Композиция, содержащая фактор модернизации эпигенома, обладающая репаративным, онкопротекторным и противовоспалительным действием
Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для создания средства, обладающего репаративным и противовоспалительным действием. Композиция, обладающая противовоспалительным и регенераторным действием, включает гиалуроновую кислоту и/или ее производные в количестве от 0,1 до 10 масс.%, фракцию митохондриальной РНК в количестве от 0,001 до 10 масс.%, 0,9% раствор NaCl или воду – до 100 масс.%. Изобретение обеспечивает выраженную устойчивость к воздействию гиалуронидазы. 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 13 пр.
Область техники
Настоящее изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для создания средства, обладающего репаративным и противовоспалительным действием.
Уровень техники
Проблема ускорения регенерации тканей после повреждений различного характера привлекает внимание широкого круга специалистов и для ее решения используются множество подходов. Одним из направлений в решении данной проблемы является создание гидрогелей на основе гиалуроновой кислоты, содержащих биологически активные компоненты.
Из уровня техники известны гели на основе гиалуроновой кислоты для косметологии и лечения повреждений кожного покрова, применяющиеся наружно для увлажнения кожи , улучшения упругости и эластичности за счет стимуляции выработки эластина и коллагена, кроме этого гели на основе гиалуроновой кислоты для инъекции используются в косметических целях, для наполнения или замены биологических тканей (например, наполнение морщин, ремоделирование контура лица, увеличение объема губ и т.д.), а также для обработки по регидратации кожи методом биоревитализации, когда внутрикожно производятся инъекции раствора гиалуроновой кислоты в чистом виде, а также мезотерапии, когда в гидрогель гиалуроновой кислоты для внутрикожных инъекций добавляются терапевтические или профилактические добавки например витамины, аминокислоты , полинуклеотиды.
Еще одним из применений геля на основе гиалуроновой кислоты является использование его в качестве внутрисуставных имплантов, где гель является протезом синовиальной жидкости, снижает воспалительные процессы и стимулирует регенерацию тканей (патент РФ № 2683286, опубл. 27.03.2019).
Также известны способы применения гелей на основе гиалуроновой кислоты для лечения и профилактики заболеваний слизистых пищеварительной системы (патент РФ № 2679638, опубл. 08.06.2018), мочеполовой системы (патент РФ № 2519010, опубл. 10.06.2014), дыхательной системы и слизистых глаз (патент РФ № 2697671, опубл. 16.08.2019).
В описанных способах применения используется свойство биорезорбции биополимера гиалуроновой кислоты, содержащего добавленные в него биологически активные вещества. Вещества фиксируются на цепочках полимера за счет химических и физических связей и выделяются в окружающие ткани по мере резорбции биополимера за счет действия фермента гиалуронидазы, причем процесс этот может варьировать по времени в зависимости от структурирования биополимера. В этой связи, было предпринято много усилий для улучшения физико-химической стабильности гелей на основе гиалуроновой кислоты для увеличения in vivo срока действия геля (то есть времени пребывания геля в месте инъекции) и тем самым увеличения продолжительности терапевтической эффективности (патент РФ № 2613887, опубл. 21.03.2017).
Указанные способы используют основные биологические свойства гиалуроновой кислоты, а именно возможность удержания воды в тканях, влияние на интенсивность обмена ионами в клетках, скорость транспорта различных биологически активных веществ и токсинов, непроницаемость среды для молекул крупного размера и клеток. При использовании в качестве протеза синовиальной жидкости в суставах гиалуроновая кислота благодаря своей вязкости выступает в роли смазки для трущихся хрящевых поверхностей, а также уменьшает негативное воздействие внешнего давления на поверхности сустава. Использование сшитой гиалуроновой кислоты позволяет улучшить ее вязко-эластичные свойства и период биорезорбции in vivo под действием фермента гиалуронидазы.
Недостатками указанных способов является отсутствие вспомогательных компонентов в составе предложенных композиций как фактора, модулирующего клеточную регенерацию, пролиферацию и оказывающего лечебный (например, противовоспалительный) эффект.
Компоненты нуклеиновых кислот, в частности полидезоксирибонуклеотиды, являются важным компонентом клеток и используются в различных целях, как, например, в медицине для лечения и улучшения поверхности ран путем инъекции указанных фракций в область ран или т.п., и в косметологии для улучшения ситуации с морщинами, обусловленными клеточной активностью (Шаповалова Е.Ю., Бойко Т.А., Барановский Ю.Г., Коломоец Т.А., Василенко С.А. Морфологические особенности регенерации тканей в модельной ишемизированной ране кожи под влиянием полинуклеотидов, Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины, т.7, №4, 2017).
Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является композиция для инъекций, содержащая производное гиалуроновой кислоты и ДНК фракцию, состоящую из полинуклеотидов (патент РФ № 2697671, опубл. 16.08.2019), применяющаяся для подкожных инъекций и для лечения синдрома сухого глаза. Недостатком указанного изобретения является то, что для получения выраженного пролиферативного эффекта необходимо использовать ДНК-полинуклеотиды в высокой концентрации в связи с их сравнительно низкой пролиферативной активностью и большим количеством нерабочего балласта, состоящего из полинуклеотидов, несущих трофическую функцию. При этом сравнительные лабораторные исследования показали, что необходимое для активации процесса деления соотношение составляет от 1 до 100 мг полинуклеотидов на 1 мл гидрогеля, что приводит к помутнению конечного продукта, повышению его цитотоксичности, и к повышению рисков развития аллергических реакций при инъекционном применении.
Задачей настоящего изобретения является разработка средства на основе гиалуроновой кислоты, имеющей хорошую вязкоэластичность, ферментативную устойчивость, с добавлением фракции митохондриальной РНК и комплекса биологически активных веществ, обеспечивающих противовоспалительное и регенераторное действие в поврежденных тканях.
Для решения этой задачи мы предлагаем композицию, обладающую противовоспалительным и регенераторным действием, включающую
гиалуроновую кислоту и/или ее производные в количестве от 0,1 до 10 масс %,
фракцию митохондриальной РНК в количестве от 0,001 до 10 масс %,
физиологический раствор или вода - до 100 мас %.
В частном случае изобретения композиция дополнительно содержит сквален в количестве от 0,01 до 10 масс %; таурина в количестве от 0,01 до 10 масс %; пантотеновой кислоты (витамина В5) в количестве от 0,01 до 10 масс %.
В частном случае изобретения композиция предназначена для инъекционного, энтерального, внутрисуставного и местного применения.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в следующем.
Одним из видов биологически активных молекул, содержащих цепочки нуклеотидов является митохондриальная РНК. Фракция митохондриальной РНК состоит из линейных биополимеров, состоящих из одной цепочки нуклеотидов. Мономеры (нуклеотиды) РНК состоят из пятиуглеродного сахара - рибозы, остатка фосфорной кислоты и азотистых оснований. Три азотистых основания в молекулах РНК такие же, как и у ДНК - аденин, гуанин, цитозин, а четвертым является урацил. Фракция митохондриальной представляет собой 22 тРНК и 2 рРНК (16S и 23S), кодируемые митохондриальной ДНК. Фракция митохондриальной РНК, полученная из стволовых клеток эмбрионов птиц или млекопитающих по активности не отличаются друг от друга, но отличаются от фракции полученной, например из дифференцированных или половых клеток. Фракция митохондриальной РНК, являясь модулятором активности DNMT обеспечивает стимуляцию клеточной пролиферации за счет модернизации эпигенома, онкопротекторный (действует как ингибитор HDAC и HAT) и противовоспалительный эффект за счет стимуляции образования внеклеточного матрикса (ВКМ) и активации заживляющей способности эпителиальных и соединительнотканных клеток человеческого организма, а также восстанавливает пониженную с возрастом способность тканей к регенерации.
Кроме того, полученная композиция гиалуроновой кислоты, обладает не только хорошими физическими свойствами вязкоэластичности, но еще и устойчивостью к гиалуронидазе.
Дополнительно в заявляемую композицию добавляют следующие биологически активные компоненты: таурин (C2H7NO3S), сквален (C30H50) и пантотеновую кислоту (C9H17NO5), которые обеспечивают следующие функции: таурин является мембраностабилизатором. Он укрепляет клеточные мембраны и регулирует их проницаемость для воды и для электролитов. Благодаря данной аминокислоте такие важнейшие электролиты как калий и магний остаются внутри клетки, а натрий - снаружи. Тем самым создается осмотический градиент, разница содержания электролитов и воды по обе стороны клеточной мембраны. Сквален является мощным антиоксидантом и иммуномодулятором. Пантотеновая кислота участвует в образовании кофермента А, Коэнзим А обеспечивает протекание важнейших биохимических реакций в нашем организме. Одна из таких реакций - цикл трикарбоновых кислот (ЦТК). ЦТК обеспечивает клеточное дыхание, при котором глюкоза под действием кислорода утилизируется с образованием углекислого газа и энергии в виде молекул АТФ. В ходе ЦТК утилизируются и синтезируются многие важнейшие для нас органические соединения: углеводы, жирные кислоты, аминокислоты. В свою очередь, жирные кислоты и аминокислоты - это строительный материал для жиров (липидов) и белков. Таким образом, коэнзим А, и, соответственно, Пантотеновая кислота, регулирует все основные звенья углеводного, липидного и белкового метаболизма.
Раскрытие сущности изобретения.
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей гиалуроновую кислоту и/или ее производные, имеющие степень сшивания от 0,1 до 150%, и содержащей фракцию митохондриальной РНК от 0,001 до 10% (масс.) от общей массы композиции.
Термин "гиалуроновая кислота", используемый в данной заявке, обозначает биополимерный материал, в котором повторяющиеся звенья, содержащие N-ацетил-D-глюкозамин и D-глюкуроновой кислоту, соединены линейно. В настоящем изобретении, термин гиалуроновая кислота используют в отношении собственно гиалуроновой кислоты и ее соли, например натриевой соли - гиалуроната натрия, В настоящем изобретении, гиалуроновую кислоту как таковую или ее соль можно использовать по отдельности или как сочетание двух этих веществ. В настоящем изобретении молекулярная масса гиалуроновой кислоты может составлять от 50000 до 4000000 Да.
Производные сшитой гиалуроновой кислоты можно получить путем сшивания гиалуроновой кислоты как таковой или ее соли при использовании сшивающего агента. Для сшивания можно использовать способ применения сшивающего агента в водном щелочном растворе. Сшивающий агент может представлять собой эфир, например 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE) или водный щелочной раствор предпочтительно NaOH. Водный раствор NaOH можно использовать при концентрации от 0,25 до 5Н. Производные сшитой гиалуроновой кислоты представляют собой вязкоэластичную сшитую гиалуроновую кислоту. Термин "степень сшивания", используемый в данной заявке, обозначает % (масс.) сшивающего агента относительно мономерных звеньев гиалуроновой кислоты в сшитой части композиции на основе гиалуроновой кислоты. "Степень сшивания", используемый в данной заявке, обозначает % (масс.) сшивающего агента относительно мономерных звеньев гиалуроновой кислоты в сшитой части композиции на основе гиалуроновой кислоты. Степень сшивания определяют как массовое отношение сшивающего агента к массовому отношению мономера гиалуроновой кислоты. В настоящем изобретении, степень сшивания гиалуроновой кислоты предпочтительно находится в диапазоне 1 до 50% при сшивании с помощью сшивающего агента.
Кроме того, композиция по настоящему изобретению включает фракции митохондриальной РНК (мтРНК). В настоящем изобретении фракция митохондриальной РНК состоит из линейных биополимеров, состоящих из одной цепочки нуклеотидов.
Фракцию митохондриальной РНК получают следующим способом. Куриные эмбрионы 4-8 дневные подвергали дезагрегации 0,05% раствором трипсина путем инкубации в растворе в течение 10 минут при 37°С. Полученную суспензию клеток поместили в пробирки и центрифугировали при 100g в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляли, осадок, содержащий клетки, ресуспендировали в гипотоническом буфере (4 мМ Трис-HCl pH 7,8, 2,5 мМ NaCl, 0,5 мМ MgCl2 и 2,5 мМ PMSF) и инкубировали в течение 6 мин на льду. Набухшие клетки разрушали в гомогенизаторе. Изотонические уровни восстанавливали добавлением 1/10 полученного объема гипертонического буфера (400 мМ Трис-HCl pH 7,8, 250 мМ NaCl и 50 мМ MgCl2), проводили центрифугирование на 1200g, осадок, содержащий ядра и клеточные фрагменты, удаляли Митохондрии получали центрифугированием оставшегося супернатанта при 13000g. Митохондрии дополнительно очищали с использованием градиента сахарозы 1,0 М и 1,5 М. После центрифугирования в течение 20 мин при 60000g митохондриальный слой собирали, ресуспендировали в PBS, подвергали воздействию УФ-света 302 нм в течение 6 мин в приборе ChemiDoc (Biorad) и концентрировали центрифугированием при 13000g. Для выделения РНК митохондрии суспендируют при температуре 0-2°С в 0,01М калийацетатном буфере, рН=5,1, содержащем 1% додецилсульфата натрия и смесь 0,5% поливинил сульфата и 0,5% макалоида. К полученной суспензии добавляют равный объем смеси фенол-хлороформ, встряхивают в течение 10 мин, затем центрифугируют на 5000g в течение 20 минут при температуре 2°С. Нижний слой удаляют шприцем, к оставшемуся объему снова добавляют равный объем смеси фенол-хлороформ и центрифугируют на 5000g в течение 20 минут. Нижний слой удаляют, оставшиеся слои экстрагируют хлороформом, встряхивая в течение 5 мин и центрифугируя на 5000g в течение 15 минут, удаляя нижний слой. Затем из оставшегося верхнего слоя осаждают митохондриальную РНК, добавляя двойной объем холодного этанола, содержащего 0,1 моля NaCl. Полученную митохондриальную РНК подвергают очистке при помощи гельфильтрационной хроматографии и последующего капиллярного электрофореза.
Получение митохондриальной РНК возможно также и иным известным способом, известным из уровня техники.
Дополнительно композиция по настоящему изобретению включает добавление сквалена в количестве от 0,01 до 10 масс %; таурина в количестве от 0,01 до 10 масс %; пантотеновой кислоты (витамина В5) в количестве от 0,01 до 10 масс %.
Способ производства композиции включает следующие стадии:
1) получение сшитой гиалуроновой кислоты и/или ее соли (в качестве производной гиалуроновой кислоты) до степени сшивания от 0,1 до 150% путем ее растворения в воде или 0,9% растворе NaCl с добавлением водного щелочного раствора при использовании сшивающих агентов;
2) примешивание фракции митохондриальной РНК, полученной, например, согласно приведенному выше методу, в производные гиалуроновой кислоты, имеющие степень сшивания от 0,1 до 150%,
В дополнительном воплощении изобретения имеют место стадии
3) примешивание биологически активного комплекса состоящего из сквалена, таурина, пантотеновой кислоты.
4) стадия упаковки продукта в необходимый носитель, емкость или контейнер (например, контейнер для предварительно наполненного шприца).
Таким образом, композицию ген-активированного гидрогеля, состоящего из гиалуроновой кислоты, фракции митохондриальной РНК и, но не обязательно, биологически активного комплекса: сквалена, таурина, пантотеновой кислоты по настоящему изобретению можно использовать в косметических, профилактических или терапевтических целях благодаря ее свойствам эластичности, устойчивости к действию фермента и способности к повышению регенерации тканей. Например, такую композицию, вводимую в виде инъекций, можно использовать в качестве композиции для наполнения или замены биологической ткани, заполнения морщин, ремоделирования лица, композиции для увеличения объема губ, композиции для регидрационной терапии кожи методом мезотерапии, композиции для замены или временного наполнения синовиальной жидкости при артрите, композиции для увеличения объема сфинктера уретры, уменьшения просвета влагалища, в урологии или гинекологии, композиции для вспомогательного действия или лечения при хирургическом лечении катаракты в офтальмологии, фармацевтического геля для высвобождения активного вещества или композиции для восстановления костей, увеличение объема голосовых связок, образования хирургической ткани, инъекционного и наружного средства для лечения алопеции.
Композицию предлагается вводить в виде внутрисуставных инъекций в объеме 2-3 мл, подкожных инъекций в дозировке 0,5-20 мг/мл, энтерально в дозе 2-5 мг/кг, или наружно, например путем местного нанесения на раневую поверхность.
Краткое описание поясняющих материалов.
Таблица 1. Заживление ран у крыс после термического ожога.
Таблица 2. Оценка противовоспалительной активности заявленной композиции.
Таблица 3. Сравнительный анализ вязкости заявленного гидрогеля и известного.
Осуществление изобретения
Пример1. Получение композиции.
Этап 1: Получение гиалуроновой кислоты.
2 г гиалуроновой кислоты молекулярной массой: 2 - 2,5 миллионов Да смешивали с 0,9% раствором NaCl, 0,25Н раствором NaOH, добавляли BDDE в количестве 0,5 мл для достижения степени сшивания 25%, и подвергали сшиванию путем выдерживания смеси в течение 10 мин при постоянной температуре 85°С. В итоге получали 95 мл базового геля вязко-упругой консистенции.
Этап 2. Получение митохондриальной РНК. Фракцию митохондриальной РНК получают из митохондрий клеток куриного эмбриона в соответствии с методом, например, описанным выше, очищают при помощи гельфильтрационной хроматографии и последующего капиллярного электрофореза супернатанта эмбриональной клеточной культуры куриного эмбриона. В результате получают кристаллический порошок митохондриальной РНК.
Этап 3. Приготовление композиции из гиалуроновой кислоты и митохондриальной РНК.
Кристаллический порошок митохондриальной РНК в количестве 0,2 мг растворяется в 2 мл 0,9% раствора NaCl и ex tempore доливается в базовый охлажденный гель (см 1 этап) при перемешивании в стандартных условиях при комнатной температуре при помощи магнитной мешалки в течение 30 мин.
Пример 2. Получение композиции.
Согласно изобретению, заявленная композиция дополнительно может содержать такие биологически активные вещества как сквален, таурин пантотеновая кислота. В этом случае приготовление композиции проводят согласно примеру 1, при этом добавляется этап, на котором производят добавление в композицию, полученную на этапах 1-3 биологически активных веществ в низких концентрациях: сквален 100 мкг на 1 мл 0,9% NaCl; таурин 400 мкг на 1мл 0,9% NaCl; пантотеновая кислота 400 мкг на 1 мл 0,9% NaCl. Все три биоактивных субстанции помещаются в лабораторный вакуумный гомогенизатор HM-220VM производства компании HT Machinery Япония. Производится гомогенизация сквалена до капель 1-5 микрона и полного растворения пантотеновой кислоты и таурина, затем полученная смесь вмешивается в композицию при помощи лабораторной магнитной мешалки DSMS-100 от компании Digisystem Тайвань.
Пример 3. Гиалуроновую кислоту молекулярной массой 2 - 2,5 миллионов Да смешивали с физиологическим раствором (0,9% NaCl), раствором NaOH до 10% (масс.) и добавляли BDDE для достижения степени сшивания 5%, и подвергали сшиванию при постоянной температуре 85°С. В итоге получали 99 мл базового геля вязко-упругой консистенции. Композицию из ген-активированного геля содержащего 0,5 мг/мл получали путем добавления, к базовому гелю раствора содержащего фракцию митохондриальной РНК в количестве 5 мг на 1 мл физиологического раствора (0,9% NaCl). Указанная композиция была использована в качестве геля для наполнения лицевых морщин и улучшения регенерации тканей кожи.
Пример 4. Натриевую соль гиалуроновой кислоты молекулярной массой 2 - 2,5 миллионов Да смешивали с физиологическим раствором (0,9% NaCl), раствором NaOH до 10% (масс.) и добавляли эфир для достижения степени сшивания 5%, и подвергали сшиванию при постоянной температуре 85°С. В итоге получали 99 мл базового геля вязко-упругой консистенции. Композицию из ген-активированного геля содержащего 0,5 мг/мл фракции митохондриальной РНК получали путем добавления к базовому гелю раствора содержащего фракцию митохондриальной РНК в количестве 5 мг на 1 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) Указанная композиция была использована инъекционно в качестве геля для наполнения лицевых морщин регенерации тканей кожи .
Пример 5. Гиалуроновую кислоту молекулярной массой 2 - 2,5 миллионов Да смешивали с физиологическим раствором (0,9% NaCl), раствором NaOH до 10% (масс.) и добавляли эфир для достижения степени сшивания 2,5%, и подвергали сшиванию при постоянной температуре 85°С. В итоге получали 98 мл базового геля вязко-упругой консистенции. Композицию из ген-активированного геля содержащего 0,5 мг/мл получали путем добавления к базовому гелю раствора содержащего фракцию митохондриальной РНК в количестве 5 мг на 1 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) затем в композицию добавляли комплекс биологически активных веществ общей массой 5 мг состоящий из изомера Сквалена; L-Таурина; в соотношении позволяющем добиться полного растворения в 1 мл растворителя и добавки 1 мг Пантотеновой кислоты. Указанная композиция была использована в качестве геля для биоревитализации и регенерации тканей кожи лица.
Пример 6. Гиалуроновую кислоту молекулярной массой: 2,5 -3 миллионов Да смешивали с физиологическим раствором (0,9% NaCl), раствором NaOH до 10% (масс.) и добавляли эфир для достижения степени сшивания 5%, и подвергали сшиванию при постоянной температуре 85°С. В итоге получали 99 мл базового геля вязко-упругой консистенции. Композицию из ген-активированного геля содержащего 0,5 мг/мл получали путем добавления к базовому гелю раствора содержащего фракцию митохондриальной РНК в количестве 5 мг на 1 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) после этого производили вмешивание микросфер из поперечносшитой гиалуроновой кислоты до степени сшивания 1000% и размерами от 1 до 999нм Указанная композиция была использована инъекционно в качестве импланта, замещающего синовиальную жидкость коленного сустава. Внесение микросфер позволило резко сократить трения суставных поверхностей за счет превращения трения скольжения в трение качения. И регенерации хрящевой соединительной ткани сустава.
Пример 7. Гиалуроновую кислоту молекулярной массой 3-3,3 миллионов Да смешивали с физиологическим раствором (0,9% NaCl), В итоге получали 99 мл базового геля вязко-упругой консистенции. Композицию из ген-активированного геля содержащего 0,5 мг/мл получали путем добавления к базовому гелю раствора содержащего фракцию митохондриальной РНК в количестве 5 мг на 1 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) Указанная композиция была использована инъекционно в качестве геля - импланта для лечения пародонтоза, а именно закрытия десной оголенной шейки зуба. регенерации соединительной ткани пародонта.
Пример 8. Гиалуроновую кислоту молекулярной массой: 3-3,3 миллионов Да растворяли в воде, в итоге получали 99 мл базового геля вязко-упругой консистенции. Композицию из ген-активированного геля содержащего 0,5 мг/мл получали путем добавления к базовому гелю раствора содержащего фракцию митохондриальной РНК в количестве 5 мг на 1 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) Указанная композиция была использована затем в композицию добавляли комплекс биологически активных веществ общей массой 5 мг состоящий из изомера Сквалена; L-Таурина; в соотношении позволяющем добиться полного растворения в 1 мл растворителя и добавки 1 мг Пантотеновой кислоты, указанная композиция была использована в качестве биоревитализанта для лечения диффузной алопеции регенерации тканей кожи и волосяных луковиц.
Пример 9. Гиалуроновую кислоту молекулярной массой 0,5 -4 миллионов Да смешивали с физиологическим раствором (0,9% NaCl), В итоге получали 85 мл базового геля вязко-упругой консистенции. Композицию из ген-активированного геля содержащего 2,5 мг/мл фракции митохондриальной РНК получали путем добавления к базовому гелю раствора содержащего фракцию митохондриальной РНК в количестве 50 мг на 5 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) затем в композицию добавляли комплекс биологически активных веществ общей массой 50 мг состоящий из изомера Сквалена; L-Таурина; в соотношении позволяющем добиться полного растворения в 10 мл растворителя и добавки 10 мг Пантотеновой кислоты, указанная композиция применялась для лечения гастрита для снятия воспаления, регенерации желудочного эпителия.
Пример 10. Гиалуроновую кислоту молекулярной массой: 0,5 -4 миллионов Да смешивали с физиологическим раствором (0,9% NaCl), в итоге получали 85 мл базового геля вязко-упругой консистенции. Композицию из ген-активированного геля содержащего 2,5 мг/мл фракции митохондриальной РНК получали путем добавления к базовому гелю раствора содержащего фракцию митохондриальной РНК в количестве 50 мг на 5 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) Указанную композицию применяли для лечения цистита для снятия воспаления регенерации эпителия мочевого пузыря с использованием уретрального катетера.
Пример 11. Подтверждение репаративных свойств заявленной композиции.
Репаративную активность заявляемой композиции в различных вариантах ее исполнения проводили на модели ожоговой раны.
Исследования проведены на белых беспородных крысах-самцах общим количеством с массой тела 310 ± 10 г. Серии опытов были проведены на 50 животных из 5 групп: контрольная и 4 опытных группы:
1 группа - контроль,
2 - наносили на поверхность ожога композицию, содержащую 0,1% масс % гиалуроновой кислоты и 0,001масс % митохондриальной РНК, 0,9% раствор NaCl до 100 масс %,
3 - наносили на поверхность ожога композицию, содержащую 10% масс % гиалуроновой кислоты, 10масс % митохондриальной РНК, воды - до 100 масс %,
4 - наносили на поверхность ожога композицию, содержащую 0,1% масс % гиалуроната натрия, 0,001 масс % митохондриальной РНК и сквален в количестве 0,01 масс %; таурина в количестве 0,01 масс %; пантотеновой кислоты (витамина В5) в количестве 0,01 масс %,
5 - наносили на поверхность ожога композицию, содержащую 10 масс % гиалуроновой кислоты, 10 масс % митохондриальной РНК и сквален в количестве 10 масс %; таурина в количестве 10 масс %; пантотеновой кислоты (витамина В5) в количестве 10 масс %.
Контрольной группе животных никакие препараты на поверхность ожога не наносили, т.е. заживление ожоговых ран проходило самостоятельно.
Моделирование ожоговой раны проводили с использованием электрического устройства для контактного термического ожога, площадь контактной металлической пластины 214 мм2, время аппликации 10 секунд, степень ожога - IIIa, средняя по всем группам исходная площадь каждого на 1-й день 232,8 ± 6,5 мм2, общая - около 15,0 % от площади поверхности тела. Каждому животному наносили 2 симметричных ожога на предварительно депилированные участки кожи заднебоковой поверхности тела по обе стороны от позвоночника. В опытных группах один участок являлся контрольным: Второй участок являлся опытным, на его поверхность ежедневно 1 раз в день в течение всего срока наблюдения наносили в соответствии с группами изучаемые варианты исполнения композиции. Площадь ожога измеряли планиметрическим способом. Измерения производили на 1-й день после нанесения ожога и затем через каждые 5 дней до полного заживления. Результаты представлены в табл. 1.
Пример 12. Подтверждение противовоспалительного эффекта заявленной композиции.
Противовоспалительное действие заявленной композиции изучали на модели каррагенинового отека лапы у крыс. Острую воспалительную реакцию воспроизводят субплантарным введением 0,1 мл 1% раствора каррагенина. Выраженность воспалительной реакции после индукции воспаления оценивают по изменению объема лапы (онкометрически).
Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Wistar массой 160-220г в количестве 90 особей. Животные были разделены на 9 групп по 10 особей - контрольная и 8 опытных:
1 - контроль, вводился физ.раствор перорально,
2 - получала перорально композицию, содержащую 0,1% масс % гиалуроновой кислоты и 0,001 масс % митохондриальной РНК,
3 - получала перорально композицию, содержащую 10 масс % гиалуроновой кислоты, 10 масс % митохондриальной РНК,
4 - получала перорально композицию, содержащую 0,1% масс % гиалуроновой кислоты, 0,001 масс % митохондриальной РНК и сквален в количестве 0,01 масс %; таурина в количестве 0,01 масс %; пантотеновой кислоты (витамина В5) в количестве 0,01 масс %,
5 - получала перорально композицию, содержащую 10 масс % гиалуроновой кислоты, 10 масс % митохондриальной РНК и сквален в количестве 10 масс %; таурина в количестве 10 масс %; пантотеновой кислоты (витамина В5) в количестве 10 масс %,
6 - получала местно аппликационно композицию, содержащую 0,1% масс % гиалуроновой кислоты и 0,001 масс % митохондриальной РНК,
7 - получала местно аппликационно композицию, содержащую содержащую 10% масс % гиалуроновой кислоты, 10 масс % митохондриальной РНК,
8 - получала местно аппликационно композицию, содержащую 0,1% масс % гиалуроновой кислоты, 0,001 масс % митохондриальной РНК и сквален в количестве 0,01 масс %; таурина в количестве 0,01 масс %; пантотеновой кислоты (витамина В5) в количестве 0,01 масс %,
9 - получала местно аппликационно композицию, содержащую 10 масс % гиалуроновой кислоты, 10 масс % митохондриальной РНК и сквален в количестве 10 масс %; таурина в количестве 10 масс %; пантотеновой кислоты (витамина В5) в количестве 10 масс %.
В экспериментальных группах композицию вводили за 1 час до индукции воспаления, а объем конечности измеряли до индукции воспаления и спустя 3 часа и 24 часа после индукции. Перорально композицию вводили через зонд внутрижелудочно в объеме 2 мл, контрольной группе - вводили 2 мл физраствора. Местно аппликационно композицию наносили на поверхность воспаленной конечности палочкой-аппликатором.
Как следует из таблицы 2, применение заявленной композиции снижает выраженность воспаления при использовании местно и перорально.
Пример 13. Изучение устойчивости заявленной композиции к воздействию гиалуронидазы.
Проводили сравнительный анализ устойчивости заявленной композиции в различных вариантах ее воплощения и известного продукта для наращивания тканей Restylane® к воздействию гиалуронидазой. Раствор гиалуронидазы (15 мкл раствора гиалуронидазы 0,15 мг/мл в 1,9 мМ фосфатном буфере, ≈2,5 единиц) добавляют к 0,75 г каждого из вариантов выполнения настоящего изобретения и тщательно перемешивают. Каждую смесь загружают в шприц и центрифугируют в течение 1 мин при 1000 об/мин для удаления пузырьков воздуха. Затем 0,35 г каждой смеси помещают на пластину реометра. Вязкость геля регистрируют каждые 30 мин в течение 5 часов при температуре 37°С на плоской пластине, при зазоре 200 мкм и частоте 1 Гц. Определяют зависимость модуля упругости G' (Па) от времени. Результаты представлены в табл. 3
Как видно из данных, приведенных в табл. 3, заявленная композиция в различных вариантах ее исполнения обладает высокой устойчивостью к гиалуронидазе, превышающей таковую других известных и применяющихся в практике гидрогелей.
Таким образом, заявляемая нами композиция обладает противовоспалительным и регенераторным действием, а также выраженной устойчивостью к воздействию гиалуронидазы и может применяться в лечебной и косметологической практике.
К заявке «Композиция, содержащая фактор модернизации эпигенома, обладающая репаративным, онкопротектрным и противовоспалительным действием»
| Площадь ожога на 5й день, мм2 | Площадь ожога на 10й день, мм2 | |
| 1 группа | 178,3±2,2 | 155,6±1,9 |
| 2 группа | 154,2±1,9 | 125,4±2,1 |
| 3 группа | 164,1±1,3 | 136,7±1,8 |
| 4 группа | 168,7±0,9 | 135,9±2,3 |
| 5 группа | 152,3±1,6 | 126,2±1,5 |
Таблица 1.
К заявке «Композиция, содержащая фактор модернизации эпигенома, обладающая репаративным, онкопротектрным и противовоспалительным действием»
| Прирост объема лапки, % по отношению к исходному после введения каррагенина | ||
| Через 3 ч | Через 24 ч | |
| 1 группа | 40±2,7 | 38±1,8 |
| 2 группа | 16,5±1,6 | 23,4±2,4 |
| 3 группа | 20,1±1,8 | 25,3±1,8 |
| 4 группа | 18,3±2,3 | 23,6±2,1 |
| 5 группа | 19,9±1,9 | 22,9±3,1 |
| 6 группа | 17,5±2,2 | 23,2±2,2 |
| 7 группа | 21,5±1,6 | 24,8±1,9 |
| 8 группа | 17,4±1,5 | 23,1±2,1 |
| 9 группа | 20,7±2,6 | 25,5±2,3 |
Таблица 2.
К заявке «Композиция, содержащая фактор модернизации эпигенома, обладающая репаративным, онкопротектрным и противовоспалительным действием»
| образец | Время инкубации, мин | |||
| 30 мин | 60 мин | 180 мин | 300 мин | |
| Restylane® | 320 | 300 | 200 | 100 |
| Заявленный гидрогель с 0,1 мас% гиалуроновой кислоты и 0,001 мас % мтРНК | 400 | 360 | 320 | 300 |
| Заявленный гидрогель с 10 мас % гиалуроновой кислоты и 10 мас % мтРНК | 450 | 435 | 418 | 405 |
| Заявленный гидрогель с 0,1 мас % гиалуроновой кислоты и 0,001 мас % мтРНК + сквален 0,01 масс %; таурин 0,01 масс %; витамин В5 в 0,01 масс %. | 410 | 390 | 375 | 362 |
| Заявленный гидрогель с 10 мас % гиалуроновой кислоты и 10 мас % мтРНК + сквален 10 масс %; таурин 10 масс %; витамин В5 10 масс %. | 445 | 430 | 417 | 403 |
Таблица 3.
1. Композиция, обладающая противовоспалительным и регенераторным действием, включающая
гиалуроновую кислоту и/или ее производные в количестве от 0,1 до 10 масс.%, фракцию митохондриальной РНК в количестве от 0,001 до 10 масс.%, 0,9% раствор NaCl или воду до 100 масс.%.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит сквален в количестве от 0,01 до 10 масс.%; таурин в количестве от 0,01 до 10 масс.%; пантотеновую кислоту (витамин В5) в количестве от 0,01 до 10 масс.%.
3. Композиция по пп. 1, 2, предназначенная для инъекционного, внутрисуставного, энтерального и местного применения.
4. Композиция по пп. 1, 2, предназначенная для внутрисуставного применения, содержащая микросферы из поперечносшитой гиалуроновой кислоты до степени сшивания 1000%, где степень сшивания – это % (масс.) сшивающего агента относительно мономерных звеньев гиалуроновой кислоты в сшитой части композиции на основе гиалуроновой кислоты и размерами от 1 до 999 нм.
