Модифицированные эпитопы для усиления ответов cd4+ т-клеток

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным пептидам, содержащим T-клеточный эпитоп, и может быть использовано в медицине для лечения, супрессии или предотвращения таких заболеваний, как инфекционные или аллергические заболевания и аутоиммунные заболевания для предотвращения или супрессии отторжения трансплантата, или для уничтожения клеток опухолей. Предложенные модифицированные антигенные пептиды способны индуцировать более сильные ответы CD4+ T-клеток по сравнению с немодифицированными антигенными пептидами. Модификация представляет собой добавление цистеина, вставку цистеина или мутацию до цистеина остатка в положении, соседнем с участком связывания МНС пептида, но вне его. 16 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 7 пр.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к иммуногенным пептидам, содержащим T-клеточный эпитоп. Указанные пептиды модифицируют таким образом, что можно получать ответы CD4+ T-клеток, которые являются намного более сильными, чем ответы CD4+ T-клеток, полученные с такими же пептидами, не содержащими указанную модификацию. В частности, модификация представляет собой добавление цистеина, вставку цистеина или мутацию до цистеина остатка в положении, соседнем с участком связывания МНС пептида, но вне его. Кроме того, описано использование таких модифицированных пептидов в лечении, супрессии или предотвращении таких заболеваний, как инфекционные и аллергические заболевания, и аутоиммунные заболевания для предотвращения или супрессии отторжения трансплантата, или для уничтожения клеток опухолей.

Предпосылки изобретения

Целью вакцинации против патогенов является вызов специфического иммунного ответа, являющегося настолько сильным, насколько возможно. При такой вакцинации используют антигены, обладающие слабой собственной иммуногенностью. Причины такой слабой иммуногенности связаны с большим разнообразием комплексов гистосовместимости в человеческой популяции. Такие комплексы либо класса I для представления CD8+ T-клеткам, либо класса II для представления CD4+ T-клеткам представляют антиген T-клеткам на поверхности специализированных клеток, называемых антигенпредставляющими клетками. Сила, с которой активируются T-клетки, зависит от силы и продолжительности действия синапса, сформированного между антигенпредставляющей клеткой, нагруженной пептидом, полученным после процессирования антигена, и специфическими T-клетками.

Общепринятым способом, которым избегают слабой иммуногенности, является добавление адъюванта. Описано несколько из этих адъювантов от солей алюминия до масляных эмульсий. Механизм, посредством которого адъюванты увеличивают иммуногенность, является неспецифическим и зависит от типа используемого адъюванта. Однако во многих случаях использование адъювантов ограничено из-за воспалительных неблагоприятных эффектов.

Является очень желательным общий способ, посредством которого можно специфически увеличивать иммуногенность вакцинных антигенов. Это относится к вакцинным антигенам для внеклеточных патогенов, таких как бактерии или паразиты, также как к вакцинным антигенам для внутриклеточных патогенов, таких как вирусы.

Иммунные ответы можно супрессировать посредством регуляторных T-клеток. Такие клетки, которые принадлежат к природной подгруппе, проходящей централизованный отбор в тимусе, или к периферическим подгруппам, полученным на периферии посредством встречи с антигеном, используют ряд механизмов для супрессиии иммунных ответов, включая продукцию супрессорных цитокинов, таких как IL-10 или TGF-бета, лишение клеток-мишеней необходимых питательных веществ, таких как аргинин или триптофан, или клеточные контакты. Репертуар природных регуляторных T-клеток является также аутореактивным в результате отбора при представлении аутоантигенов в тимусе. Периферические или индуцированные регуляторные T-клетки формируются и активируются посредством контакта либо с аутоантигенами, либо с аллоантигенами.

Процент антигенспецифических регуляторных T-клеток является очень низким, и эти клетки сложно размножать in vitro. Кроме того, способы размножения таких клеток in vivo являются не очень успешными. Например, введение синтетических пептидов, содержащих эпитопы MHC (главного комплекса гистосовместимости) класса II в отсутствие адъюванта вызывает размножение регуляторных T-клеток, продуцирующих IL-10. При этом известно, что активация и размножение регуляторных T-клеток сильно зависит от костимуляции, а именно, активации антигенпредставляющих клеток в результате поверхностной экспрессии костимулирующих молекул, включая молекулы семейства B7, которые взаимодействуют с поверхностным CD28 на поверхности T-клеток. Мыши, дефицитные по CD28, не продуцируют регуляторные T-клетки и обладают сильно увеличенной встречаемостью аутоиммунных заболеваний.

Таким образом, наиболее необходимым является общий способ, посредством которого иммуногенность вакцинных антигенов, необходимых для размножения регуляторных T-клеток, можно улучшать. Вакцинные антигены в этом контексте включают аутоантигены или аллоантигены.

Многие опухоли экспрессируют антигены, которые могут служить мишенями для терапии. Такие антигены распространяет опухоль, и их представляют иммунной системе хозяина антигенпредставляющие клетки хозяина. Этот процесс, называемый путем непрямого представления антигена, вызывает образование специфических для опухоли CD4+ и CD8+ T-клеток. В большинстве случаев, однако, клетки опухолей не экспрессируют детерминанты MHC класса II, и эффективный иммунный ответ основан только на CD8+ T-клетках, узнающих происходящие из опухоли пептиды, представляемые детерминантами MHC класса I. Это является слабо эффективным, как проиллюстрировано многочисленными попытками усиления специфических для опухолей CD8+ T-клеток с использованием рестрицированных по классу I пептидов (Boon et al. 2006, Ann Rev Immunol. 24, 175-208). Таким образом, необходимы новые способы.

Существуют некоторые предположения, что опухолеспецифические CD4+ T-клетки могут играть роль в отторжении опухоли, даже когда опухоль не экспрессирует детерминанты MHC класса II (Perez-Diez et al. 2007, Blood 15, 5346-5354), что позволяет предполагать непрямой эффект либо на NK-клетки, либо на клетки стромы. Однако не предложено попыток усилить ответ CD4+ T-клеток.

Является очень желательным общий способ, посредством которого специфический ответ CD4+ T-клеток на антигены опухоли, представленные посредством непрямого пути, можно увеличивать. Это относится к опухолям, продуцирующим онкогены или протоонкогены, белки вирусного происхождения, факторы выживания или клонотипические детерминанты.

Общим пробелом в вышеизложенном, таким образом, является обнаружение средства или способ для усиления активации CD4+ T-клеток, которое, в свою очередь, приводит к одному или нескольким из увеличенной функции эффекторным CD4+ T-клеткам, увеличенной функции регуляторным T-клеткам и увеличенной активации CD8+ T-клеткам. CD4+ T-клетки после активации не являются естественным образом цитотоксическими или цитолитическими. Описано, что добавление пептидной метки с окислительно-восстановительной активностью (пептидного мотива «CXXC» или «CXX[S/T]» или «[S/T]XXC») к T-клеточному антигену, естественным образом не содержащему такой метки, превращает CD4+ T-клетки, активированные таким модифицированным T-клеточным антигеном, из не цитолитических в цитолитические CD4+ T-клетки (WO 2008/017517; WO 2009/100505; WO 2009/100204; WO 2009/100205; WO 2009/100206; WO 2009/100207; WO 2009/100208). Ни в одном из этих документов, однако, не описано усиления «нормальной» активации CD4+ T-клеток без перевода не цитолитических в цитолитические CD4+ T-клетки.

Краткое изложение сущности изобретения

Один из аспектов настоящего изобретения относится к выделенным иммуногенным пептидам, содержащим:

a) T-клеточный эпитоп, связывающийся с щелью белка MHC, и

b) последовательность от 1 до 6 аминокислот, которая находится с n-концевой и/или c-концевой стороны эпитопа и содержит остаток цистеина, при условии, что цистеин не встречается в последовательности с мотивом Cxx[CST] или [CST]xxC, когда этот мотив, если встречается, является соседним с эпитопом или отделенным от эпитопа не более, чем 7 аминокислотами,

где указанный выделенный иммуногенный пептид представляет собой искусственный пептид, где последовательность, определенная в части a) и b), отличается от последовательности, как встречается в последовательности дикого типа указанного антигенного белка.

В конкретных вариантах осуществления последовательность, определенная в части b), содержит только один цистеин.

В конкретных вариантах осуществления эпитоп представляет собой эпитоп MCH класса II.

В конкретных вариантах осуществления пептид имеет длину от 9 до 100 аминокислот, от 9 до 50 аминокислот или от 9 до 20 аминокислот.

В других конкретных вариантах осуществления аминокислота цистеин локализована непосредственно с N- или C-конца от эпитопа, без аминокислот между эпитопом и аминокислотой цистеином.

Примерами ассоциированных с заболеваниями T-клеточных эпитопов в контексте настоящего изобретения являются T-клеточные эпитопы инфекционных агентов, T-клеточные эпитопы собственных антигенов, аллергенов, аллофакторов или антигенов аллотрансплантата. Другими примерами ассоциированных с заболеваниями T-клеточных эпитопов являются T-клеточные эпитопы, специфические или предпочтительные для опухоли.

Настоящее изобретение относится к иммуногенным пептидам. В частности, указанные иммуногенные пептиды состоят из:

(i) T-клеточного эпитопа, при условии, что если указанный T-клеточный эпитоп содержит аминокислотные остатки, отличные от аминокислотных остатков, связывающих MHC, и фланкирующие аминокислотные остатки, связывающие MHC, указанные фланкирующие аминокислотные остатки естественным образом не содержат аминокислоту цистеин внутри не более 6 аминокислот, соседних со связывающей MHC областью указанного T-клеточного эпитопа, и не содержат моно- или дицистеиновый окислительно-восстановительный мотив; и

(ii) аминокислоты цистеина в положении вне области связывания МНС T-клеточного эпитопа, где указанную аминокислоту цистеин добавляют к T-клеточному эпитопу или вставляют в T-клеточный эпитоп в указанном положении, или где указанная аминокислота цистеин возникает в результате мутации не являющейся цистеином аминокислоты в указанном положении T-клеточного эпитопа до цистеина.

В иммуногенных пептидах по изобретению указанную аминокислоту цистеин из (ii) можно добавлять к T-клеточному эпитопу или вставлять в T-клеточный эпитоп в положении, отделенном не более 5 аминокислотами от области связывания МНС, или указанная аминокислота цистеин из (ii) может возникать в результате мутации не являющейся цистеином аминокислоты до аминокислоты цистеина в положении, отделенном не более 5 аминокислотами от области связывания МНС.

Более того, в иммуногенных пептидах по изобретению указанная аминокислота цистеин из (ii) может быть отделена от области связывания МНС T-клеточного эпитопа искусственной аминокислотной последовательностью линкера из не более 5 аминокислот.

В любом из иммуногенных пептидов по изобретению указанная аминокислота цистеин может быть локализована непосредственно с N- или С-конца от области связывания МНС.

В любом из иммуногенных пептидов по изобретению указанный, ассоциированный с заболеванием T-клеточный эпитоп включает T-клеточный эпитоп инфекционного агента, собственного антигена, аллергена, аллофактора или антигена аллотрансплантата, или T-клеточный эпитоп, специфический или предпочтительный для опухоли.

Иммуногенные пептиды по изобретению или композиции по изобретению, содержащие такие пептиды, являются пригодными для использования в качестве лекарственного средства. В зависимости от природы T-клеточного эпитопа, содержащегося в иммуногенном пептиде, лекарственное средство, содержащее иммуногенный пептид, можно использовать в качестве лекарственного средства в лечении или предотвращении инфекционного заболевания, в качестве лекарственного средства для лечения, предотвращения или супрессии аутоиммунного заболевания, аллергического заболевания, для предотвращения или супрессии отторжения трансплантата, для предотвращения или супрессии иммунной реакции, нейтрализующей аллофактор, или для лечения, предотвращения или уничтожения опухоли или клеток злокачественных опухолей. Как правило, иммуногенные пептиды по изобретению или композиции по изобретению, содержащие такие пептиды, предназначены для использования в качестве лекарственного средства для индукции эффективного ответа CD4+ T-клеток, которая может приводить к эффективному ответу эффекторных CD4+ T-клеток, к эффективному ответу регуляторных T-клеток и/или к эффективной активации CD8+ T-клеток.

В настоящем документе активация CD8+ T-клеток представляет собой непрямую активацию посредством продукции цитокинов, таких как интерлейкин 2, суперактивированными CD4+ T-клетками.

Другой аспект изобретения относится к способам получения пептида антигенного белка, способного вызывать ответ CD4+ T-клеток, включающим стадии

(a) предоставления пептидной последовательности, состоящей из T-клеточного эпитопа указанного антигенного белка, и

(b) присоединения к пептидной последовательности из (a) последовательности, содержащей остаток цистеина, где остаток цистеина отделен не более, чем 5 аминокислотами от последовательности эпитопа, при условии, что указанный цистеин не встречается в качестве цистеина в последовательности с мотивом [CST]-xx-C или C-xx-[CST], когда такой мотив, если встречается, является соседним с указанной областью связывания MHC или отделен от указанной области связывания MHC не более, чем 7 аминокислотами.

(c) синтеза пептида, содержащего последовательность, как определено на стадиях a) и b).

В настоящем документе последовательность T-клеточного эпитопа в антигенном белке можно определять посредством компьютерных алгоритмов и/или биохимического анализа.

В этом способе пептидную последовательность из части b можно получать посредством модификации аминокислотной последовательности антигенного белка в области не более 6 аминокислот с N-конца или С-конца последовательности эпитопа.

Это можно осуществлять посредством мутации, выбранной из группы, состоящей из введения цистеина, делеции цистеина, который встречается в качестве цистеина в мотиве [CST]-xx-C или C-xx-[CST], и делеции цистеина в одном положении и введения цистеина в другом положении.

Альтернативно, пептидная последовательность из части b может представлять собой искусственную последовательность, не родственную последовательности антигенного белка в области не более 6 аминокислот с N конца или С конца последовательности эпитопа.

Предусмотрено также применение иммуногенных пептидов по изобретению или композиций, содержащих такие пептиды, для получения лекарственного средства для лечения, предотвращения или супрессии аутоиммунного заболевания, аллергического заболевания, для предотвращения или супрессии отторжения трансплантата, для предотвращения или супрессии иммунной реакции, нейтрализующей аллофактор, или для лечения, предотвращения или уничтожения опухоли или клеток злокачественных опухолей.

Подписи к фигурам

Фигура 1. Пролиферация специфического к пептиду Der p2 p21-35 клона CD4+ T-клеток в присутствии наивной антигенпредставляющей клетки, не нагруженной каким-либо пептидом («без пептида») или нагруженной природным пептидом p21-35 («Der p2 p21-35»), или нагруженной пептидом p21-35, где цистеин в положении 21 (N-концевая аминокислота пептида p21-35) заменен посредством мутации на аланин («Der p2 p21-35 Cys21Ala»).

Фигура 2. Рост опухоли NPM-ALK у иммунокомпетентных мышей C57BL/6 без предварительного лечения (треугольники) или после предварительного лечения предварительной иммунизацией T-клеточным антигеном, полученным из белка ALK, где указанный T-клеточный антиген содержит цистеин, соседний с областью связывания МНС T-клеточного антигена (квадраты).

Фигура 3. Скорость пролиферации CD4+ T-клеток, как оценивали по включению тритилированного тимидина, после стимуляции клеток (a) пептидом последовательности GAA EGG WTGPGAGPR (SEQ ID NO:14), соответствующей аминокислотам 1541-1555 белка ALK в его природной последовательности или последовательности дикого типа (wtALK на фигуре) или (b) пептидом последовательности CGG WTGPGAGPR (SEQ ID NO:15), в котором один цистеин добавляли в положении 1544 белка ALK.

Подробное описание изобретения

Определения

Термин «пептид» при применении в настоящем документе относится к молекуле, которая содержит аминокислотную последовательность от 2 до 200 аминокислот, соединенных пептидными связями, но которая может в конкретном варианте осуществления содержать не относящиеся к аминокислотам структуры (подобные, например, присоединенному органическому соединению). Пептиды по изобретению могут содержать любые из общепринятых 20 аминокислот или их модифицированные варианты, или могут содержать неприродные аминокислоты, включенные посредством химического синтеза пептида или посредством химической или ферментативной модификации.

Термин «эпитоп» при применении в настоящем документе относится к одной или нескольким частям (которые могут определять конформационный эпитоп) белка или фактора, которые являются специфически узнаваемыми и связываемыми антителом или его частью (Fab', Fab2' и т.д.), или рецептором, присутствующим на клеточной поверхности лимфоцита В- или T-клетки, и которые являются способными посредством указанного узнавания индуцировать иммунный ответ.

Термин «антиген» при применении в настоящем документе относится к структуре макромолекулы, содержащей один или несколько гаптен(ов) (вызывающих иммунный ответ только при присоединении к носителю) и/или содержащей один или несколько T-клеточных эпитопов. Как правило, указанная макромолекула представляет собой белок или пептид (с полисахаридами или без) или состоит из белковой композиции и содержит один или несколько эпитопов; указанная макромолекула может в настоящем документе альтернативно быть обозначена как «антигенный белок» или «антигенный пептид».

Термин «аллофактор» относится к белку, пептиду или фактору (т.е. любой молекуле), для которой показан полиморфизм при сравнении между 2 индивидуумами одного и того же вида, и, в более общей форме, к любому белку, пептиду или фактору, индуцирующему (аллореактивный) иммунный ответ у субъекта, которому вводят аллофактор.

Термин «эпитоп для T-клетки» или «T-клеточный эпитоп» в контексте настоящего изобретения относится к доминантному, субдоминантному или минорному T-клеточному эпитопу, т.е. части антигенного белка или фактора, специфически узнаваемой и связываемой рецептором на клеточной поверхности T-лимфоцита. Является ли эпитоп доминантным, субдоминантным или минорным, зависит от иммунной реакции, вызываемой против эпитопа. Доминантность зависит от частоты, с которой такие эпитопы являются узнаваемыми T-клетками и способными их активировать среди всех возможных T-клеточных эпитопов белка. В частности, T-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, связываемый молекулами MHC класса I или MHC класса II. T-клеточный эпитоп в белковой последовательности можно идентифицировать посредством функциональных анализов и/или одного или нескольких предсказательных анализов in silico. Аминокислоты в последовательности T-клеточного эпитопа пронумерованы в соответствии с их положением в связывающей бороздке белков MHC. T-клеточный эпитоп, присутствующий в пептидах по изобретению, может состоять из от 8 до 25 аминокислот, из от 8 до 16 аминокислот, или может состоять из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот. T-клеточный эпитоп иммуногенных пептидов по изобретению либо может соответствовать природной последовательности эпитопа белка, либо может представлять собой его модифицированный вариант, при условии, что модифицированный T-клеточный эпитоп сохраняет свою способность связываться внутри щели MHC, подобно природной последовательности T-клеточного эпитопа. Модифицированный T-клеточный эпитоп может обладать такой же аффинностью связывания белка MHC, как природный эпитоп, но может также обладать сниженной аффинностью. В конкретных вариантах осуществления аффинность связывания модифицированного пептида составляет не менее, чем в 10 раз меньше, чем у исходного пептида, более конкретно, не менее, чем в 5 раз меньше.

Термин «MHC» относится к «главному антигену гистосовместимости». У человека гены MHC известны как гены HLA («лейкоцитарных антигенов человека»). Хотя не существует постоянно исполняемого согласования, в некоторых литературных источниках используют HLA для обозначения белковых молекул HLA, и MHC - для обозначения генов, кодирующих белки HLA. Поэтому термины «MHC» и «HLA» представляют собой эквиваленты при применении в настоящем документе. Система HLA у человека имеет эквивалент у мыши, т.е. систему H2. Наиболее интенсивно исследуемыми генами HLA являются так называемые классические гены MHC: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA- DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA и HLA-DRB1. У человека MHC разделен на три области: класс I, II и III. Гены A, B и С принадлежат к MHC класса I, в то время как шесть генов D принадлежат к классу II. Молекулы MHC класса I состоят из одной полиморфной цепи, содержащей 3 домена (альфа 1, 2 и 3), ассоциированной с бета-2-микроглобулином на поверхности клеток. Молекулы класса II состоят из 2 полиморфных цепей, каждая из которых содержит 2 цепи (альфа 1 и 2, и бета 1 и 2).

Молекулы MHC класса I экспрессированы практически на всех ядросодержащих клетках. Пептидные фрагменты, представленные в контексте молекул MHC класса I, узнаются CD8+ T лимфоцитами (цитотоксическими T-лимфоцитами или CTL). CD8+ T-лимфоциты часто созревают до цитотоксических эффекторов, которые могут лизировать клетки, несущие стимулирующий антиген. Молекулы MHC класса II экспрессированы, в первую очередь, на активированных лимфоцитах и антигенпредставляющих клетках. CD4+ T-лимфоциты (хелперные T-лимфоциты или HTL) активируются при узнавании уникального пептидного фрагмента, представленного молекулой MHC класса II, как правило, обнаруживаемой на антигенпредставляющей клетке, такой как макрофаг или дендритная клетка. CD4+ T-лимфоциты пролиферируют и секретируют цитокины, которые либо поддерживают опосредованный антителами ответ посредством продукции IL-4 и IL-10, либо поддерживают опосредованный клетками ответ посредством продукции IL-2 и IFN-гамма.

Функциональные HLA характеризуются глубокой связывающей бороздкой, с которой связываются эндогенные, также как чужеродные, потенциально антигенные пептиды. Бороздка дополнительно характеризуется хорошо определенными формой и физико-химическими свойствами. Связывающие участки HLA класса I являются близкими в том смысле, что концы пептида прижаты в концах бороздки. Они вовлечены также в сеть водородных связей с консервативными остатками HLA. Принимая во внимание эти ограничения, длина связанных пептидов ограничена 8-10 остатками. Однако показано, что пептиды вплоть до 12 аминокислотных остатков также являются способными связывать HLA класса I. Наложение структур различных комплексов HLA подтвердило общий способ связывания, где пептиды принимают относительно линейную, протяженную конформацию.

В отличие от связывающих участков HLA класса I, участки класса II являются открытыми с обоих концов. Это позволяет пептидам продолжаться за действительный участок связывания, таким образом «свешиваясь» с обоих концов. HLA класса II могут, таким образом, связывать пептидные лиганды различной длины в диапазоне от 9 до более 25 аминокислотных остатков. Подобно HLA класса I, аффинность лиганда класса II определяется «константным» и «вариабельным» компонентом. Константная часть снова возникает из сети водородных связей, сформированных между консервативными остатками в бороздке HLA класса II и главной цепью связанного пептида. Однако эта картина водородных связей не присуща N- и С-концевым остаткам пептида, но распространена на протяжении всей цепи. Последнее является важным, поскольку это ограничивает конформацию входящих в комплекс пептидов до строго линейного способа связывания. Это является общим для всех аллотипов класса II. Второй компонент, определяющий аффинность связывания пептида, является вариабельным из-за определенных положений полиморфизма внутри участков связывания класса II. Различные аллотипы формируют различные комплементарные карманы внутри бороздки, таким образом, внося вклад в зависимый от субтипа отбор пептидов, или специфичность. Важно, что ограничения на аминокислотные остатки, удерживаемые внутри карманов класса II, как правило, «мягче», чем для класса I. Существует намного большая перекрестная реакционная способность пептидов среди различных аллотипов HLA класса II. Последовательность из +/- 9 аминокислот T-клеточного эпитопа MHC класса II, соответствующих бороздке молекула МНС II, обычно нумеруют P1-P9. Дополнительные аминокислоты с N-конца от эпитопа нумеруют P-1, P-2 и т.д., аминокислоты с С-конца от эпитопа нумеруют P+1, P+2 и т.д.

Термин «опухолеассоциированный антиген» относится к любому белку, пептиду или антигену, ассоциированному с (несомому, продуцированному, секретированному и т.д.) опухолью или клеткой(клетками) опухоли. Опухолеассоциированные антигены могут являться (почти) исключительно ассоциированными с опухолью или клеткой(клетками) опухоли, а не со здоровыми нормальными клетками или могут являться сверхэкспрессированными (например, в 10 раз, в 100 раз, в 1000 раз или более) в опухоли или клетке(клетках) опухоли по сравнению со здоровыми нормальными клетками. Более конкретно, опухолеассоциированный антиген представляет собой антиген, способный быть представленным (в процессированной форме) посредством детерминант MHC клетки опухоли. Таким образом, опухолеассоциированные антигены, по-видимому, ассоциированы только с опухолями или клетками опухолей, экспрессирующими молекулы MHC. Опухолеассоциированные антигены можно также обозначать как антигены, специфические или предпочтительные для опухоли. T-клеточные эпитопы, содержащиеся в опухолеассоциированном антигене, также обозначают в настоящем документе как T-клеточные эпитопы, специфические или предпочтительные для опухоли.

«Аллерген» определяют как вещество, как правило, макромолекулу или белковую композицию, вызывающие продукцию антител IgE в предрасположенных, в частности, генетически предрасположенных, индивидуумов - пациентов (с атопией).

Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество пептида по изобретению или его производного, которое оказывает желательный терапевтический или профилактический эффект у пациента. Например, по отношению к заболеванию или нарушению оно представляет собой количество, уменьшающее до некоторой степени один или несколько симптомов заболевания или нарушения, и более конкретно, возвращающее к нормальным, частично или полностью, физиологическим или биохимическим параметрам, ассоциированным с заболеванием или нарушением или являющиеся причиной заболевания или нарушения. Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения, терапевтически эффективное количество представляет собой количество пептида по изобретению или его производного, которое может приводить к улучшению или восстановлению нормальной физиологической ситуации. Например, при использовании для терапевтического лечения млекопитающего, пораженного иммунным нарушением, оно представляет собой ежесуточное количество пептида/кг массы тела указанного млекопитающего. Альтернативно, когда введение происходит посредством генотерапии, количество голой ДНК или вирусных векторов корректируют для обеспечения местной продукции соответствующей дозы пептида по изобретению, его производного или гомолога.

Термин «производное» при применении в настоящем документе по отношению к пептидам по изобретению относится к молекулам, которые содержат по меньшей мере активную часть пептида (т.е. способны вызывать активность цитолитических CD4+ T-клеток) и, в дополнение к этому, содержит комплементарную часть, которая может иметь различное назначение, такое как стабилизация пептидов или изменение фармакокинетических или фармакодинамических свойств пептида.

Термины «кодирующий пептид полинуклеотид (или нуклеиновая кислота)» и «полинуклеотид (или нуклеиновая кислота), кодирующий пептид», при применении в настоящем документе относятся к нуклеотидной последовательности, которая при экспрессии в подходящем окружении приводит к образованию соответствующей пептидной последовательности или ее производного или гомолога. Такие полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты включают нормальные последовательности, кодирующие пептид, также как производные и фрагменты этих нуклеиновых кислот, способные экспрессировать пептид с требуемой активностью. Согласно одному из вариантов осуществления, нуклеиновая кислота, кодирующая пептиды по изобретению или их фрагмент, представляет собой последовательность, кодирующую пептид или его фрагмент, происходящий из фрагмента пептида млекопитающего или соответствующий фрагменту пептида млекопитающего, наиболее предпочтительно, человека.

Описание

Как описано выше, добавление 4-аминокислотной пептидной метки с окислительно-восстановительной активностью (мотива «CXXC» или «CXX[S/T]» или «[S/T]XXC») к T-клеточному антигену (и где указанная метка находится вне участка связывания МНС антигена и фланкирует его) превращает CD4+ T-клетку в цитолитическую CD4+ T-клетку после активации. Это превращение в норме не происходит естественным образом, и цитолитические клетки, индуцированные в ходе природного иммунного ответа, являются ограниченными цитолитическими CD8+ T-клетками. В дальнейшей работе, исследующей вышеописанную систему и приведшей к настоящему изобретению, обнаружено, что когда окислительно-восстановительную активность пептидной метки, добавленной к T-клеточному антигену, ликвидировали превращением по меньшей мере одного из остатков цистеина в метке с окислительно-восстановительной активностью в не являющийся цистеином остаток (при этом исключая серин или треонин в качестве не являющегося цистеином остатка), тогда затем CD4+ T-клетки можно активировать. Неожиданно, однако, эта активация являлась намного более сильной, чем в случае, когда остатков цистеина вообще не присутствовало в пептидной метке. Более того, обнаружено, что присутствие в T-клеточном антигене одиночного остатка цистеина, соседнего с областью или участком связывания МНС указанного T-клеточного антигена, являлось достаточным для вызова указанной более сильной активации CD4+ T-клеток.

Без намерения быть связанными какой-либо теорией или механизмом действия, таким образом, по-видимому, существует континуум типов активации CD4+ T-клеток: (i) «фоновая» природная активация посредством T-клеточных антигенов, не содержащих пептидной метки с окислительно-восстановительной активностью или одиночного цистеина в области, фланкирующей участок связывания МНС, как описано выше, (ii) увеличенная активация (по сравнению с фоновой активацией) посредством T-клеточных антигенов, содержащих одиночный цистеин в области, соседней с участком связывания МНС/фланкирующей участок связывания МНС, и (iii) превращение CD4+ T-клетки в цитолитическую CD4+ T-клетку при активации посредством T-клеточных антигенов, содержащих пептидную метку с окислительно-восстановительной активностью в области, соседней с участком связывания МНС/фланкирующей участок связывания МНС T-клеточного антигена.

Настоящее изобретение относится к выделенным T-клеточным антигенам, модифицированным для содержания вне участка связывания МНС последовательности антигенного пептида остатка цистеина, также как к использованию таких модифицированных антигенов для увеличения активации CD4+ T-клеток. Указанная увеличенная активация присутствует по сравнению с активацией CD4+ T-клеток посредством T-клеточных антигенов, не содержащих вне последовательности антигенного пептида указанного остатка цистеина. Эти иммуногенные пептиды по изобретению, также как их применения, более подробно описаны далее в настоящем документе.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к иммуногенным пептидам. В частности, указанные иммуногенные пептиды состоят из:

(i) T-клеточного эпитопа, где, если указанный T-клеточный эпитоп содержит аминокислотные остатки, фланкирующие аминокислотные остатки, связывающие MHC (или фланкирующие аминокислотные остатки, составляющие участок связывания МНС T-клеточного эпитопа), указанные фланкирующие аминокислотные остатки естественным образом не содержат аминокислоту цистеин в положении внутри не более 6 аминокислот, соседних с (и непрерывных) областью связывания МНС указанного T-клеточного эпитопа, и не содержат моно- или дицистеиновый окислительно-восстановительный мотив или мотив с окислительно-восстановительной активностью; и

(ii) аминокислоты цистеина в положении вне области связывания МНС T-клеточного эпитопа, где указанную аминокислоту цистеин добавляют к T-клеточному эпитопу или вставляют в T-клеточный эпитоп в указанном положении, или где указанная аминокислота цистеин возникает в результате мутации не являющейся цистеином аминокислоты в указанном положении T-клеточного эпитопа на цистеин.

Иммуногенные пептиды по изобретению можно схематически представлять как A-L-B или B-L-A, где A представляет собой T-клеточный эпитоп, L представляет собой линкер, и В представляет собой свободный остаток цистеина. Иммуногенные пептиды по настоящему изобретению можно получать химическим синтезом, позволяющим включение неприродных аминокислот. Соответственно, остаток цистеина можно заменять на другую аминокислоту с тиоловой группой, такой как меркаптовалин, гомоцистеин или другие природные или неприродные аминокислоты с функциональной группой тиола. Чтобы обладать восстановительной активностью, остаток цистеина не должен встречаться в качестве части цистеинового дисульфидного мостика. Тем не менее, остаток цистеина может являться модифицированным, например, посредством метилирования, поскольку метилированный цистеин превращается в цистеин со свободными тиоловыми группами in vivo.

Иммуногенные пептиды по изобретению могут значительно варьировать по длине, например, от приблизительно 12-13 аминокислоты (T-клеточный эпитоп из 8-9 аминокислот и 4 фланкирующие аминокислоты, содержащие остаток цистеина) до вплоть до 50 или более аминокислот. Например, иммуногенный пептид по изобретению может содержать последовательность для нацеливания на эндосомы из 40 аминокислот, фланкирующую последовательность из приблизительно 6 аминокислот, содержащую цистеин, и пептид T-клеточного эпитопа из 9 аминокислот. В конкретных вариантах осуществления иммуногенные пептиды по изобретению состоят из от 12 аминокислот и до 20, вплоть до 25, 30, 50, 75, 100 или 200 аминокислот. В более конкретном варианте осуществления пептиды состоят из от 10 и до 20 аминокислот. К таким пептидам, необязательно, можно присоединять сигнал для нацеливания на эндосомы.

В вышеизложенном T-клеточный эпитоп понимают как составляющий непрерывную часть природного белка. Такая непрерывная часть может являться результатом расщепления природного белка, расщепленного, например, посредством протеасомы или эндосомы антигенпредставляющих клеток. Альтернативно, такая часть может являться рукотворной (например, полученной рекомбинантным способом или синтетически/химически). Во всех случаях T-клеточный эпитоп обладает аминокислотной последовательностью, которая является такой же, как часть природного белка, т.е. обладает непрерывной аминокислотной последовательностью, как встречается в природе/естественным образом.

T-клеточный эпитоп может состоять исключительно из аминокислот, связывающихся с бороздкой главного комплекса гистосовместимости (MHC), или может содержать те же самые аминокислоты вместе с фланкирующими аминокислотными остатками. Такие фланкирующие остатки не вносят вклад в связывание эпитопа с MHC и «свисают» снаружи бороздки MHC. Фланкирующие остатки могут присутствовать с N- и/или C-конца связывающей МНС части T-клеточного эпитопа. В иммуногенных пептидах по настоящему изобретению указанный остаток цистеина локализован таким образом, что, когда эпитоп располагается в бороздке MHC, указанный остаток цистеина остается снаружи связывающей бороздки MHC. T-клеточные эпитопы, содержащие фланкирующие остатки, могут естественным образом содержать в своей аминокислотной последовательности остаток цистеина, например, T-клеточный эпитоп, используемый в примере 2 в настоящем документе, который частично лежит в основе настоящего изобретения (указанный T-клеточный эпитоп содержит 2 фланкирующих аминокислотных остатка с N-концевой стороны связывающей МНС части и естественным образом является непрерывным со связывающей МНС частью; указанные фланкирующие аминокислотные остатки содержат природный цистеин). T-клеточные эпитопы, естественным образом содержащие цистеин в положении, необходимом по изобретению, исключены из настоящего изобретения, когда остаток цистеина встречается в непрерывной природной последовательности внутри не более 6 аминокислот, соседних со связывающими МНС аминокислотами, т.е. непосредственно с их N- или С-конца, и естественным образом непрерывных с ними. Кроме того, из настоящего изобретения исключены иммуногенные пептиды, содержащие фланкирующие аминокислотные остатки вне участка связывания МНС, где фланкирующие аминокислотные остатки содержат моно- или дицистеиновый окислительно-восстановительный мотив (природный, неприродный или после добавления/вставки/мутации цистеина, как необходимо по настоящему изобретению). Как объяснено выше, присутствие окислительно-восстановительного мотива в последних пептидах превращает не цитолитические естественным образом CD4+ T-клетки в цитолитические CD4+ T-клетки, т.е. в CD4+ T-клетки с характеристиками, нежелательными по настоящему изобретению. Дицистеиновые окислительно-восстановительные мотивы в вышеизложенном обозначают мотивы «CXXC», в то время как моноцистеиновые окислительно-восстановительные мотивы обозначают мотивы «CXX[S/T]» или «[S/T]XXC». Иммуногенные пептиды по изобретению, содержащие аминокислоту цистеин внутри их области связывания МНС (или альтернативно, погруженную в щель MHC при связывании с молекулой MHC), не исключены из изобретения.

В иммуногенных пептидах по изобретению указанную аминокислоту цистеин из (ii) можно добавлять к T-клеточному эпитопу или вставлять в T-клеточный эпитоп в положении, отделенном не более 5 аминокислотами от области связывания МНС (т.е. не более 5 аминокислот может присутствовать между указанным цистеином и концевой аминокислотой области связывания МНС), указанная аминокислота цистеин из (ii) может возникать в результате мутации не являющейся цистеином аминокислоты до аминокислоты цистеина в положении, отделенном не более 5 аминокислотами от области связывания МНС (т.е. не более 5 аминокислот могут присутствовать между указанным цистеином и концевой аминокислотой области связывания МНС).

Более того, в иммуногенных пептидах по изобретению указанная аминокислота цистеин из (ii) может быть отделена от области связывания МНС T-клеточного эпитопа искусственной аминокислотной последовательностью линкера из не более 5 аминокислот (т.е. не более 5 аминокислот могут присутствовать между указанным цистеином и концевой аминокислотой области связывания МНС). Помимо пептидного линкера, другие органические соединения можно использовать в качестве линкера для соединения частей иммуногенного пептида друг с другом.

В любом из иммуногенных пептидов по изобретению указанная аминокислота цистеин может быть локализована непосредственно с N- или С-конца от области связывания МНС.

В любом из иммуногенных пептидов по изобретению указанный ассоциированный с заболеванием T-клеточный эпитоп включает T-клеточный эпитоп инфекционного агента, собственного антигена, аллергена, аллофактора или антигена аллотрансплантата, и T-клеточный эпитоп, специфический или предпочтительный для опухоли.

Любой из иммуногенных пептидов по изобретению может дополнительно содержать аминокислотную последовательность (или другое органическое соединение), облегчающую поглощение пептида (поздними) эндосомами для процессинга и представления в составе детерминант MHC класса II. Иммуногенные пептиды по изобретению могут, таким образом, дополнительно содержать, например, последовательность для нацеливания на эндосомы. Нацеливание на поздние эндосомы опосредовано сигналами, присутствующими в цитоплазматическом хвосте белков и соответствующими хорошо идентифицированным пептидным мотивам, таким как основанный на дилейцине мотив [DE]XXXL[LI] или DXXLL (например, DXXXLL), основанный на тирозине мотив YXX∅ или так называемый мотив кислого кластера. Символ ∅ представляет собой аминокислотные остатки с объемными гидрофобными боковыми цепями, такие как Phe, Tyr и Trp. Последовательности для нацеливания на поздние эндосомы позволяют процессинг и эффективное представление полученного из антигена T-клеточного эпитопа молекулами MHC класса II. Такие последовательности для нацеливания на эндосомы содержатся, например, в составе белка gp75 (Vijayasaradhi et al. 1995, J Cell Biol 130, 807- 820), белка CD3 гамма человека, HLA-BM 13 (Copier et al. 1996, 3 Immunol 157, 1017-1027), цитоплазматического хвоста рецептора DEC205 (Mahnke et al. 2000, 3 Cell Biol 151, 673-683). Другие примеры пептидов, функционирующих как сигналы сортировки в эндосому, описаны в обзоре Bonifacio and Traub (2003), Annu Rev Biochem 72, 395-447. Альтернативно, последовательность может представлять собой последовательность субдоминантного или минорного T-клеточного эпитопа из белка, которая облегчает поглощение поздней эндосомой без преодоления ответа T-клеток, направленного на полученный из ассоциированного с патогеном антигена T-клеточный эпитоп, или полученный из ауто- или аллоантигена T-клеточный эпитоп.

Любой из вышеуказанных иммуногенных пептидов можно получать химическим синтезом или рекомбинантной экспрессией.

Изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим иммуногенный пептид по изобретению и дополнительно по меньшей мере один из растворителя, разбавителя носителя или адъюванта.

Настоящее изобретение относится к применению выделенных иммуногенных пептидов для предотвращения, лечения или супрессии инфекции у субъекта посредством усиления иммунного ответа на специфические антигены, полученные из инфекционного агента, использованного в способе вакцинации. В частности, иммунный ответ представляет собой активацию CD4+ хелперных T-клеток и/или ответ антител у указанного субъекта. В вышеизложенном указанный ассоциированный с патогеном антиген может происходить из вирусов, бактерий или паразитов. В частности, изобретение относится к способам улучшения, стимуляции или усиления размножения и функциональной активности эффекторных CD4+ T-клеток, обозначаемых также как хелперные CD4+ T-клетки. Такие эффекторные или хелперные CD4+ T-клетки принадлежат к различным подгруппам клеток, определенных в соответствии с фенотипом их поверхности, продукцией цитокинов и транскриптомом. Таким образом, клетки Th1, Th2, Th17 и Tfh разграничены в качестве репрезентативных для различных подтипов эффекторов. Кроме того, недавно описаны клетки Th9 (обзор см. в Locksley et al. 2009, J Exp Med 206, 1643-1646). В частности, изобретение относится к способам размножения специфических CD4+ T-хелперных клеток. Результатом является более эффективный ответ на патогены, включая продукцию более высоких концентраций антител.

Настоящее изобретение также относится к применению выделенных иммуногенных пептидов для супрессии иммунных ответов против аллергенов или аутоантигенов у субъекта посредством увеличения ответа регуляторных T-клеток, специфических для этого аллергена или аутоантигена. Оно, кроме того, относится к применению выделенных иммуногенных пептидов для супрессии иммунных ответов против аллоантигенов у субъекта посредством увеличения ответа регуляторных T-клеток, специфических для этого аллоантигена. В вышеизложенном указанный аутоантиген или аллоантиген включают аутоантигены, ассоциированные с аутоиммунными заболеваниями, такими как инсулин-зависимый сахарный диабет, тиреоидит, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, и включают аллоантигены, полученные из главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II, минорных антигенов гистосовместимости или тканеспецифических антигенов. В случае иммунных ответов на аллоантигены (синоним, применяемый в настоящем документе: аллофактор) иммунный ответ может являться нейтрализующим биологическую активность аллофактора. Пример последнего включает развитие нейтрализующих антител, например, при гемофилии, к экзогенному фактору VIII. Настоящее изобретение относится к способам предотвращения, лечения или супрессии у субъекта аутоиммунного заболевания или отторжения трансплантата, или предотвращения, лечения или супрессии у субъекта иммунного ответа, нейтрализующего аллофактор (такой как фактор VIII свертывания крови, к которому у нуждающихся в нем реципиентов может нарастать иммунный ответ, нейтрализующий введенный фактор VIII). В частности, изобретение относится к способам усиления размножения и функциональной активности регуляторных CD4+ T-клеток. Такие регуляторные T-клетки принадлежат либо к природной популяции регуляторных T-клеток, определяемой по экспрессии репрессора транскрипции Foxp3, либо к одной из подгрупп индуцированных или адаптивных регуляторных T-клеток, главным образом определяемых по продукции супрессирующих цитокинов, таких как IL-10 и TGF-бета (обзор см. в Yi et al. 2006, Cell Mol Immunol. 3, 189-195). В частности, изобретение относится к способам размножения специфических CD4+ регуляторных T-клеток. Результатом является более эффективная супрессия иммунных ответов на аутоантигены и снижение скорости отторжения трансплантата.

Настоящее изобретение также относится к применению выделенных иммуногенных пептидов для лечения опухоли у субъекта посредством повышения иммунного ответа на опухолеспецифические антигены, распространяемые опухолью, в способе вакцинации. В частности, иммунный ответ представляет собой активацию ответа эффекторных CD4+ T-клеток у указанного субъекта. В вышеизложенном указанный, происходящий из опухоли антиген может происходить из онкогенов или протоонкогенов, белков вирусного происхождения, факторов выживания или клонотипических детерминант. Настоящее изобретение относится к способам предотвращения или супрессии у субъекта роста опухоли или клеток злокачественных опухолей, или лечения опухоли или злокачественной опухоли. Это включает также вакцинацию с целью предотвращения инфекции вызывающими опухоль или злокачественную опухоль патогенами (например, конкретными штаммами папилломавируса человека). В частности, изобретение относится к способам усиления размножения и функциональной активности CD8+ T-клеток посредством усиления или увеличения активации эффекторных CD4+ T-клеток. В частности, изобретение относится к способам размножения специфических CD8+ T-клеток. Результатом является более эффективный ответ на происходящие из опухоли антигены или антигены из вызывающих опухоль патогенов с повышенной активностью CD8+ T-клеток.

В любом из вышеизложенного «лечение» следует понимать как приводящее по меньшей мере к стабилизации подвергаемого лечению заболевания или нарушения или приводящее к частичному или полному обращению течения заболевания или нарушения к здоровому состоянию. «Супрессию» заболевания или нарушения следует понимать как приводящую к замедленному дальнейшему развитию указанного заболевания или нарушения по сравнению со средним дальнейшим развитием указанного заболевания или нарушения, оставленного без лечения. Поскольку иммуногенные пептиды по изобретению можно использовать в способе вакцинации, из этого следует, что такие пептиды можно вводить субъекту, у которого еще не показано являющееся мишенью заболевание или нарушение, или который еще не страдает от являющегося мишенью заболевания или нарушения, где указанное введение присутствует с целью предотвращения развития указанного, являющегося мишенью заболевания или нарушения. Такая профилактическая или предварительная иммунизация или предотвращение может полностью блокировать развитие являющегося мишенью заболевания или нарушения, или может предотвратить развитие являющегося мишенью заболевания или нарушения, например, до истощающего уровня. Профилактическая вакцинация или иммунизация представляет особенный интерес для субъектов, подверженных риску развития заболевания или нарушения из-за увеличенного (риска) воздействия, например, патогена, из-за наследственной или другой предрасположенности, из-за врожденных дефектов и т.д.

Примеры заболеваний, при которых иммунный ответ, повышенный посредством использования настоящего изобретения, является способным предотвращать, облегчать или лечить заболевание, описаны в настоящем документе. Приведены также примеры антигенов, из которых можно получать T-клеточный эпитоп для использования по изобретению.

- вакцинация против аллергических заболеваний

Аллергены, которые можно использовать для выбора T-клеточных эпитопов, как правило, представляют собой аллергены, выбранные из группы, состоящей из:

- пищевых аллергенов, присутствующих, среди прочего, в арахисе (Ara h1), рыбе (паральбумин) например, треске, яичном белке (овальбумин), ракообразных, например, креветках (тропомиозин), молоке (бета-лактоглобулин) например, коровьем молоке, пшенице (глютен), зерновых, фруктах семейства розоцветных (яблоке, сливе, клубнике), овощах семейств лилейных, крестоцветных, пасленовых и зонтичных, лесных орехах, кунжуте, арахисе, сое и других аллергенах семейства бобовых, специях, дыне, авокадо, манго, инжире, банане;

- аллергенов клеща домашней пыли, полученных из Dermatophagoides spp или D. pteronyssinus, D. farinae и D. microceras, Euroglyphus maynei или Blomia sp.,

- аллергенов из насекомых, присутствующих у таракана (Bla g2) или перепончатокрылых,

- аллергенов из пыльцы, особенно пыльцы деревьев, травы и сорняков,

- аллергенов из животных, особенно кошек (Fel d1), собак, лошадей и грызунов (mus m1),

- аллергенов из грибов, особенно Aspergillus (aspf1) Alternaria (Alt A6) или Cladosporium (cla h3),

- профессиональных аллергенов, присутствующих в таких продуктах, как латекс, амилаза и т.д.

- вакцинация против внутри- и внеклеточных патогенов

- Внутриклеточные патогены являются выбранными из группы, состоящей из любого антигена, полученного из вирусов, бактерий, микобактерий или паразитов с внутриклеточным жизненным циклом. Вирусы включают вирусы с оцДНК, дцДНК и РНК, с такими примерами, как вирусы герпеса, флавивирусы и пикорнавирусы, вирусы гриппа, кори и иммунодефицита. Бактерии и микобактерии включают микобактерии туберкулеза, другие микобактерии, патогенные для людей или животных, иерсинии, бруцеллы, хламидии, микоплазму, риккетсии, сальмонеллы и шигеллы. Паразиты включают, среди прочих, плазмодии, лейшмании, трипаносомы, токсоплазму гонди, листерии, гистоплазмы.

- Внеклеточные патогены являются выбранными из группы, состоящей из вирусов, бактерий и паразитов с главным образом внеклеточным жизненным циклом, и антигены для использования по настоящему изобретению могут быть получены из них.

- вакцинация против опухолей

Примеры опухолей, на которые можно нацеливаться посредством продуктов по настоящему изобретению, и примеры ассоциированных антигенов, которые можно использовать по настоящему изобретению, являются выбранными из групп, состоящих из:

- онкогенов, таких как MAGE, идентифицированных в некоторых меланомах;

- протоонкогенов, таких как циклин D1, экспрессированный на карциномах мягких тканей, таких как карциномы почки или паращитовидной железы, также как на множественной миеломе;

- белков вирусного происхождения, таких как белки из вируса Эпштейна-Барр в некоторых карциномах и в некоторых лимфомах ходжкинского типа;

- факторов выживания, являющихся антиапоптотическими факторами, таких как сурвивин или bcl2;

- клонотипических детерминант, таких как идиотипические детерминанты, полученные из В-клеточного рецептора в фолликулярных лимфомах или множественных миеломах, или детерминант T-клеточного рецептора злокачественных новообразований T-клеток.

Примеры заболеваний, при которых увеличенная устойчивость посредством стимуляции регуляторных T-клеток с использованием настоящего изобретения может предотвращать, облегчать или лечить заболевание, описаны в настоящем документе. Приведены также примеры антигенов, из которых можно получать T-клеточный эпитоп для использования по изобретению.

- аллергическое заболевание, как описано выше

- аутоиммунные заболевания

Аутоиммунные заболевания являются выбранными из группы, состоящей из

(a) органоспецифических заболеваний, таких как болезнь Аддисона, гемолитическая или пернициозная анемия, синдром Гудпасчера, болезнь Грэйвса, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, инсулинзависимый сахарный диабет, юношеский диабет, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, пемфигус, атопический дерматит, аутоиммунный гепатит, первичный биллиарный цирроз, аутоиммунная пневмония, аутоиммунный кардит, миастения, гломерулонефрит и спонтанное бесплодие;

(b) системных заболеваний, таких как красная волчанка, псориаз, васкулит, полимиозит, склеродермия, рассеянный склероз, анкилозирующий спондилит, ревматоидный артрит и синдром Шегрена). Аутоиммунные нарушения, таким образом, нацелены на собственные клетки или ткани и включают реакцию на «аутоантигены», означающие антигены (например, белки), являющиеся собственными составляющими организма конкретного млекопитающего. По этому механизму аутоантигены узнаются В- и/или T-клетками, запускающими иммунную реакцию против указанного аутоантигена.

Неограничивающий список заболеваний, охваченных термином «аутоиммунные заболевания» или «аутоиммунные нарушения», включает, таким образом, острый диссеминированный энцефаломиелит (ADEM), болезнь Аддисона, очаговую алопецию, синдром антифосфолипидных антител (APS), аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, буллезный пемфигоид, болезнь Бехчета, целиакию, воспалительное заболевание кишечника (IBD) (такое как болезнь Крона и язвенный колит), дерматомиозит, сахарный диабет типа 1, синдром Гудпасчера, болезнь Грэйвса, синдром Гийена-Барре (GBS), болезнь Хашимото, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, красную волчанку, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз (MS), миастению, нарколепсию, обыкновенную пузырчатку, пернициозную анемию, псориаз, псориатический артрит, полимиозит, первичный биллиарный цирроз, ревматоидный артрит (RA), синдром Шегрена, височный артериит, васкулит, гранулематоз Вегенера и атопический дерматит.

Таблица Репрезентативные аутоантигены и связанные с ними заболевания
Заболевание	Антиген
заболевания щитовидной железы	тиреоглобулин
	тиреоидная пероксидаза
	рецептор TSH
диабет 1 типа	инсулин (проинсулин)
	декарбоксилаза глутаминовой кислоты (GAD)
	тирозинфосфатаза IA-2
	белок теплового шока HSP65
	белок, родственный каталитической субъединице, специфической для островков глюкозо-6-фосфатазы (IGRP)
адреналит	21-OH-гидроксилаза
полиэндокринные синдромы	17-альфа-гидроксилаза
	гистидин-декарбоксилаза
	триптофан-гидроксилаза
	тирозин-гидроксилаза
гастрит и пернициозная анемия	внутренний фактор H+/K+ АТФаза
рассеянный склероз	миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (MOG)
	основной белок миелина (MBP)
	протеолипидный белок (PLP)
миастения гравис	рецептор ацетилхолина
заболевания глаз	связывающий ретинол белок (RBP)
заболевания внутреннего уха	коллаген типа II и типа IX
глютенчувствительная целиакия	тканевая трансглутаминаза

воспалительные заболевания кишечника	гистоновый белок pANCA HI
атеросклероз	белок теплового шока HSP60

- трансплантация

Аллоантигены для использования по настоящему изобретению являются выбранными из группы, полученной из:

- главного комплекса гистосовместимости класса I или класса II

- минорных комплексов гистосовместимости

- тканеспецифические антигены

- иммунный ответ на аллофакторы

Аллофакторы для использования по настоящему изобретению являются выбранными из группы, состоящей из:

- заместительной терапии для дефектов свертывания крови или дефектов фибринолиза, включая фактор VIII, фактор IX и стафилокиназу,

- гормоны, такие как гормон роста или инсулин,

- цитокины и факторы роста, такие как интерферон-альфа, интерферон-гамма, GM-CSF и G-CSF,

- антитела для модуляции иммунных ответов, включая антитела против IgE при аллергических заболеваниях, антитела против CD3 и против CD4 при отторжении трансплантата и ряде аутоиммунных заболеваний, антитела против CD20 при неходжкинских лимфомах, эритропоэтин при почечной недостаточности.

В любом из применений и способов, описанных в настоящем документе выше, иммуногенный пептид по изобретению можно заменять CD4+ эффекторными T-клетками, примированными указанным иммуногенным пептидом, или можно заменять нуклеотидной последовательностью, кодирующей иммуногенный пептид (например, в форме голой ДНК или вирусного вектора для введения индивидууму вместо иммуногенного пептида). Кроме того, комбинацию множества иммуногенных пептидов, т.е. более 1 (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более), можно использовать в любом из вышеизложенного.

Изобретение, кроме того, относится к выделенным вирусным векторам, отличающимся тем, что они являются способными экспрессировать иммуногенный пептид по изобретению.

В любом из применений, описанных в настоящем документе выше, указанный реципиент представляет собой млекопитающее, в частности, (не относящегося к человеку) примата или человека.

Иммуногенные пептиды по изобретению можно получать, начиная с T-клеточного эпитопа(эпитопов) представляющего интерес антигена. В частности, используемый T-клеточный эпитоп может представлять собой доминантный T-клеточный эпитоп. Идентификация и выбор T-клеточного эпитопа из представляющего интерес антигена для применения в контексте настоящего изобретения находится в компетенции специалиста в данной области. Например, пептидные последовательности, выделенные из представляющего интерес антигена, можно тестировать, например, способами на основе биологии T-клеток для определения того, вызывают ли пептидные последовательности ответ T-клеток. Пептидные последовательности, как обнаружено, вызывающие ответ T-клеток, определяют как обладающие активностью стимуляции T-клеток. Активность стимуляции T-клеток человека можно далее тестировать культивированием T-клеток, полученных от индивидуума, сенсибилизированного представляющим интерес антигеном, с пептидом/эпитопом, полученным из представляющего интерес антигена, с последующим определением того, происходит ли пролиферация T-клеток в ответ на пептид/эпитоп, как измеряют, например, по поглощению клетками тритилированного тимидина. Индексы стимуляции для ответов T-клеток на пептиды/эпитопы можно вычислять как максимум CPM в ответ на пептид/эпитоп, деленный на контрольные CPM. Индекс стимуляции (S.I.) T-клеток, равный двукратному фоновому уровню или превышающий двукратный фоновый уровень, рассматривают как «положительный». Положительные результаты используют для вычисления среднего индекса стимуляции для каждого пептида/эпитопа для группы тестированных пептидов/эпитопов. Неприродные (или модифицированные) T-клеточные эпитопы можно дополнительно, необязательно, тестировать по их аффинности связывания молекул MHC класса II. Связывание неприродных (или модифицированных) T-клеточных эпитопов с молекулами MHC класса II можно осуществлять различными способами. Например, растворимые молекулы HLA класса II получают лизисом клеток, гомозиготных по данной молекуле класса II. Последнюю очищают аффинной хроматографией. Растворимые молекулы класса II инкубируют с меченным биотином контрольным пептидом, полученным в соответствии с его сильной аффинностью связывания этой молекулы класса II. Затем пептиды, подлежащие оценке по связыванию класса II, инкубируют в различных концентрациях, и их способность вытеснять контрольный пептид из связывания с классом II вычисляют посредством добавления нейтравидина. Способы можно обнаружить, например, в Texier et al. 2000, J Immunol. 164, 3177-3184). Иммуногенные пептиды по изобретению обладают средним индексом стимуляции T-клеток, большим или равным 2,0. Иммуногенный пептид, обладающий индексом стимуляции T-клеток, большим или равным 2,0, считают пригодным в качестве профилактического или лекарственного средства. Иммуногенные пептиды по изобретению могут обладать средним индексом стимуляции T-клеток по меньшей мере 2,5, по меньшей мере 3,5, по меньшей мере 4,0 или даже по меньшей мере 5,0. Кроме того, такие пептиды, как правило, обладают индексом положительности (P.I.) по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере приблизительно 200 или по меньшей мере приблизительно 250. Индекс положительности для пептида определяют умножением среднего индекса стимуляции T-клеток на процент индивидуумов, в популяции индивидуумов, чувствительных к представляющему интерес антигену (например, по меньшей мере 9 индивидуумов, по меньшей мере 16 индивидуумов или по меньшей мере 29 или 30, или даже более), обладающих T-клетками, отвечающими на пептид (таким образом, он соответствует SI, умноженному на неоднородную природу пептида/эпитопа). Таким образом, положительный индекс представляет собой как силу ответа T-клеток на пептид (S.I.), так и частоту ответа T-клеток на пептид в популяции индивидуумов, чувствительных к интересующему антигену. Для определения оптимальных T-клеточных эпитопов, например, способами подробного картирования, пептид, обладающий активностью стимуляции T-клеток, и таким образом, содержащий по меньшей мере один T-клеточный эпитоп, как определено способами на основе биологии T-клеток, модифицируют добавлением или делецией аминокислотных остатков с N- или C-конца пептида и тестируют для определения изменения реакционной способности T-клеток по отношению к модифицированному пептиду. Если обнаружено, что два или более пептидов, разделяющих область перекрывания в природной белковой последовательности, обладают активностью стимуляции T-клеток человека, как определено способами на основе биологии T-клеток, можно получать дополнительные пептиды, содержащие все или часть таких пептидов, и эти дополнительные пептиды можно тестировать сходным способом. По этому способу выбирают пептиды и получают рекомбинантным способом или синтетически. T-клеточные эпитопы или пептиды выбирают на основании различных факторов, включая силу ответа T-клеток на пептид/эпитоп (например, индекс стимуляции) и частоту ответа T-клеток на пептид в популяции индивидуумов.

Способы, используемые для идентификации антигена, известны в данной области. Таким образом, способы позиционного клонирования или экспрессионного клонирования можно использовать для идентификации антигенов-кандидатов. Полное описание способов, см., например, в Mendoza et al. 1997, Immunity 7, 461-472. Альтернативно, пептиды, фактически представленные APC в молекулах MHC класса I или класса II, можно элюировать и разделять различными способами хроматографии. Полное описание таких способов можно обнаружить в Scott et al. 2000, Immunity 12, 711-720. Можно проводить скрининг антигенов-кандидатов посредством одного или нескольких алгоритмов in vitro для идентификации последовательности T-клеточного эпитопа внутри антигенного белка. Пригодные алгоритмы включают, но без ограничения, алгоритмы, обнаруженные на следующих веб-сайтах:

- http://antigen.i2r.a-star.edu.sa/predBalbc/:

- http://antigen.i2r.a-star.edu.sa/predBalbc/:

- http://www.imtech.res.in/raahava/mhcbn/:

- http://www.svfpeithi.de/home.htm:

- http://www-bs.informatik.uni-tuebinaen.de/SVMHC:

- http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html:

- http://www.ienner.ac.uk/MHCPred/.

Более подробно эти алгоритмы описаны, например, в Zhang et al. (2005) Nucleic Acids Res 15 33, W180-W183 ( PREDBALB); Salomon & Flower (2006) BMC Bioinformatics 7, 501 (MHCBN); Schuler et al. (2007) Methods Mol Biol. 409, 75-93 (SYFPEITHI); Donnes & Kohlbacher (2006) Nucleic Acids Res 34, W194-W197 (SVMHC); Kolaskar & Tongaonkar (1990) FEBS Lett. 276, 172-174 и Guan et al. (2003) Appl Bioinformatics 2, 63-66 (MHCPred).

Более конкретно, такие алгоритмы позволяют предсказание внутри антигенного белка одной или более нонапептидных последовательностей, подходящих для бороздки молекулы MHC II.

Иммуногенные пептиды по изобретению можно получать посредством рекомбинантной экспрессии, например, в бактериальных клетках (например, Escherichia coli), клетках дрожжей (например, виды Pichia, виды Hansenula, виды Saccharomyces или виды Schizosaccharomyces), клетках насекомых (например, из Spodoptera frugiperda или Trichoplusia ni), клетках растений или клетках млекопитающих (например, клетки CHO, COS). Конструирование необходимых, таким образом, пригодных экспрессирующих векторов (включая дополнительную информацию, такую как последовательности промотора и терминатора) включает при этом общепринятые способы рекомбинантной ДНК.

Полученные рекомбинантным способом иммуногенные пептиды по изобретению можно получать из более крупного белка-предшественника, например, посредством ферментативного расщепления участков ферментативного расщепления, вставленных по соседству с N- и/или C-концом иммуногенного пептида, с последующей подходящей очисткой.

Принимая во внимание ограниченную длину иммуногенных пептидов по изобретению, их можно получать химическим синтезом пептидов, где пептиды получают присоединением различных аминокислот друг к другу. Химический синтез является особенно пригодным для вставки, например, D-аминокислот, аминокислот с неприродными боковыми цепями или природных аминокислот с модифицированными боковыми цепями, таких как метилированный цистеин. Способы химического синтеза пептидов хорошо описаны, и пептиды можно заказывать из таких компаний, как Applied Biosystems и других компаний. Синтез пептидов можно осуществлять либо как твердофазный синтез пептидов (SPPS), либо наоборот, как синтез пептидов в растворенной фазе. Наиболее известными способами SPPS являются твердофазные химические реакции с t-Boc и Fmoc, широко известные специалистам в данной области. Кроме того, пептиды можно связывать друг с другом для получения более длинных пептидов с использованием способа лигирования (хемоселективное соединение двух незащищенных фрагментов пептида), как исходно описано Kent (Schnolzer & Kent 1992, Int J Pept Prot Res 40, 180-193), и обзор приведен, например, в Tam et al. 2001, Biopolymers 60, 194-205. Это обеспечивает огромный потенциал для достижения синтеза белков, выходящего за пределы SPPS. Множество белков размером 100-300 остатков успешно синтезировано этим способом. Синтетические пептиды продолжают играть постоянно увеличивающуюся роль в исследованиях в области биохимии, фармакологии, нейробиологии, энзимологии и молекулярной биологии благодаря огромным успехам в SPPS.

Физические и химические свойства представляющего интерес иммуногенного пептида (например, растворимость, стабильность) исследуют для определения того, пригоден ли/будет ли пригоден пептид для использования в терапевтических композициях. Как правило, это оптимизируют коррекцией последовательности пептида. Необязательно, пептид можно модифицировать после синтеза (химические модификации, например, добавление/удаление функциональных групп) с использованием способов, известных в данной области.

Изобретение, кроме того, относится к способам получения антигенспецифических эффекторных CD4+ T-клеток, или антигенспецифических регуляторных T-клеток (Treg или CD4+ регуляторных T-клеток), in vivo или in vitro (ex vivo). Способы по изобретению обладают тем преимуществом, что образуются бόльшие количества CD4+ эффекторных T-клеток или CD4+ регуляторных T-клеток, и что можно получать указанные клетки, которые являются специфическими для представляющего интерес антигена.

Такие способы включают способы получения популяции CD4+ эффекторных клеток с увеличенными пролиферативными свойствами, где указанные способы включают стадии:

получения клеток периферической крови;

контакта этих клеток с иммуногенным пептидом по изобретению, где T-клеточный антиген получен из инфекционного агента; и

размножения этих клеток в присутствии IL-2

Такие способы, кроме того, включают способы, нацеленные на получение популяции CD4+ эффекторных клеток с увеличенными пролиферативными свойствами, где указанные способы включают стадии:

получения иммуногенного пептида по изобретению;

введения иммуногенного пептида субъекту, где T-клеточный эпитоп получен из инфекционного агента; и

получения популяции CD4+ эффекторных клеток с увеличенными пролиферативными свойствами.

Такие способы, кроме того, включают способы получения популяции CD4+ регуляторных клеток с увеличенными пролиферативными свойствами, где указанные способы включают стадии:

получения клеток периферической крови;

контакта этих клеток с иммуногенным пептидом по изобретению, где T-клеточный эпитоп получен из ауто- или аллоантигена; и

размножения этих клеток в присутствии IL-2

Такие способы, кроме того, включают способы, нацеленные на получение популяции CD4+ регуляторных клеток с увеличенными супрессивными свойствами, где указанные способы включают стадии:

получения иммуногенного пептида по изобретению, где T-клеточный эпитоп получен из ауто- или аллоантигена;

введения иммуногенного пептида субъекту; и

получения популяции CD4+ регуляторных клеток с увеличенными супрессивными свойствами.

Такие способы, кроме того, включают способы получения популяции эффекторных CD4+ T-клеток с увеличенными пролиферативными свойствами, где указанные способы включают стадии:

получения клеток периферической крови;

контакта этих клеток с иммуногенным пептидом по изобретению, где T-клеточный эпитоп получен из происходящего из опухоли антигена; и

размножения этих клеток в присутствии IL-2.

Такие способы, кроме того, включают способы, нацеленные на получение популяции эффекторных CD4+ T-клеток с увеличенными пролиферативными свойствами, где указанные способы включают стадии:

получения иммуногенного пептида по изобретению, где T-клеточный эпитоп получен из происходящего из опухоли антигена;

введения иммуногенного пептида субъекту; и

получения популяции эффекторных CD4+ T-клеток с увеличенными пролиферативными свойствами.

Популяции эффекторных CD4+ T-клеток с увеличенными пролиферативными свойствами и популяции регуляторных CD4+ клеток с увеличенными супрессивными свойствами, которые можно получать вышеописанными способами, также являются частью изобретения, также как их применение для изготовления лекарственного средства для лечения намеченного заболевания или нарушения.

Для любого из вышеописанных применений иммуногенных пептидов по изобретению указанные пептиды можно заменять антигенспецифическими эффекторными CD4+ T-клетками или антигенспецифическими регуляторными T-клетками. Предусмотрено применение как аллогенных, так и аутогенных клеток. Любой способ, включающий введение указанных антигенспецифических эффекторных CD4+ T-клеток или антигенспецифических регуляторных T-клеток нуждающемуся в этом субъекту, известен также как адоптивная клеточная терапия. Такая терапия представляет особенный интерес в случае лечения острых эпизодов заболевания или нарушения и в случае лечения рецидивов такого заболевания или нарушения. CD4+ эффекторные T-клетки являются критическими для предотвращения инфекционных заболеваний, таких как вирусные, бактериальные или паразитические заболевания, и таким образом, обладают огромным потенциалом. Их эффективность зависит от антигенной специфичности. Регуляторные CD4+ T-клетки являются критическими для иммунорегуляции и обладают огромным терапевтическим потенциалом. Эффективность основанной на регуляторных T-клетках иммунотерапии зависит от антигенной специфичности регуляторных T-клеток. Более того, использование антигенспецифических регуляторных T-клеток в отличие от поликлонально размноженных регуляторных T-клеток снижает общее количество регуляторных T-клеток, необходимых для терапии. Эффекторные CD4+ T-клетки являются критическими для лечения опухолей, таких как опухоли, экспрессирующие онкогены, протоонкогены, белки вирусного происхождения, факторы выживания или клонотипические детерминанты.

Настоящее изобретение также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим иммуногенные пептиды по настоящему изобретению, и к способам их использования, например, для рекомбинантной экспрессии или в генотерапии. В частности, указанные последовательности нуклеиновой кислоты являются способными экспрессировать иммуногенные пептиды по изобретению.

Иммуногенные пептиды по изобретению действительно можно вводить нуждающемуся в этом субъекту с использованием любого пригодного способа генотерапии. Иммунизацию иммуногенным пептидом по изобретению, иммунизацию с использованием подходящей генотерапии и адоптивного переноса клеток можно комбинировать. При комбинации указанные иммунизацию, адоптивный перенос клеток и генотерапию можно использовать одновременно или последовательно в любой возможной комбинации.

В генотерапии молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие иммуногенные пептиды, можно использовать в форме голой ДНК или в липосомах или других липидных системах для доставки к клеткам-мишеням. Другие способы прямого переноса плазмидной ДНК в клетки хорошо известны специалистам в данной области для использования в генотерапии человека и включают нацеливание ДНК на рецепторы клеток посредством образования комплексов плазмидной ДНК с белками. В его самой простой форме перенос генов можно проводить посредством простой инъекции незначительных количеств ДНК в ядро клетки, посредством способа микроинъекции. После введения рекомбинантных генов в клетку они могут быть узнаны нормальными механизмами клетки для транскрипции и трансляции, и продукт гена может быть экспрессирован. Другие способы также пробовали для введения ДНК в большое количество клеток. Эти способы включают: трансфекцию, где ДНК преципитирована фосфатом кальция и поглощается клетками посредством пиноцитоза; электропорацию, где клетки подвергают воздействию высоковольтных импульсов для введения отверстий в мембрану); липофекцию/слияние с липосомами, где ДНК упакована в липофильные везикулы, которые сливаются с клеткой-мишенью; и бомбардировку частицами с использованием ДНК, связанной с небольшими ядрами. Другой способ введения ДНК в клетки представляет собой присоединение ДНК к химически модифицированным белкам. Аденовирусные белки являются способными дестабилизировать эндосомы и усиливать поглощение ДНК клетками. Смешивание аденовируса с растворами, содержащими комплексы ДНК, или связывание ДНК с полилизином, ковалентно присоединенным к аденовирусу с использованием сшивающих белок средств, значительно улучшает поглощение и экспрессию рекомбинантного гена. Аденоассоциированные вирусные векторы также можно использовать для доставки генов в клетки сосудов. Как применяют в настоящем документе, «перенос гена» означает способ введения чужеродной молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, который обычно осуществляют, чтобы позволять экспрессию конкретного продукта, кодируемого геном. Указанный продукт может включать белок, полипептид, антисмысловую ДНК или РНК, или ферментативно активную РНК. Перенос гена можно осуществлять в культивированных клетках или посредством прямого введения млекопитающим. Другой вариант осуществления относится к вектору, содержащему последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуногенный пептид по изобретению. В конкретных вариантах осуществления вектор получают таким образом, что последовательность молекулы нуклеиновой кислоты экспрессируется только в конкретной ткани. Способы достижения тканеспецифической экспрессии гена хорошо известны в данной области, например, посредством помещения последовательности, кодирующей иммуногенный пептид по изобретению, под контроль промотора, который управляет экспрессией пептида специфически в одной или нескольких тканях или органах. Экспрессирующие векторы, полученные из вирусов, таких как ретровирусы, вирус осповакцины, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирусы герпеса, РНК-вирусы или вирус папилломы крупного рогатого скота, можно использовать для доставки нуклеотидных последовательностей (например, кДНК), кодирующих пептиды, их гомологи или производные по изобретению в намеченных тканях или популяции клеток. Способы, хорошо известные специалистам в данной области, можно использовать для конструирования рекомбинантных вирусных векторов, содержащих такие кодирующие последовательности. Альтернативно, модифицированные клетки, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуногенный пептид по изобретению, можно использовать в генотерапии.

Вирусные векторы для целей генотерапии или генной вакцинации хорошо поддаются модификации посредством способов рекомбинантной нуклеиновой кислоты. С учетом вышеизложенного специалист в данной области легко может дополнительно предусматривать, что модификацию в T-клеточный эпитоп вирусного вектора, как используют в иммуногенных пептидах и их применениях по изобретению, можно вводить непосредственно собственно в вирусный вектор. Таким образом, изобретение, кроме того, относится к модифицированным вирусным векторам, определенным как выделенные вирусные векторы, отличающиеся тем, что по меньшей мере один T-клеточный эпитоп, присутствующий по меньшей мере в одном из белков вирусного вектора, модифицирован посредством введения остатка цистеина, как описано для иммуногенных пептидов по изобретению. В одном варианте его осуществления указанный вирусный вектор дополнительно отличается тем, что указанный модифицированный T-клеточный эпитоп способен быть представленным детерминантой MHC класса II. В другом варианте осуществления указанные выделенные вирусные векторы дополнительно отличаются тем, что их свойства трансдукции клеток значительно не отличаются по сравнению с таким же вирусным вектором, не несущим модификацию T-клеточного эпитопа.

Когда введение одного или нескольких пептидов по изобретению обеспечивают посредством переноса гена (т.е. введения нуклеиновой кислоты, обеспечивающей экспрессию пептидов по изобретению in vivo после введения), подходящую дозу нуклеиновой кислоты можно определять на основании количества пептида, экспрессированного в результате введения нуклеиновой кислоты.

Лекарственное средство по изобретению обычно, но не обязательно, представляет собой (фармацевтический) состав, содержащий в качестве активного ингредиента по меньшей мере один из иммуногенных пептидов по изобретению, (популяцию) CD4+ эффекторных T-клеток или (популяцию) CD4+ регуляторных T-клеток, специфических для указанного иммуногенного пептида, или генотерапевтический вектор, способный экспрессировать указанный иммуногенный пептид. Помимо активного ингредиента(ингредиентов), такой состав может содержать по меньшей мере один из (фармацевтически приемлемых) разбавителя, растворителя, носителя или адъюванта. Как правило, фармацевтически приемлемые соединения (такие как разбавители, растворители, носители и адъюванты) можно обнаружить, например, в руководстве Фармакопеи (например, Фармакопеи США, Европейской или Международной Фармакопеи). Лекарственное средство или фармацевтическая композиция по изобретению обычно содержит (профилактически или терапевтически) эффективное количество активного ингредиента(ингредиентов), где эффективность присутствует по отношению к состоянию или нарушению, подлежащего предотвращению или лечению. В частности, фармацевтические композиции по изобретению представляют собой вакцины для профилактического или терапевтического применения.

Лекарственное средство или фармацевтическую композицию по изобретению может являться необходимым вводить нуждающемуся в этом субъекту в качестве части профилактического или терапевтического режима, включающего многократные введения указанного лекарственного средства или композиции. Указанные многократные введения обычно происходят последовательно, и временной интервал между двумя введениями может меняться, и его можно корректировать в соответствии с природой активного ингредиента и природой состояния, подлежащего предотвращению или лечению. Количество активного ингредиента, вводимого нуждающемуся субъекту в отдельном введении, также может меняться и может зависеть от таких факторов, как физический статус субъекта (например, масса, возраст), статус состояния, подлежащего предотвращению или лечению, и опыт лечащего врача, терапевта или медсестры.

Термин «разбавители» означает, например, физиологические солевые растворы. Термин «адъювант» обычно означает фармакологическое или иммунологическое средство, которое модифицирует (предпочтительно, увеличивает) эффект других средств (например, лекарственных средств, вакцин), в то же время оказывая, если оказывает, мало прямых эффектов при отдельном введении. В качестве одного примера адъюванта приведен гидроксид алюминия (квасцы), на котором можно адсорбировать иммуногенный пептид по изобретению. Кроме того, множество других адъювантов известно в данной области, и их можно использовать при условии, что они облегчают представление пептида на МНС класса II и активацию T-клеток. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает любой материал или вещество, с которым активный ингредиент составляют для облегчения его введения или распространения в подлежащей лечению локализации, например, посредством растворения, дисперсии или диффузии указанной композиции, и/или для облегчения его хранения, транспортировки или манипуляций с ним без нарушения его эффективности. Они включают все без исключения растворители, диспергенты, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства (например, фенол, сорбиновую кислоту, хлорбутанол), изотонические средства (такие как сахара или хлорид натрия) и т.п. Дополнительные ингредиенты можно включать для контроля продолжительности действия активного ингредиента в композиции. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой твердое вещество или жидкость, или газ, сжатый до образования жидкости, т.е. композиции по этому изобретению можно подходящим образом использовать в форме концентратов, эмульсий, растворов, гранул, пыли, спреев, аэрозолей, суспензий, мазей, кремов, таблеток, шариков или порошков. Пригодные фармацевтические носители для использования в указанных фармацевтических композициях и их составление хорошо известны специалистам в данной области, и не существует особенных ограничений для их выбора в объеме настоящего изобретения. Они могут также включать добавки, такие как увлажняющие средства, диспергирующие средства, клейкие вещества, адгезивные средства, эмульгаторы, растворители, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства (например, фенол, сорбиновая кислота, хлорбутанол), изотонические средства (такие как сахара или хлорид натрия) и т.п., при условии, что они совместимы с фармацевтической практикой, т.е. носители и добавки, которые не вызывают постоянных повреждений у млекопитающих. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно получать любым известным способом, например, посредством гомогенного смешивания, покрытия и/или размола активных ингредиентов, в одностадийном или многостадийном способе, с выбранным материалом носителя и, когда это целесообразно, другими добавками, такими как поверхностно-активные средства. Их можно получать также посредством тонкого измельчения, например, с целью их получения в форме микросфер, обычно обладающих диаметром приблизительно от 1 до 10 мкм, а именно, для изготовления микрокапсул для контролируемого или замедленного высвобождения активных ингредиентов.

Иммуногенные пептиды, их гомологи или производные по изобретению (и их физиологически приемлемые соли или фармацевтические композиции - все включенные в термин «активные ингредиенты») можно вводить любым способом, пригодным для состояния, подлежащего предотвращению или лечению, и пригодным для соединений в настоящем документе иммуногенных белков, подлежащих введению. Возможные способы включают местный, системный, пероральный (в форме твердого вещества или ингаляции), ректальный, назальный, местный (включая глазной, буккальный и подъязычный), вагинальный и парентеральный (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрикожный, внутриартериальный, интратекальный и эпидуральный). Предпочтительный способ введения может меняться, например, с состоянием реципиента или с состоянием, подлежащим предотвращению или лечению.

Составы можно удобным образом предоставлять в единичной дозированной форме и можно получать любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики. Составы по настоящему изобретению, пригодные для перорального введения, можно предоставлять в форме дискретных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, где каждая содержит предопределенное количество активного ингредиента; в форме порошка или гранул; в форме раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости; или в форме жидкой эмульсии масло-в-воде или жидкой эмульсии вода-в-масле. Активный ингредиент можно предоставлять также в форме болюса, электуария или пасты. Таблетку можно получать прессованием или отливкой, необязательно с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки можно получать прессованием в пригодном аппарате активного ингредиента в свободно текучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанные со связующим, смазывающим веществом, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим средством. Литые таблетки можно получать отливкой в пригодном аппарате смеси порошкообразного соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем. Таблетки можно, необязательно, снабжать покрытием или насечкой и можно составлять так, чтобы обеспечивать замедленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента в настоящем документе.

Настоящее изобретение в настоящее время проиллюстрировано посредством следующих примеров, представленных без намерения какого-либо ограничения. Более того, содержание всех ссылок, описанных в настоящем документе, явным образом приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Аллерген клеща домашней пыли Der p2 представляет собой негликозилированный белок 14 кДа, содержащий рестрицированный по H-2b или H-2d MHC класса II эпитоп, или последовательность EPCIIHRGKPF (SEQ ID NO:1; аминокислотные остатки 25-35 Der p2), в которой E соответствует первому заякоренному остатку. Аминоконцевые фланкирующие остатки, последовательности CHGS (SEQ ID NO:2; аминокислотные остатки 21-24 Der p2) включают моноцистеиновый мотив глутаредоксина.

Чтобы определить, увеличивает ли остаток цистеина, расположенный в P(-4), пролиферативный ответ специфических CD4+ эффекторных T-клеток после сопряженного взаимодействия с антигенпредставляющими клетками, нагруженными пептидом, содержащим аминокислоты CHGSEPCIIHRGKPF (аминокислотные остатки, фланкирующие участок связывания MHC, подчеркнуты) (SEQ ID NO:3), каждый из 4 аминокислотных остатков фланкирующей последовательности заменяли на аланин.

Истощенные по T-клеткам обработанные митомицином С спленоциты из наивных мышей BALB/с использовали в качестве антигенпредставляющих клеток и нагружали различными мутантными пептидами (0,1 мкМ). Затем специфический для p21-35 (SEQ ID NO:3) клон CD4+ T-клеток добавляли к культуре для 48-час инкубации, после которой добавляли ³H-тимидин, и его включение измеряли после дополнительных 18 час культивирования. Результаты показаны на фигуре 1 как процент включения, полученный сравнением с последовательностью p21-35 дикого типа (SEQ ID NO:3). Они показывают, что замена цистеина в P(-4) на аланин (пептид SEQ ID NO:4: AHGSEPCIIHRGKPF) снижала на 70% пролиферативный ответ специфического клона T-клеток. Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.

Пример 2

Химерный ген NPM-ALK кодирует конститутивно активированную тирозинкиназу, как показано, являющуюся сильным онкогеном. Этот слитый ген состоит из нуклеофосмина (NPM) и нового гена рецепторной тирозинкиназы, названной киназой анапластической лимфомы (ALK). Для линий клеток лимфомы, полученных из линий мышей, сделанных трансгенными по слитому белку NPM-ALK, показаны онкогенные свойства. При инокуляции иммунокомпетентному реципиенту такие клетки развиваются в агрессивные опухоли. Фенотипическая оценка таких линий клеток опухоли показала, что они не экспрессируют детерминанты главного комплекса гистосовместимости класса II, но являются положительными по детерминантам MHC класса I.

Мышам C57BL/6 инокулировали посредством подкожной инъекции клеток опухоли NPM-ALK (2×10⁶ клеток опухоли (клетки R80 NPM-ALK, H-2b-рестрицированные), суспендированных в 100 мкл PBS и инъецированных подкожно в бок через 10 суток после последней инъекции пептида, и рост опухоли оценивали с помощью штангенциркуля. Как правило, у таких мышей в пределах 5-6 суток развивались опухоли, которые затем росли с достижением диаметра ± 12 мм в пределах 3 недель. Мышей C57BL/6 иммунизировали перед инокуляцией клеток опухолей 50 мкг пептида последовательности YCT QDPDVINTA (SEQ ID NO:5), 4 раза и с интервалами 10 суток; пептид являлся адсорбированным на носителе квасцах (гидрат оксида алюминия). Этот рестрицированный по MHC класса II эпитоп представляет собой непрерывную часть белка ALK и соответствует аминокислотам 1385-1396 белка ALK, как приведено под номером доступа в GenBank Q9UM73 (вариант Q9UM73.2). Клетки опухоли инокулировали через 10 суток после последней иммунизации. Рост опухоли отслеживали у предварительно иммунизированных мышей и сравнивали с ростом в контрольной группе, которая не являлась предварительно иммунизированной. Результаты, представленные на фигуре 2, показывают, что рост опухоли являлся сильно сниженным у предварительно иммунизированных мышей. Для пептида последовательности YCTQDPDVINTA (SEQ ID NO:5) показали усиление активации ALK-специфических CD4+ T-клеток. Различие между группами являлось высоко значимым на сутки 20 (p<0,008), как оценивали по U-критерию Манна-Уитни.

Пример 3

Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis является ответственной за тысячи смертей ежегодно. Единственная доступная вакцинация, вакцина на основе Mycobacterium bovis Кальметта-Герена (BCG), не является эффективной. Кроме того, для нескольких штаммов Mycobacterium показана устойчивость к общепринятой химиотерапии. Известно, что при туберкулезе возникают антигенспецифические CD4+ клетки (Winslow et al. (2003) J. Immunol. 170: 2046-2052), которые могут являться защитными (Khader et al. (2007) Nature Immunol. 8:369-377).

M. tuberculosis продуцирует ряд антигенов, представляемых детерминантами как MHC класса I, так и MHC класса II. Антигены, представляемые детерминантами класса I, узнаются CD8+ T-лимфоцитами, обладающими цитолитической активностью, направленной на уничтожение клеток, инфицированных M. tuberculosis. Однако у пациентов - хронических носителей этот механизм не является достаточно эффективным для уничтожения инфицированных клеток.

CD8+ T-клеткам необходима помощь других подгрупп лимфоцитов, и в частности, клеток, принадлежащих линии CD4+. Активация CD4+ T-клеток приводит к продукции IL-2, обеспечивающей необходимый сигнал для CD8+ T-клеток для приобретения полного цитолитического потенциала. Терапевтический способ, посредством которого специфические CD4+ T-клетки можно активировать, может, таким образом, предоставлять преимущества для зависимого от CD8+ T-клеток уничтожения клеток, инфицированных M. tuberculosis.

Одним из лучших антигенов-кандидатов для такой цели является антиген 85b (Ag85b), белок, продуцируемый внутриклеточной M. tuberculosis. Картирован доминантный T-клеточный эпитоп, соответствующий аминокислотной последовательности 266-275. Полная последовательность такого эпитопа представляет собой YWGAQLNAM (SEQ ID NO:6).

Исследование фланкирующих остатков как на амино-, так и на карбокси-концах SEQ ID NO:6 не идентифицировало цистеина в пределах длины 6 аминокислот. В положении P-4 на амино-конце пептида добавляли остаток цистеина, образующий модифицированный T-клеточный эпитоп с последовательностью: CSWE YWGAQLNAM (SEQ ID NO:7; цистеин подчеркнут и предшествует аминокислотам 163-275 антигена Ag85b).

Мышей C57BL/6 иммунизировали пептидом SEQ ID NO:7 вместе с адъювантом, таким как квасцы. Три инъекции по 50 мкг пептида выполняли с интервалами в две недели. Через две недели после последней иммунизации мышей умерщвляли, и CD4+ T лимфоциты получали из селезенки посредством комбинации центрифугирования в градиенте плотности и отбора на покрытых антителом магнитных бусинах. Затем CD4+ T-клетки активировали и размножали in vitro с использованием антигенпредставляющих клеток, нагруженных пептидом SEQ ID NO:7, и клонировали посредством предельного разведения.

Для контрольных экспериментов мышей C57BL/6 иммунизировали пептидом SEQ ID NO:6. CD4+ T-клетки получали из селезенки, как описано выше, с использованием комбинации стадий отбора на покрытых антителом магнитных бусинах.

Для получения источника специфических CD8+ T-клеток селезенки мышей C57BL/6 иммунизировали рекомбинантным Ag85b, и CD8+ T-клетки получали из селезенки, как описано выше, с использованием магнитных бусин, нагруженных анти-CD8+ антителом.

Макрофаги, полученные от мышей C57BL/6, инкубировали с Ag85b в течение 60 минут при 37°C и в течение ночи при 4°C для поглощения белка и представления на детерминантах MHC как класса I, так и класса II. Такие макрофаги далее инкубировали с ⁵¹Cr для оценки зависимого от CD8 T-клеток уничтожения макрофагов с использованием анализа высвобождения хрома.

Для тестирования способности CD4+ T-клеток активировать CD8+ T-клетки для лизиса макрофагов проводили следующие эксперименты. В культуры меченых ⁵¹Cr макрофагов, представляющих полученные из Ag85b эпитопы, CD4+T-клетки, полученные, как описано выше, от мышей, инъецированных пептидом SEQ ID NO:7, добавляют вместе с популяцией CD8+ T-клеток, полученных от мышей, иммунизированных Ag85b. В качестве контрольного эксперимента CD4+ T-клетки, полученные от мышей, иммунизированных пептидом SEQ ID NO:6, инкубировали с макрофагами и CD8+, полученными от животных, иммунизированных Ag85b.

Можно видеть, что значительную степень лизиса макрофагов (как измерено по высвобождению ⁵¹Cr) получили, когда CD4+ T-клетки получали от мышей, иммунизированных пептидом SEQ ID NO:7, но с CD4+, стимулированными иммунизацией пептидом SEQ ID NO:6.

Таким образом, заключили, что присутствие цистеина в областях, фланкирующих области рестрицированных по классу II T-клеточных эпитопов, является достаточным для усиления уничтожения макрофагов, представляющих полученные из Ag85b T-клеточные эпитопы. На это уничтожение оказывают влияние высоко активированные CD8+ T-клетки.

Пример 4

Вирус гриппа

Вирус гриппа, подобно любому другому вирусу, представляет собой облигатный внутриклеточный патоген. Хорошо известно, что он поражает миллионы людей ежегодно по причинам, связанным с его высокой степенью контагиозности и способности быстро мутировать, делая приобретенный иммунитет неэффективным от одного года к другому. Вирус приводит к очень значительной заболеваемости и смертности. В современных способах вакцинации используют поверхностные белки, такие как гемагглютинин и нейраминидаза, которые индуцируют высокие титры специфических антител, но являются довольно неэффективными для стимуляции цитолитических T-клеток, которые могут уничтожать инфицированные клетки.

Антиген гемагглютинина несет ряд T-клеточных эпитопов, представляемых в контексте детерминант МНС класса II и активирующих эффекторные T-клетки, которые оказывают помощь для продукции специфических антител. Рестрицированные по классу I T-клеточные эпитопы также продуцируются со стимуляцией CD8+ T-клеток. Однако цитолитическая активность CD8+ T-клеток по отношению к инфицированным клеткам является недостаточной для прекращения распространения инфекции в организме. Способ, посредством которого можно увеличивать активность цитотоксических CD8+ T-клеток, может предоставлять преимущества для предотвращения и лечения инфекции гриппа.

Таким образом, пептид YSTVASSLV (SEQ ID NO:8; аминокислоты 534-542 аминокислотной последовательности предшественника гемагглютинина, например, из номера доступа в GenBank AF408859_1) содержит рестрицированный по классу II T-клеточный эпитоп из вируса гриппа H1N9. Исследование последовательности фланкирующих остатков показало, что остатков цистеина не локализовано во фланкирующих областях не более 6 аминокислот на амино- или карбокси-конце.

Получен синтетический пептид, содержащий остаток цистеина в положении P-4, с последовательностью CLAI YSTVASSLV LLV (SEQ ID NO:9; цистеин подчеркнут и предшествует аминокислотам 531-545 аминокислотной последовательности предшественника гемагглютинина, например, с номером доступа в GenBank AF408859_1), который также содержит 3 аминокислоты фланкирующей области с карбокси-конца.

Пептиды SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:8 использовали для иммунизации мышей C57BL/6 с использованием такого же способа, как описано в примере 3, для получения популяций специфических CD4+ T-клеток.

Группу мышей C57BL/6 иммунизировали рекомбинантным гемагглютинином вируса гриппа H1N9 для получения источника специфических CD8+ T-клеток, как описано в примере 3.

CD4+ T-клетки получали из селезенок каждой группы мышей, иммунизированных пептидами SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:9.

Дендритные клетки нагружали рекомбинантным гемагглютинином вируса гриппа H1N9 для представления эпитопов в детерминантах как класса I, так и класса II. Культуры нагруженных дендритных клеток инкубировали также с ⁵¹Cr в качестве маркера лизиса дендритных клеток (анализ высвобождения хрома).

Инкубация таких дендритных клеток с CD4+ T-клетками от мышей, иммунизированных пептидом SEQ ID N09, вместе с CD8+ T-клетками, полученными от мышей, иммунизированных гемагглютинином, индуцировала значительный лизис нагруженных гемагглютинином дендритных клеток, в то время как в экспериментах, проводимых с CD4+ T-клетками, полученными после иммунизации пептидом SEQ ID NO:8, не показали лизиса. Исключение CD8+ T-клеток из культуры полностью супрессировало цитолиз дендритных клеток, что указывает на то, что этот лизис являлся опосредованным активированными CD8+ T-клетками.

Таким образом, введение одиночного остатка цистеина внутри фланкирующих областей рестрицированных по классу II T-клеточных эпитопов, является достаточным для усиления активации CD8+ T-клеток, приводящего к значительному лизису клеток-мишеней.

Пример 5

Антитела против аллофакторов

Введение терапевтического белка (называемого аллофактором в настоящем примере) является общепринятой практикой в медицине. Одним из примеров является введение фактора VIII пути свертывания крови пациентам с гемофилией A. К сожалению, во многих случаях, такое введение приводит к стимуляции антител, которые узнают терапевтический белок и нейтрализуют его активность. При гемофилии A у приблизительно 30% пациентов после лечения инфузиями фактора VIII развиваются антитела, ингибирующие прокоагулянтную активность фактора VIII. Таким образом, является преимущественным иметь способ, посредством которого можно специфически исключать нежелательные антитела против аллофакторов.

Антитело BO2C11 представляет собой моноклональное антитело человека, которое ингибирует функцию фактора VIII посредством связывания с доменом C2 и, таким образом, предотвращает связывание фактора VIII с фосфолипидами (Jacquemin et al. (1998) Blood 92: 496-506). Последовательность вариабельной части тяжелой цепи (область VH) BO2C11 содержит рестрицированный по классу II T-клеточный эпитоп, который перекрывается с определяющей комплементарность областью 3 (CDR 3). Стимуляция антител против BO2C11 посредством стимуляции CD4+ T-клеток, узнающих такой эпитоп, может составлять специфический способ исключения антител BO2C11, как посредством формирования комплексов с циркулирующим BO2C11, так и посредством супрессии продукции антитела BO2C11 на уровне В-клеточного рецептора.

Последовательность YCAVPDPDA (SEQ ID NO: 10; соответствующая аминокислотам 114-122 из аминокислотной последовательности с номером доступа в GenBank CAA11829) содержит рестрицированный по классу II T-клеточный эпитоп, локализованный в области CDR3 области VH BO2C11.

Исследование аминокислотной последовательности как на амино-, так и на карбокси-концах этого эпитопа не идентифицировало цистеина в пределах 6 аминокислот. Получен пептид, в котором остаток цистеина добавляли в положении P-4, получая последовательность CAVY YCAVPDPDA FDI (SEQ ID NO:11; цистеин подчеркнут и предшествует аминокислотам 111-125 из аминокислотной последовательности с номером доступа в GenBank CAA11829), включая 3 аминокислоты природной фланкирующей последовательности карбокси-конца.

Получена линия мышей, экспрессирующая молекулу BO2C11 в качестве В-клеточного рецептора. Таких мышей иммунизировали пептидами SEQ ID NO:11, адсорбированными на квасцах, с использованием 50 мкг на 4 введения с 10-суточными интервалами. Затем у мышей отбирали кровь и тестировали на присутствие антител, узнающих пептид SEQ ID NO:10, и антитело BO2C11, как оценивали посредством ELISA с прямым связыванием. Детектировали высокие концентрации антител либо против пептида SEQ ID 10, либо против антитела BO2C11.

Более того, присутствие BO2C11 BCR на циркулирующих В-клетках, В-клетках селезенки и костного мозга оценивали посредством FACS с использованием антитела против Fc-гамма человека. Показано, что мыши, иммунизированные пептидом SEQ ID 11, не имеют В-клеток, экспрессирующих трансгенный BCR, в кровотоке, селезенке или костном мозге.

Заключили, что введение пептида, содержащего рестрицированный по классу II T-клеточный эпитоп, полученный из области VH антитела, и содержащего цистеин внутри фланкирующих остатков, приводит к уничтожению антитела-мишени и В-клеток, продуцирующих такое антитело.

Пример 6

Антитела против T-клеточного рецептора

Патогенные CD4+ T-клетки рассматривают как ключевые элементы в ряде патологий, включая аллергические и аутоиммунные заболевания. Такие клетки продуцируют цитокины, чтобы помогать В-клеткам продуцировать антитела и предоставлять помощь CD8+ T-клеткам для полной активации и приобретения эффекторных функций. Способ, посредством которого было бы возможно специфически уничтожать патогенные CD4+ T-клетки, является, таким образом, очень желательным.

Альфа-бета T-клеточный рецептор (TCR) CD4+ T-клеток содержит вариабельные части внутри тяжелой и легкой цепей. Такие вариабельные части содержат рестрицированные по классу II T-клеточные эпитопы, которые можно использовать в объеме настоящего изобретения.

Клон G121 представляет собой CD4+ T-клетки, полученные против аллергена Der p 2 Dermatophagus pteronyssinus. Область VH TCR содержит рестрицированный по классу II T-клеточный эпитоп последовательности: VYFCASSER (SEQ ID NO:12), соответствующий аминокислотам 106-114 области VH TCR G121. Эта последовательность содержит на карбокси-конце 5 аминокислот, принадлежащих области CDR 3 VH.

Исследование последовательности фланкирующих остатков не идентифицировало цистеина внутри последовательности из 6 аминокислот либо на амино-, либо на карбокси-конце эпитопа. Получен пептид, в котором остаток цистеина добавляли в положении P-4, получая последовательность CQTA VYFCASSER TGG (SEQ ID NO:13, цистеин подчеркнут), включая 3 аминокислоты природной фланкирующей последовательности карбокси-конца.

Мышей BALB/с иммунизировали пептидом SEQ ID N013, как описано в примере 5, для происходящих из антител T-клеточных эпитопов. Клон G121 CD4+ T-клеток метили CFSE и вводили иммунизированным мышам посредством инъекции 200000 клеток на мышь в хвостовую вену. Через одни сутки после введения клеток мышей умерщвляли, и присутствие меченого CFSE клона G121 детектировали в периферической крови и селезенке посредством анализа FACS. Показано, что мыши, иммунизированные пептидом SEQ ID NO:13, не имели остаточных клеток G121 в периферической крови или селезенке. Контрольные эксперименты проведенные с неимунизированными мышами, показали меченые CFSE клетки G121 в селезенке.

Кроме того, сыворотка иммунизированных мышей содержит антитела против TCR G121, как идентифицировано анализом Facs, в котором клетки G121 сначала инкубировали с разведением сыворотки мышей, иммунизированных пептидом SEQ ID N013, промывали и затем инкубировали с меченым FITC антителом против Fc-гамма мыши.

Заключили, что иммунизация пептидом, содержащим рестрицированный по классу II T-клеточный эпитоп, локализованный в вариабельной области TCR, вызывает ответ антител, достаточный для уничтожения клеток, несущих соответствующий эпитоп, а именно, клона G121.

Пример 7

ALK+ опухоли

Эксперименты, описанные в примере 2, показали, что прямая иммунизация мышей пептидом, содержащим рестрицированный по классу II эпитоп ALK, содержащий одиночный цистеин во фланкирующих остатках, приводила к значительной задержке роста опухоли и уменьшению размера опухоли. Пептид SEQ ID NO:5 вызывал повышенную активацию свойств рестрицированных по классу II CD4+ T-клеток. Эффект in vivo такой предварительной иммунизации приписывали стимуляции CD8+ T-клеток с цитолитическими свойствами для клеток опухолей. В данной области хорошо известно, что CD8+ T-клеткам необходима помощь, оказываемая CD4+ T-клетками, для приобретения полных эффекторных свойств.

Для подтверждения того, что повышенная активация специфических CD4+ T-клеток представляла собой первичный эффект, возникающий в результате иммунизации эпитопами, содержащими одиночный цистеин во фланкирующих остатках (как проиллюстрировано пептидом SEQ ID NO:5), авторы настоящего изобретения разработали эксперимент in vitro, в котором наивные CD4+ T-клетки превращали в сильные эффекторные клетки посредством воздействия рестрицированного по классу II эпитопа ALK.

Таким образом, наивные CD4+ T-клетки выделяли из селезенки мышей C57BL/6 с использованием сортировки на магнитных бусинах. Клетки инкубировали с сингенными дендритными клетками, нагруженными пептидом последовательности GAA EGG WTGPGAGPR (SEQ ID NO:14), соответствующим аминокислотам 1541-1555 белка ALK в его природной последовательности или последовательности дикого типа (wt на фигуре), или пептидом последовательности CGG WTGPGAGPR (SEQ ID NO:15), в которой одиночный цистеин добавляли в положении 1544 белка ALK.

После четырех циклов стимуляции с использованием 20 мкг каждого пептида клетки промывали и добавляли в соотношении 5/1 к истощенным по T-клеткам спленоцитам, используемым в качестве антигенпредставляющих клеток и нагруженным 1 мкМ или 10 мкМ пептидом SEQ ID NO:14.

Фигура 3 показывает, что скорость пролиферации CD4+ T-клеток, как оценено по включению тритилированного тимидина, являлась значительно увеличенной, когда пептид, содержащий одиночный цистеин (SEQ ID NO:15), использовали для стимуляции CD4+ T-клеток.

Следующие последовательности описаны в настоящей заявке и включены в список последовательностей:

1. Способ получения популяции активированных не цитолитических CD4+ T-клеток, продуцирующих IL-2, in vitro, где способ включает стадию введения в популяцию клеток периферической крови искусственного иммуногенного пептида длиной от 9 до 30 аминокислот, где пептид содержит:

a) T-клеточный эпитоп из 8 или 9 аминокислот антигенного белка для MHC класса II и

b) N-концевой или C-концевой цистеин в пределах от 1 до 6 аминокислот N-концевой или соответственно С-концевой стороны указанной последовательности эпитопа из 8 или 9 аминокислот из a), где указанный цистеин из b) представляет собой восстанавливающий остаток цистеина, где указанный цистеин не образует часть последовательности мотива с окислительно-восстановительной активностью C-xx-[CST] или [CST]-xx-C, где указанный восстанавливающий остаток цистеина не является частью дисульфидного мостика, и где «x» представляет собой любую аминокислоту, где указанный T-клеточный эпитоп представляет собой T-клеточный эпитоп собственного антигена, аллергена, аллофактора или антигена аллотрансплантата, T-клеточный эпитоп, специфический или предпочтительный для опухоли, или T-клеточный эпитоп инфекционного агента.

2. Способ по п.1, где последовательность, определенная в части b), содержит только один цистеин.

3. Способ по п.1, где иммуногенный пептид имеет длину от 9 до 20 аминокислот.

4. Способ по п.1, где указанный остаток цистеина локализован непосредственно с N- или С-конца от эпитопа из 8 или 9 аминокислот, без аминокислот между последовательностью указанного эпитопа и указанным остатком цистеина.

5. Искусственный иммуногенный пептид длиной от 9 до 30 аминокислот, способный активировать нецитолитические CD4+ Т-клетки, продуцирующие IL-2, и содержащий:

a) T-клеточный эпитоп из 8 или 9 аминокислот антигенного белка для MHC класса II, где указанный T-клеточный эпитоп представляет собой T-клеточный эпитоп собственного антигена,

b) N-концевой или C-концевой цистеин в пределах от 1 до 6 аминокислот N-концевой или соответственно C-концевой стороны указанной последовательности эпитопа из 8 или 9 аминокислот из a), где указанный цистеин из b) представляет собой восстанавливающий остаток цистеина, где указанный цистеин не образует часть последовательности мотива с окислительно-восстановительной активностью C-xx-[CST] или [CST]-xx-C, где указанный восстанавливающий остаток цистеина не является частью дисульфидного мостика, и где «x» представляет собой любую аминокислоту, для применения в лечении или предотвращении аутоиммунного заболевания.

6. Искусственный иммуногенный пептид длиной от 9 до 30 аминокислот, способный активировать нецитолитические CD4+ Т-клетки, продуцирующие IL-2, и содержащий:

a) T-клеточный эпитоп из 8 или 9 аминокислот антигенного белка для MHC класса II, где указанный T-клеточный эпитоп представляет собой T-клеточный эпитоп аллергена,

b) N-концевой или C-концевой цистеин в пределах от 1 до 6 аминокислот N-концевой или соответственно C-концевой стороны указанной последовательности эпитопа из 8 или 9 аминокислот из a), где указанный цистеин из b) представляет собой восстанавливающий остаток цистеина, где указанный цистеин не образует часть последовательности мотива с окислительно-восстановительной активностью C-xx-[CST] или [CST]-xx-C, где указанный восстанавливающий остаток цистеина не является частью дисульфидного мостика, и где «x» представляет собой любую аминокислоту, для применения в лечении или предотвращении аллергического заболевания.

7. Искусственный иммуногенный пептид длиной от 9 до 30 аминокислот, способный активировать нецитолитические CD4+ Т-клетки, продуцирующие IL-2, и содержащий:

a) T-клеточный эпитоп из 8 или 9 аминокислот антигенного белка для MHC класса II, где указанный T-клеточный эпитоп представляет собой T-клеточный эпитоп аллофактора или антигена аллотрансплантата,

b) N-концевой или C-концевой цистеин в пределах от 1 до 6 аминокислот N-концевой или соответственно C-концевой стороны указанной последовательности эпитопа из 8 или 9 аминокислот из a), где указанный цистеин из b) представляет собой восстанавливающий остаток цистеина, где указанный цистеин не образует часть последовательности мотива с окислительно-восстановительной активностью C-xx-[CST] или [CST]-xx-C, где указанный восстанавливающий остаток цистеина не является частью дисульфидного мостика, и где «x» представляет собой любую аминокислоту, для применения в лечении или предотвращении иммунного ответа на аллоантиген.

8. Искусственный иммуногенный пептид длиной от 9 до 30 аминокислот, способный активировать нецитолитические CD4+ Т-клетки, продуцирующие IL-2, и содержащий:

a) T-клеточный эпитоп из 8 или 9 аминокислот антигенного белка для MHC класса II, где указанный T-клеточный эпитоп представляет собой T-клеточный эпитоп T-клеточного эпитопа, специфического или предпочтительного для опухоли,

b) N-концевой или C-концевой цистеин в пределах от 1 до 6 аминокислот N-концевой или соответственно C-концевой стороны указанной последовательности эпитопа из 8 или 9 аминокислот из a), где указанный цистеин из b) представляет собой восстанавливающий остаток цистеина, где указанный цистеин не образует часть последовательности мотива с окислительно-восстановительной активностью C-xx-[CST] или [CST]-xx-C, где указанный восстанавливающий остаток цистеина не является частью дисульфидного мостика, и где «x» представляет собой любую аминокислоту, для применения в лечении или предотвращении опухоли.

9. Искусственный иммуногенный пептид длиной от 9 до 30 аминокислот, способный активировать нецитолитические CD4+ Т-клетки, продуцирующие IL-2, и содержащий:

a) T-клеточный эпитоп из 8 или 9 аминокислот антигенного белка для MHC класса II, где указанный T-клеточный эпитоп представляет собой T-клеточный эпитоп T-клеточного эпитопа инфекционного агента, и

b) N-концевой или C-концевой цистеин в пределах от 1 до 6 аминокислот N-концевой или соответственно C-концевой стороны указанной последовательности эпитопа из 8 или 9 аминокислот из a), где указанный цистеин из b) представляет собой восстанавливающий остаток цистеина, где указанный цистеин не образует часть последовательности мотива с окислительно-восстановительной активностью C-xx-[CST] или [CST]-xx-C, где указанный восстанавливающий остаток цистеина не является частью дисульфидного мостика, и где «x» представляет собой любую аминокислоту, для применения в лечении или предотвращении инфекционного заболевания.

10. Пептид по любому из пп.5-9, где последовательность, определенная в части b), содержит только один цистеин.

11. Пептид по любому из пп.5-9, имеющий длину от 9 до 20 аминокислот.

12. Применение пептида по п.5 в лечении или предотвращении аутоиммунного заболевания.

13. Применение пептида по п.6 в лечении или предотвращении аллергического заболевания.

14. Применение пептида по п.7 в лечении или предотвращении иммунного ответа на аллоантиген.

15. Применение пептида по п.8 в лечении или предотвращении опухоли.

16. Применение пептида по п.9 в лечении или предотвращении инфекционного заболевания.

17. Способ лечения или предотвращения аутоиммунного заболевания, включающий стадию введения эффективного количества искусственного иммуногенного пептида по п.5.

18. Способ лечения или предотвращения аллергического заболевания, включающий стадию введения эффективного количества искусственного иммуногенного пептида по п.6.

19. Способ лечения или предотвращения иммунного ответа на аллоантиген, включающий стадию введения эффективного количества искусственного иммуногенного пептида по п.7.

20. Способ лечения или предотвращения опухоли, включающий стадию введения эффективного количества искусственного иммуногенного пептида по п.8.

21. Способ лечения или предотвращения нарушения инфекционного заболевания, включающий стадию введения эффективного количества искусственного иммуногенного пептида по п.9.