Комбинированная терапия pac-1

В изобретении предложены комбинации и способы для индукции гибели раковых клеток. Комбинации и способы их применения включают использование комбинаций для терапии с целью лечения рака и для избирательной индукции апоптоза в раковых клетках. Комбинация содержит соединение РАС-1 (2-(4-бензилпиперазин-1-ил)-N-[(2-гидрокси-3-проп-2-енил-фенил)метилиденамино]ацетамид) в концентрации от 4 мкМ до 12 мкМ и второе действующее вещество, являющееся ингибитором фермента BRAF, имеющего мутацию, представляющее собой вемурафениб. Концентрация вемурафениба составляет от 0,5 мкМ до 30 мкМ. Также комбинация содержит фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель. Комбинация РАС-1 и вемурафениба проявляет синергическую противораковую активность и оказывает меньшие нейротоксические эффекты, чем те же количества других соединений и комбинаций соединений, и может быть эффективной при конкретном раковом заболевании, которое приобрело устойчивость к применяемым ранее видам терапии. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 13 ил., 1 табл., 3 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

В данной заявке заявлен приоритет согласно § 119(e) 35 раздела Кодекса законов США по предварительным заявкам на патент США №62/171882, поданной 5 июня 2015 года, и 62/345629, поданной 3 июня 2016 года, причем заявки включены в данный документ путем ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Апоптоз, или запрограммированная гибель клеток, играет основную роль в развитии и поддержании гомеостаза всех многоклеточных организмов. Распространенным отличительным признаком рака является устойчивость к природным апоптическим сигналам. В зависимости от типа ракового заболевания, эта устойчивость может существовать благодаря повышенной или пониженной регуляции ключевых белков апоптического каскада. Устойчивость также может возникать благодаря мутациям в генах, кодирующих данные белки. Эти изменения могут происходить как во внутреннем апоптическом механизме, который проходит через митохондрии, и каспазу-9, так и внешнем апоптическом механизме, который вовлекает действие рецепторов смерти и каспазы-8. Например, при раковых заболеваниях наблюдали изменения в уровнях белков при здоровом состоянии, таких как р53, Bim, Вах, Apaf-1, FLIP, а также многих других. Эти изменения могут приводить к дефективному апоптическому каскаду, в одном из которых передается ненадлежащим образом предшествующий проапоптический сигнал для активации исполнительных каспаз, каспазы-3 и каспазы-7.

Так как в большинстве апоптических механизмов неизбежно вовлекается активация прокаспазы-3, предшествующие генетические аномалии эффективно «тормозят» апоптические схемы и, в результате, такие клетки пролиферируют атипично. Принимая во внимание основную роль апоптоза при лечении рака, были предприняты усилия по разработке терапевтических средств, которые нацелены на специфические белки в апоптическом каскаде. Однако, поскольку такие терапевтические средства нацелены на ранние (или от промежуточных до верхних) положений в апоптическом каскаде, то раковые заболевания с мутациями у последующих белков таких представителей могут все же сохранять резистентность в отношении получения возможных благоприятных эффектов таких соединений.

Для терапевтических целей преимуществом было бы идентифицировать низкомолекулярные молекулы, которые непосредственно активируют проапоптический белок, дальше по последовательности развития апоптического каскада. При данном подходе может вовлекаться относительно низкое положение в каскаде, таким образом давая возможность обеспечивать гибель даже тех клеток, которые имеют мутации в своем предшествующем апоптическом механизме. Более того, такие терапевтические стратегии могли бы иметь большую вероятность достижения успеха, если бы такой проапоптический белок находился под повышенной регуляцией в раковых клетках. Таким образом, идентификация низкомолекулярных молекул, которые нацелены на последующий эффекторный белок апоптоза, прокаспазу-3, может значительно способствовать существующей противораковой терапии.

Превращение или активация прокаспазы-3 в каспазу-3 приводит к получению активной формы исполнительной каспазы, которая впоследствии катализирует гидролиз большого количества белковых субстратов. При определенных видах рака уровни прокаспазы-3 повышены относительно уровня в нормальной ткани. Исследование первичных изолятов, взятых у 20 пациентов с раком толстой кишки, выявило, что в среднем повышенная регуляция прокаспазы-3 в таких изолятах в шесть раз превышала уровень относительно соседней нераковой ткани. В дополнение к этому, повышенная регуляция прокаспазы-3 отмечается при определенных нейробластомах, лимфомах и раковых заболеваниях печени. Кроме того, была выполнена систематическая оценка уровней прокаспазы-3 в наборе из 60 клеточных линий, используемом для скрининга в исследовательской программе терапевтических средств Национального института рака. В данном исследовании выявлено, что при определенных раковых заболеваниях легкого, почек, меланомах и видах рака молочной железы отмечаются сильно повышенные уровни экспрессии прокаспазы-3. Благодаря роли активной каспазы-3 для достижения апоптоза могут иметь значительную применимость для таргетной противораковой терапии относительно высокие уровни прокаспазы-3 в некоторых типах раковых клеток и многообещающая супрессия ее аутоактивации, опосредованная безопасным захватом, низкомолекулярные молекулы, которые непосредственно модифицируют прокаспазу-3.

Кроме того, комбинированная терапия приобрела повышенную важность для лечения раковых пациентов. Цель комбинированной терапии заключается в достижении аддитивного или синергического эффекта между химиотерапевтическими средствами, что тем самым способствует сокращению периодов лечения, пониженной токсичности и повышенной выживаемости пациента. Лекарственные средства, которые действуют на единственный биохимический механизм, являются особенно сильными претендентами на синергическое действие или потенциирование, так как они могут имитировать «синтетические летальные» генетические комбинации. Таким образом, существует острая необходимость в более эффективных терапевтических средствах для лечения многих форм рака и новые синергические комбинации противораковых лекарственных средств могут способствовать этой цели. Соответственно, существует необходимость в идентификации новой комбинации цитотоксических агентов, которые эффективны для уничтожения раковых клеток, при этом защищая нормальные хозяйские ткани от нежелательной токсичности цитотоксического агента.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении предложены композиции, которые включают комбинацию из действующих веществ для терапевтического лечения рака. Композиция включает низкомолекулярные лекарственные средства, способные индуцировать гибель раковых клеток. Комбинация лекарственных средств может применяться для различных раковых заболеваний и типов раковых клеток, таких как меланома, рак надпочечников, головного мозга, молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, желчного пузыря, лейкоз, рак печени, рак легкого, лимфома, нейробластома, рак яичника, поджелудочной железы, почки, щитовидной железы, болезнь Эрдгейма-Честера (БЭЧ), гистиоцитоз клеток Лангерганса (ГКЛ) и других известных в данной области. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции взаимодействуют непосредственно или опосредованно с представителями механизма запрограммированной гибели клеток, такими как прокаспаза-3. В различных вариантах реализации изобретения композиции являются избирательными для конкретного типа раковых клеток и могут обладать пониженной нейротоксичностью, по сравнению с другими соединениями, которые взаимодействуют с представителями запрограммированной гибели клеток, такими как прокаспаза-3.

Комбинированная противораковая терапия, описанная в данном документе, может включать лекарственные средства, которые нацелены на различные биохимические механизмы, или лекарственные средства, которые поражают различные мишени в том же механизме, имитируя «синтетические летальные» генетические комбинации. Комбинация активатора прокаспазы-3 РАС-1 и ингибиторов киназы BRAF, которая имеет мутацию V600E, показывает значительную синергию в отношении индуцирования апоптической гибели раковых клеток в намного превышающей аддитивный эффект степени. Комбинация РАС-1 и таких ингибиторов гена/фермента BRAF может эффективно снижать опухолевую нагрузку в моделях опухолей, в которых соединения сами по себе оказывали минимальный эффект или не оказывали эффекта. Данные указывают на значительную эффективность комбинации РАС-1 и таких ингибиторов фермента BRAF для лечения рака и, в более широком смысле, показывают, что эта синергическая комбинация может обеспечивать значительно более выраженные терапевтические выгоды.

Соответственно, в изобретении предложена композиция, содержащая (а) соединение РАС-1:

(b) второе действующее вещество, причем действующее вещество является ингибитором фермента BRAF, имеющим мутацию, и

(c) фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель.

Ингибитор фермента BRAF, имеющего мутацию, может, например, быть вемурафенибом, дабрафенибом, BMS-908662 (Bristol-Myers Squibb), энкорафенибом (LGX818) (Novartis), PLX3603 (RO5212054) (Hofmann-LaRoche), RAF265 (Novartis), сорафенибомили производным, или пролекарством одного из вышеупомянутых действующих веществ. В частности, эффективные ингибиторы фермента BRAF являются ингибиторами фермента BRAF, имеющего мутацию V600E или V600K. Такие ингибиторы включают вемурафениб и дабрафениб. В других вариантах реализации изобретения композиция дополнительно включает ингибитор МЕК, такой как траметиниб. В альтернативном варианте второе действующее вещество (причем действующее вещество является ингибитором фермента BRAF, имеющего мутацию) можно замещать ингибитором МЕК, таким как траметиниб, для обеспечения отличающейся композиции с двумя действующими веществами. В различных вариантах реализации изобретения эти действующие вещества можно вводить пациенту одновременно или последовательно. Носитель для композиции может включать воду и/или необязательные компоненты для преимущественной доставки действующих веществ, такие как буферное вещество, сахар, целлюлоза, цикл о декстрин или их различные комбинации. В одном варианте реализации изобретения циклодекстрин представляет собой 2-гидроксипропил-р-циклодекстрин.

В изобретении также предложен способ ингибирования роста или пролиферации раковых клеток. Данный способ включает приведение в контакт раковых клеток с эффективным количеством композиции, описанной в данном документе, причем композиция может включать одно или оба из РАС-1 (т.е. первое действующее вещество) и одного или более вторых действующих веществ (например, ингибитор фермента BRAF, имеющего мутацию, и/или ингибитор МЕК). Если композиция включает только одно из РАС-1 и второго действующего вещества, способ может включать последующее приведение в контакт раковых клеток с другим (-и) действующим (-и) веществом (-ами). Таким образом, способ также может включать приведение в контакт раковых клеток с эффективным количеством ингибитора МЕК, одновременно или последовательно с РАС-1 и вторым действующим веществом. Приведение в контакт раковых клеток с такими действующими веществами (например, РАС-1 и вторым и/или третьим действующим веществом) эффективно ингибирует рост или пролиферацию раковых клеток.

В изобретении дополнительно предложен способ индуцирования апоптоза в раковых клетках. Способ может включать приведение в контакт раковой клетки с эффективным количеством РАС-1 и эффективным количеством второго и/или третьего действующего вещества, причем в раковой клетке тем самым индуцируется апоптоз. Приведение в контакт может происходить in vitro. В альтернативном варианте приведение в контакт может происходить in vivo. В одном варианте реализации изобретения раковая клетка может приводиться в контакт с РАС-1 и вторым действующим веществом одновременно. В одном варианте реализации изобретения раковая клетка может приводиться в контакт со вторым действующим веществом перед приведением раковой клетки в контакт с РАС-1. В еще одном варианте реализации изобретения раковая клетка может приводиться в контакт с РАС-1 перед приведением раковой клетки в контакт со вторым действующим веществом. Третье действующее вещество (например, ингибитор МЕК) можно вводить с раковой клеткой перед или после РАС-1, и перед или после второго действующего вещества.

В изобретение также предложен способ лечения рака у нуждающегося в этом пациента. Способ включает введение пациенту, одновременно или последовательно, терапевтически эффективного количества соединения РАС-1 и второго действующего вещества, причем действующее вещество представляет собой ингибитор фермента BRAF, имеющего мутацию, например, мутацию V600E или мутацию V600K, при этом тем самым излечивается рак. В определенных конкретных вариантах реализации изобретения второе действующее вещество представляет собой вемурафениб или дабрафениб:

Как обсуждается выше РАС-1 и второе действующее вещество можно вводить одновременно. В другом варианте реализации изобретения РАС-1 и второе действующее вещество можно вводить последовательно. При последовательном введении второе действующее вещество можно вводить перед РАС-1 или второе действующее вещество можно вводить после РАС-1. В дополнительном варианте реализации изобретения пациенту можно вводить терапевтически эффективное количество ингибитора МЕК. Ингибитор МЕК можно вводить одновременно или последовательно применительно к РАС-1 и второму действующему веществу. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения ингибитор МЕК можно вводить перед, одновременно или после либо РАС-1, либо второго действующего вещества.

Рак (или раковые клетки, как обычно происходит), который приводят в контакт или подвергается лечению, может представлять собой, например, меланому, рак надпочечника, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак желчного пузыря, рак печени, рак легкого, лимфому, нейробластому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак почки, рак щитовидной железы, болезнь Эрдгейма-Честера (БЭЧ), гистиоцитоз клеток Лангерганса (ГКЛ) или лейкоз, включая волосатоклеточный лейкоз. Меланома может быть устойчивой к BRAFi меланомой, включая устойчивые к вемурафенибу меланомы. Рак щитовидной железы может быть папиллярным раком щитовидной железы. Рак легкого может быть немелкоклеточным раком легкого (НМКРЛ). В некоторых вариантах реализации изобретения рак может быть раком головного мозга, лимфомой или раковыми клетками в костной ткани. Например, рак может быть глиобластомой или олигодендроглиомой. В другом варианте реализации изобретения раковые клетки могут быть клетками остеосаркомы и такой рак лечат как рак костей. Другие типы раковых клеток, которых можно уничтожать или ингибировать, и другие раковые патологические состояния, которые можно лечить, описаны ниже.

Таким образом, в изобретении предложено применение композиций, описанных в данном документе, для использования в лекарственной терапии. Лекарственная терапия может представлять собой излечение рака, например, меланомы и/или других раковых заболеваний, цитируемых в данном документе. В изобретении также предложено применение композиции, описанной в данном документе, для производства лекарственного средства для лечения заболевания у млекопитающего, например, рака у человека. Лекарственное средство может содержать фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Приведенные ниже чертежи являются частью данного описания и включены для дополнительной иллюстрации определенных вариантов реализации изобретения или различных аспектов данного изобретения. В некоторых примерах, вариантах реализации изобретения можно достичь наилучшего понимания путем рассмотрения сопровождающих графических материалов в комбинации с представленным в данном документе подробным описанием. Данное описание и сопровождающие графические материалы могут подчеркивать определенный конкретный пример или определенный аспект изобретения. Однако специалист в данной области техники поймет, что части примера или аспекта можно использовать в комбинации с другими примерами или аспектами изобретения.

Фиг. 1А-С. Влияние вемурафениба и РАС-1 на линии клеток ^V600EBRAF или ^WTBRAF. (А) Значения IC₅₀ (5 суток) вемурафениба и РАС-1 в наборе из девяти линий клеток. (В) и (С): Линии клеток с ^V600EBRAF обладают значительно большим процентом клеток, претерпевающих апоптоз (оценено окрашиванием аннексина V-FITC/PI) после обработки вемурафенибом (10 мкМ) и РАС-1 (12 мкМ) (В) или вемурафенибом (0,5 мкМ) и РАС-1 (12 мкМ) (С) в течение 24 ч, тогда как эта комбинация оказывала пренебрежимо малое влияние на линии клеток с диким типом BRAF. Штриховые горизонтальные линии представляют уровень гибели клеток, ожидаемый в результате простого аддитивного эффекта этих двух лекарственных средств. Значения указаны в виде среднего значения ± СОС из по меньшей мере трех независимых экспериментов. Р-значения показаны для 2-стороннего взаимодействия для определения того, является ли отличие воздействия комбинации для индукции апоптоза от аддитивного действия (штриховые горизонтальные линии) отдельных лекарственных средств статистически значимым (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).

Фиг. 2А-Е. РАС-1 + вемурафениб проявляет сильную синергию в отношении индукции апоптической гибели и активности каспазы в клетках A375. (А) Показан процент апоптической гибели клеток (оцениваемой по окрашиванию аннексина V/PI и результатам проточной цитометрии), индуцированной после 24 ч обработки. Показанные значения отмечены интенсивностью цвета, где белый представляет низкий % апоптической гибели клеток, а серый представляет высокий % апоптической гибели клеток. (В) Индексы комбинаций (CI) рассчитаны для каждой комбинации с помощью программного обеспечения Combosyn. Значения CI отмечены интенсивностью цвета с наименьшими светло-серыми значениями, а наибольшими - черными. (С) Значительная ферментативная активность каспазы-3/-7 наблюдается в клетках, обработанных комбинацией РАС-1 и вемурафениба. РАС-1 (12 мкМ) и вемурафениб (10 мкМ) сами по себе оказывают очень слабое влияние (р-значения по сравнению с контролем ДМСО > 0,1 во все моменты времени). Активность каспазы-3/-7 в лизатах клеток оценивали с помощью флуорогенного субстрата Ac-DEVD-AFC. Активность выражали как нормализованную по минимальной и максимальной активности, наблюдаемых в данном анализе с 1 мкМ стауроспорина (STS) в качестве положительного контроля. Р-значения показаны для 2-стороннего взаимодействия для определения того, является ли отличие воздействия комбинации от аддитивного действия в указанные моменты времени статистически значимым (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001). (D) РАС-1 (12 мкМ) и вемурафениб (10 мкМ) сами по себе оказывают очень слабое влияние на расщепление PARP-1 в клетках A3 75, но для комбинации посредством вестерн-блота наблюдают существенное расщепление PARP-1. (Е) Через 24 ч наблюдали отсутствие/низкую степень ингибирования фосфорилирование ERK1/2 при низких концентрациях вемурафениба (0,1 мкМ и 0,25 мкМ). При более высоких концентрациях вемурафениба (0,5 мкМ и 1 мкМ) фосфорилирование ERK1/2 эффективно ингибировалось при добавлении РАС-1 или без него, что указывает на влияние РАС-1 на последующие этапы механизма МАРК. Однако расщепленную PARP-1 наблюдали только в клетках, обработанных комбинацией вемурафениб/РАС-1, даже при концентрациях вемурафениба (0,1 и 0,25 мкМ), когда наблюдали неполное ингибирование фосфорилирования ERK1/2. Значения указаны в виде среднего значения ± СОС из по меньшей мере трех экспериментов.

Фиг. 3А-С. Добавление РАС-1 к комбинации вемурафениб + траметиниб проявляет сильную синергию в отношении индукции апоптической гибели и активности каспазы в клетках A375 и UACC-62. (А) Показан процент апоптической гибели клеток после 24 ч обработки. Комбинация траметиниба (100 нМ) и вемурафениба (10 мкМ) приводит к минимальному увеличению популяции апоптических клеток. Добавление РАС-1 (12 мкМ) приводит к кардинальному увеличению популяции апоптических клеток, что выходит за пределы аддитивного эффекта трех действующих веществ. (В) Траметиниб (100 мкМ) и вемурафениб (10 мкМ) в комбинации оказывают очень слабое влияние на расщепление PARP-1 в клетках A375 и UACC-62, но существенное расщепление PARP-1 и снижение уровня прокаспазы-3 наблюдали при добавлении РАС-1 (12 мкМ) посредством вестерн-блота. (С) Комбинация вемурафениба и траметиниба приводит к аддитивному увеличению активности каспазы-3/-7, но добавление РАС-1 приводит к значительному увеличению ферментной активности каспазы-3/-7 в A375 и UACC-62 через 24 ч. РАС-1 (12 мкМ), вемурафениб (10 мкМ) и траметиниб (100 нМ) сами по себе оказывают очень слабое влияние (р-значения по сравнению с контролем ДМСО > 0,1). Активность выражали как нормализованную по положительному контролю. Штриховые горизонтальные линии представляют уровень гибели клеток, ожидаемый в результате простого аддитивного эффекта этих двух лекарственных средств. Значения указаны в виде среднего значения ± СОС из по меньшей мере трех экспериментов. Р-значения показаны для 2-стороннего взаимодействия для определения того, является ли отличие воздействия комбинации для индукции апоптоза от аддитивного действия отдельных лекарственных средств статистически значимым (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).

Фиг. 4А-Е. Комбинация PAC-1 + вемурафениб замедляет опухолевый рост в мышиной модели меланомы подкожного ксенотрансплантата A375. (А) Влияние РАС-1, вемурафениба и их комбинации в модели A375. Мышам, имеющим опухоли, вводили дозы препаратов в течение 15 дней. Мышам вводили дозы РАС-1 один раз в сутки по 100 мг/кг (n=6) посредством в. б. инъекции, вемурафениб - дважды в сутки по 10 мг/кг (n=8) путем (п.о.) или вводили комбинацию PAC-1 + вемурафениб (n=8). Черная линия ниже оси X указывает период времени дозирования для мышей в течение исследования. Объемы опухолей отмечены на графике как среднее значение ± СОС.(В) Значения масс удаленных опухолей. (С) Лизаты опухолей анализировали вестерн-блотом на изменения уровней прокаспазы-3. В качестве контроля нагрузки использовали актин. Количественно определяли интенсивность полос с использованием программы ImageJ. (D) На графике отмечали уровни прокаспазы-3, нормализованные к контролям нагрузки актином. (Е) Процентное содержание позитивных по Ki-67 клеток определяли по иммуногистохимическому окрашиванию образцов опухолей, фиксированных формалином. В каждом образце подсчитывали 2000 клеток для каждой из четырех групп лечения. Р-значения показаны по отношению к контрольным мышам (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).

Фиг. 5A-D. Низкие концентрации РАС-1 (1 мкМ) в экспериментах с долговременным культивированием клеток значительно замедляют возобновление роста клеток в комбинации с вемурафенибом. (А) Сравнение значений E_max в клетках А375, обработанных вемурафенибом и РАС-1. (В) Клетки А375 и SK-MEL-5 обрабатывали РАС-1 (4 мкМ) или вемурафенибом (10 мкМ) в течение 30 дней. (С) Клетки А375 обрабатывали РАС-1 (1 мкМ), вемурафенибом (5 мкМ или 10 мкМ) или их комбинацией. Через 5, 10 или 20 дней лунки фиксировали 10% трихлоруксусной кислотой, окрашивали 0,5% красителем сульфородамином В (SRB) и визуализировали с помощью BioRad GelDoc RX. Не показаны изображения образцов с применением контроля и РАС-1 на день 20, потому что клетки были нежизнеспособны из-за чрезмерного разрастания. (D) Результаты количественного определения (С), при котором краситель SRB растворен в 10 мМ основании Трис при рН 10,4, а поглощение считывается при 510 нм. Скорректированные значения поглощения при 510 нм отмечали на графике по отношению к дням непрерывной обработки путем нормализации по поглощению на день 0 перед началом обработки. Значения указаны в виде среднего значения ± СОС из по меньшей мере трех экспериментов. Выполняли Т-тест для лунок, обработанных только вемурафенибом по сравнению с обработкой вемурафенибом и РАС-1 (1 мкМ). На день 10 только лунки, обработанные вемурафенибом (10 мкМ) и РАС-1 (1 мкМ), показали значимое отличие от обработки одним вемурафенибом (10 мкМ) (р=0,049). На день 20 лунки, как указано, обработанные вемурафенибом (5 или 10 мкМ) и РАС-1 (1 мкМ), показали значимое отличие от обработки вемурафенибом (5 или 10 мкМ) (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).

Фиг. 6A-D. РАС-1 сохраняет активность в устойчивых к вемурафенибу клетках A375VR (А). Вемурафениб значительно менее активный в A375R по сравнению с исходными A375. (В) Обработка 0,5 или 1 мкМ вемурафениба не способна ингибировать фосфорилирование ERK1/2 в A375VR через 2 ч. В тех же условиях наблюдали полное ингибирование фосфорилирования ERK1/2 в исходной линии клеток А375. (С) РАС-1 сохраняет активность в линии клеток A375R. Значения указаны в виде среднего значения ± СОС из по меньшей мере трех независимых экспериментов. (D) Влияние РАС-1, вемурафениба и их комбинации в модели ксенотрансплантата A375VR. Мышам, имеющим опухоли, вводили дозы препаратов в течение 15 дней. Мышам вводили дозы РАС-1 дважды в сутки по 100 мг/кг (n=7) посредством в. б. инъекции, вемурафениб - дважды в сутки по 10 мг/кг (n=5) путем (п.о.) или вводили комбинацию РАС-1 + вемурафениб (n=5). Черная линия выше оси X указывает период времени дозирования для мышей в течение исследования. Объемы опухолей отмечены на графике как среднее значение ± СОС.Р-значения показаны по отношению к контрольным мышам (* р<0,05).

Фиг. 7А-Е. РАС-1 и вемурафениб проявляют сильную синергию в отношении индукции апоптической гибели и активности каспазы в клетках SK-MEL-5. (А) Показан процент апоптической гибели клеток (оцениваемой по окрашиванию аннексина V/PI и результатам проточной цитометрии), индуцированной после 24 ч обработки. Показанные значения отмечены интенсивностью цвета, где белый представляет низкий % апоптической гибели клеток, а серый представляет высокий % апоптической гибели клеток. (В) Индексы комбинаций (CI) рассчитаны для каждой комбинации с помощью программного обеспечения Combosyn. Значения CI отмечены интенсивностью цвета с наименьшими светло-серыми значениями, а наибольшими - черными. (С) Значительная ферментативная активность каспазы-3/-7 наблюдается в клетках, обработанных комбинацией РАС-1 и вемурафениба; РАС-1 (12 мкМ) и вемурафениб (10 мкМ) сами по себе оказывают очень слабое влияние (р-значения по сравнению с контролем ДМСО > 0,1 во все моменты времени). Активность каспазы-3/-7 в лизатах клеток оценивали с помощью флуорогенного субстрата Ac-DEVD-AFC. Активность выражали как нормализованную по минимальной и максимальной активности, наблюдаемых в данном анализе с 1 мкМ стауроспорина (STS) в качестве положительного контроля. (D) РАС-1 (12 мкМ) и вемурафениб (10 мкМ) сами по себе оказывают очень слабое влияние на расщепление PARP-1 в клетках SK-MEL-5, но для комбинации посредством вестерн-блота наблюдают существенное расщепление PARP-1. (Е) Через 24 ч вемурафениб (0,5 мкМ и 1 мкМ) ингибировал фосфорилирование ERK1/2 при добавлении РАС-1 или без него, что указывает на влияние РАС-1 на последующие этапы механизма МАРК. Однако расщепленную PARP-l наблюдали только в клетках, обработанных комбинацией вемурафениб/РАС-1. Значения указаны в виде среднего значения ± СОС из по меньшей мере трех независимых экспериментов. Р-значения показаны для 2-стороннего взаимодействия для определения того, является ли отличие воздействия комбинации от аддитивного действия в указанные моменты времени статистически значимым (* р<0,05, *** р<0,001).

Фиг. 8А-Е. РАС-1 и вемурафениб проявляют сильную синергию в отношении индукции апоптической гибели и активности каспазы в клетках UACC-62. (А) Показан процент апоптической гибели клеток (оцениваемой по окрашиванию аннексина V/PI и результатам проточной цитометрии), индуцированной после 24 ч обработки. Показанные значения отмечены интенсивностью цвета, где белый представляет низкий % апоптической гибели клеток, а серый представляет высокий % апоптической гибели клеток. (В) Индексы комбинаций (CI) рассчитаны для каждой комбинации с помощью программного обеспечения Combosyn. Значения CI отмечены интенсивностью цвета с наименьшими светло-серыми значениями, а наибольшими - черными. (С) Значительная ферментативная активность каспазы-3/-7 наблюдается в клетках, обработанных комбинацией РАС-1 и вемурафениба; РАС-1 (12 мкМ) и вемурафениб (10 мкМ) сами по себе оказывают очень слабое влияние (р-значения по сравнению с контролем ДМСО > 0,1 во все моменты времени). Активность каспазы-3/-7 в лизатах клеток оценивали с помощью флуорогенного субстрата Ac-DEVD-AFC. Активность выражали как нормализованную по минимальной и максимальной активности, наблюдаемых в данном анализе с 1 мкМ STS в качестве положительного контроля. (D) РАС-1 (12 мкМ) и вемурафениб (10 мкМ) сами по себе оказывают очень слабое влияние на расщепление PARP-1 в клетках UACC-62, но для комбинации посредством вестерн-блота наблюдают существенное расщепление PARP-1. (Е) Через 24 ч вемурафениб (0,5 мкМ и 1 мкМ) ингибировал фосфорилирование ERK1/2 при добавлении РАС-1 или без него, что указывает на влияние РАС-1 на последующие этапы механизма МАРК. Минимальное количество расщепленной PARP-1 наблюдали только в обработанных РАС-1 клетках, оно существенно возрастало в клетках, обработанных комбинацией вемурафениб/РАС-1. Значения указаны в виде среднего значения ± СОС из по меньшей мере трех независимых экспериментов. Р-значения показаны для 2-стороннего взаимодействия для определения того, является ли отличие воздействия комбинации от аддитивного действия в указанные моменты времени статистически значимым (*** р<0,001).

Фиг. 9A-D. Влияние РАС-1а (12 мкМ) по сравнению с РАС-1 (12 мкМ) в комбинации с вемурафенибом (30 мкМ) через 24 ч обработки в линиях клеток (А) А375, (В) SK-MEL-5 и (С) UACC-62, как оценивали по графикам аннексии V-FITC/PI. Установленный процент апоптоза нормализован относительно контрольного образца с ДМСО. Штриховые горизонтальные линии представляют уровень гибели клеток, ожидаемый в результате простого аддитивного эффекта этих двух лекарственных средств. (D) РАС-1 (12 мкМ) и вемурафениб (10 мкМ) сами по себе оказывают минимальное влияние на расщепление PARP-l в клетках A375, но увеличенное расщепление PARP-1 наблюдают для комбинации. РАС-1а (12 мкМ) в комбинации с вемурафенибом (10 мкМ) не увеличивает расщепление PARP-1. Значения указаны в виде среднего значения ± СОС из по меньшей мере трех независимых экспериментов. Р-значения показаны для 2-стороннего взаимодействия для определения того, является ли отличие воздействия комбинации для индукции апоптоза от аддитивного действия (штриховые горизонтальные линии) отдельных лекарственных средств статистически значимым (*** р<0,001).

Фиг. 10А-С. Влияние комбинации РАС-1 и вемурафениба в линиях клеток с ^WTBRAF: MIA РаСа-2 (мутантные KRAS и ^WTBRAF) и CHL-1 (^WTKRAS и ^WTBRAF). (А) Наблюдают отсутствие влияния на активацию прокасазы-3 в линиях клеток MIA РаСа-2 и CHL-1 при обработке РАС-1 (12 мкМ) + вемурафениб (30 мкМ). Активность каспазы-3/-7 в лизатах клеток оценивали с помощью флуорогенного субстрата Ac-DEVD-AFC. Активность выражали как нормализованную по минимальной и максимальной активности, наблюдаемых в данном анализе с 1 мкМ STS в качестве положительного контроля. (В) Наблюдают отсутствие влияния на расщепление PARP-1 в клетках MIA РаСа-2 через 24 ч. (D) РАС-1 (12 мкМ) и вемурафениб (30 мкМ) не оказывают влияния на расщепление PARP-1 в клетках CHL-1 через 24 ч обработки. Значения указаны в виде среднего значения ± СОС из по меньшей мере трех независимых экспериментов.

Фиг. 11. Изображения несущих опухоли мышей, которых умерщвляли через 15 дней непрерывного введения доз. Четыре группы лечения: контрольная (n=6, 0 мг/кг РАС-1 и вемурафениба); мыши, получавшие раз в сутки по 100 мг/кг РАС-1 (n=6), два раза в сутки по 10 мг/кг вемурафениба (n=8) и комбинации 100 мг/кг РАС-1 (раз в сутки) и 10 мг/кг вемурафениба (два раза в сутки) (n=8).

Фиг. 12А-В. Добавление РАС-1 (1 мкМ) при долговременном лечении клеток UACC-62 вемурафенибом значительно замедляет возобновление роста клеток. (А) Клетки UACC-62 обрабатывали РАС-1 (1 мкМ), вемурафенибом (5 мкМ или 10 мкМ) или их комбинацией. Среду смывали каждые 2-3 дня и в каждую лунку добавляли новые соединения. Через 5, 10 или 20 дней лунки фиксировали 10% трихлоруксусной кислотой, окрашивали 0,5% красителем сульфородамином В (SRB) и визуализировали с помощью BioRad GelDoc RX. Не показаны изображения образцов с применением контроля и РАС-1 на день 20, потому что клетки были нежизнеспособны из-за чрезмерного разрастания. (В) Результаты количественного определения (А), при котором краситель SRB растворен в 10 мМ основании Трис при рН 10,4, а поглощение считывается при 510 нм. Скорректированные значения поглощения при 510 нм отмечали на графике по отношению к дням непрерывной обработки путем нормализации по поглощению на день 0 перед началом обработки. Значения указаны в виде среднего значения ± СОС из по меньшей мере трех независимых экспериментов. Выполняли 2-сторонний t-тест для лунок, обработанных только вемурафенибом, по сравнению с обработкой вемурафенибом и РАС-1 (1 мкМ). На день 10 только лунки, обработанные вемурафенибом (10 мкМ) и РАС-1 (1 мкМ), показали значимое отличие от обработки одним вемурафенибом (10 мкМ) (р=0,035). На день 20 лунки, как указано на графике, обработанные вемурафенибом (5 или 10 мкМ) и РАС-1 (1 мкМ), показали значимое отличие от обработки вемурафенибом (5 или 10 мкМ) (* р<0,05, *** р<0,001).

Фиг. 13А-С. Влияние комбинации РАС-1 и вемурафениба на клетки A375VR. (А) Показан процент апоптической гибели клеток (оцениваемой по окрашиванию аннексина V/PI и результатам проточной цитометрии), индуцированной после 24 ч обработки. (В) Наблюдали более выраженную апоптическую гибель клеток в (А), чем прогнозировала независимая модель Блисса. Избыточную гибель клеток рассчитывают как [f_{(наблюдаемая, апоптическая)} - (f_{(PAC-l, апоптическая)} + f_{(вемурафениб, апоптическая)} - f_{(PAC-l, апоптическая)} * f_{(вемурафениб, апоптическая)})]*100%. Это указывает на то, что наблюдаемый эффект является скорее синергическим, чем аддитивным. (С) Синергический эффект РАС-1 и вемурафениба в активации апоптоза у A375VR через 24 ч. Этот эффект исчезал, когда использовали неактивный РАС-1а. Штриховые горизонтальные линии представляют уровень гибели клеток, ожидаемый в результате простого аддитивного эффекта этих двух лекарственных средств. Значения указаны в виде среднего значения ± СОС из по меньшей мере трех независимых экспериментов. Р-значения показаны для 2-стороннего взаимодействия для определения того, является ли отличие воздействия комбинации для индукции апоптоза от аддитивного действия (штриховые горизонтальные линии) отдельных лекарственных средств статистически значимым (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Многие раковые заболевания не поддаются стандартной химиотерапии или становятся резистентными к конкретным химиотерапевтическим средствам через некоторый период времени. Комбинированная терапия, описанная в данном документе, дает преимущество в отношении активации прокаспазы-1 при участии РАС-1, которая может быть синергической с химиотерапевтическими свойствами второго действующего вещества, такого как ингибитор фермента BRAF, имеющего мутацию, для обеспечения эффективности в условиях, когда одно из действующих веществ может быть менее эффективным или полностью неэффективным. Эти соединения также могут успешно применяться в целевой противораковой терапии, при которой существуют преимущества избирательности по отношению к гибели раковых клеток со сравнимым снижением нежелательных реакций для нераковых клеток, имеющих более низкие уровни прокаспазы-3. Эти пониженные нежелательные реакции могут включать снижения токсичности, в частности нейротоксичности.

Комбинация соединений, композиций и способов, описанных в данном документе, может действовать посредством модуляции апоптоза или запрограммированной гибели клеток и других химиотерапевтических механизмов, которые должны быть эффективны при лечении рака. В одном варианте реализации изобретения модуляция апоптоза осуществляется индукцией или активацией апоптоза. В различных вариантах реализации изобретения введение соединений может быть параллельным или, в альтернативном варианте, последовательным.

Таким образом в изобретении предложен способ потенциирования действующего вещества с помощью РАС-1, например, для лечения меланомы, колоректального рака, рака щитовидной железы, рака легкого или рака яичника. Вовремя апоптоза посредством протеолиза активируется прокаспаза-3 до каспазы-3, а затем эта активная каспаза-3 расщепляет многочисленные клеточные субстраты, выполняя апоптическую программу. Поскольку уровни белка прокаспазы-3 повышены во множестве опухолевых гистологических проб, опосредованная лекарственным средством прямая активация прокаспазы-3 может быть высокоэффективной в качестве избирательной противораковой стратегии.

Определенные соединения могут усиливать активность и аутосозревание прокаспазы-3, и индуцировать апоптоз раковых клеток. Активирующее прокаспазу соединение-1 (РАС-1) усиливает активность прокаспазы-3 посредством хелатирования ингибирующих ионов цинка, индуцируя апоптоз в культуре раковых клеток и обладая эффективностью во многих мышиных моделях опухолей. Обнаружено, что новые комбинации РАС-1 и ингибиторов фермента BRAF, имеющего мутацию, являются синергически эффективными при обработке раковых клеток, как описано в данном документе. Поскольку РАС-1 действует в апоптическом каскаде позже, то оно уникальным образом способно синергически взаимодействовать с широким диапазоном химиотерапевтических действующих веществ, как описано в данном документе.

Меланома представляет собой наиболее часто встречающееся кожное злокачественное новообразование и при метастазах считается наиболее летальной формой рака кожи. Она является пятым наиболее распространенным раковым заболеванием в США. Одной распространенной мутацией при меланоме является замена валина на глутамат (V600E) в киназном домене белка BRAF (Davies et al., Nature 2002, 417, 949). Мутация V600E конститутивно активирует BRAF и последующий путь передачи сигнала MEK-ERK, приводя к онкогенезу. Обнаружение того, что приблизительно 50% меланом содержат мутацию V600E в белке BRAF, стимулировало разработку ингибиторов ^V600EBRAF и последующее одобрение применения вемурафениба в 2011 г. Ингибиторы ^V600EBRAF, как вемурафениб (и дабрафениб, одобренный в 2013 г. ), приводят к впечатляющему снижению опухолевой нагрузки в течение недель терапии и продлению выживаемости без прогрессирования на период от трех до четырех месяцев.

Несмотря на их первоначальную противомеланомную активность, быстро возникает устойчивость к ингибиторам ^V600EBRAF. В большинстве резистентных опухолей наблюдается реактивация механизма передачи сигнала МАРК, побуждая проводить добавление ингибиторов МЕК 1/2 (например траметиниба) в схему лечения от метастатической меланомы. Предшествующая комбинированная терапия с ингибиторами МЕК 1/2 и ^V600EBRAF является эффективной в замедлении медианного периода времени до возникновения устойчивости от 3,7 до 4,1 месяца у пациентов, которые предварительно не получали лечение ингибитором ^V600EBRAF, но добавление ингибитора МЕК 1/2 для пациентов, которым уже не помогла предварительная терапия только ингибитором ^V600EBRAF, приводит к незначительному улучшению противораковой эффективности. Принимая во внимание текущие клинические ограничения существующих видов терапии, изучаются исследования новых и рационально-обоснованных комбинаций с другими ингибиторами киназ. Несмотря на все современные усилия, развитие резистентности к нацеленным на ^V600EBRAF видам терапии возникает у практически 100% пациентов, проходящих лечение; приобретенная резистентность к лекарственным средствам к этому классу средств остается значительным препятствием для преимуществ, связанных с обеспечением существенного выживания пациентов с метастатической меланомой.

В противоположность многим исследованиям, которые сфокусированы на комбинации вемурафениба с ингибиторами разнообразных и лекарственно-ориентированных киназ, не была всесторонне исследована комбинированная терапия вемурафениба со средствами, которые активируют апоптический механизм. В частности, этот недостаток изучения может объясняться тем фактом, что клетки меланомы обладают множеством дефектов в своих апоптических сигнальных механизмах, придающим им устойчивость ко многим проапоптическим стимулам. Авторы выдвинули гипотезу, что подходящее проапоптическое средство, которое индуцирует нисходящий каскад апоптоза из-за этих апоптических дефектов, должно быть высокосинергическим с ингибиторами ^V600EBRAF.

Принимая во внимание, что искажения апоптических каскадов передачи сигналов в клетках меланомы предшествуют активации прокаспазы-3, лекарственные средства, непосредственно активирующие прокаспазу-3, являются интересными кандидатами для этой комбинированной терапии. В дополнение к этому, благодаря тому, что меланома обладает повышенной экспрессией прокаспазы-3, активатор прокаспазы-3 должен быть сильным и избирательным по отношению к таким клеткам. Кроме того, известно, что ингибиторы ^V600EBRAF индуцируют апоптическую гибель клеток, опосредованную каспазой-3; таким образом, комбинация вемурафениба с непосредственным активатором прокаспазы-3 может приводить к существенно усиленной активности каспазы-3 и гибели раковых клеток относительно влияния любого одиночного средства. РАС-1 представляет собой низкомолекулярную молекулу, которая непосредственно активирует клеточную прокаспазу-3 посредством хелатирования лабильных ингибирующих ионов цинка. _ENREF_24Благодаря сверхэкспрессии прокаспазы-3 при раковых заболеваниях различного происхождения, _ENREF_28РАС-1 и его производные избирательно индуцируют апоптоз в раковых клетках, при этом обходя нераковые клетки. РАС-1 проявляет активность единственного средства во множестве мышиных моделей рака, включая модель ксенотрансплантата меланомы. Важно отметить, что в дополнение к благоприятной доклинической активности в мышиных опухолевых моделях, пациенты-люди с раковым заболеванием получают РАС-1 как часть фазы I клинического испытания с марта 2015 г. (NCT02355535).

Вемурафениб, первый одобренный ингибитор BRAF, является таргетной терапией для пациентов с меланомой, у которых имеется белок V600E BRAF (Bollag et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2012, 11, 873). Лечение вемурафенибом приводит к апоптозу и быстрой регрессии опухоли, продлевая выживаемость без прогрессирования пациентов с белком V600E BRAF на 5,3 месяца (McArthur et al., Lancet Oncol. 2014, 15, 323). Тогда как вемурафениб представляет значительный прогресс в лечении меланомы, появление устойчивости является значительной проблемой в клинике. Комбинированная терапия вемурафениба с ингибитором МЕК клинически исследована в отношении длительности выживаемости без прогрессирования на 3,7 месяцев, но устойчивость неизбежно возрастает из-за реактивации механизма RAF-MEK-ERK (Larkin et al., N. Engl. J. Med. 2014,371, 1867).

О повышенной экспрессии прокаспазы-3, исполнительной каспазы в апоптическом каскаде, сообщалось при различных раковых заболеваниях, включая меланому (Fink et al., Melanoma Res. 2001, 11, 385; Chen et al., Hum. Pathol. 2009, 40, 950). Поэтому активация прокаспазы-3 низкомолекулярной молекулой является привлекательной терапевтической стратегией для меланомы благодаря ключевой роли, которую играет прокаспаза-3 в апоптическом каскаде. Активирующее прокаспазу-3 соединение-1 (РАС-1) представляет собой низкомолекулярную молекулу, которая хелатирует лабильный пул ионов цинка, ингибирующих прокаспазу-3, таким образом примируя раковые клетки на апоптическую гибель (Peterson et al., J. Mol. Biol. 2009, 388, 144). РАС-1 показало эффективность единственного лекарственного средства в модели ксенотрансплантата меланомы, подтверждая потенциальную активацию прокаспазы-3 в качестве противораковой стратегии (Wang et al., Mol. Oncol. 2014, 8, 1640). Принимая во внимание, что РАС-1 примирует клетки на апоптическую гибель и вемурафениб индуцирует апоптоз в раковых клетках, авторы обнаружили, что вемурафениб в комбинации с РАС-1 существенно усиливает терапевтическую эффективность.

Авторы недавно открыли, что РАС-1 показывает превосходную синергию с ингибиторами фермента BRAF, имеющего мутацию V600E, включая вемурафениб (продаваемый как зелбораф), лекарственное средство, которое недавно одобрено для лечения меланомы. На основе данных авторов (см. Фиг. 1-13), РАС-1 будет демонстрировать эквивалентную синергию со всеми лекарственными средствами в этом классе (ингибиторы фермента BRAF, которые имеют мутацию V600E или V600K), которые также включают дабрафениб (торговое название тафинлар) и другие.

В данном документе описана синергическая активность ингибиторов фермента BRAF, имеющего мутацию V600E, таких как вемурафениб, с РАС-1 в усилении апоптической гибели клеток в различных линиях клеток меланомы, содержащих белок V600E BRAF. Важно отметить, что РАС-1 сохраняет активность у резистентной к вемурафенибу линии клеток A375R, указывая на его полезность при меланомах, которые прогрессировали после лечения BRAF-ингибитором.

Определения

Следующие определения включены для обеспечения четкого и цельного понимания данного описания и формулы изобретения. Используемые в данном документе указанные термины имеют следующие значения. Все другие термины и фразы, использованные в данном описании, имеют свои обычные значения, которые могут быть поняты специалистом в данной области техники. Такие обычные значения можно получить, обратившись к техническим словарям, таким как Hawley's Condensed Chemical Dictionary 14^th Edition, by R. J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N. Y., 2001.

Ссылки в описании на «один вариант реализации изобретения», «вариант реализации изобретения» и т.д. указывают на то, что вариант реализации изобретения может включать конкретный аспект, признак, структуру, фрагмент или характеристику, но не каждый вариант реализации изобретения обязательно включает аспект, признак, структуру, фрагмент или характеристику. Более того, такие фразы могут, но не обязательно, относиться к одному и тому же варианту реализации изобретения, относящимся к другим частям описания. Дополнительно, когда конкретный аспект, признак, структура, фрагмент или характеристика описывается в связи с вариантом реализации изобретения, то в компетенции специалиста в данной области техники лежит определение влияния такого аспекта, признака, структуры, фрагмента или характеристики на другие варианты реализации изобретения или связи с ними, независимо от однозначности описания.

Формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если из контекста явно не следует обратное. Таким образом, например, ссылка на «соединение» включает множество таких соединений, так что соединение X включает множество соединений X. Дополнительно следует отметить, что формула изобретения может быть составлена в виде исключения любого необязательного элемента. По существу, это утверждение предназначено для выполнения функции предшествующего основания для применения исключающей терминологии, такой как «лишь», «только» и т.п., в связи с любым описанным в данном документе элементом и/или перечислением элементов формулы изобретения, или применения «отрицательных» ограничений.

Термин «и/или» означает любой одни из объектов, любую комбинацию объектов или все из терминов, с которыми связан данный термин. Фразы «один или более» и «по меньшей мере один» легко понятны специалисту в данной области техники, в частности при прочтении в контексте их применения. Например, фраза может означать один, два, три, четыре, пять, шесть, десять, 100 или любой больший предел, приблизительно в 10, 100 или 1000 раз больше, чем указанный меньший предел. Например, один или более заместителей на фенильном кольце относится к количеству от одного до пяти или от одного до четырех, например, если фенильное кольцо двузамещенное.

Термин «около» может относиться к вариации ±5%, ±10%, ±20% или ±25% от указанного значения. Например, «около 50» процентов, в некоторых вариантах реализации изобретения, может содержать вариацию от 45 до 55 процентов. Для целочисленных диапазонов термин «около» может включать одно или два целых числа, больших и/или меньших указанного целого числа на каждом конце диапазона. Если не указано иное, термин «около» предназначен для включения значений, например, массовых процентных содержаний, приближенных к указанному диапазону, которые эквивалентны применительно к функциональности индивидуального ингредиента, композиции или варианта реализации изобретения. Термин около также может модифицировать крайние точки указанного диапазона, как обсуждается выше в этом параграфе.

Как будет понятно специалисту в данной области, все числа, включающие те, которые выражают количества ингредиентов, свойства, такие как молекулярная масса, условия реакции и т.д., являются приближениями и их следует понимать, как необязательно модифицированные во всех случаях термином «около». Эти значения могут изменяться в зависимости требуемых свойств, которые необходимо получить специалистам в данной области техники, использующим указания описаний данного документа. Также понятно, что такие значения по своей природе содержат вариабельность, неизбежно исходящую из стандартных отклонений, возникших при соответствующих исследуемых измерениях.

Как будет понятно специалисту в данной области техники, любая или все цели, в частности касательно обеспечения письменного описания, все перечисленные в данном документе диапазоны также охватывают любой и все поддиапазоны и комбинации своих поддиапазонов, а также отдельные значения, создавая диапазон, в частности, целочисленных значений. Перечисленный диапазон (например, массовых процентных содержаний или углеродных групп) включает каждое конкретное значение, целое число, десятичное число или принадлежность внутри диапазона. Любой перечисленный диапазон можно легко распознавать как в достаточной степени описывающий и обеспечивающий тот же диапазон, разбитый на по меньшей мере равные половины, трети, четвертые, пятые или десятые части. В качестве неограничивающего примера, каждый диапазон обсуждается в данном документе как легко разбиваемый на нижнюю треть, среднюю треть и верхнюю треть и т.д. Как также будет понятно специалисту в данной области техники, все такие выражения как «вплоть до», «по меньшей мере», «больше чем», «менее чем», «более чем», «или больше» и тому подобные, включают указанное число, и такие термины относятся к диапазонам, которые могут быть впоследствии разбиты на поддиапазоны, как обсуждается выше. Таким же образом все соотношения, перечисленные в данном документе, также включают подсоотношения, попадающие в более широкое соотношение. Соответственно, конкретные значения, указанные для радикалов, заместителей и диапазонов, приводятся только для иллюстрации. Они не исключают другие определенные значения или другие значения из определенных диапазонов для радикалов и заместителей.

Специалист в данной области техники также легко распознает, что такие представители обычным образом сгруппированы вместе, как в группе Маркуша, данное изобретение охватывает не только всю группу, отмечаемую как целую, но и каждого представителя группы по отдельности и все возможные подгруппы основной группы. Дополнительно, во всех смыслах, изобретение охватывает только основную группу, но также в основной группе отсутствует один или более из представителей группы. Поэтому в изобретении предусмотрено явное исключение любого одного или более из представителей указанной группы. Соответственно, для любых из описанных категорий или вариантов реализации изобретения могут применяться оговорки, на основании которых любой один или более из перечисленных элементов, видов или вариантов реализации изобретения, могут исключаться из таких категорий или вариантов реализации изобретения, например, для применения в явном отрицательном ограничении.

Термин «приведение в контакт» относится к воздействию от прикосновения, образования контакта или переносу в непосредственную или тесную близость, включая клеточный или молекулярный уровень, например, обуславливая физиологическую реакцию, химическую реакцию или физическое изменение, например, в растворе, в реакционной смеси, in vitro или in vivo.

«Одновременно» означает (1) одновременно по времени или (2) в различные моменты времени в течение курса обычного графика лечения.

«Последовательно» относится к введению одного действующего вещества, применяемого в способе после введения другого действующего вещества. После введения одного действующего вещества следующее действующее вещество можно вводить практически одновременно с первым или следующее действующее вещество можно вводить после эффективного периода времени после первого действующего вещества. Эффективный период времени представляет собой количество времени, предназначенное для реализации максимальной пользы от введения первого действующего вещества.

«Эффективное количество» относится к количеству, эффективному для лечения заболевания, нарушения и/или патологического состояния, или для осуществления указанного эффекта, такого как активация или ингибирование. Например, эффективное количество может быть количеством, эффективным для снижения прогрессирования или тяжести патологического состояния или симптомов, подлежащих лечению. Определение терапевтически эффективного количества вполне соответствует возможностям специалистов в данной области техники. Термин «эффективное количество» предназначен для включения количества соединения, описанного в данном документе, или количества комбинации соединений, описанных в данном документе, например, которые эффективны для лечения заболевания или нарушения, или для лечения симптома заболевания или нарушения в организме хозяина. Таким образом «эффективное количество», в целом, означает количество, обеспечивающее требуемый эффект.

В одном варианте реализации изобретения эффективное количество относится к количеству действующего вещества, описанного в данном документе, которое является эффективным либо самостоятельно, либо в комбинации с фармацевтическим носителем, при одно- или многодозовом введением в клетку или субъекту, например, пациенту, при ингибировании роста или пролиферации, включая уничтожение или остановку роста гиперпролиферативных клеток. Такое ингибирование роста или уничтожение может выражаться как продолжение выживаемости субъекта, например, пациента сверх ожидаемого периода в отсутствии такого лечения, или любого улучшения при прогнозировании для субъекта, относительно отсутствия такого лечения.

Термин «лечащий», «лечить» или «лечение» включают (i) ингибирование заболевания, патологического или клинического состояния, или прекращение его развития; (ii) облегчение заболевания, патологического или клинического состояния и/или (iii) уменьшение симптомов, связанных с заболеванием, патологическим или клиническим состоянием. Таким образом, термины «лечить», «лечение» и «лечащий» могут включать снижение, остановку или обращение прогрессирования, или тяжести патологического состояния или симптомов, подлежащих лечению. По существу, термин «лечение», соответствующим образом, может включать медицинское и/или терапевтическое ведение. В некоторых вариантах реализации изобретения термин «лечение», «лечить» или «излеченный» может относится к (i) снижению или устранению симптомов, или интересующего заболевания (терапия) или (ii) удалению или разрушению опухоли (излечение).

Термины «ингибировать», «проводить ингибирование» и «ингибирование» относятся к замедлению, остановке или обращению роста, или прогрессирования заболевания, инфекции, патологического состояния или группы клеток. Ингибирование может превышать около 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95% или 99%, например, по сравнению с ростом или прогрессированием, которое происходит в отсутствии лечения или приведения в контакт. Дополнительно, термины «индуцировать», «ингибировать», «потенциировать», «повышать», «увеличивать», «снижать» или подобные отмечают количественные изменения между двумя состояниями и могут относится к по меньшей мере статистически значимым отличиям между этими двумя состояниями. Например, «количество, эффективное для ингибирования роста гиперпоролиферативных клеток» означает, что скорость роста клеток, в некоторых вариантах реализации изобретения, может по меньшей мере статистически значимо отличаться от необработанных клеток. Такие термины могут применяться в данном документе, например, к скоростям пролиферации.

Фраза «ингибирование роста или пролиферации» гиперпоролиферативной клетки, например, неопластической клетки, относится к замедлению, приостановке, прекращению или остановке ее роста или метастазирования и необязательно указывает на полное устранение неопластического роста.

Термин «рак» обычно относится к любой группе из более 100 заболеваний, вызываемых неконтролированным ростом анормальных клеток. Рак может принимать форму солидных опухолей и лимфом, и несолидных раковых новообразований, таких как лейкоз. В отличие от нормальных клеток, которые воспроизводятся до созревания, а затем только при необходимости заменяют поврежденные клетки, раковые клетки могут расти и делиться бесконечно, вытесняя ближайшие клетки и в конце концов распространяясь в другие части организма.

В изобретении предложен способ лечения раковых и злокачественных патологических состояний, и в частности раковых заболеваний, которые несут белок V600E BRAF или белок V600K BRAF. Термин «раковое патологическое состояние» относится к любому состоянию, в котором клетки находятся в анормальном состоянии или патологии, которая характеризуется быстрой пролиферации или неоплазией. Раковое патологическое состояние по своей природе может быть злокачественным или незлокачественным (например, предраковым состоянием). В дальнейшем описания «ракового патологического состояния» могут использоваться термины «гиперпроферативное», «гиперпластическое», «гиперплазия», «злокачественное», «неопластическое» и «неоплазия». Эти термины можно использовать взаимозаменяемо, и они означают включение всех типов гиперпролиферативного роста, гиперпластического роста, раковых видов роста или онкогенных процессов, метастатических тканей или злокачественно трансформированных клеток, тканей или органов, независимо от гистопатологического типа, стадии инвазивности или раковой детерминации (например, злокачественная или незлокачественная).

Термин «неоплазия» относится к росту новых клеток, который приводит к потере восприимчивости к факторам контроля нормального роста, например, неопластический рост клеток. «Гиперплазия» относится к клеткам, осуществляющим аномально высокую скорость роста. Однако эти термины могут применяться взаимозаменяемо, как будет определять их контекст, в целом относясь к клеткам, испытывающим аномальные скорости роста клеток. «Неоплазии» и «гиперплазии» включают опухоли, которые могут быть либо доброкачественной, предзлокачественной опухолью, карциномой in-situ, злокачественной, солидной или несолидной опухолью. Примеры некоторых раковых патологических состояний, которые можно лечить включают, но не ограничиваются ими, рак анального канала, переходно-клеточный рак мочевого пузыря, рак костей, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак желудка, рак головы и шеи, саркому Капоши, лейкоз, рак легкого, такой как бронхогенный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, злокачественную лимфому, нейробластомы, остеогенные карциномы (например рак кости), офтальмологические виды рака (например ретинобластомы и другие раковые заболевания глаза), рак яичника, рак простаты, рак почки, раковые заболевания кожи, такие как меланома, саркомы мягких тканей, рак щитовидной железы и опухоль Вильмса. Другие примеры незлокачественных гиперпролиферативных патологических состояний (например, предраковых патологических состояний), которые входят в объем изобретения, включают, но не ограничиваются ими, аденомы, хондромы, эндохондромы, остеомы, папиллярные опухоли и тому подобные, включая другие раковые заболевания, описанные в данном документе.

Термины «лейкоз» или «лейкозный рак» относится ко всем раковым заболеваниям или неоплазиям гемопоэтической и иммунной системы (кровеносной и лимфатической системы). Эти термины относятся к прогрессирующему злокачественному заболеванию кроветворных органов, отмеченному искаженной пролиферацией и развитием лейкоцитов и их предшественников в крови и костном мозге. Миеломы относятся к другим типам опухолей клеток крови и костного мозга. Лимфомы относятся к опухолям лимфатической ткани. • Примеры лейкоза включают острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), острый лимфобластный лейкоз (О Л Л) и хронический миелогенный лейкоз (ХМ Л).

Как описано в данном документе, композиции и способы изобретения можно использовать для лечения различных неопластических нарушений, включая такие патологические состояния как акральная лентигинозная меланома, актинический кератоз, аденокарцинома, аденоидная кистозная карцинома, аденомы, аденосаркома, аденосквамозная карцинома, астроцитарные опухоли, карцинома бартолиновой железы, базальноклеточная карцинома, карциномы бронхиальных желез, капиллярные карциноиды, карцинома, карциносаркома, кавернозный рак, холангиокарцинома, хондросаркома, папиллома/карцинома хориоидного сплетения, светлоклеточная карцинома, цистаденома, опухоль эндодермального синуса, гиперплазия эндометрия, стромальная саркома эндометрия, эндометриоидная аденокарцинома, эпендимальная эпителиоидная саркома Юинга, фиброламеллярная фокальная нодулярная гиперплазия, гастриома, эмбрионально-клеточные опухоли, глиобластома, глюкагонома, геманнибластомы, гемангиоэндотелиома, гемангиомы, аденома печени, аденоматоз печени, гепатоцеллюлярная карцинома, инсулинома, интраэпителиальная неоплазия, интраэпителиальная сквамозная неоплазия, инвазивная сквамозная карцинома, крупноклеточная карцинома, лейомиосаркома, меланома типа злокачественного лентиго, злокачественная меланома, злокачественные мезотелиальные опухоли, медуллобластома, медуллоэпителиома, меланома, нейробластома, нейроэпителиальная аденокарцинома, нодулярная меланома, овсяноклеточный рак, олигодендроглиальная остеосаркома, панкреатический полипептид, папиллярная серозная аденокарцинома, опухоли гипофизарной шишковидной клетки, плазмацитома, псевдосаркома, легочная бластома, почечноклеточный рак, ретинобластома, рабдомиосаркома, саркома, серозная карцинома, мелкоклеточная карцинома, карциномы мягких тканей, секретирующая соматостатин опухоль, сквамозная карцинома, сквамозноклеточная карцинома, субмезотелиальная поверхностная распространяющаяся меланома, недифференцированная карцинома, увеальная меланома, веррукозная карцинома, випома, хорошо дифференцированная карцинома и опухоль Вильмса. Соответственно, описанные в данном документе композиции и способы можно применять для лечения рака кожи, рака мочевого пузыря, рака головного мозга (включая внутричерепные неоплазмы, такие как глиома, менингиома, нейринома и аденома), рака молочной железы, рака толстой кишки, рака легкого (МРЛ или НМРЛ), рака яичника, рака поджелудочной железы, рака простаты и/или других видов рака, указанных в данном документе.

В некоторых вариантах реализации изобретения комбинация РАС-1 и второго действующего вещества (например, ингибитор фермента BRAF, имеющего мутацию, например, действующее вещество вемурафениб) может быть в частности эффективным для лечения меланомы. Другие раковые заболевания, которые можно лечить включают, но не ограничиваются ими, олигодендроглиомы и глиобластомы, включая мультиформную глиобластому (МФГ). Ткани, поражаемые раковыми клетками, могут находиться в самом головном мозге (например, в черепе или спинномозговом канале) или в лимфатической ткани, в кровеносных сосудах, в черепно-мозговых нервах, в полостях головного мозга (оболочках головного мозга), черепе, гипофизарной железе или шишковидной железе. Конкретные формы рака головного мозга, которые можно лечить, включают астроцитомы, хондромы, хондросаркомы, хордомы, лимфомы ЦНС (центральной нервной системы), краниофарингиомы, эпендимомы, ганглиоглиомы, ганглионейромы (также называемые ганглиоцитомы), глиомы, включая астроцитомы, олигодендроглиомы и эпендимомы, геманглиобластомы (также называемые сосудистые опухоли), примитивные нейроэктодермальные опухоли (ПНЭО), такие как медуллобластомы, менингиомы и вестибулярные шванномы (раннее известные как акустическая нейрома / шваннома).

Комбинацию также можно использовать для лечения метастатических опухолей, которые вторгаются в внутричерепную сферу из раковых образований, возникающих в других органах организма. Эти патологические состояния обычно называются вторичными опухолями головного мозга. Вторичные опухоли головного мозга, которые можно лечить комбинацией РАС-1 и второго действующего вещества, включают метастатические опухоли головного мозга, которые происходят из рак легкого, рака молочной железы, злокачественной меланомы, рака почки, рака толстой кишки и других карцином.

Другие примеры раковых патологических состояний, которые входят в объем изобретения, включают, но не ограничиваются ими, нейробластомы и остеогенные карциномы (например, рак кости или неопластический рост ткани в кости). Примеры злокачественных первичных опухолей костей, которые можно лечить комбинацией РАС-1 и второго действующего вещества, включая остеосаркомы, хондросаркомы, саркому Юинга, фибросаркомы и тому подобные, и вторичные опухоли костей, такие как метастатическиеочаги, которые распространились из других органов, включая карциномы молочной железы, легкого и простаты.

Терапевтические средства и их активность

Активирующее прокаспазу соединение-1 (РАС-1; (2-(4-бензилпиперазин-1-ил)-N-[(2-гирокси-3-проп-2-енил-фенил)метилиденамино]ацетамид) избирательно индуцирует апоптоз в раковых клетках. Способы получения РАС-1 описаны в патенте США №8778945 (Hergenrother et al.). РАС-1 усиливает активность прокаспазы-3 посредством хелатирования ингибирующих ионов цинка, индуцируя апоптоз раковых клеток. РАС-1 может усиливать активность и аутосозревание прокаспазы-3, и индуцировать апоптоз раковых клеток. РАС-1 также усиливает химиотерапевтическую активность ингибиторов фермента BRAF, имеющего мутацию (второе действующее вещество), часто где-либо РАС-1, либо второе действующее вещество самостоятельно менее активно или полностью неактивно.

Неожиданно обнаружено, что РАС-1 и его производные могут действовать синергически по отношению к активности ингибиторов фермента BRAF, имеющего мутацию. Соответственно, в изобретении предложены дополнительные варианты реализации изобретения, в которых действующее вещество РАС-1 в описанных в данном документе композициях может заменяться производным РАС-1, описанным в патенте США №8592584 (Hergenrother et al.) или патенте США №8778945 (Hergenrother et al.), причем патенты включены в данный документ путем ссылки, для предоставления дополнительных композиций по данному изобретению. Одним примером таких производных РАС-1 является SPAC-1 (4-((4-(2-(2-(3-аллил-2-гидроксибензилиден)гидразинил)-2-оксоэтил)пиперазин-1-ил)метил)бензолсульфонамид). РАС-1 и его производные также могут действовать синергически в отношении активности ингибиторов МЕК, таких как траметиниб.

Соответственно, РАС-1 можно комбинировать с ингибитором фермента BRAF, имеющего мутацию, как описано в данном документе, и/или с таким ингибитором МЕК, как траметиниб, комбиметиниб, биниметиниб (МЕК162), селуметиниб, PD-325901, CI-1040, PD035901 или ТАК-733. Ингибиторы МЕК являются лекарственными средствами, которые ингибируют активируемые митогенами протеинкиназные ферменты-киназы МЕК1 и/или МЕК2. Их можно использовать для воздействия на механизм MAPK/ERK, который сверхактивируется при некоторых формах рака.

Количество или концентрация РАС-1 или производного РАС-1 в терапевтической композиции может составлять количество или концентрацию, эффективную для ингибирования роста раковых клеток, для индуцирования апоптоза в раковой клетке или для синергического взаимодействия со вторым действующим веществом. Например, концентрация РАС-1 может составлять от около 0,2 мкМ до около 5 мМ или от около 2 мкМ до около 50 мкМ, как правило, около 2,5 мкМ, около 5 мкМ, около 7,5 мкМ, около 10 мкМ, около 12,5 мкМ, около 15 мкМ, около 20 мкМ, около 25 мкМ, около 30 мкМ, около 40 мкМ или около 50 мкМ, или диапазон между любым из вышеупомянутых значений. Аналогично, концентрации второго действующего вещества (например, ингибиторов фермента BRAF, имеющего мутацию, таких как вемурафениб или дабрафениб) могут составлять от около 1 нМ до около 1 мМ или от около 25 нМ до около 1 мМ, как правило, около 1 нМ, около 2 нМ, около 3 нМ, около 5 нМ, около 10 нМ, около 25 нМ, около 50 нМ, около 100 нМ, около 250 нМ, около 500 нМ, около 750 нМ, около 900 нМ, около 1 мкМ, около 2,5 мкМ, около 5 мкМ, около 7,5 мкМ, около 10 мкМ, около 12,5 мкМ, около 15 мкМ, около 20 мкМ, около 25 мкМ, около 30 мкМ, около 40 мкМ, около 50 мкМ, около 75 мкМ, около 100 мкМ, около 125 мкМ, около 150 мкМ, около 200 мкМ, около 250 мкМ, около 300 мкМ, около 500 мкМ, около 750 мкМ или около 1 мМ, или диапазон между любым из вышеупомянутых значений. Специалист в данной области техники может легко преобразовать количество действующего вещества в дозе конкретной концентрации в количество действующего вещества, например, для применения в твердой лекарственной формы.

Данные различных экспериментов показаны на Фиг. 1-13. РАС-1 и вемурафениб проявляют сильную синергию в отношении индукции апоптической гибели и активности каспазы в клетках меланомы. Существенная активация прокаспазы-3 наблюдается в клетках, обработанных РАС-1 + вемурафениб. Дополнительно, самостоятельно 12 мкМ РАС-1 и 10 мкМ вемурафениб оказывают очень слабое влияние на расщепление PARP-1 в клетках A375, но существенное расщепление PARP наблюдают для их комбинации (посредством вестерн-блота). Кроме того, добавление РАС-1 к комбинации вемурафениба и ингибитора МЕК, траметиниб, существенно усиливает активность каспазы-3 и проапоптическое влияние комбинации. Более того, добавление низких концентраций РАС-1, замедляет возобновление роста раковых клеток после обработки вемурафенибом. РАС-1 также остается действенным против резистентных к вемурафенибу клеток A375VR в культуре клеток и синергически взаимодействует с вемурафенибом для проявления противоопухолевых воздействий на рост клеток A375VR in vivo. Данные авторов указывают, что ингибирование передачи сигнала МАРК с одновременной активацией прокаспазы-3 является эффективной стратегией для усиления противоопухолевой активности вемурафениба и уменьшения развития устойчивости. Соответственно, в изобретении предложен способ преодоления устойчивости к вемурафенибу путем введения РАС-1 в комбинации с терапией вемурафенибом и/или терапии с вемурафенибом/ингибитором МЕК пациентов, болеющих резистентным к вемурафенибу раком.

Способы по данному изобретению

В изобретении предложен способ избирательного индуцирования апоптоза в раковой клетке, включающий введение в раковую клетку комбинации соединений, способных модифицировать молекулу прокаспазы-3 указанной раковой клетки; причем комбинация соединений представляет собой РАС-1 и второе действующее вещество. Предложен также способ избирательного индуцирования апоптоза в раковой клетке, включающий введение в раковую клетку комбинации соединений, способных модифицировать молекулу прокаспазы-3 раковой клетки; причем комбинация соединений представляет собой РАС-1 и второе действующее вещество, например, раковая клетка находится в организме пациента, нуждающегося в лечении.

В изобретении предложены дополнительные способы, в которых указанная комбинация соединений представляет собой РАС-1 и второе действующее вещество, например, в качестве способа лечения раковой клетки, включающего (а) идентификацию потенциальной восприимчивости раковой клетки к лечению соединением-активатором прокаспазы и (b) воздействие на раковую клетку эффективного количества комбинации соединения-активатора прокаспазы и второго действующего вещества. Предложены также способы лечения раковой клетки, включающие (а) идентификацию потенциальной восприимчивости раковой клетки к лечению соединением-активатором прокаспазы и (b) воздействие на указанную раковую клетку эффективного количества РАС-1 и второго действующего вещества; причем РАС-1 способно активировать по меньшей мере одну из прокаспазы-3 и прокаспазы-7. Предложен также способ индуцирования гибели раковой клетки (например, уничтожения раковой клетки), включающий введение в раковую клетку действующего вещества и соединения, способного активировать молекулу прокаспазы-3 раковой клетки; такого как РАС-1.

В изобретении дополнительно предложено лекарственное средство, содержащее эффективное количество комбинации РАС-1 и второго действующего вещества. Лекарственное средство можно использовать в способе индуцирования апоптоза в клетке. В некоторых вариантах реализации изобретения комбинация соединений не проникает через гематоэнцефалический барьер до такой степени, которая вызывает у пациента нейротоксические эффекты. Способ по данному изобретению включает приведение в контакт одной или более клеток с эффективным количеством комбинации соединений, описанной в данном документе, in vivo или in vitro. Таким образом, в изобретении также предложены способы лечения клетки, которые включают приведение в контакт клетки с эффективным количеством комбинации соединений, описанной в данном документе, и лечение пациента, нуждающегося в противораковой терапии, эффективным количеством комбинации соединений, описанной в данном документе.

Как описано в данном документе, в изобретении предложен способ лечения пациента, который имеет опухолевые клетки с повышенным уровнем прокаспазы-3. Способ может включать введение пациенту, имеющему опухолевые клетки с повышенным уровнем прокаспазы-3, терапевтически эффективного количества комбинации РАС-1 и второго действующего вещества, описанной в данном документе, или ее композиции. В изобретении дополнительно предложены способы лечения опухолевых клеток с повышенным уровнем прокаспазы-3, включающие воздействие на опухолевую клетку терапевтически эффективного количества комбинации РАС-1 и второго действующего вещества, описанной в данном документе, причем опухолевая клетка излечивается, уничтожается или ингибируется ее рост. Опухоль или опухолевые клетки могут быть злокачественными опухолевыми клетками. В некоторых вариантах реализации изобретения опухолевые клетки являются клетками меланомы, колоректального рака, рак щитовидной железы, рак легкого или рака яичника.

РАС-1 для введения пациенту можно комбинировать со вторым действующим веществом в унитарной лекарственной форме. Комбинированную терапию можно применять в виде одновременной или последовательной схемы. При последовательном введении комбинацию можно применять в виде двух или трех введений.

Комбинированная терапия может обеспечивать «синергию», т.е. при использовании активных ингредиентов вместе достигаемый эффект оказывается больше, чем сумма эффектов, получаемых в результате применения соединений по отдельности. Синергический эффект может достигаться, когда РАС-1 и второе действующее вещество: (1) приготовлены в одном составе и вводятся или доставляются одновременно в комбинированной лекарственной форме; (2) доставляются поочередно или одновременно в виде отдельных лекарственных форм или (3) по некоторым другим схемам. При доставке в виде поочередной терапии синергический эффект можно достигать, когда соединения вводятся или доставляются последовательно, например, в виде отдельных таблеток, пилюлей или капсул, или различными инъекциями в отдельных шприцах. В целом, во время поочередной терапии эффективная дозировка каждого активного ингредиента может применяться последовательно, т.е. периодически, тогда как в комбинированной терапии эффективные дозировки двух или более активных ингредиентов вводят вместе. Синергический противораковых эффект отмечается как противораковый эффект, который превышает предполагаемые чисто аддитивные эффекты отдельных соединений комбинации. Комбинированная терапия дополнительно описана в патенте США №6833373 (McKearn et al.), который включает дополнительные действующие вещества, которые можно комбинировать с РАС-1, и дополнительные типы рака и других патологических состояний, которых можно лечить с помощью РАС-1.

Соответственно, РАС-1 можно применять в комбинации со вторым действующим веществом для лечения рака. Введение РАС-1 может предшествовать или следовать за вторым действующим веществом через интервалы в диапазоне от минут до недель. В вариантах реализации изобретения, в которых второе действующее вещество и РАС-1 применяют к клетке по отдельности, каждый может в целом убедиться, что между каждой доставкой не прошел значительный период времени, так что действующее вещество и РАС-1 все еще способны проявлять комбинированное влияние на клетку. В таких случаях, например, предполагается, что одно вещество может вступать в контакт с клеткой, тканью или организмом в двух режимах практически одновременно (т.е. в течение менее около нескольких минут). В другом аспекте изобретения второе действующее вещество комбинации может вводиться в пределах около 1 минуты, около 5 минут, около 10 минут, около 20 минут, около 30 минут, около 45 минут, около 60 минут, около 2 часов, около 3 часов, около 4 часов, около 6 часов, около 8 часов, около 9 часов, около 12 часов, около 15 часов, около 18 часов, около 21 часов, около 24 часов, около 28 часов, около 31 часов, около 35 часов, около 38 часов, около 42 часов, около 45 часов или через около 48 часов, или больше, до и/или после введения РАС-1. В определенных других вариантах реализации изобретения второе действующее вещество можно вводить в пределах около 1 дня, около 2 дней, около 3 дней, около 4 дней, около 5 дней, около 6 дней, около 8 дней, около 9 дней, около 12 дней, около 15 дней, около 16 дней, около 18 дней, около 20 дней или около 21 дней, до и/или после введения РАС-1. В некоторых ситуациях может требоваться значительно продлить период времени для лечения, однако, когда между соответствующими введениями проходит несколько недель (например, около 1, около 2, около 3, около 4, около 6 или около 8 недель или больше).

Введение химиотерапевтических композиций изобретения пациенту как правило будет следовать общим протоколам введения химиотерапевтических средств, принимая во внимание токсичность, если она есть. Ожидается, что при необходимости циклы лечения могут повторяться. Предполагается также, что в комбинации с описанными комбинациями могут применяться различные стандартные виды терапии или вспомогательные противораковые терапии, а также хирургическое вмешательство. Эти виды терапии включают, но не ограничиваются ими, химиотерапию, иммунотерапию, генную терапию и хирургическую операцию.

Фармацевтические лекарственные формы

Соединения, описанные в данном документе, можно применять для приготовления терапевтических фармацевтических композиций, например, путем комбинирования соединения с фармацевтически приемлемым разбавителем, наполнителем или носителем. Соединения можно добавлять к носителю в форме соли или сольвата. Например, в случаях, когда соединения достаточно основные или кислотные для образования нетоксических солей кислоты или основания, то может быть подходящим введение соединений в виде солей. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают соли присоединения органических кислот, образованные из кислот, которые образуют физиологически приемлемый анион, например, тозилат, метансульфонат, ацетат, цитрат, малонат, тартрат, сукцинат, бензоат, аскорбат, α-кетоглутарат и β-глицерофосфат.Могут также образовываться пригодные неорганические соли, включая соли гидрохлоридов, галогенидов, сульфатов, нитратов, бикарбонатов и карбонатов.

Фармацевтически приемлемые соли можно получать, используя хорошо известные в данной области техники стандартные процедуры, например, путем проведения реакции достаточно основного соединения, такого как амин, с подходящей кислотой для обеспечения физиологически приемлемого ионного соединения. Аналогичными способами также можно готовить соли карбоновых кислот и щелочных металлов (например, натрия, калия или лития) или щелочноземельных металлов (например, кальция).

Соединения описанных в данном документе формул можно готовить в виде фармацевтических композиций и вводить в различных формах млекопитающему хозяину, такому как пациент-человек. Формы можно специально адаптировать к выбранному пути введения, например, пероральное или парентеральное введение, внутривенному, внутримышечному, местному или подкожному путям.

Описанные в данном документе соединения можно системно вводить в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как инертный разбавитель или усваиваемый пищевой носитель. Для перорального введения соединения можно заключать в капсулы с твердой или мягкой желатиновой оболочкой, прессовать в таблетки или непосредственно вводить в пищу рациона пациента. Соединения также можно объединять с одним или более вспомогательными веществами и использовать в форме таблеток для проглатывания, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и тому подобного. Такие композиции и препараты как правило содержат по меньшей мере 0,1% активного соединения. Процентное содержание композиций и препаратов может изменяться и может традиционно составлять от около 0,5%, до около 60%, от около 1% до около 25% или от около 2% до около 10% от массы данной стандартной лекарственной формы. Количество активного соединения в таких терапевтически пригодных композициях может быть таким, чтобы получать эффективный уровень дозирования.

Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и тому подобное, также могут содержать одно или более из следующего: такие связующие, как трагакантовая камедь, аравийская камедь, кукурузных крахмал или желатин; такие наполнители, как фосфат дикальция; такие разрыхлители, как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и тому подобные и такое смазывающее вещество, как стеарат магния. Можно добавлять такой подсластитель, как сахароза, фруктоза, лактоза или аспартам; или такой ароматизатор, как мятное масло, винтергриновое масло или вишневый ароматизатор. Когда стандартной лекарственной формой является капсула, то она в дополнение к вышеуказанным материалам может содержать такой жидкий носитель, как растительное масло или полиэтиленгликоль. В качестве покрытий или иной модификации физической формы твердой стандартной лекарственной формы могут присутствовать различные другие материалы. К примеру, таблетки, пилюли или капсулы можно покрывать желатином, воском, шеллаком или сахаром и тому подобным. Сироп или эликсир могут содержать активное соединение, сахарозу или фруктозу в качестве подсластителя, метил-и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель или такой ароматизатор, как вишеневый или апельсиновый ароматизатор. Любой применяемый при приготовлении любой стандартной лекарственной формы материал должен быть фармацевтически приемлемым и практически нетоксичным в применяемых количествах. В дополнение к этому активное соединение можно включать в препараты и устройства для замедленного высвобождения.

Активное соединение можно вводить внутривенно или внутрибрюшинно путем вливания или инъекции. Растворы активного соединения или его солей можно готовить в воде, необязательно смешанной с нетоксическим поверхностно-активным веществом. Дисперсии также можно готовить в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, триацетине или их смесях, или в фармацевтически приемлемых маслах. При обычных условиях хранения и применения препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические лекарственные формы, пригодные для инъекции или вливания могут содержать стерильные водные растворы, дисперсии или стерильные порошки, содержащие активный ингредиент, приспособленный для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных или инфузионных растворов, или дисперсий, необязательно инкапсулированных в липосомы. Готовая лекарственная форма должна быть стерильной, жидкой и стабильной в условиях производства, и хранения. Жидкий носитель или разбавитель может представлять собой растворитель или жидкую дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкие полиэтиленгликоли и т.п.), растительные масла, нетоксичные глицериловые сложные эфиры и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем образования липосом, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсий или применением поверхностно-активных веществ. Предупреждение воздействия микроорганизмов можно достигать с помощью различных антибактериальных и/или противогрибковых средств, таких как парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота, тимеросал и т.п.Во многих случаях будет предпочтительным включать в композицию изотонические агенты, например, сахара, буферные вещества или натрия хлорид. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть обеспечена с помощью агентов, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и/или желатина.

Стерильные инъекционные растворы можно готовить путем введения активного соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, необязательно с последующей стерилизацией фильтрованием. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов, способы приготовления могут включать методы вакуумной сушки и лиофилизации, в результате которых получают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный ингредиент, требующий присутствия в растворе.

Пригодные твердые носители включают тонкоизмельченные твердые вещества, такие как тальк, глину, микрокристаллическую целлюлозу, силикагель, глинозем и тому подобное. Пригодные жидкие носители включают воду, диметилсульфоксид (ДМСО), спирты, гликоли или водно-спиртовые/гликолевые смеси, в которых может растворяться или диспергироваться соединение при эффективных уровнях концентрации, необязательно с помощью нетоксических поверхностно-активных веществ. Для оптимизации свойств для данного применения можно добавлять такие адъюванты, как ароматизирующие вещества и дополнительные антимикробные средства. Результирующая жидкая композиция может применяться для абсорбентных вкладок, используемых для импрегнированных бандажей и других повязок, или распыляться на пораженную область с использованием распылителя типа насоса или аэрозольного распылителя. С жидкими носителями также могут применяться такие загустители, как синтетические полимеры, жидкие кислоты, соли и сложные эфиры жирных кислот, жирные спирты, модифицированные целлюлозы или модифицированные минеральные материалы.

Пригодные дозировки действующих веществ, описанных в данном документе, могут определяться сравнением их активности in vitro и активности in vivo в моделях на животных. Способы для экстраполяции эффективных дозировок у мышей и других животных для людей известны в данной области, например, см. патент США №4938949 (Borch et al.). Количество соединения или его активной соли или производного, требуемого для применения будет изменяться не только от конкретного выбранного соединения или соли, но также от пути введения, природы патологического состояния, подлежащего лечению, а также возраста и состояния пациента, и будет в конечном итоге зависеть от усмотрения лечащего врача или клинициста.

Однако, в общем, подходящая доза действующих веществ будет находиться в диапазоне от около 0,5 до около 100 мг/кг, например, от около 10 до около 75 мг/кг массы тела в день, например, от 3 до 50 мг на килограмм массы тела реципиента в день, предпочтительно в диапазоне от 6 до 90 мг/кг/день, наиболее предпочтительно в диапазоне от 15 до 60 мг/кг/день. Соединение может быть традиционно готовиться в единичной лекарственной форме; например, содержащей от 5 мг до 1000 мг, традиционно от 10 мг до 750 мг, традиционнее всего от 50 мг до 500 мг активного ингредиента на единичную лекарственную форму. В некоторых вариантах реализации изобретения дозировка РАС-1 будет составлять около 50-250 мг/кг, около 75-150 мг/кг или около 100 мг/кг. В различных вариантах реализации изобретения дозировка ингибитора гена или фермента BRAF будет составлять около от 0,5 мг/кг до около 25 мг/кг, от около 5 мг/кг до около 15 мг/кг или около 10 мг/кг. Дозировки ингибитора МЕК могут составлять сходные количества для любых из этих действующих веществ или составлять от около половины до около одной десятой количества любого из этих действующих веществ. В одном варианте реализации в изобретении предложена композиция, содержащая действующее вещество или комбинацию действующих веществ, описанную в данном документе, приготовленные в виде одной или более из таких стандартных лекарственных форм.

Требуемая доза может традиционно быть представлена в однократной дозе или в виде разделенных доз, вводимых через соответствующие интервалы, например, в виде двух, трех, четырех или более частей дозы в день. Часть дозы саму по себе можно дополнительно разделять, например, на ряд дискретных произвольно распределенных введений, таких как множественные ингаляции из инсуфлятора или пероральным введением.

Комбинация действующих веществ может традиционно вводиться в виде единичной лекарственной форме, например, содержащей от 100 до 5000 мг/м², от 300 до 4000 мг/м², от 370 до 3700 мг/м², от 50 до 750 мг/м² или от 750 до 4000 мг/м² действующего вещества на единичную лекарственную форму. Каждое действующее вещество, по отдельности или в комбинации, также можно вводить в дозе от около 1 мг/кг до около 250 мг/кг, от около 10 мг/кг до около 100 мг/кг, от около 10 мг/кг до около 50 мг/кг, от около 50 мг/кг до около 100 мг/кг, от около 10 мг/кг до около 50 мг/кг или около 10 мг/кг, около 25 мг/кг, около 50 мг/кг, около 75 мг/кг, около 100 мг/кг или около 150 мг/кг, или в диапазоне от любого одного из вышеупомянутых значений до любого другого из вышеупомянутых значений. Действующее вещество также можно вводить субъекту для обеспечения в плазме равновесной концентрации лекарственных средств, самостоятельно или в комбинации, от около 1 мкмоль/л до около 25 мкмоль/л или около 10 мкмоль/л, или около 15 мкмоль/л.

В некоторых вариантах реализации в изобретении предложено действующее вещество в эффективной концентрации от около 10 нМ до около 100 мкМ. В другом варианте реализации изобретения эффективная концентрация составляет от около 200 нМ до около 50 мкМ, от около 500 нМ до около 40 мкМ, от около 750 нМ до около 25 мкМ, от около 1 мкМ до около 20 мкМ или от около 1 мкМ до около 10 мкМ. В другом варианте реализации изобретения считается, что эффективная концентрация должна иметь такие значения, как концентрация 50% активности при прямом анализе активации прокаспазы, в анализе индукции апоптоза клеток или при клинической терапевтической оценке на животных. В одном варианте реализации изобретения такое значение составляет менее около 200 мкМ. В другом варианте реализации изобретения значение представляет собой менее около 10 мкМ, но более около 10 нМ. Требуемая доза может традиционно быть представлена в однократной дозе или в виде разделенных доз, вводимых через соответствующие интервалы, например, в виде двух, трех, четырех или более частей дозы в день. Часть дозы саму по себе можно дополнительно разделять, например, на ряд дискретных произвольно распределенных введений.

Описанные в данном документе действующие вещества могут быть эффективными противоопухолевыми средствами и иметь более высокую активность и/или пониженную токсичность по сравнению с введением любого из одиночных средств. В изобретении предложены терапевтические способы лечения рака у пациента или субъекта, такого как млекопитающее, которые вовлекают введение млекопитающему, имеющему рак, эффективного количества соединения или композиции, описанных в данном документе. Млекопитающее включает примата, человека, грызуна, собачьих, кошачьих, крупный рогатый скот, овечьих, лошадиных, свиней, коз, коров и тому подобных. Рак относится к различным типам злокачественной неплазии, например, раку толстой кишки, раку молочной железы, меланоме или лейкозу, среди прочих описанных в данном документе, и в общем характеризуются нежелательной клеточной пролиферацией, например, неконтролируемым ростом, отсутствием дифференциации, инвазией соседней ткани и метастазами.

Способность композиции лечить рак может определяться использованием анализов, хорошо известных в данной области техники. Например, известны схемы протоколов лечения, оценки токсичности, анализа данных, количественного определения гибели опухолевых клеток и биологической значимости при применении наборов для скрининга перевиваемых опухолей. В дополнение к этому способность композиции лечить рак может определяться использованием анализов в ссылках и патентных документах, цитируемых в данном документе.

В изобретении также предложены соединения в форме пролекарств. Любое соединение, которое будет превращаться in vivo с обеспечением РАС-1 или другого действующего вещества, цитируемого в данном документе, является пролекарством. В данной области техники хорошо известны многочисленные способы образования пролекарств. Примеры пролекарств и способов их получения, в том числе, можно найти в Design of Prodrugs, edited by H. Bundgaard, (Elsevier, 1985), Methods in Enzymology, Vol.42, at pp.309-396, edited by K. Widder, et. al. (Academic Press, 1985); A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krosgaard-Larsen and H. Bundgaard, Chapter 5, "Design and Application of Prodrugs," by H. Bundgaard, at pp. 113-191, 1991); H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 8, p. 1-38 (1992); H. Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.77, p.285 (1988) и Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392).

В дополнение к этому, в некоторых вариантах реализации изобретения РАС-1 можно заменять на производное РАС-1 или другой ингибитор, такой как соединение, описанное в патентах США №7632972 (Hergenrother et al.), 8778945 (Hergenrother et al.) или 8916705 (Hergenrother et al.), публикации патента США №2007/0049602 (Hergenrother et al.), заявке на патент США №12/597287 (Hergenrother et al.) или международной публикации №WO 2014/022858 (Hergenrother et al.), которые включены в данный документ посредством ссылки. Пригодные соединения, способы и методики для противораковой терапии, которые можно применять в комбинации с описанием в данном документе, описаны в вышеупомянутых документах, а также в патентах США №6303329 (Heinrikson et al.), 6403765 (Alnemri), 6878743 (Choong et al.) и 7041784 (Wang et al.) и публикации патента США №2004/0180828 (Shi).

Методы для выполнения исследований и оценки линий раковых клеток можно выполнять, как описано Putt et al., Nature Chemical Biology2006, 2(10), 543-550; Peterson et al., J. Mol. Biol. 2009, 388, 144-158 и Peterson et al, Cancer Res. 2010, 70(18), 7232-7241.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации вышеуказанного изобретения и их не следует истолковывать как сужающие его объем. Специалист в данной области техники с легкостью поймет, что примеры предполагают множество других способов, с которыми можно практически осуществлять данное изобретение. Следует понимать, что можно сделать многочисленные вариации и модификации, не выходя за пределы объема данного изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Комбинация вемурафениба и активации прокаспазы-3 является синергической для меланом с мутантным BRAF.

Определение пределов устойчивости к вемурафенибу при долговременной эффективности данного лекарственного средства для лечения метастатических меланом с мутацией ^V600EBRAF. Ингибирование последующей передачи сигнала МАРК вемурафенибом индуцирует апоптическую гибель клеток, опосредованную каспазой-3, что дает основание предполагать, что добавление активатора прокаспазы-3 может усиливать противораковые эффекты. Авторы здесь показывают, что комбинация РАС-1, активирующего прокаспазу соединения, и вемурафениба обладает высокой синергией для усиления активности каспазы-3 и апоптической гибели клеток в линиях клеток меланомы с мутацией ^V600EBRAF. Данная комбинация in vivo демонстрирует благоприятный профиль безопасности у мышей и проявляет значимые противоопухолевые эффекты. Авторы дополнительно демонстрируют, что добавление РАС-1 к клинически пригодной комбинации вемурафениба и ингибитора МЕК, траметиниб, резко усиливает активность каспазы-3 и проапоптическое влияние комбинации. Более того, добавление низких концентраций РАС-1 также замедляет возобновление роста клеток после обработки вемурафенибом. Наконец, РАС-1 остается действенным против резистентных к вемурафенибу клеток A375VR в культуре клеток и синергически взаимодействует с вемурафенибом для проявления противоопухолевых воздействий на рост клеток A375VR in vivo. В совокупности, данные авторов указывают, что ингибирование передачи сигнала МАРК с одновременной активацией прокаспазы-3 является эффективной стратегией для усиления противоопухолевой активности вемурафениба и уменьшения развития устойчивости.

Авторы здесь сообщают о синергической активности PAC-1 + вемурафениб и РАС-1 + вемурафениб + траметиниб в отношении усиления активности каспазы-3 и апоптической гибели клеток в меланоме ^V600EBRAF. В результате увеличенная апоптическая гибель клеток, которую индуцирует комбинация PAC-1 + вемурафениб вызывает значимое уменьшение объема опухолей в мышиной модели ксенотрансплантата меланомы ^V600EBRAF, сильно превосходит противоопухолевые эффекты отдельных действующих веществ. В дополнение к этому это усиление апоптической гибели в отношении чувствительной к вемурафенибу меланоме путем добавления РАС-1 значительно задерживает возобновление роста клеток после воздействия вемурафениба. Наконец, РАС-1 сохраняет эффективность в отношении чувствительных к вемурафенибу клеток A375VR в культуре и синергически взаимодействует с вемурафенибом в отношении замедления опухолевого роста этих клеток in vivo, демонстрируя применении этой комбинации в меланомах, которые прогрессировали в отсутствии лечения ингибитором BRAF, для которых в настоящее время доступно только несколько вариантов лечения.

Комбинация РАС-1 и вемурафениба усиливает апоптоз в клетках с мутациями ^V600EBRAF. На наборе из девяти линий клеток различного происхождения и мутационным статусом BRAF вемурафениб является активным (значения IC₅₀ в пределах 200 - 550 нМ) только в линиях клеток с мутацией ^V600EBRAF, что согласуется с раннее сообщенными значениями (Фиг. 1А). Оценка РАС-1 на том же наборе линий клеток показывает, что РАС-1 сохраняет сходную активность во всех линиях клеток (значения IC₅₀ в пределах 1-4 мкМ), независимо от мутационного статуса (Фиг. 1А). Способность комбинации РАС-1 + вемурафениб индуцировать апоптическую гибель клеток затем оценивали на этих линиях клеток. В условиях (24 ч инкубации с соединениями), в которых ни вемурафениб, ни РАС-1 не индуцировали значительной апоптической гибели (≤10%) в качестве единственных средств, комбинация PAC-1 + вемурафениб индуцирует значительный апоптоз (20-45%) в линиях клеток с мутацией ^V600EBRAF (Фиг. 1 В). Сходную тенденцию также наблюдали, когда на линиях клеток ^V600EBRAF проводили оценку более низкой концентрации вемурафениба (0,5 мкМ) в комбинации с РАС-1 (Фиг. 1С). Однако комбинация PAC-1 + вемурафениб не индуцирует синергический апоптоз в линиях клеток с BRAF дикого типа (Фиг. 1В).

РАС-1 и вемурафениб воздействуют синергически в отношении усиления активности каспазы-3 активность и апоптоза в клетках А375, SK-MEL-5 и UACC-62.

С целью более подробного изучения наблюдаемой синергии, апоптическую гибель оценивали на трех линиях клеток меланом ^V600EBRAF с рядом концентраций РАС-1 и вемурафениба, которые индуцировали минимальный апоптоз при использовании в качестве единственных средств. В этих экспериментах наблюдали большие увеличения популяций апоптических клеток (превышающих аддитивное воздействие только одиночных средств) для А375 (Фиг. 2A),SK-MEL-5 (Фиг. 7А)и иАСС-62(Фиг. 8А). Для количественного определения синергии этой комбинации лекарственных средств рассчитывали индексы комбинации (CI). Комбинация лекарственных средств, которая является синергической, будет иметь значение CI менее 1, тогда как значение равное 1 отражает аддитивное воздействие (Chou, Pharmacol Rev 2006;58:621-81). 93% из рассчитанных значений CI оказываются меньше 1 (A375 на Фиг. 2 В, SK-MEL-5 на Фиг. 7 В и UACC-62 на Фиг. 8В), указывая на синергию для комбинации во всех трех исследуемых линиях клеток.

Для оценки увеличения апоптоза в результате увеличенной активации исполнительных прокаспаз, ферментативную активность каспазы-3/-7 оценивали на клетках А375 (после лизиса) с использованием флуорогенного субстрата. В клетках А375, обработанных только вемурафенибом или РАС-1 (в тех же концентрациях, которые использованы на Фиг. 1В), в такие моменты времени и при таких концентрациях наблюдали пренебрежимо малые увеличения активности каспазы-3 (Фиг. 2С). Однако, когда клетки A3 75 обрабатывали РАС-1 и вемурафенибом, наблюдали существенное увеличение активности каспазы-3 уже через 7 ч после обработки (Фиг. 2С). В анализах вестерн-блота ни одно из одиночных средств не оказало влияния на расщепление PARP-l в такие же моменты времени и при таких же концентрациях; тем не менее комбинация приводила к существенному расщеплению PARP-1 (Фиг. 2D) в результате увеличенной активности каспазы-3/-7 в клетках, обработанных комбинацией PAC-1 + вемурафениб. После обработки комбинацией в течение 24 ч наблюдали практически полное расщепление PARP-1 в клетках А375 (Фиг. 2D). Сходные результаты для анализа активности каспазы-3/-7 и расщепления PARP-1 также наблюдали для клеток SK-MEL-5 (Фиг. 7С и 7D) и UACC-62 (Фиг. 8С и 8D).

У производного РАС-1, РАС-1а, отсутствовал хелатирующий ионы цинка мотив, и поэтому оно не активирует прокаспазу-3 или индукцию апоптоза.

Применение РАС-la в комбинации с вемурафенибом не приводило к существенному увеличению пропорции клеток, проходящих апоптоз для клеток A375, SK-MEL-5 или UACC-62 (Фиг. 9А-С). Данный результат также согласуется с отсутствием увеличенного расщепления PARP-1 в клетках, обработанных комбинацией РАС-1а и вемурафениба (Фиг. 9D), указывая на то, что клетки не подвергаются апоптической гибели.

Ингибирование фосфорилирования ERK1/2 и активация прокаспазы-3 требуется для усиления апоптической гибели клеток. В соответствии с данными на Фиг. 1В не наблюдали усиления активности каспазы-3 или расщепления PARP-1 в двух линиях клеток ^WTBRAF при обработке комбинацией PAC-1 + вемурафениб (Фиг. 1А-С). Отсутствие синергии PAC-1 + вемурафениб в линиях клеток с ^WTBRAF, дает основание предполагать, что и ингибирование ERK1/2 и активация прокаспазы-3 требуются для индуцирования кардинального усиления апоптической гибели клеток. Действительно, через 24 ч обработки вемурафенибом не наблюдали ингибирования фосфорилирования ERK1/2 в линии клеток ^WTBRAF даже при высокой концентрации (30 мкМ) вемурафениба (Фиг. 1В и 1С). Данное наблюдение согласуется с предыдущими сообщениями, в которых вемурафениб не ингибирует фосфорилирование ERK1/2 в клетках ^WTBRAF, но парадоксальным образом активирует его.

Для дополнительного исследования этого факта клетки A3 75 (с ^V600EBRAF) обрабатывали РАС-1, вемурафенибом или комбинацией и анализировали на присутствие расщепленной PARP-1 и фосфорилирование ERK1/2. Через 24 ч не наблюдали полосы фocфop-ERKl/2 в клетках, обработанных вемурафенибом (при 0,5 и 1,0 мкМ) и комбинацией (Фиг. 2Е). Однако существенные увеличения количества расщепленной PARP-1 наблюдали только в клетках, обработанных как РАС-1, так и вемурафенибом (Фиг. 2Е). Сходные результаты также наблюдали для клеток SK-MEL-5 (Фиг. 7Е) и UACC-62 (Фиг. 8Е). При низкой концентрации вемурафениба (0,1 и 0,25 мкМ), когда наблюдали неполное ингибирование фосфорилирования ERK1/2, также наблюдали слабое увеличение расщепления PARP-1 над таким расщеплением при воздействии одиночных средств (Фиг. 2Е). Такой результат дает основание предполагать, что даже неполное ингибирование фосфорилирования ERK1/2, активации прокаспазы-3, которые сопровождают передачу сигнала ERK1/2, могут усиливаться при добавлении РАС-1 к обработке вемурафенибом. В своей совокупности данные показывают, что активация прокаспазы-3 посредством РАС-1 кардинально усиливает проапоптическое влияние вемурафениба на линии клеток с мутацией ^V600EBRAF.

Добавление РАС-1 к вемурафенибу и траметинибу усиливает активность каспазы-3 и апоптоз. Добавление такого ингибитора МЕК1/2, как траметиниб, широко используется в клинике для усиления эффективности вемурафениба для меланом ^V600EBRAF. Для изучения влияния РАС-1 с этой комбинацией клетки обрабатывали вемурафенибом+траметиниб в присутствии или отсутствии РАС-1 и оценивали апоптоз. В обеих линиях клеток A375 и UACC-62 совместная обработка вемурафенибом+траметаниб приводила к простым аддитивным увеличениям в популяции апоптических клеток (Фиг. 3А). В противоположность этому добавление РАС-1 приводило к большому увеличению популяций апоптических клеток, превышающему аддитивное воздействие только одиночных средств (Фиг. 3А). Совместная обработка вемурафенибом+траметанибом не приводила к расщеплению PARP-1, тогда как добавление РАС-1 приводило к практически количественному расщеплению PARP-1 (Фиг. 3В). Для изучения того, является ли увеличенная апоптическая гибель клеток в присутствии РАС-1 результатом усиленной ферментативной активности исполнительных каспаз, оценивали активность каспазы-3/-7 клеток A375 и UACC-62, обработанных вемурафенибомом+траметинибом плюс или минус РАС-1. Снова наблюдали кардинальное увеличение активности каспазы-3/-7, когда добавляли РАС-1, эффект, который отсутствовал без добавления РАС-1 (Фиг. 3С).

Комбинация вемурафениба и РАС-1 существенно снижает опухолевую нагрузку в модели ксенотрансплантата А375. Для определения противоопухолевого воздействия комбинации PAC-1+вемурафениб in vivo использовали модель ксенотрансплантата A3 75 (Yadav et al., Mol Cancer Ther 2014;13:2253-63). В этой модели бестимусным мышам подкожно инокулировали клетки A3 75 и давали опухолям вырасти, мышей рандомизированно распределяли на основании объема опухолей в четыре группы [F=0,03<F_{критический}(3,01)] и вводили дозы РАС-1, вемурафениба или их комбинации в течение 15 дней. Лечение одним РАС-1 приводило к минимальному снижению массы и объема опухолей по сравнению с не получавшими лечение мышами (Фиг. 4А и 4В). Мыши, получавшие дозы только вемурафениба, испытывали умеренное снижение (53%; р=0,04) массы и объема опухолей по сравнению с контролем (Фиг. 4А и 4В), 3 из 8 мышей имели сравнимую массу опухолей, как и контрольные мыши (Фиг. 4В). В противоположность этому у мышей, леченных комбинацией РАС-1 и вемурафениба, были существенно меньшие опухолевые нагрузки по сравнению с контрольными мышами (Фиг. 4А, 4В и Фиг. 11). У этих мышей наблюдали 78% снижение объема опухолей (Фиг. 4А, р=0,0008 по сравнению с контролем), 6 из 8 мышей имели опухоли массой менее 0,2 г) (Фиг. 4В), что указывает на то, что РАС-1 дополнительно усиливает противоопухолевые эффекты вемурафениба in vivo и снижает вариабельность в ответ на лечение.

Проверка уровней прокаспазы-3 в образцах опухолей методом вестерн-блота показала поддающееся измерению и согласующееся снижение в количестве прокаспазы-3 только в образцах опухолей, взятых у мышей, получавших комбинированное лечение, по сравнению с вариабельными ответами у других групп дозирования (Фиг. 4С и 4D). Используя иммуногистохимическое окрашивание, наблюдали существенное снижение процентного содержания экспрессирующих Ki-67 клеток в опухолях, обработанных РАС-1+вемурафениб (Фиг. 4Е), что указывает на то, что комбинация PAC-1+вемурафениб способна не только амплифицировать активацию прокаспазы-3, но также ослаблять пролиферацию клеток. Наконец, у мышей, леченных PAC-1+вемурафениб, не наблюдали гематологических признаков токсичности (табл. 1), что указывает на безопасный профиль данной комбинации. В своей совокупности данные in vivo согласуются с результатами культивирования клеток, показывающими, что синергия PAC-1+вемурафениб приводит к увеличению активности каспазы-3 и индукции апоптической гибели клеток, а также снижению пролиферации клеток.

Таблица 1. Гематологическая и биохимическая токсичность РАС-1 и вемурафениба. Средние данные, полученные от 4 мышей, получавших лечение 100 мг/кг РАС-1 раз в день и 10 мг/кг вемурафениба два раза в день в течение 15 дней. Не идентифицировано клинически значимого подтверждения наличия миелосупрессии, повреждения почек или гепатической токсичности. *Значения числа тромбоцитов были снижены из-за наблюдавшегося слипания тромбоцитов. ¹Значения нормального диапазона получены от самок мышей NU/NU лаборатории Charles River возрастом от 8 до 10 недель.

Долговременное лечение РАС-1 предотвращает возобновление роста, а добавление РАС-1 к вемурафенибу задерживает проявление возобновления роста.

Значение Е_max вемурафениба (процент гибели клеток, индуцированной высокими концентрациями соединения) в клетках А375 составляет 96,8±0,3% через 5 дней (Фиг. 5А), указывая, что ~3% клеток A3 75 нечувствительны к вемурафенибу. В тех же условиях РАС-1 имеет значение Е_max 99,4±0,7% (Фиг. 5А), указывая на то, что РАС-1 количественно уничтожает клетки A375 с сохранением очень малого количества нечувствительных клеток. Поэтому авторы выдвигают гипотезу, что долговременное лечение вемурафенибом будет приводить к возобновлению роста раковых клеток, тогда как лечение РАС-1 должно предотвращать возобновление роста. Для исследования этой гипотезы клетки A375 и SK-MEL-5 высаживали при низких плотностях и непрерывно обрабатывали РАС-1 (4 мкМ) или вемурафенибом (10 мкМ) вплоть до 30 дней. В клетках A375 и SK-MEL-5, обработанных вемурафенибом, наблюдали возобновление роста клеток уже через 20 дней (Фиг. 5В). Однако в лунках, обработанных РАС-1, не наблюдали возобновление роста даже после 30 дней (Фиг. 5В). Таким образом, в соответствии с более высоким значением E_max, РАС-1 способно количественно уничтожать клетки, тем самым предотвращая возобновление их роста.

Для исследования того, могут ли низкие концентрации РАС-1 в комбинации с вемурафенибом предотвращать возобновление роста раковых клеток, клетки A375 и UACC-62 высаживали при низких плотностях в 96-луночные планшеты и непрерывно обрабатывали РАС-1 (1 мкМ) или вемурафенибом (5 мкМ или 10 мкМ), или их комбинацией вплоть до 20 дней. Через 5 дней обработки с помощью РАС-1, вемурафениб или комбинации, каждая из них приводила к существенному снижению количества клеток по сравнению с контролем (А375: Фиг. 5С и 5D; UACC-62: Фиг. 12А и 12В). На день 10 не наблюдали различия между обработанными РАС-1 лунками и контролем. В лунках, обработанных 5 мкМ или 10 мкМ вемурафениба гибель клеток составляла, соответственно, 89,4±1,4% и 93,2±1,1%. Однако в лунках, в которых клетки А375 обрабатывали 1 мкМ РАС-1 и 5 мкМ или 10 мкМ вемурафениба, наблюдалась увеличенная гибель клеток, соответственно, 96,1±1,0% и 97,9±0,7%. Впоследствии, для достижения более полной гибели клеток меньшую часть клеток оставляли в лунках, обработанных и РАС-1 и вемурафенибом. Через 20 дней обработки наблюдали существенное возобновление роста колоний в лунках, обработанных только вемурафенибом, но не в лунках, получавших совместную обработку (A375: Фиг. 5С и 5D; UACC-62: Фиг. 12А и 12В). Данных результат указывает на то, что более полная гибель клеток индуцировалась путем совместной обработки клеток с РАС-1, а вемурафениб эффективен в задержке возобновления роста A375 и UACC-62.

РАС-1 синергически взаимодействует с вемурафенибом в отношении резистентной к вемурафенибу меланоме in vivo. Для оценки того, остается ли РАС-1 активным в линии клеток, которая приобрела устойчивость к вемурафенибу, получали резистентную к вемурафенибу линию клеток A375VR путем выращивания исходной линии клеток А375 с последовательно возрастающими концентрациями вемурафениба (0,5 мкМ до 1,0 мкМ) в течение 2 месяцев. Для определения механизма устойчивости A375VR секвенировали гены МЕК1/2, NRAS и АКТ, но обычно сообщаемые мутации, которые могли бы придавать устойчивость обнаружены не были (Rizos et al., Clinical Cancer Research 2014;20:1965-77). Аналогичным образом, также не наблюдали сплайс-вариант мРНК ^V600EBRAF. Посредством кПЦР установлено, что клетки A375VR имеют приблизительно 3-кратный более высокий уровень мРНК MDR1 по сравнению с A375. Однако, по сравнению с 1000-кратными более высокими уровнями мРНК MDR1 в клетках яичника, резистентных к доксорубицину или цисплатину, уровень сверхэкспрессии мРНК MDR1 считается низким, показывая, что устойчивость маловероятно возникает из-за кардинальной повышенной регуляции фенотипа MDR.

Вемурафениб уничтожает линию клеток A375VR со значением IC₅₀ за 5 дней равным 1,5 мкМ, т.е. в 12 раз менее активен по сравнению с чувствительностью исходной А375 (Фиг. 6А). Более того, Е_max вемурафениба для A375VR составляет 79±6,3%, что на 14% ниже, чем у исходной линии клеток А375. При обработке исходных клеток А375 вемурафенибом (0,5 или 1 мкМ) в течение 2 ч приводит к полному ингибированию фосфорилирования ERK1/2, этот эффект не наблюдался у A375VR, что согласуется с устойчивостью A375VR к вемурафенибу и продолжению передачи сигнала МАРК (Фиг. 6В). В противоположность этому, РАС-1 сохраняет активность против A375VR со значением IC₅₀ равным 2,4 мкМ (по сравнению с 1,2 мкМ для исходной линии клеток, Фиг. 6С) и сходным значением Е_max. Авторы выдвинули гипотезу, что несмотря на неспособность вемурафениба ингибировать фосфорилирование ERK1/2 и передачу сигнала МАРК в резистентной линии клеток A375VR, комбинация может сохранять частичную способность проявлять синергическое воздействие, основанное на расщеплении PARP-1, наблюдаемом для обработки PAC-1+вемурафениб даже в условиях неполного ингибирования фосфорилирования ERK1/2 (Фиг. 2Е). Для исследования того, может ли РАС-1 повторно сенсибилизировать клетки A375VR к индуцированному вемурафенибом апоптозу, клетки A375VR обрабатывали РАС-1 в комбинации с низкими концентрациями вемурафениба. Эта обработка комбинацией приводила к увеличению пропорции клеток, претерпевающих апоптоз (Fig. 13А, 13С), указывая на то, что добавление РАС-1 может обходить механизм устойчивости A375VR к вемурафенибу. Данный эффект исчезал при использовании неактивного варианта РАС-1а (Фиг. 13С). Комбинация PAC-1+вемурафениб была синергической, индуцируя в среднем на 7,5% большую популяцию апоптических клеток, чем предполагалось независимой моделью Блисса (Bliss, Ann Appl Biol 1939;26:585-615) (Фиг. 13A и 13В). Наконец, для определения того, может ли РАС-1 синергически действовать с вемурафенибом in vivo, клетки A375VR подкожно имплантировали бестимусным мышам, и мышам ежедневно в течение 15 дней вводили дозы вемурафениба (10 мг/кг), РАС-1 (100 мг/кг) или их комбинации. Обработка самостоятельно вемурафенибом или РАС-1 не выявляет какого-либо противоопухолевого влияния в этой модели in vivo, тогда как обработка комбинацией ведет к существенному снижению объема опухолей по сравнению с необработанным контролем (Фиг. 6D).

Обсуждение. Принимая во внимание, что искажения апоптических каскадов передачи сигналов в клетках меланомы, являются предшествующими активации прокаспазы-3, низкомолекулярные молекулы, непосредственно активирующие прокаспазу-3, могут индуцировать апоптоз путем обхода дефектной апоптической схемы. Раннее показано, что активация прокаспазы-3 с помощью РАС-1 обладает эффективностью единственного средства против клеток меланомы в культуре (Wang et al., Mol Oncol 2014;8:1640-52; Peterson et al., Cancer Res 2010;70:7232-41; Putt et al., Nat Chem Biol 2006;2:543-50), а сейчас авторы показывают, что PAC-1+вемурафениб или РАС-1+вемурафениб+траметиниб проявляют сильную синергию при индукции активности каспазы-3 и апоптической гибели клеток в меланомах с мутацией ^V600EBRAF. Кроме меланом, сообщали, что мутация ^V600EBRAF обнаружена при некоторых других раковых заболеваниях, включая болезнь Эрдгейма-Честера (БЭЧ) (54%), гистиоцитоз клеток Лангерганса (ГКЛ) (57%), немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) (1,5%) и волосатоклеточный лейкоз (100%). В двух недавних исследованиях II фазы сообщали о эффективности вемурафениба при некоторых немеланомных раковых заболеваниях с мутацию ^V600EBRAF, с многообещающими результатами, обнаруженными у пациентов с НМРЛ, БЭЧ, ГКЛ и рефракторным волосатоклеточным лейкозом. Принимая во внимание, эти клинические данные и настоящую работу авторов, показывающую сильную синергию между РАС-1, вемурафенибом и траметинибом в меланомах ^V600EBRAF, эти комбинации РАС-1/лекарственного средства могут быть эффективными при других злокачественных заболеваниях с мутацией ^V600EBRAF.

Параметр Е_max представляет собой подходящий критерий для оценки способности соединения количественно уничтожать раковые клетки в культуре (Fallahi-Sichani et al., Nat Chem Biol 2013;9:708-14). Значения E_max менее 100% подразумевают гетерогенность в способности лекарственного средства уничтожать популяцию раковых клеток. В данном документе авторы показывают, что вемурафениб имеет Е_mах ~97% у мутантных по ^V600EBRAF клетках A375, но значение Е_mах для РАС-1 достигает 100%. Благодаря этому в долговременных экспериментах с РАС-1 не наблюдали возобновления роста А375 или SK-MEL-5. Однако, интенсивное возобновление роста наблюдали через 20 дней для клеток A375, UACC-62 и SK-MEL-5, обработанных только вемурафенибом. При добавлении низкой концентрации РАС-1 (1 мкМ) к вемурафенибу у клеток наблюдали от слабого возобновления роста до его отсутствия. Эти результаты указывают, что добавление низких концентраций РАС-1 (1 мкМ, концентрация РАС-1, которая легко достижима n vivo (Lucas et al., Invest New Drugs 2011;29:901-11)), может быть эффективным для задержки развития устойчивости. Существенное увеличение активности каспазы-3, после массивной индукции апоптоза перед продолжением комбинированой обработки, вероятно уничтожает большую часть клеток, которые первоначально были нечувствительны к вемурафенибу. Впоследствии, остается значительно меньшая остаточная популяция клеток, которые не подвержены действию данной обработки, что крайне важно для задержки возобновления роста клеток.

В настоящее время существует мало вариантов лечения для пациентов, у которых развились резистентные к вемурафенибу меланомы. Ингибитор МЕК1/2, траметиниб, несмотря на одобрение для лечения меланом с мутацией ^V600EBRAF, проявляет ограниченную активность в комбинации с ингибитором BRAF у пациентов, у которых предыдущая терапия не дала результата (Kim et al., J Clin Oncol 2013; 31:482-89). Результаты авторов показывают, что РАС-1 все же сохраняет синергию с вемурафенибом для проявления противоопухолевых эффектов в отношении резистентных к вемурафенибу опухолей. Поэтому добавление РАС-1 может быть конкурентоспособным и альтернативным вариантом лечения для пациентов, меланомы которых прогрессировали после лечения вемурафенибом. Комбинация PAC-1+вемурафениб хорошо переносится, имеет хороший профиль безопасности и проявляет существенные противоопухолевые эффекты in vivo. В настоящее время РАС-1 находится на клиническом исследовании фазы I (NCT02355535), а вемурафениб и траметиниб одобрены как лечение первой линии для меланомы ^V600EBRAF. Таким образом, существует четкий путь для переноса доклинической демонстрации синергии, описанной в этой работе, на клинические исследования, в которых данная новая комбинация может оцениваться на пациентах-людях с раковыми заболеваниями с мутацией ^V600EBRAF.

Материалы и методы

Культура клеток и реактивы. A375 (CRL-1619) и CHL-1 (CRL-9446) приобретали у АТСС, соответственно, 11/5/2014 и 11/18/2014. A375SM предоставил проф. Isiah Fidler (Онкологический центр им. М.Д. Андерсона, Техас) 10/30/2014. Все линии клеток, за исключением B16-F10, Н460 и НСТ 116, культивировали в среде DMEM с добавлением 10% ЭБС (Gemini). B16-F10, Н460 и НСТ 116 культивировали в среде RPMI с 10% ЭБС. Вемурафениб, траметиниб и аннексии V-FITC (10040-02) приобретали, соответственно, у LC Laboratories, MedChemExpress и SouthernBiotech. Следующие антитела приобретали у Cell Signalling Technology: анти-PARP-l (9542), анти-каспаза-3 (9662), анти-β-актин (4967), анти-фосфо-ЕЯК1/2 (Thr202/Tyr204) (4370), анти-ЕRK1/2 (4695) анти-IgG кролика, связанное с HRP (7074). Антитело против расщепленной PARP-1 (аb32561) приобретали у Epitomics. РАС-1 и РАС-1а синтезировали, как сообщали раннее (Putt et al., Nat Chem Biol 2006;2:543-50).

Установление аутентичности линий клеток. Установление аутентичности всех человеческих линий клеток (А375, A375SM, CHL-1, Н460, НСТ 116, MIA РаСа-2, SK-MEL-5 и UACC-62) выполняли с использованием анализа PowerPlex16HS (Promega): изучали 15 аутосомальных локусов, X/Y в центре Genetics Core Университета штата Аризона. Фиксировали результаты исследования и ферограммы. Исследование на наличие микоплазм для линии клеток A375 выполняли с использованием ПЦР для выявления микоплазм в ветеринарной диагностической лаборатории Университета штата Иллинойс.

Анализы пролиферации клеток. Высаживали 1000 - 2000 клеток на лунку 96-луночного планшета и давали им возможность прикрепиться перед добавлением к каждой лунке растворов РАС-1 или вемурафениба в ДМСО. Пролиферацию оценивали анализом с сульфородамином В (SRB). _ENREF_36_ENREF_36_ENREF_21

Анализ проточной цитометрии с аннексином V/PI. В 12-луночные планшеты высаживали 70000 клеток и давали им возможность прикрепиться перед добавлением соединений. Клетки обрабатывали соединениями в течение 24 ч при 37°С, после чего их собирали и ресуспендировали в 450 мкл холодного буферного раствора (10 мМ ГЭПЭС, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ СаСl₂ рН 7,4) предварительно смешанного с красителями аннексии V-ФИТЦ и PI (0,55 мкг/мл). Образцы анализировали на проточном цитометре BD Biosciences LSR II и выполняли анализ данных с использованием FCS Express V3-2.

Анализ активности каспазы-3/7. В 96-луночные планшеты высаживали 5000-8000 клеток и давали им возможность прикрепиться. Клетки обрабатывали 1 мкМ стауроспорина в течение 24 ч или 13 мкМ раптиналя (Palchaudhuri et al., Cell Rep 2015;13:2027-36) в течение 3 ч, в качестве положительного контроля, ДМСО использовали в качестве отрицательного контроля и обрабатывали концентрациями РАС-1 и вемурафениба в течение 0, 2, 4, 7, 10, 12, 16, 20 или 24 ч. Затем планшеты оценивали на активность каспазы-3/7 посредством добавления бифункционального буферного раствора для лизиса и определения активности (200 мМ ГЭПЭС, 400 мМ NaCl, 40 мМ ДТТ, 0,4 мМ ЭДТА, 1% Тритон-Х, рН 7,4) с 20 мкМ Ac-DEVD-AFC (Cayman Chemicals) в качестве флуорогенного субстрата (λ_ex=400 НМ, λ_em=505 нм). Планшеты предварительно инкубировали при 37°С в течение 30 мин в мультимодовом устройстве считывания Synergy (BioTek), а затем проводили считывание в течение 30 мин с интервалами 3 мин. Рассчитывали кривые для каждой лунки. Активность выражали как нормализованную по минимальной и максимальной активности, наблюдаемых в данном анализе.

Анализ устойчивости in vitro. В 96-луночные планшеты высаживали 800 клеток A375 или UACC-62 и в течение ночи давали им возможность прикрепиться. На следующий день в шести технических повторах проводили обработку вемурафенибом (5 или 10 мкМ) или РАС-1 (1 мкМ) в течение 5, 10 и 20 дней. Каждые 2-3 дня добавляли свежую среду и соединения в течение длительности исследования. В конце периода из 5, 10 или 20 дней лунки фиксировали 10% холодной трихлоруксусной кислотой в течение 1 ч при 4°С. Затем лунки промывали, давая возможность высохнуть и окраситься красителем 0,5% SRB в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем лунки промывали 0,1% уксусной кислотой и давали возможность высохнуть. В этот момент получали изображения планшетов с помощью GelDoc XR (BioRad). Наконец, в лунки добавляли 200 мкл 10 мМ основания Трис (рН>10,4) и считывали значение поглощения при 510 нм с использованием SpectraMax Plus (Molecular Devices). Поглощение при 510 нм откладывали на графике в зависимости от дней, прошедших после обработки, как показатель пролиферации клеток с течением времени эксперимента.

Иммуноблоттинг. Клетки и опухолевые ткани лизировали с использованием буферного раствора RIPА, содержащего смесь ингибиторов фосфатаз и протеаз (Calbiochem). Концентрацию белков каждого образца определяли анализом ВСА (Pierce). Лизаты клеток, содержащие 20 мкл белка, наносили на каждую дорожку гелей с градиентами 4-20% (BioRad) для ДСН-ПААГ-электрофореза. Белки переносили на мембрану PDVF для анализа вестерн-блот.

ПЦР и секвенирование. Лизировали клетки A375 и A375VR и экстрагировали РНК с использованием набора RNeasy (Qiagen). Для проведения реакции обратной транскрипции с использованием набора для синтеза кДНК iScript (BioRad) применяли 900 нг РНК. Реакции кПЦР проводили в системе для быстрой ПЦР в реальном времени 7900НТ (Applied Biosystems). Традиционные реакции ПЦР проводили с использованием набора для ПЦР MyFi Mix (Bioline) для 35 циклов и анализировали результат на 1% агарозном геле. Целевые ампликоны экстрагировали в гели и секвенировали в основном подразделении UIUC. Использованные праймеры можно найти в следующей таблице.

Использовали последовательности праймеров для определения характеристик резистентной к вемурафенибу линии A375VR.

Модель ксенотрансплантатов А375 и A375VR. Все исследования на животных выполняли в соответствии с руководствами UIUC IACUC (протокол №14292). В правый бок бестимусных самок мышей (Charles River) возрастом 6-7 (A375) или 5 (A375VR) недель инъецировали 0,1 мл клеток A375 или A375VR в DМЕМ:матригель (Corning) 1:1. В обеих моделях мышей рандомизированно распределяли в четыре группы лечения: контрольная, получавшие 100 мг/кг РАС-1, 10 мг/кг вемурафениба и комбинацию 100 мг/кг РАС-1 и 10 мг/кг вемурафениба (n=8). Выполняли начальные измерения объема опухолей и начинали введение доз в течение 15 дней. Вемурафениб готовили в виде 5% ДМСО с 1% метилцеллюлозы и вводили его два раза ежедневно через желудочный зонд (п.о.). РАС-1 готовили в 200 мг/мл гидроксипропил-β-циклодекстрина при рН 5,5 и вводили путем внутрибрюшинной (в. б.) инъекции. Измерения длины и ширины опухолей выполняли три раза в неделю и рассчитывали объем опухолей как 0,52*L*W². В конце исследования мышей умерщвляли и вырезали опухоли. Опухоли взвешивали и использовали для анализов вестерн-блота и иммуногистохимических анализов.

Иммуногистохимические анализы опухолейА375 и количественное определение индекса Ki-67. Иммуногистохимические (ИГХ) анализы проводили на зафиксированных формалином и залитых парафином опухолях A375 толщиной 4 мм после того как окрашиванием Н&Е подтверждали наличие популяции неопластических клеток наряду с приемлемой целостностью ткани. Для анализа ИГХ использовали антитело против Ki-67 (Biocare Medical, №CRM325) и выполняли визуализацию окрашивания с использованием набора хромогенов IntelliPATH FLX DAB (Biocare Medical, №IPK 5010 G80). Миндалевидную железу человека применяли в качестве положительного контроля ткани. Полимер-негативную контрольную сыворотку (мыши и кролика) (Biocare Medical, №NC499) замещали первичным антителом и использовали в качестве отрицательного контроля. Для количественного определения индекса Ki-67 отсчитывали 2000 неопластических клеток и рассчитывали процент позитивных клеток. В опухолях, которые были слишком малы для подсчета 2000 клеток, считали максимальное количество неопластических клеток. Все микропрепараты просматривал один ветеринар-патолог.

Пример 2. Фармацевтические лекарственные формы.

Следующие лекарственные препараты иллюстрируют репрезентативные фармацевтические лекарственные формы, которые можно применять для терапевтического или профилактического введения соединений комбинаций, описанных в данном документе (например, РАС-1 и второе действующее вещество), или их фармацевтически приемлемых солей или сольватов (в данном документе называются «соединения X», в которых может быть одно действующее вещество или комбинация двух действующих веществ):

Эти лекарственные формы можно готовить традиционными процедурами, хорошо известными в фармацевтической сфере. Следует учитывать, что вышеуказанные фармацевтические композиции могут изменяться в соответствии с хорошо известными фармацевтическими методиками для согласования с различными количествами и типами активного ингредиента (-ов)) «соединения X». Аэрозольный препарат (vi) может использоваться в сочетании со стандартным дозирующим аэрозольным распылителем. В дополнение к этому специальные ингредиенты и пропорции приведены для иллюстративных целей. Ингредиенты можно заменять подходящими эквивалентами (например, компонентами, описанными выше) и можно изменять пропорции в соответствии с требуемыми свойствами интересующей лекарственной формы.

Пример 3. Таблетированные формы

Следующий лекарственный препарат иллюстрирует репрезентативные фармацевтические лекарственные формы, которые можно применять для терапевтического или профилактического введения соединений комбинаций, описанных в данном документе (например, РАС-1 и второе действующее вещество), или их фармацевтически приемлемых солей или сольватов:

Второе действующее вещество может быть, например, вемурафенибом, дабрафенибом, BMS-908662 (также известным как XL281), энкорафенибом (LGX818), PLX3603 (RO5212054) или RAF265 (1-метил-5-[2-[5-(трифторметил)-1Н-имидазол-2-ил]пиридин-4-ил]окси-N-[4-(трифторметил)фенил]-бензимидазол-2-амин). Второе действующее вещество также может быть ингибитором МЕК или комбинацией ингибитора МЕК и одного из вышеупомянутых действующих веществ. Кроме того, для введения ингибитора МЕК (например, в качестве третьего отдельного и последовательного введения действующего вещества) можно применять третью фармацевтическую лекарственную форму, аналогичную таблетке В. Эти лекарственные формы можно готовить традиционными процедурами, хорошо известными в фармацевтической сфере. Следует учитывать, что вышеуказанные фармацевтические композиции могут изменяться в соответствии с хорошо известными фармацевтическими методиками для согласования с различными количествами и типами действующих веществ. В дополнение к этому специальные ингредиенты и пропорции приведены для иллюстративных целей. Ингредиенты можно заменять подходящими эквивалентами (например, компонентами, описанными выше) и можно изменять пропорции в соответствии с требуемыми свойствами интересующей лекарственной формы.

Поскольку конкретные варианты реализации изобретения описаны выше со ссылкой на раскрытые варианты реализации изобретения и примеры, то такие варианты реализации изобретения являются только иллюстративными и не ограничивают объем данного изобретения. Можно выполнять изменения и модификации в соответствии со средними навыками в данной области техники, не отступая от сути изобретения в его более широких аспектах, определенных следующей формулой изобретения.

Все публикации, патенты и патентные документы включены в данный документ путем ссылки, как если бы они были по отдельности включены путем ссылки. Отсутствуют ограничения, не согласующиеся с этим описанием, которые могут быть поняты из него. Изобретение описано со ссылкой на различные конкретные и предпочтительные варианты реализации изобретения и методики. Однако, следует понимать, что можно делать многочисленные вариации и модификации, не выходя за пределы сути и объема данного изобретения.

1. Комбинация для лечения рака, содержащая:

(а) соединение РАС-1:

(b) второе действующее вещество, являющееся ингибитором фермента BRAF, имеющего мутацию, где второе действующее вещество представляет собой вемурафениб, и концентрация вемурафениба составляет от около 0,5 мкМ до около 30 мкМ; и

(c) фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель;

причем концентрация РАС-1 составляет от около 4 мкМ до около 12 мкМ.

2. Комбинация по п. 1, отличающаяся тем, что второе действующее вещество, являющееся ингибитором фермента BRAF, имеющего мутацию, представляет собой ингибитор фермента BRAF, имеющего мутацию V600E или V600K.

3. Комбинация по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ингибитор MEK, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб.

4. Комбинация по п. 1, отличающаяся тем, что носитель содержит воду, буферное вещество, сахар, целлюлозу, циклодекстрин или их комбинацию.

5. Комбинация по п. 3, где концентрация траметиниба составляет около 100 нМ.

6. Способ ингибирования роста или пролиферации раковых клеток, включающий приведение раковых клеток в контакт с эффективным количеством комбинации по п. 1, что тем самым ингибирует рост или пролиферацию раковых клеток.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что раковые клетки являются меланомными клетками, лимфомными клетками, лейкозными клетками, остеосаркомными клетками, клетками рака молочной железы или клетками карциномы яичника.

8. Способ индукции апоптоза в раковой клетке, включающий приведение раковой клетки в контакт с эффективным количеством соединения РАС-1:

и эффективным количеством второго действующего вещества, причем второе действующее вещество представляет собой ингибитор фермента BRAF, имеющего мутацию, где второе действующее вещество представляет собой вемурафениб, и при этом в раковой клетке тем самым индуцируется апоптоз.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что второе действующее вещество представляет собой ингибитор фермента BRAF, имеющего мутацию V600E или V600K.

10. Способ по п. 8 или 9, дополнительно включающий приведение раковой клетки в контакт с эффективным количеством ингибитора MEK, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб.

11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что приведение в контакт осуществляется in vivo.

12. Способ по любому одному из пп. 8-11, отличающийся тем, что раковую клетку приводят в контакт с РАС-1 и вторым действующим веществом одновременно.

13. Способ по любому одному из пп. 8-11, отличающийся тем, что раковую клетку приводят в контакт с РАС-1 перед приведением данной раковой клетки в контакт со вторым действующим веществом.

14. Способ по любому одному из пп. 8-11, отличающийся тем, что раковую клетку приводят в контакт с РАС-1 после приведения данной раковой клетки в контакт со вторым действующим веществом.

15. Способ лечения рака у нуждающегося в этом пациента, включающий введение пациенту, одновременно или последовательно, терапевтически эффективного количества соединения РАС-1:

и эффективного количества второго действующего вещества, причем второе действующее вещество представляет собой ингибитор фермента BRAF, имеющего мутацию, где второе действующее вещество представляет собой вемурафениб, и концентрация вемурафениба составляет от около 0,5 мкМ до около 30 мкМ; при этом концентрация РАС-1 составляет от около 4 мкМ до около 12 мкМ, тем самым осуществляя лечение рака.

16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что второе действующее вещество представляет собой ингибитор фермента BRAF, имеющего мутацию V600E или V600K.

17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что соединение РАС-1 и второе действующее вещество вводят одновременно.

18. Способ по п. 15, отличающийся тем, что соединение РАС-1 и второе действующее вещество вводят последовательно.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что соединение РАС-1 вводят перед вторым действующим веществом.

20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что соединение РАС-1 вводят после второго действующего вещества.

21. Способ по любому одному из пп. 15-20, отличающийся тем, что рак представляет собой меланому, лейкоз, колоректальный рак, рак щитовидной железы, рак легкого, рак яичника, болезнь Эрдгейма-Честера (БЭЧ) или гистиоцитоз клеток Лангерганса (ГКЛ).

22. Способ по любому одному из пп. 15-21, дополнительно включающий введение пациенту, одновременно или последовательно, терапевтически эффективного количества ингибитора MEK, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб.