диссоциации связывания AB с EGFR. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует ММ, который не мешает связыванию AB активируемого антитела в расщепленном состоянии или не конкурирует с ним за связывание с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует CM, который расщепляется протеазой, которая локализована в ткани совместно с EGFR, и протеаза расщепляет СМ активируемого антитела, когда активируемое антитело подвергается действию протеазы. В некоторых вариантах осуществления протеаза не активна или значительно менее активна в тканях, которые существенно не экспрессируют EGFR. В некоторых вариантах осуществления протеаза не активна или значительно менее активна в здоровых, например, непораженных тканей.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое включает линкерный пептид между MM и CM.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое включает линкерный пептид между CM и AB.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое включает первый линкерный пептид (LP1) и второй линкерный пептид (LP2), и где активируемое антитело имеет следующую структурную организацию в нерасщепленном состоянии от N-конца к С-концу: ММ-LP1-CM-LP2-AB или AB-LP2-CM-LP1-MM. В некоторых вариантах осуществления два линкерных пептида не обязательно должны быть идентичными друг другу.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, которая кодирует AB активируемого антитела, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, которая кодирует AB активируемого антитела, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, которая кодирует AB активируемого антитела, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, которая кодирует AB активируемого антитела, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, которая кодирует AB активируемого антитела, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, которая кодирует AB активируемого антитела, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает AB, который включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает AB, который включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает AB, который включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает AB, который включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 29, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 29, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 29, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает AB, который включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает AB, который включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает тяжелую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует AB, который имеет равновесную константу диссоциации связывания с EGFR приблизительно 100 нМ или менее.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует ММ, который представляет собой полипептид, составляющий примерно от 2 до 40 аминокислот в длину, например, не превышающий 40 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует полипептидную последовательность ММ, которая отличается от последовательности EGFR, и полипептидная последовательность MM не более чем на 50% идентична любому природному партнеру связывания AB.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует CM, который расположен в активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела с EGFR понижено с возникновением такой равновесной константы диссоциации, которая, по меньшей мере, в 20 раз выше, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR, и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует CM, который расположен в активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела с EGFR понижено с возникновением такой равновесной константы диссоциации, которая, по меньшей мере, в 100 раз выше, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR, и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует CM, который расположен в активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела с EGFR понижено с возникновением такой равновесной константы диссоциации, которая, по меньшей мере, в 200 раз выше, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR, и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует CM, который представляет собой полипептид, состоящий из до 15 аминокислот в длину.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует ММ, который в присутствии EGFR снижает способность к связыванию AB с EGFR, по меньшей мере, на 90%, когда CM не расщеплен, по сравнению с тем, когда СМ расщеплен при измерении in vitro с использованием анализа с заменой мишени, такого как, например, анализ, описанный в публикациях PCT №№ WO 2009/025846 и WO 2010/081173.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое включает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с EGFR. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует антитело или его иммунологически активный фрагмент, который связывается с EGFR, и представляет собой моноклональное антитело, домен антитела, одноцепочечное антитело, Fab-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент, scFv, scab, dAb, один домен тяжелой цепи антитела и один домен легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует антитело или иммунологически активный фрагмент, который связывается с EGFR и представляет собой мышиное, гибридное, гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует AB активируемого антитела, который включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует AB активируемого антитела, который включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи с SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи с SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи с SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи с SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи с SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает AB, который включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты включает AB, который включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID No: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает AB, который включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает AB, который включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи с SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи с SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи с SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи с SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи с SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает AB, который включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты включает AB, который включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая включает последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует CM, который является субстратом для фермента, выбранного из группы, состоящей из uPA, легумаина и MT-SP1. В некоторых вариантах осуществления фермент включает uPA. В некоторых вариантах осуществления фермент включает легумаин. В некоторых вариантах осуществления фермент включает МТ-SP1.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует CM, который включает аминокислотную последовательность LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13).

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует ММ, который имеет не более 25% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует ММ, который имеет не более 10% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует ММ, который включает аминокислотную последовательность CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14).

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует LP1 и/или LP2, где, по меньшей мере, один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (GS)_n, (GGS)_n, (GSGGS)_n (SEQ ID NO: 15) и (GGGS)_n (SEQ ID NO: 16), где n представляет собой целое число, по меньшей мере, единицу.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует LP1 и/или LP2, где, по меньшей мере, один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGSG (SEQ ID NO: 17), GGSGG (SEQ ID NO: 18), GSGSG (SEQ ID NO: 19), GSGGG (SEQ ID NO: 20), GGGSG (SEQ ID NO: 21) и GSSSG (SEQ ID NO: 22).

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует LP1, который включает аминокислотную последовательность, GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 23).

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует LP2, который включает аминокислотную последовательность, GSSGT (SEQ ID NO: 24) или GSSG (SEQ ID NO: 37).

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое включает также сигнальный пептид. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует сигнальный пептид, который конъюгируют с активируемым антителом через спейсер. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует спейсер, который конъюгируют с активируемым антителом в отсутствие сигнального пептида. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует спейсер, который соединен непосредственно с MM активируемого антитела. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует спейсер, который включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое включает спейсер с последовательностью QGQSGQ (SEQ ID NO: 38), соединенный непосредственно с последовательностью MM CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14) со структурной организацией от N-конца к C-концу спейсер-ММ-СМ-AB. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует активируемое антитело, которое включает спейсер, соединенный непосредственно с последовательностью ММ, и включает аминокислотную последовательность QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59) со структурной организацией от N-конца к С-концу спейсер-ММ-CM-AB.

Изобретение также относится к способу получения активируемых антител, которые в активированном состоянии связываются с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), путем (а) культивирования клетки, содержащей конструкт нуклеиновой кислоты, кодирующей активируемое антитело в условиях, которые приводят к экспрессии активируемого антитела, где активируемое антитело содержит маскирующий фрагмент (MM), расщепляемый фрагмент (CM) и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (AB), которые специфически связываются с EGFR, (i) где CM представляет собой полипептид, который функционирует в качестве субстрата протеазы; и (ii) где СМ расположен в активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии MM мешает специфическому связыванию AB с EGFR, и когда активируемое антитело находится в расщепленном состоянии MM не мешает специфическому связыванию AB с EGFR или не конкурирует с ним; и (b) выделения активируемого антитела.

В некоторых вариантах осуществления AB представляет собой цетуксимаб или его производное.

В некоторых вариантах осуществления MM имеет равновесную константу диссоциации связывания с AB, которая выше, чем равновесная константа диссоциации связывания AB с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления MM имеет равновесную константу диссоциации связывания с AB, которая не выше, чем равновесная константа диссоциации связывания AB с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления MM не мешает связыванию AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR или не конкурирует за связывание с ним.

В некоторых вариантах осуществления протеаза локализована в ткани совместно с EGFR, и протеаза расщепляет СМ активируемого антитела, когда активируемое антитело подвергается воздействию протеазы. В некоторых вариантах осуществления протеаза является неактивной или значительно менее активной в тканях, которые существенно не экспрессируют EGFR. В некоторых вариантах осуществления протеаза не является активной или значительно менее активна в здоровых, например, непораженных тканях.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает линкерный пептид между MM и СМ.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает линкерный пептид между СМ и AB.

В некоторых вариантах осуществления два линкерных пептида не должны быть идентичны друг другу.

В некоторых вариантах осуществления MM представляет собой полипептид, состоящий приблизительно от 2 до 40 аминокислот в длину, например, не превышающий 40 аминокислот в длину.

В некоторых вариантах осуществления СМ расположен в активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела с EGFR снижено и происходит с равновесной константой диссоциации, по меньшей мере, в 20 раз более высокой, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR, и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления СМ расположен в активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела с EGFR снижено и происходит с равновесной константой диссоциации, по меньшей мере, в 100 раз более высокой, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR, и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления СМ расположен в активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела с EGFR снижено и происходит с равновесной константой диссоциации, по меньшей мере, в 200 раз более высокой, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR, и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления присоединение MM снижает способность связывания AB с EGFR таким образом, что константа диссоциации (K_d) связывания AB с присоединенным MM с EGFR является, по меньшей мере, в 20 раз более высокой, чем K_d связывания AB с EGFR, когда он не соединен с ММ. В некоторых вариантах осуществления присоединение MM снижает способность связывания AB с EGFR таким образом, что K_d связывания AB с присоединенным MM с EGFR является, по меньшей мере, в 100 раз более высокой, чем K_d связывания AB с EGFR, когда он не соединен с ММ. В некоторых вариантах осуществления присоединение MM снижает способность связывания AB с EGFR таким образом, что K_d связывания AB с присоединенным MM с EGFR является, по меньшей мере, в 1000 раз более высокой, чем K_d связывания AB с EGFR, когда он не соединен с ММ. В некоторых вариантах осуществления присоединение MM снижает способность связывания AB с EGFR таким образом, что K_d связывания AB с присоединенным MM с EGFR является, по меньшей мере, в 10000 раз более высокой, чем K_d связывания AB с EGFR, когда он не соединен с ММ.

В некоторых вариантах осуществления в присутствии EGFR MM снижает способность связывания AB с EGFR, по меньшей мере, на 90%, когда CM не расщеплен, по сравнению с расщепленным СМ при тестировании in vitro с использованием анализа с заменой мишени, такого как, например, анализ, описанный в публикациях РСТ №№ WO 2009/025846 и WO 2010/081173.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с EGFR. В некоторых вариантах осуществления антитело или его иммунологически активный фрагмент, которые связываются с EGFR, представляют собой моноклональное антитело, домен антитела, одиночную цепь, Fab-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент, scFv, scab, dAb, один домен тяжелой цепи антитела и один домен легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления такое антитело или его иммунологически активный фрагмент, которые связываются с EGFR, представляют собой мышиное, гибридное, гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID No: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ(SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей включенную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепь SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей содержание аминокислотной последовательности тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающей SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нуклеиновую кислоту легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающей SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нуклеиновую кислоту легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающей SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нуклеиновую кислоту легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающей SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающей SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ(SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления СМ является субстратом для фермента, выбранного из группы, состоящей из uPA, легумаина и MT-SP1. В некоторых вариантах осуществления фермент включает uPA. В некоторых вариантах осуществления фермент включает легумаин. В некоторых вариантах осуществления фермент включает МТ-SP1.

В некоторых вариантах осуществления СМ включает аминокислотную последовательность LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13).

В некоторых вариантах осуществления MM имеет не более 25% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления MM имеет не более 10% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления MM включает аминокислотную последовательность CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14).

В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один из LP1 и LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGSG (SEQ ID NO: 17), GGSGG (SEQ ID NO: 18), GSGSG (SEQ ID NO: 19), GSGGG (SEQ ID NO: 20), GGGSG (SEQ ID NO: 21) и GSSSG (SEQ ID NO: 22).

В некоторых вариантах осуществления LP1 включает аминокислотную последовательность GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 23).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает также регистрируемый компонент. В некоторых вариантах осуществления регистрируемым компонентом является диагностический агент. В некоторых вариантах осуществления регистрируемым компонентом является конъюгируемый детектируемый реагент. В некоторых вариантах осуществления регистрируемым компонентом является, например, производное флуоресцеина, такое как флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает также сигнальный пептид. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид конъюгирован с активируемым антителом через спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер конъюгирован с активируемым антителом в отсутствие сигнального пептида. В некоторых вариантах осуществления спейсер соединен непосредственно с MM активируемого антитела. В некоторых вариантах осуществления спейсер включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает спейсер с последовательностью QGQSGQ (SEQ ID NO: 38), соединенный непосредственно с последовательностью MM CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14) при структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-MM-CM-AB. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает последовательность спейсера, соединенную непосредственно с последовательностью ММ, и включает аминокислотную последовательность QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59) при структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-ММ-CM-AB.

Изобретение относится к способам лечения, профилактики и/или задержки наступления или прогрессии, или облегчения симптома состояния, например, заболевания или нарушения, связанного с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR, например, нарушения, связанного с EGFR, или заболевания, связанного с EGFR, у индивидуума с использованием терапевтической молекулы, например, активируемых антител, которые связываются с EGFR, и/или конъюгированных активируемых антител, которые связываются с EGFR, особенно активируемых антител и/или конъюгированных активируемых антител, которые при активации связывают и нейтрализуют или иным образом ингибируют, по меньшей мере, одну биологическую активность EGFR и/или опосредованные EGFR пути передачи сигнала.

В некоторых вариантах осуществления показанием, например, заболеванием или нарушением, связанным с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR, является рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак молочной железы, например, в качестве неограничивающего примера, рак молочной железы, представляющий собой тройной негативный рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой тройной негативный рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак толстой кишки. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак желудка. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой глиобластому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак головы и шеи, например, в качестве неограничивающего примера, рак пищевода. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак пищевода. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак легкого, например, в качестве неограничивающего примера, немелкоклеточный рак легкого. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой немелкоклеточный рак легкого. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак яичников/рак эндометрия. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак почки. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой саркому, например, в качестве неограничивающего примера, остеосаркому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой остеосаркому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак кожи, например, в качестве неограничивающего примера, плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак и/или меланому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой плоскоклеточный рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой базальноклеточный рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой меланому.

В некоторых вариантах осуществления показанием, например, заболеванием или нарушением, связанным с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR, является воспалительное заболевание и/или аутоиммунное заболевание. В некоторых вариантах осуществления воспалительное и/или аутоиммунное заболевание представляет собой псориаз.

Терапевтическую молекулу, например, активируемое антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR, можно вводить на любой стадии заболевания. Например, терапевтическую молекулу можно вводить больному, страдающему раком, на любой стадии, от ранней до метастатической. Например, терапевтическая молекула может вводиться больному, страдающему воспалительным состоянием и/или аутоиммунным заболеванием, на любой стадии от раннего развития до далеко зашедшей стадии. Следует понимать, что термины индивидуум и больной используются в настоящем описании взаимозаменяемо.

Терапевтические молекулы, например, активируемые антитела против EGFR и/или конъюгированные активируемые антитела против EGFR, могут быть также использованы и в других терапевтических целях и схемах лечения. Например, терапевтические молекулы из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, могут быть использованы в схеме лечения, которая включает неоадъювантную терапию.

В некоторых вариантах осуществления терапевтические молекулы, например, активируемые антитела против EGFR и/или конъюгированные активируемые антитела против EGFR, вводят во время и/или после лечения в сочетании с одним или более дополнительными агентами, такими как, в качестве неограничивающего примера, химиотерапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления терапевтическую молекулу и дополнительный(ые) агент(ы) вводят одновременно. Например, терапевтическую молекулу и дополнительный(ые) агент(ы) можно составлять в виде единой композиции или вводить в виде двух или более отдельных композиций. В некоторых вариантах осуществления терапевтическую молекулу и дополнительный(ые) агент(ы) вводят последовательно.

Изобретение также относится к способам профилактики, задержки развития, лечения, облегчения симптома или ослабления другим образом расстройства, связанного с EGFR, например, рака, у индивидуума путем введения терапевтически эффективного количества активируемого антитела против EGFR, описанного в настоящем документе, нуждающемуся в этом индивидууму.

Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования ангиогенеза у индивидуума путем введения терапевтически эффективного количества активируемого антитела против EGFR, описанного в настоящем документе, нуждающемуся в этом индивидууму.

В некоторых вариантах осуществления индивидуумом является млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления индивидуумом является человек. В некоторых вариантах осуществления индивидуум представляет собой млекопитающее, не являющееся человеком, такое как нечеловекообразный примат, животное-компаньон (например, кошка, собака, лошадь), сельскохозяйственное животное, рабочее животное или животное из зоопарка.

Активируемое антитело против EGFR и его терапевтические составы вводят индивидууму, страдающему от заболевания или расстройства, связанного с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR, или восприимчивого к нему. Индивидуум, страдающий от болезни или расстройства, связанного с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR, или восприимчивый к нему, идентифицируется с использованием любого из множества способов, известных в данной области техники. Например, индивидуума, страдающего раком или другим неопластическим состоянием, идентифицируют с использованием любой из множества клинических и/или лабораторных анализов, таких как физическое обследование и анализы крови, мочи и кала для оценки состояния здоровья.

Введение активируемого антитела против EGFR больному, страдающему заболеванием или расстройством, связанным с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR, считается успешным, если достигается любая из различных лабораторных или клинических целей. Например, введение активируемого антитела против EGFR больному, страдающему заболеванием или расстройством, связанным с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR, считается успешным, если один или более симптомов, связанных с заболеванием или расстройством, облегчается, уменьшается, ингибируется или не прогрессирует дальше, т.е. в сторону ухудшения состояния. Введение активируемого антитела против EGFR больному, страдающему заболеванием или расстройством, связанным с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR, считается успешным, если сахарный диабет входит в стадию ремиссии или не прогрессирует дальше, т.е. в сторону ухудшения состояния.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR вводят во время и/или после лечения в сочетании с одним или более дополнительными агентами, такими как, например, химиотерапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR и дополнительный(ые) агент(ы) вводят одновременно. Например, активируемое антитело против EGFR и дополнительный(ые) агент(ы) можно составлять в виде единой композиции или вводить в виде двух или более отдельных композиций. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR и дополнительный(ые) агент(ы) вводят последовательно.

Настоящее изобретение относится также к способам применения активируемых антител, которые связываются с EGFR (т.е. активируемых антител против EGFR, также обозначаемых в данном документе как активируемые антитела анти-EGFR), по различным диагностическим и/или профилактическим показаниям, а также к наборам для использования в этих способах. Например, изобретение относится к способам определения присутствия или отсутствия расщепляющего агента и EGFR у индивидуума или в образце с помощью (i) приведения индивидуума или образца в контакт с активируемым антителом против EGFR, и (ii) измерения уровня активации активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце, где определяемый уровень активации активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент и EGFR присутствуют у индивидуума или в образце, и где отсутствие определяемого уровня активации активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент, EGFR или как расщепляющий агент, так и EGFR отсутствуют у индивидуума или в образце. Такое активируемое антитело против EGFR включает маскирующий фрагмент (MM), расщепляемый фрагмент (CM), который расщепляется с помощью расщепляющего агента, и антигенсвязывающий домен или его фрагмент (AB), которые специфически связываются с EGFR, где активируемое антитело против EGFR в нерасщепленном (т.е. в неактивированном) состоянии включает следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ; (ii) где MM представляет собой пептид, который ингибирует связывание AB с EGFR, и где MM не содержит аминокислотную последовательность природного партнера связывания AB; и (iii) где MM активируемого антитела в нерасщепленном состоянии мешает специфическому связыванию AB с EGFR, и где MM активируемого антитела в расщепленном (т.е. в активированном) состоянии не мешает специфическому связыванию AB с EGFR или не конкурирует с AB за специфическое связывание с EGFR.

Настоящее изобретение также относится к наборам для использования в способах обнаружения присутствия или отсутствия расщепляющего агента и представляющей интерес мишени (EGFR) у индивидуума или в образце, где наборы включают, по меньшей мере, активируемое антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR, описанные в данном документе, для использования при приведении индивидуума или образца в контакт, и способах определения уровня активированного активируемого антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце, где определяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент и EGFR присутствуют у индивидуума или в образце, и где неопределяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент, EGFR или как расщепляющий агент, так и EGFR отсутствуют у индивидуума или в образце.

Изобретение относится также к способам определения присутствия или отсутствия расщепляющего агента у индивидуума или в образце путем (i) приведения индивидуума или образца в контакт с активируемым антителом против EGFR в присутствии EGFR, и (ii) измерения уровня активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце, где определяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент присутствует у индивидуума или в образце, и где неопределяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент отсутствует у индивидуума или в образце. Такое активируемое антитело против EGFR включает маскирующий фрагмент (MM), расщепляемый фрагмент (CM), который расщепляется с помощью расщепляющего агента, и антигенсвязывающий домен или его фрагмент (AB), которые специфически связываются с EGFR, где активируемое антитело против EGFR в нерасщепленном (т.е. в неактивированном) состоянии включает следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ; (ii) где MM представляет собой пептид, который ингибирует связывание AB с EGFR, и где MM не содержит аминокислотную последовательность природного партнера связывания AB; и (iii) где MM активируемого антитела в нерасщепленном состоянии мешает специфическому связыванию AB с EGFR, и где MM активируемого антитела в расщепленном (т.е. в активированном) состоянии не мешает специфическому связыванию AB с EGFR или не конкурирует с AB за специфическое связывание с EGFR.

Настоящее изобретение относится также к наборам для использования в способах обнаружения присутствия или отсутствия расщепляющего агента у индивидуума или в образце, где наборы включают, по меньшей мере, активируемое антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR, описанные в данном документе, для использования при приведении индивидуума или образца в контакт, и способах определения уровня активированного активируемого антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце, где определяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент присутствует у индивидуума или в образце, и где неопределяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент отсутствует у индивидуума или в образце.

Изобретение относится к способам определения присутствия или отсутствия расщепляющего агента и EGFR у индивидуума или в образце путем (i) приведения индивидуума или образца в контакт с активируемым антителом против EGFR, где активируемое антитело против EGFR включает регистрируемую метку, которая локализована в части активируемого антитела против EGFR так, что высвобождается после расщепления CM, и (ii) измерения уровня активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце, где определяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент и EGFR присутствуют у индивидуума или в образце, и где неопределяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент, EGFR или как расщепляющий агент, так и EGFR отсутствуют у индивидуума или в образце. Такое активируемое антитело против EGFR включает маскирующий фрагмент (MM), расщепляемый фрагмент (CM), который расщепляется с помощью расщепляющего агента, и антигенсвязывающий домен или его фрагмент (AB), которые специфически связываются с EGFR, где активируемое антитело против EGFR в нерасщепленном (т.е. в неактивированном) состоянии включает следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ; (ii) где MM представляет собой пептид, который ингибирует связывание AB с EGFR, и где MM не содержит аминокислотную последовательность природного партнера связывания AB; и (iii) где MM активируемого антитела в нерасщепленном состоянии мешает специфическому связыванию AB с EGFR, и где MM активируемого антитела в расщепленном (т.е. в активированном) состоянии не мешает специфическому связыванию AB с EGFR или не конкурирует с AB за специфическое связывание с EGFR.

Изобретение относится также к способам определения присутствия или отсутствия расщепляющего агента у индивидуума или в образце путем (i) приведения индивидуума или образца в контакт с активируемым антителом против EGFR, где активируемое антитело против EGFR включает регистрируемую метку, которая локализована в части активируемого антитела против EGFR так, что отделяется после расщепления CM; и (ii) измерения уровня регистрируемой метки у индивидуума или в образце, где определяемый уровень регистрируемой метки у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент отсутствует у индивидуума или в образце, и где неопределяемый уровень регистрируемой метки у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент присутствует у индивидуума или в образце. Такое активируемое антитело против EGFR включает маскирующий фрагмент (MM), расщепляемый фрагмент (CM), которые расщепляются с помощью расщепляющего агента, и антигенсвязывающий домен или его фрагмент (AB), который специфически связывается с EGFR, где активируемое антитело против EGFR в нерасщепленном (т.е. в неактивированном) состоянии включает следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ; (ii) где MM представляет собой пептид, который ингибирует связывание AB с EGFR, и где MM не содержит аминокислотную последовательность природного партнера связывания AB; и (iii) где MM активируемого антитела в нерасщепленном состоянии мешает специфическому связыванию AB с EGFR, и где MM активируемого антитела в расщепленном (т.е. в активированном) состоянии не мешает специфическому связыванию AB с EGFR или не конкурирует с AB за специфическое связывание с EGFR.

Настоящее изобретение относится также к наборам для использования в способах обнаружения присутствия или отсутствия расщепляющего агента и представляющей интерес мишени (EGFR) у индивидуума или в образце, где наборы включают, по меньшей мере, активируемое антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR, описанные в данном документе, для использования при приведении индивидуума или образца в контакт, и способах определения уровня активированного активируемого антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце, где определяемый уровень регистрируемой метки у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент отсутствует у индивидуума или в образце, и где неопределяемый уровень регистрируемой метки у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент присутствует у индивидуума или в образце.

В некоторых вариантах осуществления этих способов и/или наборов активируемое антитело против EGFR включает регистрируемую метку. В некоторых вариантах осуществления этих способов и/или наборов регистрируемая метка включает визуализирующий агент, контрастирующий агент, фермент, флуоресцентную метку, хромофор, краситель, один или более ионов металлов или метку на основе лиганда. В некоторых вариантах осуществления этих способов и/или наборов визуализирующий агент включает радиоизотоп. В некоторых вариантах осуществления этих способов радиоизотоп представляет собой индий или технеций. В некоторых вариантах осуществления этих способов радиоизотоп представляет собой йод или производное йода. В некоторых вариантах осуществления этих способов радиоизотоп представляет собой ¹²⁵I или ¹³³I. В некоторых вариантах осуществления этих способов и/или наборов контрастирующий агент включает йод, гадолиний или оксид железа. В некоторых вариантах осуществления этих способов и/или наборов фермент включает пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу или β-галактозидазу. В некоторых вариантах осуществления этих способов и/или наборов флуоресцентная метка включает желтый флуоресцентный белок (YFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), зеленый флуоресцентный белок (GFP), модифицированный красный флуоресцентный белок (mRFP), красный флуоресцентный белок tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED или производное европия. В некоторых вариантах осуществления этих способов и/или наборов люминесцентная метка включает производное N-метилакридия. В некоторых вариантах осуществления этих методов и/или наборов метка включает метку Alexa Fluor®, такую как Alexa Fluor® 680 или Alexa Fluor® 750. В некоторых вариантах осуществления этих способов и/или наборов метка на основе лиганда включает биотин, авидин, стрептавидин или один или более гаптенов.

В некоторых вариантах осуществления этих способов и/или наборов индивидуумом является млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления этих способов и/или наборов индивидуумом является человек. В некоторых вариантах осуществления индивидуум представляет собой млекопитающее, не являющееся человеком, такое как нечеловекообразный примат, животное-компаньон (например, кошка, собака, лошадь), сельскохозяйственное животное, рабочее животное или животное из зоопарка.

В некоторых вариантах осуществления этих способов способ представляет собой способ in vivo. В некоторых вариантах осуществления этих способов способ представляет собой способ in situ. В некоторых вариантах осуществления этих способов способ представляет собой способ ex vivo. В некоторых вариантах осуществления этих способов способ представляет собой способ in vitro.

В некоторых вариантах осуществления способов и/или наборов способ и/или набор используется для идентификации или иного уточнения, например, стратификации популяции больных, которые подходят для лечения активируемым антителом против EGFR по настоящему раскрытию. Например, больные, которые при тестировании этими способами демонстрируют положительный результат при определении как мишени (например, EGFR), так и протеазы, которая расщепляет субстрат расщепляемого фрагмента (CM) активируемого антитела против EGFR, идентифицируются как подходящие кандидаты для лечения таким активируемым антителом против EGFR, включающим такой CM. Таким же образом больные, которые при тестировании этими способами демонстрируют отрицательный результат при определении каждой или обеих мишеней (например, EGFR) и протеазы, которая расщепляет субстрат СМ активируемого антитела, идентифицируются как подходящие кандидаты для другого вида лечения (т.е. не подходят для лечения активируемым антителом против EGFR, проходящим тестирование). В некоторых вариантах осуществления такие больные могут быть проверены на другие активируемые антитела против EGFR до тех пор, пока не будет идентифицировано подходящее для лечения активируемое антитело против EGFR (например, активируемое антитело против EGFR, включающее CM, который расщепляется у больного в области заболевания).

Изобретение относится также к наборам для использования в способах идентификации или иного уточнения популяции больных, где наборы включают, по меньшей мере, (i) активируемое антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR, описанное в данном документе, для использования при приведении в контакт с индивидуумом или образцом, (ii) способ определения уровня активированного активируемого антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце, где определяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR в образце указывает на то, что образец демонстрирует положительный результат в отношении присутствия EGFR и расщепляющего агента, который расщепляет субстрат в расщепляемом фрагменте (CM) активируемого антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR, и (iii) способ идентификации и отбора одного или более индивидуумов, демонстрирующих положительный результат тестирования на присутствие EGFR и расщепляющего агента, тем самым идентифицируя или уточняя популяцию больных. В некоторых вариантах осуществления набор также включает инструкции по введению терапевтически эффективного количества активируемого антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR, описанных в настоящем документе, одному или более индивидуумов в популяции больных, которые дали положительный результат при тестировании на присутствие EGFR и расщепляющего агента. В некоторых вариантах осуществления набор также включает инструкции по введению терапевтически эффективного количества другого терапевтического агента против EGFR, описанного в настоящем документе, одному или более индивидуумам в популяции больных, которые не дали положительный результат при тестировании на присутствие как EGFR, так и расщепляющего агента. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR включает регистрируемую метку. В некоторых вариантах осуществления регистрируемая метка включает визуализирующий агент, контрастирующий агент, фермент, флуоресцентную метку, хромофор, краситель, один или более ионов металлов или метку на основе лиганда. В некоторых вариантах осуществления нарушением, связанным с EGFR, является рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, глиобластому, рак головы и шеи, рак легких, рак яичников, рак эндометрия, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, саркому или рак кожи. В некоторых вариантах осуществления нарушением, связанным с EGFR, является псориаз.

В некоторых вариантах осуществления этих способов MM представляет собой пептид, имеющий длину приблизительно от 2 до 40 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления этих способов активируемое антитело против EGFR включает линкерный пептид, где линкерный пептид расположен между MM и CM. В некоторых вариантах осуществления этих способов активируемое антитело против EGFR включает линкерный пептид, где линкерный пептид расположен между AB и CM. В некоторых вариантах осуществления этих способов активируемое антитело против EGFR включает первый линкерный пептид (L1) и второй линкерный пептид (L2), где первый линкерный пептид расположен между MM и CM и второй линкерный пептид расположен между AB и CM. В некоторых вариантах осуществления этих способов каждый из L1 и L2 представляет собой пептид, состоящий из 1-20 аминокислот в длину, и где каждый из L1 и L2 не должен представлять собой один и тот же линкер. В некоторых вариантах осуществления этих способов один или оба L1 и L2 включают полимер глицин-серин.

В некоторых вариантах осуществления этих способов, по меньшей мере, один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (GS)_n, (GGS)_n, (GSGGS)_n (SEQ ID NO: 15) и (GGGS)_n (SEQ ID NO: 16), где n представляет собой целое число, по меньшей мере, единицу. В некоторых вариантах осуществления этих способов, по меньшей мере, один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGSG (SEQ ID NO: 17), GGSGG (SEQ ID NO: 18), GSGSG (SEQ ID NO: 19), GSGGG (SEQ ID NO: 20), GGGSG (SEQ ID NO: 21) и GSSSG (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах осуществления этих способов LP1 включает аминокислотную последовательность GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 23). В некоторых вариантах осуществления этих способов LP2 включает аминокислотную последовательность GSSGT (SEQ ID NO: 24) или GSSG (SEQ ID NO: 37).

В некоторых вариантах осуществления этих способов AB включает последовательность антитела или фрагмента антитела, выбранную из последовательностей антител против EGFR, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах этих способов AB включает Fab-фрагмент, scFv или одноцепочечное антитело (SCAB).

В некоторых вариантах осуществления этих способов расщепляющий агент представляет собой протеазу, которая у индивидуума или в образце локализована совместно с EGFR, и CM представляет собой полипептид, который функционирует в качестве субстрата протеазы, где протеаза расщепляет СМ активируемого антитела против EGFR, когда активируемое антитело против EGFR подвергается воздействию протеазы. В некоторых вариантах осуществления этих способов CM представляет собой полипептид, состоящий из до 15 аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления этих способов СМ соединен с N-концом AB. В некоторых вариантах осуществления этих способов СМ соединен с С-концом AB. В некоторых вариантах осуществления этих способов СМ соединен с N-концом VL-цепи AB.

В некоторых вариантах осуществления этих способов расщепляющий агент является ферментом, и СМ является субстратом фермента. В некоторых вариантах осуществления этих способов фермент представляет собой протеазу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления этих способов протеаза представляет собой одну из протеаз, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления этих способов протеаза выбрана из группы, состоящей из uPA, легумаина, МТ-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, ММР-12, ММР-13 и ММР-14. В некоторых вариантах осуществления фермент включает uPA. В некоторых вариантах осуществления фермент включает легумаин. В некоторых вариантах осуществления фермент включает МТ-SP1. В некоторых вариантах осуществления протеаза является неактивной или значительно менее активной в тканях, которые существенно не экспрессируют EGFR. В некоторых вариантах осуществления протеаза является неактивной или значительно менее активной в здоровых, например, непораженных тканях.

Настоящее изобретение относится также к способам применения антител против EGFR и/или конъюгированных активируемых антител против EGFR (т.е. конъюгатов активируемых антител против EGFR, обозначаемых в данном документе также как конъюгированные активируемые антитела против EGFR и/или конъюгированные активируемые антитела анти-EGFR) при различных диагностических и/или профилактических показаниях. Например, изобретение относится к способам определения присутствия или отсутствия расщепляющего агента и представляющей интерес мишени (EGFR) у индивидуума или в образце с помощью (i) приведения индивидуума или образца в контакт с антителом против EGFR и/или конъюгированным активируемым антителом против EGFR; и (ii) измерения уровня антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце, где определяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент и EGFR присутствуют у индивидуума или в образце, и где отсутствие определяемого уровня активированного антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент, EGFR или как расщепляющий агент, так и EGFR отсутствуют у индивидуума или в образце.

Изобретение относится также к способам определения присутствия или отсутствия расщепляющего агента у индивидуума или в образце с помощью (i) приведения индивидуума или образца в контакт с антителом против EGFR и/или с конъюгированным активируемым антителом против EGFR в присутствии EGFR; и (ii) измерения уровня активированного антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце, где определяемый уровень активированного антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент присутствует у индивидуума или в образце, и где неопределяемый уровень антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент отсутствует у индивидуума или в образце.

Изобретение относится также к способам определения присутствия или отсутствия расщепляющего агента у индивидуума или в образце с помощью (i) приведения индивидуума или образца в контакт с антителом против EGFR и/или конъюгированным активируемым антителом против EGFR; и (ii) измерения уровня регистрируемой метки у индивидуума или в образце, где определяемый уровень регистрируемой метки у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент отсутствует у индивидуума или в образце, и где неопределяемый уровень регистрируемой метки у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент присутствует у индивидуума или в образце.

В некоторых вариантах осуществления этих способов антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR включает регистрируемую метку, выбранную из группы, состоящей из визуализирующего агента, контрастирующего агента, фермента, флуоресцентной метки, хромофора, красителя, одного или более ионов металлов и метки на основе лиганда. В некоторых вариантах осуществления этих способов визуализирующий агент включает радиоизотоп. В некоторых вариантах осуществления этих способов радиоизотоп представляет собой индий или технеций. В некоторых вариантах осуществления этих способов контрастирующий агент включает йод, гадолиний или оксид железа. В некоторых вариантах осуществления этих способов фермент включает пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу или β-галактозидазу. В некоторых вариантах осуществления этих способов флуоресцентная метка включает желтый флуоресцентный белок (YFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), зеленый флуоресцентный белок (GFP), модифицированный красный флуоресцентный белок (mRFP), красный флуоресцентный белок tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED или производное европия. В некоторых вариантах осуществления этих способов люминесцентная метка включает производное N-метилакридия. В некоторых вариантах осуществления этих способов метка включает метку Alexa Fluor®, такую как Alexa Fluor® 680 или Alexa Fluor® 750. В некоторых вариантах осуществления этих способов метка на основе лиганда включает биотин, авидин, стрептавидин или один или более гаптенов.

В некоторых вариантах осуществления этих способов индивидуумом является млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления этих способов индивидуумом является человек. В некоторых вариантах осуществления этих способов индивидуум представляет собой млекопитающее, не являющееся человеком, такое как нечеловекообразный примат, животное-компаньон (например, кошка, собака, лошадь), сельскохозяйственное животное, рабочее животное или животное из зоопарка.

В некоторых вариантах осуществления способов способ используется для идентификации или иного уточнения популяции больных, которые подходят для лечения антителом против EGFR и/или конъюгированным активируемым антителом против EGFR по настоящему раскрытию. Например, больные, которые при тестировании этими способами демонстрируют положительный результат при определении как мишени (например, EGFR), так и протеазы, которая расщепляет субстрат расщепляемого фрагмента (CM) антитела против EGFR и/или конъюгированного активируемого антитела против EGFR, идентифицируются как подходящие кандидаты для лечения таким антителом против EGFR и/или таким конъюгированным активируемым антителом против EGFR, включающими такой CM. Таким же образом больные, которые при тестировании этими способами демонстрируют отрицательный результат при определении каждой или обеих мишеней (например, EGFR) и протеазы, которая расщепляет субстрат СМ активируемого антитела, идентифицируются как подходящие кандидаты для другого вида лечения (т.е. не подходят для лечения антителом против EGFR и/или конъюгированным активируемым антителом против EGFR, проходящим тестирование). В некоторых вариантах осуществления такие больные могут быть проверены на другое активируемое антитело против EGFR и/или другое конъюгированное активируемое антитело против EGFR до тех пор, пока не будет идентифицировано подходящее для лечения антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR (например, антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR, включающее CM, который расщепляется у больного в области заболевания).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело связывается с EGFR в активированном состоянии и включает (i) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (AB), которые специфически связываются с EGFR, где AB представляет собой цетуксимаб или его производное; (ii) маскирующий фрагмент (MM), который ингибирует связывание AB активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с EGFR; и (с) расщепляемый фрагмент (CM), соединенный с АВ, где CM представляет собой полипептид, который функционирует в качестве субстрата протеазы.

В некоторых вариантах осуществления MM имеет равновесную константу диссоциации связывания с AB, которая является более высокой, чем равновесная константа диссоциации связывания AB с EGFR. В некоторых вариантах осуществления MM имеет равновесную константу диссоциации связывания с AB, которая не выше, чем равновесная константа диссоциации связывания AB с EGFR. В некоторых вариантах осуществления MM не мешает AB активируемого антитела в расщепленном состоянии связываться с EGFR или не конкурирует с ним за связывание с EGFR, когда представлено активируемое антитело.

В некоторых вариантах осуществления протеаза локализована в ткани совместно с EGFR, и протеаза расщепляет СМ активируемого антитела, когда активируемое антитело подвергается воздействию протеазы. В некоторых вариантах осуществления протеаза является неактивной или значительно менее активной в тканях, которые существенно не экспрессируют EGFR. В некоторых вариантах осуществления протеаза неактивна или значительно менее активна в здоровых, например, непораженных тканях.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело и/или конъюгированное активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело и/или конъюгированное активируемое антитело включает линкерный пептид между MM и СМ.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело и/или конъюгированное активируемое антитело включает линкерный пептид между СМ и AB.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело и/или конъюгированное активируемое антитело включает первый линкерный пептид (LP1) и второй линкерный пептид (LP2), и где активируемое антитело и/или конъюгированное активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: ММ-LP1-CM-LP2-AB или AB-LP2-CM-LP1-MM. В некоторых вариантах осуществления два линкерных пептида не должны быть идентичными друг другу.

В некоторых вариантах осуществления MM представляет собой полипептид, состоящий приблизительно из 2-40 аминокислот в длину, например, не превышающий 40 аминокислот в длину.

В некоторых вариантах осуществления СМ расположен в активируемом антителе и/или конъюгированном активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела с EGFR снижено и происходит с равновесной константой диссоциации, по меньшей мере, в 20 раз более высокой, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления СМ расположен в активируемом антителе и/или конъюгированном активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела с EGFR снижено и происходит с равновесной константой диссоциации, по меньшей мере, в 100 раз более высокой, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления СМ расположен в активируемом антителе и/или конъюгированном активируемом антителе таким образом, что в нерасщепленном состоянии связывание активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела с EGFR снижено и происходит с равновесной константой диссоциации, по меньшей мере, в 200 раз более высокой, чем равновесная константа диссоциации связывания немодифицированного AB с EGFR и связывания AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело и/или конъюгированное активируемое антитело включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с EGFR. В некоторых вариантах осуществления антитело или его иммунологически активный фрагмент, которые связываются с EGFR, представляют собой моноклональное антитело, домен антитела, одиночную цепь, Fab-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент, scFv, scab, dAb, один домен тяжелой цепи антитела и один домен легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления такое антитело или его иммунологически активный фрагмент, которые связываются с EGFR, представляют собой мышиное, гибридное, гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей включение аминокислотной последовательности тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10, и последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, и последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нуклеиновую кислоту легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую включение аминокислотной последовательности тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, включающей SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела кодируется нуклеиновой кислотой, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 33, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID No: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления AB активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, и аминокислотную последовательность спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 68, соединенную непосредственно с аминокислотной последовательностью спейсера, которая включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

В некоторых вариантах осуществления СМ включает аминокислотную последовательность LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13).

В некоторых вариантах осуществления MM включает аминокислотную последовательность CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14).

В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (GS)_n, (GGS)_n, (GSGGS)_n (SEQ ID NO: 15) и (GGGS)_n (SEQ ID NO: 16), где n представляет собой целое число, по меньшей мере, единицу. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один из LP1 и LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGSG (SEQ ID NO: 17), GGSGG (SEQ ID NO: 18), GSGSG (SEQ ID NO: 19), GSGGG (SEQ ID NO: 20), GGGSG (SEQ ID NO: 21) и GSSSG (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах осуществления LP1 включает аминокислотную последовательность GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 23). В некоторых вариантах осуществления LP2 включает аминокислотную последовательность GSSGT (SEQ ID NO: 24) или GSSG (SEQ ID NO: 37).

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает также агент, конъюгированный с AB. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой терапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой противоопухолевый агент. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой токсин или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой агент, выбранный из группы, указанной в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой доластатин. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой ауристатин или его производное. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой ауристатин Е или его производное. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой монометилауристатин E (MMAE). В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой мейтансиноид или производное мейтансиноида. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой DM1 или DM4. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой дуокармицин или его производное. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой калихеамицин или его производное.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело и/или конъюгированное активируемое антитело включает также сигнальный пептид. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид конъюгирован с активируемым антителом и/или с конъюгированным активируемым антителом через спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер конъюгирован с активируемым антителом и/или с конъюгированным активируемым антителом в отсутствие сигнального пептида. В некоторых вариантах осуществления спейсер соединен непосредственно с MM активируемого антитела и/или конъюгированного активируемого антитела. В некоторых вариантах осуществления спейсер включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело и/или конъюгированное активируемое антитело включает спейсер с последовательностью QGQSGQ (SEQ ID NO: 38), соединенный непосредственно с последовательностью MM CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14) при структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-MM-CM-AB. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело и/или конъюгированное активируемое антитело включает спейсер, соединенный непосредственно с последовательностью ММ, и включает аминокислотную последовательность QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59) при структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-ММ-CM-AB.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR является моноспецифичным. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR является мультиспецифичным, например, в качестве неограничивающего примера, биспецифичным или триспецифичным. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR составляют в виде части молекулы про-биспецифичного стимулятора работы Т-клеток (BITE). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR и/или конъюгированное активируемое антитело против EGFR составляют в виде части Т-клетки, модифицированной прогибридным рецептором антигена (CAR) или другим сконструированным рецептором.

Фармацевтические композиции по изобретению могут включать антитело и/или конъюгированное антитело по изобретению и носитель. Эти фармацевтические композиции могут быть включены в наборы, такие как, например, диагностические наборы.

Краткое описание фигур

На фигуре 1А проиллюстрировано изображение активируемого антитела по изобретению, маскируемое в первом состоянии и активированное в присутствии ассоциированной с заболеванием протеазы.

На фигуре 1B проиллюстрировано изображение процесса выбора субстрата, используемого для идентификации подходящих субстратов, которые избирательно активируют активируемые антитела против EGFR по изобретению в желаемой облласти локализации.

Фигура 2А представляет собой схематическое изображение активируемого антитела.

Фигуры 2B-2D представляют собой серию графиков, описывающих характеристики активируемого антитела против EGFR in vitro, обозначаемого в настоящем описании как активируемое антитело «Pb-1204» или 3954-1204-C225v4. Фигура 2В представляет собой гистограмму, представляющую эффективность ферментативного расщепления PB-1204 двумя протеазами МТ-SP1 и uPA. Фигура 2C представляет собой график, изображающий капиллярный электрофоретический анализ Pb-1204 до и после расщепления протеазами uPA, MT-SP1 и легумаином. Фигура 2D представляет собой график, представляющий действие антитела против EGFR - цетуксимаба, Pb-1204 и uPA-активированного Pb-1204 на пролиферацию клеток H292.

Фигура 3A представляет собой схематическое изображение химической структуры зонда Cy5.5-1204-Q с гасящейся флуоресценцией в ближней инфракрасной области спектра.

Фигуры 3B-3Н представляют собой серии иллюстраций, изображающих как активируемое антитело против EGFR, обозначаемое в настоящем описании как Pb-1204, накапливается в ксенотрансплантатах опухолей. Фигура 3В представляет собой иллюстрацию, изображающую оптическую визуализацию мышей, несущих ксенотрансплантат опухоли НТ29, которым внутрибрюшинно вводили либо PB-NSUB, конъюгированный с Alexa Fluor 750 (красный), либо зонд с гасящейся флуоресценцией Cy5-NSUB-Q, обозначаемый в настоящем описании как «IQ-NSUB» (синий, левая панель), где NSUB представляет собой аминокислотную последовательность, которая не восприимчива к расщеплению протеазой, либо Alexa Fluor 750-конъюгированное Pb-1204 (красный) и зонд с гасящейся флуоресценцией Cy5.5-1204-Q, обозначаемый в настоящем описании как «IQ-1204» (синий; правая панель), где 1204 представляет собой последовательность субстрата 1204: LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13), которая восприимчива к расщеплению, по меньшей мере, uPA. Высокую интенсивность перекрытия флуоресцентного сигнала обнаружили только в опухоли мыши с введением активируемого антитела против EGFR и зонда, содержащего субстрат 1204. Фигуры 3С и 3D являются иллюстрациями, изображающими иммунофлуоресцентное определение активируемых антител против EGFR в ксенотрансплантатах опухоли НТ29 через 7 дней после введения мышам Alexa Fluor 750-конъюгированного Pb-1204 (фигура 3C) или Alexa Fluor 750-конъюгированного Pb-NSUB (фигура 3D). Фигуры 3E и 3F представляют собой серию фотографий оптических изображений мышей, несущих ксенотрансплантаты опухоли НТ292, которым внутрибрюшинно вводили Pb-NSUB, 3954-1204-C225v4 или цетуксимаб (т.е. немодифицированный цетуксимаб). Активируемое антитело 3954-1204-C225v4 локализуется в области опухоли в мышиной модели ксенотрансплантата H292. Фигура 3G представляет собой серию фотографий, которые изображают трехмерную оптическую и компьютеризированную томографию (3D/КТ томографию) животных в мышиной модели ксенотрансплантата H292, которым вводили цетуксимаб, Pb-NSUB или 3954-1204-C225v4. Фигура 3Н представляет собой серию фотографий, изображающих иммуногистохимическое окрашивание IgG человека репрезентативных опухолей H292 из исследований визуализации in vivo.

Фигуры 4A-4F представляют собой серию графиков, указывающих на способность активируемого антитела против EGFR, обозначаемого в настоящем описании как Pb-1204, ингибировать рост опухоли в модели ксенотрансплантата. Фигура 4А представляет собой график, изображающий эффекты, наблюдаемые у мышей, несущих ксенотрансплантат опухоли H292, которых лечили в течение недели, используя цетуксимаб (25 мг/кг, синяя линия), Pb-1204 (25 мг/кг, красная линия), Pb-NSUB (25 мг/кг, зеленая линия) или носитель (черная линия), где Pb-NSUB представляет собой конструкт активируемого антитела против EGFR, который включает фрагмент антитела, который связывается с EGFR, а также включает аминокислотную последовательность NSUB, которая не восприимчива к расщеплению протеазой. Данные представлены как средний объем опухоли ±SEM. Процент ингибирования роста опухоли (TGI) оценивали на 20-ый день. Фигуры 4В и 4С представляют собой графики, изображающие уровень концентрации IgG и уровень EGFR-связывающего IgG в образцах плазмы (через 1, 8, 24, 72 часа после введения дозы) (фигура 4В) и в опухолях (через 72 часа после введения дозы) (фигура 4C), полученных от мышей, несущих ксенотрансплантаты опухоли H292, которым вводили 25 мг/кг цетуксимаба, Pb-NSUB или Pb-1204. Концентрацию IgG (синий) и связывание с EGFR (красный) измеряли с помощью ELISA. Фигура 4D представляет собой график, изображающий объем опухоли, выявляемый у мышей, несущих опухоль LXFA677, которым вводили внутрибрюшинно (в/б) один раз цетуксимаб (25 мг/кг, синяя линия), Pb-1204 (25 мг/кг, красная линия), носитель (черная линия). Данные представлены как средний объем опухоли ±SEM. Процент ингибирования роста опухоли (TGI) оценивали на 25-ый день. Фигуры 4E и 4F представляют собой графики, изображающие уровень концентрации IgG и уровень EGFR-связывающего IgG в образцах плазмы (на 1, 7, 14, 21, 28 день после введения дозы) (фигура 4E) и в опухоли (через 72 часа после введения дозы) (фигура 4F), полученные от мышей, несущих ксенотрансплантаты опухоли LXFA677, которым вводили носитель, 25 мг/кг цетуксимаба или 25 мг/кг Pb-1204. Концентрацию IgG (синий) и связывание с EGFR (красный) измеряли с помощью ELISA.

Фигуры 5А-5С представляют собой серию графиков, демонстрирующих дополнительную характеристику активируемых антител против EGFR in vitro. Фигура 5 представляет собой график, изображающий уровень протеолитической реакции расщепления Pb-1204 под действием MT-SP1 и uPA. Фигура 5В представляет собой фотографию SDS-PAGE анализа Pb-1204 до и после гидролиза легумаином, MT-SP1 и uPA. На фигуре 5С представлен график, демонстрирующий связывание цетуксимаба, родительского Ab, Pb-1204 или uPA-активированного Pb-1204 с иммобилизованным EGFR-ECD.

На фигурах 6А и 6В представлены иллюстрации, демонстрирующие как Pb-1204 не активируется в нормальной печени. На фигурах 6А и 6B представлено иммунофлуоресцентное определение активируемых антител против EGFR в печени через 7 дней после введения мышам Alexa Fluor 750-конъюгированного Pb-1204 (фигура 6а) или Alexa Fluor 750-конъюгированного Pb-NSUB (фигура 6B).

Фигуры 7А и 7B представляют собой иллюстрацию и график, демонстрирующие активацию опухоли и PK цетуксимаба и Pb-1204 у мышей, несущих опухоль. На фигуре 7А лизаты ксенотрансплантатов опухолей H292, обработанных цетуксимабом, Pb-NSUB и Pb-1204 (25 мг/кг), получали через 72 часа после лечения и анализировали с помощью иммуноблоттинга легкую цепь IgG человека. На фигуре 7В плазму от мышей, несущих ксенотрансплантаты опухолей LXFA677, которым вводили на день 0 25 мг/кг цетуксимаба или Pb-1204, собирали на 1, 7, 14, 21, 28 день после введения, и измеряли связывание с иммобилизованным EGFR-ECD (цетуксимаб, синий; Pb-1204, красный).

Фигуры 8А и 8B представляют собой серию иллюстраций, демонстрирующих прогрессию, инвазию и метастазирование опухолей, происходящих в результате нескольких взаимосвязанных процессов, в которые вовлечены протеазы. Фигуры адаптированы из статьи Affara NI, et al. «Delineating protease functions during cancer development.» Methods Mol Biol. 539 (2009): 1-32.

Фигуры 9А и 9В представляют собой таблицу и график, которые демонстрируют скорость расщепления и субстратную селективность протеаз uPA (человека и мыши), MT-SP1 (человека и мыши), легумаина (человека), тканевого активатора плазминогена (tPA, человека) и тромбина (человека) в отношении последовательности LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13) субстрата 1204 в зонде IQ. Фигуры 9С и 9D представляют собой серию графиков, которые демонстрируют скорость расщепления последовательности субстрата 1204 рекомбинантным uPA человека (фигура 9С) и рекомбинантным МТ-SP1 человека (фигура 9D). Последовательность субстрата 1204 присутствовала в каждом исследовании в конечной концентрации 500 нМ.

Фигура 10А представляет собой график, иллюстрирующий относительную способность немодифицированного («родительского») антитела цетуксимаба, конструкта Pb-NSUB («NSUB») и нерасщепленного активируемого антитела 3954-1204-C225v4 связываться с EGFR в отсутствие протеазы. Фигура 10B представляет собой график, демонстрирующий относительную способность немодифицированного («родительского») антитела цетуксимаба, конструкта Pb-NSUB («NSUB») и активированного, т.е. расщепленного, 3954-1204-C225v4 активируемого антитела связываться с EGFR в присутствии двух протеаз, uPA человека и МТ-SP1 человека. На фигуре 10B показано, что сразу после активации соответствующей протеазой активируемое антитело 3954-1204-C225v4 связывается с EGFR на уровне, сопоставимом с родительским антителом.

Фигуры 11A и 11B представляют собой серию графиков, демонстрирующих, что активируемое антитело 3954-1204-C225v4 против EGFR, по меньшей мере, через четыре недели после введения дозы мышам стабильно в циркуляторном русле и характеризуется низкой активацией в плазме, что предполагает прекрасный профиль токсичности. При использовании в фигурах 11A и 11B «родительское Ab» относится к немодифицированному антителу цетуксимабу, конструкт Pb-NSUB представляет собой активируемое антитело против EGFR, которое включает последовательность NSUB, не чувствительную к расщеплению протеазой, и «PB-NSELECT» представляет собой активируемое антитело против EGFR, которое включает неселективный субстрат, т.е. аминокислотную последовательность, которая узнается ферментами в циркуляторном русле.

Фигура 12 представляет собой график, демонстрирующий количество приматов с появлением кожной сыпи после введения цетуксимаба, Pb-NSUBv5 (т.е. 3954-NSUB-C225v5) или 3954-1204-C225v5.

Фигуры 13A-13D представляют собой серию графиков, сравнивающих уровень цетуксимаба и 3954-1204-C225v5, обнаруживаемых в крови макак, получавших еженедельную дозу 25 мг/кг после первоначальной нагрузочной дозы 40 мг/кг.

Фигуры 14А-14С представляют собой серию фотографий флуоресцентных изображений ксенотрансплантатов опухолей H292 с антителом, которое специфически узнает активный центр МТ-SP1 (антитело A11).

Фигура 15 представляет собой схематический общий вид визуализации in situ активируемого антитела: 1. Срез ткани накладывается на предметное стекло. 2. Предметное стекло покрывается раствором, содержащим меченое активируемое антитело, и инкубируется. 3. После тщательной промывки визуализируется связывание активированного антитела.

Фигура 16 представляет собой серию фотографий, демонстрирующих способность активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR активироваться и связываться с замороженными тканями рака человека с использованием визуализации in situ. Красное флуоресцентное изображение ткани на фигуре 16, панель A, демонстрирует связывание антитела C225v5, активированного путем протеолитического расщепления активируемого антитела против EGFR, происходящего в ткани. Идентичный паттерн окрашивания ткани обнаружен при экспозиции с тканью коммерчески доступного антитела против EGFR, как показано на фигуре 16, панель B. На фигуре 16, панель C, показано, что флуоресцентный сигнал, обнаруживаемый на панели А, ингибируется при предварительной обработке ткани коктейлем ингибиторов широкого спектра действия set III и 50 мМ ЭДТА в разведении 1:100. Синее окрашивание представляет собой ядерное окрашивание DAPI.

Фигура 17 представляет собой серию таблиц, демонстрирующих, что 3954-1204-C225v5 является активируемым в широком наборе образцов опухолей человека. Столбец 2 показывает уровень экспрессии рецептора EGFR при определении с помощью коммерчески доступного антитела против EGFR в различных образцах ткани рака человека. Столбец 3 показывает количество активной матриптазы (МТ-SP1) при определении антителом A11 в различных образцах ткани рака человека. Столбцы 4 и 5 представляют собой оценку активации in situ и связывания активируемого антитела против EGFR (столбец 5) по сравнению с окрашиванием ткани цетуксимабом (Cetux) (столбец 4). ИГХ окрашивание, которое является мерой количества EGFR и связывания антител A11 с образцом ткани, оценивали по очкам от 0 до 3+: 0, нет окрашивания; 1+ (т.е. «+»), слабое окрашивание; 2+ (т.е. «++»), умеренное окрашивание; и 3+ (т.е. «+++»), сильное окрашивание. Подсчет очков при визуализации окрашивания in situ основан на сравнении с окрашиванием антителом цетуксимабом и определяется следующим образом: 0, отсутствие окрашивания; 1+ (т.е. «+»), слабое окрашивание по сравнению с родительским антителом; 2+ (т.е. «++»), умеренное окрашивание по сравнению с родительским антителом; и 3+ (т.е. «+++»), окрашивание, аналогичное родительскому антителу.

Фигура 18 представляет собой график, иллюстрирующий способность активируемого конъюгата антитело-активируемый агент против EGFR 3954-1204-C225v5-MMAE ингибировать рост опухоли.

Фигура 19 представляет собой график, демонстрирующий период полужизни активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR по сравнению с периодом полужизни цетуксимаба.

Фигуры 20A и 20B представляют собой серию графиков, демонстрирующих, что конъюгация с лизином MMAE увеличивает силу 3954-1204-C225v5 при сохранении маскирования и потенциала активации. Конъюгация MMAE с 3954-1204-C225v5 не изменяет его связывания с EGFR. Конъюгация MMAE с 3954-1204-C225v5 увеличивает его активность в отношении гибели клеток.

Фигура 21 представляет собой иллюстрацию, демонстрирующую совместную локализацию EGFR и A11 в тканевых образцах печеночных метастазов колоректального рака человека.

Фигура 22 представляет собой иллюстрацию, изображающую способность тканей печеночных метастазов колоректального рака человека активировать и связывать активируемые антитела против EGFR.

Фигура 23 представляет собой серию фотографий, демонстрирующих тройное окрашивание при визуализации in situ, ИГХ EGFR и ИГХ A11. Верхний ряд изображений показывает окрашивание, выполненное на срезе одной ткани, демонстрирующее (слева направо): экспрессию EGFR, активность матриптазы (MT-SP1) и связывание цетуксимаба в условиях визуализации in situ. Нижний ряд изображений показывает окрашивание, выполненное на срезе одной ткани, демонстрирующее (слева направо): экспрессию EGFR, активность матриптазы (MT-SP1) и визуализацию in situ активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR. В правой колонке изображений на фигуре 23 сравнивается связывание цетуксимаба (верхнее изображение) и активируемого антитела против EGFR, активированного в результате возникающего в ткани протеолитического расщепления (нижнее изображение), в условиях визуализации in situ. Идентичный паттерн окрашивания тканей обнаружен при экспозиции с тканью коммерчески доступного антитела против EGFR, как показано на фигуре 23, левая колонка изображений. Фигура 23, средняя колонка изображений, демонстрирует совместную локализацию активности матриптазы (MT-SP1) и экспрессии EGFR.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предлагаются активируемые моноклональные антитела (mAb), которые специфически связываются с рецептором эпидермального фактора роста человека (EGFR), также известным как рецептор EGF, рецептор-1 EGF человека (HER1), erbB, erbBl и видовой антиген 7 (SA-7). Активируемые антитела против EGFR, обозначаемые в данном документе также как активируемые антитела анти-EGFR или активируемые антитела, направленные на EGFR, используются в способах лечения, профилактики, задержки развития, облегчения и/или ослабления симптомов заболевания или нарушения, связанного с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR. Например, активируемые антитела против EGFR используются в методах лечения, профилактики, задержки развития, ослабления и/или облегчения симптомов рака или другого неопластического состояния.

Активируемые антитела против EGFR включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), соединенные с маскирующим фрагментом (MM) таким образом, что соединение с MM снижает способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента связаться с EGFR. В предпочтительном варианте осуществления MM соединен через последовательность, включающую субстрат протеазы, например, протеазы, которая у индивидуума локализуется совместно с EGFR в области лечения. Многочисленные исследования показали корреляцию аберрантных уровней протеаз, например, uPA, легумаина, MT-SP1, металлопротеиназ матрикса (MMP), в солидных опухолях. (Смотри, например, Murthy RV, et al. «Legumain expression in relation to clinicopathologic and biological variables in colorectal cancer.» Clin Cancer Res. 11 (2005): 2293-2299; Nielsen BS, et al. «Urokinase plasminogen activator is localized in stromal cells in ductal breast cancer.» Lab Invest 81 (2001): 1485-1501; Mook OR, et al. «In situ localization of gelatinolytic activity in the extracellular matrix of metastases of colon cancer in rat liver using quenched fluorogenic DQ-gelatin.» J Histochem Cytochem. 51 (2003): 821-829).

Активируемые антитела против EGFR, предлагаемые в настоящем изобретении, включают субстрат протеазы, который пригоден для реализации активности протеаз в опухолевых клетках в целях направленной активации антитела в области лечения и/или диагностики. Общий обзор этого процесса показан на фигуре 1А, и общий обзор процесса, с помощью которого выбирают подходящий субстрат протеазы, такой как uPA, МТ-SP1, легумаин и т.д., показан на фигуре 1B. Процесс выбора субстрата используется для идентификации субстратов, которые имеют ряд желаемых характеристик. Например, выбранные субстраты являются стабильными в системной циркуляции (т.е., стабильны в системном кровотоке индивидуума), обычно не чувствительны к расщеплению циркулирующими протеазами, такими как плазмин, тромбин, тканевой активатор плазминогена (tPA) или калликреин (KLK), такой как KLK-5 и/или KLK-7, не токсичны, обычно не чувствительны к расщеплению в потенциальных участках токсичности, таких как кожа, протеазами, такими как ADAM 9, ADAM 10, ADAM 17 и/или калликреины, такие как KLK-5 и KLK-7, и активны в предназначенной области лечения и/или диагностики. Предпочтительно, чтобы идентифицированные субстраты были выбраны для протеаз, которые сверхэкспрессируются в предназначенной области лечения и/или диагностики, но обычно не экспрессируются в области или в самих нормальных здоровых или другим образом непораженных или неповрежденных тканях, и затем выбранные субстраты последовательно подвергают обратному скринингу против протеаз, экспрессируемых в нормальной, например, непораженной ткани.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в активируемом антителе против EGFR происходят от антитела против EGFR цетуксимаба. Цетуксимаб, также известный как эрбитукс или C225, представляет собой гибридное (мышь/человек) моноклональное антитело, которое специфически связывается с EGFR. Цетуксимаб в настоящее время используется для лечения метастатического колоректального рака и рака головы и шеи.

Предпочтительно активируемое антитело против EGFR включает тяжелую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или их производные.

В некоторых вариантах осуществления последовательность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с EGFR, содержат, по меньшей мере, одну аминокислотную замену для удаления потенциального сайта гликозилирования. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с EGFR, содержат аминокислотную замену в тяжелой цепи и/или в легкой цепи для удаления потенциального сайта гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с EGFR, имеют тяжелую цепь, в которой аспарагин (N), соответствующий аспарагину в положении 88 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, заменен на остаток глутамина (Q) для получения тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с EGFR в активируемых антителах, могут включать дополнительные модификации, в частности в области Fc антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, область Fc антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может включать одну или более аминокислотных замен для удаления потенциального сайта гликозилирования и/или для нарушения связывания области Fc со своим рецептором. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с EGFR, имеют тяжелую цепь, в которой аспарагин (N), соответствующий аспарагину в положении 299 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, заменен на остаток аланина (A). Эта мутация удаляет сайт гликозилирования в области Fc и приводит к снижению связывания рецептора Fc с Fc. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с EGFR, имеют тяжелую цепь, в которой аспарагин (N), соответствующий аспарагину в положении 88 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, заменен на остаток глутамина (Q), и в которой аспарагин (N), соответствующий аспарагину в положении 299 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, заменен на остаток аланина (A) с получением тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело против EGFR включает сигнальный пептид. Сигнальный пептид может быть соединен с активируемым антителом против EGFR с помощью спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер конъюгирован с активируемым антителом в отсутствие сигнального пептида. В некоторых вариантах осуществления спейсер соединен непосредственно с MM активируемого антитела. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает последовательность спейсера QGQSGQ (SEQ ID NO: 38), соединенную непосредственно с последовательностью MM CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14), в структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-MM-CM-AB. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело включает спейсер, соединенный непосредственно с последовательностью ММ, и включает аминокислотную последовательность QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59) в структурной организации от N-конца к С-концу спейсер-ММ-CM-AB.

Активируемые антитела против EGFR, представленные в настоящем описании, включают маскирующий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления маскирующий фрагмент представляет собой аминокислотную последовательность, которая соединена или иным образом присоединена к антителу против EGFR, и расположен в пределах конструкта активируемого антитела против EGFR таким образом, что маскирующий фрагмент снижает способность антитела против EGFR специфически связываться с EGFR. Подходящие маскирующие фрагменты идентифицируют с использованием любого из множества известных методов. Например, пептидные маскирующие фрагменты идентифицируют с использованием способов, описанных в заявке на патент США № 2009/0062142 Daugherty et al., содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Активируемые антитела против EGFR, представленные в настоящем описании, включают расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент включает аминокислотную последовательность, которая является субстратом протеазы, обычно внеклеточной протеазы. Подходящие субстраты идентифицируют с использованием любого из множества известных методов. Например, пептидные субстраты идентифицируют с использованием способов, описанных в патенте США № 7666817 Daugherty et al., содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. (Смотри также Boulware et al. «Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics.» Biotechnol Bioeng. 106.3 (2010): 339-46).

Активируемые антитела против EGFR, описанные в настоящем документе, преодолевают ограничения в лечении антителами, в частности, в лечении антителами, которые, как известно, являются, по меньшей мере, в некоторой степени токсичными in vivo. Опосредуемая мишенью токсичность представляет собой главное ограничение в разработке терапевтических антител. Это лучше всего иллюстрируется кожной сыпью, которая поражает 88% больных, получавших цетуксимаб, антитело, которое специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и одобрено для лечения колоректального рака и рака головы и шеи. Активируемые антитела против EGFR, представленные в настоящем описании, созданы для решения проблемы токсичности, связанной с ингибированием мишени в нормальных тканях в результате действия традиционных терапевтических антител. Эти активируемые антитела против EGFR остаются в замаскированном состоянии, пока протеолитически не активируются в области заболевания. Начиная с цетуксимаба в качестве родительского терапевтического антитела, активируемые антитела против EGFR по изобретению разрабатывали путем присоединения антитела к ингибирующему маскирующему агенту через линкер, который включает субстрат протеазы. В исследованиях, проведенных in vitro, связывание с EGFR и активность активируемого антитела против EGFR в клеточной системе уменьшались по сравнению с цетуксимабом. В исследованиях, проведенных in vivo, активируемое антитело против EGFR оставалось маскированным в нормальных тканях, но активировалось и аккумулировалось в окружении опухоли. Активация в опухоли активируемого антитела против EGFR истолковывается как эффективность in vivo, которая эквивалентна эффективности цетуксимаба.

Активируемые антитела против EGFR, предлагаемые в настоящем описании, удовлетворяют существенной клинической потребности. EGFR является клинически подтвержденной мишенью, которая, как показано, стимулирует пролиферацию, ангиогенез и инвазию/метастазирование, а также ингибирует апоптоз опухолевых клеток. Антитела и низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназы, направленные на EGFR, были одобрены для лечения рака (Nature Rev Cancer 5 (2005) 341; Curr Opin Cell Biol 21, (2009) 177). Однако имеющиеся в настоящее время агенты для терапии против EGFR, также обозначаемые как ингибиторы EGFR (EGFRi), как показано, индуцируют ряд побочных эффектов после лечения, включая, например, папулопустулярную сыпь, особенно на лице и верхней части туловища человека; сухую и зудящую кожу; воспаление вокруг ногтей, выпадение волос волосистой части головы; и усиленный рост ресниц и волос на лице. Кожная токсичность, которая возникает в результате лечения EGFRi, как показано, возникает у 45-100% больных. (Смотри, например, Segaert and Van Cutsem. Ann Oncol. 16(9) (2005): 1425-33).

Примеры активируемых антител против EGFR по изобретению включают, например, активируемое антитело, обозначаемое в настоящем описании как активируемое антитело 3954-1204-C225v5, которое связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR). Две последовательности активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR представлены ниже, последовательность 1 представляет собой последовательность варианта активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR, которая включает сигнальный пептид, и последовательность 2 представляет собой последовательность активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR без сигнального пептида:

Нуклеотидная последовательность 1 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v5:

[Сигнальный пептид (SEQ ID NO: 60)] [C225v5 (SEQ ID NO: 25)]

Курсив	Сигнальный пептид
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Аминокислотная последовательность 1 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v5:

[Сигнальный пептид (SEQ ID NO: 61)] [C225v5 (SEQ ID NO: 26)]

Курсив	Сигнальный пептид
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Нуклеотидная последовательность 1 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v5:

[Сигнальный пептид (SEQ ID NO: 60)] [спейсер (SEQ ID NO: 62)] [маскирующий фрагмент (SEQ ID NO: 63)] [линкер 1 (SEQ ID NO: 64)] [1204 субстрат (SEQ ID NO: 65)] [линкер 2 (SEQ ID NO: 66)] [С225 (SEQ ID NO: 67)]

Курсив

Сигнальный пептид

Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Аминокислотная последовательность 1 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v5:

[Сигнальный пептид (SEQ ID NO: 61)] [спейсер (SEQ ID NO: 38)] [маскирующий фрагмент (SEQ ID NO: 14)] [линкер 1 (SEQ ID NO: 23)] [1204 субстрат (SEQ ID NO: 13)] [линкер 2 (SEQ ID NO: 24)] [С225 (SEQ ID NO: 68)]

Курсив	Сигнальный пептид
Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Нуклеотидная последовательность 2 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v5:

[С225v5 (SEQ ID NO: 25)]

Аминокислотная последовательность 2 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v5:

[С225v5 (SEQ ID NO: 26)]

Нуклеотидная последовательность 2 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v5:

[Спейсер (SEQ ID NO: 62)] [маскирующий фрагмент (SEQ ID NO: 63)] [линкер 1 (SEQ ID NO: 64)] [1204 субстрат (SEQ ID NO: 65)] [линкер 2 (SEQ ID NO: 66)] [С225 (SEQ ID NO: 67)]

Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Аминокислотная последовательность 2 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v5:

[Спейсер (SEQ ID NO: 38)] [маскирующий фрагмент (SEQ ID NO: 14)] [линкер 1 (SEQ ID NO: 23)] [1204 субстрат (SEQ ID NO: 13)] [линкер 2 (SEQ ID NO: 24)] [С225 (SEQ ID NO: 68)]

Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Другим примером активируемого антитела против EGFR по изобретению является активируемое антитело, обозначаемое в настоящем описании как активируемое антитело 3954-1204-C225v4, которое связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR). Две последовательности активируемого антитела 3954-1204-C225v4 против EGFR показаны ниже, последовательность 1 представляет собой последовательность версии активируемого антитела 3954-1204-C225v4 против EGFR, которая включает сигнальный пептид, и последовательность 2 представляет собой последовательность активируемого антитела 3954-1204-C225v4 против EGFR без сигнального пептида:

Нуклеотидная последовательность 1 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v4:

[Сигнальный пептид (SEQ ID NO: 60)] [C225v4 (SEQ ID NO: 29)]

Курсив	Сигнальный пептид
Нормальный шрифт	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Аминокислотная последовательность 1 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v4:

[Сигнальный пептид (SEQ ID NO: 61)] [C225v4 (SEQ ID NO: 30)]

Курсив	Сигнальный пептид
Нормальный шрифт	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Нуклеотидная последовательность 1 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v4:

[Сигнальный пептид (SEQ ID NO: 60)] [спейсер (SEQ ID NO: 62)] [маскирующий фрагмент (SEQ ID NO: 63)] [линкер 1 (SEQ ID NO: 64)] [1204 Субстрат (SEQ ID NO: 65)] [линкер 2 (SEQ ID NO: 66)] [С225 (SEQ ID NO: 67)]

Курсив	Сигнальный пептид
Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Аминокислотная последовательность 1 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v4:

[Сигнальный пептид (SEQ ID NO: 61)] [спейсер (SEQ ID NO: 38)] [маскирующий фрагмент (SEQ ID NO: 14)] [линкер 1 (SEQ ID NO: 23)] [1204 Субстрат (SEQ ID NO: 13)] [линкер 2 (SEQ ID NO: 24)] [С225 (SEQ ID NO: 68)]

Курсив	Сигнальный пептид
Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Нуклеотидная последовательность 2 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v4:

[C225v4 (SEQ ID NO: 29)]

Аминокислотная последовательность 2 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v4:

[C225v4 (SEQ ID NO: 30)]

Нуклеотидная последовательность 2 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v4:

[Спейсер (SEQ ID NO: 62)] [маскирующий фрагмент (SEQ ID NO: 63)] [линкер 1 (SEQ ID NO: 64)] [1204 Субстрат (SEQ ID NO: 65)] [линкер 2 (SEQ ID NO: 66)] [С225 (SEQ ID NO: 67)]

Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2

Нормальный текст

Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Аминокислотная последовательность 2 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v4:

[Спейсер (SEQ ID NO: 38)] [маскирующий фрагмент (SEQ ID NO: 14)] [линкер 1 (SEQ ID NO: 23)] [1204 Субстрат (SEQ ID NO: 13)] [линкер 2 (SEQ ID NO: 24)] [С225 (SEQ ID NO: 68)]

Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Другим примером активируемого антитела против EGFR по изобретению является активируемое антитело, обозначаемое в настоящем описании как активируемое антитело 3954-1204-C225v6, которое связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR). Две последовательности активируемого антитела 3954-1204-C225v6 против EGFR показаны ниже, последовательность 1 представляет собой последовательность версии активируемого антитела 3954-1204-C225v6 против EGFR, которая включает сигнальный пептид, и последовательность 2 представляет собой последовательность активируемого антитела 3954-1204-C225v6 против EGFR без сигнального пептида:

Нуклеотидная последовательность 1 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v6:

[Сигнальный пептид (SEQ ID NO: 60)] [C225v6 (SEQ ID NO: 33)]

Курсив	Сигнальный пептид
Нормальный шрифт	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Аминокислотная последовательность 1 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v6:

[Сигнальный пептид (SEQ ID NO: 61)] [C225v6 (SEQ ID NO: 34)]

Курсив	Сигнальный пептид
Нормальный шрифт	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Нуклеотидная последовательность 1 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v6:

Курсив	Сигнальный пептид
Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Аминокислотная последовательность 1 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v6:

Курсив	Сигнальный пептид
Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Нуклеотидная последовательность 2 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v6:

[C225v6 (SEQ ID NO: 33)]

Аминокислотная последовательность 2 тяжелой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v6:

[C225v6 (SEQ ID NO: 34)]

Нуклеотидная последовательность 2 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v6:

Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2

Нормальный текст

Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Аминокислотная последовательность 2 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v6:

Жирный шрифт	Спейсер
Подчеркнутый шрифт	Маскирующий фрагмент
Подчеркнутый курсив	Линкер 1
Жирный и подчеркнутый шрифт	Субстрат 1204
Жирный и подчеркнутый курсив	Линкер 2
Нормальный текст	Последовательность, происходящая от антитела против EGFR

Когда активируемое антитело против EGFR по изобретению расщепляется с помощью протеазы, т.е. когда активируемое антитело против EGFR находится в активном или расщепленном состоянии, активированное антитело против EGFR должно сохранять только часть аминокислотной последовательности активируемого антитела в неактивном или нерасщепленном состоянии. Последовательность активируемого антитела против EGFR в активном или расщепленном состоянии будет варьироваться в зависимости от того, какая протеаза расщепляет субстрат (CM), так как различные протеазы могут иметь различные сайты узнавания.

Так, например, иллюстративные антитела против EGFR по изобретению - активируемое антитело 3954-1204-C225v5, активируемое антитело 3954-1204-C225v4 и/или активируемое антитело 3954-1204-C225v6, каждое имеет одну и ту же аминокислотную последовательность легкой цепи (называемую в настоящем описании аминокислотной последовательностью 2 легкой цепи). При воздействии на нее и активации либо урокиназным активатором плазминогена (uPA), либо MT-SP1, активированная форма активируемого антитела против EGFR будет иметь следующую аминокислотную последовательность:

Активированная форма аминокислотной последовательности 2 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v5, 3954-1204-C225v4 и/или 3954-1204-C225v6 при активации с помощью uPA или МТ-SP1:

При воздействии легумаина и активации им активированная форма активируемого антитела против EGFR будет иметь следующую аминокислотную последовательность:

Активированная форма аминокислотной последовательности 2 легкой цепи активируемого антитела 3954-1204-C225v5, 3954-1204-C225v4 и/или 3954-1204-C225v6 при активации легумаином:

В некоторых вариантах осуществления активируемые антитела против EGFR, описанные в настоящем документе, также включают агент, конъюгированный с активируемым антителом. В некоторых вариантах осуществления конъюгированный агент представляет собой терапевтический агент, такой как противоопухолевый агент. В таких вариантах осуществления агент конъюгирован с углеводной частью активируемого антитела, предпочтительно там, где углеводная часть находится за пределами антигенсвязывающей области антитела или антигенсвязывающего фрагмента активируемого антитела. В некоторых вариантах осуществления агент конъюгирован с сульфгидрильной группой антитела или антигенсвязывающего фрагмента в активируемом антителе. В некоторых вариантах осуществления агент конъюгирован с аминогруппой антитела или антигенсвязывающего фрагмента активируемого антитела. В некоторых вариантах осуществления агент конъюгирован с группой карбоновой кислоты антитела или антигенсвязывающего фрагмента активируемого антитела.

В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой цитотоксический агент, такой как токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или его фрагмент), или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат). Подходящие цитотоксические агенты включают, например, любой из цитотоксических агентов, приведенных в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления цитотоксический агент представляет собой доластатин или его производное (например, ауристатин Е, AFP, MMAF, ММАЕ, DMAF, DMAE). Например, цитотоксический агент представляет собой монометилауристатин E (MMAE).

В некоторых вариантах осуществления конъюгированное активируемое антитело может быть модифицировано для сайт-специфической конъюгации через модифицированные аминокислотные последовательности, вставленные или иным образом включенные в последовательность активируемого антитела. Эти модифицированные аминокислотные последовательности предназначены для обеспечения контролируемой локализации и/или дозирования конъюгированного агента в конъюгированном активируемом антителе против EGFR. Например, активируемое антитело может быть сконструировано как включающее замены на цистеин в положениях легких и тяжелых цепей, который обеспечивает реактивными тиоловыми группами и не оказывает негативного влияния на укладку и сборку белка, а также не изменяет связывания антигена. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело может быть сконструировано для включения или введения иным образом одного или более неприродных аминокислотных остатков в пределах активируемого антитела, чтобы обеспечить подходящие места для конъюгации. В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело может быть сконструировано для включения или введения иным образом в последовательность активируемого антитела ферментативно активируемых пептидных последовательностей.

В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой регистрируемую часть молекулы, такую как, например, метка или другой маркер. Например, агент представляет собой или включает меченную радиоактивным изотопом аминокислоту, одну или более биотинилированных частей, которые могут быть обнаружены с помощью маркерного авидина (например, стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которые могут быть обнаружены с помощью оптических или калориметрических методов), один или более радиоизотопов или радионуклидов, одну или более флуоресцентных меток, одну или более ферментных меток и/или один или более хемилюминесцентных агентов. В некоторых вариантах осуществления регистрируемые части присоединены с помощью спейсерных молекул.

Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут быть использованы, включают цепь A дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модесцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Множество радионуклидов доступно для получения радиоконъюгированных антител. Примеры включают ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y и ¹⁸⁶Re.

Конъюгаты антитела и цитотоксического агента получают с использованием множества бифункциональных присоединяющих белок агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCL), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как 2,6-диизоцианат толуола) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано у Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Меченная углеродом 14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгации радионуклеотида и антитела. (Смотри патент W094/11026).

Специалистам в данной области понятно, что большое разнообразие возможных фрагментов может быть соединено с полученными антителами по изобретению. (Смотри, например, «Conjugate Vaccines», Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989), полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки).

В таблице 1 приведены некоторые из примеров фармацевтических агентов, которые могут быть использованы в изобретении, описанном в данном документе, но это перечисление никоим образом не является исчерпывающим.

Таблица 1 Примеры фармацевтических агентов для конъюгации
Цитотоксические агенты
Ауристатины	Турбостатин
Ауристатин Е	Фенстатины
Монометилауристатин Е (MMAE)	Гидроксифенстатин
Дезметилауристатин Е (DMAE)	Спонгистатин 5
Ауристатин F	Спонгистатин 7
Монометилауристатин F (MMAF)	Галистатин 1
Дезметилауристатин F (DMAF)	Галистатин 2
Производные ауристатина, например, его амиды	Галистатин 3
Ауристатин тирамин	Модифицированные бриостатины
Ауристатин хинолин	Галокомстатины
Доластатины	Пирролобензимидазолы (PBI)
Производные доластатина	Цибростатин 6
Доластатин 16 DmJ	Доксалиформ
Доластатин 16 Dpv	Аналоги антрациклинов
Мейтансиноиды, например, DM-1; DM-4	Аналоги антрациклинов
Производные мейтансиноидов
Дуокармицин	Аналог цемадотина (CemCH2-SH)

Производные дуокармицина	Вариант токсина А Pseudomonas (PE38)
Альфа-аманитин	Вариант токсина А Pseudomonas (ZZ-PE38)
Антрациклины	ZJ-101
Доксорубицин	OSW-1
Даунорубицин	4-нитробензилоксикарбонильные производные O6-бензилгуанина
Бриостатины	Ингибиторы топоизомеразы
Камптотецин	Гемиастерлин
Производные камптотецина	Цефалотаксин
7-замещенный камптотецин	Гомогаррингтонин
10,11-дифторметилендиоксикамптотецин	Димеры пирролобензодиазепина (PBD)
Комбретастатины	Функционализированные пирролобензодиазепены
Дебромоаплисиатоксин	Калихеамицины
Кахалалид-F	Подофиллотоксины
Дискодермолид	Таксаны
Эктеинасцидины	Алкалоиды барвинка
Противовирусные агенты	Конъюгированные реагенты для регистрации
Ацикловир	Флуоресцеин и его производные
Вира А	Флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ)
Симметрел
Противогрибковые агенты
Нистатин
Дополнительные противоопухолевые агенты	Радиофармацевтические агенты
Адриамицин	¹²⁵I
Церубидин	¹³¹I
Блеомицин	⁸⁹Zr
Алкеран	¹¹¹In
Велбан	¹²³I
Онковин	¹³¹I
Фторурацил	⁹⁹mTc
Метотрексат	²⁰¹Tl

Тиотепа	¹³³Xe
Бисантрен
Новантрон	⁶²Cu
Тиогуанин
Прокарабизин	⁶⁸Ga
Цитарабин	¹³N
	¹⁵O
Антибактериальные агенты	³⁸K
Аминогликозиды	⁸²Rb
Стрептомицин	⁹⁹mTc (технеций)
Неомицин
Канамицин	Тяжелые металлы
Амикацин	Барий
Гентамицин	Золото
Тобрамицин	Платина
Стрептомицин В
Спектиномицин	Агенты против микоплазмы
Ампициллин	Тилозин
Сульфаниламид	Спектиномицин
Полимиксин
Хлорамфеникол

Присоединение может быть выполнено с помощью любой химической реакции, при которой будут связываться две молекулы, в том случае, если антитело и другая часть сохраняют соответствующую им активность. Это присоединение может включать множественные химические механизмы, например, ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркаляцию, связывание с помощью координационных связей и комплексообразование. Предпочтительным связыванием является, однако, ковалентное связывание. Ковалентное связывание может быть достигнуто либо путем прямой конденсации существующих боковых цепей, либо путем включения внешних молекул мостика. Для присоединения белковых молекул, таких как антитела по настоящему изобретению, к другим молекулам могут быть использованы многие двухвалентные или поливалентные линкерные агенты. Например, иллюстративные присоединяющие агенты могут включать органические соединения, такие как тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидные эфиры, диизоцианаты, глутаровый альдегид, диазобензолы и гексаметилендиамины. Этот список не претендует на исчерпывающий для различных классов присоединяющих агентов, известных в данной области техники, а скорее является примером наиболее распространенных присоединяющих агентов. (Смотри Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335-2549 (1984); Jansen et al, Immunological Reviews 62: 185-216 (1982); and Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)).

Предпочтительные линкеры описаны в литературе. (Смотри, например, статью Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984), описывающую применение MBS (эфира М-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида). Смотри также патент США № 5030719, описывающий применение галогенизированных ацетилгидразидных производных, соединенных с антителом посредством олигопептидного линкера.). Особенно предпочтительные линкеры включают: (i) SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)-толуол (Pierce Chem. Со, Cat. (21558G); (ii) SPDP (сукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (Pierce Chem. Со, Cat # (21651G); и (iii) сульфо-LC-SPDP (сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)-пропианамид]гексаноат (Pierce Chem. Cо. Cat. # 2165-G).

Линкеры, описанные выше, содержат компоненты, которые имеют разные свойства, что приводит к конъюгатам с различными физико-химическими свойствами. Например, линкер SMPT содержит пространственно заблокированную дисульфидную связь и может образовывать конъюгаты с повышенной стабильностью. Дисульфидные связи в целом менее стабильны, чем другие связи, так как дисульфидная связь расщепляется in vitro, приводя в результате к меньшей доступности конъюгата.

Реагент EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид) пригоден для создания карбоксамида, начиная с карбоновой кислоты и первичного или вторичного амина. Таким образом, EDC может быть использован для соединения остатков лизина в антителе с карбоновой кислотой линкера или токсина, или для соединения остатков аспартата или глутамата в антителе с амином линкера или токсина. Такие реакции конъюгации, использующие EDC, могут быть усилены путем добавления NHS (N-гидроксисукцинимида) или сульфо-NHS (N-гидрокси-3-оксисульфонилсукцинимида). Добавление NHS или сульфо-NHS в таких реакциях конъюгации может увеличить скорость, полноту, селективность и/или воспроизводимость реакций конъюгации.

В некоторых вариантах осуществления линкеры являются расщепляемыми. В некоторых вариантах осуществления линкеры являются нерасщепляемыми. В некоторых вариантах осуществления присутствуют два или более линкеров. Два или более линкеров, все являются одинаковыми, например, расщепляемыми или нерасщепляемыми, или два или более линкеров различны, например, по меньшей мере, один является расщепляемым и, по меньшей мере, один является нерасщепляемым.

В настоящем изобретении используется несколько методов присоединения агентов к AB: (а) присоединение к углеводным частям AB, или (b) присоединение к сульфгидрильным группам AB, или (c) присоединение к аминогруппам AB, или (d) присоединение к карбоксилатным группам AB. В соответствии с изобретением AB могут быть ковалентно присоединены к агенту через промежуточный линкер, имеющий, по меньшей мере, две реакционноспособные группы, одна для взаимодействия с AB и одна для взаимодействия с агентом. Линкер, который может включать любое совместимое органическое соединение, может быть выбран таким образом, чтобы взаимодействие с AB (или с агентом) не оказывало отрицательного влияния на реакционную способность и селективность AB. Кроме того, присоединение линкера к агенту не должно нарушать активность агента. Подходящие линкеры для взаимодействия с окисленными антителами или окисленными фрагментами антител включают линкеры, которые содержат амин, выбранный из группы, состоящей из групп первичного амина, вторичного амина, гидразина, гидразида, гидроксиламина, фенилгидразина, семикарбазида и тиосемикарбазида. Такие реакционноспособные функциональные группы могут существовать в виде части структуры линкера или могут быть введены с помощью подходящей химической модификации линкеров, не содержащих таких групп.

В соответствии с настоящим изобретением подходящие линкеры для присоединения к восстановленным AB включают линкеры, которые имеют определенные реакционноспособные группы, способные к взаимодействию с сульфгидрильной группой восстановленного антитела или фрагмента. Такие реакционноспособные группы включают, но не ограничиваются этим: реакционноспособные галогеналкильные группы (включая, например, галогенацетильные группы), п-меркурийбензоатные группы и группы, способные к реакциям присоединения типа Михаэля (включая, например, малеимиды и группы типа, описанного Mitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110).

В соответствии с настоящим изобретением подходящие линкеры для присоединения не окисленных и не восстановленных Abs включают линкеры, которые имеют определенные функциональные группы, способные к взаимодействию с первичными аминогруппами, присутствующими в немодифицированных остатках лизина Ab. Такие реакционноспособные группы включают, но не ограничиваются этим, NHS эфиров карбоновой или угольной кислоты, сульфо-NHS эфиров карбоновой или угольной кислоты, 4-нитрофенил эфиров карбоновой или угольной кислоты, пентафторфенил эфиров карбоновой или угольной кислоты, ацилимидазолы, изоцианаты и изотиоцианаты.

В соответствии с настоящим изобретением подходящие линкеры для присоединения не окисленных и не восстановленных Ab включают линкеры, имеющие определенные функциональные группы, способные к взаимодействию с карбоксильными группами, присутствующими в остатках аспартата или глутамата Ab, которые активированы подходящими реагентами. Подходящие активирующие реагенты включают EDC с добавлением или без добавления NHS или сульфо-NHS и другие дегидратирующие агенты, используемые для образования карбоксамида. В этих случаях функциональные группы, присутствующие в подходящих линкерах, должны включать первичные и вторичные амины, гидразины, гидроксиламины и гидразиды.

Агент может быть присоединен к линкеру до или после присоединения линкера к AB. В некоторых вариантах применения может быть желательно, чтобы первым получали промежуточный продукт AB-линкер, в котором линкер свободен от присоединяемого агента. В зависимости от конкретного применения специфический агент может быть затем ковалентно присоединен к линкеру. В других вариантах осуществления AB сначала соединяют с ММ, СМ и ассоциированными линкерами и затем присоединяют к линкеру с целью конъюгации.

Разветвленные линкеры: В конкретных вариантах осуществления используются разветвленные линкеры, которые имеют множественные сайты для присоединения агентов. Для линкеров с множественными сайтами одно ковалентное присоединение к AB должно приводить к промежуточному продукту AB-линкер, способному связывать агент в ряде сайтов. Сайты могут представлять собой альдегидные или сульфгидрильные группы или любой химический сайт, к которому могут быть присоединены агенты.

Альтернативно, более высокая специфическая активность (или более высокое отношение агентов к АВ) может быть достигнута путем присоединения линкера с одним сайтом к множественным сайтам AB. Это множество сайтов может быть введено в AB с помощью любого из двух методов. Во-первых, можно создавать множественные альдегидные группы и/или сульфгидрильные группы в одном и том же AB. Во-вторых, можно присоединить к альдегиду или сульфгидрилу AB «разветвленный линкер», имеющий множественные функциональные сайты для последующего присоединения к линкерам. Функциональные сайты разветвленного линкера или линкера с множественными сайтами могут представлять собой альдегидные или сульфгидрильные группы, или могут представлять собой любой химический сайт, к которому могут быть присоединены линкеры. Еще более высокая специфическая активность может быть получена с помощью объединения этих двух подходов, что означает присоединение линкеров с множественными сайтами к нескольким сайтам AB.

Расщепляемые линкеры: Пептидные линкеры, которые чувствительны к расщеплению ферментами системы комплемента, такими как, но не ограничиваясь этим, урокиназа, тканевой активатор плазминогена, трипсин, плазмин или другой фермент, обладающий протеолитической активностью, могут быть использованы в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения. Согласно одному способу по настоящему изобретению, агент присоединяют через линкер, чувствительный к расщеплению комплементом. Антитело выбирают из класса, который может активировать комплемент. Конъюгат антитело-агент, таким образом, активирует каскад комплемента и высвобождает агент в области мишени. Согласно другому способу по настоящему изобретению, агент присоединяют через линкер, чувствительный к расщеплению ферментами, имеющими протеолитическую активность, такими как, урокиназа, тканевой активатор плазминогена, плазмин или трипсин. Эти расщепляемые линкеры используются в конъюгированных активируемых антителах, которые включают внеклеточный токсин, например, в качестве неограничивающего примера, любой из внеклеточных токсинов, представленных в таблице 1.

Неограничивающие примеры последовательностей расщепляемых линкеров представлены в таблице 2.

Таблица 2 Примеры последовательностей линкеров для конъюгации
Типы расщепляемых последовательностей	Аминокислотная последовательность
Последовательности, расщепляемые плазмином
Проурокиназа
TGFβ
Плазминоген
Стафилокиназа

Последовательности, расщепляемые фактором Ха

Последовательности, расщепляемые MMP
Желатиназа А
Последовательности, расщепляемые коллагеназой
Коллаген кожи телят (цепь α1(I))

Коллаген кожи телят (цепь α2(I))
Коллаген хряща коров (цепь α1(II))
Коллаген печени человека (цепь α1(III))
α₂М человека
PZP человека
α₁М крысы
α₂М крысы
α₁I₃(2J) крысы
α₁I₃(27J) крысы
Коллагеназа фибробластов человека (автолитическое расщепление)

Кроме того, агенты могут быть присоединены через дисульфидные связи (например, дисульфидные связи молекулы цистеина) АВ. Поскольку многие опухоли в естественных условиях высвобождают высокие уровни глутатиона (восстанавливающего агента), это может вызывать восстановление дисульфидных связей с последующим высвобождением агента в области его доставки. В некоторых конкретных вариантах осуществления восстанавливающий агент, который должен модифицировать CM, должен также модифицировать линкер конъюгированного активируемого антитела.

Спейсеры и расщепляемые элементы: В еще одном варианте осуществления может возникнуть необходимость конструкции линкера таким образом, чтобы оптимизировать спейсер между агентом и AB активируемого антитела. Это может быть достигнуто путем использования линкера общей структуры:

W-(CH₂)n-Q,

где

W представляет собой либо -NH-CH₂-, либо -CH₂-;

Q представляет собой аминокислоту, пептид; и

n представляет собой целое число от 0 до 20.

В еще одних вариантах осуществления линкер может включать спейсерный элемент и расщепляемый элемент. Спейсерный элемент служит для позиционирования отщепляемого элемента в сторону от остова AB таким образом, что расщепляемый элемент более доступен для фермента, ответственного за расщепление. Некоторые из разветвленных линкеров, описанных выше, могут служить в качестве спейсерных элементов.

Обсуждая это, следует понимать, что присоединение линкера к агенту (или спейсерного элемента к расщепляемому элементу, или расщепляемого элемента к агенту) не требует конкретного способа или реакции присоединения. Любая реакция, обеспечивающая продукт с подходящей стабильностью и биологической совместимостью, является приемлемой.

Комплемент сыворотки и выбор линкеров: Согласно одному способу по настоящему изобретению, когда желательно высвобождение агента, используется AB, которое представляет собой антитело такого класса, который может активировать комплемент. Полученный в результате конъюгат сохраняет способность как связывать антиген, так и активировать каскад комплемента. Таким образом, согласно этому варианту осуществления настоящего изобретения, агент присоединяют к одному концу расщепляемого линкера или расщепляемого элемента, а другой конец линкерной группы присоединяют к специфическому сайту AB. Например, если агент имеет гидроксильную группу или аминогруппу, он может быть присоединен к карбоксильному концу пептида, аминокислоты или другого подходящим образом выбранного линкера через сложноэфирную или амидную связь, соответственно. Например, такие агенты могут быть присоединены к линкерному пептиду с помощью карбодиимидной реакции. Если агент содержит функциональные группы, которые могли бы помешать присоединению к линкеру, эти мешающие функциональные группы могут быть заблокированы перед присоединением и разблокированы как только получен конъюгированный продукт или промежуточное соединение. Противоположный или аминоконец линкера затем используют либо непосредственно, либо после дальнейшей модификации для связывания с AB, которое способно активировать комплемент.

Линкеры (или спейсерные элементы линкеров) могут быть любой желаемой длины, один их конец может быть ковалентно присоединен к специфическим сайтам AB активируемого антитела. Другой конец линкера или спейсерного элемента может быть присоединен к аминокислоте или пептидному линкеру.

Таким образом, когда эти конъюгаты связываются с антигеном в присутствии комплемента, амидная или сложноэфирная связь, которая соединяет агент с линкером, будет расщепляться, приводя к высвобождению агента в его активной форме. Эти конъюгаты при введении индивидууму будут осуществлять доставку и высвобождение агента в области мишени, и особенно эффективны для доставки in vivo фармацевтических агентов, антибиотиков, антиметаболитов, антипролиферативных агентов и тому подобного, таких как представленные без ограничения в таблице 1.

Линкеры для высвобождения без активации комплемента: В еще одном применении направленной доставки желательно высвобождение агента без активации комплемента, так как активация каскада комплемента в конечном счете лизирует клетки-мишени. Следовательно, этот подход полезен, когда доставка и высвобождение агента должны достигаться без гибели клетки-мишени. Такая цель преследуется, когда желательна доставка в клетки-мишени клеточных медиаторов, таких как гормоны, ферменты, кортикостероиды, нейротрансмиттеры, гены или ферменты. Эти конъюгаты могут быть получены путем присоединения агента к AB, которое не способно активировать комплемент, через линкер, который является умеренно чувствительным к расщеплению сывороточными протеазами. Когда такой конъюгат вводят индивидууму, комплексы антиген-антитело будут образовываться быстро, в то время как расщепление агента будет происходить медленно, что таким образом приведет к высвобождению соединения в области мишени.

Биохимические кросслинкеры: В других вариантах осуществления активируемое антитело может быть конъюгировано с одним или более терапевтическими агентами с использованием определенных биохимических кросслинкеров. Кросслинкерные реагенты образуют молекулярные мостики, которые связывают вместе функциональные группы двух различных молекул. Чтобы связать два разных белка поэтапно, могут быть использованы гетеробифункциональные кросслинкеры, которые исключают образование нежелательных гомополимеров.

Пригодны также пептидильные линкеры, расщепляемые с помощью лизосомальных протеаз, например, Val-Cit, Val-Ala или другие дипептиды. Кроме того, могут быть использованы кислото-лабильные линкеры, расщепляемые в лизосомной среде с низким рН, например: бис-сиалиловый эфир. Другие подходящие линкеры включают катепсин-лабильные субстраты, особенно субстраты, которые оптимально функционируют при кислом значении рН.

Иллюстративные гетеробифункциональные кросслинкеры представлены в таблице 3.

Таблица 3 Иллюстративные гетеробифункциональные кросслинкеры
Гетеробифункциональные кросслинкеры
Линкер	Реактивный в отношении	Преимущества и применение	Длина плеча спейсера после поперечной сшивки (Ангстремы)
SMPT	Первичные амины Сульфгидрилы	Более высокая стабильность	11,2 Å
SPDP	Первичные амины Сульфгидрилы	Тиолирование Расщепляемая поперечная сшивка	6,8 Å
LC-SPDP	Первичные амины Сульфгидрилы	Увеличенное плечо спейсера	15,6 Å
Сульфо-LC-SPDP	Первичные амины Сульфгидрилы	Увеличенное плечо спейсера Водорастворимые	15,6 Å
SMCC	Первичные амины Сульфгидрилы	Стабильная малеимидная реакционноспособная группа Конъюгация фермент-антитело Конъюгация гаптен-белок-носитель	11,6 Å
Сульфо-SMCC	Первичные амины Сульфгидрилы	Стабильная малеимидная реакционноспособная группа Водорастворимые Конъюгация фермент-антитело	11,6 Å
MBS	Первичные амины Сульфгидрилы	Конъюгация фермент-антитело Конъюгация гаптен-белок-носитель	9,9 Å

Сульфо-MBS	Первичные амины Сульфгидрилы	Водорастворимые	9,9 Å
SIAB	Первичные амины Сульфгидрилы	Конъюгация фермент-антитело	10,6 Å
Сульфо-SIAB	Первичные амины Сульфгидрилы	Водорастворимые	10,6 Å
SMPB	Первичные амины Сульфгидрилы	Увеличенное плечо спейсера Конъюгация фермент-антитело	14,5 Å
Сульфо-SMPB	Первичные амины Сульфгидрилы	Увеличенное плечо спейсера Водорастворимые	14,5 Å
EDE/сульфо-NHS	Первичные амины Карбоксильные группы	Конъюгация гаптен-носитель	0
ABH	Углеводы Неселектиный	Взаимодействие с группами сахаров	11,9 Å

Нерасщепляемые линкеры или прямое присоединение: В еще одних вариантах осуществления изобретения, конъюгат может быть создан таким образом, что агент доставляется к мишени, но не высвобождается. Это может быть достигнуто путем присоединения агента к AB либо непосредственно, либо через нерасщепляемый линкер.

Эти нерасщепляемые линкеры могут включать аминокислоты, пептиды, D-аминокислоты или другие органические соединения, которые могут быть модифицированы так, чтобы включать функциональные группы, которые впоследствии могут быть использованы для присоединения к AB с помощью методов, описанных в данном документе. Общая формула для такого органического линкера может представлять собой:

W-(CH₂)_n-Q,

где

W представляет собой либо -NH-CH₂-, либо -CH₂-;

Q представляет собой аминокислоту, пептид; и

n представляет собой целое число от 0 до 20.

Нерасщепляемые конъюгаты: Альтернативно, соединение может быть присоединено к AB, которые не активируют комплемент. При использовании AB, которые не способны активировать комплемент, это присоединение может быть выполнено с использованием линкеров, которые чувствительны к расщеплению активированным комплементом, или с использованием линкеров, которые не чувствительны к расщеплению активированным комплементом.

Определения:

Если не указано иначе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, должны иметь значения, которые обычно понятны специалисту в данной области техники. Кроме того, если иное не предусмотрено контекстом, термины в единственном числе должны включать множественное число, и термины во множественном числе должны включать единственное число. Обычно номенклатура, используемая в связи с настоящим изобретением, и методы, и клеточные и тканевые культуры, методы молекулярной биологии, и белковой и олиго- или полинуклеотидной химии, а также методы гибридизации, описанные в настоящем документе, хорошо известны и обычно используются в данной области техники. Стандартные методы используются для рекомбинантной ДНК, синтеза олигонуклеотидов и тканевой культуры и трансформации (например, электропорация, липофекция). Ферментативные реакции и способы очистки осуществляются в соответствии с инструкциями производителя или как обычно выполняется в данной области техники, или как описано в настоящем документе. Упомянутые выше методы и процедуры обычно осуществляются в соответствии с традиционными способами, хорошо известными в данной области техники, и как описано в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в данном описании. Смотри, например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Номенклатура, используемая в связи с настоящим изобретением, и лабораторные методы и приемы аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящем документе, хорошо известны и обычно используются в данной области техники. Стандартные методы используются для химических синтезов, химических анализов, фармацевтических препаратов, составов и доставки, а также лечения больных.

При использовании в соответствии с настоящим изобретением, следующие термины, если не указано иное, следует понимать как имеющие следующие значения:

При применении в настоящем описании термин «антитело» относится к молекулам иммуноглобулинов и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулинов (Ig), т.е. молекул, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается (иммуновзаимодействует) с антигеном. Под термином «специфически связывается» или «иммуновзаимодействует» или «иммуноспецифически связывается» подразумевается, что антитело взаимодействует с одной или более антигенных детерминант желаемого антигена, и не взаимодействует с другими полипептидами или связывается со значительно более низкой аффинностью (K_d>10^-6). Антитела включают, но не ограничиваются этим, поликлональные, моноклональные, гибридные, домен антитела, одноцепочечные, Fab-, и F(аb')₂-фрагменты, scFvs и экспрессионную библиотеку Fab.

Основная структурная единица антитела, как известно, включает тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну «легкую» (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (приблизительно 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область от приблизительно 100 до 110 или более аминокислот, ответственную в первую очередь за узнавание антигена. Карбоксиконцевой участок каждой цепи определяет константную область, ответственную в первую очередь за эффекторную функцию. В целом, молекулы антител, полученные от человека, относятся к любому из классов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, которые отличаются друг от друга по природе тяжелой цепи, присутствующей в молекуле. Некоторые классы имеют также подклассы, такие как IgG₁, IgG₂ и другие. Кроме того, у человека легкая цепь может представлять собой каппа-цепь или лямбда-цепь.

Термин «моноклональное антитело» (mAb) или «композиция моноклонального антитела» при использовании в настоящем описании относится к популяции молекул антител, которые содержат только один молекулярный тип молекулы антитела, состоящий из продукта гена уникальной легкой цепи и продукта гена уникальной тяжелый цепи. В частности, области, определяющие комплементарность (CDR), моноклонального антитела идентичны во всех молекулах популяции. Mab содержат антигенсвязывающий сайт, способный иммуновзаимодействовать с конкретным эпитопом антигена, характеризуемый уникальной аффинностью связывания к нему.

Термин «антигенсвязывающий сайт» или «связывающий участок» относится к части молекулы иммуноглобулина, которая участвует в связывании антигена. Антигенсвязывающий сайт образуется аминокислотными остатками N-концевых вариабельных областей («V») тяжелой («H») и легкой («L») цепей. Три очень различающихся участка в пределах V областей тяжелой и легкой цепей, называемых «гипервариабельными участками», расположены между более консервативными примыкающими участками, известными как «каркасные области» или «FR». Таким образом, термин «FR» относится к аминокислотным последовательностям, которые в природе находятся в иммуноглобулинах между гипервариабельными областями и примыкают к ним. В молекуле антитела три гипервариабельные области легкой цепи и три гипервариабельные области тяжелой цепи расположены в трехмерном пространстве относительно друг друга, так что образуется антигенсвязывающая поверхность. Антигенсвязывающая поверхность комплементарна трехмерной поверхности связываемого антигена, и три гипервариабельные области каждой из тяжелых и легких цепей, называют «областями, определяющими комплементарность» или «CDR». Отнесение аминокислот к каждому домену осуществляется в соответствии с определениями Кабата последовательностей белков, представляющих иммунологический интерес (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), или Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).

При использовании в данном описании термин «эпитоп» включает любую детерминанту белка, способную специфически связываться с иммуноглобулином, scFv или с Т-клеточным рецептором. Термин «эпитоп» включает любую детерминанту белка, способную специфически связываться с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Например, могут быть выработаны антитела против N-концевых или С-концевых пептидов полипептида. Говорится, что антитело специфически связывается с антигеном, если константа диссоциации составляет ≤1 мкМ; предпочтительно ≤100 нМ и наиболее предпочтительно ≤10 нМ.

При использовании в данном описании термины «специфическое связывание», «иммунологическое связывание» и «иммунологические связывающие свойства» относятся к нековалентным взаимодействиям такого типа, который возникает между молекулой иммуноглобулина и антигеном, в отношении которого специфичен иммуноглобулин. Сила или аффинность связывания иммунологических взаимодействий может быть выражена в терминах константы диссоциации (K_d) связывания, где более низкая К_d характеризует более высокое сродство. Иммунологические связывающие свойства выбранных полипептидов могут быть определены количественно с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Один из таких методов включает измерение скоростей образования и диссоциации комплексов антигенсвязывающий сайт/антиген, где эти скорости зависят от концентраций партнеров комплекса, аффинности связывания и геометрических параметров, которые в равной степени влияют на скорость в обоих направлениях. Таким образом, как «константа скорости возникновения комплекса» (К_on), так и «константа скорости распада комплекса» (К_off) может быть определена путем подсчета концентраций и фактических скоростей ассоциации и диссоциации. (Смотри Nature 361:186-87 (1993)). Отношение K_off/K_on позволяет отменить все параметры, не относящиеся к сродству, и равно константе диссоциации K_d. (Смотри, обычно, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Считается, что антитело по настоящему изобретению специфически связывается с EGFR, когда равновесная константа связывания (K_d) составляет ≤1 мкМ, предпочтительно ≤100 нМ, более предпочтительно ≤10 нМ и наиболее предпочтительно от ≤100 пкМ до приблизительно 1 пкМ при измерении с помощью таких методов, как радиолигандный связывающий анализ или сходные методы, известные специалистам в данной области техники.

При использовании в данном описании термин «выделенный полинуклеотид» должен обозначать полинуклеотид геномного происхождения, кДНК или полинуклеотид синтетического происхождения или некоторые их сочетания, который в силу своего происхождения является «выделенным полинуклеотидом», который (1) не связан со всем или с частью полинуклеотида, в котором «выделенный полинуклеотид» находится в природе, (2) оперативно связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе в виде части более крупной последовательности. Полинуклеотиды в соответствии с изобретением включают молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелые цепи молекул иммуноглобулина, представленные в настоящем описании, и молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкие цепи молекул иммуноглобулина, представленные в настоящем описании.

При использовании в данном описании термин «выделенный белок» означает белок с кДНК, с рекомбинантной РНК или белок синтетического происхождения или некоторые их сочетания, который в силу своего происхождения или источника дериватизации является «выделенным белком», который (1) не связан с белками, обнаруживаемыми в природе, (2) свободен от других белков из того же источника, например, свободен от белков мыши, (3) экспрессируется клеткой различных видов, или (4) не встречается в природе.

Термин «полипептид» используется в данном описании как общий термин для обозначения нативного белка, фрагментов или аналогов полипептидной последовательности. Таким образом, нативные фрагменты белка, а также аналоги относятся к видам полипептида. Полипептиды в соответствии с изобретением включают молекулы тяжелых цепей иммуноглобулина, представленные в данном описании, и молекулы легких цепей иммуноглобулина, представленные в данном описании, а также молекулы антител, образованные сочетаниями, включающими сочетание молекул тяжелых цепей иммуноглобулина с молекулами легких цепей иммуноглобулина, такими как молекулы легкой цепи каппа иммуноглобулина, и наоборот, а также их фрагменты и аналоги.

Термин «природный», используемый в настоящем описании применительно к объекту, относится к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника и которая не была намеренно модифицирована человеком в лаборатории или иным образом, является природной.

Термин «оперативно связанный», используемый в настоящем описании, относится к положениям компонентов, так что описываемые компоненты находятся в таких отношениях, которые позволяют им функционировать предназначенным образом. Регуляторная последовательность, «оперативно связанная» с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с регуляторными последовательностями.

Термин «регуляторная последовательность», используемый в настоящем описании, относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они соединены. Природа таких регуляторных последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина, у прокариот такие регуляторные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосом и последовательность терминации транскрипции, у эукариот обычно такие регуляторные последовательности включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин «регуляторные последовательности» предназначен для включения как минимум всех компонентов, присутствие которых необходимо для экспрессии и процессинга, а также может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является выгодным, например, лидирующие последовательности и последовательности партнеров по гибридизации. Термин «полинуклеотид», как указано в данном описании, обозначает нуклеотиды, состоящие, по меньшей мере, из 10 оснований в длину, либо рибонуклеотиды, либо дезоксирибонуклеотиды, либо модифицированные формы любого типа нуклеотида. Этот термин включает одно- и двухцепочечные формы ДНК.

Термин олигонуклеотид, как обозначается в настоящем описании, включает природные и модифицированные нуклеотиды, связанные друг с другом природными и не встречающимися в природе олигонуклеотидными связями. Олигонуклеотиды представляют собой подгруппу полинуклеотидов, обычно включающую в длину 200 оснований или менее. Предпочтительно олигонуклеотиды состоят из от 10 до 60 оснований в длину и наиболее предпочтительно составляют 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или от 20 до 40 оснований в длину. Олигонуклеотиды обычно являются одноцепочечными, например, в случае зондов, хотя олигонуклеотиды могут быть двухцепочечными, например, при использовании в конструкте мутантного гена. Олигонуклеотиды по изобретению являются либо смысловыми, либо антисмысловыми олигонуклеотидами.

Термин «природные нуклеотиды», как обозначается в настоящем описании, включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин «модифицированные нуклеотиды», как обозначается в настоящем описании, включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными группами сахаров и тому подобное. Термин «олигонуклеотидные связи», как обозначается в настоящем описании, включает олигонуклеотидные связи, такие как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселерлоат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфораниладат, фосфоронмидат и тому подобное. Смотри, например, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. U.S. Patent No. 5, 151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Олигонуклеотид может включать детектируемую метку, если это необходимо.

При применении в данном описании обычно следуют традиционному использованию двадцати обычных аминокислот и их аббревиатур. Смотри Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991)). Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати обычных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α-,α-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нетрадиционные аминокислоты могут также быть подходящими компонентами для полипептидов по настоящему изобретению. Примеры нетрадиционных аминокислот включают: 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-N,N,N-триметиллизин, ε-N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-N-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В обозначениях полипептидов, используемых в настоящем описании, левое направление представляет собой аминоконцевое направление, а правое направление является карбоксиконцевым направлением в соответствии со стандартным использованием и договоренностью.

Сходно, если не указано иначе, левый конец одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей представляет собой 5'-конец, левое направление двухцепочечных полинуклеотидных последовательностей обозначается как 5'-направление. Направление от 5' к 3' при добавлении формирующихся РНК-транскриптов обозначается как транскрипционное направление областей последовательности на цепи ДНК, имеющих ту же последовательность, что и РНК, и те, которые представляют собой конец от 5' к 5' РНК-транскрипта, обозначаются как «вышележащие последовательности», области последовательности на цепи ДНК, имеющие ту же последовательность, что и РНК, и те, которые представляют собой конец от 3' к 3' РНК-транскрипта, обозначаются как «нижележащие» последовательности.

Применительно к полипептидам термин «существенная идентичность» обозначает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программ GAP или BESTFIT, с весом пробелов по умолчанию, имеют идентичность последовательностей, по меньшей мере, 80 процентов, предпочтительно идентичность последовательностей, по меньшей мере, 90 процентов, более предпочтительно идентичность последовательностей, по меньшей мере, 95 процентов, и наиболее предпочтительно идентичность последовательностей, по меньшей мере, 99 процентов.

Предпочтительно, положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами.

Как обсуждалось в настоящем документе, незначительные вариации аминокислотных последовательностей антител или молекул иммуноглобулинов рассматриваются как охватываемые объемом настоящего изобретения, при условии, что при вариации аминокислотной последовательности сохраняется, по меньшей мере, 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, 90%, 95%, и наиболее предпочтительно 99% последовательности. В частности, рассматриваются консервативные аминокислотные замены. Консервативные замены представляют собой замены, которые имеют место внутри семейства аминокислот с родственными боковыми цепями. Генетически кодируемые аминокислоты обычно разделены на семейства: (1) кислые аминокислоты представляют собой аспартат, глутамат; (2) основные аминокислоты представляют собой лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные аминокислоты представляют собой аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные аминокислоты представляют собой глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Гидрофильные аминокислоты включают аргинин, аспарагин, глутамин, аспартат, глутамат, гистидин, лизин, серин и треонин. Гидрофобные аминокислоты включают аланин, цистеин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, триптофан, тирозин и валин. Другие семейства аминокислот включают (i) серин и треонин, которые представляют собой алифатическое гидроксильное семейство; (ii) аспарагин и глютамин, которые представляют собой семейство, содержащее амид; (iii) аланин, валин, лейцин и изолейцин, которые представляют собой алифатическое семейство; и (iv) фенилаланин, триптофан и тирозин, которые представляют собой ароматическое семейство. Например, разумно ожидать, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или подобная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не должна иметь существенного влияния на связывание или свойства полученной молекулы, особенно, если замена не вовлекает аминокислоту в пределах сайта остова. Будет ли замена аминокислот приводить к функционирующему пептиду, можно легко определить путем анализа специфической активности полипептидного производного. Анализы подробно описаны в настоящем документе. Фрагменты или аналоги антител или молекул иммуноглобулина могут быть легко получены специалистом в данной области техники. Предпочтительные амино- и карбоксиконцы фрагментов или аналогов находятся вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут быть идентифицированы путем сравнения данных о нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностях с базами данных об общедоступных или запатентованных последовательностях. Предпочтительно, для идентификации мотивов последовательностей или предсказания конформационных доменов белка, которые находят в других белках с известной структурой и/или функцией, используются компьютерные методы сравнения. Известны методы идентификации белковых последовательностей, которые укладываются в известную трехмерную структуру. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Таким образом, приведенные выше примеры показывают, что специалисты в данной области техники могут узнать мотивы последовательностей и структурные конформации, которые могут быть использованы, чтобы определить структурные и функциональные домены в соответствии с настоящим изобретением.

Предпочтительными аминокислотными заменами являются замены, которые: (1) уменьшают чувствительность к протеолизу, (2) уменьшают чувствительность к окислению, (3) изменяют связывающее сродство образующихся белковых комплексов, (4) изменяют аффинность связывания и (4) предоставляют или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут включать различные мутеины последовательности, отличной от природной последовательности пептида. Например, одну или множественные аминокислотные замены (предпочтительно консервативные аминокислотные замены) можно сделать в природной последовательности (предпочтительно в части полипептида вне домена(ов), образующих межмолекулярные контакты). Консервативная аминокислотная замена не должна существенно изменять структурные характеристики родительской последовательности (например, замена аминокислоты не должна вести к тенденции разрушения спирали, которая существует в родительской последовательности, или нарушать другие типы вторичной структуры, которые характеризуют родительскую последовательность). Примеры вторичных и третичных полипептидных структур, известные в данной области техники, описаны в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et at. Nature 354:105 (1991).

Термин «полипептидный фрагмент», используемый в настоящем описании, относится к полипептиду, который имеет аминоконцевую и/или карбоксиконцевую делецию и/или одну или более внутренних делеций(ю), но где оставшаяся аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям в установленной природной последовательности, например, полной последовательности кДНК. Фрагменты обычно составляют, по меньшей мере, 5, 6, 8 или 10 аминокислот в длину, предпочтительно, по меньшей мере, 14 аминокислот в длину, более предпочтительно, по меньшей мере, 20 аминокислот в длину, обычно, по меньшей мере, 50 аминокислот в длину, и даже более предпочтительно, по меньшей мере, 70 аминокислот в длину. Термин «аналог», используемый в настоящем описании, относится к полипептидам, которые включают сегмент, по меньшей мере, из 25 аминокислот, который по существу идентичен части с установленной аминокислотной последовательностью и который специфически связывается с EGFR при подходящих условиях связывания. Обычно полипептидные аналоги включают консервативную аминокислотную замену (или добавление или делецию) относительно природной последовательности. Аналоги обычно составляют, по меньшей мере, 20 аминокислот в длину, предпочтительно, по меньшей мере, 50 аминокислот в длину или более, и часто могут быть такими же длинными, как полноразмерный природный полипептид.

Термин «агент» используется в настоящем описании для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, полученного из биологических материалов.

В данном описании термины «метка» или «меченый» относятся к включению регистрируемого маркера, например, путем включения аминокислоты, меченной радиоактивной меткой, или путем присоединения к полипептиду биотинилированных фрагментов, которые могут быть выявлены с помощью меченого авидина (например, стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер или ферментативную активность, что может быть выявлено с помощью оптических или калориметрических методов). В некоторых ситуациях метка или маркер может быть также терапевтическим. Различные способы мечения полипептидов и гликопротеидов известны в данной области техники и могут быть использованы. Примеры меток для полипептидов включают, но не ограничиваются этим, следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), флуоресцентные метки (например, ФИТЦ, родамин, люминофоры на основе лантаноидов), ферментные метки (например, пероксидаза хрена, п-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные агенты, биотинилированные группы, предварительно определенные полипептидные эпитопы, узнаваемые вторичным репортером (например, последовательности пар лейциновых застежек, сайты связывания вторых антител, домены связывания металлов, эпитопные метки). В некоторых вариантах осуществления метки присоединяют с помощью плеча спейсеров различной длины, чтобы уменьшить потенциальное пространственное затруднение. Термин «фармацевтический агент или лекарство» при использовании в настоящем описании относится к химическому соединению или композиции, способных индуцировать желаемый терапевтический эффект при надлежащем введении больному.

Другие химические термины в данном документе используются в соответствии с обычным использованием в данной области техники, как проиллюстрировано The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

При использовании в настоящем описании «по существу чистый» означает, что вид объекта является преобладающим присутствующим видом (т.е. на основе молярности он находится в композиции в большем избытке, чем любые другие конкретные виды), предпочтительно, чтобы по существу очищенная фракция представляла собой композицию, в которой вид объекта составляет, по меньшей мере, приблизительно 50 процентов (на основе молярности) от всех присутствующих видов макромолекул.

Обычно, по существу чистая композиция должна содержать более приблизительно 80 процентов всех видов макромолекул, присутствующих в композиции, более предпочтительно более приблизительно 85%, 90%, 95% и 99%. Наиболее предпочтительно, чтобы вид объекта очищали по существу до гомогенности (загрязняющие виды невозможно определить в композиции с помощью обычных методов определения), где композиция состоит по существу из одного вида макромолекул.

Термин больной включает людей и ветеринарных животных.

Антитела

Активируемые антитела по изобретению специфически связываются с рецептором эпидермального фактора роста человека (EGFR). В изобретение включаются также активируемые антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и активируемые антитела против EGFR, описанные в настоящем документе.

Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что можно определить без чрезмерного экспериментирования, будет ли моноклональное антитело (например, мышиное моноклональное или гуманизированное антитело) иметь такую же специфичность, что и моноклональное антитело, используемое в способах, описанных в настоящем документе в качестве установочного, по тому, будет ли описанное выше антитело предотвращать связывание последнего с EGFR. Если моноклональное антитело, подвергаемое тестированию, конкурирует с моноклональным антителом по изобретению, что демонстрируется по уменьшению связывания моноклонального антитела по изобретению, то эти два моноклональных антитела связываются с тем же или родственным ему эпитопом. Альтернативный способ определения того, имеет ли моноклональное антитело специфичность моноклонального антитела по изобретению, заключается в предварительной инкубации моноклонального антитела по изобретению с EGFR и последующем добавлении моноклонального антитела, подвергаемого тестированию, для определения того, ингибируется ли способность моноклонального антитела, подвергаемого тестированию, связываться с EGFR. Если способность к связыванию у моноклонального антитела, подвергаемого тестированию, ингибируется, то, по всей вероятности, оно имеет ту же или функционально эквивалентную эпитопную специфичность, что и моноклональное антитело по изобретению.

Использование активируемых антител против EGFR

Следует иметь в виду, что при введении терапевтических агентов в соответствии с настоящим изобретением они могут быть введены с подходящими носителями, наполнителями и другими агентами, которые включают в композиции, чтобы обеспечить улучшенную передачу, доставку, толерантность и тому подобное. Множество подходящих составов может быть найдено в фармацевтическом справочнике, известном всем фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), в частности, в нем глава 87 Blaug, Seymour. Эти составы включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воск, масла, липиды, содержащие липиды (катионные или анионные) везикулы (такие как липофектин™), конъюгаты ДНК, безводные абсорбирующие пасты, эмульсии масла в воде и воды в масле, карбовакс (полиэтиленгликоли различной молекулярной массы), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Любая из вышеуказанных смесей может подходить для лечения и терапии в соответствии с настоящим изобретением, при том условии, что активный ингредиент в составе не инактивируется составом, и состав является физиологически совместимым и приемлемым для пути введения. Для получения дополнительной информации, связанной с составами, наполнителями и носителями, хорошо известными фармацевтам, смотри также Baldrick P. «Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.» Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. «Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.» Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN «Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.» J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. «Compendium of excipients for parenteral formulations» PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) и цитирование в них.

Терапевтические композиции по данному изобретению, которые включают активируемое антитело против EGFR, применяют для профилактики, лечения или облегчения иным образом заболевания или нарушения, связанного с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR. Например, терапевтические композиции по изобретению, включающие активируемое антитело против EGFR, применяют для лечения или облегчения иным образом рака или другого неопластического состояния.

Повышенный протеолиз, как известно, является отличительным признаком рака. (Смотри, например, Affara NI, et al. «Delineating protease functions during cancer development.» Methods Mol Biol. 539 (2009): 1-32). Прогрессия, инвазия и метастазирование опухолей происходит в результате нескольких взаимозависимых процессов, в которые вовлечены протеазы. Этот процесс показан в общем виде на фигурах 8A и 8В.

Эффективность профилактики, улучшения или лечения определяется с помощью любого известного способа диагностики или лечения заболевания или нарушения, связанного с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR. Продление выживаемости индивидуума или иным образом задержка прогрессии заболевания или нарушения, связанного с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR у индивидуума, указывает на то, что активируемое антитело дает положительный клинический эффект.

Активируемые антитела против EGFR могут быть введены в виде фармацевтических композиций. Принципы и соображения, используемые при получении таких композиций, а также руководство по выбору компонентов предлагаются, например, в Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York.

В случае использования активируемых фрагментов антител, предпочтителен самый маленький фрагмент, который специфически связывается со связывающим доменом белка-мишени. Например, пептидные молекулы, которые сохраняют способность связываться с последовательностью белка-мишени, могут быть разработаны на основе вариабельных областей последовательностей антитела. Такие пептиды могут быть синтезированы химически и/или получены методом рекомбинантной ДНК. (См, например, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)). Состав может также содержать более одного активного соединения, необходимого для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно содержать соединения с дополняющей активностью, которые не оказывают отрицательного влияния друг на друга. Альтернативно, или дополнительно, композиция может включать агент, который усиливает эту функцию, такой как, например, цитотоксический агент, цитокин, химиотерапевтический агент или ингибирующий рост агент. Такие молекулы могут присутствовать надлежащим образом в сочетании в количествах, которые эффективны для предназначенных целей.

Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, способами коацервации или путем межфазной полимеризации, например, в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилат)ные микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарств (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии.

Составы, которые предназначены для использования при введении in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществляется путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны.

Могут быть получены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, где матрицы находятся в виде формованных продуктов, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (поддающиеся введению микросферы, включающие сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетат лейпролида) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как этиленвинилацетат и сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, способны высвобождать молекулы в течение более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени.

В некоторых вариантах осуществления активируемое антитело содержит регистрируемую метку. Используется интактное антитело или его фрагмент (например, Fab, scFv или F(аb)₂). Термин «меченый» в отношении зонда или антитела предназначен для охвата прямого мечения зонда или антитела путем присоединения (то есть, физического связывания) регистрируемого вещества с зондом или антителом, а также непрямого мечения зонда или антитела путем взаимодействия с другим реагентом, который метится прямо. Примеры непрямого мечения включают определение первого антитела с помощью флуоресцентно меченного второго антитела и мечение конца ДНК-зонда биотином таким образом, что он может быть обнаружен с помощью флуоресцентно меченного стрептавидина. Термин «биологический образец» предназначен для включения тканей, клеток и биологических жидкостей, выделенных от индивидуума, а также тканей, клеток и жидкостей, присутствующих у индивидуума. Включенными в использование термина «биологический образец», таким образом, являются кровь и фракция или компонент крови, включая сыворотку крови, плазму крови или лимфу. Это означает, что метод детекции по данному изобретению может быть использован для обнаружения аналита мРНК, белка или геномной ДНК в биологическом образце in vitro, а также in vivo. Например, методы in vitro для обнаружения аналита мРНК включают методы нозерн-гибридизации и гибридизации in situ. Методы обнаружения анализируемого белка in vitro включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноблоттинг, иммунопреципитацию, иммунохимическое окрашивание и иммунофлуоресценцию. Методы in vitro для обнаружения аналита геномной ДНК включают саузерн-гибридизацию. Процедуры проведения иммуноанализов описаны, например, в «ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology», Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; «Immunoassay», E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; and «Practice and Theory of Enzyme Immunoassays», P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Кроме того, методы in vivo для обнаружения анализируемого белка включают введение индивидууму меченого антитела против анализируемого белка. Например, антитело может быть помечено радиоактивным маркером, присутствие и локализация которого у индивидуума может быть обнаружена с помощью стандартных методов визуализации.

Диагностические и профилактические составы

Антитела против EGFR и/или активируемые антитела против EGFR по изобретению используются в диагностических и профилактических составах. В одном варианте осуществления антитело против EGFR и/или активируемое антитело против EGFR вводят больным, которые подвержены риску развития одного или более вышеупомянутых типов рака или других нарушений. Предрасположенность больного или органа к одному или более из указанных выше нарушений может быть определена с использованием генотипирования, серологических или биохимических маркеров.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело против EGFR и/или активируемое антитело против EGFR вводят индивидуумам, являющимся человеком, имеющим диагностированные клинические показания, связанные с одним или более указанными выше нарушениями. После диагностики антитело против EGFR и/или активируемое антитело против EGFR вводят для смягчения или обратного развития клинических показаний.

Антитела и/или активируемые антитела по изобретению также пригодны для обнаружения EGFR в образцах больных и, соответственно, применимы как диагностические. Например, антитела против EGFR и/или активируемые антитела против EGFR по изобретению используются в анализах in vitro, например, в ELISA для определения уровня EGFR в образце больного.

В одном варианте осуществления антитело против EGFR и/или активируемое антитело против EGFR по изобретению иммобилизуют на твердой подложке (например, лунке(ах) планшета для микротитрования). Иммобилизованное антитело и/или активируемое антитело служит в качестве улавливающего антитела для любого EGFR, который может присутствовать в тестируемом образце. Перед контактом иммобилизованного антитела с образцом больного твердую подложку промывают и обрабатывают блокирующим агентом, таким как молочный белок или альбумин, для предотвращения неспецифической адсорбции анализируемого агента.

Затем лунки обрабатывают тестируемым образцом, предположительно содержащим антиген, или раствором, содержащим стандартное количество антигена. Такой образец представляет собой, например, образец сыворотки индивидуума, предположительно имеющий уровни циркулирующего антигена, рассматриваемые как являющиеся диагностическими для патологии. После отмывки от тестируемого образца или стандарта, твердую подложку обрабатывают вторым антителом, которое помечено детектируемой меткой. Меченое второе антитело служит в качестве детектирующего антитела. Измеряется уровень детектируемой метки, и концентрация антигена EGFR в тестируемом образце определяется путем сравнения со стандартной кривой, полученной с помощью стандартных образцов.

Следует иметь в виду, что на основе результатов, полученных с использованием антител против EGFR по изобретению в диагностическом анализе in vitro, возможно определить стадию заболевания у индивидуума на основе уровней экспрессии антигена EGFR. Для конкретного заболевания берут образцы крови от индивидуумов, диагностированных как находящиеся на разных стадиях прогрессии заболевания и/или на различных этапах терапевтического лечения заболевания. При использовании набора образцов, которые обеспечивают статистически значимые результаты для каждого этапа прогрессии или терапии, обозначается диапазон концентраций антигена, который может считаться характерным для каждого этапа.

Антитела против EGFR и/или активируемые антитела против EGFR могут также использоваться в диагностических методах и/или методах визуализации. В некоторых вариантах осуществления такие способы представляют собой способы in vitro. В некоторых вариантах осуществления такие способы представляют собой способы in vivo. В некоторых вариантах осуществления такие способы представляют собой способы in situ. В некоторых вариантах осуществления такие способы представляют собой способы ex vivo. Например, активируемые антитела против EGFR, имеющие ферментативно отщепляемый СМ, могут быть использованы для обнаружения присутствия или отсутствия фермента, который способен расщеплять CM. Такие активируемые антитела против EGFR могут быть использованы в диагностических целях, которые могут включать определение in vivo (например, качественное или количественное) активности фермента (или в некоторых вариантах осуществления условий повышенного восстанавливающего потенциала, такого как потенциал, который может обеспечить восстановление дисульфидной связи) путем измерения аккумуляции активированных антител против EGFR (т.е. антител, возникающих в результате расщепления активируемого антитела против EGFR) в данной клетке или ткани данного организма-хозяина. Такая аккумуляция активированных антител против EGFR указывает не только на то, что ткань характеризуется экспрессией ферментативной активности (или повышенным восстанавливающим потенциалом в зависимости от природы СМ), но и на то, что ткань экспрессирует мишень, с которой связывается активированное антитело.

Например, СМ может быть выбран как являющийся субстратом протеазы для протеазы, найденной в области опухоли, в участке вирусной или бактериальной инфекции, в биологически ограниченном месте (например, в таком как абсцесс, орган и тому подобное) и тому подобное. AB может представлять собой антитело, которое связывает антиген-мишень. При использовании методов, хорошо известных специалисту в данной области техники, детектируемую метку (например, флуоресцентную метку или радиоактивную метку или радиоактивный индикатор) можно конъюгировать с AB или другой областью антитела против EGFR и/или активируемого антитела против EGFR. Подходящие детектируемые метки обсуждаются в контексте вышеуказанных методов скрининга, и дополнительные конкретные примеры приведены ниже. При использовании AB, специфичных к белку или пептиду, характерных для патологического состояния, совместно с протеазой, активность которой повышается в интересующей патологической ткани, активируемые антитела против EGFR будут проявлять повышенную скорость связывания с патологической тканью относительно тканей, в которых специфический для СМ фермент не присутствует на определяемом уровне или присутствует на более низком уровне, чем в патологической ткани, или является неактивным (например, присутствует в форме зимогена или в комплексе с ингибитором). Так как небольшие белки и пептиды быстро выводятся из крови с помощью системы почечной фильтрации, и потому что фермент, специфический для СМ, не присутствует на определяемом уровне (или присутствует на более низких уровнях в непатологических тканях или присутствует в неактивной конформации), накопление активированных антител против EGFR в патологической ткани усиливается относительно непатологических тканей.

В другом примере активируемые антитела против EGFR могут быть использованы для обнаружения присутствия или отсутствия расщепляющего агента в образце. Например, если активируемые антитела против EGFR содержат CM, чувствительный к расщеплению ферментом, активируемые антитела против EGFR могут быть использованы для определения (качественного или количественного) присутствия фермента в образце. В другом примере, когда активируемые антитела против EGFR содержат СМ, чувствительный к расщеплению восстанавливающим агентом, активируемые антитела против EGFR могут быть использованы для определения (качественного или количественного) наличия восстанавливающих условий в образце. Для облегчения анализа в этих методах, активируемые антитела могут быть помечены для детекции и могут быть связаны с подложкой (например, с твердой подложкой, такой как предметное стекло или шарик). Детектируемая метка может быть расположена на участке активируемого антитела против EGFR, который не высвобождается после расщепления, например, детектируемая метка может представлять собой погашенную флуоресцентную метку или другую метку, которая не обнаруживается, пока не произошло расщепление. Анализ может быть проведен, например, путем приведения иммобилизованных помеченных детектируемой меткой активируемых антител против EGFR в контакт с образцом, предположительно содержащим фермент и/или восстанавливающий агент, в течение времени, достаточного для осуществления расщепления, с последующей промывкой для удаления избытка образца и загрязнений. Присутствие или отсутствие расщепляющего агента (например, фермента или восстанавливающего агента) в образце затем оценивают по изменению детектируемого сигнала активируемых антител против EGFR до контакта с образцом, например, по присутствию и/или увеличению детектируемого сигнала, обусловленному расщеплением активируемого антитела расщепляющим агентом в образце.

Такие методы детекции могут быть адаптированы так, чтобы также обеспечить детекцию присутствия или отсутствия мишени, которая способна связываться с AB активируемых антител против EGFR после расщепления. Таким образом, методы могут быть адаптированы так, чтобы оценивать присутствие или отсутствие расщепляющего агента и присутствие или отсутствие представляющей интерес мишени (EGFR). Присутствие или отсутствие расщепляющего агента может быть определено по присутствию и/или росту детектируемой метки активируемых антител против EGFR, как описано выше, и присутствие или отсутствие мишени может быть определено путем выявления комплекса мишень-АВ, например, путем использования антитела против мишени с детектируемой меткой.

Активируемые антитела против EGFR используются также в визуализации in situ для подтверждения активации активируемого антитела, например, путем расщепления протеазой и связывания с конкретной мишенью. Визуализация in situ представляет собой метод, который позволяет локализовать протеолитическую активность и мишень в биологических образцах, таких как клеточные культуры или тканевые срезы. Используя этот метод, можно подтвердить как связывание с данной мишенью, так и протеолитическую активность, основываясь на присутствии детектируемой метки (например, флуоресцентной метки).

Эти методы используются с любыми замороженными клетками или тканями, которые получены из области заболевания (например, опухолевой ткани) или из здоровых тканей. Эти методы используются также с образцами свежевыделенных клеток или тканей.

В этих методах активируемое антитело против EGFR метится детектируемой меткой. Детектируемая метка может представлять собой флуоресцентный краситель (например, флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ), родамина изотиоцианат (TRITC)), краситель ближней инфракрасной области (NIR) (например, нанокристаллы Qdot®), коллоидный металл, гаптен, радиоактивный маркер, биотин и реагент амплификации, такой как стрептавидин или фермент (например, пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза).

Определение метки в образце, который проинкубирован с меченым, активируемым антителом против EGFR, показывает, что образец содержит мишень, т.е. EGFR, и содержит протеазу, специфичную для СМ активируемого антитела против EGFR. В некоторых вариантах осуществления присутствие протеазы может быть подтверждено при использовании широкого спектра ингибиторов протеаз, таких как ингибиторы, описанные в данном документе, и/или при использовании агента, который специфичен для протеазы, например, антитела, такого как A11, которое является специфичным для протеазы матриптазы (MT-SP1) и ингибирует протеолитическую активность MT-SP1; смотри, например, международную публикацию WO 2010/129609, опубликованную 11 ноября 2010 г. Такой же подход с использованием широкого спектра ингибиторов протеаз, таких как ингибиторы, описанные в данном документе, и/или с использованием более селективного ингибирующего агента может быть использован для идентификации протеазы или класса протеаз, специфичных для CM активируемого антитела против EGFR. В некоторых вариантах осуществления присутствие мишени может быть подтверждено при использовании агента, специфичного для мишени, например, другого антитела против EGFR, или детектируемая метка может конкурировать с немеченым EGFR. В некоторых вариантах осуществления может быть использовано немеченое активируемое антитело против EGFR при определении с помощью меченого второго антитела или более сложной системы детекции.

Сходные методы используются также для визуализации in vivo, когда выявление флуоресцентного сигнала у индивидуума, например, у млекопитающего, включая человека, указывает на то, что область заболевания содержит мишень, т.е. EGFR, и содержит протеазу, которая специфична для СМ активируемого антитела против EGFR.

Эти методы используются также в наборах и/или в качестве реагентов для детекции, идентификации или характеристики протеазной активности в различных клетках, тканях и организмах на основе специфичного для протеазы CM в активируемом антителе против EGFR.

В некоторых вариантах осуществления визуализация in situ и/или визуализация in vivo используются в методах выбора больных для лечения. Например, при визуализации in situ активируемые антитела против EGFR используются для скрининга образцов больных для выявления тех больных, которые имеют подходящую(ие) протеазу(ы) и мишень(ни) в подходящей локализации, например, в области опухоли.

В некоторых вариантах осуществления визуализация in situ используется для идентификации или другого уточнения популяции больных, подходящих для лечения активируемым антителом против EGFR по данному раскрытию. Например, больные, тестирование которых дало положительный результат в отношении как мишени (например, EGFR), так и протеазы, которая расщепляет субстрат в расщепляемом фрагменте (CM) активируемого антитела против EGFR, подвергаемого тестированию (например, активированные антитела аккумулируются в области заболевания), идентифицируются как подходящие кандидаты для лечения таким активируемым антителом против EGFR, включающим такой CM. Таким же образом больные, тестирование которых дало отрицательный результат в отношении любой или обеих мишени (например, EGFR) и протеазы, которая расщепляет субстрат в СМ активируемого антитела, подвергаемого тестированию с использованием этих методов, идентифицируются как подходящие кандидаты для другого типа лечения (т.е. не подходят для лечения активируемым антителом против EGFR, подвергаемым тестированию). В некоторых вариантах осуществления такие больные, тестирование которых дало отрицательный результат в отношении первого активируемого антитела против EGFR, могут быть проверены в отношении других активируемых антител против EGFR, включающих различные CM, до тех пор, пока не идентифицируется подходящее для лечения активируемое антитело против EGFR (например, активируемое антитело против EGFR, включающее CM, который расщепляется у больного в области заболевания).

В некоторых вариантах осуществления визуализация in vivo используется для идентификации или иного уточнения популяции больных, подходящих для лечения активируемым антителом против EGFR по настоящему раскрытию. Например, больные, тестирование которых дало положительный результат в отношении как мишени (например, EGFR), так и протеазы, которая расщепляет субстрат в расщепляемом фрагменте (CM) активируемого антитела против EGFR, подвергаемого тестированию (например, активированные антитела аккумулируются в области заболевания), идентифицируются как подходящие кандидаты для лечения таким активируемым антителом против EGFR, включающим такой CM. Таким же образом больные, тестирование которых дало отрицательный результат, идентифицируются как подходящие кандидаты для другого типа лечения (т.е. не подходят для лечения активируемым антителом против EGFR, подвергаемым тестированию). В некоторых вариантах осуществления такие больные, тестирование которых дало отрицательный результат в отношении первого активируемого антитела против EGFR, могут быть проверены в отношении других активируемых антител против EGFR, включающих различные CM, до тех пор, пока не идентифицируется подходящее для лечения активируемое антитело против EGFR (например, активируемое антитело против EGFR, включающее CM, который расщепляется у больного в области заболевания).

Фармацевтические композиции

Активируемые антитела против EGFR по изобретению (также обозначаемые в данном документе как «активные соединения»), и их производные, фрагменты, аналоги и гомологи, могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения. Такие композиции обычно включают активируемое антитело и фармацевтически приемлемый носитель. При использовании в данном описании термин «фармацевтически приемлемый носитель» предназначен для включения любых и всех растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических и задерживающих всасывание агентов и тому подобного, совместимых с фармацевтическим введением. Подходящие носители описаны в самом последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences, эталонного руководства в этой области, которое включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительные примеры таких носителей или разбавителей включают, но не ограничиваются этим, воду, физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% сывороточный альбумин человека. Также можно использовать липосомы и неводные носители, такие как нелетучие масла. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. Рассматривается их применение в композициях за исключением тех случаев, когда любые обычные среды или агенты несовместимы с активным соединением. В композиции могут быть также введены дополнительные активные соединения.

Фармацевтическую композицию по изобретению составляют как совместимую с намеченным путем ее введения. Примеры путей введения включают парентеральное, например, внутривенное, внутрикожное, подкожное, пероральное (например, ингаляцию), трансдермальное (т.е. местное), через слизистые и ректальное введение. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для доведения тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН можно доводить с помощью кислот или оснований, таких как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. Препарат для парентерального введения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или сосуды, содержащие множество доз, изготовленные из стекла или пластика.

Фармацевтические композиции, подходящие для применения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы (в случае водорастворимых агентов) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного приема. Подходящие носители для внутривенного введения включают физиологический солевой раствор, бактериостатическую воду, кремофор EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы легко вводить шприцем. Она должна быть стабильной в условиях получения и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобного. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, хлорид натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может быть осуществлено путем включения в композицию агента, который задерживает всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем включения активного соединения в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним ингредиентом или с сочетанием ингредиентов, перечисленных выше, по потребности с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии получают включением активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из ингредиентов, перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов способы получения представляют собой сушку в вакууме и лиофильную сушку с получением порошка активного ингредиента с добавлением любого дополнительного желаемого ингредиента из его предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.

Пероральные композиции обычно включают инертный разбавитель или съедобный носитель. Они могут быть заключены в желатиновые капсулы или спрессованы в таблетки. Для целей перорального терапевтического введения активное соединение может быть включено с наполнителями и использовано в форме таблеток, пастилок или капсул. Пероральные композиции также могут быть получены с использованием жидкого носителя для применения в виде жидкости для полоскания рта, где соединение в жидком носителе применяют перорально и выплескивают и отплевывают или проглатывают. В качестве части композиции могут быть включены фармацевтически совместимые связующие агенты и/или адъюванты. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и тому подобное могут содержать любые из следующих ингредиентов или соединений подобной природы: связующий агент, такой как микрокристаллическая целлюлоза, смола трагаканта или желатин; наполнитель, такой как крахмал или лактоза, дезинтегрирующий агент, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающий агент, такой как стеарат магния или стеротес; агент, способствующий скольжению, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как мята перечная, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор.

Для введения путем ингаляции соединения доставляются в форме аэрозольного спрея из находящегося под давлением контейнера или диспенсера, который содержит подходящий пропеллент, например, газ, такой как диоксид углерода, или из небулайзера.

Системное введение может также осуществляться через слизистую оболочку или через кожу. Для введения через слизистую оболочку или для трансдермального введения в композиции используются агенты, подходящие для проникновения через соответствующий барьер, который надо пересечь. Такие пенетранты обычно известны в данной области техники и включают, например, агенты для введения через слизистую оболочку, детергенты, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты. Введение через слизистую оболочку может быть достигнуто за счет использования назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения активные соединения составляют в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, обычно известных в данной области техники.

Соединения также могут быть получены в форме суппозиториев (например, с обычными основами суппозиториев, такими как масло какао и другие глицериды) или в форме удерживающих клизм для ректальной доставки.

В одном варианте осуществления активные соединения получают с носителями, которые должны защищать соединение против быстрого удаления из организма, такими как составы для контролируемого высвобождения, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких составов должны быть очевидны специалистам в данной области техники. Материалы также могут быть получены коммерческим путем от Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. Суспензии липосом (включая липосомы с моноклональными антителами против вирусных антигенов для направленной доставки к инфицированным клеткам) также могут быть использованы в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, например, как описано в патенте США No. 4522811.

Особенно выгодно составлять пероральные или парентеральные композиции в виде единиц дозированной лекарственной формы для простоты введения и однородности дозировки. Единица дозированной лекарственной формы при использовании в настоящем описании относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для индивидуума, подлежащего лечению; причем каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных единиц дозированных лекарственных форм по изобретению продиктована и непосредственно зависит от уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, и от ограничений, присущих в данной области составления композиций такого активного соединения для лечения индивидуумов.

Фармацевтические композиции могут быть заключены в контейнер, пакет или диспенсер вместе с инструкциями по введению.

Изобретение будет далее описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанный в формуле изобретения.

Примеры

Пример 1. Материалы и методы

Экспрессия и очистка активируемого антитела против EGFR. кДНК, кодирующую тяжелую цепь и легкую цепь каждого из активируемых антител против EGFR, отдельно клонировали в модифицированный экспрессионный вектор млекопитающих pcDNA3.1 (Life Technologies). Клетки СНО-S (Life Technologies) временно трансфицировали плазмидами для каждого активируемого антитела против EGFR на 5-7 дней, используя реагент для трансфекции FreeStyle MAX (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Активируемые антитела против EGFR очищали с использованием колонки протеина А HiTrap Mab Select Sure (GE Healthcare), соединенной с очистителем АКТА (GE Healthcare). Чистоту и гомогенность очищенных активируемых антител против EGFR анализировали с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и исключающей по размеру гель-хроматографии с использованием колонки 10/300 GL Superdex 200 (GE Healthcare), соответственно.

Скорость расщепления активируемого антитела против EGFR и определение Kcat/Кm. Рекомбинантные человеческие uPA и MT-SP1 (R & D Systems, конечные концентрации 1,6-100 нМ) инкубировали с 500 нМ (uPA) и 2 мкМ (MT-SP1) в 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,05% Tween-20, 5 мМ хлориде кальция (TBST) в течение 24 час при 37°С. Реакцию останавливали путем добавления 5 мкл образца к 7 мкл буфера НТ для экспрессии белков образца (Caliper LifeSciences) и инкубации в течение 10 мин при 95°C. Образцы анализировали с помощью капиллярного электрофореза (GXII; Caliper LifeSciences), и концентрации расщепленной и нерасщепленной легкой цепи определяли с использованием программного обеспечения LabChip GX (Caliper LifeSciences). Kcat/Кm определяли с помощью следующего уравнения:

$\frac{k c a t}{K_{m}} = - \ln (1 - C) / (t * p)$

С=относительная часть превращенного продукта (расщепленной легкой цепи/расщепленной+нерасщепленной легкой цепи), t=время (сек) и р=концентрация протеазы (M). Концентрацию субстрата поддерживали ниже Km и при избытке протеазы.

Гидролиз/активация протеазой активируемого антитела против EGFR. Активируемое антитело 3954-1204-C225v4, также обозначаемое в данном документе как Pb-1204, (100 мкг) инкубировали с различными протеазами: uPA (50 нМ в PBS, рН 7,2), МТ-SP1 (10 нМ в PBS, рН 7,2) или легумаином (30 мкг/мл в 50 мМ MES, 250 мМ NaCl, рН 6,0) при комнатной температуре в течение 4 дней. Для анализа клеточной пролиферации и связывания с EGFR, uPA-расщепленное Pb-1204 очищали с помощью аффинной хроматографии на протеин А-агарозе. Расщепление Pb-1204 анализировали с помощью SDS-PAGE и капиллярного электрофореза (LabChip GXII; Caliper LifeSciences).

Клеточная культура и анализ пролиферации. Клетки рака легких человека H292 (американская коллекция типов культур) поддерживали при 37°С (5% СО₂) в среде RPMI, дополненной 10% сывороткой плодов телят (FBS). Для анализа пролиферации клетки высевали в количестве 3000 клеток/лунка в 96-луночный планшет в условиях низкой концентрации сыворотки (RPMI+1% FBS). На следующий день добавляли антитела или активируемые антитела против EGFR в указанных концентрациях, и клетки инкубировали в течение дополнительных 4 дней при 37°C. Жизнеспособность клеток измеряли с помощью Cell-Titer Glo (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ связывания с EGFR. 96-луночные планшеты (Nunc) покрывали EGFR-Fc (50 нг/лунка, R&D Systems) в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS, рН 7,4, 10 мМ Hepes) и блокировали HBSS, содержащим 1% BSA. Планшеты инкубировали с указанными концентрациями антитела или активируемого антитела против EGFR в HBSS/1% BSA в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты затем инкубировали с антителом против человеческого F(аb')₂, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) в HBSS в течение 30 мин, и определение осуществляли путем добавления субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (1-Step Ultra-TMB, Pierce) и затем равного объема 1М хлористоводородной кислоты. Затем измеряли поглощение при 450 нм и представляли в виде оптической плотности (ОП 450 нм).

В некоторых случаях относительное связывание EGFR преобразовывали в концентрацию IgG с помощью стандартной кривой цетуксимаба (исходная концентрация 1 нМ, 10-кратные серийные разведения). Стандартная кривая укладывалась в 4-параметрическую кривую, и результаты интерполировались с помощью программного обеспечения Elx 800.

Оценка распределения активируемого антитела против EGFR in vivo с помощью оптической визуализации. Мышам, несущим ксенотрансплантат опухоли НТ29, внутрибрюшинно вводили 12,5 мг/кг активируемых антител против EGFR, конъюгированных с Alexa Fluor 750. За один час до визуализации мышам вводили внутривенно пегилированные зонды Cy5.5, несущие последовательность субстрата, с гасящейся флуоресценцией (2 нмоль). Мышей визуализировали через 24 часа после введения активируемого антитела против EGFR с использованием системы визуализации IVIS Spectrum/CT (Caliper LifeSciences). Во время процедуры мыши находились под газовой анестезией (5% изофлуран) при 37°C. Для оценки уровней аккумуляции активируемых антител против EGFR (например, 3954-1204-C225v4 или 3954-1204-C225v5, а также конструкта Pb-NSUB, в котором последовательность субстрата протеазы из 3954-1204-C225v4 или 3954-1204-C225v5, соответственно, была заменена последовательностью, которая не чувствительна к расщеплению протеазой) используется визуализация при 750 нм, тогда распределение меченых конструктов активируемых антител против EGFR на этой длине волны является показателем активации антител и связывания с рецептором EGFR. Визуализация при 680 нм используется для оценки уровня расщепления субстрата путем мониторинга кинетики активации зонда в опухолевой ткани. Наконец, вскрытие используется для оценки биораспределения ex vivo.

Иммунофлуоресценция. Через семь дней после инъекции активируемого антитела против EGFR мышей забивали, и образцы ткани извлекали и сохраняли при замораживании. Делали срезы (5 мкм) образцов ксенотрансплантатов опухолей НТ29 и печени при -20°C. Срезы окрашивали IgG осла против иммуноглобулинов человека, конъюгированными с AlexaFluor488, и подвергали контрастирующему окрашиванию препятствующей выгоранию средой DAPI для заключения. Окрашенные срезы визуализировали с использованием флуоресцентного микроскопа (Olympus IX 81) и программного обеспечения для визуализации Life Science Microscopy Cell.

ELISA IgG человека. 96-луночные планшеты MaxiSorp (Nunc) покрывали антителом мыши против Fc антитела IgG человека (50 нг/лунка; Jackson ImmunoResearch) в HBSS (Invitrogen) и блокировали HBSS, содержащим 1% BSA. Образцы добавляли к лункам и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты инкубировали с антителом против F(аb')₂ человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories), в HBSS в течение 30 мин, и определение проводили путем добавления субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (1-Step Ultra-TMB, Pierce) и затем равного объема 1М хлористоводородной кислоты. Затем измеряли поглощение при 450 нм и представляли в виде оптической плотности (ОП 450 нм). Получали стандартную кривую для каждого планшета с использованием цетуксимаба (исходная концентрация 1 нМ, 10-кратные серийные разведения). Стандартная кривая укладывалась в 4-параметрическую кривую, и результаты интерполировались с помощью программного обеспечения Elx 800.

Иммунопреципитация и иммуноблоттинг. Образцы тканей гомогенизировали в лизирующем буфере (HBSS/2% тритон X-100, коктейль ингибиторов протеаз Холта; Thermo Fisher Scientific) с использованием шариков из нержавеющей стали, содержащих трубки для гомогенизации Bullet Blender (Next Advance) в соотношении 1 г опухоли/ткани на 2 мл лизирующего буфера. Полученный гомогенат ткани центрифугировали при 3000×g, и супернатант дополнительно центрифугировали при 20800×g при 4°С в течение 45 минут. Лизаты тканей сразу инкубировали с 10 мкл специфичных магнитных шариков с IgG козы против Fc антител человека (Bangs Laboratories, Inc) в течение ночи при 4°С. Шарики промывали и затем элюировали с помощью денатурации (5 минут, 95°С) в буфере для образцов LDS (Invitrogen), содержащем бета-меркаптоэтанол (Sigma, St. Louis, MO). Пробы подвергали электрофорезу, переносили на нитроцеллюлозу, подвергали блоттингу с использованием антитела мыши против Fc IgG человека, конъюгированного с HRP (Jackson ImmunoResearch). Полосы визуализировали с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal Pico (Thermo Fisher Scientific) и ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).

Исследование эффективности in vivo. Исследования in vivo, проведенные в лаборатории Jackson, были рассмотрены и одобрены комитетом по уходу и использованию животных института (IACUC). Исследования in vivo, проведенные в Oncotest GmbH, были рассмотрены и одобрены Regierungs-prasidium Freiburg, Germany и проведены в соответствии с руководящими принципами немецкого закона об охране животных.

Исследование ксенотрансплантатов in vivo. В одной серии исследований ксенотрансплантатов в лаборатории Jackson 6-8-недельным самкам NU/J (JAX #2019) мышей инокулировали подкожно в правый задний пах 5×10⁶ клеток NCI-H292 (АТСС), суспендированных 1:1 с матригелем™ в бессывороточной среде. Клинические наблюдения, определение массы тела и измерение объема опухоли цифровым штангенциркулем осуществляли 3 раза в неделю, как только опухоль становилась измеримой. Животных ранжировали по размеру опухоли в подобранные когорты (12 мышей/группа) со средними объемами опухоли ~150 мм³-200 мм³, и начинали лечение. Животных лечили внутривенным введением еженедельно в течение 4 недель. Опухоли измеряли штангенциркулем два раза в неделю в продолжение всего исследования. Плазму собирали в K₂ЭДТА от 3 мышей на группу через 1 час, 8 час, 24 час, 72 час, сбор крови у мышей в когорте осуществляли поочередно. Четырех мышей на группу забивали на 3-й день, и опухоли собирали и мгновенно замораживали для анализа.

Другая серия исследований ксенотрансплантатов, использующая модель ксенотрансплантата LXFA677, была проведена в Oncotest GmbH из первичного материала больных после их информированного согласия. Ксенотрансплантаты росли подкожно у бестимусных мышей NMRI nu/nu, и их рандомизировали после достижения объемов опухоли 100-300 мм³. Мышей (12/группа) лечили антителами один раз в неделю внутрибрюшинно, и опухоли измеряли штангенциркулем два раза в неделю. Кровь собирали у 3 мышей на группу один раз в неделю, и сбор крови у мышей в когорте чередовали. Четырех мышей на группу забивали на 3-й день, и опухоли собирали и мгновенно замораживали для анализа.

Иммуногистохимия: Делали срезы (5 мкм) образцов ксенотрансплантатов опухолей и печени. Срезы депарафинизировали и регидратировали в дистиллированной воде с последующим восстановлением цитратным буфером с рН 6,0 (Thermo Scientific). Эндогенную пероксидазу блокировали 0,3% перекисью водорода. Срезы блокировали блокирующим набором авидин/биотин (Vector Laboratories) и затем 3% BSA. Срезы окрашивали антителами осла против IgG человека, конъюгированными с биотином (Jackson), с использованием набора для определения ABC Elite (Vector Laboratories) и визуализировали с помощью DAB (Pierce Scientific). Срезы контрастировали гематоксилином, обезвоживали, просветляли и покрывали покровным стеклом. Окрашенные срезы визуализировали с использованием светлопольного микроскопа (Leica DM750) и программного обеспечения LAS EZ (Leica Application Suite).

Фармакокинетика: Фармакокинетические параметры в плазме получали исходя из концентраций цетуксимаба или активируемых антител против EGFR с использованием бескомпартментного анализа с редким взятием проб (Phoenix WinNonlin, v 5.2; Pharsight; Mountain View, CA) с объединением концентраций индивидуальных животных для каждой группы в каждый момент времени. Величины представлены как величина в популяции со стандартной ошибкой определения.

Пример 2. Получение активируемых антител против EGFR

Активируемые антитела против EGFR, описанные в настоящем документе, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который происходит от антитела против EGFR цетуксимаба. Цетуксимаб представляет собой хорошо охарактеризованное терапевтическое антитело, одобренное для лечения колоректального рака и рака головы и шеи. Одно активируемое антитело против EGFR на основе цетуксимаба, обозначаемое в настоящем описании как Pb-1204, было сконструировано путем добавления связывающего пептида из 21 аминокислоты в длину, т.е. маскирующего фрагмента, к N-концу легкой цепи (фигура 2А). Маскирующий фрагмент был присоединен к антителу через линкер длиной в 26 аминокислот, несущий последовательность из 8 остатков в длину, которая представляет собой последовательность специфического субстрата для uPA, МТ-SP1 или легумаина. Эффективность, скорость расщепления и селективность различных протеаз (uPA, МТ-SP1, тканевого активатора плазминогена (tPA) и/или тромбина) по отношению к субстрату (обозначаемому в данном документе как субстрат 1204 или просто 1204) активируемого антитела Pb-1204 показаны на фигурах 9А-9D.

Оценивали эффективность и специфичность расщепления Pb-1204 различными протеазами. Pb-1204 эффективно расщеплялся МТ-SP1 человека (2200 M^-1сек^-1 ± 470 М^-1сек^-1) uPA человека (530 M^-1сек^-1 ± 40 M^-1сек^-1) и легумаином. Однако Pb-1204 не расщеплялся tPA или плазмином, ADAM 9, 10 и 17, калликреином 5 и 7. Pb-1204 было гидролизовано почти полностью и проанализировано путем SDS-PAGE, капиллярного электрофореза и N-концевого секвенирования (фигуры 2С и 5B). В N-концевой последовательности расщепленных продуктов продемонстрированы предсказанные сайты расщепления для трех протеаз. MT-SP1 и uPA расщепляли последовательность субстрата Pb-1204 в одном и том же сайте P1 с получением продуктов легкой цепи одной и той же молекулярной массы. Расщепление легумаином привело к получению более медленно движущейся легкой цепи, которая была короче на 3 аминокислоты.

Пример 3. Активность in vitro активируемых антител против EGFR

Относительную активность in vitro цетуксимаба, Pb-1204 и Pb-1204, полностью гидролизованного с помощью uPA, оценивали следующим образом. Связывание Pb-1204 с EGFR было снижено в 23 раза относительно цетуксимаба, демонстрируя кажущуюся K_d 0,36 нМ по сравнению с 0,02 нМ, соответственно (фигура 5C). Кажущиеся K_d полностью активированного Pb-1204 и цетуксимаба были идентичными (0,02 нМ). Ингибиторная активность Pb-1204 в отношении пролиферации клеток H292 был снижена в 990 раз по отношению к цетуксимабу (IC₅₀ 46,6 нМ и 0,05 нМ, соответственно; фигура 2D). После активации Pb-1204 продемонстрировало ингибиторную активность, сравнимую с цетуксимабом (IC₅₀ 0,07 нМ).

Пример 4. Распределение in vivo активируемых антител против EGFR

Для оценки распределения in vivo протеолитической активности, способной к расщеплению Pb-1204, для визуализации использовали зонды с самостоятельно гасящейся флуоресценцией в ближней инфракрасной области спектра (IQ). Зонд IQ, несущий последовательность субстрата Pb-1204 (IQ-1204; фигура 3А), и зонд IQ отрицательного контроля, несущий пептидный линкер без последовательности субстрата (IQ-NSUB), вводили мышам, несущим опухоль HT29. Термин «NSUB», используемый в настоящем описании, относится к аминокислотной последовательности субстрата, которая включает остатки глицина и серина, но не чувствительна к расщеплению протеазой. Через один час после введения IQ-1204 визуализация показала, что флуоресценция ограничена областью опухоли (фигура 3В). Одновременная визуализация этих мышей через 48 часов после введения флуоресцентно меченного Pb-1204 показала, что распределение флуоресценции идентично IQ-1204 и ограничивается опухолью. Никакой флуоресценции не было обнаружено у животных, которым вводили отрицательные контроли - IQ-NSUB и флуоресцентно меченное Pb-NSUB. Через семь дней после инъекции оценивали локализацию активируемого антитела против EGFR в образцах опухоли и печени обработанных мышей с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания. В опухолях животных, которым вводили Pb-1204, продемонстрировано флуоресцентное окрашивание мембран эпителиальных клеток, в то время как никакого окрашивания не было обнаружено в опухолях от мышей, которым вводили Pb-NSUB (фигуры 3С и 3D). Никакого окрашивания не было обнаружено в образцах печени животных, получавших Pb-1204 или Pb-NSUB (фигуры 6А и 6В). Эти результаты показывают, что протеолитическая активность, связанная с областью опухоли, специфически расщепляет последовательность субстрата 1204. Расщепление последовательности субстрата позволяет антителу связываться с его мишенью и аккумулироваться в области опухоли.

Пример 5. Анализ активируемых антител против EGFR в моделях ксенотрансплантатов

Эффект Pb-1204 на зависимый от EGFR рост опухоли исследовали с использованием модели H292 ксенотрансплантата NSCLC. Регрессия опухоли была обнаружена в группе с лечением Pb-1204 и в контрольной группе с лечением цетуксимабом (фигура 4а). Средний объем опухоли между этими группами с лечением статистически не различался по окончании исследования (20 день), предполагая, что Pb-1204 был так же эффективен, как цетуксимаб. Статистически значимого снижения объема опухоли не наблюдалось у мышей, получавших контрольное Pb-NSUB. В подгруппе мышей (n=4) образцы плазмы собирали в различные моменты времени до 72 часов, в этот момент времени мышей забивали, и опухоли извлекали. Несмотря на то, что концентрация циркулирующего Pb-1204 была выше, чем концентрации цетуксимаба и Pb-NSUB, результирующая связывающая EGFR активность Pb-1204 (2,2%±0,2) и Pb-NSUB (3,9%±0,3) была пограничной по сравнению с цетуксимабом (95,6%±3,5; фигура 4В). Концентрации Pb-1204, Pb-NSUB и цетуксимаба, найденные в опухоли, были эквивалентны. Анализ лизатов этих опухолей путем иммуноблоттинга показал, что значительная фракция Pb-1204 была активирована, в то время как Pb-NSUB осталось интактным и неактивированным. Как и ожидалось, связывающая EGFR активность Pb-1204 (51,6%±0,8), обнаруженная в опухолях, была выше, чем его активность в плазме или связывающая активность Pb-NSUB (18,2%±0,3; фигура 4C).

Затем определяли активность одной дозы Pb-1204 относительно цетуксимаба в модели ксенотрансплантата опухоли немелкоклеточного рака легких (LXFA677), полученной от больного. Активируемое антитело против EGFR и это антитело были одинаково эффективны в отношении ингибирования роста опухоли. На 21-ый день цетуксимаб ингибировал рост опухоли на 96% и Pb-1204 на 100% (фигура 4D). Концентрации цетуксимаба и Pb-1204 в плазме были эквивалентны на протяжении всего исследования (фигура 7B) при идентичных экспозициях (3331 мкг/мл × день). Концентрация связывающей EGFR активности в плазме была эквивалентна концентрации антитела для цетуксимаба. Тем не менее, для Pb-1204 концентрация связывающей EGFR активности была существенно снижена по сравнению с суммарной концентрацией циркулирующего активируемого антитела против EGFR. Воздействие (на 1-28 день) Pb-1204 (1214 мкг/мл × день) в отношении связывающей EGFR активности составляло 36% от воздействия в отношении суммарной концентрации в циркуляторном русле активируемого антитела против EGFR. Через семьдесят два часа после лечения у подгруппы мышей (n=4) опухоли извлекали, и оценивали концентрацию и активность активируемого антитела против EGFR и антитела. Средняя концентрация Pb-1204 в опухоли была эквивалентна концентрации цетуксимаба. Значительная часть (35±4%) активируемого антитела против EGFR, обнаруживаемого в опухолях, демонстрировала связывающую EGFR активность.

Таким образом, за счет разработки двух платформ скрининга бактериального дисплея идентифицированы ингибирующий связывающий пептид для цетуксимаба, т.е. маскирующий фрагмент, и новый пептидный субстрат для протеаз MT-SP1, uPA и легумаина. Родительское антитело модифицировано для присоединения ингибирующего пептида к N-концу легкой цепи через гибкий пептидный линкер, несущий новый пептидный субстрат. Это активируемое антитело против EGFR названо Pb-1204. Характеристика Pb-1204 in vitro показала, что маскирующий пептид существенно ингибировал активность активируемого антитела против EGFR по сравнению с цетуксимабом. Линкер, содержащий субстрат, позволяет осуществлять специфическую активацию активируемого антитела против EGFR с помощью MT-SP1, uPA и легумаина, и после активации активируемое антитело против EGFR демонстрирует активность, равную цетуксимабу. In vivo Pb-1204 оставалось стабильным в циркуляторном русле и в нормальных тканях, но эффективно активировалось в ксенотрансплантатах опухолей. Специфическая для опухоли активация Pb-1204 приводила к эффективности противоопухолевого действия, которая эквивалентна цетуксимабу.

Таким образом, активируемые антитела против EGFR, описанные в настоящем документе, пригодны для улучшения терапевтического окна действия большинства терапевтических антител, демонстрируя опосредованную мишенью токсичность. Кроме того, использование активируемого антитела против EGFR расширяет область направленного лечения рака, давая возможность развитию противораковой терапии, направленной на мишени, что не может рассматриваться в отношении традиционных антител за счет связанной с ними токсичности.

Пример 6. Анализ активируемых антител против EGFR в моделях нечеловекообразных приматов

Среди типов токсичности, наблюдаемых у человека и нечеловекообразных приматов, которым вводили цетуксимаб, выявляется кожная сыпь, в том числе папулезно-пустулезная сыпь лица и верхней части туловища, и сухая и зудящая кожа. В исследованиях, описанных в данном документе, активируемое антитело 3954-1204-C225v5 против EGFR оценивали с использованием животной модели нечеловекообразных приматов. Кратко, трем группам из 3 самок макак вводили внутривенно (в/в) цетуксимаб (т.е. немодифицированный цетуксимаб), 3954-1204-C225v5 или Pb-NSUB (т.е. 3954-NSUB-C225v5, активируемое антитело против EGFR, которое включает последовательность NSUB, не чувствительную к расщеплению протеазой), соответственно. Вводили нагрузочную дозу 40 мг/кг (три 2-часовых инфузии на протяжении 5 дней) с последующей дозой 25 мг/кг, которую вводили еженедельно (две 2-часовых инфузии в неделю). Животные получали дозы в течение 5-недельного периода (последнюю дозу вводили на 32 день) с последующим 4-недельным этапом восстановления без лечения. Всех животных ежедневно осматривали в отношении кожной сыпи. У всех животных были также проведены анализы клинической химии и гематологии, а также TK и иммуногенности. Как показано на фигуре 12 и в таблице 4, животные, которым вводили активируемое антитело 3954-1204-C225v5 против EGFR, не демонстрировали выявляемой сыпи по сравнению с животными, которым вводили цетуксимаб. Кроме того, у животных, которым вводили активируемое антитело 3954-1204-C225v5 против EGFR, отмечалось уменьшение дерматологической токсичности по сравнению с животными, которым вводили цетуксимаб.

Таблица 4 Сводка результатов по дерматологической токсичности, наблюдаемой у нечеловекообразных приматов
Группы 25 мг/кг	№ животного	День исследования
22	25	27	29	32	35	40
Цетуксимаб	WT0101	1	1	1	2	2	2	2
Цетуксимаб	WT0102(a)	0	0-1	0	0-1	0-1	0-1	0
WT0103	1	1	1	2	2	2	1
Pb-NSUB	WT1101	0	0	0	0	0	0	0
Pb-NSUB	WT1102	0	0	0	0	0	0	0
WT1103	0	0	0	0	0	0	0
3954-1204-C225v4	WT2101	0	0	0	0	0	0	0
3954-1204-C225v4	WT2102	0	0	0	0	0	0	0
WT2103	0	0	0	0	0	0	0
0 = нет эритемы 1 = слабая эритема 2 = хорошо выраженная эритема 3 = умеренная или тяжелая эритема 4 = тяжелая эритема с образованием слабых струпьев (a) = покраснение, наблюдаемое у этого животного, было нетипичным для «сыпи», наблюдаемой у двух других животных

Сравнение уровней цетуксимаба и 3954-1204-C225v5, выявляемых в крови макак, получавших дозу 25 мг/кг еженедельно после первоначальной нагрузочной дозы 40 мг/кг, показано на фигурах 13А-13D.

ИГХ анализ IgG человека в коже макак показал существенное связывание цетуксимаба в коже, но не выявил определяемого связывания активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR в коже.

Фармакокинетическое исследование по сравнению концентраций в сыворотке в зависимости от времени показало, что период полужизни активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR составлял 6,6±0,5 дней, тогда как период полужизни цетуксимаба составлял 3,2±0,4 дня. Иллюстративное исследование, демонстрирующее период полужизни активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR по сравнению с периодом полужизни цетуксимаба, представлено на фигуре 19. Период полужизни цетуксимаба был сходен с описанными ранее значениями. Фармакокинетика активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR согласуется с отсутствием системного опосредованного антигеном клиренса (EGFR в нормальных тканях).

Пример 7. Визуалиазация и иммуногистохимическое окрашивание опухолевых тканей антителами A11, узнающими активный сайт

Исследования, описанные в настоящем документе, разработаны для демонстрации того, что целевая протеаза для активируемых антител против EGFR, описанных в данном документе, в частности протеаза МТ-SP1, активна в опухолевой ткани.

Как показано на фигурах 14А-14С, визуализация in vivo и иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание опухолевых тканей антителами A11, узнающими активный сайт (Darragh et al., «Tumor detection by imaging proteolytic activity.» Cancer Res. 70 (2010): 1505-1512), подтвердило присутствие активной MT-SP1 в модели ксенотрансплантата H292. A11 представляет собой антитело, которое специфически связывается с активным сайтом протеазы МТ-SP1, также известной как матриптаза.

Пример 8. Визуализация in situ активируемых антител против EGFR

Настоящий пример описывает применение визуализации in situ активации и связывания активируемого антитела против EGFR по настоящему раскрытию. Результаты показывают, что активируемые антитела против EGFR по изобретению могут активироваться протеазами, экспрессирующимися в ткани, и связывают мишень EGFR в этой ткани.

Визуализация in situ активируемых антител представляет собой уникальный подход для характеристики активности протеаз в клетках и тканях. Этот метод позволяет подтвердить активацию активируемых антител и связывание с мишенью на гистологических срезах клеток и тканей, экспрессирующих протеазы, способные к расщеплению активируемого антитела. Схема такого подхода in situ представлена на фигуре 15.

Визуализацию in situ (также обозначаемую в данном документе как in situ визуализация) активации и связывания активируемого антитела против EGFR клеткой или тканью, способной расщеплять активируемое антитело в области, локализованной совместно с мишенью, узнаваемой активированным антителом, проводили следующим образом: Срезы замороженной ткани помещали на предметные стекла. На ткани наносили раствор, содержащий меченые активируемые антитела против EGFR (меченные, например, флуоресцентной меткой), и инкубировали, например, в течение 1 часа при комнатной температуре (приблизительно 22-24°С) в инкубационном буфере - 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7,4, содержащем 150 мМ NaCl, 100 мкМ ZnCl₂, 5 мМ CaCl₂ и 0,05% твин 20; активируемое антитело в концентрации приблизительно 1 мкг/мл. Условия такой инкубации могут быть подобраны так, чтобы они способствовали прохождению расщепляющего агента в срез ткани, например, с помощью варьирования рН раствора (например, в диапазоне от приблизительно рН 7 до приблизительно рН 8,5), температуры инкубации (например, в диапазоне от приблизительно 20°С до приблизительно 40°C, например, при комнатной температуре или 37°C), времени инкубации (например, в диапазоне от приблизительно 15 минут до приблизительно 150 минут) и/или концентраций активируемого антитела (например, в диапазоне от приблизительно 0,05 мкг/мл до 10 мкг/мл). Затем ткань тщательно промывали для удаления несвязанного материала и измеряли детектируемую метку. Например, при использовании флуоресцентной метки ткань анализировали на флуоресцентном микроскопе. Выявление активированного антитела на срезе ткани указывало на то, что ткань экспрессирует протеазы, которые расщепляют активируемое антитело, а также экспрессирует мишень EGFR, с которой связывается активированное антитело.

Способность активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR активироваться и связываться с замороженной тканью рака легкого человека оценивали с помощью визуализации in situ. Активируемое антитело метили Alexa Fluor® 680 (Invitrogen) для получения меченого активируемого антитела 3954-1204-C225v5-AF680. Меченое активируемое антитело инкубировали с образцом замороженной ткани рака легкого человека, как описано выше. Результаты показаны на фигуре 16, панель A. Красная флуоресцентная визуализация ткани демонстрирует связывание антитела C225v5, активированного в результате происходящего в ткани протеолитического расщепления активируемого антитела против EGFR. Идентичный тип окрашивания ткани был обнаружен при экспозиции ткани с антителом против EGFR (кроличьим моноклональным антителом против EGFR, Cell Signaling), как показано на фигуре 16, панель B. Флуоресцентный сигнал, показанный на панели А, ингибировался в результате предварительной обработки ткани в разведении 1:100 набором III коктейля широкого спектра ингибиторов (539134, EMD Millipore, Billerica, MA) и 50 мМ ЭДТА, как показано на фигуре 16, панель C. Голубое окрашивание представляет собой ядерное окрашивание DAPI.

На фигуре 17 демонстрируется, что 3954-1204-C225v5 является активируемым в широком диапазоне образцов опухолей человека. Столбец 2 показывает уровень экспрессии рецептора EGFR при определении с помощью антитела против EGFR (кроличьего моноклонального антитела против EGFR, Cell Signaling) в различных образцах ткани рака человека. Столбец 3 показывает количество активной матриптазы (МТ-SP1) при определении антителом A11 в различных образцах ткани рака человека. Столбцы 4 и 5 представляют собой оценку активации in situ и связывания активируемого антитела против EGFR (столбец 5) по сравнению с окрашиванием ткани цетуксимабом (Cetux) (столбец 4). Окрашивание, которое является мерой количества EGFR и связывания антител A11 и цетуксимаба с образцом ткани, оценивали по очкам от 0 до 3+: 0, нет окрашивания; 1+ (т.е. «+»), слабое окрашивание; 2+ (т.е. «++»), умеренное окрашивание; и 3+ (т.е. «+++»), сильное окрашивание. Подсчет очков при визуализации окрашивания in situ основан на сравнении с окрашиванием антителом цетуксимабом и определяется следующим образом: 0, отсутствие окрашивания; 1+ (т.е. «+»), слабое окрашивание по сравнению с родительским антителом; 2+ (т.е. «++»), умеренное окрашивание по сравнению с родительским антителом; и 3+ (т.е. «+++»), окрашивание, аналогичное родительскому антителу. Как показано на фигуре 17, высокие уровни активности матриптазы наблюдают в 8 из 9 образцов рака ободочной кишки (CRC), и высокие уровни активности матриптазы наблюдают в 5 из 10 образцов рака легкого (NSCLC). Активность матриптазы не наблюдают в образцах из соседних тканей легкого.

Эти данные предполагают пригодность методов визуализации in situ для способов эффективной идентификации или другого уточнения популяции больных, подходящих для лечения активируемым антителом против EGFR по данному раскрытию, таким как активируемое антитело 3954-1204-C225v5. Например, больные, тестирование которых дало положительный результат в отношении как мишени (например, EGFR), так и протеазы, которая расщепляет субстрат в расщепляемом фрагменте (CM) активируемого антитела против EGFR, (например, MT-SP1), при использовании этих методов визуализации in situ, могут быть идентифицированы как подходящие кандидаты для лечения активируемым антителом против EGFR, подвергаемым тестированию. Таким же образом больные, тестирование которых дало отрицательный результат в отношении любой или обеих - мишени (например, EGFR) и протеазы, которая расщепляет субстрат в СМ (например, MT-SP1), при использовании этих методов визуализации in situ, идентифицируются как подходящие кандидаты для другого типа лечения (т.е. не подходят для лечения активируемым антителом против EGFR, подвергаемым тестированию). В некоторых вариантах осуществления такие больные могут быть проверены в отношении других активируемых антител против EGFR, до тех пор, пока не идентифицируется подходящее для лечения активируемое антитело против EGFR (например, активируемое антитело против EGFR, включающее CM, который расщепляется у больного в области заболевания).

Пример 9. Активируемые антитела, конъюгированные с агентом

Настоящий пример демонстрирует способность конъюгата активируемое антитело-агент по настоящему раскрытию ингибировать рост опухоли.

Активируемое антитело 3954-1204-C225v5 конъюгировали с монометилауристатином E (MMAE), синтетическим антимитотическим ингибитором полимеризации тубулина через линкер на основе Val-Cit (K-lock C5-vc-PAB; Concortis Biosystems Corp., San Diego, CA), для получения конъюгата активируемое антитело-агент 3954-1204-C225v5-MMAE. Эффективность in vivo 3954-1204-C225v5-MMAE относительно 3954-1204-C225v5 и цетуксимаба была протестирована с использованием мышиной модели ксенотрансплантата линии клеток H292 рака легкого. Модель H292 ксенотрансплантата создавали путем подкожной инокуляции 6-8-недельным самкам мышей NU/J (JAX #2019) в правый задний пах 5×10⁶ клеток NCI-H292 (АТСС), суспендированных 1:1 с матригелем™ в бессывороточной среде. Измерения объема опухоли цифровым штангенциркулем осуществляли 3 раза (3Х) в неделю, как только опухоль становилась измеримой. Животных ранжировали по размеру опухоли в подобранные когорты (8 мышей/группа) со средними объемами опухоли ~150 мм³-200 мм³, и при лечении группам вводили 1 раз в день 0 следующее: (а) 12,5 мг/кг 3954-1204-C225v5-MMAE, вводимое внутривенно; (b) 2,5 мг/кг 3954-1204-C225v5-MMAE, вводимое внутривенно; (с) 12,5 мг/кг ритуксан-MMAE (т.е. ритуксимаб-MMAE; ритуксимаб доступен от Genentech, So. San Francisco, CA), вводимый внутривенно; (d) 12,5 мг/кг 3954-1204-C225v5, вводимое внутрибрюшинно; (e) 12,5 мг/кг цетуксимаб, вводимый внутрибрюшинно; или (f) 12,5 мг/кг IVIg, вводимый внутрибрюшинно. Опухоли измеряли штангенциркулем два раза в неделю на протяжении исследования.

Как показано на фигуре 18, при однократном введении 12,5 мг/кг конъюгата активируемое антитело-агент 3954-1204-C225v5-MMAE через 28 дней после введения продемонстрирована достоверная эффективность по сравнению с 12,5 мг/кг IVIg (снижение объема опухоли на 92%, р=0,0000003), как это характерно для однократного введения 12,5 мг/кг цетуксимаба (снижение объема опухоли на 78%, р=0,000006). Эффективность 3954-1204-C225v5-MMAE на 28-ой день была значительно выше, чем у цетуксимаба в этой дозе (р=0,03). Сниженная эффективность была отмечена при более низкой дозе (2,5 мг/кг) 3954-1204-C225v5-MMAE (р=0,007), а также при дозе 12,5 мг/кг ритуксана-ММАЕ (р=0,008) на 28-ой день. Не наблюдалось статистически значимых различий в эффективности с активируемым антителом 3954-1204-C225v5 в дозе 12,5 мг/кг (p=0,06 на 28-ой день).

В дополнительном исследовании в той же модели ксенотрансплантата опухоли H292 осуществляли разбиение дозы для сравнения активности цетуксимаба, активируемого антитела 3954-1204-C225v5-ММАЕ, вводимых в однократной дозе 12,5 мг/кг или вводимых два раза в неделю (в дни 0, 3, 7, 10 и 14) в дозе 2,5 мг/кг каждая, суммарно 5 доз (суммарно вводили 12,5 мг/кг активируемого антитела в течение исследования). В этом исследовании с разбиением дозы использовали тот же контроль (12,5 мг/кг IVIg) и методы, описанные выше для модели ксенотрансплантата H292, анализа связывания с EGFR, и методов оценки пролиферации в клеточной культуре. В этом исследовании с разбиением дозы активируемое антитело 3954-1204-C225v5-MMAE хорошо переносилось, о чем свидетельствует отсутствие потери массы у подвергаемых лечению мышей. Одно контрольное животное забили на 23 день при потере массы тела >20%, но все другие животные выживали в течение 35 дней.

Значительная противоопухолевая активность наблюдалась во всех группах с лечением активируемым антителом 3954-1204-C225v5-ММАЕ и цетуксимабом, как показано ниже в таблице 5, в которой значения выше 100% представляют собой уменьшение размеров опухоли.

Таблица 5 Ингибирование роста опухоли по сравнению с группой, получавшей контрольное соединение.
Лечение	Ингибирование роста опухоли (%)
7 день	14 день	21 день	28 день	35 день
IVIG 25 мг/кг	0%	0%	0%	0%	0%
Цетуксимаб 12,5 мг/кг	91%	102%	90%	74%	61%
Цетуксимаб 2,5 мг/кг × 5	82%	98%	93%	87%	77%
3954-1204-C225v5-ММАЕ 12,5 мг/кг	104%	124%	112%	112%	109%
3954-1204-C225v5-ММАЕ 2,5 мг/кг × 5	39%	107%	107%	107%	107%

Цетуксимаб в однократной дозе 12,5 мг/кг вызывал прекращение роста опухоли или регрессию опухоли у 8/8 мышей; однако, эффект был недолгим, причем у 6/8 мышей обнаруживался очевидный повторный рост опухоли на 35-ый день. Цетуксимаб в дробной дозе 2,5 мг/кг аналогично вызывал прекращение роста или регрессию опухоли у всех животных с последующим повторным ростом у 5/8 мышей на 35-ый день. Введение активируемого антитела 3954-1204-C225v5-MMAE в виде однократной дозы 12,5 мг/кг обладало более выраженным противоопухолевым эффектом, приводя в результате к регрессии опухоли у 7/7 мышей без признаков повторного роста опухоли на 35-ый день. Введение дважды в неделю 2,5 мг/кг 3954-1204-C225v5-MMAE вызывало регрессию опухоли у 8/8 мышей, и только у одной из них выявлялся очевидный повторный рост опухоли на 35-ый день. Статистический анализ объемов опухолей на 35-ый день показал, что обе схемы с использованием 3954-1204-C225v5-MMAE были значительно более эффективны, чем дробная доза цетуксимаба (односторонний тест ANOVA р<0,005 в каждом случае). То же самое подтверждалось при сравнении с цетуксимабом в группе с однократной дозой. Не наблюдалось значимых различий на 35-ый день между активностью 3954-1204-C225v5-MMAE при использовании двух схем введения (р=0,22 при использовании двухстороннего t-теста).

В заключение, конъюгат активируемое антитело 3954-1204-C225v5-MMAE против EGFR-агент продемонстрировал устойчивую и продолжительную эффективность в модели опухоли H292 с активностью, превышающей активность такой же дозы цетуксимаба. Конъюгат активируемое антитело 3954-1204-C225v5-ММАЕ-агент был одинаково эффективен при введении в виде однократной дозы 12,5 мг/кг или в виде повторяющейся дозы 2,5 мг/кг, вводимой два раза в неделю, суммарно 5 доз.

Пример 10. Характеристика in vitro активируемых антител, конъюгированных с агентом

В этом примере описана способность конъюгата активируемое антитело-агент по настоящему раскрытию сохранять связывание с EGFR и ингибировать пролиферацию клеток H292 в культуре.

Активируемое антитело 3954-1204-C225v5 против EGFR конъюгировали с монометилауристатином E (MMAE), синтетическим антимитотическим ингибитором полимеризации тубулина, как описано в настоящем документе в примерах, чтобы создать конъюгат активируемое антитело-агент 3954-1204-C225v5-MMAE. Среднее соотношение лекарства к антителу (DAR) составляло 3,44.

Определяли способность связываться с EGFR с помощью анализа на основе ELISA и способность ингибировать пролиферацию клеток H292 в клеточной культуре следующих соединений: конъюгата активируемое антитело против EGFR-агент 3954-1204-C225v5-MMAE; конъюгата активируемое антитело против EGFR-агент 3954-1204-C225v5-MMAE, активированного uPA; активируемого антитела против EGFR 3954-1204-C225v5; активируемого антитела против EGFR 3954-1204-C225v5, активированного uPA; и антитела против EGFR C225v5. Активацию активируемого антитела и конъюгата активируемое антитело-агент осуществляли путем гидролиза в течение ночи при 37°C активной титрованной по сайту uPA (500 нМ) в трисе рН 8,5; активацию измеряли с помощью анализа CE (LabChip GXII). Активированное uPA активируемое антитело и активированный uPA конъюгат активируемое антитело-агент очищали с использованием протеина А и затем хранили при 4°C до исследования.

Для экспериментов по связыванию на основе ELISA лунки 96-луночного планшета ELISA покрывали EGFR-Fc (R&D Systems). Серийное разведение соединений 1:3 вносили в лунки планшета и давали связаться. Связанное антитело визуализировали с помощью конъюгата F(аb')₂IgG против человека-HRP (Jackson Immunoresearch Laboratories), и развитие окраски вызывали с помощью хромогенного субстрата ТМВ. На фигуре 20А показано, что конъюгация MMAE с активируемым антителом не препятствует способности маскирующего фрагмента ингибировать связывание активируемого антитела с EGFR. Кроме того, конъюгация MMAE с активированным uPA активируемым антителом не изменяет способность активированного антитела связываться с EGFR.

Для анализа клеточной пролиферации линию клеток H292 рака легких человека получали от АТСС. Клетки H292 выращивали в полной среде (RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки плодов телят) при 37°С в атмосфере 5% СO₂ на воздухе. Клетки H292 собирали в течение логарифмического периода роста, ресуспендировали в полной среде и высевали при плотности 10000 клеток на лунку в белостенный 96-луночный планшет типа «дымовая труба». После инкубации в течение ночи к клеткам в культуре добавляли каждое соединение в серийном последовательном (10 раз) разведении 1:3, начиная с 10 мкг/мл и заканчивая по существу 0 мкг/мл при параллельных определениях. Клетки культивировали в течение 3 дней, и жизнеспособность клеток измеряли с использованием CellTiterGlo (Promega) в соответствии с протоколом производителя и люминометра (Tecan). Данные проанализированы с помощью Prism GraphPad. На фигуре 20B показано, что конъюгация MMAE с активированным uPA активируемым антителом увеличивает активность активированного антитела, вызывающую гибель клеток. Кроме того, конъюгация MMAE с активируемым антителом не препятствует способности маскирующего фрагмента препятствовать гибели клеток под действием нерасщепленного активируемого антитела.

Пример 11. Визуализация in situ активируемых антител против EGFR

Настоящий пример описывает использование подхода визуализации in situ для скрининга образцов тканей больных в отношении активации и связывания активируемого антитела против EGFR. Результаты показывают, что активируемые антитела против EGFR по изобретению могут быть активированы протеазами, экспрессируемыми раковой тканью больного, и связываются с рецептором EGFR в этой ткани.

Образцы тканей колоректального рака человека, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) и метастазов печени проверяли на экспрессию EGFR и MT-SP1 путем обработки замороженной ткани меченым EGFR и антителами A11 в концентрациях 1 мкг/мл и 5 мкг/мл, соответственно, в течение 1 часа (фигура 21 и таблицы 6-8). Далее способность активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR активироваться и связываться с опухолью человека или тканями печеночных метастазов оценивали с использованием визуализации in situ. Активируемое антитело метили Alexa Fluor® 680 (Invitrogen), как описано выше. Полученное активируемое антитело 3954-1204-C225V5-AF680 (также обозначаемое как 1204-C225v5 или 1204-C225) инкубировали с образцами замороженных тканей больных в соответствии с протоколом визуализации in situ, описанным в настоящем документе. Фигура 22 иллюстрирует способность тканей колоректального рака и печеночных метастазов активировать и связывать активируемые антитела против EGFR. Результаты по способности образцов раковых тканей больных активировать и связывать активируемые антитела против EGFR суммированы в таблицах 6-8. ИГХ окрашивание, которое является мерой количества EGFR и связывания антител A11 с образцом ткани, оценивали по очкам от 0 до 3+: 0, нет окрашивания; 1+ (т.е. «+»), слабое окрашивание; 2+ (т.е. «++»), умеренное окрашивание; и 3+ (т.е. «+++»), сильное окрашивание. Подсчет очков при визуализации окрашивания in situ основан на сравнении с окрашиванием антителом цетуксимабом и определяется следующим образом: 0, отсутствие окрашивания; 1+ (т.е. «+»), слабое окрашивание по сравнению с родительским антителом; 2+ (т.е. «++»), умеренное окрашивание по сравнению с родительским антителом; и 3+ (т.е. «+++»), окрашивание, аналогичное родительскому антителу.

Пример 12. Количественная оценка визуализации in situ активируемых антител против EGFR

В настоящем примере описывается визуализация in situ активации и связывания активируемого антитела против EGFR в биологических тканях ex vivo в сочетании с ИГХ антитела против EGFR и ИГХ антитела A11. Использование коммерчески доступной ИГХ антитела против EGFR позволяет нормализовать окрашивание родительского антитела (например, цетуксимаба) и активируемого антитела против EGFR относительно уровня экспрессии EGFR в ткани. Совместное окрашивание с антителами против EGFR также позволяет при визуализации in situ качественно оценить количество активируемых антител против EGFR по отношению к окрашиванию цетуксимаба, нормализованному на экспрессию EGFR. Количественное определение флуоресцентного сигнала может быть выполнено с использованием биоаналитического программного обеспечения для обработки изображений, такого как MetaMorph. Для мониторинга активности МТ-SP1, фермента, который протеолитически расщепляет субстрат активируемых антител 3954-1204-C225v4, 3954-1204-C225v5 и 3954-1204-C225v6, может быть также выполнено окрашивание ткани антителом, которое специфически распознает активный сайт МТ-SP1 (антителом А11).

Количественное определение путем визуализации in situ расщепления активируемого антитела против EGFR клеткой или тканью, выполняемое в сочетании с ИГХ EGFR, проводили следующим образом: срезы замороженной ткани помещали на предметные стекла и промывали в 1х PBS-T. Раствор, содержащий меченые активируемые антитела против EGFR (меченные, например, флуоресцентной меткой), наносили на ткань и инкубировали, например, в течение 1 часа при комнатной температуре в буфере для инкубации 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7,4, содержащем 150 мМ NaCl, 100 мкМ ZnCl₂, 5 мМ CaCl₂ и 0,05% твин 20; активируемые антитела в концентрации приблизительно 1 мкг/мл. Затем ткань промывали в 1х PBS-T для удаления несвязавшегося материала, и эндогенный IgG блокировали 3% BSA. Срезы инкубировали с коммерчески доступными антикроличьими антителами против EGFR и мечеными антителами A11 (меченными, например, флуоресцентной меткой), например, в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания наносили второе антитело против IgG кролика, меченное флуоресцентной меткой, в концентрации 5 мкг/мл и инкубировали на срезах, например, в течение 30 минут при комнатной температуре для усиления окраски первого антитела. Срезы промывали и измеряли детектируемую метку. Например, при использовании флуоресцентной метки ткань исследовали флуоресцентной микроскопией. Способность активируемого антитела против EGFR к активации и связыванию с рецептором in situ количественно оценивали с помощью следующего уравнения:

PbA=% активации и связывания активируемого антитела против EGFR по сравнению с родительским антителом (например, цетуксимабом), Ab EGFR=интенсивность ИГХ окрашивания EGFR на срезе при связывании цетуксимаба, Pb EGFR=интенсивность ИГХ окрашивания EGFR на срезе активируемым антителом против EGFR при визуализации in situ, Ab визуализации in situ=интенсивность связывания цетуксимаба, Pb визуализации in situ=интенсивность связывания активируемого антитела против EGFR.

Образцы тканей рака пищевода и поджелудочной железы проверяли на экспрессию EGFR и MT-SP1; способность активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR активироваться и связываться с опухолью человека оценивали с использованием визуализации in situ. Активируемое антитело метили Alexa Fluor® 680 (Invitrogen), как описано выше. Полученное активируемое антитело 3954-1204-C225v5-AF680 инкубировали с образцами замороженных тканей больных в соответствии с протоколом визуализации in situ, описанным в настоящем документе. Кроме того, EGFR и антитела A11, меченные Alexa Fluor® 750, использовали при обработке замороженной ткани в концентрации 1 мкг/мл и 5 мкг/мл, соответственно, в течение 1 часа. На фигуре 23 проиллюстрирована способность тканей рака пищевода активировать и связывать активируемые антитела против EGFR. Результаты по способности образцов тканей рака пищевода и поджелудочной железы человека активировать и связывать активируемые антитела против EGFR суммированы в таблице 9. ИГХ окрашивание, которое является мерой количества цетуксимаба, EGFR и связывания антител A11 с образцом ткани, оценивали по очкам от 0 до 3+: 0, отсутствие окрашивания; 1+ (т.е. «+»), слабое окрашивание; 2+ (т.е. «++»), умеренное окрашивание; и 3+ (т.е. «+++»), сильное окрашивание. Окрашивание активируемых антител против EGFR при визуализации in situ количественно оценивали на основе сравнения с окрашиванием антителом цетуксимабом, нормированным на окрашивание EGFR и рассчитанным по формуле, описанной выше.

Таблица 9 Скрининг экспрессии EGFR и MT-SP1 путем визуализации in situ активируемого антитела 3954-1204-C225 в опухолевых тканях больных раком пищевода и раком поджелудочной железы.
# больного	ИГХ	Визуализация in situ	Диагноз заболевания
EGFR	MT-SP1	Цетуксимаб	3954-1204-С225
5586	++	++	++	~55%	Рак пищевода
5594	+++	++	+++	~90%	Рак пищевода
5595	++	++	+++	~80%	Рак пищевода
5606	+++	+++	+++	~100%	Рак пищевода
5641	+++	++	++	~90%	Рак пищевода
5587	++	+++	++	~100%	Рак поджелудочной железы
5617	+	+	+	~80%	Рак поджелудочной железы
5623	++	++	++	~75%	Рак поджелудочной железы
13007	++	++	++	~100%	Рак поджелудочной железы
13011	-	+	-	-	Рак поджелудочной железы
* ИГХ и окрашивание цетуксимаба оценивали по очкам от 0 до 3+, которые характеризуют измеряемый уровень связывания антител: 0, отсутствие окрашивания; 1+, слабое окрашивание; 2+, умеренное окрашивание; и 3+, сильное окрашивание. ** Подсчет очков при визуализации in situ 3954-1204-С225 основан на сравнении с окрашиванием родительских антител, нормализованным на ИГХ окрашивание EGFR и идентифицируемым как % активации: 0, отсутствие активации; 100% активация, активация в результате окрашивания, аналогичного окрашиванию родительского антитела.

Фигура 23 представляет собой серию фотографий, демонстрирующих тройное окрашивание при визуализации in situ, ИГХ EGFR и ИГХ A11. Верхний ряд изображений показывает окрашивание, выполненное на срезе одной ткани, демонстрирующее (слева направо): экспрессию EGFR, активность матриптазы (MT-SP1) и связывание цетуксимаба в условиях визуализации in situ. Нижний ряд изображений показывает окрашивание, выполненное на срезе одной ткани, демонстрирующее (слева направо): экспрессию EGFR, активность матриптазы (MT-SP1) и визуализацию in situ активируемого антитела 3954-1204-C225v5 против EGFR. В правой колонке изображений на фигуре 23 сравнивается связывание цетуксимаба (верхнее изображение) и активируемого антитела против EGFR, активированного возникающим в ткани протеолитическим расщеплением (нижнее изображение), в условиях визуализации in situ. Идентичный паттерн окрашивания тканей обнаружен при экспозиции с тканью коммерчески доступного антитела против EGFR, как показано на фигуре 23, левая колонка изображений. Фигура 23, средняя колонка изображений, демонстрирует совместную локализацию активности матриптазы (MT-SP1) и экспрессии EGFR. При использовании в данном описании термин «совместная локализация» не предназначен для обозначения никакого перекрывающегося или другого частично совпадающего окрашивания EGFR и/или окрашивания A11, и термин «совместная локализация» используется для обозначения присутствия активности МТ-SP1 в ткани больного, экспрессирующей EGFR. В целом эти данные демонстрируют приблизительно 90% активацию антитела 3954-1204-C255v5 против EGFR образцом ткани рака пищевода человека.

Другие варианты осуществления

Несмотря на то, что изобретение изложено в связи с его подробным описанием, представленное выше описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения, который определен объемом прилагаемой формулы изобретения.

1. Активируемое антитело, которое в активированном состоянии связывает рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), включающее:

антитело (AB), которое специфически связывается с EGFR, где AB включает (i) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68, или (ii) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 68;

маскирующий фрагмент (MM), связанный с AB, который ингибирует связывание AB активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с EGFR, где маскирующий фрагмент включает аминокислотную последовательность CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14); и

расщепляемый фрагмент (CM), соединенный с АВ, где CM представляет собой полипептид, который функционирует в качестве субстрата для протеазы, и где CM включает аминокислотную последовательность LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13),

где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-CM-AB или AB-CM-ММ.

2. Активируемое антитело по п.1, где активируемое антитело включает сочетание тяжелых и легких цепей, выбранное из группы, состоящей из:

(a) тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28;

(b) тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(c) тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; и

(d) тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

3. Активируемое антитело по п.1, где активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

4. Активируемое антитело по п.1, где активируемое антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

5. Активируемое антитело по п.1, где AB имеет равновесную константу диссоциации связывания с EGFR приблизительно 100 нМ или менее.

6. Активируемое антитело по п.1, где MM имеет равновесную константу диссоциации связывания с AB, которая является более высокой, чем равновесная константа диссоциации связывания AB с EGFR.

7. Активируемое антитело по п.1, где MM имеет константу диссоциации связывания с AB, которая не является более высокой, чем константа диссоциации связывания AB с EGFR.

8. Активируемое антитело по п.1, где MM не препятствует связыванию AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с EGFR или не конкурирует с AB за связывание.

9. Активируемое антитело по п.1, где MM представляет собой полипептид, состоящий из не более 40 аминокислот в длину.

10. Активируемое антитело по п.1, где последовательность полипептида MM отличается от EGFR, и где последовательность полипептида MM не более чем на 50% идентична любому природному партнеру связывания AB.

11. Активируемое антитело по п.1, где MM имеет не более 25% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR.

12. Активируемое антитело по п.1, где MM имеет не более 10% идентичности аминокислотной последовательности с EGFR.

13. Активируемое антитело по п.1, где CM представляет собой полипептид, состоящий из до 15 аминокислот в длину.

14. Активируемое антитело по п.1, где протеаза локализована в ткани совместно с EGFR, и где протеаза расщепляет СМ в активируемом антителе, когда активируемое антитело подвергается воздействию протеазы.

15. Активируемое антитело по п.1, где активируемое антитело включает линкерный пептид между MM и CM.

16. Активируемое антитело по п.1, где активируемое антитело включает линкерный пептид между CM и AB.

17. Активируемое антитело по п.1, где активируемое антитело включает первый линкерный пептид (LP1) и второй линкерный пептид (LP2), и где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к C-концу: ММ-LP1-CM-LP2-AB или AB-LP2-CM-LP1-MM.

18. Активируемое антитело по п.17, где два линкерных пептида необязательно идентичны друг другу.

19. Активируемое антитело по п.17, где, по меньшей мере, один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (GS)_n, (GGS)_n, (GSGGS)_n (SEQ ID NO: 15) и (GGGS)_n (SEQ ID NO: 16), где n представляет собой целое число, по меньшей мере, единицу.

20. Активируемое антитело по п.17, где, по меньшей мере, один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGSG (SEQ ID NO: 17), GGSGG (SEQ ID NO: 18), GSGSG (SEQ ID NO: 19), GSGGG (SEQ ID NO: 20), GGGSG (SEQ ID NO: 21) и GSSSG (SEQ ID NO: 22).

21. Активируемое антитело по п.17, где LP1 включает аминокислотную последовательность GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 23).

22. Активируемое антитело по п.17, где LP2 включает аминокислотную последовательность GSSGT (SEQ ID NO: 24) или GSSG (SEQ ID NO: 37).

23. Активируемое антитело по п.1, где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии включает спейсер, где спейсер соединен непосредственно с MM и имеет структурную организацию от N-конца к С-концу спейсер-MM-СМ-AB.

24. Активируемое антитело по п.23, где спейсер включает аминокислотную последовательность QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

25. Активируемое антитело по п.23, где спейсер и MM включают аминокислотную последовательность QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59).

26. Активируемое антитело по п.1, где активируемое антитело включает первый линкерный пептид (LP1) и второй линкерный пептид (LP2), так что активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структурную организацию от N-конца к С-концу: MM-LP1-CM-LP2-AB или AB-LP2-CM-LP1-MM, где LP1 включает аминокислотную последовательность GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 23), и LP2 включает аминокислотную последовательность GSSGT (SEQ ID NO: 24) или GSSG (SEQ ID NO: 37), и где AB включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68.

27. Активируемое антитело по п.1, где AB конъюгирован с агентом.

28. Активируемое антитело по п.27, где агент представляет собой токсин или его фрагмент.

29. Активируемое антитело по п.27, где агент представляет собой доластатин или его производное.

30. Активируемое антитело по п.27, где агент представляет собой ауристатин или его производное.

31. Активируемое антитело по п.27, где агент представляет собой ауристатин Е или его производное.

32. Активируемое антитело по п.27, где агент представляет собой монометилауристатин E (MMAE).

33. Активируемое антитело по п.27, где агент представляет собой мейтансиноид или его производное.

34. Активируемое антитело по п.27, где агент представляет собой DM1 или DM4.

35. Активируемое антитело по п.27, где агент представляет собой дуокармицин или его производное.

36. Активируемое антитело по п.27, где агент представляет собой калихеамицин или его производное.

37. Активируемое антитело по п.27, где агент конъюгирован с AB через линкер.

38. Активируемое антитело по п.37, где линкер представляет собой расщепляемый линкер.

39. Активируемое антитело по п.1, включающее детектируемую часть.

40. Активируемое антитело по п.39, где детектируемая часть представляет собой диагностический агент.

41. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая активируемое антитело по любому из пп.1-26.

42. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.41, где нуклеиновая кислота, кодирующая активируемое антитело, включает нуклеиновую кислоту, кодирующую сигнальный пептид.

43. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.42, где нуклеиновая кислота, кодирующая сигнальный пептид, оперативно связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей активируемое антитело, через нуклеиновую кислоту, кодирующую спейсер.

44. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.43, где нуклеиновая кислота, кодирующая спейсер, кодирует аминокислотную последовательность, которая включает QGQSGQ (SEQ ID NO: 38).

45. Вектор для применения в получении активируемого антитела, где культивирование клетки, содержащей указанный вектор, в условиях, которые приводят к экспрессии активируемого антитела, приводит к получению активируемого антитела, включающий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.41.

46. Способ получения активируемого антитела путем культивирования клетки в условиях, которые приводят к экспрессии активируемого антитела, где клетка включает вектор по п.45.

47. Способ получения активируемого антитела, которое в активированном состоянии связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), причем способ включает:

(a) культивирование клетки, включающей нуклеиновую кислоту, которая кодирует активируемое антитело по п.1, в условиях, которые приводят к экспрессии активируемого антитела, и

(b) выделение активируемого антитела.

48. Способ по п.47, дополнительно включающий конъюгирование агента с по меньшей мере одним выделенным активируемым антителом, где указанный агент представляет собой токсин или его фрагмент, и где указанный токсин выбран из одного или более из: доластатина или его производного, ауристатина или его производного, ауристатина Е или его производного, монометилауристатина E (MMAE), мейтансиноида или его производного, DM1, DM4, дуокармицина или его производного, и калихеамицина или его производного;

необязательно где указанный агент конъюгирован с AB через линкер; и

необязательно где указанный линкер представляет собой расщепляемый линкер.

49. Способ лечения или задержки прогрессии нарушения, связанного с EGFR, у индивидуума, включающий введение терапевтически эффективного количества активируемого антитела по любому из пп.1-40 нуждающемуся в этом индивидууму,

необязательно где указанное нарушение, связанное с EGFR, связано с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR у субъекта.

50. Способ по п.49, где нарушением, связанным с EGFR, является рак.

51. Способ по п.50, где рак представляет собой рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, глиобластому, рак головы и шеи, рак легкого, рак яичника, рак эндометрия, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, саркому, рак кожи, тройной негативный рак молочной железы, рак пищевода, немелкоклеточный рак легкого, остеосаркому, плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак или меланому.

52. Способ по п.49, где нарушением, связанным с EGFR, является псориаз.

53. Способ ингибирования ангиогенеза у индивидуума, включающий введение терапевтически эффективного количества активируемого антитела по любому из пп.1-40 нуждающемуся в этом индивидууму.

54. Способ обнаружения присутствия или отсутствия расщепляющего агента и рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) у индивидуума или в образце, причем способ включает:

(a) приведение индивидуума или образца в контакт с активируемым антителом по любому из пп.1-40, и

(b) измерение уровня активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце,

где определяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент и EGFR присутствуют у индивидуума или в образце, и где неопределяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR у индивидуума или в образце указывает на то, что расщепляющий агент, EGFR или оба, расщепляющий агент и EGFR, отсутствуют у индивидуума или в образце.

55. Способ по п.54, где активируемое антитело против EGFR включает детектируемую метку.

56. Способ по п.55, где детектируемая метка включает визуализирующий агент, контрастирующий агент, фермент, флуоресцентную метку, хромофор, краситель, один или более ионов металла или метку на основе лиганда.

57. Способ по п.54, где способ представляет собой способ in vivo, способ in situ, способ ex vivo или способ in vitro.

58. Способ идентификации или уточнения популяции больных для лечения нарушения, связанного с EGFR, причем способ включает:

(i) приведение образца индивидуума в контакт с активируемым антителом против EGFR по любому из пп.1-40;

(ii) измерение уровня активированного активируемого антитела против EGFR в образце, где определяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR в образце указывает на то, что образец дает положительный результат на присутствие EGFR и расщепляющего агента, который расщепляет субстрат в расщепляемом фрагменте (CM) активируемого антитела по любому из пп.1-40;

(iii) идентификацию и отбор одного или более индивидуумов, которые имеют положительный результат теста на присутствие EGFR и расщепляющего агента, тем самым идентифицируя или уточняя популяцию больных; и

(iv) введение терапевтически эффективного количества активируемого антитела по любому из пп.1-40 одному или более индивидуумам в популяции больных, которые имеют положительный результат теста на присутствие EGFR и расщепляющего агента,

59. Способ по п.58, где активируемое антитело против EGFR включает детектируемую метку.

60. Способ по п.59, где детектируемая метка включает визуализирующий агент, контрастирующий агент, фермент, флуоресцентную метку, хромофор, краситель, один или более ионов металла или метку на основе лиганда.

61. Способ по п.58, где нарушением, связанным с EGFR, является рак.

62. Способ по п.61, где рак представляет собой рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, глиобластому, рак головы и шеи, рак легкого, рак яичника, рак эндометрия, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, саркому, рак кожи, тройной негативный рак молочной железы, рак пищевода, немелкоклеточный рак легкого, остеосаркому, плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак или меланому.

63. Способ по п.58, где нарушением, связанным с EGFR, является псориаз.

64. Набор для идентификации или уточнения популяции больных для лечения нарушения, связанного с EGFR, причем набор включает:

(i) активируемое антитело против EGFR по любому из пп.1-40;

(ii) средство для измерения уровня активированного активируемого антитела против EGFR в образце от индивидуума, где определяемый уровень активированного активируемого антитела против EGFR в образце указывает на то, что образец дает положительный результат на присутствие EGFR и расщепляющего агента, который расщепляет субстрат в расщепляемом фрагменте (CM) активируемого антитела по любому из пп.1-40;

(iii) средство идентификации и отбора одного или более индивидуумов, которые имеют положительный результат теста на присутствие EGFR и расщепляющего агента, тем самым идентифицируя или уточняя популяцию индивидуумов; и

(iv) инструкции по введению терапевтически эффективного количества активируемого антитела по любому из пп.1-40 одному или более индивидуумам в популяции больных, которые имеют положительный результат теста на присутствие EGFR и расщепляющего агента,

65. Набор по п.64, где активируемое антитело против EGFR включает детектируемую метку.

66. Набор по п.65, где детектируемая метка включает визуализирующий агент, контрастирующий агент, фермент, флуоресцентную метку, хромофор, краситель, один или более ионов металла или метку на основе лиганда.

67. Набор по п.64, где нарушением, связанным с EGFR, является рак.

68. Набор по п.67, где рак представляет собой рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, глиобластому, рак головы и шеи, рак легкого, рак яичника, рак эндометрия, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, саркому, рак кожи, тройной негативный рак молочной железы, рак пищевода, немелкоклеточный рак легкого, остеосаркому, плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак или меланому.

69. Набор по п.64, где нарушением, связанным с EGFR, является псориаз.

70. Применение активируемого антитела по любому из пп.1-40 в производстве лекарственного средства для лечения или задержки развития нарушения, связанного с EGFR,

необязательно где указанное нарушение, связанное с EGFR, связано с аберрантной экспрессией и/или активностью EGFR у субъекта,

необязательно где указанное нарушение, связанное с EGFR, представляет собой рак,

необязательно где указанное нарушение, связанное с EGFR, представляет собой псориаз,

необязательно где указанное нарушение, связанное с EGFR, представляет собой рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, глиобластому, рак головы и шеи, рак легкого, рак яичника, рак эндометрия, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, саркому, рак кожи, тройной негативный рак молочной железы, рак пищевода, немелкоклеточный рак легкого, остеосаркому, плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак или меланому.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая применение тест-системы для изготовления набора для обнаружения и определения характеристики вируса гриппа типа «А» или типа «В», диагностическую тест-систему для обнаружения и определения характеристики вируса гриппа типа «А» или типа «В», набор для обнаружения и определения характеристики вируса гриппа типа «А» или типа «В».

Способ извлечения витаминов в2 и в6 из водного раствора // 2712666

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к анализу органических соединений, и может быть использовано при разработке процессов извлечения и раздельного определения витаминов В2 и В6.

Способ лечения почечно-клеточного рака // 2712454

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и предназначено для лечения почечно-клеточного рака. Больному вводят комбинацию препаратов: 3 раза в неделю в количестве 12000000 ME в сутки и Эндоксан.

Способ гельминтологического исследования печени оленей // 2712242

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к гельминтологии, и может быть использовано для качественного и количественного учета гельминтов при ветсанэкспертизе органов или при выявлении причин смерти животного.

Способ определения степени тяжести преэклампсии по относительному содержанию cd16+ моноцитов в периферической крови беременных // 2712228

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и гинекологии, и относится к способу определения степени тяжести преэклампсии по относительному содержанию CD16+ моноцитов в периферической крови беременных.

Способ постановки прогноза и наборы, применимые в указанном способе // 2712225

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ предсказания длительности выживаемости без признаков локального заболевания у пациента с раком молочной железы и набор для использования в этом способе.

Набор для дифференцированного выявления в сыворотке крови маркеров на всех стадиях инфекционного заболевания методом мультипараметрического дот-иммуноанализа // 2712149

Изобретение относится к наборам для иммунохимического анализа. Набор нанесенных на подложку-иммуночип реагентов захвата представлен видовым антигеном вируса Денге или смесью антигенов вируса Денге типов I-IV, антителом против IgM человека и моноклональными антителами против белка NS1 вируса Денге для выделения из образца и детекции ранних белков патогена; многокомпонентный конъюгат представлен смесью золей золота, связанных с антителами против IgG человека для детекции IgG, видовым антигеном вируса Денге или смесью антигенов вируса Денге типов I-IV для детекции специфических IgM и моноклональными антителами против белка NS1 вируса Денге для выделения из образца и детекции ранних белков патогена, а встроенные контроли содержат IgG человека и белок NS1 вируса Денге иммобилизованные на отдельных сегментах подложки-иммуночипа и включают сегмент с нанесенными IgG человека для контроля работоспособности антивидовых детекторных антител к выявленным антигенам и свободным от специфических белков сегментом для оценки проявляющей системы и фоновых явлений.

Способ оценки загрязнения территорий пестицидами путем биоиндикации // 2712100

Группа изобретений относится к охране окружающей среды и рациональному природопользованию, а именно к способам оценки экологического состояния окружающей среды с помощью биоиндикации.

Генетически модифицированные животные, отличные от человека, экспрессирующие epo человека // 2711744

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированной мыши, несущей нуклеотидную последовательность, которая кодирует человеческий белок EPO, где генетически модифицированная мышь является иммунодефицитной, а также к ее применению в способе идентификации агента, который ингибирует инфекцию, вызванную патогеном, который поражает человеческие клетки эритроидного ростка, и в способе идентификации агента, который предупреждает инфекцию, вызванную патогеном, который поражает человеческие клетки эритроидного ростка.

Способ улучшения стабильности антител // 2711719

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу отбора одного или нескольких антител, стабильных к деградации. Указанный способ включает стадии, при которых: а) берут два или более антител, б) у каждого остатка Asn и Asp в Fv домене антитела определяют конформационную подвижность Сα-атома с использованием ансамбля моделей, основанных на гомологии, в) у каждого остатка Asn и Asp в Fv домене антитела определяют размер аминокислотного остатка, прилегающего к остатку Asn или Asp со стороны С-конца, г) выбирают одно или несколько антител, у которых Сα-атом является конформационно неподвижным и у которого со стороны С-конца к Asn или Asp прилегает аминокислотный остаток с доступной для растворителя площадью поверхности, составляющей 111 или более, где конформационная подвижность представляет собой среднеквадратичное отклонение (RMSD) соответствующих Сα-атомов остатков Asn/Asp в ансамбле моделей, основанных на гомологии.

Способ прогнозирования риска формирования органического тревожного расстройства // 2712915

Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии, и раскрывает способ прогнозирования риска формирования органического тревожного расстройства. Способ характеризуется тем, что дополнительно к общеклиническим показателям у пациентов с органическим эмоционально-лабильным (астеническим) расстройством определяют психологические и иммунобиологические показатели и при повышении уровня личностной тревожности более 52 баллов, количества лимфоцитов с рецепторами готовности к апоптозу более 16%, значении иммунорегуляторного индекса менее 1,3 ед.

Способ прогнозирования невынашивания беременности у женщин с гипоталамическим синдромом // 2712628

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования невынашивания беременности у женщин репродуктивного возраста с гипоталамическим синдромом и индексом массы тела меньше 30.

Способ прогнозирования бесплодия у женщин с гипоталамическим синдромом // 2712627

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования бесплодия у женщин репродуктивного возраста с гипоталамическим синдромом.

Способ проведения количественного иммунохроматографического анализа // 2712249

Изобретение относится области биохимической диагностики, в частности к способам оценки концентрации антигенов при проведении анализов сыворотки крови, мочи, пищевых продуктов, образцов окружающей среды и других жидкостей с помощью иммунохроматографии.

Способ диагностики степени тяжести вегетативных нарушений при болезни паркинсона // 2712059

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для диагностики степени тяжести вегетативных нарушений при болезни Паркинсона с помощью анализа крови.

Элементы, связывающиеся с ил-1 бета // 2711118

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены антитела и их антиген-связывающие фрагменты против ИЛ-1-бета.

Антитела против вспомогательного белка рецептора человеческого интерлейкина-1 (il1rap) и их применение // 2710787

Изобретение относится к области биохимии, в частности к моноклональному антителу, которое специфически связывается с вспомогательным белком рецептора человеческого интерлейкина-1 (IL1RAP).

Способ морфометрической оценки прогноза течения диффузной в-крупноклеточной лимфомы по содержанию stat3+ клеток в опухолевой ткани // 2710591

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, и может быть использовано для морфометрической оценки прогноза течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ).

Способ прогнозирования летального исхода при клиническом течении коинфекции вич и туберкулез, сопровождающемся множественной лекарственной устойчивостью mycobacterium tuberculosis // 2710266

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, фтизиатрии и терапии. Раскрыт способ прогнозирования летального исхода при клиническом течении коинфекции ВИЧ-туберкулез, при котором у пациентов с выявленной множественной лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis и известным количеством CD4-лимфоцитов проводят забор образцов венозной крови, выделение плазмы крови и иммуноферментный анализ с целью определения концентрации неспецифических общих иммуноглобулинов IgE в МЕ/мл, IgM в мг/мл, IgA в мг/мл и секреторного IgA в мг/л в плазме крови, вычисляют коэффициент предикции летального исхода (КП), равный отношению произведения их концентраций к количеству CD4-лимфоцитов в 1 мкл крови и при превышении этим коэффициентом значения 200 прогнозируют летальный исход с 56,7-кратным относительным риском.

Способы и средства для диагностики гриппа // 2713112