Способ синтеза наборов олигонуклеотидов для ампликонного таргетного секвенирования
Владельцы патента RU 2755538:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ синтеза набора олигонуклеотидов путем амидофосфитного синтеза. Способ осуществляют на твердофазном носителе в аппарате для автоматического параллельного синтеза. В качестве верхнего фильтра для реакционных ячеек используют гранулят из стекла диаметром 1 мм, после синтеза таргетных фрагментов твердофазный носитель с прикрепленными фрагментами олигонуклеотидов извлекают из реакционных ячеек, перемешивают в одной емкости с промывочной жидкостью, отделяют от гранулята и оставшуюся смесь распределяют между ячейками, синтез продолжают до формирования полной последовательности каждого олигонуклеотида из синтезируемого набора. Изобретение обеспечивает одновременный синтез большого количества олигонуклеотидных праймеров, сокращение количества необходимых реакционных ячеек на аппаратах параллельного синтеза молекул ДНК, целесообразность создания ампликонных панелей для таргетного секвенирования с индексированием на этапе первой полимеразной цепной реакции.
Изобретение относится к области биохимии и медицины, в частности к способам получения олигонуклеотидов, и может быть использовано для синтеза наборов олигонуклеотидов для ампликонного таргетного секвенирования.
Известен способ ампликонного таргетного секвенирования, состоящий из двух этапов полимеразной цепной реакции (ПЦР). На первом этапе отдельно в каждом образце происходит амплификация целевых фрагментов при помощи набора праймеров, состоящих из вариабельного таргетного фрагмента на 3' конце и фиксированного фрагмента для универсального праймера на 5' конце. На втором этапе добавляются универсальные праймеры, состоящие из фиксированной последовательности на 3' конце и уникальной для каждого образца индексной последовательности на 5' конце. При этом способе количество реакционных ячеек необходимых для синтеза олигонуклеотидов, определяется формулой 1 [Herbold CW, Pelikan С, Kuzyk О, Hausmann В, Angel R, Berry D, Loy A. A flexible and economical barcoding approach for highly multiplexed amplicon sequencing of diverse target genes. Frontiers in microbiology. 2015 Jul 16; 6:731]. Недостатком способа является необходимость проведения двух этапов ПЦР, между которыми может произойти кросс-контаминация образцов.
Известен способ секвенирования единичных ампликонов с использованием "смешанных праймеров" (fusion primers), содержащих одновременно фиксированный таргетный фрагмент на 3' конце и фиксированный фрагмент, включающий индекс и последовательность для универсального адаптера на 5' конце. Преимуществом данного способа является возможность индексирования образцов уже на этапе первой ПЦР, что уменьшает вероятность кросс-контаминации. При этом способе количество реакционных ячеек необходимых для синтеза олигонуклеотидов, определяется формулой 2 [Comeau AM, Douglas GM, Langille MG. Microbiome helper: a custom and streamlined workflow for microbiome research. MSystems. 2017 Feb 28; 2(1)].
Недостатком способа является необходимость синтеза большого числа длинных (около 80 оснований) олигонуклеотидов, что ограничивает применение этого способа только для небольшого числа (единицы) ампликонов.
где N - количество реакционных ячеек, необходимых для синтеза;
IF - количество прямых индексов;
IR - количество обратных индексов;
TF - количество прямых таргетных праймеров;
TR - количество обратных таргетных праймеров.
Техническим результатом изобретения является одновременный синтез большого количества олигонуклеотидных праймеров, состоящих из вариабельного таргетного фрагмента на 3' конце и фиксированного фрагмента, включающего индекс и последовательность комплементарную универсальному адаптеру на 5' конце за счет введения дополнительного этапа перемешивания твердофазного носителя, содержащего таргетные фрагменты олигонуклеотидов, сокращение количества необходимых реакционных ячеек на аппаратах параллельного синтеза молекул ДНК, целесообразность создания ампликонных панелей для таргетного секвенирования с индексированием на этапе первой полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Указанный технический результат достигается в способе синтеза набора олигонуклеотидов путем амидофосфитного синтеза на твердофазном носителе в аппарате для автоматического параллельного синтеза, состоящих из вариабельного таргетного фрагмента на 3' конце и фиксированного фрагмента, включающего индекс и последовательность для универсального адаптера на 5' конце, отличающийся тем, что в качестве верхнего фильтра для реакционных ячеек используют гранулят из стекла диаметром 1 мм, при этом после синтеза таргетных фрагментов твердофазный носитель с прикрепленными фрагментами олигонуклеотидов извлекают из реакционных ячеек, извлекают из реакционных ячеек, перемешивают в одной емкости с промывочной жидкостью, отделяют от гранулята и оставшуюся смесь распределяют между ячейками, причем количество ячеек определяют по формуле
N=IF+IR+TF+TR, где:
IF - количество прямых индексов;
IR - количество обратных индексов;
TF - количество прямых таргетных праймеров;
TR - количество обратных таргетных праймеров, после чего синтез продолжают до формирования полной последовательности каждого олигонуклеотида из синтезируемого набора.
Введение дополнительного этапа перемешивания твердофазного носителя, содержащего таргетные фрагменты олигонуклеотидов позволяет синтезировать "смешанные праймеры" длиной около 80 нуклеотидов, при этом количество реакционных ячеек, необходимых для синтеза олигонуклеотидов значительно сокращается и определяется формулой 1, приведенной выше.
Использование в качестве верхнего фильтра для реакционных ячеек гранулята из стекла диаметром 1 мм позволяет осуществлять удобную выгрузку твердофазного носителя из реакционных ячеек. Помимо стеклянного гранулята можно использовать гранулят из керамики или полипропилена, в зависимости от конфигурации реакционной ячейки и системы дозирования реагентов.
Способ осуществляют, например, следующим образом.
Синтез начинают стандартным амидофосфатным методом на твердофазном носителе в аппарате для автоматического параллельного синтеза олигонуклеотидов. В реакционные ячейки в соответствие с набором таргетных праймеров помещают твердофазный носитель, а затем сверху вместо стандартного фильтра помещают слой гранулята из стекла диаметром 1 мм. Проводят синтез таргетных фрагментов стандартным методом, после чего ячейки извлекают из аппарата. В каждую ячейку приливают промывочную жидкость, например, ацетонитрил. Сверху располагают приемную емкость и переворачивают сборку. Собранный твердофазный носитель, с прикрепленными фрагментами олигонуклеотидов, перемешивают и отделяют от гранулята. Постоянно перемешивая твердофазный носитель и промывочную жидкость, смесь переносят в реакционные ячейки в соответствии с набором индексов. Количество реакционных ячеек определяют по формуле N=IF+IR+TF+TR, где: IF - количество прямых индексов; IR - количество обратных индексов; TF - количество прямых таргетных праймеров; TR - количество обратных таргетных праймеров.
Проводят синтез индексов и универсального адаптера стандартным методом. Открепляют синтезированные олигонуклеотиды от носителя и деблокируют в соответствии с рекомендациями для используемых реагентов.
Заявляемое изобретение решает задачу одновременного синтеза большого количества олигонуклеотидных праймеров, состоящих из вариабельного таргетного фрагмента на 3' конце и фиксированного фрагмента, включающего индекс и последовательность комплементарную универсальному адаптеру на 5' конце.
Способ позволяет сократить количество необходимых реакционных ячеек на аппаратах параллельного синтеза молекул ДНК, тем самым снизить себестоимость набора олигонуклеотидов и обеспечить целесообразность создания ампликонных панелей для таргетного секвенирования с индексированием на этапе первой полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Способ синтеза набора олигонуклеотидов путем амидофосфитного синтеза на твердофазном носителе в аппарате для автоматического параллельного синтеза, состоящих из вариабельного таргетного фрагмента на 3' конце и фиксированного фрагмента, включающего индекс и последовательность для универсального адаптера на 5' конце, отличающийся тем, что в качестве верхнего фильтра для реакционных ячеек используют гранулят из стекла диаметром 1 мм, при этом после синтеза таргетных фрагментов твердофазный носитель с прикрепленными фрагментами олигонуклеотидов извлекают из реакционных ячеек, перемешивают в одной емкости с промывочной жидкостью, отделяют от гранулята и оставшуюся смесь распределяют между ячейками, причем количество ячеек определяют по формуле:
N=IF+IR+TF+TR, где:
IF - количество прямых индексов;
IR - количество обратных индексов;
TF - количество прямых таргетных праймеров;
TR - количество обратных таргетных праймеров,
после чего синтез продолжают до формирования полной последовательности каждого олигонуклеотида из синтезируемого набора.
