Способ выявления диабетической фетопатии плода

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ выявления диабетической фетопатии плода, включающий определение содержания по меньшей мере одного маркера диабетической фетопатии плода, выбранного из группы, состоящей из альфа-1-микроглобулина/предшественника бикунина (АМВР), аполипопротеина А-II, аполипопротеина В-100, аполипопротеина С-III, фактора комплемента Н, протромбина, кининогена-1, альфа-1-кислого гликопротеина, плазминогена, ингибитора интер-альфа-трипсина тяжелая цепь H1 и витронектина, в аналите, определение общего содержания белков в аналите, оценку доли по меньшей мере одного маркера диабетической фетопатии плода от общего содержания белков в аналите. Изобретение обеспечивает повышение точности анализа, а также расширение арсенала существующих способов анализа в диагностике диабетической фетопатии плода. 4 з.п. ф-лы, 5 табл., 3 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области клинической диагностики, а именно к способам анализа в диагностике диабетической фетопатии.

В соответствии с определением Российской Ассоциации акушеров-гинекологов, диабетическая фетопатия - это заболевание неонатального периода, развивающееся у новорожденных, матери которых страдают сахарным диабетом во время беременности, и характеризующееся системным поражением, метаболическими и эндокринными дисфункциями. По данным ВОЗ за 2017 год, в зависимости от региона проживания и антропометрических данных, от 10% до 25% беременных женщин находятся в группе риска развития гипергликемии в период беременности. Статистика Международной Диабетической Федерации (IDF) за 2017 год [https://www.idf.org/our-activities/care-prevention/gdm] свидетельствует о том, что в мире до 204 миллионов женщин в возрасте от 20 до 79 лет живут с различным типом диабета, при этом до 21.3 миллионов новорожденных детей имеют симптомы гипергликемии, которая в 85.1% случаев была обусловлена гестационным диабетом у матери во время беременности.

Несмотря на достаточно хорошо известную этиологию и патогенез диабетической фетопатии, ее диагностика и предотвращение остаются острой проблемой в настоящее время. В частности, несовершенство методов точной дифференциальной диагностики гипергликемии не позволяют провести своевременное лечение и предотвратить развитие диабетической фетопатии. Причиной слабой чувствительности существующих биохимических методов диагностики диабетической фетопатии является прежде всего отсутствие достоверных клинических маркеров, которые позволили бы провести диагностику развития фетопатии у плода.

Из уровня техники известен способ получения аналитической тест-системы (MRM-теста) для мультиплексной идентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов, предусматривающий следующие стадии:

1) выявление уникальных для белка протеотипических маркерных пептидных последовательностей;

2) отбор по меньшей мере двух маркерных протеотипических пептидных последовательностей белка, наиболее пригодных для исследования методом мониторинга множественных реакций;

3) предсказание фрагментов пептидов;

4) предсказание MRM-теста в виде перечня маркерных пептидов, их фрагментов и наилучших параметров детекции методом мониторинга множественных реакций;

5) синтез одного или нескольких маркерных пептидов;

6) определение профиля переходов одного и нескольких синтетических маркерных пептидов методом мониторинга множественных реакций в условиях ускоренного хроматографического градиента;

7) оптимизация MRM-теста в соответствии с полученными профилями, удаление из набора пептидных фрагментов, характеризующихся наименьшими значениями интенсивности в масс-спектре;

8) очистка пептидов, синтезированных на стадии 5);

9) подготовка биологического образца, предусматривающая удаление мажорных белков;

10) идентификация белка в биологическом образце с заколом синтетических пептидов методом мониторинга множественных реакций в условиях нормального хроматографического градиента на основании профилей, полученных на стадии 6);

11) определение значений времени удержания маркерных пептидов с внесением установленных значений в MRM-тесты;

12) проведение мультиплексных калибровочных измерений в условиях нормального хроматографического градиента в буферном растворе очищенных синтетических пептидов на фоне смеси не имеющих к ним отношения белков и/или пептидов;

13) количественное измерение содержания маркерных пептидов в биологическом образце в условиях нормального хроматографического градиента с вводом синтетических пептидов; и

14) суждение о содержании интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов, количественно определенных на стадии 13) [патент РФ RU 2595835]. Данный способ представляет собой общий подход к идентификации белков протеома и сам по себе неприменим для выявления диабетической фетопатии плода.

Ближайшим аналогом заявленного изобретения является способ выявления диабетической фетопатии, представляющий собой динамическое ультразвуковое исследование плода на различных сроках беременности [Гестационный диабет: диагностика, лечение, послеродовое наблюдение. Клинические рекомендации (протокол) // Москва, 2014]. Однако зачастую с использованием данного метода признаки диабетической фетопатии не удается выявить достоверно, несмотря на рекомендации проводить такого рода исследования в период, начиная с 20-ой недели.

Во втором и третьем триместрах беременности при динамическом ультразвуковом исследовании (УЗИ) можно зарегистрировать так называемый синдром опережающего развития плода, что является следствием развития гиперинсулинемии. В таком случае при УЗИ исследовании основным показателем является увеличение размеров плода с опережением реального срока на 2 недели, многоводие, отечность тканей и диспропорция размеров плода. Признаки диабетической фетопатии при исследовании УЗИ, при котором особое внимание уделяется таким признаком, как кардиопатия, двухконтурность головки, отек и утолщение головки, могут быть показателями к инсулиновой терапии. При диагностике фетопатии также учитываются показатели глюкозы в крови матери, определение инсулина, а также ее предрасположенность к диабету. По этой причине постоянный динамический контроль уровня глюкозы в течение всего периода гестации является основным требованием для контроля риска развития фетопатии в соответствие с рекомендациями ВОЗ от 2016 года. Однако указанный способ выявления диабетической фетопатии не дает достаточно достоверных признаков для диагностирования. Во многих случаях указанный способ не позволяет выявить признаки формирующейся диабетической фетопатии, а значит, и провести эффективную корректирующую компенсаторную терапию. Это приводит к осложнениям развития в постнатальном периоде.

Протеомика (англ. Proteomics) - область молекулярной биологии, посвященная идентификации и количественному анализу белков (иными словами, высокопроизводительному исследованию белков). Совокупность всех белков клетки называют протеомом [James P. Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics. (англ.) // Quarterly Reviews Of Biophysics. - 1997. - November (vol. 30, no. 4). - P. 279-331. - PMID 9634650]. Из уровня техники известно, что данные, полученные методами протеомики, могут быть использованы для формирования более глубокого понимания причин возникновения разнообразных заболеваний, например, нейродегенеративных, а также в целях разработки методов лечения. С помощью протеомики осуществляется поиск антигенов, пригодных для создания новых вакцин. Идентификация белков, которые аномально экспрессируются при различных раковых заболеваниях, имеет огромное значение для диагностики с помощью биомаркеров, прогнозирования и лечения рака [Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. - М.: ТЕХНОСФЕРА, 2005. - С. 185. - 256 с. - ISBN 94836-044-Х.].

В рамках клинического исследования протеома беременных женщин, страдающих различными типами сахарного диабета (гестационный сахарный диабет, сахарный диабет 1 и 2 типа), были выявлены маркеры, аномальное содержание которых в протеоме коррелирует с развитием фетопатии плода. Данные маркеры позволяют проводить дифференциальную диагностику на малом объеме биологического материала (используемый в работе объем плазмы крови составлял 2 мкл) и выявлять первичные причины развития диабетической фетопатии, что позволяет более точно говорить о ее этиологии, и прогнозировать ее течение. Средние значения содержания белков в протеоме женщин контрольной группы представлены в таблице 1.

В таблице 2 представлены динамические изменения относительного содержания белков протеома участников исследования по отношению к контрольной группе (беременные женщины).

Полученные данные позволили разработать метод малоинвазивного мониторинга развития патологии. Учитывая корреляцию различных маркеров, предложенный метод дает возможность наблюдать полномасштабную протеомную картину диабетической фетопатии. Установлена связь между различными маркерными белками и процессами липидного обмена, сигнальными путями PPAR-рецепторов, процессами гемостаза, а также белками внеклеточного матрикса и архитектуры внеклеточного пространства. Полученные данные о взаимосвязанных клеточных процессах с учетом полуколичественных величин позволяют определить пределы нормы содержания тех или отдельных маркеров или их сочетаний в различных группах исследования и провести дифференциальные уровни их содержания в группах с диабетической фетопатией.

Таким образом, техническим результатом заявленного изобретения является повышение точности анализа в диагностике диабетической фетопатии плода, а также расширение арсенала существующих способов анализа в диагностике диабетической фетопатии плода.

Технический результат изобретения обеспечивает способ анализа в диагностике фетопатии плода, включающий:

- забор образца крови матери;

- пробоподготовку образца крови матери с получением аналита;

- определение содержания по меньшей мере одного маркера диабетической фетопатии плода в аналите;

- определение общего содержания белков в аналите;

- оценку доли по меньшей мере одного маркера диабетической фетопатии плода от общего содержания белков в аналите.

Определение содержания маркеров диабетической фетопатии плода в аналите может осуществляться методами иммуноферментного анализа, хромато-масс-спектрометрии или любыми другими методами, позволяющими определять содержание указанных маркеров в аналите.

Определение общего содержания белков в аналите может осуществляться методами хромато-масс-спектрометрии, фотометрии или любыми другими методами, позволяющими определять общее содержание белков в аналите.

Определение общего содержания белков, а также содержания маркеров диабетической фетопатии плода в аналите может осуществляться, например, следующим способом.

Для проведения анализа отбирают 1-2 мкл пробы плазмы венозной крови матери. К 2 мкл (около 100 мкг белка) пробы плазмы добавляют 10 мкл денатурирующего раствора, состоящего из 5 М мочевины, 15% ацетонитрила, 0,5% дезоксихолиевой кислоты натриевой соли, 300 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6.0) и 5 мМ ТСЕР (трис-(2-карбоксиэтил)фосфин). Раствор инкубируют при температуре 45°С в течение 20 минут для восстановления сульфогидрильных групп аминокислотных остатков цистеина. Затем добавляют 1,5 мкл раствора 2% 4-винилпиридина в 30% пропан-2-оле до конечной концентрации около 0,2%. Реакцию алкилирования винилпиридином проводят при комнатной температуре (22±2°С) в течение 30 минут. Объем пробы доводят до 100 мкл (расчетная концентрация белка в пробе составляет 1 мкг/мкл) 100 мМ раствором триэтиламмония бикарбоната для достижения реакции среды до рН=7,5-8,5.

Далее проводят ферментативное расщепление белков трипсином, предварительно разведенном в 30 мМ уксусной кислоте до конечной концентрации 200 нг/мкл, в два этапа, на первом из которых добавляют трипсин в соотношении 1:50 (по массе белка), а на втором этапе - аликвоту трипсина, эквивалентную соотношению 1:100 (по массе белка). В обоих случаях реакцию ферментативного гидролиза проводят при температуре 38°С в течение 3-х часов на каждом этапе. Реакцию останавливают путем добавления 2 мкл 10% раствора муравьиной кислоты.

Полученные растворы высушивают под вакуумом при температуре 30°С в режиме V-HV (вакуум, летучие соединения) в течение 40-60 минут. Сухой остаток проб восстанавливают в 100 мкл раствора 0,5% муравьиной кислоты (до конечной концентрации пептидов 1 мкг/мкл). С полученной после восстановления пробой проводят хромато-масс-спектрометрический анализ.

Хроматографическое разделение проводят на системе Ultimate 3000 RSLC Nano (Thermo Scientific) с установленным объемом петли инжектора 5 мкл и коэффициент вымывания пробы из петли - 3 (три полных объема петли перед переключением клапана в режим загрузки). Образцы постоянно термостатируют в пределах температуры +5±0,5°С. На колонку наносят 5 мкл пробы. Скорость отбора пробы 12 мкл/мин, скорость инжекции пробы 15 мкл/мин. Скорость потока аналитического насоса 0,3 мкл/мин, ограничение по давлению не более 800 бар (номинальное ограничение не более 1000 бар) с динамическим ускорением потока при градиенте 0,996 мкл/мин². Коэффициент вязкости на канале «А» - 101%, на канале «В» - 64,7%. Аналитическое время - 55 минут, время уравновешивания 13 минут, общее время анализа 68 минут.Разделение пептидов проводят в градиенте подвижной фазы «А» (водный раствор 0,01% муравьиной кислоты, 0,03% уксусной кислоты, рН=2,5-2,7 в зависимости от температуры раствора в пределах 18-20°С), и подвижная фаза «В» (90% ацетонитрила, 10% метанола, 0,01%) муравьиной кислоты, 0.03% уксусной кислоты) на стационарной фазе Acclaim Pepmap® (геометрия 75 мкм × 150 мм, 1,8 мкм, 60А). Начальные условия градиента элюции 98% «А»:2% «В», скорость потока 0,3 мкл/мин, давление на колонку 310-320 бар, скорость загрузки на обогащающую колонку - 15 мкл/мин. В ходе хроматографического разделения применяют динамическое изменение скорости потока до 0,45 мл/мин при высоком относительном содержании подвижной фазы «В» в целях увеличения эффективности промывки колонки от связанных гидрофобных компонентов.

Масс-спектрометрический анализ проводят на гибридном масс-спектрометре высокого разрешения Orbitrap Fusion (Thermo Scientific) с источником ионизации NSI в режиме положительной электростатической ионизации и динамическим потенциалом на входной S-линзе. Прекурсорные ионы регистрируют с использованием орбитального масс-анализатора с разрешением 60К в диапазоне m/z 425-1250 с максимальной скоростью накопления ионов - 15 миллисекунд, или минимальным числом интеграции -4е5 ионов. Селекция по зарядному состоянию z=2+…6+, активное динамическое исключение после шести сканов (n=6) в течение 4 секунд длительностью 180 секунд с ассиметричной изоляцией +10 / -25 ppm. Пик-зависимая активация сканирования на уровне 40% высоты хроматографического пика при средней величине FWHM=24 секунды и уровнем сигнала к шуму не менее 150. Тандемное сканирование проводят после изоляции через квадруполь с окном изоляции ±0,75 Th со сдвигом 0,5 Th. Тип активации - HCD, относительная энергия активации - 27% с переменным смещением +/-20%. Тип детектора фрагментных ионов - орбитальный с разрешением 15К с максимальным временем накопления 47 миллисекунд, или числом интеграции ионов - 5е4.

Исходные файлы данных (raw-формат, получаемые при записи данных с масс-спектрометров производства Thermo Fisher) были конвертированы mgf-формат с помощью программы MSConvert (ProteomeWizard). Идентификацию проводят против базы данных аминокислотных последовательностей белков (база с аминокислотными последовательностями в формате FASTA с ограничением таксономической группы «Human», доступна на открытом репозитории Uniprot, версия актуализируется каждые 3-4 месяца) с включением обращенных последовательностей для верификации полученных идентификаций. Для проведения поиска в качестве гидролизующего фермента был выбран трипсин (специфическое расщепление по остаткам лизина и аргинина, если в положении Р1 не стоит пролин) с максимальным допустимым числом пропущенных внутренних участков расщепления не более одного.

Разрешенные зарядные состояния были от z=2+ до z=6+с допустимой точностью измерения прекурсорного иона ±5 ppm и допустимой точностью измерения фрагментного иона ±0,01 Да. Переменной модификацией, используемой для поиска и обнаружения, были дезамидирование Q/E, однократное окисление метионина и 4-гидроксипролин. Фиксированной модификацией было пиридилэтилирование 4-винилпиридином. Результаты верифицируют по уровню отсечения FDR=1% (false discovery rate) на основе суммарной частоты ложных положительных результатов для спектров, соответствующих пептидам (PSM, peptide-spectra match).

Качественный состав протеома определяют по идентификациям белков, которые проводили с помощью программного обеспечения Search Gui версии 3.3 (Compomics, Бельгия) по поисковому алгоритму X!Tandem Vengeance версии 12.15.2. Количественный анализ проводят на основании показателя NSAF (нормированный показатель спектральной интенсивности) в выборке общих для группы проб белков после выравнивания по интенсивности опорных спектров. Выборку интересующих белков нормируют по показателям NSAF на сумму их парциального вклада в субпротеоме исследования. Динамические изменения индивидуальных белков анализируют с использованием открытой программы Heatmapper (Канада), а парную кластеризацию - с помощью программы Pairwise Distance (Канада). Изменения проверяются на корректность кластеризации к той или иной группе исследования через ранговый коэффициент корреляции Кендала. Численно динамические изменения выражаются в единицах FC (folds change) или в логарифмической величине FC, если изменения превышает FC>10.

Как вариант реализации заявленного изобретения, в качестве маркера диабетической фетопатии плода в аналите может быть использован белок Альфа-1-микроглобулин/предшественник бикунина (АМВР). При этом значение относительного содержания маркера диабетической фетопатии плода составляет не более 0,3% от общего содержания белков в аналите.

Также в качестве маркера диабетической фетопатии плода при гестационном сахарном диабете матери в аналите может быть использован белок Аполипопротеин А-II. При этом значение относительного содержания маркера диабетической фетопатии плода составляет не менее 4,6% от общего содержания белков в аналите.

Также в качестве маркера диабетической фетопатии плода при гестационном сахарном диабете матери в аналите может быть использован белок Аполипопротеин В-100. При этом относительное содержание белка при фетопатии плода составляет не менее 0,14% от общего содержания белков в аналите.

Также, в качестве маркера диабетической фетопатии плода при гестационном сахарном диабете матери в аналите может быть использован, например, белок Аполипопротеин С-III. При этом относительное содержание маркера диабетической фетопатии плода составляет от 2,7 до 3,5% от общего содержания белков в аналите.

Также в качестве маркера диабетической фетопатии плода при гестационном сахарном диабете матери в аналите может быть использован белок Фактор комплемента Н. При этом относительное содержание маркера диабетической фетопатии плода составляет не менее 0,25% от общего содержания белков в аналите.

Также в качестве маркера диабетической фетопатии плода при гестационном сахарном диабете матери в аналите может быть использован белок Протромбин. При этом относительное содержание маркера диабетической фетопатии плода составляет не менее 0,48% от общего содержания белков в аналите.

Также, в качестве маркера диабетической фетопатии плода при гестационном сахарном диабете матери в аналите может быть использован, например, белок Кининоген-1. При этом относительное содержание маркера диабетической фетопатии плода составляет от 0,43 до 0,47% от общего содержания белков в аналите.

Также в качестве маркера диабетической фетопатии плода при гестационном сахарном диабете матери в аналите может быть использован белок Альфа-1 -кислый гликопротеин 1. При этом относительное содержание маркера диабетической фетопатии плода составляет от 1,30 до 1,83% от общего содержания белков в аналите.

Также в качестве маркера диабетической фетопатии плода при гестационном сахарном диабете матери в аналите может быть использован белок Плазминоген. При этом относительное содержание маркера диабетической фетопатии плода составляет от 0,35 до 0,42%% от общего содержания белков в аналите.

Также в качестве маркера диабетической фетопатии плода при гестационном сахарном диабете матери в аналите может быть использован белок Ингибитор интер-альфа-трипсина тяжелая цепь H1. При этом относительное содержание маркера диабетической фетопатии плода составляет не менее 0,63% от общего содержания белков в аналите.

Также в качестве маркера диабетической фетопатии плода при гестационном сахарном диабете матери в аналите может быть использован белок Витронектин. При этом относительное содержание маркера диабетической фетопатии плода составляет не более 0,48% от общего содержания белков в аналите.

Как вариант, в качестве образца крови может быть использована плазма или сыворотка венозной крови матери.

Указанный способ позволяет составлять полные и модульные диагностические панели для проведения мониторингового анализа и подтверждающего анализа в диагностике фетопатии плода.

В случае ранней диагностики и оценки риска развития данной патологии возникает возможность проведения своевременной корректирующей или компенсаторной терапии.

Проведение исследования в формате диагностической панели по предложенным в рамках изобретения маркерам или их сочетаниям возможно, например, в формате иммуноферментного анализа (ИФА) или масс-спектрометрического (МС) анализа. При этом, преимуществами МС анализа является индифферентность к типу белкового маркера, более высокая чувствительность, высокая производительность (возможность проведения анализа за 15-30 минут в расчете на одного пациента), невысокий уровень затрат на анализ, высокая точность измерения сигнала маркеров, возможность составления модульных диагностических панелей без дополнительных финансовых затрат за несколько минут в зависимости от цели проведения анализа (диагностика, наблюдение, подтверждение) без ущерба производительности, а также возможность проведения количественного анализа протеомного профиля пациента, направленного на оценку риска развития диабетической фетопатии.

Заявленный способ иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Реализация заявленного изобретения.

Пациентка М, 28 лет, первая нормально протекающая беременность. Страдает сахарным диабетом первого типа в течение 2 лет. Находится на комбинированной терапии (короткие + пролонгированные инсулины). На момент постановки на учет по беременности в женской консультации заболевание находится в стадии субкомпенсации: уровень гликемии натощак - 4,4 ммоль\л, через 1 час после еды - 10,0 ммоль\л. В течение беременности пациентка находилась под наблюдением врача-эндокринолога с контролем гликемии и коррекцией проводимой терапии. Уровень гликированного гемоглобина (HbA1c) по триместрам: 5,7% - 5,3% - 5,5%, соответственно.

УЗИ плода в 1-ом триместре - без особенностей.

УЗИ на сроке 26 недель - без особенностей.

На сроке 30 недель проведено протеомное исследование плазмы крови на наличие маркеров фетопатии в соответствии с заявленным способом. Результаты исследования приведены в таблице 3:

Полученные данные свидетельствуют о высоком риске развития фетопатии у плода.

УЗИ на сроке 32 недели - тенденция к крупному плоду, многоводие, признаков фетопатии не выявлено.

УЗИ на сроке 38 недель - крупный плод, предполагаемая масса плода 4100±100 г, многоводие, признаки фетопатии (гепатомегалия, двойной контур головки).

Родоразрешение на сроке 38,5 недель путем операции кесарева сечения. Родилась живая доношенная девочка, вес 4170 г, рост 55 см, баллы по шкале Апгар 8\9, с признаками фетопатии (макросомия, гепатомегалия) и морфофункциональной незрелости.

Таким образом, использование заявленного способа позволяет повысить точность анализа в диагностике диабетической фетопатии плода.

Пример 2.

Пациентка Н, 24 года, первая нормально протекающая беременность. Страдает сахарным диабетом первого типа в течение 8 лет. Постоянно наблюдается эндокринологом, находится на комбинированной терапии (короткие + пролонгированные инсулины). При постановке на учет по беременности в женской консультации уровень гликемии натощак - 5,0 ммоль\л, через 1 час после еды - 18,0 ммоль\л. В течение беременности пациентка находилась под наблюдением врача-эндокринолога с контролем гликемии и коррекцией проводимой терапии. Уровень гликированного гемоглобина (HbA1c) в I, II и III триместрах беременности 8,0% - 7,0% - 7,3%, соответственно.

При УЗ исследованиях на сроке 12-13 недель и 19-20 недель - патологии не выявлено.

При УЗ исследовании на сроке 26 недель - тенденция к крупному плоду, умеренное многоводие, утолщение шейной складки.

На сроке 28 недель проведено протеомное исследование плазмы крови на наличие маркера фетопатии (Prothrombin) в соответствии с заявленным способом. Результаты исследования приведены в таблице 4:

Полученные данные свидетельствуют о высоком риске развития фетопатии у плода.

УЗИ в 32 недели - тенденция к крупному плоду, макросомия, многоводие, утолщение шейной складки, гепатомегалия.

УЗИ в 36 недель - крупный плод, макросомия, многоводие, утолщение шейной складки, двойной контур головки, гепатомегалия, нарушение маточно-плацентарного кровотока.

Родоразрешение на сроке 38 недель путем операции кесарева сечения, родился живой мальчик, вес 4100 г, рост 51 см, баллы по шкале Апгар 8\9. У ребенка отмечается угнетение рефлексов, неопущение яичек в мошонку. Выявлены признаки фетопатии: макросомия, гепатомегалия, пастозность тканей, лунообразное лицо, короткая шея, короткие нижние конечности, гипертрихоз, морфофункциональная незрелость. При проведении НСГ выявлена повышенная эхогенность перивентрикулярной зоны.

Таким образом, использование заявленного способа позволяет повысить точность анализа в диагностике диабетической фетопатии плода.

Пример 3.

Пациентка К, 28 лет, вторая нормально протекающая беременность. Первая беременность закончилась срочными самопроизвольными родами на сроке 40 недель, ребенок здоров. При первичном обращении в женскую консультацию в сроке 10 недель уровень гликемии натощак 4,9 ммоль/л, в дальнейшем (ПГТТ) пероральный глюкозотолерантный тест не проводился. На сроке 28 недель отмечено повышение уровня гликемии натощак до 6,7 ммоль\л, поставлен диагноз ГСД, назначена диетотерапия. На фоне диетотерапии уровень гликемии натощак 5,3 ммоль\л, через 1 час после еды - 7,0 ммоль\л. На сроке 36 недель подключена инсулинотерапия (инсулины пролонгированного действия), уровень гликемии натощак 5,2 ммоль\л, через 1 час после еды - 6,2 ммоль\л.

В течение беременности проводились УЗ исследования на сроках 21 неделя, 29 недель, 36 недель - признаков фетопатии не выявлено.

На сроке 29 недель проведено протеомное исследование плазмы крови на наличие маркеров фетопатии в соответствии с заявленным способом. Результаты исследования приведены в таблице 5:

Уровни всех исследованных белков находятся в пределах нормы, что является показателем нормального развития плода.

Роды срочные (на 40-41 неделе), самопроизвольные, через естественные родовые пути. Родилась живая доношенная девочка, вес 3150 г, рост 51 см, баллы по шкале Апгар 9\9. Признаков фетопатии не выявлено.

Таким образом, использование заявленного способа позволяет осуществлять анализ в диагностике диабетической фетопатии плода с высокой точностью.

Приложение 2

Пример реализации заявленного изобретения

Пациентка Н, 31 год, первая нормально протекающая беременность. Страдает сахарным диабетом первого типа в течение 3 лет. Находится на комбинированной терапии (короткие + пролонгированные инсулины). На момент постановки на учет по беременности уровень гликемии натощак - 4,7 ммоль\л, через 1 час после еды - 9,7 ммоль\л. В течение беременности пациентка находилась под наблюдением врача-эндокринолога с контролем гликемии и коррекцией проводимой терапии. Уровень гликированного гемоглобина (HbA1c) по триместрам: 5,4% - 5,2% - 5,4%, соответственно.

УЗИ плода в 1-ом триместре - без особенностей.

УЗИ на сроке 26 недель - без особенностей.

На сроке 26 недель проведено протеомное исследование плазмы крови на наличие маркеров фетопатии в соответствии с заявленным способом.

Результаты исследования приведены в таблице 1:

Полученные данные свидетельствуют о высоком риске развития фетопатии у плода.

УЗИ на сроке 30 недель - тенденция к крупному плоду, многоводие, признаков фетопатии не выявлено.

УЗИ на сроке 38 недель - крупный плод, предполагаемая масса плода 4200±100 г, многоводие, признаки фетопатии (гепатомегалия, двойной контур головки).

Родоразрешение на сроке 38 недель путем операции кесарева сечения. Родился живой доношенный мальчик, вес 4090 г, рост 57 см, баллы по шкале Апгар 8\9, с признаками фетопатии (макросомия, гепатомегалия) и морфофункциональной незрелости.

Таким образом, использование заявленного способа позволяет повысить точность анализа в диагностике диабетической фетопатии плода.

1. Способ выявления диабетической фетопатии плода, включающий:

- забор образца крови матери;

- пробоподготовку образца крови матери с получением аналита;

- определение содержания по меньшей мере одного маркера диабетической фетопатии плода, выбранного из группы, состоящей из альфа-1-микроглобулина/предшественника бикунина (АМВР), аполипопротеина А-II, аполипопротеина В-100, аполипопротеина С-III, фактора комплемента Н, протромбина, кининогена-1, альфа-1-кислого гликопротеина, плазминогена, ингибитора интер-альфа-трипсина тяжелая цепь H1 и витронектина, в аналите;

- определение общего содержания белков в аналите;

- оценку доли по меньшей мере одного маркера диабетической фетопатии плода от общего содержания белков в аналите, где в случае, если: значение относительного содержания альфа-1-микроглобулина/предшественника бикунина (АМВР) составляет не более 0,3% от общего содержания белков в аналите и/или значение относительного содержания аполипопротеина А-II составляет не менее 4,6% от общего содержания белков в аналите и/или значение относительного содержания аполипопротеина В-100 составляет не менее 0,14% от общего содержания белков в аналите и/или значение относительного содержания аполипопротеина C-III составляет от 2,7 до 3,5% от общего содержания белков в аналите и/или значение относительного содержания фактора комплемента H составляет не менее 0,25% от общего содержания белков в аналите и/или значение относительного содержания протромбина составляет не менее 0,48% от общего содержания белков в аналите и/или значение относительного содержания кининогена-1 составляет от 0,43 до 0,47% от общего содержания белков в аналите и/или значение относительного содержания альфа-1-кислого гликопротеина составляет от 1,30 до 1,83% от общего содержания белков в аналите и/или значение относительного содержания плазминогена составляет от 0,35 до 0,42% от общего содержания белков в аналите и/или значение относительного содержания ингибитора интер-альфа-трипсина тяжелая цепь H1 составляет не менее 0,63% от общего содержания белков в аналите и/или значение относительного содержания витронектина составляет не более 0,48% от общего содержания белков в аналите, определяют высокий риск развития фетопатии у плода.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение содержания маркеров диабетической фетопатии плода в аналите проводится методом иммуноферментного анализа.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение содержания маркеров диабетической фетопатии плода в аналите проводится методом хромато-масс-спектрометрии.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение общего содержания белков в аналите проводится методом хромато-масс-спектрометрии.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение общего содержания белков в аналите проводится методом фотометрии.