Способ моделирования ингаляционного поражения сернистым ипритом

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к военной токсикологии, и может быть использовано в исследовательских целях для моделирования ингаляционного поражения сернистым ипритом. Способ предусматривает отравление находящихся под наркозом мелких лабораторных животных аэрозолем раствора, полученного при растворении сернистого иприта в 4%-ном водном растворе диметилсульфоксида, с концентрацией сернистого иприта 1,37 мг/мл путем введения в дистальные отделы бронхолегочной системы каждой участвующей в эксперименте крысе при помощи микроспреера в виде аэрозоля дисперсностью 32,1±2,6 мкм. В шприц микроспреера помещают раствор сернистого иприта в объеме 100 мкл на 100 г массы тела крысы и вводят крысе интратрахеально через смыкающуюся голосовую щель. Проводят контроль попадания микроспреера по визуальному контролю дыхательных экскурсий при движении поршня микроспреера на себя, и выполняют механическое давление на поршень до полного опустошения микроспреера. Выводят крыс из эксперимента на 1, 3, 7, 10 и 14 сут от начала их отравления аэрозолем раствора сернистого иприта с поглощенной дозой сернистого иприта 1,37 мг/кг массы тела крысы по 6 крыс в сут путем декапитации. Способ позволяет получить у всех отравленных крыс повторяемые модели локальных ингаляционных поражений, достоверно отражающих воздействие сернистого иприта, по которым можно в ходе некропсии визуально оценить состояние левого легкого крыс на каждом сроке наблюдения за ними и выполнить патоморфологическое исследование микропрепаратов. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к военной токсикологии, касается способа моделирования ингаляционного поражения сернистым ипритом (ИПСИ), которое может быть широко использовано в исследовательских целях в любой научно-исследовательской лаборатории, занимающейся вопросами экспериментальной медицины.

Сернистый иприт (СИ) относится к ядам политропного типа действия, способным вмешиваться в процессы метаболизма на различных уровнях. Ведущими механизмами действия СИ служат алкилирование гуаниновых оснований, активация АДФ-полимеразы, сопровождающимися каскад-индуцированным запуском факторов апоптоза, нарушением синтеза белка и клеточного деления, приводящее к утрате метаболических процессов клетки, конъюгацией с тиолосодержащими ферментами и прооксидантным действием за счет эффекта радиолиза воды под действием образующегося хлор-иона [1, 2]. Широкий спектр биологической активности и мишеней для реализации токсического действия СИ обуславливает невозможность создания специфических антидотов, пригодных для применения в условиях чрезвычайных ситуаций (локальные конфликты с использованием СИ, террористические акты, техногенные аварии и т.п.). Определенные перспективы связывают с разработкой средств патогенетической терапии, действие которых будет направлено как в отношении блокады первичных реакций, так и, в большей степени, на предупреждение вторичных механизмов токсического действия СИ (профилактика увеличения экспрессии NB-kB, провоспалительного эффекта ФНОα, цитопротекция ингибированием сфигмомиелазы, борьба с эндотоксикозом и т.д.).

Актуальность поиска перспективных медицинских средств для профилактики и лечения последствий поражения СИ определяется существующими аналитическими выводами о высокой вероятности использования этого токсиканта в качестве боевого и диверсионного поражающего агента. Не следует забывать и о массовом затоплении (свыше 300000 т) боевых химических отравляющих веществ в различных районах Балтики после окончания Второй мировой войны. По мнению специалистов, с каждым годом не только не исчезает, но и возрастает вероятность объемного (залпового) выброса в окружающую среду отравляющих химических веществ (в том числе и СИ), по причине коррозии металлических бочек и конструкций снарядов и бомб.

Одной из задач, стоящих перед исследователями на пути создания эффективных медицинских средств защиты от поражения СИ, является разработка экспериментальных моделей ИПСИ, максимально приближающих условия экспериментов к наиболее вероятным сценариям их применения в террористических целях, и адекватно отражающих возникающие патоморфологические изменения бронхолегочной системы.

Для моделирования ингаляционных поражений биообъектов часто применяют инсталляцию жидкого раствора СИ с использованием различных шприц-систем с набором канюль и инструментария для интубации трахеи. Известен способ [3], согласно которому моделирование ингаляционного поражения СИ выполняют посредством трахеотомии подопытного животного с использованием набора для хирургического вмешательства, после чего в трахеостому вводят канюлю, через которую подают токсикант. Для моделирования поражения используют взрослых крыс-самцов с массой тела 275-325 г. После анестезии путем внутрибрюшинного введения кетамина (100 мг/кг массы тела крысы) производят трахеотомию, для чего в трахею ниже ее бифуркации вводят слегка изогнутый катетер Р50 для моделирования одностороннего поражения левого легкого. Инстилляция СИ в дыхательные пути крыс приводит к острому повреждению левого легкого. Недостаток такого подхода состоит в оперативном вмешательстве как таковом и его последствиях для подопытного животного. Среди явных недостатков рассматриваемого способа моделирования следует отметить необходимость гемостаза, возможность повреждения пищевода или задней стенки трахеи, опасность присоединения вторичной инфекции.

Известен способ моделирования [4], согласно которому ингаляционное поражение СИ выполняют посредством безоперационной интубации и вливания жидкого раствора токсиканта. Моделирование поражения осуществляют на крысах-самцах с массой тела 280-300 г путем интратрахеальной инсталляции СИ. После анестезии кетамином, который вводят внутримышечно в дозе 100 мг/кг массы тела крыс, вводят СИ в трахею крыс в различных дозах в расчете 0,1 мл на крысу, а затем рассчитывают среднюю смертельную дозу (ЛД₅₀), которая составляла 2 мг/кг. В рассмотренном способе моделирования канюлю или зонд вводят через голосовую щель крысы с помощью ларингоскопа. Указанный способ даже при должной сноровке и опыте экспериментатора не исключает риск введения зонда в желудок вместо трахеи.

Для обеих рассмотренных моделей ИПСИ [3, 4] прослеживается общий очевидный недостаток - использование токсиканта в жидком агрегатном состоянии. Отсутствие при этом распыления делает невозможным обеспечение одинаковых концентраций СИ, инсталлируемого в легкие.

Поскольку агрегатное состояние СИ в предполагаемых условиях чрезвычайных ситуаций состоит из смеси пара и аэрозоля с различными фазово-дисперсными характеристиками, адекватным подходом может стать моделирование ингаляционных поражений биообъектов с использованием систем ингаляционной доставки аэрозоля или пара указанного токсиканта в максимально широком диапазоне доз, при этом модель ИПСИ должна обладать достаточно высокой пропускной способностью и быть экономически рентабельной.

Известен способ моделирования ингаляционного поражения СИ [5], при реализации которого используют испаритель и систему камер, трубок и клапанов. В соответствии с указанным способом, животных помещают в камеры из полиметилметакрилата. Перед экспериментом токсикант в необходимом количестве доставляют в камеру нагрева (испаритель), откуда он пассивным способом перемещается по системе трубок и клапанов до полного испарения. В качестве биообъекта используют крыс-самцов массой тела 230-260 г. Биообъекты предварительно анестезируют внутримышечно комбинацией кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг), затем интубируют и подвергают воздействию токсиканта путем обеспечения вдыхания его паров в концентрации 3,5 мг/мл в растворе абсолютного этанола в течение 50 мин. При пересчете на массу тела подопытных животных доза токсиканта составляла 1,4 мг/кг.

Основным достоинством данного способа является приближенность к наиболее вероятным сценариям применения токсиканта. Однако СИ имеет свойство проникать в различные полимерные комплектующие, быть устойчивым к используемым при обработке дегазирующим рецептурам и длительное время подвергаться десорбции, что может иметь отрицательные последствия как с точки зрения отсутствия безопасности персонала лаборатории, так и опасности возникновения фоновых нагрузок в ходе последующих экспериментов. Кроме того, пассивное движение токсиканта по системе клапанов не позволяет точно контролировать испарение токсиканта с момента начала эксперимента и до окончания полного испарения. Также указанный способ не подходит для использования при оценке эффективности средств экстренной профилактики (лечения) в первые минуты от момента поражения СИ, так как продолжительность экспозиции составляет 50 мин.

Известен способ моделирования ингаляционного поражения СИ [6], предусматривающий использование небулайзера и систему камер, трубок и клапанов. Указанный способ наиболее близок по достигаемому результату к заявляемому способу и принят в качестве способа-прототипа.

В соответствии со способом-прототипом при моделировании ИПСИ в качестве биообъекта используют взрослых морских свинок Данкина-Хартли обоих полов с массой тела 480-890 г в количестве тридцати голов, из которых были сформированы пять групп: контрольная и 4 подопытные по 6 особей в каждой.

В ходе реализации способа-прототипа морских свинок контрольной группы подвергают воздействию аэрозоля растворителя СИ - этанола, а подопытных групп - аэрозоля раствора СИ в этаноле. При этом доза токсиканта составляла 40 мг/м³, а продолжительность экспозиции 5 мин.

В соответствии с указанным способом, каждый раз по 6 морских свинок помещали в экспозиционную камеру, выполненную из полиметилметакрилата в виде короба размерами 25 см×16 см×69 см, таким образом, что их головы были закреплены в отсеке размерами 10 см×16 смх11,5 см, а тело находилось в другом отсеке размерами 15 см×16 см×11,5 см. В свою очередь, для обеспечения герметизации экспозиционную камеру помещали в камеру размерами 34 см×23 см×84 см.

В начале эксперимента 2,5 мл раствора, содержащего 3,175 мг СИ, растворенного в этаноле (1,27 г/мл), помещали в резервуар небулайзера, откуда затем распыляли в течение 5 мин в экспозиционную камеру с животными при потоке воздуха 14,4 л/мин. В течение этого срока в замкнутом контуре объемом 72 л (0,072 м³) создавалась экспозиционная концентрация СИ, составляющая 40 мг/м³. Практически сразу после включения небулайзера экспозиционная камера заполнялась аэрозолем СИ и каждое животное в течение 5 мин подвергалось воздействию аэрозоля СИ в дозе 40 мг/м³.

По окончании экспозиции следовал этап дегазации, для чего в экспозиционную камеру в течение 25 мин прокачивали чистый воздух через небулайзер. В свою очередь, воздух, содержащий остаточную концентрацию токсиканта, выпускали из экспозиционной камеры через имеющееся в ней выходное отверстие и пропускали через резервуар объемом 30 л, содержащий 5%-ный раствор гипохлорита натрия.

Полученная при реализации способа-прототипа модель ИПСИ с применением небулайзера имеет некоторые признаки, характерные для отравления, возникшего вследствие воздействия на организм животного поражающих факторов СИ. Согласно имеющимся сведениям, в бронхоальвеолярной лаважной жидкости отравленных животных выявлены признаки воспаления (увеличение числа нейтрофилов и эозинофилов в суспензии клеток и провоспалительных цитокинов в жидкой части супернатанта), а также положительный тест бронхоконстрикции (с метахолином) [6]. Это свидетельствует о том, что в ходе моделирования ингаляционного поражения СИ с использованием способа-прототипа воспроизводится клиническая картина и макро- и микроскопические признаки, типичные для данного типа поражений. Однако в описании материальной части способа-прототипа, а точнее, полученной при его реализации модели, макроскопические признаки отравления подопытных животных СИ в достаточной степени не конкретизированы. Развернутое лабораторно-инструментальное подтверждение также отсутствует. Сведения о выявленных формирующихся патоморфологических изменениях, связанных с локальным ингаляционным поражением СИ бронхолегочной системы подопытных животных с использованием указанной модели, также отсутствуют.

Основное достоинство полученной вследствие воздействия аэрозоля токсиканта модели ИПСИ - модульность и приближенность к ингаляционному сценарию поступления токсиканта.

Наряду с отмеченными достоинствами для способа-прототипа характерен ряд существенных недостатков:

- большие потери токсиканта вследствие аппликации СИ на стенки ингаляционной камеры и выход большей его части в камеру для дегазации;

- отсутствие расчетных данных о поглощенной дозе СИ, которая служит интегральным показателем тяжести модели ИПСИ, а также позволяет рассчитать показатели защитной эффективности средств патогенетической терапии;

- сложность исполнения и необходимость использования дорогостоящих модулей и расходных материалов, а именно, клапанов, системы трубок и полиметилметакрилатных пеналов общей стоимостью из расчета на одну экспозицию 6 животных более 1 млн. рублей в связи с необходимостью реализации серьезных усилий по обеспечению безопасности исследователя и окружающей среды;

- отсутствие в доступных источниках информации сведений о конкретной последовательности действий, способах разведения токсиканта и результатах микрометрической оценки полученного аэрозоля, имеющих принципиальное значение для установления глубины проникновения токсиканта и его объема, поступившего в альвеолы, что, в свою очередь, важно для повышения значимости проведенных экспериментов по показателям повторяемость и воспроизводимость;

- использование полимерных материалов для изготовления значительной части комплектующих ингаляционных систем. Однако известно, что СИ способен проникать в полимерные материалы и затем подвергаться длительной десорбции из них, сохраняя при этом свои токсические свойства, несмотря на проветривание экспозиционной камеры чистым воздухом в течение 25 мин. Данный факт свидетельствует о повышенных рисках не только для здоровья персонала исследовательских лабораторий при выполнении экспериментов, но и окружающей среды в целом. Возможно лишь однократное использование полимерных комплектующих, что значительно увеличивает стоимость выполняемых исследовательских работ. Кроме того, продолжающаяся десорбция СИ из системы возгонки может обуславливать фоновую нагрузку в ходе последующих экспериментов, что полностью исключает возможность использования оборудования для получения аэрозолей других токсикантов;

- моделирование у подопытных животных локального поражения бронхолегочной системы вследствие поражения СИ и формирующихся при этом патоморфологических изменений не представляется возможным в связи с тем, что изоляция голов подопытных животных, что предусмотрено при использовании способа-прототипа, не исключает контаминации токсикантом их кожных покровов и слизистых оболочек.

Отмеченные существенные недостатки свидетельствуют о невозможности использования способа-прототипа для моделирования ингаляционного поражения СИ и получения валидных данных больших выборок животных на протяжении длительного периода экспериментальной работы. В ходе анализа уровня техники не выявлены другие способы, позволяющие при использовании в качестве биологических моделей мелких лабораторных животных получить значимую модель ИПСИ, которая отражала бы условия применения токсиканта, приближенные к возможным при чрезвычайных ситуациях (локальные конфликты с использованием СИ с террористическими целями, при техногенных авариях и т.п.), но была бы при этом достаточно безопасной при минимальных уровнях трудовых и материальных затрат.

Таким образом, выявленные недостатки и ограничения существующих моделей ИПСИ указывают на необходимость их совершенствования и модификации, что весьма актуально в настоящее время.

Цель изобретения - разработка способа моделирования ингаляционного поражения СИ, простого в проведении, не требующего использования сложных устройств и приспособлений для доставки токсиканта в бронхолегочную систему, обеспечивающего возможность получения экспериментальной модели патоморфологических изменений поврежденной легочной ткани, связанных с локальным ингаляционным поражением аэрозолем СИ бронхолегочной системы крыс, достоверно отражающей воздействие на организм животных поражающих факторов СИ, высоковоспроизводимой по макро- и микроскопическим признакам и объему поврежденной легочной ткани у всех животных экспериментальной группы, отличающегося простотой последующей дегазации используемого оборудования.

Указанная цель достигается путем создания и применения способа, позволяющего получить в бронхолегочной системе мелких лабораторных животных, в качестве которых используют крыс с массой тела 200±20 г, моделей локальных ингаляционных поражений аэрозолем СИ, а именно, моделей патоморфологических изменений поврежденной легочной ткани у отравленных крыс, повторяемых по макро- и микроскопическим признакам и объему поврежденной легочной ткани у всех животных экспериментальной группы.

Введение каждому животному необходимой дозы СИ в виде аэрозоля требуемой дисперсности обеспечивается за счет применения микроспреера MicroSprayer^® Aerosolizer (модель IA-1B-R) («Penn-Century Inc.», США) [7], представляющего собой шприц-систему с зондом, при опорожнении которого давлением руки экспериментатора достигается приведение находящейся внутри жидкости в аэрозольное состояние с дисперсностью, составляющей, согласно гарантиям завода-изготовителя, 30-100 мкм. Зонд вводят подопытному животному, находящемуся в наркотизированном состоянии, в трахею до уровня бифуркации (интратрахеально), после чего выходящий из микроспреера в виде облака аэрозоль СИ достигает дистальных отделов бронхолегочной системы, вызывая там локальное поражение.

При сохранении эффектов, общих со способом-прототипом, в отличие от способа-прототипа, для которого отсутствуют сведения о последовательности действий при получении конкретной модели ингаляционного поражения СИ, в заявляемом способе экспериментально определены условия и отработана последовательность действий для получения модели значимых патоморфологических изменений в поврежденной легочной ткани у отравленных крыс вследствие локального ингаляционного поражения указанным токсикантом дистальных отделов бронхолегочной системы, пригодной для изучения макро- и микроскопической картины патоморфологических изменений и объема поврежденной легочной ткани, а именно, для обеспечения максимального эффекта по доставке и распределению токсиканта в дистальных отделах легких опорожнение микроспреера производят при достижении наконечником зонда уровня бифуркации трахеи, и используют раствор, полученный при растворении СИ в 4%-ном водном растворе диметилсульфоксида (ДМСО), с необходимой концентрацией СИ.

Экспериментально установлен оптимальный объем вводимого раствора токсиканта, который составил 100 мкл на 100 г массы тела крысы. В ходе серии экспериментов установлено, что при интратрахеальном введении токсиканта в объеме более 100 мкл на 100 г массы тела крыс выявляются случаи рефлекторной остановки у них дыхания и мгновенной гибели, а при снижении объема не обеспечивалось развитие объемной картины поражения бронхолегочной системы и соответствующих патоморфологических изменений поврежденной легочной ткани. Значение в 100 мкл удобно с точки зрения скорости расчета объема токсиканта, исходя из массы тела каждого животного, что важно в эксперименте при отравлении значительного количества животных (например, когда каждое животное имеет различную массу тела в пределах 180-220 г). При реализации заявляемого способа при наборе токсиканта в шприц микроспреера исходят из массы тела каждой участвующей в эксперименте крысы.

В оптимальном объеме вводимого раствора токсиканта поглощенная доза СИ равна средней летальной дозе (ЛД₅₀) и составляет 1,37 мг/кг. Поглощенная доза токсиканта, необходимая для получения модели патоморфологических изменений в поврежденной легочной ткани при реализации заявляемого способа, установлена экспериментально по принципу минимальной достаточности. Так, при дозе СИ менее 1,0 ЛД₅₀ значимых изменений макро- и микроскопических признаков и объема поврежденной легочной ткани у отравленных крыс в сравнении с контрольными не выявляли. При увеличении поглощенной дозы свыше 1,0 ЛД₅₀ наблюдали значимое возрастание количества погибших крыс.

Указанная поглощенная доза СИ (1,37 мг/кг) оптимальна для получения экспериментальной модели, пригодной для наблюдения за патоморфологическими изменениями в поврежденной легочной ткани у отравленных крыс в сравнении с интактными животными.

Общеизвестно, что дисперсность аэрозоля влияет на глубину проникновения токсиканта в дыхательные пути. Экспериментально установлен фазово-дисперсный состав аэрозоля СИ, который определяли при помощи лазерного анализатора размера частиц TSI 3321 с дилютером TSI 3302A [8]. К ингаляционной камере через специальное отверстие последовательно подключали анализатор размера частиц и дилютер. На следующем этапе подавали аэрозоль СИ в камеру и в течение необходимого времени выполняли измерения. По завершении измерений регистрировали соответствующую характеристику аэрозоля, и выведенное на экран лазерного анализатора значение размера частиц переносили в протоколы эксперимента. Зарегистрированный средний масс-медианный размер аэрозольных частиц раствора СИ, получаемых при использовании микроспреера указанной модели, составил 32,1±2,6 мкм.

Экспериментальным путем выявлено, что именно достаточная дисперсность аэрозоля и введение аэрозоля в трахею достигая ее бифуркации, обеспечиваемые за счет использования микроспреера MicroSprayer^® Aerosolizer (модель IA-1B-R), позволяют получить достоверную модель патоморфологических изменений в поврежденной легочной ткани, связанных с ингаляционным поражением, близким к реальным, наблюдаемым в условиях чрезвычайных ситуаций (поступление токсиканта в дистальные отделы бронхолегочной системы, аэрозольное состояние токсиканта, развитие типичной патоморфологической картины).

Важным существенным отличием заявляемого способа является то, что при его реализации предусмотрено введение определенной (экспериментально установленной) дозы токсиканта, лимитированной массой тела крысы, непосредственно каждому животному, в то время как при реализации способа-прототипа речь идет об экспозиционной дозе токсиканта в воздухе, а именно, на местности вокруг крысы. При этом экспериментально установленная доза ЛД₅₀, составляющая 1,37 мг/кг, сопоставима и даже значимо ниже, чем указано при описании аналога безоперационной интубации [4], что свидетельствует о большей биодоступности токсиканта в случае его использования при реализации заявляемого способа, и как следствие - высокой воспроизводимости получаемой модели.

Возможность достижения цели изобретения показана в представленных примерах, раскрывающих последовательность действий при реализации заявляемого способа, подтверждающих возможность получения у мелких лабораторных животных (крыс) модели ингаляционного поражения аэрозолем СИ дистальных отделов бронхолегочной системы, отражающих возможность изучения возникших вследствие отравления крыс патоморфологических изменений в поврежденной легочной ткани на различных сроках наблюдения до 14 сут.

Пример 1. Реализация заявляемого способа получения у мелких лабораторных животных модели патоморфологических изменений в поврежденной легочной ткани, связанных с локальным ингаляционным поражением аэрозолем сернистого иприта бронхолегочной системы.

Реализацию заявляемого способа осуществляют в соответствии с Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985). Удостоверяем, что протокол исследования соответствовал этическим нормам и принципам биомедицинских исследований, одобрен локальным этическим комитетом ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ (протокол №217 от 25.12.2018 г.).

При реализации заявляемого способа используют здоровых мелких лабораторных животных (крыс) с массой тела 200±20 г. Предварительно, до начала исследования, в течение 14 дней проводят наблюдение за животными в условиях вивария при постоянной температуре 25±2°С, свободном доступе к пище, воде и с ежедневным осмотром (поведение, общее состояние).

За 5 мин до начала реализации заявляемого способа выполняют общую анестезию (наркоз), в составе которой необходим препарат с миорелаксирующим действием, для чего крысам внутримышечно вводят лекарственное средство с подобным составом. В частном конкретном случае анестезию осуществляют путем введения Золетил-100™ (Virbac, Франция) в дозе 15 мг/кг массы тела.

Ингаляционное отравление крыс аэрозолем СИ выполняет один экспериментатор с использованием механического аналога струйного небулайзера - микроспреера MicroSprayer^® Aerosolizer (модель IA-1B-R). Через 3-4 мин после введения наркоза экспериментатор фиксирует крысу на металлической трапециевидной решетке спиной кверху так, чтобы грудная клетка была в подвешенном состоянии и беспрепятственно экскурсировала, а верхнюю челюсть удерживает при помощи корнцанга. Далее экспериментатор с помощью ларингоскопа отводит нижнюю челюсть и язык, обеспечивая зрительный контакт с голосовой щелью крысы. Заявляемый способ предусматривает интратрахеальное введение токсиканта, для чего экспериментатор, наблюдая за движениями грудной клетки крысы, в момент выдоха заводит наконечник микроспреера в бифуркацию трахеи до упора, причем выполняет введение микроспреера очень аккуратно. Далее экспериментатор проводит контроль попадания микроспреера по визуальному контролю дыхательных экскурсий при движении поршня микроспреера на себя. После контроля экспериментатор выполняет механическое давление на поршень с постоянным по величине усилием до полного опустошения микроспреера. Для достижения требуемой поглощенной дозы СИ (1,37 мг/кг) используют раствор, полученный при растворении СИ в 4%-ном водном растворе ДМСО. Объем вводимого раствора СИ лимитирован массой тела подопытного животного и составил 100 мкл на 100 г (то есть, например, крысе с массой тела 200 г вводят 0,2 мл раствора с концентрацей СИ 1,37 мг/мл).

После вывода наконечника микроспреера из трахеи экспериментатор выполняет контроль сохранности у крысы дыхательных движений и продолжает наблюдение за ней еще в течение 30-40 мин до полного выхода из наркоза.

Заявляемый способ прост в проведении, а при его реализации используют не дорогостоящий небулайзер с комплексом клапанов и трубок (способ-прототип), а аэрозольную шприц-систему, простую в обращении и сравнительно дешевую (в 5-7 раз для разных изготовителей). Так как при реализации заявляемого способа выполняют интратрахеальное введение аэрозоля раствора СИ через смыкающуюся голосовую щель, обратный его выброс практически исключен, что очень ценно не только из соображений точности дозирования вводимого токсиканта, но и возможности обеспечения безопасности экспериментатора. Используемые при этом приборы максимально просты в конструкции, вследствие чего их просто дегазировать по окончании моделирования, что свидетельствует о возможности их многократного безопасного использования, в том числе и для введения других токсикантов.

Пример 2. Получение с использованием заявляемого способа модели ингаляционного поражения аэрозолем раствора сернистого иприта бронхолегочной системы крыс с типичными патоморфологическими признаками отравления.

В ходе исследования по доказательству возможности использования заявляемого способа для получения модели ингаляционного поражения аэрозолем раствора СИ дистальных отделов бронхолегочной системы, была сформирована группа из 30 подопытных животных, в качестве которых использовали белых беспородных крыс с массой тела 200±20 г и возрастом 1,5-2 мес.

За 5 мин до начала реализации заявляемого способа, а именно, отравления крыс аэрозолем раствора СИ с поглощенной дозой токсиканта 1,0 ЛД₅₀, составляющей 1,37 мг/кг, экспериментатор выполняет общую анестезию (наркоз) путем внутримышечного введения в частном конкретном случае лекарственного средства Золетил-100™ («Virbac», Франция), представляющего комбинацию тилетамина (анестетик диссоциативного действия) и золазепама (анксиолитик бензодиазепинового ряда), которое обеспечивает быструю скорость наступления анестезии и достаточное для введения аэрозоля раствора СИ время действия. При этом средство Золетил-100™ минимально подавляет дыхательный центр и обладает хорошим миорелаксирующим эффектом. Вводят средство Золетил-100™ (Virbac, Франция) в дозе 15 мг/кг массы тела крысы, причем подбор дозы средства Золетил-100™ осуществлен по принципу минимальной достаточности достижения необходимых критериев. При меньшей дозе не достигался эффект обездвиживания крыс, при большей - появлялись неадекватная миорелаксация и угнетение дыхания.

В качестве растворителя для СИ используют водный раствор ДМСО (химическое вещество с формулой (СН₃)₂SO, бесцветная жидкость без запаха со специфическим сладковатым вкусом, биполярный апротонный растворитель). Конечное содержание ДМСО во всех разведениях доводили до 4%.

Для моделирования ингаляционного отравления используют микроспреер MicroSprayer^® Aerosolizer (модель IA-1B-R). После наркотизации крыс экспериментатор осуществляет интратрахеальное введение им раствора СИ в объеме 100 мкл на 100 г массы тела крысы с поглощенной дозой СИ 1,0 ЛД₅₀ (1,37 мг/кг). Выводят крыс из опыта на 1, 3, 7, 10 и 14 сут (по 6 крыс в сут) от начала эксперимента путем декапитации, проводят некропсию и выполняют патоморфологическое исследование.

Экспериментально отработаны условия и получена модель ингаляционного поражения аэрозолем раствора СИ бронхолегочной системы мелких лабораторных животных (крыс) с характерными для нее патоморфологическими признаками, которую можно использовать для изучения течения процесса поражения легочной ткани на различных сроках наблюдения до 14 сут, включая острейший период от момента введения токсиканта, а также использования в последующем в ходе исследований по изучению действия антидотных средств и средств патогенетической терапии.

Пример 3. Исследования по оценке изменений патоморфологических характеристик легочной ткани крыс после локального ингаляционного поражения их аэрозолем раствора сернистого иприта с использованием заявляемого способа.

В ходе исследования по оценке изменений патоморфологических характеристик легочной ткани крыс после локального ингаляционного поражения их аэрозолем раствора СИ с поглощенной дозой 1,0 ЛД₅₀ (1,37 мг/кг) проводили некропсию и выполняли патоморфологическое исследование.

Из подопытных животных были сформированы две группы по 30 особей в каждой: группа контроля растворителя (4%-ного водного раствора ДМСО) и группа крыс, отравленных аэрозолем раствора СИ. Выводили крыс из эксперимента на 1,3, 7, 10 и 14 сут (по 6 крыс в сут) от начала отравления токсикантом путем декапитации.

В ходе некропсии визуально оценивали состояние левого легкого крыс, которое наиболее часто подвергается действию токсиканта ввиду морфологических особенностей трахеобронхиального дерева. Извлеченные легкие фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине. На вырезке для последующего исследования отбирали образец ткани левого легкого при поперечном разрезе на уровне 1-2 мм ниже воротной зоны. Образцы тканей обрабатывали в спиртах возрастающей концентрации, заключали в парафин и изготовляли срезы толщиной 3-4 мкм согласно общепринятым методикам [8]. Парафиновые срезы органов окрашивали гематоксилином и эозином. Подготовленные микропрепараты изучали при помощи микроскопа Leica DM 2500. Фоторегистрацию осуществляли при помощи цифровой фотокамеры Leica DFC490 с базовым программным обеспечением Leica Image Manager и цифровой камеры VideoZavr Standard.

Общий вид и типичная макроскопическая картина левого легкого на различных сроках наблюдения в течение первых двух недель после начала отравления крыс путем интратрахеального введения аэрозоля раствора СИ с поглощенной дозой СИ 1,0 ЛД₅₀ (1,37 мг/кг) с использованием заявляемого способа представлены на фиг. 1. При этом на фиг. 1А представлена типичная макроскопическая картина левого легкого через 1 сут после интратрахеального введения аэрозоля растворителя (4%-ного водного раствора ДМСО), на фиг. 1Б - через 1 сут после отравления аэрозолем раствора СИ, на фиг. 1В-1Е - соответственно через 3, 7, 10, 14 сут после отравления аэрозолем раствора СИ.

Как видно, через 1 сут после интратрахеального введения аэрозоля раствора СИ выявляли выраженную гиперемию поверхностей левого легкого с появлением обширных сливных участков прикорневой локализации темно-коричневого цвета плотной консистенции. По всем долям отмечали единичные мелкие точечные кровоизлияния.

Через 3 сут отмечали разнообразное состояние левого легкого, отражающее объем поврежденной ткани. У животных в окраске доминируют крупные коричнево-серые участки, образующие сливные поверхности, занимающие у крыс все доли левого легкого. По краю долей левого легкого сохранялись узкие розовые полоски. Поверхность долей имела бугристый вид. Левое легкое имело плотную консистенцию, при надавливании отмечали пенистые выделения.

На 7 сут в окраске доминируют темно-коричневые цвета, занимающие почти всю поверхность долей левого легкого. Поверхность левого легкого выглядела более гладкой. Продолжали визуализироваться более светлые зоны в виде краевой полосы. В отдельных фокусах появлялись белесоватые участки.

Через 10 сут поверхность левого легкого блестящая, окраска долей приобретает более неоднородный вид. На бледно-розовом фоне выявляют выбухающие крупные сливные пятна темно-серого цвета, занимающие до 4/5 объема ткани, плотные на разрезе.

К 14 сут окраска долей левого легкого, как и через 10 сут, выраженно неравномерная. Выбухающие фокусы плотной ткани серого цвета чередуются с участками темно-вишневых ателектазов и воздушной бледно-розовой тканью. На разрезе пенистые выделения не определяются.

При микроскопии в качестве препарата сравнения представлена микроскопическая картина легочной ткани крысы в группе интратрахеального введения аэрозоля растворителя (фиг. 2А). При интратрахеальном введении аэрозоля растворителя каких-либо патоморфологических изменений не выявлялось. Во всех профилях бронхиального дерева наблюдали целостность и однородность эпителиальной выстилки, соответствующей диаметру бронха с визуализацией щеточной каемки, наличие отделенной слизи в виде пристеночных узких полосок или капельных фрагментов с единичными макрофагами или эпителиальными клетками. В зонах повышенной воздушности альвеолярные перегородки были тонкими с незначительным содержанием клеточных элементов. Микроскопическая картина легочной ткани после отравления аэрозолем раствора СИ с поглощенной дозой СИ 1,0 ЛД₅₀ (1,37 мг/кг массы тела крысы) в течение первых двух недель представлена на фиг. 2 (фиг. 2Б, 2В, 2Г, 2Д, 2Е - состояние легочной ткани соответственно через 1, 3, 7, 10 и 14 сут после отравления аэрозолем раствора СИ в указанной дозе). После ингаляционного воздействия аэрозолем раствора СИ отмечали возникшие поражения, а именно, развитие выраженного патологического процесса в паренхиме легких крыс экспериментальной группы с образованием крупных безвоздушных участков. Объемность поврежденной паренхимы во взятых образцах у разных крыс подопытной группы занимала от 2/3 до 3/4 всего объема. К 1 сут (фиг. 2Б) отечная жидкость не полностью занимала объем альвеол. В ней визуализировались в умеренном количестве палочкоядерные и сегментоядерные лейкоциты, моноциты, макрофаги и эритроциты. Безвоздушные участки связаны с развитием интерстициального и внутриальвеолярного отеков разной насыщенности белками в разных фокусах альвеол. К 3 сут отмечали формирование выраженных воспалительных пневмонических инфильтративных изменений (фиг. 2В), заметно увеличивалась площадь, занимаемая фокусами плотных ателектазов. Через 7 сут (фиг. 2Г) влияние на паренхиму выявляется в виде паравазального отека с расширением прилежащих лимфососудов, заполненных окрашенной лимфой, и серозного отека мелких участков просвета альвеол в краевых областях. К окончанию сроков наблюдения на 10-14 сут (фиг. 2Д, 2Е) воздушные зоны паренхимы имели проявления центроацинарной эмфиземы.

Таким образом, экспериментально доказано, что у всех крыс, отравленных путем интратрахеального введения аэрозоля раствора СИ с поглощенной дозой СИ 1,0 ЛД₅₀ (1,37 мг/кг), формировалось иприт-индуцированное повреждение легочной ткани и патоморфологическая картина, характерная для ИПСИ.

Отмеченные повреждения легочной ткани у всех крыс экспериментальной группы были идентичны по характеру и локализации и не имели существенных отличий по данным патоморфологического исследования, то есть, на один и тот же срок наблюдения у разных крыс наблюдали сходные макро- и микроскопические признаки и объем поврежденной легочной ткани. Это свидетельствует о том, что полученная модель отличается высокой воспроизводимостью на всех сроках наблюдения, а именно, на 1, 3, 7, 10, 14 сут от начала отравления крыс аэрозолем раствора СИ.

Таким образом, заявляемый способ позволяет моделировать ингаляционное поражение аэрозолем раствора СИ в установленной экспериментальным путем дозе при использовании аэрозольной шприц-системы, а именно, микроспреера указанной модели, при этом данный способ достаточно прост в исполнении, не требует использования специальных сложных устройств и приспособлений, проведения в специально оборудованных помещениях, практичен, в связи с чем доступен исследовательским группам и имеет перспективы для широкого использования в исследовательских целях. Экспериментально доказано, что:

- при реализации заявляемого способа на легкие крыс действуют все факторы поражающего действия СИ, как правило, наблюдаемые в предполагаемых условиях чрезвычайных ситуаций (поступление токсиканта в дистальные отделы легких, аэрозольное состояние токсиканта, развитие в бронхолегочной системе крыс типичных патоморфологических изменений);

- не требуется выполнение сложного пересчета экспозиционной дозы в поглощенную и отсутствуют потери токсиканта при его интратрахеальном введении;

- использование микроспреера MicroSprayer^® Aerosolizer (модель IA-1B-R) позволяет обеспечить ингаляционное поражение СИ, вызывающее сходные патоморфологические изменения (макро- и микроскопические признаки и объем поврежденной легочной ткани) у всех крыс экспериментальной группы на всех сроках наблюдения за ними;

-заявляемый способ не требует больших финансовых затрат, связанных с приобретением сложных ингаляционных установок для приведения токсиканта в аэрозольное состояние.

Вышесказанное свидетельствует о достижении цели изобретения.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна», так как впервые предложен способ, позволяющий путем ингаляционного воздействия аэрозолем раствора СИ с поглощенной дозой токсиканта 1,37 мг/кг, обеспечиваемого за счет использования микроспреера MicroSprayer^® Aerosolizer (модель IA-1B-R), моделировать у мелких лабораторных животных (крыс) локальные ингаляционные поражения дистальных отделов легких, высоковоспроизводимые, то есть сходные по макро- и микроскопическим признакам и объему поврежденной легочной ткани у всех крыс экспериментальной группы, что весьма актуально в настоящее время и определяет перспективы его широкого использования в исследовательских целях.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», так как в известных и доступных источниках информации (из уровня техники), содержащих описания способов моделирования ингаляционных поражений СИ, нет сведений (не известны), из которых была бы очевидна возможность достижения положительного эффекта - получения у мелких лабораторных животных (крыс) моделей локальных ингаляционных поражений аэрозолем раствора СИ бронхолегочной системы с воспроизводимыми макро- и микроскопическими признаками и сходными по объему повреждениями легочной ткани, достоверно отражающих воздействие на организм животных всех наиболее значимых факторов действия СИ (поступление токсиканта в дистальные отделы легких, аэрозольное состояние токсиканта, развитие типичной патоморфологической картины), и целесообразность использования микроспреера MicroSprayer^® Aerosolizer (модель IA-1B-R) («Penn-Century Inc.», США) для интратрахеального введения токсиканта в экспериментально установленной поглощенной дозе.

Соответствие критерию «пригодность для промышленного применения» доказывается результатами выполненных экспериментов, из которых видно, что заявляемый способ достаточно прост в проведении, предусматривает использование для введения аэрозоля раствора СИ вместо сложных и дорогостоящих устройств и приспособлений микроспреера MicroSprayer^® Aerosolizer (модель IA-1B-R), обращение с которым достаточно простое и не требует специальных знаний и навыков. Заявляемый способ моделирования практичен, в связи с чем доступен исследовательским группам и имеет перспективы для широкого использования в исследовательских целях при изучении патоморфологических характеристик повреждений легочной ткани у мелких лабораторных животных (крыс) в случаях отравления аэрозолем СИ, а также при разработке антидотов и средств профилактики отравлений СИ.

Список литературы

1. Kumar D. Nitrogen mustard exposure of murine skin induces DNA damage, oxidative stress and activation of MAPK/Akt-AP1 pathway leading to induction of inflammatory and proteolytic mediators / D. Kumar [et al.] // Toxicol. Lett. - 2015. Vol. 235. - P. 161-171.

2. Goswami G. Topical nitrogen mustard exposure causes systemic toxic effects in mice / D.G. Goswami [et al.] // Experimental and Toxicologic Pathology. 2015. Vol. 67, №2. - P. 161-170.

3. McClintock S.D Attenuation of half sulfur mustard gas-induced acute lung injury in rats. / S.D. McClintock [et al.] // J. Appl. Toxicol. - 2006. - Vol. 26. - P. 126-131.

4. Yu D. In vitro the differences of inflammatory and oxidative reactions due to sulfur mustard induced acute pulmonary injury underlying intraperitoneal injection and intratracheal instillation in rats. / D. Yu [et al.] // Int. immunopharmacol. 2017. - Vol. 47. - P. 78-87.

5. Anderson D.R. Evaluation of protease inhibitors and an antioxidant for treatment of sulfur mustard-induced toxic lung injury. / D.R. Anderson [et al.] // Toxicology. 2009. - Vol. 263. -P. 41-46.

6. Boskabady M.H. The effect of Nigella sativa alone, and in combination with dexamethasone, on tracheal muscle responsiveness and lung inflammation in sulfur mustard exposed guinea pigs / M.H. Boskabady [et al.] // J. Ethnopharmacol. - 2011. - Vol. 137(2). -P. 1028-1034.

7. Sosnowski T.R. Spraying of cell colloids in medical atomizers / T.R. Sosnowski [et al.] // Conference of Italian Association of Chemical Engineering. - 2013. - Vol. 11. - P. 371-378.

8. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / под ред. Н.Н. Каркищенко, С.В. Грачева // М.: Профиль-2С. - 2010. - 358 с.

1. Способ моделирования ингаляционного поражения сернистым ипритом, включающий отравление находящихся под наркозом мелких лабораторных животных аэрозолем раствора сернистого иприта, отличающийся тем, что используют раствор, полученный при растворении сернистого иприта в 4%-ном водном растворе диметилсульфоксида, с концентрацией сернистого иприта 1,37 мг/мл, вводят раствор сернистого иприта в дистальные отделы бронхолегочной системы каждого участвующего в эксперименте мелкого лабораторного животного - крысы с массой тела 200±20 г - в виде аэрозоля дисперсностью 32,1±2,6 мкм, получают аэрозоль дисперсностью 32,1±2,6 мкм при помощи аэрозольной шприц-системы - микроспреера MicroSprayer® Aerosolizer модели IA-1B-R, при этом в шприц микроспреера помещают раствор сернистого иприта в объеме 100 мкл на 100 г массы тела крысы, причем с помощью микроспреера вводят аэрозоль раствора сернистого иприта интратрахеально через смыкающуюся голосовую щель, для чего после введения наркоза фиксируют крысу на металлической трапециевидной решетке спиной кверху так, чтобы грудная клетка была в подвешенном состоянии и беспрепятственно экскурсировала, а верхнюю челюсть удерживают при помощи корнцанга, отводят с помощью ларингоскопа нижнюю челюсть и язык, обеспечивая зрительный контакт с голосовой щелью крысы, наблюдают за движениями грудной клетки крысы и в момент выдоха заводят наконечник микроспреера в бифуркацию трахеи до упора, проводят контроль попадания микроспреера по визуальному контролю дыхательных экскурсий при движении поршня микроспреера на себя, при достижении наконечником микроспреера уровня бифуркации трахеи выполняют механическое давление на поршень до полного опустошения микроспреера, выводят крыс из эксперимента на 1, 3, 7, 10 и 14 сут от начала отравления их аэрозолем раствора сернистого иприта с поглощенной дозой сернистого иприта 1,37 мг/кг массы тела крысы по 6 крыс в сут путем декапитации, в ходе некропсии визуально оценивают состояние левого легкого крыс и выполняют патоморфологическое исследование микропрепаратов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что общую анестезию выполняют внутримышечно препаратом Золетил-100™ в дозе 15 мг/кг массы тела крысы.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что патоморфологическое исследование микропрепаратов выполняют при помощи микроскопа Leica DM 2500, а фоторегистрацию выполняют при помощи цифровой фотокамеры Leica DFC490 с базовым программным обеспечением Leica Image Manager и цифровой камеры VideoZavr Standard.