Способ диагностики радиационных поражений организма и способ получения противолучевого антительного бентонитового препарата для диагностики радиационных поражений организма

Группа изобретений относится к радиационной биологии, в частности к производству препаратов, предназначенных для диагностики радиационных поражений организма, и раскрывает способ диагностики радиационных поражений организма, а так же способ получения антительного противолучевого бентонитового препарата (АТБД). Способ диагностики включает серологический анализ сыворотки крови облученных животных в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) и обнаружение в ней радиотоксинов. Серологический анализ сыворотки крови в РБФ проводят с использованием противолучевого антительного бентонитового препарата (АТБД), в котором в качестве носителя антител используют сенсибилизированные противолучевой антительной сывороткой наноразмерные частицы бентонита, и по феномену флокуляции сенсибилизированных наночастиц бентонита судят о наличии радиоиндуцированного антигена - радиотоксина в исследуемых сыворотках и ставят диагноз на радиационные поражения. Изобретение позволяет диагностировать радиационные поражения организма в ранние сроки после облучения. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к радиационной биологии, производству препаратов, предназначенных для диагностики радиационных поражений организма.

Известен способ диагностики радиационных поражений организма путем гематологического анализа периферической крови и определения нейтрофильного индекса (см. кн. «Ветеринарная противорадиационная защита». - Под. ред. В.А. Киршина и В.А. Бударкова. - М.: Агропромиздат, 1990. - С. 111).

Недостатком способа является ограниченность его применения, так как он рассчитан только для диагностики лучевой болезни овец, а для остальных млекопитающих он не пригоден.

Известен способ диагностики радиационных поражений людей путем выявления аутоантител в сыворотке крови методом непрямой иммунофлуо-ресценции (НРИФ) на криостатных средах тимуса в 14-дневной культуре эпителиальных клеток тимуса новорожденных мышей (см. сб. тезисов «Иммунный статус человека и радиация». - М., 1991. - С. 31).

Однако известный способ является сложным, дорогостоящим, длительным и самое главное - оценка результатов исследований является субъективной.

Известен способ диагностики радиационных поражений организма путем серологического анализа сыворотки крови, облученных животных в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) с использованием противолучевого антительного эритроцитарного диагностикума (АТЭД) и по обнаружении радиотоксина в сыворотке крови ставят диагноз на лучевую болезнь (см. Патент РФ №2145712, опубл. 20.02.2000, Бюл. №5; Патент РФ №2240137. - опубл. 20.11.2014, Бюл. №32).

Недостатком способа является использование в качестве иммуносорбента эритроцитов барана, которые характеризуются высокой чувствительностью к колебаниям факторов внешней среды (рН, присутствие химических агентов), ведущие к инактивации эритроцитарного диагностикума.

Известен способ диагностики радиационных поражений организма путем постановки реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) с использованием макрочастиц бентонита (см. автореферат канд. дисс. P.P. Гайнуллина «Разработка бентонитового диагностикума для индикации радиоиндуцированных токсических соединений». - Казань, 2009. - 23 с.).

Недостатком способа является сложная технология очистки бентонита и низкая чувствительность диагностикума, поскольку в качестве иммуносорбента используются микрочастицы бентонита размером 60-90 мкм, которые обладают недостаточной сорбционной активностью и, вследствие низкой дисперсности, быстро выпадают в осадок, изменяя ход реакции и снижая чувствительность РБФ тест-системы при иммунохимическом анализе исследуемого материала.

Между тем из области нанотехнологии известно, что переход материи в наноразмерное состояние сопровождается изменением фундаментальных свойств вещества, обладающих гигантским научно-техническим и социально-экономическим потенциалом (см. статью А.С. Радилова и В.Р. Рембовского «Нанотехнологии и нанотоксикология» // Токсикологический вестник. - 2007. - №6. - С. 4-8).

Поэтому одним из перспективных направлений использования минералов является создание на их основе наноразмерных лекарственных и диагностических препаратов с более выраженными положительными свойствами и, в связи с этим, возникает постоянная необходимость биологического тестирования наноразмерных частиц, полученных из минеральных сырьевых ресурсов.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка высокочувствительного способа диагностики радиационных поражений организма за счет использования противолучевого антительного бентонитового диагностикума, повышающего постановку прижизненного экспресс - диагноза на радиационные поражения в ранние сроки после летального облучения.

Поставленная задача решается за счет использования иммунологического анализа сыворотки крови облученных животных в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ), которую проводят с использованием противолучевого антительного бентонитового диагностикума (АТБД), в котором в качестве носителя специфических антител используют сенсибилизированные противолучевой сывороткой наночастицы бентонита. Затем, по феномену флокуляции сенсибилизированных наночастиц бентонита судят о наличии радио-индуцированного антигена-радиотоксина в сыворотках, по степени флокуляции сенсибилизированных наночастиц и по титру радиотоксина в РБФ тест-системе, ставят диагноз на радиационные поражения. За диагностический титр радиотоксинов в РБФ принимают положительную реакцию в разведениях исследуемых сывороток 1:8 и выше со степенью флокуляции наночастиц в 3-4 креста, а в качестве оценочного критерия тяжести летального облучения (степени острой лучевой болезни животных) - 8-10-кратное повышение диагностического титра радиотоксина в сыворотке крови в РБФ (1:64-128).

В предлагаемом изобретении противолучевой антительный бентонитовый препарат (АТБД) для диагностики радиационных поражений организма получают путем извлечения из облученных в дозе 350-400 Гр картофеля-радиотоксина, гипериммунизации им кроликов путем внутримышечного 4-кратного с интервалом в 14 дней введения антигена в дозе 1,0-2 см³, конъюгированного с неполным адъювантом Фрейда в соотношении 1:1, получения диагностических сывороток, сенсибилизации последними наночастиц бентонита. В качестве наночастиц бентонита используют диспергированный бентпорошок (термоактивированная бентонитовая глина) с размерами частиц 75-85 нм, который получают на ультразвуковой установке «УЗУ - 0,25» при частоте 18,5 кГц, выходной мощности установки 80 Вт и амплитуде колебаний волновода 5 мкм, а сенсибилизацию наночастиц бентонита проводят путем смешивания сначала наночастиц бентонита с дистиллированной водой до получения 0,19-0,20%-ной водной суспензии, а затем ее смешивания с гипериммунной сывороткой в соотношении 3-7 соответственно с последующим термостатированием смеси при температуре при 30°С в течение 30 мин, затем смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 7 мин, полученный осадок дважды отмывают дистиллированной водой при 3000 об/мин в течение 10 мин, супернатант декантируют, а осадок ресуспензируют в дистиллированной воде до концентрации 0,19-0,20%, затем вносят в полученный иммунологический комплекс индикаторный компонент - 0,1%-ную метиленовую синь из расчета 0,7 см³ на 100 см³ суспензии, полученный противолучевой антительный бентонитовый диагностикум (АТБД), хранят в холодильнике при температуре 2-6°С, используют в качестве специфических антител в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) для обнаружения радиотоксинов в исследуемых сыворотках.

Существенным отличием предлагаемого способа диагностики радиационных поражений организма и способа получения противолучевого антительного бентонитового препарата для диагностики радиационных поражений организма, является то, что для детектирования специфического радио-индуцированного антигена - радиотоксина в облученном организме вводится высокоспецифичная и чувствительная тест-система - реакция бентонитовой флокуляции (РБФ) с использованием наночастиц бентонита с размерами 75-85 нм, полученных путем диспергирования бентонитового порошка в ультразвуковой установке «УЗУ-0,25» при частоте 18,5 кГц, выходной мощности установки 80 Вт и амплитуде колебаний волновода 5 мкм, и с учетом сроков появления радоиндуцированных антигенов и степени их концентрации от дозы летального облучения.

Использование наноразмерного бентонита до 100 нм (75-85 нм) в реакции бентонитовой флокуляции способствовало повышению ее чувствительности в 9-10 раз по сравнению с микроаналогом (максимальные титры стандартного антигена-радиотоксина в РБФ с известным диагностикумом составляли 1:220-1:250, а при использовании предлагаемого (нанодиагностикума) - 1:2250-1:2500.

Сущность предлагаемого способа основана на том, что под воздействием ионизирующей реакции в организме происходит радиолиз воды с появлением высокоактивных радикалов, которые, присоединяясь к аддуктам белков, липидов, аминокислот, образуют токсические продукты молекулярной модификации - хиноидные и липидные радиотоксины, обладающие антигенными свойствами, вступающие в иммунохимическую реакцию с гомогенными антисыворотками в специфических тест-системах (РНГА, РБФ). Сроки появления радиоиндуцированных антигенов (радиотоксинов) в организме облученных животных приходится на первые часы и сутки после радиационного поражения и регистрируются во весь период разгара острой лучевой болезни (первые 10-14 сут после облучения).

Использование предлагаемого антительного бентонитового диагностикума (АТБД) в иммунохимической тест-системе (РБФ) позволяет за 1,5-2 часа обнаружить в сыворотке крови облученного организма лучевые антигены-радиотоксины (РТ), которые появляются в первые часы и сутки после облучения в концентрациях, соответствующих тяжести радиационного поражения.

Такая технология приводит к значительному упрощению способа, повышению экспрессности, производительности труда, достоверности результатов анализа и, главное, возможность прогнозировать течение и исход острой лучевой болезни (ОЛБ).

Способ диагностики радиационных поражений организма и способ получения противолучевого антительного бентонитового препарата (АТБД) для диагностики радиационных поражений организма осуществляется следующим образом.

На первом этапе получают иммуносорбент наночастиц бентонита путем диспергирования бентонита любого происхождения (термостатированная бентонитовая глина) в ультразвуковой установке УЗУ-0,25 при частоте 18,5 кГц, выходной мощности установки 80 Вт и амплитуде колебаний ультразвукового волновода 5 мкм (см. автореферат Мотиной Т.Ю., «Фармакотоксикологическая оценка наноразмерного бентонита» Казань. 2014. - 23 с.).

Указанные режимы ультразвуковой обработки бентонита обеспечивают получение наночастиц, размерами 75-85 нм. Полученный наноразмерный бентпорошок суспендируют из расчета 190-200 мг/100 см³ дистиллированной воды и получают 0,19-0,20%-ную водную суспензию бентонита.

На 2-м этапе получают сенситин - специфическую антирадиотоксическую сыворотку (АРТС) путем гипериммунизации кроликов конъюгированным антигеном, содержащим специфический радиомиметик - радиотоксин, в качестве которого используют этаноловый экстракт облученной растительной ткани. Для получения радиотоксина используют клубни картофеля, которые облучают гамма-лучами в дозе 350-400 Гр при мощности экспозиционной дозы 2500 Гр/ч. Облученные клубни выдерживают при температуре 18-22°С в течение 24 часов. Дальнейшую обработку облученного объекта с целью изолирования антигенного материала - радиотоксина проводят по методике С.К. Мельниковой и В.А. Копылова (см. кн. Радиотоксины, их природа и роль. Под ред. A.M. Кузина. - М.: Атомиздат, 1966. - С. 86-91). С клубней картофеля снимают верхний слой толщиной 3-4 мм и оставшуюся ткань гомогенизируют в трехкратном объеме 96%-ного этанола. Экстрагирование проводят в течение 1 часа при постоянном перемешивании, строму отделяют и спирт удаляют под вакуумом при температуре 28-33°С.

В полученном этаноловом экстракте определяют белок по Лоури, хиноны - по A.M. Кузину и В.А. Копылову (Радиотоксины. - М.: Наука, 1983, - С. 27-28), содержание сухого вещества - общепринятым методом высушивания, биологическую активность - в тесте 50%-ного гемолиза эритроцитов по методу кислотных эритрограмм (И.А. Терсков, И.Н. Гительзон. - Биофизика, 1957, №2, С. 259.), антигенную активность - в реакции диффузионной преципитации - РДП по Э.Н. Шляхову (Антигены макроорганизмов и ответные реакции. - Кишинев, 1962, - С. 123-126).

Полученный концентрированный экстракт, содержащий хиноидные радиотоксины, стандартизируют путем разведения стерильной дистиллированной водой рН 7,2 до концентрации 1,0 мг/мл. Полученный препарат, состоящий в основном из хинонов, является неполноценным в антигенном отношении, поскольку из-за незначительного (1-1,8%) количества белка, имеет низкую молекулярную массу (5-6 кДа), что характеризует его как гаптен и, ввиду этого, не может вызывать иммунный ответ в иммунизируемом организме. Поэтому для перевода гаптена в полноценный белковый антиген, полученный этаноловый экстракт (0,1%-ный раствор растительного радиотоксина) смешивают в соотношении 1:1 с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ). Конъюгирование антигена и иммуномодулятора проводят на шейкере при интенсивности 110-120 качаний в минуту в течение 15-17 минут. Конъюгированный антиген, содержащий специфическую лучевую субстанцию - радиотоксин, используют в качестве иммунизирующего агента для гипериммунизации лабораторных (кроликов) или сельскохозяйственных (овец) животных.

Гипериммунизацию кроликов живой массой 2,0-2,5 кг проводят по следующей схеме. Приготовленный по вышеописанной методике конъюгированный антиген в виде эмульсии подогревают в водяной бане до 37°С перед применением и вводят кроликам 4-кратно, внутримышечно в область внутренней поверхности бедра с интервалом в 14 дней между введениями по 1,0-2,0 см на каждое введение. На восьмой день после последней инъекции антигена (АГ) у кроликов берут пробу крови из ушной вены для определения уровня антирадиотоксических антител, который изучают в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) по К. Мальборгу (Иммунологические методы М.: Медицина, 1987.- С. 211-218). В качестве положительного антигена используют растительный радиотоксин (РТ), в качестве отрицательного - АГ из необлученных клубней картофеля. Получение антирадиотоксической сыворотки осуществляют согласно Патенту РФ №2240137 от 20.11.2004 Бюл. №32.

На следующем этапе проводят сенсибилизацию (нагрузка специфическими антитоксическими антителами) наночастиц путем смешивания 0,19-0,20%-ной водной суспензии бентонита с гипериммунной антирадиотоксической сывороткой в соотношении 3:7 (30 см бентонитовой суспензии +70 см гипериммунной сыворотки). Полученную смесь тщательно перемешивают и помещают в термостат при 30°С на 30 минут, затем смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 7 минут, полученный осадок дважды отмывают в 100 см³ дистиллированной воде при 3000 об/мин в течение 10 минут, супернатант декантируют. Полученный осадок (центрифугат) ресуспензируют в дистиллированной воде до концентрации 0,19-0,20%.

Для визуальной индикации комплекса антиген (радиотоксин) - антитело, в РБФ тест-системе полученный комплекс метят специальным индикатором - метиленовой синью из расчета 0,7 см³ на 100 см³ диагностикума.

Полученный вышеописанным способом антительный бентонитовый диагностикум (АТБД), используют в качестве источника антирадиотоксических антител в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) для обнаружения радиотоксинов в сыворотке крови животных и хранят в холодильнике при температуре 2-6°С.

Постановку диагноза на радиационные поражения организма осуществляют следующим образом. У обследуемых животных берут периферическую кровь и получают из нее сыворотку общепринятым методом.

Полученную сыворотку используют в качестве антигенсодержащего компонента в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ), постановку и оценку результатов которой проводят в соответствии с методическими рекомендациями З.В. Пручкиной и др. (А.с. СССР №952260 A61K 39/00. Опубл. 23.08.1982. Бюл. №31).

В качестве источника специфических антител в РБФ используют полученный по вышеописанному способу АТБД.

Реакцию сопровождают соответствующими контролями: 1) сыворотка интактных животных (отрицательный контроль); 2) сыворотка облученных животных (положительный контроль); 3) стандартный радиотоксин (положительный контроль); 4) сыворотка облученных животных (гетерологический контроль).

За «положительную» реакцию бентонитовой флокуляции принимают оседание сенсибилизированных антирадиотоксическими антителами наночастиц бентонита (АГБД) на дне лунок иммунологических планшетов с оценкой в 3-4 креста в разведении испытуемых сывороток 1:8 и выше при отрицательной реакции с гетерологичным и отрицательным контролями.

Положительная реакция бентонитовой флокуляции (РБФ) с испытуемыми сыворотками в разведении 1:8 и выше (степень флокуляции 3-4 креста) свидетельствуют о поражении организма ионизирующей радиацией, вызывающей острую лучевую болезнь (ОЛБ) легкой, средней и тяжелой степени тяжести.

При этом дифференциальными диагностическими критериями степени ОЛБ служат титры радиотоксина в РБФ: 8-10-кратное превышение диагностического титра (1:64-1:128) свидетельствует о поражении организма летальными (смертельными), а титры в пределах 1:16-1:64 - о поражении сублетальными (несмертельными) дозами радиации.

Способ диагностики радиационных поражений апробирован на лабораторных (морских свинках, кроликах) и сельскохозяйственных (овцах) животных. Животных облучали на гамма-установке «Пума» с источником излучения ¹³⁷Cs при мощности экспозиционной дозы 5,68 Р/мин. Развитие лучевой болезни оценивали по клинико-гематологическим показателям, динамике гибели, патологоанатомическим изменениям органов, характерных для лучевой болезни и выживаемости животных.

Пример 1. Эффективность способа диагностики лучевых поражений животных с использованием известного (микроаналога) и предлагаемого диагностикума. С этой целью 15 морских свинок подвергали летальному гамма-облучению на установке «Пума» в дозе 6,0 Гр, 10 животных не облучали и использовали в качестве биологического контроля. У контрольных и облученных животных в динамиках через 1; 1,5; 2; 4; 8; 10 ежедневно в течение первых 7 суток, а затем - через 10; 14; 18; 22; 26 и 28 суток после облучения брали пробы крови для иммунологического анализа в РБФ тест-системе. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Из данных таблицы видно, что предлагаемый диагностикум значительно чувствительнее (4-8 раз), чем известный аналог (микрочастицы бентонита), который уже через 1 час после облучения выявляет радиотоксины в диагностическом титре (1:8), в то время как микроаналог выявляет их через 1,5 часа. При этом к началу разгара ОЛБ (8 сутки) титры радиотоксина в РБФ с нанодиагностикумом составляли 1:256 против 1:48 с микродиагностикумом. Максимальная радиотоксинемия (1:128 с известным диагностикумом и 1:1024 с предлагаемым) сыворотки крови летально облученных морских свинок совпадала с периодом максимальной радиационной гибели облученных животных, т.е. на 10-20-е сутки после облучения.

Пример 2. Проверка специфичности нанодиагностикума. Для этого опыты проводили на 15 кроликах, разделенных на 3 группы по 3 животных в каждой. Кроликов 1-й группы подвергали гамма-облучению в летальной дозе (11,0 Гр), 2-й группы - термическому ожогу путем приложения к боковой поверхности тела нагретую до 100°С металлическую пластинку. Животных 3-й группы не облучали и термическому воздействию не подергали - они служили биологическим контролем. У контрольных, облученных и обожженных животных в динамике (ежедневно в течение 10 суток после термического и радиационного воздействия) брали пробы крови для иммунодиагностики на предмет обнаружения радиотоксина и термотоксина.

Результаты иммунохимического анализа сывороток крови в динамике показали, что у облученных кроликов уже через 1 час после облучения в сыворотке крови были обнаружены радиотоксины в диагностическом титре (1:8), которые постепенно нарастали и через 72 часа они достигли значений 1:64 с максимальным значением титра радиотоксина к 10-м суткам (1:512). В сыворотке крови необлученных и подвергнутых термическому воздействию животных, искомые радиотоксины во все сроки исследования не обнаружены, что свидетельствует о специфичности предлагаемого диагностикума.

Пример 3. Эффективность изучаемого способа диагностики радиационных поражений животных и возможность дифференциации летального облучения от сублетальных (несмертельного) проведена на сельскохозяйственных животных, в качестве которых использовали 18 взрослых овец со средней живой массой 35-38 кг, используя по 6 животных на каждый вариант опыта. При этом овец 1-й группы облучали гамма-лучами в летальной дозе (6,0 Гр), 2-й - полулетальной (4,0 Гр), 3-й - нелетальной (2,0-2,5 Гр). У всех овец в динамике брали пробы крови на 7, 10, 14, 18, 22 и 26 сутки после облучения и подвергали их иммунохимическому анализу в РБФ с предлагаемым нанодиагностикумом (АТБД).

Установлено, что у всех облученных животных в сыворотке крови обнаружены радиотоксины, концентрации которых зависели от дозы и периода развития ОЛБ после облучения. При этом установлено, что титры радиотоксина (РТ) в РБФ у облученных в летальной дозе (6,0 Гр) овец колебались в пределах 1:256-1:1024 и все они погибали на 10-15 сутки после облучения с клиникой тяжелой степени ОЛБ. Животные, в сыворотках которых регистрировали РТ в титрах 1:64-1:128, переболевали ОЛБ средней степени тяжести и часть из них (50%) погибала на 18-25 сутки после облучения. У овец, в сыворотках которых обнаруживали РТ в титрах 1:16-1:64 в РБФ тест-системе, переболевали ОЛБ в легкой степени и гибели среди них не регистрировали.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики и способ получения противолучевого антительного бентонитового препарата для диагностики радиационных поражений организма позволяет экстренно ставить диагноз на лучевую болезнь, определить ее степень, а также прогнозировать ее исход, и может быть применен как в ветеринарной, так и в медицинской практике при радиационных поражениях организма.

1. Способ получения противолучевого антительного бентонитового диагностикума (АТБД) для диагностики радиационных поражений организма, включающий извлечение из облученных в дозе 350-400 Гр клубней картофеля радиотоксина, гипериммунизацию кроликов путем внутримышечного 4-кратного с интервалом в 14 дней введения антигена в дозе 1,0-2,0 см³, конъюгированного с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) в соотношении 1:1, получение диагностических сывороток, сенсибилизации последними наночастиц бентонита, отличающийся тем, что в качестве наночастиц бентонита используют диспергированный бентпорошок (термоактивированная бентонитовая глина) с размерами частиц 75-85 нм, который получают на ультразвуковой установке при частоте 18,5 кГц, выходной мощности установки 80 Вт и амплитуде колебаний ультразвукового волновода 5 мкм, а сенсибилизацию наночастицами бентонита осуществляют путем смешивания сначала наночастиц бентпорошка с дистиллированной водой до получения 0,19-0,20%-ной водной суспензии, а затем ее смешивания с гипериммунной сывороткой в соотношении 3:7 соответственно с последующим термостатированием смеси при температуре 30°С в течение 30 минут, затем смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 7 мин, полученный осадок дважды отмывают дистиллированной водой при 3000 об/мин в течение 10 мин, супернатант декантируют, а осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до концентрации 0,19-0,20% с последующим внесением в иммунологический комплекс индикаторного компонента - 0,1%-ной метиленовой сини из расчета 0,7 см³ на 100 см³ бентонитовой суспензии и полученный продукт - противолучевой антительный бентонитовый диагностикум (АТБД) хранят в холодильнике при 2-6°С.

2. Способ диагностики радиационных поражений организма, включающий серологический анализ сыворотки облученных животных в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) и обнаружения в ней радиотоксинов, отличающийся тем, что серологический анализ сыворотки крови в РБФ проводят с использованием противолучевого бентонитового диагностикума (АТБД), полученного согласно способу по п. 1, в котором в качестве носителя специфических антител используют сенсибилизированные противолучевой сывороткой наноразмерные частицы бентонита и по их феномену флокуляции сенсибилизированных наночастиц бентонита судят о наличии радиоиндуцированного антигена - радиотоксина в исследуемых сыворотках, по степени флокуляции наночастиц и по титру РБФ ставят диагноз на радиационные поражения, за диагностический титр радиотоксинов в РБФ принимают положительную реакцию в разведениях исследуемых сывороток 1:8 и выше со степенью флокуляции наночастиц в 3-4 креста, а в качестве дифференциального критерия летального облучения животных принимают 8-10-кратное повышение диагностического титра радиотоксина в сыворотках крови в РБФ (1:64-1:128).