Способ дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы человека

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы человека. Осуществляют взятие образца ткани узлового образования щитовидной железы, выделение суммарного пула РНК из образца, анализ уровня экспрессии гена HMGA2, митохондриальной ДНК, а также определение мутации V600E в гене BRAF. Измеряют уровень экспрессии микроРНК-146b, -221, -375. Дополнительно измеряют уровень экспрессии гена GCM2. Заключение о наличии и характере узлового образования составляют на основании дерева принятия решений, согласно которому анализируемый образец относят к одному, выбранному из следующей группы: узловое образование паращитовидной железы, доброкачественное узловое образование щитовидной железы, злокачественное узловое образование щитовидной железы, включающее папиллярный рак, медуллярный рак, гюртлеклеточный рак, фолликулярные опухоли с маркерами злокачественности. Изобретение обеспечивает повышение точности способа дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы и расширение его функциональных возможностей. 1 ил., 16 табл., 8 пр.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, эндокринологии и медицины, в частности к онкологии, и предназначено для быстрого определения типа узловых образований щитовидной железы человека.

По распространенности узловые образования щитовидной железы (ЩЖ) доминируют среди патологий эндокринной системы.

Известен стандартный метод их дооперационной диагностики, основанный на цитологическом исследовании препаратов, полученных тонкоигольной аспирационной пункционной биопсией (ТАПБ). Результат цитологического исследования ТАПБ предполагает разделение узловых образований ЩЖ на 6 диагностических категорий по системе Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology. В таблице 1 представлена классификация Bethesda при цитологическом анализе узловых образований щитовидной железы.

Однако такое исследование требует большого опыта от исполнителя и относительно часто приводит к ошибкам. Более того, даже при адекватном заборе материала в 30% случаев заключение оказывается неопределенным, поскольку цитологических признаков недостаточно для разделения доброкачественных и злокачественных фолликулярных опухолей. В соответствии с клиническими рекомендациями, большинство пациентов с неопределенным цитологическим заключением (в том числе все, относящиеся к категории Bethesda III и IV) направляются на диагностическую операцию (1) или молекулярное тестирование. При этом от 70% до 80% узловых образований ЩЖ, по результатам послеоперационного гистологического исследования, оказываются доброкачественными, а сама операция - ненужной (2). Риск послеоперационных осложнений и послеоперационный гипотиреоз, требующий пожизненной заместительной гормональной терапии, существенно снижают качество жизни.

Таким образом, возможность диагностировать образцы с неопределенной цитологией на доброкачественные и злокачественные, позволит снизить количество хирургических вмешательств и, соответственно, последующий риск осложнений.

Ядерная атипия клеток Гюртля сама по себе не является критерием злокачественности опухоли. Гюртлеклеточные пролифераты необходимо дифференцировать между неопухолевыми процессами (тиреоидит Хашимото и многоузловой зоб) и другими опухолями, в том числе папиллярной карциномой, медуллярным раком и опухолями паращитовидной железы (ПЩЖ). Цитологическая картина аденомы и карциномы из клеток Гюртля идентична и диагноз может быть определен только после гистологического исследования после удаления узла. В связи с этим, использование дополнительных молекулярных опухолевых маркеров может сделать исследование материала ТАПБ более точным для определения последующей клинической тактики и прогноза для пациента.

В связи с необходимостью совершенствования подходов к дооперационному типированию патологий ЩЖ, актуальной задачей является разработка способов диагностики узловых образований ЩЖ с использованием биомаркеров.

В качестве таких маркеров могут выступать микроРНК (миР, miR), представляющие собой короткие (18-24 нуклеотида) не кодирующие белок, молекулы РНК, регулирующие экспрессию множества генов на посттранскрипционном уровне. МикроРНК участвуют практически во всех базовых процессах от момента возникновения организма: эмбриональном развитии, пролиферации, дифференцировке, старении, иммунном и стрессорном ответах, геномном импринтинге, в ключевых процессах метаболизма.

Известен способ дифференциальной диагностики новообразований щитовидной железы человека, включающий взятие образца ткани опухоли ЩЖ и прилежащей неизмененной ткани железы в качестве контроля, выделение суммарного пула РНК из образцов, измерение уровня экспрессии диагностируемых микроРНК с последующим сравнительным анализом изменения уровня экспрессии 13 микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200а, -200b микроРНК в норме и при опухолевых образованиях ЩЖ и составлением заключения о наличии и типе злокачественного новообразования (3).

Однако, данный способ ориентирован на анализ операционного материала, поэтому недостаточно эффективен для дооперационной диагностики узловых образований ЩЖ.

Известен способ диагностики рака щитовидной железы и доброкачественного поражения щитовидной железы у пациента in vitro, включающий получение биологического образца, взятого у пациента, определение количества одной или нескольких микроРНК (miR), выбранных из группы, состоящей из miR-146b-5p, miR-146b-3p, miR-221-5p, miR-221-3р, miR-222-5p, miR-222-3р, miR-181a-5p и miR-182-5p в биологическом образце, сравнение полученного уровня экспрессии микроРНК с контрольной группой, в которой пациенту поставлен диагноз рак ЩЖ и/или доброкачественное поражение, при этом, если уровень экспрессии в биологическом образце изменяется относительно уровня экспрессии микроРНК, наблюдаемого в образцах биологических жидкостей от здоровых субъектов, то ставят диагноз РЩЖ (4).

Основными недостатками известного способа являются его ограниченные функциональные возможности, поскольку он не обеспечивает возможность дифференцирования опухоли ПЩЖ, а также опухолей с присутствием клеток Гюртля.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ дифференциальной диагностики новообразований ЩЖ человека, где при неопределенных цитологических заключениях выполняют молекулярно-генетическое исследование, производя методом ОТ-ПЦР в реальном времени количественную оценку матричной РНК (мРНК) и микроРНК и при условии показателей HMGA2 более 0.09, микроРНК-221 более 0,0105 и микроРНК-375 более -12,1213, определяют фолликулярную опухоль с признаками злокачественности, при условии показателей микроРНК-146b более 0.1721, определяют папиллярный рак, при показателях миРНК-375 более 5.2514, определяют медуллярный рак, а показатель соотношения митохондриальной ДНК/ядерной ДНК более 5716,3013 - В-клеточный рак, наличие мутации V600 в гене BRAF - папиллярный рак и является риском наличия высокой биологической агрессивности данного папиллярного рака (5).

Основными недостатками известного способа являются его ограниченные функциональные возможности, поскольку он не позволяет дифференцировать узлы ПЩЖ, узловые образования с присутствием клеток Гюртля, а также недостаточная точность. Известно, что количество клеток Гюртля коррелирует с уровнем митохондриальной ДНК (мтДНК). Для современных молекулярных тестов важно обеспечить возможность точно отличать узловые поражения ЩЖ, медуллярный рак и поражения ПЩЖ.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является повышение точности анализа, расширение функциональных возможностей способа за счет обеспечения возможности диагностики узловых образований ПЩЖ и узловых образований с присутствием клеток Гюртля ЩЖ человека.

Технический результат: повышение точности способа дифференциальной диагностики узловых образований ЩЖ и расширение его функциональных возможностей.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

При получении неопределенных результатов цитологического исследования: III и IV класс по классификации Bethesda, противоречивых результатах цитологического, ультразвукового и гистологического исследований, при множественных неинформативных заключениях пункционной биопсии проводят молекулярно-генетическое исследование. Забор образца узлового образования ЩЖ или ПЩЖ человека осуществляют путем ТАПБ. Из полученного образца готовят высушенный цитологический препарат на подложках (стеклах). Цитологический препарат смывают в пробирку при помощи лизирующего буфера и производят выделение суммарного пула РНК (содержащего и микроРНК) любым из известных способов, с помощью наборов для выделения. Затем проводят измерение уровней экспрессии трех микроРНК (miR): miR-146b-5p, miR-221-3р и miR-375 методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводят, как описано в (6). В качестве референса используют набор из 3-х микроРНК (miR-197-3р, -23а-3р, -29b-3р), характеризующихся стабильной экспрессией. Нормировку содержания микроРНК проводят на геометрическое среднее содержания трех референсных микроРНК с помощью метода (7). Проводят анализ уровня мтДНК методом ПЦР в реальном времени. Нормировку содержания мтДНК проводят на уровень ядерной ДНК (яДНК). Проводят анализ уровней экспрессии гена HMGA2 (high-mobility group AT-hook 2) и гена GCM2 (glial cells missing transcription factor 2), а также определяют наличие соматической мутации V600E в гене BRAF, как описано в (8).

Заключение о наличии и типе узловых образований составляют на основании дерева принятия решений, представленного на фигуре 1, опираясь на значения уровней исследуемых биомаркеров и наличия/отсутствия мутации V600E в гене BRAF.

В соответствии с деревом принятия решений, на первом этапе анализа определяют тип узлового образования, а именно, узловое образование ЩЖ или ПЩЖ. При этом если в образце опухолевой ткани уровень экспрессии биомаркера GCM2 повышен (GCM2 >= (0,1-0,5) то делают заключение, что материал взят из области ПЩЖ и дальнейший анализ не проводят. Если уровень экспрессии биомаркера GCM2 понижен (GCM2 < (0,1-0,5)), то делают заключение о наличии у пациента узлового образования ЩЖ.

На втором этапе анализа определяют характер узлового образования ЩЖ: доброкачественное или злокачественное. Диапазон пороговых значений биомаркеров HMGA, miR-375, miR-221 и BRAF V600E для дифференциации доброкачественных узловых образований щитовидной железы представлен в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что если в образце опухолевой ткани ЩЖ уровни экспрессии биомаркеров HMGA, miR-375, miR-221 ниже пороговых значений и отсутствует мутация V600E в гене BRAF, то делают заключение о наличии у пациента доброкачественного узлового образования ЩЖ, а если уровень экспрессии хотя бы одного биомаркера повышен, то делают заключение о вероятности наличия у пациента злокачественного узлового образования ЩЖ.

На третьем этапе определяют характер злокачественного образования, опираясь на значения уровней исследуемых биомаркеров, и наличия/отсутствия мутации V600E в гене BRAF.

В таблице 3 представлены пороговые значения биомаркеров, на основании которых делают заключение о вероятности наличия у пациента медуллярного рака ЩЖ (MP), из которой видно, что характеристикой медуллярного рака является повышенный уровень miR-375 (>=(3.5-4.5)).

В таблице 4 представлены пороговые значения биомаркеров, на основании которых делают заключение о вероятности наличия у пациента папиллярного рака ЩЖ (ПР), из которой видно, что характеристикой папиллярного рака является повышенный уровень miR-146b (>=(-0.05-0.5)) и повышенный уровень хотя бы одного из следующих биомаркеров: HMGA2 (>=(0.05-0.015)), miR-375 (>=(-10-15)), miR-221 (>=(0.02-0.07)), либо наличие мутации V600E в гене BRAF.

В таблице 5 представлены пороговые значения биомаркеров, на основании которых делают заключение о вероятности наличия у пациента гюртлеклеточного рака ЩЖ (ГКР), из которой видно, что характеристикой гюртлеклеточного рака является высокий уровень мтДНК (>=(5500-6500)) и повышенный уровень хотя бы одного из следующих биомаркеров: HMGA2 (>=(0.05-0.015)), miR-375 (>=(-10-15)), miR-221 (>=(0.02-0.07)).

При этом, в частном случае, если делается заключение о доброкачественном характере узлового образования, то проводят анализ уровня мтДНК и в случае повышенного уровня мтДНК, свидетельствующего о повышенном содержании клеток Гюртля в доброкачественном узле, делают заключение «Доброкачественное образование, Гюртлеклеточный вариант».

Аналогично, если делается заключение о злокачественном характере узлового образования, не подходящего под диагноз «гюртлеклеточный рак», проводят анализ уровня мтДНК и в случае повышенного уровня мтДНК, делают заключение «Папиллярный рак, Гюртлеклеточный вариант» или «Медуллярный рак, Гюртлеклеточный вариант» в зависимости от основного типа рака.

В таблице 6 представлены пороговые значения биомаркеров, на основании которых делают заключение «Папиллярный рак, Гюртлеклеточный вариант». В таблице 7 представлены пороговые значения биомаркеров, на основании которых делают заключение «Медуллярный рак, Гюртлеклеточный вариант».

При этом, если значения биомаркеров не соответствуют гюртлеклеточному раку (ГКР), папиллярному раку (ПР) или медуллярному раку (MP), а также не соответствуют их Гюртлеклеточным вариантам, но при этом на втором этапе анализа сделано заключение о вероятности наличия у пациента злокачественного узлового образования ЩЖ, то делают заключение о наличии у пациента «Фолликулярной опухоли с маркерами злокачественности (ФО-МЗ)».

В таблице 8 представлены пороговые значения биомаркеров, на основании которых делают заключение о вероятности наличия у пациента Фолликулярной опухоли с маркерами злокачественности (ФО-МЗ), из которой видно, что характеристикой ФО-МЗ является повышенный уровень хотя бы одного из следующих биомаркеров: HMGA2 (>=(0.05-0.015)), miR-375 (>=(-10-15)), miR-221 (>=(0.02-0.07)).

Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа являются:

1. Для диагностики узлового образования паращитовидной железы (ПЩЖ) проводят анализ уровня экспрессии биомаркера GCM2, что позволяет расширить функциональные возможности способа.

2. Заключение о наличии и характере узлового образования составляют на основании дерева принятия решений, построенного на основе средних значений уровней экспрессии измеряемых биомаркеров в разных типах узловых образований щитовидной и паращитовидной железы, согласно которому анализируемый образец относят к одному из следующей группы: узловое образование паращитовидной железы, доброкачественное узловое образование ЩЖ (ДО), злокачественное узловое образование ЩЖ (РАК), включающее папиллярный рак (ПР), медуллярный рак (MP), гюртлеклеточный рак (ГКР), фолликулярные опухоли с маркерами злокачественности (ФО-МЗ), что позволяет повысить точность диагностики и расширить функциональные возможности способа.

4. В преимущественном варианте способа, дополнительно проводят анализ уровня мтДНК и в случае повышенного уровня мтДНК, свидетельствующего о повышенном содержании клеток Гюртля в доброкачественном или злокачественном узловом образовании, делают заключение о вероятности наличия у пациентов Гюртлеклеточных вариантов доброкачественного образования или папиллярного рака, или медуллярного рака соответственно, что позволяет повысить точность диагностики и расширить функциональные возможности способа.

Предлагаемый способ одновременно обладает высокой предсказательной ценностью отрицательного результата (ПЦОР) и положительного результата (ПЦПР).

В таблице 9 представлены диагностические характеристики определения злокачественных опухолей предлагаемым способом для разных категорий цитологических препаратов (по сравнению с прототипом).

Из таблицы 9 видно, что заявляемый способ, несколько уступая старому в чувствительности (0.9%) и ПЦОР (0.7%), значительно превосходит его в специфичности (5.6%), ПЦПР (6.3%) и общей точности (2.6%). Фактически, это означает, что количество ложноположительных результатов сократилось в 9.5 раза.

Таким образом, заявляемый способ диагностики узловых образований ЩЖ человека является более точным и надежным, позволяя избежать ошибок в диагностике узловых образований ЩЖ.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения заявляемого способа.

Пример 1.

Пациент М., 57 лет. При проведении УЗИ выявлены узлы в обеих долях щитовидной железы. Пациенту выполнили тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию (ТАПБ). По результатам которой получено заключение в отношении обоих узлов: цитограмма клеточно-коллоидного узла с гиперплазией на фоне тиреоидита. Фолликулярная опухоль. Bethesda IV. Рекомендовано оперативное лечение.

Пациенту был проведен молекулярно-генетический анализ заявляемым способом.

Материал, нанесенный на цитологические стекла, смыли 600 мкл лизирующего буфера в пробирку объемом 1,5 мл. Выделение суммарного пула РНК, содержащего также и микроРНК, проводили с помощью набора «РеалБест экстракция 100» (АО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя.

Затем измерение уровней экспрессии GCM2, HMGA, miR-375, miR-221, а также определение мутации BRAF V600E проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США).

Использовали стандартную концентрацию прямых и обратных праймеров 0,5 мкМ, концентрация флуоресцентно меченого зонда - 0,25 мкМ. Реакцию обратной транскрипции проводили в течение 15 мин. при 16°С, 15 мин. при 42°С, затем обратную транскриптазу инактивировали 2 мин. при 95°С и отбирали 3 мкл полученной смеси для ПЦР в реальном времени. Протокол ПЦР: предварительный прогрев при 95°С - 2 мин, 50 циклов: денатурация при 94°С - 10 сек, отжиг праймеров и элонгация: 60°С - 20 сек.

Анализ полученных данных пороговых циклов ПЦР в реальном времени проводился 2(-ΔCt) методом (7).

При проведении молекулярно-генетического анализа получены следующие значения исследуемых биомаркеров:

Из таблицы 10 видно, что значение биомаркера GCM2 меньше порогового значения, следовательно, материал получен из узла ЩЖ, кроме того, экспрессии биомаркеров HMGA, miR-375, miR-221 ниже пороговых значений и отсутствует мутация V600E в гене BRAF, следовательно, на основе дерева принятия решений делают заключение о наличии у пациента доброкачественного узлового образования ЩЖ. Уровень мтДНК не повышен. Пациенту рекомендовано клиническое наблюдение за узлами ЩЖ.

Итог: Проведена тиреоидэктомия. По данным патогистологического исследования оба узла ЩЖ соответствуют аденоме щитовидной железы.

Пример 2.

Пациент М., 50 лет. При проведении УЗИ выявлен узел в правой доле щитовидной железы. Пациенту выполнили тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию (ТАПБ). По результатам которой получено заключение: цитограмма клеточно-коллоидного узла с тиреоидитом и гиперплазией. Фолликулярная опухоль. Bethesda IV. Рекомендовано оперативное лечение.

Пациенту был проведен молекулярно-генетический анализ, аналогично примеру 1, в результате которого получены следующие значения исследуемых биомаркеров:

Из таблицы 11 видно, что значение биомаркера GCM2 меньше порогового значения, следовательно, материал получен из узла ЩЖ, кроме того, экспрессии биомаркеров HMGA, miR-375, miR-146b выше пороговых значений и присутствует мутация V600E в гене BRAF, в связи с чем, на основе дерева принятия решений, делают заключение о наличии у пациента папиллярного рака правой доли щитовидной железы. Уровень мтДНК не повышен. Пациенту рекомендовано оперативное лечение.

Итог: Проведена тиреоидэктомия, центральная лимфаденэктомия, фасциально-футлярная лимфодиссекция. По данным патогистологического исследования подтвержден папиллярный рак правой доли щитовидной железы.

Пример 3.

Пациент Ж., 47 лет. При проведении УЗИ выявлен узел в правой доле щитовидной железы. Пациенту выполнили тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию (ТАПБ), по результатам которой получено заключение: Фолликулярная опухоль. Bethesda IV. Рекомендовано оперативное лечение.

Пациенту был проведен молекулярно-генетический анализ, аналогично примеру 1, в результате которого получено значения биомаркера GCM2, равное 1,23, что соответствует наличию у пациента узлового образования паращитовидной железы.

Итог: проведена гемитиреоидэктомия. По данным патогистологического исследования выявлена аденома паращитовидной железы.

Пример 4.

Пациент М., 46 лет. При проведении УЗИ выявлен узел в левой доле щитовидной железы. Пациенту выполнили тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию (ТАПБ), по результатам которой получено заключение: атипия неясного значения. Bethesda III. Проведена повторная ТАПБ, по результатам которой также получено заключение: атипия неясного значения. Bethesda III. Рекомендовано оперативное лечение.

Пациенту был проведен молекулярно-генетический анализ, аналогично примеру 1, в результате которого получены следующие значения исследуемых биомаркеров:

Из таблицы 12 видно, что значение биомаркера GCM2 меньше порогового значения, следовательно, материал получен из узла ЩЖ, кроме того, экспрессии биомаркеров HMGA, miR-221, miR-146b ниже пороговых значений и отсутствует мутация V600E в гене BRAF, а экспрессия биомаркера miR-375 выше порогового значения. Уровень мтДНК не повышен.

Общее заключение с учетом молекулярно-генетического анализа: фолликулярная опухоль с маркерами злокачественности (ФО-МЗ). Пациенту рекомендовано оперативное лечение.

Итог: проведена тиреоидэктомия, центральная лимфаденэктомия, фасциально-футлярная лимфодиссекция. По данным патогистологического исследования подтвержден папиллярный рак левой доли щитовидной железы.

Пример 5.

Пациент М., 63 года. При проведении УЗИ выявлен узел в левой доле щитовидной железы. Пациенту выполнили тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию (ТАПБ), по результатам которой получено заключение: Фолликулярная опухоль из клеток Гюртля. Bethesda IV. Рекомендовано оперативное лечение.

Пациенту был проведен молекулярно-генетический анализ, аналогично примеру 1, в результате которого получены следующие значения исследуемых биомаркеров:

Из таблицы 13 видно, что значение биомаркера GCM2 меньше порогового значения, следовательно, материал получен из узла ЩЖ, значения биомаркеров HMGA, miR-375, miR-146b ниже пороговых значений и отсутствует мутация V600E в гене BRAF, а уровень miR-221 и мтДНК повышены, следовательно, на основе дерева принятия решений, сделано заключение о вероятности наличия у пациента гюртлеклеточного рака в левой доле щитовидной железы. Пациенту рекомендовано оперативное лечение.

В результате пациенту проведена тиреоидэктомия, центральная лимфаденэктомия, фасциально-футлярная лимфодиссекция. По данным патогистологического исследования подтвержден гюртлеклеточный рак ЩЖ.

Пример 6.

Пациент Ж., 38 лет. При проведении УЗИ выявлен узел в левой доле щитовидной железы. Пациенту выполнили тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию (ТАПБ). По результатам которой получено заключение: атипия неясного значения Bethesda III. Рекомендовано повторное проведение ТАПБ.

Пациенту был проведен молекулярно-генетический анализ, аналогично примеру 1, в результате которого получены следующие значения исследуемых биомаркеров:

Из таблицы 14 видно, что значение биомаркера GCM2 меньше порогового значения, следовательно, материал получен из узла ЩЖ, значения биомаркеров HMGA, miR-221, miR-146b и мтДНК понижены и отсутствует мутация V600E в гене BRAF, а уровень генетического биомаркера miR-375 повышен, в связи с чем, на основе дерева принятия решений делают, заключение о вероятности наличия у пациента медуллярного рака ЩЖ. Пациенту рекомендовано оперативное лечение.

Итог: проведена тиреоидэктомия, центральная лимфаденэктомия, фасциально-футлярная лимфодиссекция. По данным патогистологического исследования подтвержден медуллярный рак ЩЖ.

Пример 7.

Пациент. М., 52 года. При проведении УЗИ выявлен узел в левой доле щитовидной железы. Пациенту выполнили тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию (ТАПБ). По результатам которой получено заключение: Фолликулярная опухоль Bethesda IV. Рекомендовано оперативное лечение.

Пациенту был проведен молекулярно-генетический анализ, аналогично примеру 1, в результате которого получены следующие значения исследуемых биомаркеров:

Из таблицы 15 видно, что значение биомаркера GCM2 меньше порогового значения, следовательно, материал получен из узла ЩЖ, кроме того, уровни экспрессии биомаркеров HMGA, miR-375, miR-146b выше пороговых значений, в связи с чем, на основе дерева принятия решений, делают заключение о вероятности наличия у пациента папиллярного рака ЩЖ. Однако поскольку значение мтДНК, выше порогового значения этого биомаркера, свидетельствующего о повышенном содержании клеток Гюртля в злокачественном узле, делают уточнение к основному заключению и ставят диагноз: «Папиллярный рак, Гюртлеклеточный вариант». Пациенту рекомендовано оперативное лечение.

Итог: проведена тиреоидэктомия. По данным патогистологического исследования подтвержден папиллярный рак. Гюртлеклеточный вариант.

Пример 8.

Пациент Ж., 35 лет. При проведении УЗИ выявлен узел в правой доле щитовидной железы. Пациенту выполнили тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию (ТАПБ), по результатам которой получено заключение: Фолликулярная опухоль. Bethesda IV. Рекомендовано оперативное лечение.

Пациенту был проведен молекулярно-генетический анализ, аналогично примеру 1, в результате которого получены следующие значения исследуемых биомаркеров:

Из таблицы 16 видно, что значение биомаркера GCM2 меньше порогового значения, следовательно, материал получен из узла ЩЖ, значения биомаркеров HMGA, miR-221, miR-146b понижены и отсутствует мутация V600E в гене BRAF, а уровень генетического биомаркера miR-375 повышен и, кроме того, уровень мтДНК выше порогового значения, в связи с чем делают заключение о наличии у пациента медуллярного рака ЩЖ, Гюртлеклеточный вариант.Пациенту рекомендовано оперативное лечение.

Итог: проведена тиреоидэктомия. По данным патогистологического исследования подтвержден медуллярный рак, Гюртлеклеточный вариант.

Заявляемый способ позволит просто, быстро и точно диагностировать тип узла ЩЖ до операции, чтобы подтвердить или скорректировать результаты, полученные при цитологическом исследовании, своевременно выбрать правильную тактику последующего лечения пациента.

Источники информации

1. Cibas ES, Ali SZ. The 2017 Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology. Thyroid. 2017 Nov; 27(11):1341-1346.

2. Haugen BR, Alexander EK, Bible KC, Doherty GM, Mandel SJ, Nikiforov YE, Pacini F, Randolph GW, Sawka AM, Schlumberger M, Schuff KG, Sherman SI, Sosa JA, Steward DL, Turtle RM, Wartofsky L. 2015 American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer: The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer. Thyroid. 2016 Jan; 26(1):1-133.

3. Патент RU 2569154 C1, опубл. 20.11.2015

4. Патентная заявка WO 2015071876 A2, опубл. 21.05.2015

5. Патент RU 2705110 С1, опубл. 06.11.2019

6. Titov SE, Ivanov MK, Karpinskaya EV, Tsivlikova EV, Shevchenko SP, Veryaskina YA, Akhmerova LG, Poloz TL, Klimova OA, Gulyaeva LF, Zhimulev IF, Kolesnikov NN. miRNA profiling, detection of BRAF V600E mutation and RET-PTC1 translocation in patients from Novosibirsk oblast (Russia) with different types of thyroid tumors. BMC Cancer. 2016

7. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 Dec; 25(4):402

8. Titov SE, Ivanov MK, Demenkov PS, Katanyan GA, Kozorezova ES, Malek AV, Veryaskina YA, Zhimulev IF. Combined quantitation of HMGA2 mRNA, microRNAs, and mitochondrial-DNA content enables the identification and typing of thyroid tumors in fine-needle aspiration smears. BMC Cancer. 2019 Oct 28; 19(1):1010.

Способ дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы человека

Способ дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы человека, включающий взятие образца ткани узлового образования щитовидной железы, выделение суммарного пула РНК из образца, измерение уровня экспрессии диагностируемых микроРНК методом ОТ-ПЦР в реальном времени, анализ уровня экспрессии гена HMGA2, митохондриальной ДНК, а также определение мутации V600E в гене BRAF с последующим сравнительным анализом изменения уровня экспрессии диагностируемых биомаркеров в норме и при узловых образованиях щитовидной железы и составлением заключения о наличии и характере узлового образования, отличающийся тем, что измеряют уровень экспрессии трех микроРНК, а именно микроРНК-146b, -221, -375, дополнительно измеряют уровень экспрессии гена GCM2, характеризующего клетки паращитовидной железы, а заключение о наличии и характере узлового образования составляют на основании дерева принятия решений, построенного на основе средних значений уровней экспрессии измеряемых биомаркеров в разных типах узловых образований щитовидной железы, согласно которому анализируемый образец относят к одному, выбранному из следующей группы: узловое образование паращитовидной железы, доброкачественное узловое образование щитовидной железы, злокачественное узловое образование щитовидной железы, включающее папиллярный рак, медуллярный рак, гюртлеклеточный рак, фолликулярные опухоли с маркерами злокачественности, при этом:

- если в образце опухолевой ткани уровень биомаркера GCM2 выше 0,5, то делают заключение о том, что материал получен из образования паращитовидной железы, а если ниже 0,1, то делают заключение о том, что материал получен из узлового образования щитовидной железы;

- если в образце опухолевой ткани уровни биомаркеров HMGA, miR-375, miR-221 ниже 0,05, -10 и 0,02 соответственно и отсутствует мутация V600E в гене BRAF, то делают заключение о наличии у пациента доброкачественного узлового образования щитовидной железы, а если уровень хотя бы одного биомаркера повышен, то делают заключение о вероятности наличия у пациента злокачественного узлового образования щитовидной железы;

- если в образце опухолевой ткани повышен уровень митохондриальной ДНК более 6500, свидетельствующий о повышенном содержании клеток Гюртля в узловом образовании, то делают заключение о вероятности наличия у пациента гюртлеклеточного варианта папиллярного или медуллярного рака соответственно, в зависимости от основного типа рака или гюртлеклеточного варианта доброкачественного образования щитовидной железы;

- если в образце опухолевой ткани значение биомаркера HMGA2 выше или равно 0,015, miR-221 выше или равно 0,07, miR-375 выше или равно 3,5, уровень митохондриальной ДНК менее 5500 и отсутствует мутация V600E в гене BRAF, то делают заключение о вероятности наличия у пациента фолликулярной опухоли с маркерами злокачественности.