Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма вниизж в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом пцр в режиме реального времени

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с применением оригинальных специфических олигонуклеотидов для участка G-гена и разработанной логарифмической функции зависимости величины порогового цикла амплификации и титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ. Значение титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ определяют по величине порогового цикла амплификации. На основании установленной величины порогового цикла амплификации (C_t) рассчитывают значение титра вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ (Т_{ВБ ВНИИЗЖ}) с применением разработанной математической логарифмической модели: lg Т_{ВБ ВНИИЗЖ}=-0,299C_t+12,780 (R²=0,9994, Е=99,07%). Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять титр инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины на основе ПЦР в режиме реального времени с последующим применением разработанной математической модели. 9 з.п. ф-лы, 6 ил., 8 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству антирабических вакцин, а именно к способу опосредованного определения титра вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с применением разработанной логарифмической функции зависимости величины порогового цикла амплификации и титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ (Т_{ВБ ВНИИЗЖ}).

Бешенство - острая вирусная болезнь животных и человека, характеризующаяся признаками полиоэнцефаломиелита и абсолютной летальностью [1]. Данное заболевание представляет собой мировую проблему, которой уделяют особое внимание международные организации (ВОЗ, МЭБ, ФАО, GARC) и ветеринарные службы многих стран мира [2].

Классический вирус бешенства Rabies virus (RABV) - нейротропный РНК-(-) содержащий вирус, который принадлежит роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Вирус вызывает необратимые поражения головного мозга человека и теплокровных животных.

Вирионы вируса бешенства имеют пулевидную форму длиной 100-300 нм, диаметром 45-100 нм. На наружной поверхности вирусной частицы имеются выступы в виде шипов длиной 10-12 нм, которые прикреплены к двуслойной липидной оболочке [3]. Геном RABV составляет около 12000 нуклеотидных оснований (н.о.) и включает 5 последовательно расположенных генов 3'-N-P-M-G-L-5' (N - нуклеопротеин, G - гликопротеин, Р - фосфопротеин, М - матриксный белок, L - РНК-зависимая РНК-полимераза), кодирующих соответственно 5 белков и лидерную РНК длиной 50 н.о. Гены разделены некодирующими областями [4]. Наиболее консервативным является N-ген, наибольшие изменения, происходящие в изолятах и штаммах, отмечаются в G-гене [5].

Бешенство приводит к значительным экономическим потерям, которые связаны с падежом животных, ликвидацией последствий вспышек заболевания, проведением профилактических и карантинных мероприятий, регулированием численности диких плотоядных животных, отловом бродячих кошек и собак и осуществлением лабораторно-диагностических исследований. Система мер для борьбы с бешенством и его профилактики предусматривает иммунизацию домашних, сельскохозяйственных и диких плотоядных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [2].

Для вакцинации домашних и сельскохозяйственных целевых животных применяют инактивированные антирабические вакцины. При изготовлении инактивированных антирабических вакцин вируссодержащую суспензию до инактивации исследуют на определение титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ для оценки его активности в клетках. В 1,0 см³ суспензии вируса определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих РНК в активном состоянии.

Традиционно для определения титра инфекционной активности вируса бешенства применяют метод титрования в монослойной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21, с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [2]. Данный метод хорошо зарекомендовал себя, однако он имеет некоторые недостатки: 1) длительная процедура анализа (не менее 3 суток), связанная с поражением клеток вирусом; 2) определенная степень субъективности при оценке результатов исследования; 3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток.

В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины на основе метода ПЦР в режиме реального времени.

Предложенный метод является высокочувствительным и специфичным, объективным и позволяет определять титр инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в вируссодержащих суспензиях в течение 4 часов, не требует использования культуры клеток для анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов, поскольку во время анализа пробирки закрыты, и предусматривает оценку степени чистоты выделенных элюатов РНК вируса бешенства, и может быть использован для исследования качества сырья при изготовлении антирабических вакцин и проведения научно-исследовательской работы.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного, экспрессного, объективного, не предполагающего применения линий клеток способа определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря созданию нового опосредованного способа определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины при использовании метода ПЦР в режиме реального времени. Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ до 4 ч; 2) исключить вероятность контаминации исследуемого материала; 3) повысить степень чистоты элюата РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ; 4) проводить анализ степени чистоты получаемых элюатов РНК с помощью спектрального анализа при длинах волны в диапазоне 205-325 нм для последующего проведения реакции обратной транскрипции и амплификации; 5) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и ДНК-зонда, рассчитанных для G-гена вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ; 5) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ (Т_{ВБ ВНИИЗЖ}) и пороговым циклом амплификации (C_t, представленной в виде логарифмической функции lg Т_{ВБ ВНИИЗЖ}=-0,299C_t+12,780 с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9994) и эффективностью амплификации 99,07%. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Принцип выделения РНК вируса бешенства с помощью магнитных коллоидных частиц поверхностно-модифицированного оксида железа (II, III) Fe₃O₄ с инертной поверхностью после обработки полиэтиленимином и диаметром 180-200 нм.

Фиг. 2 - Нуклеотидная последовательность кДНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, несущая информацию о гликопротеине. Выделены участки, которые использованы для разработки олигонуклеотидов (зеленый -для прямого праймера, синий - для обратного праймера, красный - для молекулярного зонда).

Фиг. 3 - Спектры поглощения экстрактов РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ стандартных образцов для оценки степени их чистоты при определении титра инфекционной активности вируса в исходных суспензиях (максимальные оптические сигналы для РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ зарегистрированы при длине волны 260 нм) (n=3).

Фиг. 4 - Зависимость титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ (Т_{ВБ ВНИИЗЖ}) с помощью метода ПЦР в режиме реального времени от величины порогового цикла амплификации (C_t) (n=5, отмечены точки, отображающие средние значения пороговых циклов реакции амплификации).

Фиг. 5 - Зависимость величины порогового цикла амплификации (C_t) от титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ (Т_{ВБ ВНИИЗЖ}) с помощью метода ПЦР в режиме реального времени (n=5, отмечены точки, отображающие средние значения пороговых циклов реакции амплификации).

Фиг. 6 - Правильность способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.

Сущность изобретения заключается в новом подходе по опосредованному определению титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины с применением метода ПЦР в режиме реального времени. Заявляемый способ основан на: 1) элюировании РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с применением магнитных коллоидных частиц поверхностно-модифицированного оксида железа (II, III) Fe₃O₄ с инертной поверхностью за счет обработки полиэтиленимином (ПЭИ) и диаметром 180-200 нм; 2) проведении обратной транскрипции РНК вируса бешенства с применением фермента AMV-ревертазы [6]; 3) амплификации специфического фрагмента G-гена РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем FAM (λ_max флуоресценции = 520 нм) и тушителем свечения RTQ-1 (λ_max поглощения = 520 нм) [7]; 4) проведение реакции амплификации с детекцей ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте; 5) определении титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения lg Т_{ВБ ВНИИЗЖ}=-0,299C_t+12,780 с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9994) и эффективностью амплификации 99,07%.

В настоящее время метод ПЦР в режиме реального времени применяют для индикации нуклеиновых кислот различных инфекционных агентов, в том числе вируса бешенства. Для определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных праймеров и молекулярного зонда не использовался. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины авторами не обнаружено.

Разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины с помощью метода ПЦР в режиме реального времени по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, объективностью и экспрессностью выполнения анализа и значительным снижением риска контаминации.

В отличие от прототипа разработанный способ включает этап элюирования РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с применением магнитных коллоидных частиц поверхностно-модифицированного Fe₂O₄ с инертной поверхностью за счет обработки ПЭИ и диаметром 180-200 нм; проведение обратной транскрипции РНК вируса бешенства с применением фермента AMV-ревертазы; амплификацию специфического фрагмента G-гена РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем FAM и тушителем свечения RTQ-1; проведение реакции амплификации с детекцией ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте; новый подход к методике расчета титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с применением модели зависимости порогового цикла амплификации для кривой флуоресценции и титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в виде логарифмической функции. Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ до 4 ч; исключить вероятность контаминации и использование клеточных линий; увеличить чистоту элюата РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ; повысить специфичность и чувствительность анализа; удешевить исследование; увеличить достоверность проводимого анализа. Иными словами, актуально применять предложенный способ для определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины.

Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений пороговых циклов кривых реакции амплификации нуклеиновой кислоты вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в ПЦР режиме реального времени и расчет титра инфекционной активности данного вируса с использованием разработанной логарифмической модели зависимости порогового цикла амплификации и титра инфекционной активности.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа количественной ПЦР в режиме реального времени, оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных на участок G-гена вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, и разработанной логарифмической функции зависимости величины порогового цикла амплификации и титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ для опосредованного определения титра инфекционной активности данного вируса в сырье для инактивированной антирабической вакцины.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости величины порогового цикла амплификации (C_t) и титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ (Т_{ВБ ВНИИЗЖ}) (n=5) (фиг. 4).

С целью определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ подготавливают контрольную панель стандартов вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии вируса бешенства указанного штамма с титрами: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 lg ККИД₅₀/см³, которые разводят 1/15 М фосфатно-буферным раствором до требуемого объема и титра. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21), не зараженную вирусом бешенства, и не зараженную вирусом бешенства штамма ВНИИЗЖ.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют РНК с помощью коллоидных частиц поверхностно-модифицированного Fe₃O₄ с инертной поверхностью за счет обработки ПЭИ и диаметром 180-200 нм. Принцип данного способа заключается в том, что сенсибилизированные частицы, обладающие магнитным моментом, извлекаются из исследуемого лизата с помощью магнитного поля (Фиг. 1). Предложенный способ является простым, экспрессным и эффективным, позволяет избавляться от ингибиторов реакции амплификации (водорастворимые соли калия, натрия, кальция, коллаген, гемоглобин, иммуноглобулины, ЭДТА, этиловый и изопропиловый спирты, фенол и др.) при извлечении нуклеиновой кислоты из лизата [8, 9, 10].

Заранее готовят растворы для выделения РНК.

Лизирующий раствор. Смешивают гуанидинизотиоцианат (ГТЦ) (47,27 г), тритон Х-100 (2,02 г), поливинилпирролидон (2,00 г), тетрахлоруксусную кислоту (0,73 г) и ацетат аммония (0,40 г), растворяют в деионизированной воде, объем которой доводят до 100 мл. Конечная концентрация ГТЦ составляет 4,5 М, что на 0,5 М выше, чем обычно применяют в методике с использованием известных коммерческих наборов [11].

Раствор для отмывания 1 представляет собой 75% раствор этилового спирта.

Раствор для отмывания 2 представляет собой 100% ацетон.

Раствор для элюирования РНК представляет собой буферный раствор ТЕ, состоящий из трис(оксиметил)аминометан (0,01 М) и этилендиамин-тетраацетата (0,001 М), свободного от РНКаз и ионов Mg²⁺ (pH 7,2-7,3).

К 100 мкл суспензии вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ добавляют 1000 мкл полученного лизирующего раствора, инкубируют содержимое в процессе перемешивания в течение 5 мин, затем продлевают инкубирование в открытом сухом термостате при 60°С. К полученному лизату добавляют 10 мкл коллоидных частиц поверхностно-модифицированного Fe₂O₄, обработанных ПЭИ, с диаметром 180-200 нм. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортексе, и помещают в магнитный штатив до полного осветления раствора. Не вынимая пробирки из магнитного штатива, удаляют супернатант, не захватывая магнитные частицы. Иными словами, оставляют магнитные частицы, которые сенсибилизированы РНК и балластными компонентами. На следующем этапе проводят отмывание магнитных частиц от балластных составляющих. Для этого в каждую пробирку добавляют по 500 мкл раствора для отмывания 1 (75% этиловый спирт), тщательно перемешивают на вортексе, и снова помещают в магнитный штатив до полного осветления раствора с последующим удалением супернатанта. Для очистки от гидрофобных примесей в каждую пробирку добавляют по 500 мл раствора для отмывки 2 (100% ацетон), и повторяют процедуру с удалением жидкости в магнитном штативе. Пробирки с открытыми крышками оставляют в магнитном поле до полного высыхания магнитных частиц. В пробирки добавляют по 50 мкл раствора для элюирования (буфер ТЕ) и прогревают содержимое при 60°С в течение 8-10 мин, периодически встряхивая их на вортексе. После процесса десорбции пробирки помещают в магнитный штатив и после полного осветления раствора, не задевая частицы, отбирают элюаты РНК. Полученный экстракт суммарной РНК хранят при температуре -20±2°С или сразу используют в дальнейшей работе.

На следующем этапе проводят спектральный анализ элюата суммарной РНК, определяя поглощение аналитом монохроматического ультрафиолетового света, что позволяет оценить степень чистоты экстракта, который в последующем исследуют в ПЦР в режиме реального времени. Измерения спектральной поглощающей способности образцов проводят при длинах волны в диапазоне 205-325 нм и температуре 22-25°С. В выделенных экстрактах оценивают содержание остатков фосфолипидов, полисахаридов и ГТЦ, полипептидов и крупных взвешенных частиц, определяя значения оптической плотности (OD, optical density) при 205, 235, 280 и 320 нм, соответственно [12]. Элюат РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ считают свободным от примесей полипептидов, если коэффициент экстинкции R₁ (OD₂₆₀/OD₂₈₀) находится в пределах 1,8-2,2 и оптимально составляет примерно 2,0. Более низкие значения R₁ указывают на наличие клеточной ДНК и белковых составляющих в элюате. Более высокие значения коэффициента R₁ свидетельствуют о деградации РНК и наличии свободных рибонуклеотидов. Экстракт нуклеиновой кислоты вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ считают незагрязненным полисахаридами, если коэффициент экстинкции R₂ (OD₂₆₀/OD₂₃₅) приближен к значению 2,000 [13]. При замещении 1% РНК на полисахаридные составляющие коэффициент R2 снижается на 0,002. Значения коэффициента R₂ большие 2,000 могут указывать на деградацию молекул РНК. Отсутствие взвеси крупных частиц в элюате подтверждается, если OD₃₂₀ приближено к нулевому значению [12, 13]. При несоответствии требованиям чистоты элюата повторно осуществляют этап выделения РНК вируса бешенства из суспензии.

На следующем этапе проводят ПЦР в режиме реального времени для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн праймеров и молекулярного зонда отражены в таблице 2. Расчет праймеров и зонда проводили на основании нуклеотидных последовательностей G-гена вируса бешенства производственного штамма ВНИИЗЖ и других изолятов, опубликованных в базах данных GenBank [14] и полученных в рамках исследований в «Федеральном центре охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

В качестве гомологичных участку G-гена вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ олигонуклеотидов используют:

GF-ARRIAH/quant-праймер (5'- GGT GCT ААТ GTG GTA ААС СТА АА-3'), GR-ARRIAH/quant-праймер (5'-CGT САА ТТТ CAT CTG AGT GAAA-3') и GP-ARRIAH/quant -FAM/RTQ1-зонд (5'-FAM-CCT СТС ТТТ CTG GAC GCC GAA A-RTO1-3') в концентрации 10 пМ на реакцию с внесением в реакционную смесь по 0,2 мкл. Для элонгации применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их суммарной концентрацией в реакционной смеси 2 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К⁺) (5×10^-2 М) и диметилсульфооксид (DMSO) (1%). В смесь также добавляют хлорида магниядо концентрации 2 мМ. Содержание деионизированной воды составляет 64,8%. В качестве катализаторов обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени применяют следующие ферменты: AMV-обратная транскриптаза (10 ед.) и Pfu-ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (10 ед.). Элюаты суммарной РНК вируса бешенства каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Олигонуклеотиды для кДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [15, 16]. Нуклеотидная последовательность РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, несущая информацию о G-белке, представлена на Фиг 2.

Длины GF-ARRIAH/quant-праймера, GR-ARRIAH/quant-праймера и GP-ARRIAH/quant-зонда составляют 22, 22 и 22 и.о., что соответствует требованиям (20-30 н.о.) [15, 16]. Молекулярный вес олигонуклеотидов GF-ARRIAH/quant-праймера, GR-ARRIAH/quant-праймера и GP-ARRIAH/quant-зонда равен 6807,5; 6749,5 и 7721,4, соответственно. Процентное содержание G и С в GF-ARRIAH/quant-праймере, GR-ARRIAH/quant-праймере и GP-ARRIAH/quant-зонде составляет 41, 41 и 55%, соответственно, что нормально (допустимо 40-60%) [15, 16, 17]. На 5'-конце праймеров и зонда отмечается преобладание G и С, а на 3'-конце - А и Т. На 3'-конце олигонуклеотидных праймеров располагается полиадениловый фрагмент (poly(А)). Праймеры и зонд очищены в полиакрил амид ном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор FAM присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции RTQ1 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в ПЦР в режиме реального времени [15, 16]. В качестве флуоресцентного красителя был выбран FAM с длиной волны максимальной флуоресценцией 520 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции RTQ1 с длиной волны максимального поглощения при 520 нм и возможном диапазоне гашения 470-570 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».

При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, - 5, а для образования «шпилек», - 4 [19, 20].

Проведено определение температур плавления (T_m) для олигонуклеотидных праймеров и зонда. Точное определение температуры плавления играет важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе ДНК-праймеров и зонда для ПЦР в режиме реального времени кДНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли несколько методов. Один из них - метод, учитывающий концентрации ионов К* и диметилсульфооксида (DMSO) с применением формулы [19]:

где [К⁺] - концентрация ионов калия (М),

[% DMSO] - количество диметилсульфооксида (%),

G - количество остатков гуанозинтрифосфата,

С - количество остатков цитидинтрифосфата.

Данный метод не является сверхточным, однако он позволяет оценить температуру плавления олигонуклеотидов.

Другой метод, который применяли в работе, высокоточный и основан на модели ближайших соседей (nearest neighbour, NN) с применением расчетной термодинамической формулы [20, 21]:

где dH - дифференциал энтропии (ккал/моль),

dG - дифференциал энергии Гиббса (ккал/моль),

dS - дифференциал энтальпии (кал/°К⋅моль),

С - концентрация олигонуклеотида (М),

L - длина олигонуклеотида,

[К⁺] - концентрация ионов калия (М), ln - натуральный логарифм.

В данной формуле учитывается длина олигонуклеотида (L), концентрация ионов калия ([К⁺]=5×10^-2 М), газовая постоянная (R=1,987 кал/K⋅моль), концентрация олигонуклеотида в (с=2×10^-7 М), значения энтропии (dH) (в ккал/моль) и энтальпии (dS) (в кал/К×моль). Значения dH и dS вычисляли в соответствии с общеизвестными формулами и термодинамическими параметрами для ближайших соседей пар нуклеотидов при концентрации NaCl 1М, температуре 25°С и значении водородного показателя рН 7,0 [19, 20, 21].

Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления [19] разработанных олигонуклеотидных ДНК-праймеров и молекулярного зонда представлены в таблице 3. Из нее следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для GF-ARRIAH/quant-праймера составили 179,0 ккал/моль, 26,6 ккал/моль, 475,5 кал/(K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для GR-ARRIAH/quant-праймера составили 176,2 ккал/моль, 27,3 ккал/моль, 463,8 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для GP-ARRIAH/quant-зонда составили 186,8 ккал/моль, 30,7 ккал/моль, 486,8 кал/(K×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. T_m при использовании алгоритма ближайших соседей для GF-ARRIAH/quant-праймера, GR-ARRIAH/quant-праймера и GP-ARRIAH/quant-зонда составили 51, 53 и 58°С, соответственно. Температура отжига олигонуклеотидов (T_a) должна быть примерно на 1-5°С ниже T_m [15, 16]. Исходя из полученных данных, она должна находиться в диапазоне 46-57°С.

При использовании более простого метода, учитывающего концентрации ионов K⁺ и диметилсульфооксида (DMSO) T_m для GF-ARRIAH/quant-праймера, GR-ARRIAH/quant-праймера и GP-ARRIAH/quant-зонда составили 58, 58 и 64°С. Температура отжига олигонуклеотидов (T_a) должна быть примерно на 1-5°С ниже T_m [15, 16]. Исходя из полученных данных, она должна находиться в диапазоне 53-63°С.

Экспериментально было выявлено, что температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 53, 53, 57°С. Для проведения ПЦР в режиме реального времени было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком G-гена вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ при температуре 54°С.

Последовательности разработанных праймеров и молекулярного зонда проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот вируса бешенства [14]. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold [18, 22]. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Постановку реакции осуществляли в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.

Обратную транскрипцию проводили при температуре 42°С в течение 15 мин. Перед проведением ПЦР в режиме реального времени осуществляли предварительный прогрев смеси при температуре 95°С в течение 3 мин. для активации фермента Pfu-ДНК-полимеразы и инактивации AMV-ревертазы.

Для реакции амплификации применяли Pyrococcus furiosus (Pfu)-ДНК-полимеразу, которая в отличие от классической Tag-ДНК-полимеразы обладает превосходной термостабильностью и коррекционными свойствами. В отличие от Taq-ДНК-полимеразы Pfu-ДНК-полимераза обладает 3'→5' - экзонуклеазной коррекционной активностью, иными словами, по мере элонгации цепи ДНК в направлении 5'→3' происходит удаление неправильно встроенных нуклеотидов. Следовательно, ПЦР-фрагменты, генерируемые Pfu-ДНК-полимеразой, будут иметь меньше ошибок, чем при использовании Taq-ДНК-полимеразы. Так, процент количества мутаций для 1 kb ПЦР-продукта при работе Pfu-ДНК-полимеразы составляет 2,6%, а Taq-ДНК-полимеразы - 16%. Таким образом, применение Pfu-ДНК-полимеразы повысит специфичность и чувствительность реакции ПЦР в режиме реального времени по амплификации участка G-гена вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ. При этом данный фермент работает медленнее по сравнению с Thermus aquaticus Taq-ДНК-полимеразой, по этой причине требуется увеличивать время элонгации до 1-2 мин.

ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 94°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов - при температуре 54°С в течение 30 с, элонгацию - при температуре 72°С в течение 90 с (таблица 4).

Результаты реакции амплификации РНК в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации C_t, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции F1=f(C_t). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Флуориметр определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической кДНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость (график представлен в виде сигмоиды). Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоиды, полученные при анализе флуоресценции красителя, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует экспоненциальная кривая.

Устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и титром инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины в процессе построения логарифмической функции. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10^-1/k-1), где k - угловой коэффициент в зависимости C_t=-k×lg Т_{ВБ ВНИИЗЖ} + b, а также достоверность аппроксимации (R²). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины.

Пример 1. выявление зависимости титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины и порогового цикла реакции амплификации в виде логарифмической функции.

Для выявления зависимости титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины и порогового цикла реакции амплификации подготавливали контрольную панель стандартов вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, в качестве которых использовали лиофилизированные суспензии вируса бешенства указанного штамма с титрами: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 lg ККИД₅₀/см³, которые растворяли в 1/15 М фосфотном буферном растворе до требуемого объема. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток ВНК-21, не зараженную вирусом бешенства, и не зараженную вирусом бешенства штамма ВНИИЗЖ.

На первом этапе исследования из всех контролей выделяли нуклеиновую кислоту. К 100 мкл суспензии вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ добавляли 1000 мкл полученного лизирующего раствора, инкубировали содержимое в процессе перемешивания в течение 5 мин., затем продлевали инкубирование в открытом сухом термостате при 60°С. К полученному лизату добавляли 10 мкл коллоидных частиц поверхностно-модифицированного Fe₃O₄, обработанных ПЭИ, с диаметром 180-200 нм. Содержимое пробирок тщательно перемешивали на вортексе, и помещали в магнитный штатив до полного осветления раствора. Не вынимая пробирки из магнитного штатива, удаляли супернатант, не захватывая магнитные частицы. Иными словами, получали магнитные частицы, которые сенсибилизированы РНК и балластными компонентами. На следующем этапе проводили отмывание магнитных частиц от балластных составляющих. Для этого в каждую пробирку добавляли по 500 мкл раствора для отмывания 1 (75% этиловый спирт), тщательно перемешивали на вортексе, и снова помещали в магнитный штатив до полного осветления раствора с удалением супернатанта. Для очистки от гидрофобных примесей в каждую пробирку добавляли по 500 мл раствора для отмывки 2 (100% ацетон), и повторяли процедуру с удалением жидкости в магнитном штативе. Пробирки с открытыми крышками оставляли в магнитном поле до полного высыхания магнитных частиц. В пробирки добавляли по 50 мкл раствора для элюирования (буфер ТЕ) и прогревали содержимое при температуре 60±2°С в течение 8-10 мин, периодически встряхивая их на вортексе. После процесса десорбции пробирки помещали в магнитный штатив и после полного осветления раствора, не задевая частицы, отбирали элюаты РНК. Полученный экстракт суммарной РНК использовали в дальнейшей работе.

На следующем этапе исследования с помощью спектрального анализа в излучении ультрафиолетового света проводили оценку степени чистоты полученных элюатов РНК из разведений стандарта. Образцы РНК сканировали в кварцевых кюветах (1=10 мм) при температуре 23-25°С и регистрировали значения экстинкции в диапазоне от 205 до 325 нм через каждые 2 нм, производя запись спектра поглощения РНК с помощью компьютерной программы Specrtrum v. 5.0 (фиг. 3, таблица 5).

По результатам анализа стандартов выявили, что значения OD_205-259 и OD_261-325 не превышали OD₂₆₀ что является признаком высокой степени чистоты полученных элюатов РНК (n=3). Из данных спектрального исследования стандартов отмечали отсутствие выраженных пиков на графиках (фиг. 3) при длинах волны 205, 235, 280 и 320 нм, что свидетельствовало о практически полном отсутствии загрязнения экстрактов РНК примесями фосфолипидов, полисахаридов и ГТЦ, полипептидов и крупных конгломератов, соответственно. Значения коэффициентов экстинкции R₁ для стандартов приближены к норме 2,000 (R₁=1,968-2,008), что подтверждало отсутствие ДНК и наличие лишь следовых количеств примесей белка. Деградации нуклеиновой кислоты и наличия свободных нуклеотидов в элюатах практически не наблюдалось, поскольку R₁ превышал 2,000 лишь на 0,008 (не более 4% рибонуклеотидов). Экстракты вирусной РНК не загрязнены полисахаридами и ГТЦ, так как значения коэффициента экстинкции R2 приближены к норме 2,000 и соответствовали 1,968-2,000. Разрушения РНК в экстрактах данным методом не обнаружено. Таким образом, элюаты РНК, выделенные из стандартов вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, характеризовались высокой степенью чистоты [12, 13].

После оценки степени чистоты полученного экстракта РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ проводили обратную транскрипцию и ПЦР в режиме реального времени для исследования стандартов. Для постановки реакции готовили реакционную смесь в соответствии с данными таблицы 1. ОТ-ПЦР в реальном времени осуществляли при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.

Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации C_t, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f (C_t). Устанавливали зависимость между пороговым циклом амплификации и титром инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины в процессе построения логарифмической функции. Полученные данные отражены на фиг. 4 и выражены в виде логарифмической функции: lg Т_{ВБ ВНИИЗЖ}=-0,299×C_t+12,780. Оценивали величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10^-1/k-1) (k брали из функции C_t=-3,3424×lg Т_{ВБ ВНИИЗЖ} + 42,731) (фиг. 5), а также достоверность аппроксимации (R²). Эффективность реакции амплификации составила 99,07%, достоверность аппроксимации - 0,9994, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к молекулярно-биологическим тест-системам [23].

Пример 2. Применение способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины с использованием метода ОТ-ПЦР-РВ.

В исследовании использовали 6 суспензий культурального вируса бешенства вакцинного штамма ВНИИЗЖ с титрами вируса 6,50; 6,75; 7,00; 7,25; 7,50; 7,75 lg ККИД₅₀/см³, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с титром 7,00 lg ККИД₅₀/см³. Отрицательными контролями служили суспензии клеток ВНК-21, не зараженные вирусом бешенства, и не зараженные вирусом бешенства штамма ВНИИЗЖ. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано в примере 1. Исследования проводили в 5 повторностях.

Из данных спектрального анализа (таблица 6) шести элюатов РНК проб вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ следует, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 261-325 нм не превышали OD₂₆₀, иными словами, элюаты РНК характеризовались высокой степенью чистоты. Экстракты не были контаминированы примесями фосфолипидов, полисахаридов и ГТЦ, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на спектрограммах отсутствовали выраженные пики при λ 205, 235, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициенты экстинкции R₁ для проб вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ составляли 1,997-2,000, что приближено к значению нормы 2,000 и означало высокую степень чистоты элюатов вирусной РНК, практически полное отсутствие белка. Коэффициенты экстинкции R₂ для проб вируса соответствовали значениям 2,000-2,003, что близко к норме 2,000 и обуславливало высокую чистоту элюатов. Таким образом, полученные препараты удовлетворяли требованиям чистоты [12, 13], и их можно использовать для дальнейших исследований.

С полученными экстрактами РНК проб вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ проводили ПЦР в режиме реального времени. С помощью разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени получали данные, которые отражены в таблице 6. Из нее следует, что средние значения пороговых циклов амплификации для проб №1-6 составляли 20,97±0,01, 20,10±0,02, 19,30±0,02, 18,54±0,01, 17,64±0,01, 16,82±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией lg Т_{ВБ ВНИИЗЖ}=-0,299C_t+12,780 (R²=0,9994, Е=99,07%), рассчитали средние значения титра вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ для проб №1-6, которые составили 6,51; 6,77; 7,01; 7,24; 7,51; 7,75 lg ККИД₅₀/см³, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 19,33±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, равному 7,00 lg ККИД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие вируса бешенства в данных образцах.

Исследуемые образцы параллельно тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии ВНК-21 с применением специфического иммуноглобулина G, меченого флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) и в ПЦР в режиме реального времени. Обнаружили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99-100% (n=7). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.

Иными словами, разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ позволяет оценивать титр вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.

Пример 3. Выделение степени достоверности определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины с применением разработанного способа.

Для анализа использовали 340 суспензий культурального вируса бешенства вакцинного штамма ВНИИЗЖ с титром вируса от 1,00 до 9,00 lg ККИД₅₀/см³. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с титром вируса 7,00 lg ККИД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток ВНК-21, не зараженную вирусом бешенства, и не зараженную вирусом бешенства штамма ВНИИЗЖ. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот, оценки степени их чистоты и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как отражено в примере 1. Результаты анализа представлены в таблице 7.

Из данных спектрального анализа 340 элюатов РНК проб вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ видно, что средние значения оптической плотности при длинах волны 205-259 и 261-325 нм не превышали OD₂₆₀, таким образом, элюаты РНК характеризовались высокой степенью чистоты. Экстракты не были контаминированы примесями фосфолипидов, полисахаридов и ГТЦ, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на спектрограммах отсутствовали выраженные пики при λ 205, 235, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициенты экстинкции R₁ для проб вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ составляли 1,994-2,002, что приближено к значению нормы 2,000 и означало высокую степень чистоты элюатов вирусной РНК, практически полное отсутствие полипептидов. Коэффициенты экстинкции R₂ для проб вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ соответствовали значениям 1,997-2,001, что близко к норме 2,000 и обуславливало высокую чистоту элюатов. Таким образом, полученные препараты удовлетворяли требованиям чистоты [12, 13], и их можно использовать для дальнейших исследований.

На следующем этапе исследования проводили анализ РНК бешенства штамма ВНИИЗЖ с помощью разработанного способа опосредованного определения титра вируса. Данные анализа представлены в таблице 7. Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной логарифмической функцией lg Т_{ВБ ВНИИЗЖ}=-0,299C_t+12,780 (R²=0,9994, Е=99,07%) с получением значений Т_{ВБ ВНИИЗЖ} для каждой из 340 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 19,33±0,01, что соответствовало титру вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, равному 7,00 lg ККИД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие вируса бешенства в данных образцах.

Анализируемые пробы и контроли также тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии ВНК-21 с применением специфического иммуноглобулина G, меченого ФИТЦ, и в ПЦР в режиме реального времени. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99,3-100% для 9,0-6,0 lg ККИД₅₀/см³ (n=85), на 98,1-99,3% для 5,9-4,0 lg ККИД₅₀/см³ (n=85), на 96,8-98,3% для 3,9-2,0 lg ККИД₅₀/см³ (n=85), на 94,2-96,8% для 1,5-1,0 lg ККИД₅₀/см³ (n=85). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.

Иными словами, разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ позволяет с высокой степенью достоверности оценивать титра вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в реальном времени.

Пример 4. Оценка аналитической чувствительности тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.

При определении аналитической чувствительности разработанной тест-системы для способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ подготавливали серию стандартов вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с Т_{ВБ ВНИИЗЖ} 0,50-9,00 lg ККИД₅₀/см³ с шагом 0,1 lg ККИД₅₀/см³. Контрольные образцы тестировали в 5 повторностях. Этапы элюирования нуклеиновой кислоты, оценки степени их чистоты и постановку ПЦР в режиме реального времени, как описано в примере 1. Результаты исследования отражены в таблице 7, в которой отражен сравнительный анализ определения титра вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с помощью разработанного способа в сравнении с данными прототипного метода. Выявлено, что с достоверностью 99,3-100,0% разработанным способом определены титры вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ со значениями от 6,0 до 9,0 lg ККИД₅₀/см³, с достоверностью 98,1-99,2% - с титрами от 4,0 до 5,9 lg ККИД₅₀/см³, с достоверностью 96,8-98,2% - с титрами от 2,0 до 3,9 lg ККИД₅₀/см³, с достоверностью 94,5-96,7% - с титрами от 1,5 до 2,0 lg ККИД₅₀/см³, с достоверностью 92,0-94,4% - с титрами от 1,0 до 1,4 lg ККИД₅₀/см³. При изготовлении инактивированных антирабических вакцин применяют вирусосодержащее сырье только с титрами вируса до инактивации ≥6,50 lg ККИД₅₀/см³. Для данных образцов достоверность определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ составляла 99,3-100%.

Следовательно, аналитическая чувствительность тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени, составляет не менее 1,5 lg ККИД₅₀/см³ с достоверностью результатов исследования 94,5-100%.

Пример 5. Оценки специфичности тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.

При оценке специфичности тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени, исследовали суспензии вируса бешенства штаммов ВНИИЗЖ, РВ-97, CVS-11, вируса ящура штамма О/Приморский/2014, инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых, весенней виремии карповых, инфекционного некроза поджелудочной железы. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ККИД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

Этапы элюирования РНК, оценки степени их чистоты и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано в примере 1. Полученные экстракты РНК характеризовались высокими показателями степени чистоты, поскольку коэффициенты экстинкции R₁ и R₂ находились в диапазоне 1,996-2,000, что соответствовало требованиям [12, 13].

В результате проведения реакции амплификации в режиме реального времени с тест-системой, специфичной для участка G-гена гена вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, наблюдали построение логистических кривых накопления флуоресцентного сигнала только для вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ. Для проб, содержащих другие штаммы вируса бешенства и другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,0125 у.е.) (таблица 8). Таким образом, разработанные тест-система и способ являются специфичными по отношению к вирусу бешенства штамма ВНИИЗЖ и могут быть использованы для его количественного определения.

Пример 6. Оценка правильности способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.

Для определения правильности предложенного способа проводили анализ 315 образцов культурального вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с известными значениями титра от 1,00 до 9,00 lg ККИД₅₀/см³ (с шагом 0,25 lg ККИД₅₀/см³), осуществляя постановку количественного варианта ПЦР в режиме реального времени. Данные представляют в виде уравнения линейной зависимости между экспериментально найденными в ПЦР в режиме реального времени (у) и эталонными значениями титра вируса (х): y=kx+b. Для полученной функции проверяют гипотезы о равенстве тангенса угла наклона (k) единице и равенстве свободного члена (b) нулю. При доказательстве верности указанных гипотез со степенью надежности, равной 0,05, использование разработанного способа дает свободные от ошибки результаты [24, 25].

Результаты исследования представлены на фиг. 6 в виде линейной функции у=0,9989х+0,0109, которая при степени достоверности (R²) 0,9995, подтверждает, что тангенс угла наклона (tg α=k) стремится к единице (k=0,9989, k→1), а свободный член (b) - к нулю (b=0,0109, b→0). Из анализа полученных данных следует, что использование предложенного способа позволяет получать достоверные результаты.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность увеличить степень чистоты элюата РНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ за счет применения коллоидных частиц поверхностно-модифицированного оксида железа (II, III) Fe₃O₄ с инертной поверхностью за счет обработки полиэтиленимином и с диаметром 180-200 нм; исключить вероятность контаминации в ходе реакции; снизить время проведения анализа вируссодержащего сырья для инактивированной антирабической вакцины до 4 ч; увеличить специфичность и чувствительность анализа по определению титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ. В предлагаемом изобретении между титром инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ (Т_{ВБ ВНИИЗЖ}) и пороговым циклом амплификации (C_t) установлена зависимость, отраженная в виде логарифмической функции lg Т_{ВБ ВНИИЗЖ}=-0,299C_t+12,780 (R²=0,9994, эффективностью амплификации Е=99,07%). Разработанная математическая модель дает возможность оценивать титр инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в неинактивированном сырье для производства инактивированной антирабической вакцины.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять титр инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины на основе ПЦР в режиме реального времени с применением оригинальных специфических олигонуклеотидов для участка G-гена вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ и разработанной логарифмической модели.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени»:

1. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Бешенство. URL: https://www.fsvps.ru/fsvps/laws/177.html (Дата обращения: 22.06.2020).

2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 3.1.17. - P. 578-612.

3. Груздев K.H., Метлин A.E. Бешенство животных. - Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019. - 394 с.

4. King M.Q., Michael A.J., Carstens В.Е., Lefkowitz J.E. Virus taxonomy, classification and nomenclature of viruses. In: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Amsterdam: Elsevier, Academic Press. - 2012. P. 95-111.

5. Delmas О., Holmes E.C., Talbi С, Larrous F., Dacheux L., Bouchier C. et al. Genomic diversity and evolution of the lyssaviruses. PLoSOne. 2008. - V. 3(4): e2057.

6. Freeman W.M., Walker S.J., Vrana K.E. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential // BioTechniques. - 1999. - T. 26, вып. 1. - С. 112-122.

7. Справочная информация. Красители и тушители для ПЦР в реальном времени. URL: http://www.oligos.ru/spravka-krasiteli-tushiteli.html (Дата обращения: 11.05.2020).

8. Isolation and detection of enterovirus RNA from large-volume water samples by using the NucliSens miniMAG system and real-time nucleic acid sequence-based amplification / Rutjes S.A., Italiaander R., van den Berg H.H. et al. // Appl Environ Microbiol. - 2005. - V. 71. - P. 3734-3740.

9. Ngazoa, E.S. Quantitative study of persistence of human norovirus genome in water using TaqMan real-time RT-PCR / E.S. Ngazoa, I. Fliss, J. Jean // J Appl Microbiol. - 2008. - V. 104 - P. 707-715.

10. Immiscible phase nucleic acid purification eliminates PCR inhibitors with a single pass of paramagnetic particles through a hydrophobic liquid / K. Sur, S.M. McFal, E.T. Yeh et al. // J Mol Diagn. - 2010. - V. 12. - P. 620-628.

11. Синтол. Наборы для выделения ДНК и РНК. [Электронный ресурс] URL: https://www.syntol.ru/catalog/nabory-reagentov-dlya-vydeleniya-dnk-i-rnk (Дата обращения: 25.04.2020).

12. Boom R., Sol С.J.A., Salimans М.М.М., Hansen C.L. et al. Rapid and simple method for the purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol. 28. - P. 495-503.

13. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com [Электронный ресурс] / URL: http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm. (Дата обращения 02.11.2019).

14. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 15.12.2019).

15. Deiman В., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplication // Mol. Biotech. - 2002. - Vol. 20. - P. 163-179.

16. Sooknanan R., van Gemen В., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995.-P. 261-285.

17. SantaLucia J. J., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure: journal. - 2004. - Vol. 33. - P. 11-14.

18. The RNA Institute college of arts and science university at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Электронный ресурс] / URL: http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/form1.cgi (Дата обращения: 19.04.2020).

19. Молекулярный олигокалькулятор. [Электронный ресурс] / URL: http://www.bio.bsu.by/molbiol/oligocalc.html. (Дата обращения: 25.04.2020).

20. Nicolas von Ahsen, Carl Т. Wittwer, Ekkehard Oligonucleotide melting temperatures under per conditions: nearest-neighbor corrections for Mg²⁺, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas (англ.) // Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Vol. 47, no. 11. - P. 1956-1961.

21. SantaLucia J.J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America: journal. - 1998. - Vol. 95, no. 4. - P. 1460-1465.

22. The mfold Web Server [Электронный ресурс] URL: http://unafold.rna.albany.edu/?q=search/node/ (Дата обращения 18.04.2020).

23. Лакин Г.Ф, Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.

24. СТБ ИСО 5725-2002. «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». Части 1-6. - 01.11.2002.

25. Vallat В. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. - 2^nd ed. - Paris, France, 2008. - 67 p.

1. Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени, отличающийся тем, что в качестве гомологичных G-гену вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ оригинальных олигонуклеотидов используют GF-ARRIAH/quant-праймер, GR-ARRIAH/quant-праймер, GP-ARRIAH/quant-FAM/RTQ1-зонд со следующими последовательностями:

5'- GGT GCT ААТ GTG GTA ААС СТА АА-3',

5'-CGT САА ТТТ CAT CTG AGT GAA A-3',

5'-FAM-CCT СТС ТТТ CTG GAC GCC GAA A-RTQ1-3', соответственно, а титр инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ (Т_{ВБ ВНИИЗЖ}) в образцах вируссодержащего сырья рассчитывают с использованием разработанной логарифмической модели:

lg Т_{ВБ ВНИИЗЖ} = -0,299C_t + 12,780 (R² = 0,9994, Е = 99,07%), где R² обозначает достоверность аппроксимации, а Е обозначает эффективность реакции амплификации.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что постановка ПЦР включает следующие стадии:

- составление калибровочной панели положительных контрольных стандартов вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, в качестве которых используют суспензии с титрами инфекционной активности: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 lg ККИД₅₀/см³, а также суспензии клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21, не зараженные вирусом бешенства любого штамма и вирусом бешенства штамма ВНИИЗЖ (отрицательные контроли);

- экстрагирование РНК из вируссодержащего сырья для инактивированной антирабической вакцины, положительных контрольных стандартов и отрицательных контролей;

- составление реакционной смеси для проведения обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени с олигонуклеотидами, специфичными участку G-гена вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ;

- проведение обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени с последующей детекцией амликонов с помощью детектирующего термоциклера;

- детектирование флуоресцентного сигнала каждого образца с помощью флуориметра;

- определение величины порогового цикла амплификации;

- установление зависимости порогового цикла амплификации и титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в вируссодержащем сырье для инактивированной антирабической вакцины в виде логарифмической функции, установление достоверности аппроксимации (R²) и эффективности реакции амплификации (Е);

- определение значения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в образцах вируссодержащего сырья для инактивированной антирабической вакцины на основе разработанной логарифмической модели.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для экстрагирования РНК применяют коллоидные частицы поверхностно-модифицированного оксида железа (II, III) Fe₃O₄ с инертной поверхностью за счет обработки полиэтиленимином и с диаметром 180-200 нм.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определяют степень чистоты элюатов РНК с помощью спектрального анализа при длинах волны в диапазоне 205-325 нм.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что увеличивается специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и молекулярного зонда.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смесь компонентов для проведения обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени включает в свой состав следующие компоненты: GF-ARRIAH/quant-праймер, GR-ARRIAH/quant-праймер и GP-ARRIAH/quant-FAM/RTQ1 - зонд (каждый) - по 10 пМ, смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP) - по 0,20 мМ, MgCl₂ - 2 мМ, Taq-буферный раствор Colorless Flexi (х 5) - 20% от объема реакционной смеси, AMV-ревертаза - 10 ед., Pfu-ДНК-зависимая ДНК-полимераза - 10 ед, деионизированная вода - 64,8% от объема реакционной смеси.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для элонгации ДНК вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ применяют Pfu-ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, которая обладает 3'→5'-экзонуклеазной коррекционной активностью.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обратную транскрипцию и ПЦР в режиме реального времени проводят с соблюдением следующих режимов:

- обратная транскрипция (температура 42°С в течение 15 мин.);

- предварительная денатурация (температура 95°С в течение 5 мин.);

- ПЦР в режиме реального времени: денатурация (температура 94°С в течение 10 с), отжиг олигонуклеотидов (температура 54°С в течение 30 с), элонгация (температура 72°С в течение 90 с).

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что является высокочувствительным и специфичным, объективным и позволяет определять титр инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в вируссодержащих суспензиях в течение 4 часов, не требует использования культуры клеток для анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов и предусматривает оценку степени чистоты выделенных элюатов РНК вируса бешенства.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аналитическая чувствительность разработанного способа определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ составляет не менее 1,5 lg ККИД₅₀/см³ с достоверностью результатов исследования 94,5-100%.