Способ определения радиочувствительности злокачественных опухолей прямой кишки

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к молекулярной биологии и онкологии. Способ включает выделение РНК из биопсийного материала, определение экспрессии микро-РНК miR-550a-3-5p, miR-3610 и miR-23b-5p относительно референсной последовательности U6 методом ПЦР-РВ с использованием высокспецифичных праймеров, сравнение полученных значений miRE с интервалами miRE_miR-550a, miRE_miR-3610 и miRE_miR-23b характерными для радиорезистентной или чувствительной к лучевой терапии формы рака прямой кишки. Способ позволяет сделать процедуру определения радиорезистентной или чувствительной к лучевой терапии формы рака прямой кишки более простой и точной, а также позволяет своевременно скорректировать тактику проводимой терапии. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, молекулярной биологии и онкологии, и может быть использовано для определения радиорезистентных и радиочувствительных форм рака прямой кишки.

Согласно данным статистики, рак прямой кишки (РПК) занимает третье место в структуре впервые диагностированных злокачественных новообразований и второе место среди причин смерти онкологических больных. РПК занимает лидирующие позиции среди новообразований желудочно-кишечного тракта обоих полов в Российской Федерации, при этом частота заболеваемости РПК среди мужчин и женщин составляет 11 и 7,1 на 100 тысяч взрослого населения соответственно (см. Бойцов С.А., Деев А.Д., Шальнова С.А. Смертность и факторы риска неинфекционных заболеваний в России: особенности, динамика, прогноз. Терапевтический архив (архив до 2018 г.). - 2017. - Т. 89. - N. 1. - С. 5-13.).

Радиотерапия является одним из основных методов лечения РПК (см. Кит О.И, Геворкян Ю.А., Солдаткина Н.В., Новикова И.А., Гусарева М.А. Клинико-морфологические эффекты предоперационной лучевой терапии крупным фракционированием дозы при раке прямой кишки // Тюменский медицинский журнал. - 2016. - Т. 18. - N 2. - С. 39-44.). В качестве варианта предоперационного лечения применяют короткий курс лучевой терапии, который проводится на первичную опухоль и зону регионарного метастазирования за 5 фракций с разовой очаговой дозой 5 Гр (см. Кутилин Д.С., Кошелева Н.Г., Максимов А.Ю., Гусарева М.А., Бондаренко Е.С., Сагакянц А.Б., Донцов В.А., Габричидзе П.Н., Черняк М.Н., Гречкин Ф.Н., Мезенцев С.С., Ульянова Е.П., Полуэктов С.И. Влияние различных доз лучевой терапии на выживаемость клеток аденокарциномы толстой кишки линии НТ-29 // Современные проблемы науки и образования. - 2019. - N 3.; URL: http://www.scieNce-educatioN.ru/ra/article/view?id=28918 (дата обращения: 06.09.2019).). Эффективность подобной терапии зависит от исходной радиорезистентности опухолевых клеток, ассоциированной с их генетическими и эпигенетическими особенностями (см. Кутилин Д.С., Кошелева Н.Г., Гусарева М.А., Харагезов Д.А., Донцов В.А., Полуэктов С.И., Зема Т.В., Лиман Н.А., Щляхова О.В., Удаленкова И.А. Влияние транскрипционной активности генов, регулирующих репарацию ДНК, на эффективность лучевой терапии опухолей прямой кишки // Современные проблемы науки и образования. - 2019. - N 6.; URL: http://scieNce-educatioN.ru/ru/article/view?id=29353; см. Кутилин Д.С, Гусарева М.А., Кошелева Н.Г., Габричидзе П.Н., Донцов В.А., Легостаев В.М., Шляхова О.В., Лиман Н.А., Солнцева А.А., Крохмаль Ю.Н. Аберрантная транскрипционная активность генов как фактор радиорезистентности клеток линии НТ-29 // Современные проблемы науки и образования. - 2020. - N 3.; URL:http://scieNce-educatioN.ru/ru/article/view?id=29831). К подобным особенностям можно отнести изменение уровня экспрессии микро-РНК (см. Novikova I.A., TimoshkiNa N.N., Kit O.I., Poluektov S.I., Dashkov A.V., Haragezov D., Tolmakh R.E., KolesNikov E.N., DoNtsov V.A., Petrov D.S., SoldatkiNa N.V., GevorkyaN Y.A., KutiliN D.S. DiffereNtial expressioN of micro-RNA iN tumor aNd NoN-tumor tissues of patieNts with colorectal caNcer. J CliN ONcol 38: 2020 (suppl; abstr el3516)).

Микро-РНК - короткие некодирующие РНК, являющиеся эпигенетическими регуляторами, специфичными для определенных тканей, которые модулируют экспрессию генов путем взаимодействия с комплементарными нуклеотидными последовательностями мишеней матричной РНК (мРНК), что либо катализирует разрушение мРНК, либо ингибирует трансляцию мРНК в белок (см. Димитриади Т.А., Бурцев Д.В., Дженкова Е.А., Кутилин Д.С. Дифференциальная экспрессия микроРНК и их генов-мишеней при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях разной степени тяжести. Успехи молекулярной онкологии. 2020; 7(2):47-61).

Ранее было установлено, что изменение транскрипционной активности генов Н2АХ, RBBP8 и BRCA2 ассоциировано с развитием радиорезистентности опухолевых клеток прямой кишки (см. Кутилин Д.С., Кошелева Н.Г., Гусарева М.А., Харагезов Д.А., Донцов В.А., Полуэктов С.И., Зема Т.В., Лиман Н.А., Шляхова О.В., Удаленкова И.А. Влияние транскрипционной активности генов, регулирующих репарацию ДНК, на эффективность лучевой терапии опухолей прямой кишки // Современные проблемы науки и образования. - 2019. - N 6.; URL: http://scieNce-educatioN.ru/ru/article/view?id=29353). С использованием инвертированного алгоритма TarPmiR (см. Димитриади Т.А., Бурцев Д.В., Дженкова Е.А., Кутилин Д.С Дифференциальная экспрессия микроРНК и их генов-мишеней при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях разной степени тяжести. Успехи молекулярной онкологии. 2020; 7(2):47-61) и баз данных TargetScaN, mirDB и miRTarBase установлено, что 248 микро-РНК таргетирующих гены Н2АХ, RBBP8 и BRCA2 4 микро-РНК (hsa-miR-550a-3-5p, hsa-miR-3610, hsa-miR-4747-3р, hsa-miR-23b-5p) являются перекрывающимися. Анализ уровня экспрессии этих микро-РНК выполненный методом ПЦР в режиме реального времени в биопсийных образцах опухолей прямой кишки позволил установить, что в качестве маркеров для прогнозирования радирезистентности/радиочувствительности рака прямой кишки допустимо использование показателя экспрессии hsa-miR-550a-3-5p, hsa-miR-3610 и hsa-miR-23b-5p.

Из патентных источников известно изобретение «Способ прогнозирования чувствительности опухоли к лучевой терапии у больных раком прямой кишки» (см. патент RU 2349916 С1, опубликован: 20.03.2009, Бюл. N 8) Способ основан на гистологическом исследовании биоптата, взятого из опухоли после 4-го сеанса лучевой терапии, проводимой дробно-протяженным методом. При наличии патоморфоза III-IV степени прогнозируют высокую чувствительность опухоли к облучению, а при наличии патоморфоза I-II степени - низкую чувствительность. Использование способа позволяет прогнозировать чувствительность опухоли у больных раком прямой кишки к проводимой лучевой терапии в ранние сроки, что позволяет при выявлении радиорезистентности опухоли своевременно выполнять радикальную операцию - экстирпацию прямой кишки.

Однако, описанный выше способ принципиально отличается от нашего. Данный способ не позволяет диагностировать радиорезистентную форму рака прямой кишки до начала терапии.

Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на способ определения радиочувствительности злокачественных опухолей прямой кишки на основании уровня экспрессии микро-РНК miR-550a-3-5p, miR-3610 и miR-23b-5p.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, точного способа определения радиочувствительности злокачественных опухолей прямой кишки.

Технический результат заключается в том, что проводят определение экспрессии микро-РНК miR-550a-3-5p, miR-3610 и miR-23b-5p относительно референсной последовательности U6 методом ПЦР-РВ с использованием высокоспецифичных праймеров на матрице кДНК, рассчитывают относительную экспрессию микро-РНК: miRE по формуле miRE=2^{-ΔCt(нормальная ткань)}/2^{-ΔCt(опухолевая ткань)}=2^-ΔΔCt, где ΔCt=C_{tцелевой локус miR-550a-3-5p, miR-3610, miR-23b-5p} - Сt_{референсный локус U6} и сравнивают полученные значения miRE с прогностическим интервалом, при значениях в интервале miRE_miR-550a<0,97, miRE_miR-3610<0,41 и miRE_miR-23b<0,65 у пациента определяют радиорезистентную форму рака прямой кишки, а при значениях в интервале miRE_miR-550a>1,9, miRE_miR-3610>2,2 и miR_miR-23b>3,5 у пациента определяют чувствительную к лучевой терапии форму рака прямой кишки.

Новизной способа является то, что определяют уровень экспрессии miR-550a-3-5p, miR-3610 и miR-23b-5p относительно референсного локуса U6 в образцах биопсии больных раком прямой кишки, сравнивают полученные значения с интервалами miRE_miR-550a, miRE_miR-3610 и miRE_miR-23b характерными для радиорезистентной или чувствительной к лучевой терапии формы рака прямой кишки.

Заявленный способ включает следующие приемы:

- получение образцов биопсии нормальной и опухолевой ткани прямой кишки при выполнении видеоколоноскопии;

- выделение РНК методом гуанидин-тиоционат-фенол-хлороформной экстракции и проведение реакции обратной транскрипции одновременно с полиаденилированием РНК;

- определение относительной экспрессии микро-РНК (miR-550a-3-5р, miR-3610, miR-23b-5p)

- расчет miRE_miR-550a, miRE_miR-3610 и miRE_miR-23b на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами целевой и референсной последовательностей (U6),

- сравнение miRE_miR-550a, miRE_miR-3610 и miRE_miR-23b пробы с прогностическими значениями miRE_miR-550a, miRE_miR-3610 и miRE_miR-23b, определенными для радиорезистентной и чувствительной к лучевой терапии формы рака прямой кишки.

Для осуществления способа были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для микро-РНК miR-550a-3-5р, miR-3610, miR-23b-5p и малой ядерной РНК U6. Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров (см. таблица 1) осуществлялся с использованием референсных последовательностей MirBase (http://www.mirbase.org/).

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

При видеоколоноскопии получают образцы нормальной и опухолевой ткани прямой кишки, замораживают их в жидком азоте и доставляют лабораторию. Далее биопсийные образцы помещают в пробирки, содержащие 300 мкл лизирующего раствора (4 М гуанидин изотиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,3% саркозил, 3% ДТТ). Пробирки устанавливают в MagNa Lyser (Roche, Швейцария) и подвергают механической гомогенизации. Дальнейшее выделение РНК проводят методом гуанидин-тиоционат-фенол-хлороформной экстракции (см. Кутилин Д.С., Бондаренко Т.И, Корниенко И.В., Михалева И.И. Влияние пептида дельта-сна на экспрессию генов антиоксидантных ферментов в мозге и крови крыс при физиологическом старении организма. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2014. - N 5. - С. 634-637). Для очистки от примесей геномной ДНК суммарную РНК обрабатывают ДНК-азой-1.

Выделенную суммарную РНК используют в реакции обратной транскрипции, которая проводится одновременно с полиаденилированием РНК с использованием специфичных RT-праймеров. Для каждой микро-РНК (miR-550a-3-5p, miR-3610, miR-23b-5p) и U6 (референс) отдельно проводят реакцию обратной транскрипции в одном повторе. Для обратной транскрипции используют реакционную смесь, содержащую 1х поли(А) буфер, 10 U/мкл Reverse TraNscriptase MMLV, 0,1 мМ dNTPs, 0,1 мМ АТФ, 1 μM RT-праймера, 0,5 U/мкл Poly(А)-полимераза и 1 мкг тотальной РНК. Реакцию проводят в течение 15 мин. при 16°C, 15 мин. при 42°C, затем обратную транскриптазу инактивируют 2 мин. при 95°C.

Далее изменение относительной экспрессии микро-РНК оценивают методом RT-qPCR. RT-qPCR амплификацию проводят в 20 мкл смеси, содержащей 1х ПЦР-буфер, 0,25 mM dNTPs, 2 мМ MgCl₂, 1 ед.акт. Taq-DNA-полимеразы и по 400 нМ прямого и обратного праймеров, по следующей программе: 2 минуты 94°C, 50 циклов: денатурация при 94°C 10 с, отжиг и элонгация - 64°C 20 с.

Затем анализируют первичные данные, вычисляют относительную экспрессию микро-РНК (miRE) по формуле miRE=2^{-ΔCt(нормальная ткань)}/2^{-ΔCt(опухолевая ткань)}=2^-ΔΔCt, где ΔCt=Ct_{целевой локус miR-550a-3-5p, miR-3610, miR-23b-5p} - Ct_{референсный локус U6}.

Сравнивают полученные значения miRE с прогностическими значениями экспрессии:

- при значениях в интервале miRE_miR-550a<0,97, miRE_miR-3610<0,41 и miRE_miR-23b<0,65 у пациента определяют радиорезистентную форму рака прямой кишки (чувствительность 91%, специфичность 93%),

- при значениях в интервале miRE_miR-550a>1,9, miRE_miR-3610>2,2 и miRE_miR-23b>3,5 у пациента определяют чувствительную к лучевой терапии форму рака прямой кишки (чувствительность 94%, специфичность 93%).

Предлагаемым способом было осуществлено обследование 50 пациентов, у которых был диагностирован рак прямой кишки. Для доказательства прогностической ценности предлагаемого способа приводятся два клинических примера применения способа.

Пример №1.

Больной Н., 75 лет, состоит на учете в НМИЦ онкологии с июля 2019 г., диагноз рак средне- и верхнеампулярного отделов прямой кишки, с T3N₀M₀.

MPT ОБП, ОМТ (от 10.07.2019 г.) - на 14 см от анодермального перехода, в области границы средне- и верхнеампулярного отделов прямой кишки по левой стенке участок опухоли 15×23×10 мм. Лимфоузлы не поражены. СРКТ ОГК (от 12.06.2019 г.) - КТ-признаки единичных мелких очагов S1 справа и S3 слева. ВКС (от 30.07.2019 г.) - на 15 см от ануса по левой стенке - опухолевидное экзофитное образование на широком основании в виде утолщенной фиксированной площадки с эрозированной мелкобугристой поверхностью. Гистологический анализ - G1 аденокарцинома.

Консультация радиолога (от 01.08.2019 г.) - показано проведение курса конформной лучевой терапии на зону прямой кишки, лимфоузлы малого таза, на фоне радиомодификации фторпиримидинами.

Перед началом лечения, во время ВКС, взята биопсия (нормальная/опухолевая ткань) для выделения РНК/микро-РНК. Результаты молекулярного анализа образцов биопсии miRE_miR-550a=2,9, miRE_miR-3610=2,2 и miRE_miR-23b=5,1 соответствуют прогностическим коэффициентам чувствительной к лучевой терапии формы рака прямой кишки.

С 05.08.2019 г. по 05.09.2019 г. после СРКТ-топометрической подготовки проведен курс конформной лучевой терапии на зону прямой кишки и лимфоузлы малого таза на линейном ускорителе низких энергий UNique VariaN 6MV, на фоне радиомодификации фторпиримидинами - капецитабин 1650 мг/м².

МРТ ОБП, ОМТ (от 24.10.2019 г.) - MP-признаков рецидива опухолевого процесса нет, метастатического поражения лимфатических узлов не обнаружено. ВКС (от 21.10.2019 г.) - эндоскопически полный регресс опухоли (полный патоморфоз).

Пример №2.

Больной У., 73 года, состоит на учете в НМИЦ онкологии с мая 2019 г, диагноз: рак средне- и верхненеампулярного отделов прямой кишки, cT3N₁M_x.

ВКС (от 31.05.2019 г.) - на расстоянии 7 см от ануса до 15 см - слизистая бугристая, контактно кровоточива. Гистологический анализ - низкодифференцированная аденокарцинома. СРКТ ОГК, ОБП, ОМТ (от 10.06.2019 г.) - опухоль прямой кишки 8,1×4,2 см с переходом на ректосигмоидный отдел, инфильтрация окружающей клетчатки, мтс-узлами в ней до 1 см. МРТ ОБП, ОМТ (от 11.06.2019 г.) - на 8 см от входа в анус, на 4,5 см от анодермального перехода циркулярный опухолевый процесс, протяженностью не менее 80 мм. Структура опухоли преимущественно солидная, просвет локально сужен. Экстрамуральный рост с инвазией мезореткальной клетчатки, наличие десмопластической реакции клетчатки. В паректальной клетчатке лимфоузел 8 мм. В мезоректальной клетчатке - единичные лимфоузлы до 5-6 мм.

Консультация радиолога (от 17.06.2019 г.) - показано проведение курса конформной лучевой терапии на зону прямой кишки и лимфоузлы малого таза.

Перед началом лечения, во время ВКС, взята биопсия (нормальная/опухолевая ткань) для выделения РНК/микро-РНК. Результаты молекулярного анализа образцов биопсии miRE_miR-550a=0,5, miRE_miR-3610=0,1 и miRE_miR-23b=0,2 соответствуют прогностическим коэффициентам радиорезистентной формы рака прямой кишки.

С 18.06.2019 г. по 19.07.2019 г. после СРКТ-топометрической подготовки проведен курс конформной лучевой терапии на зону прямой кишки, лимфоузлы малого таза, паховые зоны с обеих сторон, на фоне радиомодификации капецитабином 1650 мг/м² в сутки на линейном ускорителе низких энергий UNique VariaN 6MV.

МРТ ОБП, ОМТ (от 19.09.2019 г.) - MP-картина солидной опухоли средне- и верхненеампулярного отделов прямой кишки с инвазией окружающей клетчатки. ВКС (от 20.09.2019 г.) - рак прямой кишки, состояние после курса НАХЛТ, эндоскопически без выраженной динамики.

Заявляемый способ включает в себя разработанные нами праймеры и является экономически оправданным для определения радиочувствительности злокачественных опухолей прямой кишки, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, осуществление анализа возможно с биопсийным материалом, занимает не более 7 часов.

--->

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy

tsentr onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 1

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

GAGTGCCTGA GGGAGT 16

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr

onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 2

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

GGTCCAGTTT TTTTTTTTTT TTCTCT 26

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr

onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

CAGGTCCAGT TTTTTTTTTT TTTTCT 26

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr

onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 4

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

GCAGGAATCG GAAAGGAG 18

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr

onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

GTCCAGTTTT TTTTTTTTTT TCGG 24

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr

onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 6

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

CAGGTCCAGT TTTTTTTTTT TTTTCG G 26

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr

onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 7

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

GGGTTCCTGG CATGCT 16

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr

onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 8

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

CAGGTCCAGT TTTTTTTTTT TTTTAAATC 29

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr

onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 9

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

CAGGTCCAGT TTTTTTTTTT TTTTAA 26

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr

onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 10

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

CGATAAAATT GGAACGATAC AGA 23

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr

onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 11

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ATTTGGACCA TTTCTCGATT TGT 23

<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr

onkologii

<120> Method for determining the radiosensitivity of rectal malignant tumors.

<160> 12

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ATTTGGACCA TTTCTCGATT TGT 23

<---

1. Способ определения радиочувствительности злокачественных опухолей прямой кишки, заключающийся в том, что проводят определение экспрессии микро-РНК miR-550a-3-5p, miR-3610 и miR-23b-5p относительно референсной последовательности U6 методом ПЦР-РВ с использованием высокоспецифичных праймеров на матрице кДНК, рассчитывают относительную экспрессию микро-РНК: miRE по формуле miRE=2^{-ΔCt(нормальная ткань)}/2^{-ΔCt(опухолевая ткань)}=2^-ΔΔCt, где ΔCt=Ct_{целевой локус miR-550a-3-5p, miR-3610, miR-23b-5p} - Ct_{референсный локус U6}, и сравнивают полученные значения miRE с прогностическим интервалом, при значениях в интервале miRE_miR-550a<0,97, miRE_miR-3610<0,41 и miRE_miR-23b<0,65 у пациента определяют радиорезистентную форму рака прямой кишки, а при значениях в интервале miRE_miR-550a>1,9, miRE_miR-3610>2,2 и miRE_miR-23b>3,5 у пациента определяют чувствительную к лучевой терапии форму рака прямой кишки.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня экспрессии микро-РНК miR-550a-3-5p используют праймеры: SEQ ID 1, SEQ ID 2 и SEQ ID 3.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня экспрессии микро-РНК miR-3610 используют праймеры: SEQ ID 4, SEQ ID 5 и SEQ ID 6.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня экспрессии микро-РНК miR-23b-5p используют праймеры: SEQ ID 7, SEQ ID 8 и SEQ ID 9.