Применение ингибитора альфа1-протеиназы (альфа1-антитрипсина) для профилактики и/или лечения острого респираторного дистресс синдрома и способ профилактики и/или лечения острого респираторного дистресс синдрома с использованием альфа1-антитрипсина
Группа изобретений относится к области фармакологии и медицины и предназначена для профилактики или лечения острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Для профилактики или лечения ОРДС применяют альфа1-антитрипсин (ААТ), который вводят пациентам в количестве от 60 до 180 мг/кг однократно внутривенно. Кроме того, представлен способ профилактики или лечения ОРДС с помощью альфа1-антитрипсина. Технический результат: выявлены корригирующие свойства AAT, свидетельствующие о наличии специфического фармакологического действия у препарата в отношении купирования проявлений острого респираторного дистресс-синдрома, что позволяет использовать ААТ для профилактики или лечения острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 12 ил., 8 табл., 4 пр.
Изобретение относится к области медицины, в частности, к применению ингибитора альфа1-протеиназы (альфа1-антитрипсина) для профилактики и/или лечения острого респираторного дистресс-синдрома и способу профилактики и/или лечения острого респираторного дистресс-синдрома с использованием альфа1-антитрипсина.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Альфа1-антитрипсин (ААТ) – белок, который естественным образом находится в организме человека. Фармацевтические компании во всем мире получают его из плазмы крови для лечения дефицита ААТ, наследственного заболевания.
Традиционно принято считать, что противовоспалительное действие ААТ (альфа1-антитрипсина) объясняется его способностью ингибировать сериновую протеазу, и, в особенности, эластазу нейтрофилов, что является основой использования ААТ (альфа1-антитрипсина) в качестве заместительной терапии для пациентов с дефицитом ААТ. Исследования ААТ человека на моделях in vitro и in vivo зависят от использования имеющихся на рынке препаратов, направленных на ингибирование сериновой протеазы, одобренных для использования в клинической практике.
AAT изначально классифицировался как ингибитор протеазы, принадлежащий к суперсемейству серпинов. Он обычно известен как ингибитор сывороточного трипсина. ААТ также можно считать ингибитором альфа-1 протеиназы (A1PI), т.к. он ингибирует широкий ряд протеаз. ААТ защищает ткани от энзимов воспалительных клеток, например, эластазы нейтрофилов, и обычно концентрируется в крови в диапазоне от 1,5 до 3,5 г/л.
В настоящее время тенденцией в получении терапевтических концентраций ААТ является получение ААТ из плазмы доноров крови. Управление по контролю за продуктами и лекарствами США одобрило использование нескольких коммерческих продуктов, полученных из плазмы крови человека. Например, некоторые из таких продуктов включают Земайра РТМ и Араласт РТМ (Бакстер), и Камада (Камада, Израиль). Препараты вводятся внутривенно в рамках ААТ-терапии пациентам с дефицитом ААТ.
Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) был впервые описан в 1967 г.; это синдром гипосемической дыхательной недостаточности, связанный с некардиогенным отеком легких, встречающийся у 10% пациентов отделения интенсивной терапии. Он является результатом диффузного воспалительного повреждения альвеол и капилляров в легких. ОРДС часто ассоциируется с полиорганной недостаточностью и влечет за собой высокий риск смертности и финансовые затраты.
ОРДС характеризуется острой воспалительной реакцией, провоцирующей проникновение экссудата из легочных капилляров в альвеолы, после чего наступает пролиферативная фаза. В дальнейшем она может привести к фиброзу или распаду [John Rae. Acute Respiratory Distress Syndrome. Опубликовано 1 октября 2019, ATOTW 411].
Принцип лечения нацелен на избежание ухудшения повреждения легких путем вентилирования с низким объемом вдоха с контролируемым давлением, надлежащего использования положительного давления конца выдоха и допустимой гиперкапнии [Pierrakos C, Karanikolas M, Scolletta S, et al. Acute respiratory distress syndrome: pathophysiology and therapeutic options. J Clin Med Res. 2012;4(1):7-16; Fan E, Del Sorbo L, Goligher EC, et al. An official American Thoracic Society/European Society of Intensive Care Medicine/Society of Critical Care Medicine clinical practice guideline: mechanical ventilation in adult patients with acute respiratory distress syndrome. AmJ Respir Crit Care Med. 2017;195(9):1253-1263].
Вспомогательные средства лечения включают стратегию консервативной инфузионной терапии; при средней и высокой степени тяжести – нейромышечную блокаду и вентиляцию легких в положении лежа на животе. В некоторых случаях в качестве резервной терапии допускается экстракорпоральная мембранная оксигенация. Фактически, всем пациентам с ОРДС необходима искусственная вентиляция легких, что является риском развития вентиляторно-ассоциированной пневмонии (ВАП). У взрослых пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС) частота ВАП может достигать 70%.
Определение ОРДС было обновлено в 2012 г. с целью улучшить надежность и прогностическую ценность. В настоящее время ОРДС определяется как «острое диффузное воспалительное повреждение легких, приводящее к повышенной проницаемости сосудов легких, увеличению массы легкого и потере вентилируемой легочной ткани… [с] гипоксемией и затемнением легких на рентгенографии, связанным с увеличением венозных примесей, физиологически мертвого пространства и уменьшением податливости легочной ткани» [ The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: the Berlin definition. JAMA. 2012;307(23):2526-2533].
Тяжесть ОРДС определяется степенью гипоксемии, которая рассчитывается как отношение напряжения кислорода в артериальной крови к доле вдыхаемого кислорода (PaO 2 /FiO 2). ОРДС может быть слабым, умеренным или тяжелым, согласно классификации в берлинском определении ОРДС:
При наблюдательном исследовании эпидемиологии и лечения ОРДС с участием 29 000 пациентов в более чем 50 странах (LUNG SAFE) было обнаружено, что критерии ОРДС были выполнены в 10% случаях при госпитализации в отделение интенсивной терапии; в 23% случаях требовалась искусственная вентиляция легких. В 30% случаях ОРДС был слабым, в 47% - умеренным и в 23% - тяжелым. Медианный период искусственной вентиляции составил 8 дней, медианный период пребывания в отделении интенсивной терапии составил 10 дней. Смертность в отделении интенсивной терапии и в больнице составили 34% и 40%, соответственно. Был сделан вывод о том, что ОРДС является недостаточно определяемым и недолечиваемым заболеванием с высокой смертностью [Bellani G, Laffey JG, Pham T, et al. Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries. JAMA. 2016;315(8):788-800].
Потенциальные отягчающие состояния можно классифицировать на легочные и внелегочные:
Пневмония (59%)
Сепсис (16%)
Вдыхание содержимого желудка (14%)
Без очевидных провоцирующих факторов (8%)
Ушиб легкого (3%)
Некардиогенный шок (7.5%)
Ингаляционное повреждение (2%)
Обширная трансфузия (4%)
Легочный васкулит (1%)
Множественные травмы (4%)
Утопление (1%)
Прочие (например, панкреатит) (3%)
Наркотические и токсические вещества (2%)
Ожоги (1%).
Наиболее частыми причинами ОРДС являются вирусная и бактериальная пневмония.
В настоящее время, к сожалению, несмотря на существующие методы лечения ARDS, открытой проблемой остается профилактика и терапия АRDS, поскольку арсенал применяемых методов и лекарственных средств на сегодняшний день ограничен. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что AAT может быть эффективно использован для профилактики и/или терапии ARDS.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к использованию ААТ для профилактики и/или лечения острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Другой аспект изобретения включает метод профилактики и/или лечения острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), который предусматривает введение ААТ в эффективном количестве пациентам с ОРДС или имеющим риск развития ОРДС.
Эффективное количество вводимого ААТ зависит от состояния пациента.
В одном из вариантов осуществления изобретения эффективное количество составляет от 60 до 180 мг/кг веса пациента при одноразовом введении путём внутривенной инъекции.
Один из вариантов изобретения относится к профилактике и/или лечению ОРДС при состояниях, способствующих развитию ОРДС, включающих состояния легочного и внелегочного происхождения, например, пневмонию, сепсис, вдыхание содержимого желудка, ушиб легкого, некардиогенный шок, ингаляционное повреждение, обширную трансфузию, легочный васкулит, множественные травмы, наркотические и токсические вещества или ожоги.
Другой вариант изобретения относится к вирусной и бактериальной пневмонии, которые являются наиболее частыми состояниями, способствующими развитию ОРДС. Вирусные инфекции включают, в частности, вирусы гриппа (например, типов А, B, С), ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы, пикорнавирусы и др.
В ещё одном варианте изобретение может использоваться для лечения пациента с вирусной инфекцией с целью профилактики и/или уменьшения симптомов ОРДС.
В другом варианте изобретения ААТ вводится пациентам с целью профилактики ОРДС в количестве от 60 до 180 мг/кг однократно внутривенно при таких симптомах, как, например, гипоксия, инфильтраты легких, обнаруженных на рентгенографии или компьютерной томографии, или одышка.
Проведенные исследования выявили специфическое фармакологическое действие AAT (препарат Респикам®, раствор для инфузий 20 мг/мл, Камада Лтд., Израиль) в отношении купирования проявлений острого респираторного дистресс-синдрома: в зависимости от дозы уменьшались степень интерстициального и альвеолярного отека и выраженность воспалительного инфильтрата как внутри альвеол, так и снаружи, восстанавливалась структура стенок альвеол в течение 7 дней наблюдения, повышалась выживаемость животных на 60%. Также, ААТ в эффективном количестве вызываeт дозозависимое снижение выраженности провоспалительной реакции: снижается содержание ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10 в ткани легкого и ИЛ-10 в сыворотке крови. Применение ААТ позволяет избежать использования искусственной вентиляции лёгких, и, как следствие, угрожающих жизни осложнений ИВЛ, таких как, например, баротравма, стрессовые язвы, отеки, интерстициальная эмфизема, пневмоторакс, инфекционные осложнения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1. Структура легких мышей после введения препарата Респикам® в дозе 60 мг/кг интактным животным. Окрашено гематоксилином и эозином, х 200.
Фиг. 2. Структура легких мышей контрольной группы после введения 0,9% раствор натрия хлорида для инъекций. Окрашено гематоксилином и эозином, х 200.
Фиг. 3. Структура легких погибших мышей с острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС). Окрашено гематоксилином и эозином, х 200.
Фиг. 4. Структура легких мышей с ОРДС через 7 суток после введения препарата Респикам®, 60 мг/кг.
Фиг. 5. Структура легких павших мышей с ОРДС через 1 сутки после введения препарата Респикам®, 60 мг/кг. Окрашено гематоксилином и эозином, х 200.
Фиг 6. Структура легких павших мышей с ОРДС через 2 суток после введения препарата Респикам®, 60 мг/кг. Окр. гематоксилином и эозином, х 200.
Фиг. 7. Структура легких павших мышей с ОРДС через 3 суток после введения препарата Респикам®, 60 мг/кг. Окрашено гематоксилином и эозином, х 200.
Фиг. 8. Структура легких мышей с ОРДС через 7 суток после введения препарата Респикам®, 120 мг/кг. Окрашено гематоксилином и эозином, х 200.
Фиг. 9. Структура легких павших мышей с ОРДС через 1 сутки после введения препарата Респикам®, 120 мг/кг. Окрашено гематоксилином и эозином, х 200.
Фиг. 10. Структура легких павших мышей с ОРДС через 3 суток после введения препарата Респикам®, 120 мг/кг. Окрашено гематоксилином и эозином, х 200.
Фиг. 11. Структура легких мышей с ОРДС через 7 суток после введения препарата Респикам®, 180 мг/кг. Окрашено гематоксилином и эозином, х 200.
Фиг. 12. Структура легких павших мышей с ОРДС через 1 сутки после введения препарата Респикам®, 180 мг/кг. Окрашено гематоксилином и эозином, х 200.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к использованию ААТ для профилактики и/или лечения острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Другой аспект изобретения включает способ профилактики и/или лечения острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), который предусматривает введение ААТ в эффективном количестве пациентам с ОРДС или имеющим риск развития ОРДС.
Эффективное количество вводимого ААТ зависит от состояния пациента.
В вариантах осуществления изобретения эффективное количество составляет 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 и 180 мг/кг веса пациента при одноразовом введении путём внутривенной инъекции.
Другой аспект изобретения относится к профилактики и/или лечению ОРДС при состояниях, способствующих развитию ОРДС, включающих состояния легочного и внелегочного происхождения, например, пневмонию, сепсис, вдыхание содержимого желудка, ушиб легкого, некардиогенный шок, ингаляционное повреждение, обширную трансфузию, легочный васкулит, множественные травмы, наркотические и токсические вещества или ожоги.
Ешё один аспект изобретения относится к вирусной и бактериальной пневмонии, которые являются наиболее частыми состояниями, способствующими развитию ОРДС. Вирусные инфекции включают, в частности, вирусы гриппа (например, типов А, B, С), ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы, пикорнавирусы и др.
В одном из вариантов изобретение может использоваться для лечения пациента с вирусной инфекцией с целью профилактики и/или уменьшения симптомов ОРДС.
В другом варианте изобретения ААТ вводится пациентам с целью профилактики ОРДС в количестве от 60 до 180 мг/кг однократно внутривенно при таких симптомах, как, например, гипоксия, инфильтраты легких, обнаруженных на рентгенографии или компьютерной томографии, или одышка.
Специфическое фармакологическое действие ААТ согласно изобретению было исследовано с использованием препарата Респикам®, представляющего раствор для инфузий 20 мг/мл (Камада Лтд., Израиль) на модели мышей с острым респираторным дистресс-синдромом.
Результаты гистология тканей легкого, определения содержания цитокинов ИЛ-1в, ИЛ-6, ИЛ-10 в крови и тканях легких представлены в Примерах.
Сокращения:
| М | - | среднее арифметическое |
| МК | - | массовые коэффициенты |
| n | - | количество животных |
| SEM | - | cтандартная ошибка среднего значения |
| SD | - | среднеквадратичное отклонение |
Специфическое фармакологическое действие препарата Респикам® изучали на модели острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) у мышей при однократном внутривенном введении в дозах 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 и 180 мг/кг. Выявлена дозозависимость фармакологических эффектов препарата Респикам®.
Влияние препарата Респикам® на выживаемость животных изучалось в первые сутки после моделирования ОРДС и в последующие 7 суток наблюдения.
При введении препарата Респикам® в дозе 60 мг/кг гибель животных наблюдалась на 1-е, 2-е и 3-и сутки после моделирования ОРДС. На 1-е сутки погибло 5 мышей, на 2-е – 2 мыши и на 3-и – 1 мышь (Пример 1, табл. 3).
При введении препарата Респикам® в дозе 120 мг/кг гибель животных наблюдалась на 1-е, 2-е, 3-и и 5-е сутки после моделирования ОРДС. В 1-е сутки погибло 2 мыши, на 2-е – 1 мышь, на 3-и – 2 мыши и на 5-е сутки – 1 мышь (пример 1, табл. 3).
При введении препарата Респикам® в дозе 180 мг/кг гибель животных наблюдалась на 1-е, 3-и и 6-е сутки после моделирования ОРДС. В первые сутки погибло 2 мыши, на 3-и сутки– 1 мышь и на 6-е – 1 мышь (пример 1, табл. 3).
Проведенные исследования выявили в течение 7 дней наблюдения дозозависимое повышение выживаемости животных на 60%.: ингаляционное введение ЛПС в дозе 10 мг/кг в модели ОРДС вызывает 100% гибель животных в первые сутки. Введение через 30 минут после окончания ингаляционного воздействия ЛПС препарата Респикам® вызывает линейное дозозависимое повышение выживаемости животных с наилучшими результатами при применении препарата в дозе 180 мг.кг (60%).
Также, специфическое фармакологическое действие, направленное на профилактику ОРДС, проявляется при одноразовом внутривенном введении мышам ААТ в дозах от 60 до 180 мг/кг, предшествующем ингаляции липополисахарида, вызывающего ОРДС, что приводит к повышению выживаемости животных.
Влияние препарата Респикам® на выраженность отека легких оценивалось при макроскопическом и гистологическом исследовании легких (Примеры 2 и 3), путем определения массовых коэффициентов легких; а также исследовалось влияния препарата Респикам® на профиль цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-10 ткани легких и крови животных (Пример 4)
При развитии ОРДС в легких погибших в течение суток мышей контрольной группы отмечен отек рыхлой соединительной ткани, окружающей бронхи и сопутствующие им сосуды. Продукция слизи железами и бокаловидными усилена, отмечены участки слущивания призматического эпителия слизистой оболочки бронхов. Наблюдалась диффузная инфильтрация соединительной ткани вокруг бронхов воспалительными элементами. В части альвеол отмечались скопления экссудата с примесью эритроцитов, слущенного альвеолярного эпителия. Межальвеолярные перегородки утолщены и пропитаны клеточным инфильтратом (Пример 3, Фиг. 3).
Применение исследуемого препарата в дозе 60 мг/кг снижает степень выраженности ОРДС у выживших животных через 7 суток после введения препарата. Это проявлялется в уменьшении интерстициального отека вокруг бронхов. Бронхи и мелкие бронхиолы имели открытый чистый просвет. Отмечается незначительный воспалительный инфильтрат вокруг бронхиол, участки легочной ткани с неравномерно утолщенными стенками альвеол и альвеолы, содержащие экссудат (Пример 3, Фиг.4 ).
Применение исследуемого препарата в дозе 120 мг/кг приводит к купированию проявлений ОРДС у выживших животных через 7 суток после его введения. Отсутствует интерстициальный отек вокруг бронхов и сопутствующих сосудов, бронхи и мелкие бронхиолы имели открытый чистый просвет. Встречаются единичные участки альвеол с экссудатом и утолщенными стенками, большинство имели открытый чистый просвет и тонкие стенки (Пример 3, Фиг. 8).
При применении исследуемого препарата в дозе 180 мг/кг у выживших животных через 7 суток после его введения структура ткани легких не отличается от таковой у контрольных животных. Наблюдается отсутствие перибронхиального отека, бронхи и мелкие бронхиолы имеуит открытый чистый просвет. Подавляющее большинство альвеол были расправлены, имели открытый чистый просвет и тонкие стенки (Пример 3, Фиг. 11).
Проведенные исследования выявили специфическое фармакологическое действие препарата Респикам® в отношении купирования проявлений острого респираторного синдрома: в зависимости от дозы уменьшались степень интерстициального и альвеолярного отека и выраженность воспалительного инфильтрата как внутри альвеол, так и снаружи, восстанавливалась структура стенок альвеол в течение 7 дней наблюдения, восстанавливались до начальных значений увеличенные при моделировании ОРДС массовые коэффициенты легких.
При изучении содержания цитокинов в ткани легких мышей после ингаляционного введения ЛПС в дозе 10 мг/кг через сутки выявлено повышение их уровня в ткани легкого мышей в среднем в 2 – 2,8 раз, что свидетельствует о выраженной острой воспалительной реакции на введение антигена. Введение через 30 минут после окончания ингаляционного воздействия ЛПС препарата Респикам® вызывает нелинейное дозозависимое снижение выраженности провоспалительной реакции, достоверно значимое для дозы препарата 120 мг.кг: снижение содержания ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10 в ткани легкого и ИЛ-10 в сыворотке крови (пример 4, табл. 6-8).
Настоящее изобретение демонстрирует, что ААТ может быть эффективно использован для профилактики и/или терапии острого респираторного синдрома как отдельно, так и в качестве адъювантной терапии в комбинации с применением известных способов и средств. ААТ может быть использован в качестве замены аппарата ИВЛ, что позволяет избежать угрожающих жизни осложнений ИВЛ, таких как, например, баротравма, стрессовые язвы, отеки, интерстициальная эмфизема, пневмоторакс, инфекционные осложнения.
ПРИМЕРЫ
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1 Препараты:
Тестируемый препарат
| Наименование | Респикам®, раствор для инфузий 20 мг/мл |
| Производитель | Камада Лтд., Израиль |
| Состав | 1 флакон с 50 мл раствора содержит: Активное вещество: Ингибитор альфа1-протеиназы [человеческий] (альфа1-антитрипсин) 1000 мг Вспомогательные вещества: натрия дигидрофосфата дигидрат, натрия хлорид, вода для инъекций |
Контроль
| Наименование | 0,9% раствор натрия хлорида для инъекций |
1.2 Характеристика животных и условий их содержания
Характеристика тест-системы:
- Вид – мышь домовая (Mus musculus);
- Линия – С57BL/6;
- Пол – самцы;
- Возраст на начало исследования – 8 недель;
- Масса – 18-20 г;
- Общее количество – 60;
В нормативных документах мыши рекомендуются в качестве одной из наиболее адекватных тест-систем для исследования фармакологической активности лекарственных препаратов. Количество животных, используемое в исследовании (количество в группе составило по 10 особей самцов), достаточно для полной и надежной регистрации изучаемых эффектов и статистической обработки данных (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. А.Н. Миронова. – Часть первая. — М.: Гриф и К, 2012, п.п. 6.2, С. 16).
Карантин/адаптация. Животные до начала исследования были помещены в отдельную комнату на период карантина (14 дней). Во время этого периода у животных контролировалось проявление отклонений в состоянии здоровья.
1.3 Процедура введения лекарственного средства
Респикам® и используемый в качестве контроля 0,9% раствор натрия хлорида для инъекций (ООО «Авексима Сибирь», Россия) вводили мышам внутривенно однократно.
1.4 Расчет доз лекарственного средства
При расчете доз для изучения специфического фармакологического действия на мышах учитывали следующие положения:
- максимальная терапевтическая доза препарата Респикам® согласно инструкции для медицинского применения составляет 60 мг/кг в сутки;
- максимально возможный объем лекарственного средства при внутривенном введении мышам составляет 0,5 мл согласно рекомендациям [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. – В двух частях. М.: Гриф и К, 2012].
В связи с чем были выбраны следующие экспериментальные дозы:
60 мг/кг по действующему веществу или 0,06 мл/мышь по лекарственной форме внутривенно;
120 мг/кг по действующему веществу или 0,12 мл/мышь по лекарственной форме внутривенно;
180 мг/кг по действующему веществу или 0,18 мл/мышь по лекарственной форме внутривенно.
Также препарат вводился животным в дозах 70, 80, 90, 100, 110, 130, 140, 150, 160, и 170 мг/кг.
Контрольной группе вводился 0,9% раствор натрия хлорида для инъекций (ООО «Авексима Сибирь», Россия) в объеме 0,18 мл/мышь.
1.5 Схема и методы исследования специфического фармакологического действия
1.5.1 Схема исследования
Распределение животных по группам представлено в таблице 1 и по номерам в таблице 2.
ТАБЛИЦА 1. Распределение животных по группам при исследовании специфического фармакологического действия согласно изобретению препарата Респикам®
| Номер группы | Кол-во животных в группе | Доза | Путь введения | Эвтаназия/регистрация показателей |
| 1 | 10♂ | Респикам® 60мг/кг |
Внутривенно | На 8-й день после периода наблюдения и оценки выживаемости животных |
| 2 | 10♂ | 0,9% NaCl | Внутривенно | На 8-й день после периода наблюдения и оценки выживаемости животных |
| 3 | 10♂ | ОРДС+ 0,9% NaCl |
ЛПС 10 мг/кг ингаляционно в течение 1,5 часа, 0,9% NaCl внутривенно через 30 мин после ингаляции ЛПС | На 8-й день после периода наблюдения и оценки выживаемости животных |
| 4 | 10♂ | ОРДС+ Респикам® 60 мг.мл |
ЛПС 10 мг/кг ингаляционно в течение 1,5 часа, Респикам® внутривенно через 30 мин после ингаляции ЛПС |
На 8-й день после периода наблюдения и оценки выживаемости животных |
| 5 | 10♂ | ОРДС+ Респикам® 120 мг/мл |
ЛПС 10 мг/кг ингаляционно в течение 1,5 часа, Респикам® внутривенно через 30 мин после ингаляции ЛПС |
На 8-й день после периода наблюдения и оценки выживаемости животных |
| 6 | 10♂ | ОРДС+ Респикам® 180 мг.мл |
ЛПС 10 мг/кг ингаляционно в течение 1,5 часа, Респикам® внутривенно через 30 мин после ингаляции ЛПС |
На 8-й день после периода наблюдения и оценки выживаемости животных |
Примечание:
♂ - самцы; ОРДС – модель острого респираторного дистресс-синдрома; ЛПС - липополисахарид
ТАБЛИЦА 2. Номера животных в группах при исследовании специфического фармакологического действия согласно изобретению препарата Респикам®
| №п/п | Группа животных | Номер животного |
| 1 | Респикам® 60 мг/мл | 1-10 |
| 2 | 0,9% NaCl | 11-20 |
| 3 | ОРДС+0,9% NaCl | 21-30 |
| 4 | ОРДС+Респикам® 60 мг/мл | 31-40 |
| 5 | ОРДС+Респикам® 120 мг/мл | 41-50 |
| 6 | ОРДС+Респикам® 180 мг/мл | 51-60 |
1.5.2 Методы исследования животных
1.5.2.1 Моделирование острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС)
Процедура моделирования осуществляется путем ингаляции липополисахарида (ЛПС, Escherichia coli O111:B4, Sigma) с последующим развитием острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Фатальность определяется 100% смертностью животных в первые сутки.
При моделировании ОРДС применили динамический способ воздействия, при котором создавались условия для поддержания концентрации на относительно постоянном уровне, с обеспечением необходимого воздухообмена [Kalashnikova S.A., Polyakova L.V. The use of bacterial lipopolysaccharide for pathological processes modeling on biomedical research (review). Journal of new medical technologies. 2017; 24(2):209-219. DOI:10.12737/artide_5947d50a4ddf68.91843258]. В эксперименте использовали ингаляционную (затравочную) систему оригинальной конструкции, позволяющую одномоментно разместить до 10 мелких лабораторных животных.
Система представляет собой герметичную камеру для животных. Затравочная система снабжена небулайзером с аэрозолеподатчиком, патрубками ввода в камеру и патрубками сброса из камеры, снабженные специальными дегазирующими уловителями.
Моделирующая ОРДС доза ЛПС составила 10 мг/кг при воздухоподаче 2 л/час на одно животное, с экспозицией 1 час 30 минут или 0,16 л/мин.
Через 30 мин после ингаляции ЛПС в опытных группах вводили 0,9% раствор натрия хлорида для инъекций (ООО «Авексима Сибирь», Россия) объемом 0,18 мл или препарат Респикам® в соответствующих дозах 60 мг/кг, 120 мг/кг и 180 мг/кг.
Исследуемые параметры
- Оценка выживаемости животных в первые 24 ч после моделирования ОРДС и последующие 7 дней;
- Оценка выраженности отека легких макроскопически и путем определения массовых коэффициентов легких;
- Гистологическое исследование легких.
Выживаемость. При изучении специфического фармакологического действия в первые сутки и на протяжении всего периода наблюдения ежедневно проводился учет погибших животных.
Некропсия. Погибшие животные сразу после гибели в дневное время и выжившие животные на 8-й день после введения подвергались эвтаназии с последующей некропсией. Некропсию выполняли под непосредственным наблюдением патоморфолога в соответствии с СОП ЦДИ ЦНИЛ ИФМ ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России.
Макроскопическое описание и определение массовых коэффициентов органов. Для макроскопического описания легких и определения массовых коэффициентов легких осуществлен забор ткани легких.
Массовые коэффициенты (относительную массу органа на 1 кг веса животного) определяли по формуле:
MK = (m/M) × 1000
где m – масса органа (г)
М – масса животного (г).
Гистологическое исследование. Экспериментальный материал (ткань легких) фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, затем обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин [Микроскопическая техника /под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перовой. М.: Медицина, 1996. – 544 с.]. Парафиновые срезы толщиной 7 мкм получали на микротоме SM 2000R (Leica, Германия), окрашивали гематоксилином и эозином и рассматривали с помощью микроскопа DM1000 (Leica, Германия). Видеоизображения получали с помощью видеокамеры DFC290 (Leica, Германия) согласно СОП ЦДИ ЦНИЛ ИФМ ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России.
Морфометрический анализ гистологических срезов легких мышей проводился путем наложения на изображение поля зрения в стандартном увеличении сетки с фиксированным размером ячеек.
Отбор сыворотки крови и ткани легкого для оценки содержания цитокинов
Для проведения ИФА исследования кровь отбирали до первого моделирования ОРДС у всех животных, у погибших животных, у которых была проведена некропсия и у выживших животных на 8-й день эксперимента. Сыворотку крови в объеме 0,5 мл и гомогенат ткани легких хранили при температуре -70oС до оценки профиля цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-10) методом ИФА.
1.6 Статистический анализ данных
Статистическая обработка результатов исследования осуществлялась согласно Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Миронова – М: Медицина, 2012. - В 2-х томах.
Полученные результаты были обработаны с помощью пакета прикладных программ Statistica 10. Описательная статистика включала среднее значение (M), среднеквадратичное отклонение (SD). При малых объемах выборки (n≤10) были применены непараметрические критерии: для двух независимых выборок (контроль-опыт) - критерий Манна—Уитни, в случае сравнения более двух групп – критерий Краскела-Уоллиса.
Различия между группами считались статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ПРИМЕР 1. Выживаемость животных
В группах как с введением препарата Респикам®, 60 мг/кг, так и при введении 0,9% раствор натрия хлорида для инъекций интактным животным гибели животных не наблюдалось (Таблица 3).
ТАБЛИЦА 3. Влияние препарата Респикам® на выживаемость животных при моделировании острого респираторного дистресс-синдрома
| № группы | Название группы | Всего | Погибло | Выжило | Выживаемость, % |
| 1 | Респикам® 60 мг/мл | 10 | 0 | 10 | 100 |
| 2 | 0,9% NaCl | 10 | 0 | 10 | 100 |
| 3 | ОРДС+0,9% NaCl | 10 | 10 | 0 | 0 |
| 4 | ОРДС+Респикам® 60 мг/мл |
10 | 8 | 2 | 20 |
| 5 | ОРДС+Респикам® 120 мг/мл |
10 | 6 | 4 | 40 |
| 6 | ОРДС+Респикам® 180 мг/мл |
10 | 4 | 6 | 60 |
Группа №3 (ОРДС+0,9% раствор натрия хлорида для инъекций). В группе с моделированием ОРДС 100% гибель животных отмечена уже на 1-е сутки после ингаляции ЛПС. В первую половину суток погибли 5 мышей, во вторую половину суток – оставшиеся 5 мышей. У 7 мышей после гибели была проведена некропсия и ткань легких взята для макроскопического описания, определения массовых коэффициентов органов, гистологии и определения содержания цитокинов методом ИФА.
Группа №4 (ОРДС+Респикам®, 60 мг/кг). Гибель животных наблюдалась на 1-е, 2-е и 3-и сутки после моделирования ОРДС. На 1-е сутки погибло 5 мышей, на 2-е – 2 мыши и на 3-и – 1 мышь. У 7 мышей была проведена некропсия и ткань легких взята для макроскопического описания, определения массовых коэффициентов органов, гистологии и определения содержания цитокинов методом ИФА.
Группа №5 (ОРДС+Респикам®, 120 мг/кг). Гибель животных наблюдалась на 1-е, 2-е, 3-и и 5-е сутки после моделирования ОРДС. В 1-е сутки погибло 2 мыши, на 2-е – 1 мышь, на 3-и – 2 мыши и на 5-е сутки – 1 мышь. У 2-х мышей была проведена некропсия и ткань легких взята для макроскопического описания, определения массовых коэффициентов органов, гистологии и определения содержания цитокинов методом ИФА.
Группа №6 (ОРДС+Респикам®, 180 мг/кг). Гибель животных наблюдалась на 1-е, 3-и и 6-е сутки после моделирования ОРДС. В первые сутки погибло 2 мыши, на 3-и сутки – 1 мышь и на 6-е – 1 мышь. У 2-х мышей была проведена некропсия и ткань легких взята для макроскопического описания, определения массовых коэффициентов органов, гистологии и определения содержания цитокинов методом ИФА.
ПРИМЕР 2. Макроскопическое описание
1 Макроскопическое описание легких погибших животных
В связи с тем, что макроскопическое описание легких погибших животных различных групп не отличалось, ниже приведено описание для всех групп.
1-е сутки. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, ярко-розовой окраски, полнокровные. Просвет бронхов расширен, их слизистая розоватого цвета.
3-и сутки. Легкие с очаговыми уплотнениями на ощупь, более влажные, имеются пятна ярко-бордовой окраски. Просвет бронхов расширен, их слизистая розоватого цвета.
2 Макроскопическое описание легких выживших животных
В связи с тем, что макроскопическое описание легких выживших животных различных групп не отличалось, ниже приведено описание для всех групп.
7-е сутки. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, просвет бронхов не расширен, их слизистая розоватого цвета.
3. Массовые коэффициенты легких
Массовые коэффициенты (МК) легких представлены в таблице 4. Выявлено достоверное отличие МК выживших животных в группах с лечением на 7 сутки от значений МК погибших животных в группе с моделированием ОРДС.
Таблица 4. Влияние препарата Респикам®, на массовые коэффициенты легких мышей при моделировании острого респираторного дистресс-синдрома, M±SD
| № группы | Название группы |
МК
погибших мышей |
МК
выживших мышей |
| 1 | Респикам® 1 ТД | - | 0,89±0,17* (n=10) |
| 2 | 0,9% NaCl | - | 1,01±0,11* (n=10) |
| 3 | ОРДС+0,9% NaCl | 1,13±0,17 (n=7) |
- |
| 4 | ОРДС+Респикам® 60 мг/кг |
0,96±0,25 (n=7) |
1,08±0,25 (n=2) |
| 5 | ОРДС+Респикам® 120 мг/кг |
1,20±0,12 (n=2) |
0,81±0,09* (n=4) |
| 6 | ОРДС+Респикам® 180 мг/кг |
1,1±0,2 (n=2) |
0,86±0,09* (n=6) |
*достоверность различий с группой №3 (ОРДС), р<0,05 (Манна-Уитни)
ПРИМЕР 3 Гистологические исследования
1. Гистологические исследования легких в группах с введением препарата Респикам® и 0,9% NaCl
Группа №1 (Респикам®, 60 мг/кг). После введения препарата интактным животным не выявлено каких-либо нарушений структуры легких и сосудов. В легких основное поле зрения занимали округлые, хорошо расправленные альвеолы с тонкими стенками и свободным просветом. Ядра альвеолярного эпителия четкие, цитоплазма оксифильная. Бронхиолы и бронхи выстланы кубическим и цилиндрическим эпителием, просвет их свободен (Фиг. 1).
Группа №2 (0,9% раствор натрия хлорида для инъекций). Введение 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций интактным животным не влияло на структуру легких. В легких основное поле зрения занимали округлые, хорошо расправленные альвеолы с тонкими стенками и свободным просветом. Ядра альвеолярного эпителия четкие, цитоплазма оксифильная. Бронхиолы и бронхи выстланы кубическим и цилиндрическим эпителием, просвет их свободен (Фиг. 2).
2. Гистологические исследования легких в группе с моделированием ОРДС
Группа №3 (острый респираторный дистресс-синдром + 0,9% раствор натрия хлорида для инъекций). При развитии ОРДС в легких погибших в течение суток мышей отмечен отек рыхлой соединительной ткани, окружающей бронхи и сопутствующие им сосуды. Продукция слизи железами и бокаловидными усилена, отмечены участки слущивания призматического эпителия слизистой оболочки бронхов. Наблюдалась диффузная инфильтрация соединительной ткани вокруг бронхов воспалительными элементами. В части альвеол отмечались скопления экссудата с примесью эритроцитов, слущенного альвеолярного эпителия. Межальвеолярные перегородки утолщены и пропитаны клеточным инфильтратом (Фиг. 3).
3. Гистологические исследования легких в группе с коррекцией ОРДС препаратом Респикам®
Группа №4 (ОРДС+Респикам®, 60 мг/кг) – выжившие животные. Применение исследуемого препарата в дозе 60 мг/кг снижало степень выраженности ОРДС у выживших животных через 7 суток после введения препарата. Это проявлялось в уменьшении интерстициального отека вокруг бронхов. Бронхи и мелкие бронхиолы имели открытый чистый просвет. Отмечался незначительный воспалительный инфильтрат вокруг бронхиол, участки легочной ткани с неравномерно утолщенными стенками альвеол и альвеолы, содержащие экссудат (Фиг.4 ).
Группа №4 (ОРДС+Респикам®, 60 мг/кг) – погибшие животные У животных, погибших через 1 сутки после лечения ОРДС, морфологическая картина легких не отличалась от таковой в группе с ОРДС. Отмечен отек рыхлой соединительной ткани, окружающей бронхи и сопутствующие им сосуды. Продукция слизи железами и бокаловидными клетками резко усиливается; покровный призматический эпителий слизистой оболочки местами слущивается. Наблюдается диффузная инфильтрация соединительной ткани вокруг бронхов лимфоидными элементами. В части альвеол отмечают скопления экссудата с примесью эритроцитов, слущенного альвеолярного эпителия. Межальвеолярные перегородки утолщены и пропитаны клеточным инфильтратом (Фиг. 5).
У животных, погибших через 2 суток после лечения, отмечен отек рыхлой соединительной ткани, окружающей бронхи и сопутствующие им сосуды. Призматический эпителий слизистой оболочки бронхов местами слущивался. Наблюдалась диффузная инфильтрация соединительной ткани вокруг бронхов лимфоидными элементами. Альвеолы заполнены экссудатом с примесью эритроцитов, слущенного альвеолярного эпителия. Межальвеолярные перегородки утолщены и пропитаны клеточным инфильтратом. Отмечены участки легочной ткани с расширением альвеолярных ходов (Фиг. 6).
У животных, погибших через 3 суток после лечения, отмечен отек рыхлой соединительной ткани, окружающей бронхи и сопутствующие им сосуды. Продукция слизи железами и бокаловидными клетками резко усиливается; покровный призматический эпителий слизистой оболочки местами слущивался. Наблюдалась диффузная инфильтрация соединительной ткани вокруг бронхов лимфоидными элементами. Альвеолы и бронхи заполнены экссудатом с примесью слизи и эритроцитов, слущенного альвеолярного эпителия. Межальвеолярные перегородки утолщены и пропитаны клеточным инфильтратом. Отмечены участки легочной ткани с расширением альвеолярных ходов, а также деструкция межальвеолярных перегородок (Фиг.7).
Группа №5 (ОРДС+Респикам®, 120 мг/кг) – выжившие животные. Применение исследуемого препарата в дозе 120мг/кг приводило к купированию проявлений ОРДС у выживших животных через 7 суток после его введения. Отсутствовал интерстициальный отек вокруг бронхов и сопутствующих сосудов, бронхи и мелкие бронхиолы имели открытый чистый просвет. Встречались единичные участки альвеол с экссудатом и утолщенными стенками, большинство имели открытый чистый просвет и тонкие стенки (Фиг. 8).
Группа №5 (ОРДС+Респикам®, 120 мг/кг) – погибшие животные. У животных, погибших через 1 сутки после лечения, морфологическая картина легких не отличалась от таковой в группе с ОРДС, отмечен отек рыхлой соединительной ткани, окружающей бронхи и сопутствующие им сосуды. Продукция слизи железами и бокаловидными клетками резко усиливалась; покровный призматический эпителий слизистой оболочки слущивался. Наблюдалась диффузная инфильтрация соединительной ткани вокруг бронхов лимфоидными элементами. В части альвеол отмечали скопления экссудата с примесью, эритроцитов, слущенного альвеолярного эпителия (Фиг. 9).
У животных, погибших через 3 суток после лечения, отмечен отек рыхлой соединительной ткани, окружающей бронхи и сопутствующие им сосуды, покровный призматический эпителий слизистой оболочки бронхов местами слущивался. Местами наблюдалась диффузная инфильтрация соединительной ткани вокруг бронхов лимфоидными элементами. Некоторые альвеолы заполнены экссудатом с примесью эритроцитов, слущенного альвеолярного эпителия. Межальвеолярные перегородки утолщены и пропитаны клеточным инфильтратом. Местами отмечалась деструкция межальвеолярных перегородок (Фиг. 10).
Группа №6 (ОРДС+Респикам®, 180 мг/кг) – выжившие животные. При применении исследуемого препарата в дозе 180 мг/кг у выживших животных через 7 суток после его введения структура ткани легких не отличалась от таковой у контрольных животных. Наблюдалось отсутствие перибронхиального отека, бронхи и мелкие бронхиолы имели открытый чистый просвет. Подавляющее большинство альвеол были расправлены, имели открытый чистый просвет и тонкие стенки (Фиг. 11).
Группа №6 (ОРДС+Респикам®, 180 мг/кг) – погибшие животные. У животных, погибших через 1 сутки после лечения, морфологическая картина легких не отличалась от таковой в группе с ОРДС. Отмечен отек рыхлой соединительной ткани, окружающей бронхи и сопутствующие им сосуды. Продукция слизи железами и бокаловидными клетками усиливалась; покровный призматический эпителий слизистой оболочки местами слущивался. Наблюдалась диффузная инфильтрация соединительной ткани вокруг бронхов лимфоидными элементами. В части альвеол отмечали скопление экссудата с примесью эритроцитов, слущенного альвеолярного эпителия. Межальвеолярные перегородки утолщены и пропитаны клеточным инфильтратом (Фиг. 12).
Морфометрические данные гистологической оценки состояния легких представлены в Таблице 5.
ТАБЛИЦА 5. Влияние препарата Респикам®, на морфометрические показатели легких выживших животных при моделировании острого респираторного дистресс-синдрома, M±SEM
| № группы | Название группы |
Плотность альвеолита, %
утолщение стенок без экссудата/ утолщение стенок с экссудатом |
||
| погибшие | выжившие | |||
| 1-е сутки | 3-и сутки | 7-е сутки | ||
| 1 | Респикам® 60 мг/мл |
Нет данных | Нет данных | 0 (n=10) |
| 2 | 0,9% NaCl | Нет данных | Нет данных | 0 (n=10) |
| 3 | ОРДС+0,9% NaCl | 50,16±1,66/ 25,85±0,98 (nm=7; nf=35) |
Нет данных | Нет данных |
| 4 | ОРДС+Респикам® 60 мг.мл |
50,92±2,23/ 25,14±1,39 (n=5; nf=25) |
10,16±2,05*а/ 75,24±5,78*а (nm=1; nf=5) |
5,24±0,89*/ 20,16±1,76*а (nm=2; nf=10) |
| 5 | ОРДС+Респикам® 120 мг/мл | 50,79±4,84/ 25,08±2,15 (nm=1; nf=5) |
10,48±1,56#/ 74,92±5,84# (nm=1; nf=5) |
5,16±0,54/ 5,00±0,60# (nm=4; nf=20) |
| 6 | ОРДС+Респикам® 180 мг.мл |
50,32±3,60/ 24,92±2,10 (nm=2; nf=10) |
Нет данных | 4,02±0,44*# а / 1,38±0,22*# а (nm=6; nf=30) |
Примечание : *-достоверность различий с группой №3; # - достоверность различий с группой №4; а - достоверность различий с группой №5 (критерий Манна -Уитни); nm – количество животных; nf – количество полей зрения.
Таким образом, морфологическое исследование структуры легких с экспериментальным острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС) и его лечением с помощью препарата Респикам® выявило следующее;
При моделировании ОРДС путем ингаляции в затравочной камере ЛПС 10 мг/кг в легких обнаружено выраженное нарушение их структуры: интерстициальный отек, локализованный в перибронхиальной области и вокруг сопутствующих сосудов, диффузный воспалительный инфильтрат в этой области. Отмечается утолщение альвелоярных перегородок, пропитывание их экссудатом, который выявляется и в просвете альвеол, частично их заполняя.
При лечении в зависимости от дозы препарата Респикам® в каждой из опытных групп наблюдалась гибель животных, максимально в группе с применением препарата в 60 мг/кг и минимально при применении препарата в дозе 180 мг.кг. При этом морфологическая картина легких погибших животных была сходной у всех групп и зависела от периода наступления гибели после лечения, но не от дозы препарата.
Через 1 сутки после лечения препаратом у погибших животных морфологическая картина в легких не отличалась от таковой в группе с ОРДС. Выявлен интерстициальный отек как в перибронхиальной зоне, так и в стенках альвеол, диффузный инфильтрат в перибронхиальной зоне, частично выявлен экссудат в альвеолах. Через 2 и 3 суток в группах с лечением препаратом у погибших животных в легких прогрессировали нарушения структуры, связанные с ОРДС. Вся ткань легких была пропитана экссудатом, межальвеолярные перегородки утолщены, отмечены участки деструкци межальвеолярных перегородок. Продукция слизи клетками эпителия бронхов усилена, отмечалось его частичное слущивание. Наблюдалась диффузная инфильтрация соединительной ткани вокруг бронхов лимфоидными элементами. Выявленные изменения свидетельствовали о следующей стадии развития ОРДС – воспаления легких.
У выживших животных в группах с лечением препаратом, легкие которых были изучены через 7 суток после лечения, отмечен дозозависимый эффект лечения. При лечении препаратом Респикам® в дозе 60 мг/кг уменьшалась степень интерстициального отека вокруг бронхов и выраженность воспалительного инфильтрата. Бронхи и мелкие бронхиолы имели открытый чистый просвет. Наблюдались лишь участки легочной ткани с неравномерно утолщенными стенками альвеол и альвеолы, содержащие экссудат. При лечении препаратом Респикам® в дозах 120 мг/кг и 180 мг/кг структура ткани легких не отличалась от таковой у контрольных животных. Наблюдалось отсутствие перибронхиального отека, бронхи и мелкие бронхиолы имели открытый чистый просвет. Альвеолы расправлены, с чистым просветом и тонкими стенками.
Выявленные корригирующие свойства препарата Респикам® позволяют сделать вывод о наличии специфического фармакологического действия у препарата в отношении купирования проявлений острого респираторного дистресс-синдрома: в зависимости от дозы уменьшается степень интерстициального и альвеолярного отека и выраженность воспалительного инфильтрата как внутри альвеол, так и снаружи, восстанавливается структура стенок альвеол в течение 7 дней наблюдения.
ПРИМЕР 4. Иммунохимические исследования
Влияние препарата на содержание цитокинов в ткани легких представлено в таблице 6. Для статистического анализа взяты данные как умерших, так и выживших животных. Индивидуальные данные содержания интерлейкинов в ткани легких представлены в таблице 7.
ТАБЛИЦА 6. Влияние препарата Респикам® на содержание интерлейкинов в ткани легких умерших и выживших животных при моделировании острого респираторного дистресс-синдрома, M±SD
| №п/п | Название группы | ИЛ-1β, пг/мл | ИЛ-6, пг/мл | ИЛ-10, пг/мл |
| 1 | Респикам® 1 ТД, n=10 |
72,5±16,6 | 59,9±21,7 | 97,5±15,9 |
| 2 | 0,9% NaCl, n=10 |
99,8±23,6 | 77,5±15,2 | 133,2±37,2 |
| 3 | ОРДС+0,9% NaCl, n=7 |
279,4±16,3* | 132,8±20,4* | 319,7±107,7* |
| 4 | ОРДС+Респикам® 60 мг/кг , n=9 |
222,8±33,6* | 141,6±12,9* | 755,6±415,1* |
| 5 | ОРДС+Респикам® 120 мг/кг, n=6 |
168,7±35,8*# | 111,9±25,1*# | 206,0±41,4* |
| 6 | ОРДС+Респикам® 180 мг/кг, n=8 |
261,9 ±46,9* | 172,0 ±34,2* | 270,8±46,9* |
Примечание: *-достоверность различий с группой №2, р<0,05; # - достоверность различий с группой №3 р<0,05 (критерий Манна-Уитни)
ТАБЛИЦА 7. Индивидуальные данные содержания интерлейкинов в ткани легких умерших и выживших животных при моделировании острого респираторного дистресс-синдрома
Влияние препарата на содержание цитокина ИЛ-10 в сыворотке крови выживших животных при моделировании острого респираторного дистресс-синдрома представлено в Таблице 8.
ТАБЛИЦА 8. Влияние препарата Респикам® на содержание интерлейкина ИЛ-10 в сыворотке крови выживших животных при моделировании фатального острого респираторного дистресс-синдрома, M±SD
| №п/п | Название группы | ИЛ-10, пг/мл |
| 1 | Респикам® 60 мг/кг, n=10 | 11,87±0,45 |
| 2 | 0,9% NaCl, n=10 | 18,80 ±1,7 |
| 3 | ОРДС+Респикам® 60 мг/кг, n=2 | 29,80±1,41* |
| 4 | ОРДС+Респикам® 120 мг/кг, n=4 | 18,68±5,41# |
| 5 | ОРДС+Респикам® 180 мг/кг, n=6 | 12,30±6,76# |
Примечание: *-достоверность различий с группой №2, р<0,05; # - достоверность различий с группой №3 р<0,05 (критерий Манна-Уитни)
Таким образом, результаты изучения цитокинов в ткани легких и сыворотки крови мышей выявили следующие особенности:
- Ингаляционное введение ЛПС в дозе 10 мг/кг через сутки вызывает повышение уровня вызывающих воспаление и противовоспалительных цитокинов в ткани легкого мышей в среднем в 2 – 2,8 раз, что свидетельствует о выраженной острой воспалительной реакции на введение антигена;
- Введение через 30 минут после окончания ингаляционного воздействия ЛПС препарата Респикам® вызывает дозозависимое снижение выраженности провоспалительной реакции в ткани легкого, достоверно значимое для дозы препарата 120 мг.кг: снижение содержания ИЛ-1β и ИЛ-6 при тенденции к снижению значения противовоспалительного цитокина ИЛ-10 относительно высокого уровня при развитии ОРДС;
- Содержание противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в сыворотке крови мышей достоверно повышалось при введении препарата Респикам® в дозе 60 мг/кг на фоне развития ОРДС, при увеличении дозы препарата уровень цитокина ИЛ-10 возвращался к значениям контрольных групп Респикам® 60 мг/кг и 0,9% раствора NaCl.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Микроскопическая техника /под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перовой. М.: Медицина, 1996. – 544 с.
2. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. – В двух частях. М.: Гриф и К, 2012.
3. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Восьмое издание /пер. с англ. Под ред. И.В. Белозерцевой, Д.В. Блинова, М.С. Красильщиковой-М.: ИРБИС, 2017. - 336 с.
4. Справочник. Физиологические, биохимические и биометрические показатели нормы экспериментальных животных. СПБ.: Изд-во «ЛЕМА», 2013. - 116 с.
5. Kalashnikova S.A., Polyakova L.V. The use of bacterial lipopolysaccharide for pathological processes modeling on biomedical research (review). Journal of new medical technologies. 2017; 24(2):209-219. DOI:10.12737/artide_5947d50a4ddf68.91843258.
6. Shekunova EV, Kovaleva MA, Makarova MN, Makarov VG. Dose selection in preclinical studies: cross-species dose conversion. Vedomosti Nauchnogo tsentra ekspertizy sredstv meditsinskogo primeneniya. Тhе Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products. 2020; 10(1):19–28. doi.org/10.30895/1991-2919-2020-10-1-19-28
1. Применение ААТ для профилактики и/или лечения острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), при которых ААТ вводят пациентам в количестве от 60 до 180 мг/кг однократно внутривенно.
2. Применение ААТ по п.1, при котором состояния, способствующие развитию ОРДС, включают состояния легочного или внелегочного происхождения, например пневмонию, сепсис, вдыхание содержимого желудка, ушиб легкого, некардиогенный шок, ингаляционное повреждение, обширную трансфузию, легочный васкулит, множественные травмы, наркотические и токсические вещества или ожог.
3. Применение ААТ по любому из пп. 1, 2, при котором состояния, способствующие развитию ОРДС, относятся к вирусной или бактериальной пневмонии.
4. Применение ААТ по п. 3, при котором вирусные инфекции включают вирусы гриппа (например, типов А, В, С), ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы, пикорнавирусы и др.
5. Способ профилактики и/или лечения острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), включающий введение ААТ пациенту с ОРДС или имеющему риск развития ОРДС в количестве от 60 до 180 мг/кг однократно внутривенно.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что состояния, способствующие развитию ОРДС, включают состояния легочного или внелегочного происхождения, например пневмонию, сепсис, вдыхание содержимого желудка, ушиб легкого, некардиогенный шок, ингаляционное повреждение, обширную трансфузию, легочный васкулит, множественные травмы, наркотические и токсические вещества, или ожог.
7. Способ по любому из пп. 5, 6, отличающийся тем, что состояния, способствующие развитию ОРДС, относятся к вирусной или бактериальной пневмонии.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что вирусные инфекции включают вирусы гриппа (например, типов А, В, С), ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы, пикорнавирусы и др.
