Тест-система для идентификации днк ткани ежа обыкновенного (erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест-систему для идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающую буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью: T4F: 5`-TACATATAAATCACGCAAAGC-3` - прямой праймер; T4R: 5`- TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3` - обратный праймер; Т4Р: НЕХ-5`-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3`-BHQ1 - зонд, взятых в объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца используют фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) со следующей нуклеотидной последовательностью: Hed-F: 5`-AGTCTATTGATTCGAATAGAGC-3` - прямой праймер; Hed-R: 5`-CATGAGAGGTACTAACCAGT-3` - обратный праймер; Hed-P: FAM-5`-CAGGAGCTTTATTAGGTGATGATCAG-3-BHQ1 – зонд. Изобретение позволяет расширить функциональные возможности, повысить точность идентификации видовой принадлежности, упрощение процесса подготовки проб. 5 табл.

 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к методам определения видовой принадлежности мяса с помощью полимеразной цепной реакции.

Известно использование тест-системы при проведении ПЦР в реальном времени для определения ДНК тканей животных в мясном продукте (CN 108624659 A, кл C12G 1/6851, 2018 г.).

Также известно техническое решение содержащее набор идентификации ДНК животных, входящих группу: мышь, крыса, собака, кошка и др. в кормах и мясных продуктах (патент РФ №2560579, C12Q 1/68, 2015 г.), включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец и другие контрольные образцы.

Однако известный набор используется для полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией, в которой нуклеотидная последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза, что влияет на точность диагностирования видовой принадлежности ткани животного в кормах и мясных продуктах.

Наиболее близким по технической сущности является техническое решение (патент РФ №2680094, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2019 г.) включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

взятых в объемном соотношении 1:1.

Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности выявления ДНК ткани ежа в кормах и пищевых продуктах, недостаточная точность из-за использования суспензии бактериофага, которая требует предварительную обработку, включая центрифугирование, концентрирование и перевод в определенный буферный раствор, что влечет за собой значительную трудоемкость и финансовые затраты, а также использование генома бактериофага Т4 с возможными повреждениями после исследования, что также влияет на точность выявления объекта. Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности идентификации видовой принадлежности ткани ежа, упрощение процесса подготовки внутреннего контроля и уменьшение стоимости этого процесса.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающей буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

взятых в объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) со следующей нуклеотидной последовательностью:

Новизна заявляемой тест-системы состоит в идентификации видовой принадлежности тканей ежа обыкновенного с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, что в свою очередь позволяет с высокой точностью определить наличие их ингредиентов в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемая тест-система рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Тест-система идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах используется следующим образом.

Для исследования сухих кормов и мясных полуфабрикатов на содержание ДНК ткани ежа обыкновенного проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Для повышения точности идентификации мяса для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую фрагменты геномов ДНК тканей ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) и нативного бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: фаголизата и фрагмента генома нативного бактериофага со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов. Кроме того, использование фаголизата бактериофага Т4, представляющего собой суспензию бактериофага, полученную после лизиса зараженных фагом клеток ткани, повышает чувствительность и упрощает процесс идентификации ткани ежа обыкновенного в продуктах.

При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.

Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.

Праймеры, специфичные для ДНК ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) были отобраны на основе нуклеотидной последовательности митохондриального гена (Erinaceus europaeus mitochondrion, complete genome. 17447 bp DNA circular MAM 10-SEP-2009) на участке между 5400 и 5800 нуклеотидами. Код доступа нуклеотидной последовательности в GeneBank NCBI: NC_002080.

Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы на специфичность с использованием программы BLAST на сервере NCBI. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Hed-P (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, фланкированной позициями для праймеров Hed-F и Hed-R). На 5` - конец зонда Hed-P добавлен флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин (FAM), со следующими нуклеотидными последовательностями:

Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПНР. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геномах каких либо животных и птиц (исключая Erinaceus europaeus) и любых видов растений, которые потенциально могут быть использованы при производстве кормов и пищевых продуктов.

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 600 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы на специфичность с использованием программы BLAST на сервере NCBI.

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем HEX. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПНР.

Пример конкретного использования тест-системы идентификации ткани ежа

Для подтверждения эффективности тест-системы были использованы сухие корма в виде рыбной и мясной муки; сырые и термически обработанные мясные продукты, т.е. мясные полуфабрикаты.

От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.

Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.

Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-ЕЖ -ФАКТОР». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)

2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы). Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-ЕЖ-ФАКТОР» для определения ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) методом полимеразной цепной реакции (ПНР) с флуоресцентной детекцией в РВ ТУ 21.10.60-163-51062356-2018, для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/. Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.

Исследования состоит из трех этапов:

• экстракция нуклеиновая кислота (НК);

• проведение реакции ПЦР РВ;

• учет результатов анализа.

Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), вносят по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) для ткани ежа обыкновенного, в качестве которого, используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл. Следующий этап это подготовка образцов к проведению ПЦР. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл. Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) ЕЖ, ВКО ЕЖ и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов ткани ежа обыкновенного и нативного бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

5 мкл ПЦР СМЕСЬ ЕЖ;
10 мкл ПЦР БУФЕР ЕЖ;
0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Перемешивают смесь на вортексе и сбросывают капли кратковременным центрифугированием.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.

Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.

Интерпретация результатов анализа. Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК - на канале JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К - на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на канале JOE/Yellow) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ.

В образце обнаружена ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus), если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).

Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным.

Образец считается отрицательным ДНК (Erinaceus europaeus) не обнаружена), если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале JOE/Y ellow при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4), а значение Ct по каналу Cy5/Red менее 35.

Для исследуемых образцов (сухой корм и мясные полуфабрикаты) предел точности содержания тканей ежа обыкновенного представлен в таблице 5.

Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с использованием внутреннего контроля в виде суспензии бактериофага, а в заявляемом - использовался фаголизат бактериофага и геном нативного бактериофага. Оказалось чувствительность ПЦР при обнаружении примеси ткани ежа обыкновенного в кормах и в мясных фаршах примерно в 1,5 раза выше. Трудоемкость и стоимость процесса определения ДНК ткани ежа обыкновенного в кормах и фаршах снизилась на 3-5%.

Тест-система для идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающая буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

T4F: 5`-TACATATAAATCACGCAAAGC-3` - прямой праймер

T4R: 5`-TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3` - обратный праймер

Т4Р: НЕХ-5`-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3`-BHQ1 – зонд,

взятых в объемном соотношении 1:1, отличающаяся тем, что для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца используют фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) со следующей нуклеотидной последовательностью:

Hed-F: 5`-AGTCTATTGATTCGAATAGAGC-3` - прямой праймер

Hed-R: 5`-CATGAGAGGTACTAACCAGT-3` - обратный праймер

Hed-P: FAM-5`-CAGGAGCTTTATTAGGTGATGATCAG -3` -BHQ1 - зонд.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест-систему для идентицикации ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающую буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью: - прямой праймер, - обратный праймер, - зонд, взятые в объемном соотношении 1:1, для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани перепелки обыкновенной Coturnix coturnix) со следующей нуклеотидной последовательностью: - прямой праймер; - обратный праймер; - зонд.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности предложен способ анализа образцов. Способ включает: (a) фильтрование жидкого образца, содержащего продукты амплификации по типу катящегося кольца (АКК), с применением пористой капиллярной мембраны, с помощью которого получают массив продуктов АКК на мембране; при этом образец содержит по меньшей мере первую совокупность продуктов АКК и вторую совокупность продуктов АКК, причем первая и вторая совокупности меченых продуктов АКК мечены различно; и (b) определение количества первой меченой совокупности продуктов АКК и количества второй меченой совокупности продуктов АКК в области мембраны.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности предложен способ анализа образцов. Способ включает: (a) фильтрование жидкого образца, содержащего продукты амплификации по типу катящегося кольца (АКК), с применением пористой капиллярной мембраны, с помощью которого получают массив продуктов АКК на мембране; при этом образец содержит по меньшей мере первую совокупность продуктов АКК и вторую совокупность продуктов АКК, причем первая и вторая совокупности меченых продуктов АКК мечены различно; и (b) определение количества первой меченой совокупности продуктов АКК и количества второй меченой совокупности продуктов АКК в области мембраны.

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, и предназначено для прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ идентификации потенциальных агентов, включающий: (a) предоставление библиотеки потенциальных агентов, в которой каждый потенциальный агент присоединен к уникальному маркеру-нуклеиновой кислоте, имеющей последовательность маркера, где потенциальные агенты выбраны из группы, состоящей из белков, нуклеиновых кислот, клеток и небольших молекул, где небольшие молекулы выбраны из группы, состоящей из потенциальных ингибиторов ферментов, потенциальных антибиотиков, потенциальных противовирусных агентов, потенциальных пестицидов, потенциальных гормонов, потенциальных активаторов клеточной сигнализации, потенциальных ингибиторов клеточной сигнализации и потенциальных активаторов ферментов; (b) присоединение библиотеки потенциальных агентов к твердой подложке, включающей праймеры нуклеиновых кислот, посредством гибридизации маркеров-нуклеиновых кислот с праймерами нуклеиновых кислот с образованием массива потенциальных агентов; (c) приведение массива потенциальных агентов в контакт с агентом для скрининга, при котором один или более из потенциальных агентов массива реагирует с агентом для скрининга, где агент для скрининга реагирует с одним или более потенциальными агентами посредством связывания с одним или более потенциальными агентами или блокировки связывания между потенциальным агентом и аналитом, имеющим сродство к потенциальному агенту; (d) исследование массива во время или после контакта массива с агентом для скрининга для установления того, что по меньшей мере один потенциальный агент, находящийся в массиве, реагирует с агентом для скрининга, где исследование массива включает обнаружение агента для скрининга, который связан с одним или более потенциальными агентами, где агент для скрининга является люминесцентным, а обнаружение представляет собой обнаружение люминесценции от массива; (e) секвенирование маркеров-нуклеиновых кислот в массиве для определения последовательности маркера, который присоединен к каждому из потенциальных агентов; и (f) идентификацию по меньшей мере одного потенциального агента в массиве, который реагирует с агентом для скрининга, на основании определенной последовательности маркера.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ модуляции флоры бактерий в среде путем ингибирования чувства кворума бактерий (варианты).

Изобретение относится к области биотехнологии и описывает способ определения количественного состава двухкомпонентной или многокомпонентной смеси растений. Использование базы данных поправочных коэффициентов для растений различных видов позволяет производить количественную оценку присутствия каждого из рассматриваемых видов в сложном образце, т.е.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложено устройство для регистрации изменения электрического поля в процессе катализируемой молекулой фермента биохимической реакции и способ определения нуклеотидной последовательности фрагмента молекулы нуклеиновой кислоты.

Изобретение относится к молекулярной биологии. Согласно способу выделения ДНК из костного материала его измельчение проводят в среде жидкого азота, приготовление лизата осуществляют путем инкубации в термостате с последующим центрифугированием, причем инкубацию осуществляют в два этапа, где на первом этапе навеску измельченного костного материала с добавлением буфера 50 мМ Tris-HCl, 50 мМ EDTA, рН 8,0, 1% SDS и 20 мкл протеиназы К, инкубируют с перемешиванием в течение 8-12 часов при температуре 56°С, на втором этапе добавляют буфер 4М Gu-HCl и инкубируют в течение 10 минут при температуре 70°С, затем проводят стадию отделения супернатанта центрифугированием, выделение нуклеиновых кислот из лизата осуществляют путем пропускания лизата через силикатную мембрану, отмывку осуществляют путем добавления в центр силикатной мембраны буфера 10 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 80% этанол и последующего ее центрифугирования, при этом отмывку осуществляют дважды, а элюцию осуществляют путем добавления в центр силикатной мембраны буфера 10 мМ Tris-HCl, 0,5 мМ EDTA, рН 8,0 и инкубирования при комнатной температуре в течение 5 минут, с последующим центрифугированием силикатной мембраны.

Изобретение относится к молекулярной биологии. Согласно способу выделения ДНК из костного материала его измельчение проводят в среде жидкого азота, приготовление лизата осуществляют путем инкубации в термостате с последующим центрифугированием, причем инкубацию осуществляют в два этапа, где на первом этапе навеску измельченного костного материала с добавлением буфера 50 мМ Tris-HCl, 50 мМ EDTA, рН 8,0, 1% SDS и 20 мкл протеиназы К, инкубируют с перемешиванием в течение 8-12 часов при температуре 56°С, на втором этапе добавляют буфер 4М Gu-HCl и инкубируют в течение 10 минут при температуре 70°С, затем проводят стадию отделения супернатанта центрифугированием, выделение нуклеиновых кислот из лизата осуществляют путем пропускания лизата через силикатную мембрану, отмывку осуществляют путем добавления в центр силикатной мембраны буфера 10 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 80% этанол и последующего ее центрифугирования, при этом отмывку осуществляют дважды, а элюцию осуществляют путем добавления в центр силикатной мембраны буфера 10 мМ Tris-HCl, 0,5 мМ EDTA, рН 8,0 и инкубирования при комнатной температуре в течение 5 минут, с последующим центрифугированием силикатной мембраны.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест систему для идентификации ДНК ткани ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающую буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью, взятых в объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца используют фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и дятла (Picidae) со следующей нуклеотидной последовательностью. Изобретение позволяет расширить функциональные возможности и повысить точность идентификации видовой принадлежности, упростить процесс подготовки. 5 табл., 1 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест-систему для идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающую буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью: T4F: 5`-TACATATAAATCACGCAAAGC-3` - прямой праймер; T4R: 5`- TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3` - обратный праймер; Т4Р: НЕХ-5`-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3`-BHQ1 - зонд, взятых в объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца используют фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани ежа обыкновенного со следующей нуклеотидной последовательностью: Hed-F: 5`-AGTCTATTGATTCGAATAGAGC-3` - прямой праймер; Hed-R: 5`-CATGAGAGGTACTAACCAGT-3` - обратный праймер; Hed-P: FAM-5`-CAGGAGCTTTATTAGGTGATGATCAG-3-BHQ1 – зонд. Изобретение позволяет расширить функциональные возможности, повысить точность идентификации видовой принадлежности, упрощение процесса подготовки проб. 5 табл.

Наверх