Способ деструкции нуклеокапсида бактериофага м.п. покровской

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу деструкции нуклеокапсида бактериофага М.П. Покровской. Способ деструкции нуклеокапсида бактериофага М.П. Покровской включает приготовление средства для осуществления предлагаемого способа, включающего препарат Скай-форс, растворенный в дистиллированной воде в концентрации 100 мкг Скай-форс на 1 мл дистиллированной воды; приготовление суспензии бактериофага М.П. Покровской на изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации 1×10⁹ фаговых частиц в 1 мл; внесение приготовленной суспензии бактериофага во флакон с раствором препарата Скай-форс с таким расчетом, чтобы концентрация фаговых частиц в реакционной смеси составляла 1×10⁸ в 1 мл, а концентрация препарата Скай-форс составляла 100 мкг в 1 мл; отбор проб реакционной смеси с разрушенными фаговыми частицами через 10-20 мин и исследование ее с помощью устройств электронной микроскопии. Вышеописанный способ позволяет эффективно проводить деструкцию нуклеокапсида бактериофага М.П. Покровской. 2 пр., 3 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, инфектологии, экспериментальной микробиологии и вирусологии и может быть использовано для оценки возможности применения наноструктурного препарата Скай-форс для лечения коронавирусной инфекции и разработки схемы его применения в качестве препарата первого выбора.

Микроорганизмы занимали и продолжают занимать ведущее место среди потенциально опасных для людей факторов внешней среды, к которым с января 2020 г. относится коронавирус, вызвавший инфекционное заболевание, признанное пандемией [Воробьев А.А., Гинцбург А.Л., Бондаренко В.М. Мир микробов // Вестник РАМН. – 2000. - №11. – С. 11-14; Воробьев А.А. Современные проблемы микробиологической безопасности . – 2002. – №10. – С. 9-12; Супотницкий М.В. Новый коронавирус SARS-CoV-2 в аспекте глобальной эпидемиологии коронавирусной инфекции //Вестник войск РХБ защиты 2020. – Т. 4, №1. – С. 32-65]. В начале XXI века смертность от инфекционных болезней составляла 25 % от всех смертей в мире. Ежегодно инфекционные болезни уносят более 13 млн жизней, причем каждый час в мире от них умирает 1500 человек. От 60 до 80 % смертей регистрируется от так называемых «неуправляемых инфекций», к которым до сентября 2020 г. виду отсутствия вакцины относилась коронавирусная инфекция.

Генеральный директор Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) Тедрос Адханом Гебрейесус 30 января 2020 г. объявил международную чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения (пандемию) из-за глобальной вспышки инфекционного заболевания, вызванного коронавирусом COVID-19), а советник ВОЗ Айру Лонджини выразился предельно конкретно: при неблагоприятном стечении обстоятельств две трети жителей Земли могут заразиться коронавирусом [В ВОЗ допустили заражение коронавирусом двух третей жителей Земли. http: //yandex.ru/news/ V_VOZ_dopustili_zarazhenie_koronavirusom_dvukh_tretej_zhitelej_Zemli].

Коронавирус COVID-19 жестко и надолго изменил нашу реальность. Борьба с пандемией – это война, которую каждый народ и каждое государство ведет по-своему. В ряде стран реакция на коронавирус носит чрезмерный и саморазрушительный характер, когда главы государств из страха перед болезнью фактически обрекают граждан на смерть от голода. Вирусолог Иан Маккей, профессор Университета Квисленда в интервью газете Daily Mail в конце февраля 2020 г. заявил, что новый коронавирус вряд ли когда-нибудь удастся победить полностью. Поэтому коронавирусом переболеют абсолютно все в мире. Ученый подчеркнул, что, вероятно, вирус станет тем, что мы называем эндемичной инфекцией (т.е. пребывающей в определенной местности). По данным на декабрь 2020 г., коронавирус выявили у каждого 150-го жителя Земли [https://news.mail.ru].

Коронавирусы (Coronaviridae) – семейство вирусов, включающее на май 2020 г. 43 вида РНК-содержащих вирусов, объединенных в два подсемейства, которые поражают млекопитающих, включая человека, птиц и земноводных [Щелканов М. Ю., Попова А. Ю., Дедков В. Г., Акимкин В. Г., Малеев В. В. История изучения и современная классификация коронавирусов (Nidovirales: Coronaviridae) // Инфекция и иммунитет. – 2020. – Т. 10, № 2. – С. 221-246]. Название связано со строением вируса, шиповидные отростки которого напоминают солнечную корону. Известно 7 видов коронавирусов, поражающих человекаhttps://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D0%BE%D1%80%D0%BE%D0%BD%D0%B0%D0%B2%D0%B8%D1%80%D1%83%D1%81%D1%8B - cite_note-5: HCoV-229E – Alphacoronavirus, впервые выявлен в середине 1960-х годов; HCoV-NL63 – Alphacoronavirus, возбудитель был выявлен в Нидерландах в 2004 году; HCoV-OC43 – Betacoronavirus A, возбудитель выявлен в 1967 году; HCoV-HKU1 – Betacoronavirus A, возбудитель обнаружен в Гонконге в 2005 году; SARS-CoV – Betacoronavirus B, возбудитель тяжёлого острого респираторного синдрома, первый случай заболевания которым был зарегистрирован в 2002 году; MERS-CoV – Betacoronavirus C, возбудитель ближневосточного респираторного синдрома, вспышка которого произошла в 2015 году; SARS-CoV-2 – Betacoronavirus B, выявленный во второй половине 2019, вызвавший пандемию пневмонии нового типа COVID-19 и ставший сейчас всемирной проблемой, в результате чего были закрыты многие границы и введены экстренные меры безопасности [Пульмонология: национальное руководство. Под ред. А.Г. Чучалина. М.: ГЭОТАР-Мед., 2018. – 800 с.; Широбоков В. П. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. – Винница: Нова Книга, 2015. – С. 504-505].

Коронавирус представляет собой сферические частицы размером 80-120 нм в диаметре [Xintian X., Ping C., Jingfang W., Jiannan F., Hui Z. Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission // SCIENCE CHINA Life Sciences. – 2020-01-21. – ISSN 1869-1889. – doi:10.1007/s11427-020-1637-5; Стасевич К. Жизнь и устройство коронавирусов  // Наука и жизнь. – 2020. – № 4. – C. 8 -13]. Частицы коронавируса содержат позитивно-смысловую одноцепочечную РНК протяженностью 27-32 тысяч пар нуклеотидов, образующую нуклеокапсид (вирион). В свою очередь нуклеокапсид окружен белковой оболочкой, от которой отходят булавовидные шиповидные отростки, предназначенные для взаимодействия с трансмембранными рецепторами клеток-мишеней. При электронной микроскопии у коронавирусов наблюдается характерная морфология: далеко отстоящие друг от друга шаровидные отростки, образующие вокруг вирусных частиц «корону» (см. Фиг. 1).

После проникновения в клетку коронавирус с помощью внутриклеточных мембран создаёт мембранные пузырьки, к которым прикрепляются специальные белковые комплексы. В этих комплексах синтезируется копия геномной РНК вируса и короткие мРНК для синтеза белков вируса. Цикл репликации коронавируса состоит из несколько этапов: прикрепление к поверхности и проникновение в клетку, трансляция вирусной РНК-репликазы, транскрипция и репликация генома, трансляция структурных белков, сборка и высвобождение вирионов. После выхода вирионов из клетки она погибает [Virus metadata repository: version May 1, 2020. MSL35 // International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). - 2020; Thiel V. (editor). Coronaviruses: molecular and cellular biology. - 1st. - Caister Academic Press, 2007. - ISBN 978-1-904455-16-5]. Синтезированные de novo вирусные частицы способны поражать здоровые клетки и ткани инфицированного организма человека и животного.

Важно подчеркнуть, что с помощью ряда превентивных мер можно предотвратить распространение инфекционных болезней, включая коронавирусную инфекцию, а также купировать развитие инфекционного процесса в организме конкретного пациента. К числу таких превентивных мер следует отнести осуществление планомерных и целенаправленных мероприятий, являющихся необходимым условием обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в масштабах страны и минимизации ущерба в результате развития эпидемического процесса. Ведущая роль в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия страны отводится экстренной и специфической профилактике, а также дезинфекции как эффективному средству снижения инфекционной заболеваемости [Шандала М.Г. Новые дезинфектологические технологии для профилактики инфекционных болезней // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2006. – №4. – С.15-17]. Таким образом, противоэпидемические, санитарно-гигиенические и лечебно-профилактические мероприятия, взятые в комплексе, решают триединую задачу и в итоге способны остановить распространение коронавирусной инфекции. Но если противоэпидемические, в том числе дезинфекционные мероприятия, наряду с санитарно-гигиеническими мероприятиями, достаточно глубоко разработаны и являются классическими, которые применимы с определенными дополнениями при любых инфекциях, то коронавирусная инфекция, являясь уникальной, требует нестандартного подхода. До недавнего времени вакцинопрофилактики коронавирусной инфекции не существовало, а при лечении использовали обычные противовирусные препараты в различных сочетаниях с другими средствами терапии. 11 августа 2020 г. Минздрав Российской Федерации зарегистрировал первую в мире вакцину для профилактики коронавирусной инфекции, разработанную учеными и специалистами НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, 48 ЦНИИ Минобороны России, производимую совместно с Российским фондом прямых инвестиций (РФПИ). Вакцина, названная «Спутник V», создана за две недели: работа началась в феврале. Специалисты использовали вирус-носитель (аденовирус человека), который доставляет в организм человека генетическую информацию коронавируса и вызывает иммунный ответ на него. Как пояснил замдиректора НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи по научной работе член-корреспондент РАН Д. Ю. Логунов, при разработке вакцины были использованы имеющиеся наработки по созданию такого рода вакцины против вируса лихорадки Эбола. Вакцинация населения России вакциной «Спутник V» началась в декабре 2020 г.

22 августа 2020 г. СМИ распространили сообщение о том, что Минздрав России выдал разрешение на клиническое исследование вакцины от коронавируса, разработанной в Федеральном научном центре исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН. Об этом сообщил Гендиректор центра член-корреспондент РАН А.А. Ишмухаметов [Центру им. Чумакова разрешили клинические исследования вакцины от коронавируса. https://iz.ru/1063677/22.09.2020/tsentru-im-chumakova–rasreshili-klinicheskie-issledovania-vartciny-ot-covid-19]. 17 сентября 2020 г. представитель ФБУН ГНЦ «Вектор» в Новосибирске заведующий отделом зоонозных инфекций и гриппа А.Б. Рыжиков сообщил о завершении первой фазы исследований вакцины против коронавируса: на данном этапе клинических испытаний доказана ее безопасность [Разработчик вакцины рассказал, как правильно прививаться. http://vestinn.ru/news/society/157980/]. Специалистами Института экспериментальной медицины в Санкт-Петербурге также создана вакцина от COVID-19, но в виде кисломолочного продукта. При этом было установлено образование антител к коронавирусу, которые были обнаружены как в крови подопытных животных, так и на слизистых оболочках [РИА Новости. Вакцину от COVID-19 в виде йогурта успешно испытали на животных. http://news.mail.ru]. В арсенале средств иммунопрофилактики коронавируса имеется также вакцина Pfizer/BioNTech, совместная разработка ученых Германии и США, производимая в Бельгии, однако проведенные исследования вакцины вызвали настороженность как у ученых, так и у медиков, поскольку в ходе ее апробации умерли шесть участников исследования [Известия. Шесть человек умерли в ходе исследования вакцины Pfizer/BioNTech. Известия/https://news.mail.ru/incident/44474850/? Frommail=1].

Следует особо отметить, что изменчивость коронавируса такова, что иммунитет, выработанный организмом по завершении инфекционного процесса, не успевает за изменением вируса и, как следствие, заболевание возникает повторно. Коронаврус в результате мутаций научился «обходить» антитела организма. Именно поэтому директор программы ВОЗ по чрезвычайным ситуациям Майкл Райан на сессии Генассамблеи ООН доложил, что вакцинация от коронавируса поможет остановить пандемию только в сочетании со всеми действующими противоэпидемическими мерами [В ВОЗ исключили возможность искоренить COVID-1:9 только вакцинацией. http://rbc.ru/rbcfree news/5fcae6cf9a794726af9fd cee?utm_source=yandex&utm_medium=desktop].

Из триады мероприятий по противодействию распространения коронавирусной инфекции наиболее проблемными являются лечебно-профилактические. Лечение коронавирусной инфекции чаще всего симптоматическое. Кислородная терапия представляет собой основной терапевтический способ лечения пациентов с тяжелым течением коронавируса. В комплексном лечении рекомендуется избегать неселективного или ненадлежащего применения антибиотиков. В качестве противовирусного лечения предложена комбинация из альфа-интерферона и лопинавир/ритонавира (является ингибитором ВИЧ-1 и ВИЧ-2 протеазы/ингибитора аспаратилпротеаз ВИЧ-1 И ВИЧ-2). Доклинические исследования показали, что нуклеозидный аналог ремдесевир–ингибитор РНК-полимеразы может быть использован для профилактики и лечения коронавируса. Предложен антивирусный препарат триазавирин. В журнале Nature Microbiology опубликованы результаты исследований специалистов Университета в Джорджии, США [Найден препарат, быстро блокирующий передачу коронавируса. https://news.mail.ru/imcident/44421303/?frommail=1]. Указывается, что противовирусный препарат, названный молнуправир (4482/EIDD-2801), обладает противовирусным действием в отношении РНК-содержащих вирусов: применение препарата на ранней стадии заболевания якобы прерывает его переход в тяжелую форму. Наличие большого количества препаратов, обладающих вообще противовирусной активностью, ставит в затруднительное положение врачей, призванных на борьбу с коронавирусом и определяющих тактику лечения больных. Кроме того, практический опыт врачей инфекционистов свидетельствует о том, что существующие препараты не одинаково эффективны на разных стадиях заболевания, а некоторые их них обладают существенными побочными действиями, о чем даже предупреждают под расписку больных. Таким образом, налицо явное отсутствие в практике инфекционистов эффективного противокоронавирусного препарата, который непосредственно в организме инфицированного пациента воздействовал бы на вирусные частицы, нарушая их целостность и предупреждая поражение здоровых клеток и тканей организма, и тем самым прерывал бы течение инфекционного процесса.

Пандемия коронавируса стимулировала научные исследования в направлении создания препарата против COVID-19. Известен представляющий определенный научный и исторический интерес способ очистки рекомбинантных аденовирусов млекопитающих и человека [Патент RU 2465327 С1; С12N 7/02, C12R 1/93; заявка №2011123472/10 от 09.06.2011, опубл. 27.10.2012 г. в Бюл. № 30]. Культура клеток линии НЕК-293, в которых размножается аденовирус, разрушается путем перемораживания с последующей очисткой и осаждением рекомбинантных аденовирусов, выделением нуклеиновых кислот. Способ разрушения капсида и молекул нуклеокапсидного белка N аденовируса выполняется только in vitro в лабораторных условиях.

Опубликована гипотеза двух анонимных студентов химического факультета Уральского государственного университета с указанием их электронной почты [Разрушение капсидной оболочки вирусов. ИнтерЛабСервис. https://molbiol.ru/ forums/index.php?showtopic=21333]. Суть гипотезы состоит в том, что с помощью специально подобранных молекул-катализаторов, введенных в организм млекопитающих, осуществляется разрушение аминокислот, входящих в состав белков капсида вирусов, и это, по мнению авторов гипотезы, должно привести к разрушению самих вирусных частиц. Идея разрушения капсида вирусов in vivo (т.е. в инфицированном живом организме) хороша, но неосуществима ввиду неизвестного характера взаимодействия молекул катализатора (-ов) с тканями живого организма. Кроме того, процесс подбора катализатора представляется трудоемким, длительным, с неочевидным итогом.

Для лечения острых легочных и респираторных заболеваний и подавления антигенного процесса предложена малая интерферирующая рибонуклеиновая кислота (ми-РНК) для перорального введения [Патент RU 2487716 C2; А61К 31/7088, С12N 15/11; заявка №2010113514/10 от 04.09.2008, опубл. 20.07.2013 г. в Бюл. № 20].

Известно комплексное лекарственное средство для лечения бактериальных инфекций, в том числе атипичных пневмоний различной этиологии, которое содержит антитела к гамма интерферону человека и к CD₄-рецептору, а также активированную потенцированную форму антител к гистамину [Патент RU 2502521 C2; A61Р 31/32, А61К 39/00; заявка № 2010133050/15 от 06.08.2010, опубл. 27.12.2013 г. в Бюл. № 36].

Несмотря на свою научную информативность, имеющиеся запатентованные средства не вошли в арсенал перспективных и не применяются при лечении инфекционных болезней. Очевидно, что любое предлагаемое средство должно быть апробировано in vitro и in vivo, т.е. на экспериментальных животных, в том числе инфицированных коронавирусом. С точки зрения реализации идеи использования антивирусных препаратов для лечения коронавирусной инфекции большое значение имеют экспериментальные данные, в ходе которых важно получить обнадеживающие положительные результаты. В этой связи необходимо отметить, что для решения проблемы терапии различных инфекционных болезней много внимания во всех странах уделяется моделированию бактериальных инфекций на лабораторных животных, в ходе которого может быть оценена эффективность разработанных средств при различных курсах и способах их введения. К сожалению, экспериментальной модели коронавирусной инфекции не существует. И этот факт необходимо учитывать, рассматривая те или иные предложения, гипотезы или практические результаты, которые могут содействовать продвижению в направлении лечения и профилактики коронавирусной инфекции. Отсутствие адекватной модели коронавирусной инфекции для проведения лабораторных исследований диктует необходимость применения несколько иного подхода к рассмотрению проблемы, а именно использовать данные, полученные ветеринарами при лечении сельскохозяйственных животных, болеющих вирусными инфекциями в естественных условиях, которых лечили теми или иными препаратами и получили в итоге положительные результаты с полным выздоровлением животных. Такие благоприятные исходы при антивирусной терапии сельскохозяйственных животных должны послужить стимулом проведения углубленных исследований самих антивирусных препаратов на инфицированных COVID-19 людях. При этом нужно не забывать о высокой патогенности, включая высокую контагиозность и инвазивность, вируса COVID-19, что обязывает проводить все эксперименты с вирусом только в специальных лицензированных лабораториях, исключающих инфицирование экспериментатора. Выходом из такой сложной ситуации является проведение экспериментов с вирусами бактерий (бактериофагов), имеющих структуру вирусных частиц, аналогичную таковой у коронавируса. Вирус бактерий (бактериофаг) впервые обнаружил в 1915 г. английский бактериолог Фредерик Туорт и описал в статье «Sur un microbe invisible antagoniste des bacilles dysenteriques» [d^, Herelles F. //Comptes rendus Acad Sci Paris: magazine. – 1917. – Vol. 165. – P.373-375]. Бактериофаги - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего они размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис.

Типичная частица вируса бактерий (вирион) состоит из головки и хвоста, который отсутствует у ряда бактериофагов. В головке вириона содержится генетический материал – одноцепочечная или двухцепочечная РНК или ДНК с ферментом транскриптазой в неактивном состоянии, окруженная белковой или липопротеиновой оболочкой (капсидом). Нуклеиновая кислота вместе с капсидом составляют нуклеокапсид вируса бактерий. Бактериофаги, как и все вирусы, являются абсолютными внутриклеточными паразитами. Они содержат внутри капсида всю необходимую генетическую информацию для запуска собственной репродукции в соответствующем хозяине – бактериальной клетке. В зависимости от биологических особенностей одна инфицированная бактериофагом бактерия может «произвести» от десяти до нескольких сотен частиц потомства.

С учетом вышеизложенного, можно считать, что по совокупности существенных признаков наиболее близким к предполагаемому изобретению является техническое решение [Горшков Г.И., Тарасов М.Б., Хмельков Я.Т., Кравченко Э.А., Яковлева Е.Т., Тарасова Л.Б. «Способ лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней телят и поросят». Патент RU 2427366 C1; А61К 31/00, А61Р 31/04; заявка №2010100540/15 от 11.01.2010; опубл. 27.08.2011 г. в Бюл. № 24], в котором предлагается применять созданный с использованием нанотехнологий препарат Пентациклин для лечения желудочно-кишечных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии сельскохозяйственных животных. Данный препарат был синтезирован одним из первых в линейке наноструктурных препаратов (Пентациклин, Эндосупер, Рифомаст, Скай-форс). Однако свой выбор для проведения исследований мы остановили на другом представителе линейки наноструктурных препаратов, а именно на препарате Скай-форс. Изначально препарат Скай-форс был синтезирован как препарат первого выбора для практического применения в инфектологии, когда еще не установлен и не идентифицирован возбудитель инфекционного заболевания, но уже есть явные признаки генерализации инфекционного процесса. Препарат Скай-форс, созданный в ООО «НПФ «НаноТехПром» изобретателем М.Б. Тарасовым, является хелатом, что обуславливает его повышенную реакционную способность. Присутствие в его структуре как положительных, так и отрицательных ионов делает препарат универсальными, т.к. мишенью для них является практически вся поверхность микробной клетки. Важно также отметить и другие характеристики: препарат разработан на основе разрешённого к применению в лечебных целях фармакопейного средства; препарат создан с использованием нанотехнологий; специалисты Национального исследовательского технологического университета «Московский институт стали и сплавов» не обнаружили в составе препарата ни одного из применяемых при лечении инфекций бактериальной природы антибактериальных препаратов или их фрагментов; препарат является единственным (наноструктурным) препаратом, апробированным при лечении экспериментального псевдотуберкулёза, кишечного иерсиниоза и эшерихоза [Тарасов М.Б., Погорельский И.П., Чичерин И.Ю., Лундовских И.А., Лещенко А.А. Способ лечения системных иерсиниозных бактериальных инфекций в эксперименте. Патент RU 2563174 С1; A61K 35/74, A61P 31/00; заявка №2014116017/15, 22.04.2014 опубл. 20.09.2015 г. в Бюл. № 26; Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Лещенко А.А. Антибактериальное средство и способ лечения кишечного иерсиниоза или псевдотуберкулеза или эшерихиоза. Патент RU 2564014, A61K 9/08, A61K 31/164, A61K 331/00 и др., заявка №2013154953/15 от 10.12.2013; опубл. 27.09. 2015 г. в Бюл. № 17] с доказательством с помощью электронной микроскопии деструкции бактериальных клеток возбудителей; присутствие в структуре препарата положительных и отрицательных ионов делает его универсальным в том смысле, что мишенью для него является вся микробная клетка; на поверхности патогенных бактерий при контакте с препаратом изменяется тип кластеризации препарата и при сохранении химического состава возрастает его реакционная способность; в организме в очаге воспаления, где локализуются возбудители бактериальной или вирусной природы, происходит модификационная перестройка препарата с изменением его физико-химических свойств, что сопровождается одновременной активацией препарата, оказывающего бактерицидное и вирулицидное действие на бактерии и вирусы [Тарасов М.Б. Нанопрепараты для животноводства и птицеводства // Наноиндустрия. Научно-технический журнал. 2012. – № 4(34). С. 54-56; Тарасов М.Б. Идентификация нанопрепаратов// Наноиндустрия. Научно-технический журнал. 2019. № 7-8 (93). – С.420-423; Глухова М.В., Погорельский И.П., Тарасов М.Б. Оценка антибактериальной активности и токсичности нового наноструктурного препарата Скай-форс //Международный научный журнал «Символ науки». 2015. – № 4. – С. 215-217; Романов В.Е., Тарасов М.Б., Погорельский И.П. Опыт практического использования наноструктурных препаратов в ветеринарии //Материалы Всероссийской научно-практической конференции 10-11 апреля 2014 г. «Современные научно-практические достижения в ветеринарии». Киров: ВятГСХА. 2014. – Вып.5. – С. 87-89; Тарасов М.Б., Погорельский И.П., Дармов И.В., Лундовских И.А., Чичерин И.Ю., Лещенко А.А., Урванов К.А. Научное открытие «Явление селективности воздействия наноструктурных химиотерапевтических препаратов с перестраиваемой наноструктурой и изменяемой топологией поверхности на возбудителей кишечных инфекций». Диплом № 502 // Научные открытия: сборник кратких описаний научных открытий, научных идей, научных гипотез - 2017/ Составитель В.В. Потоцкий – М.: РАЕН, 2018. – 52 с.; формула и сущность открытия представлены в сборнике на стр. 16-18].

Важно также подчеркнуть, что препарат Скай-форс в организме млекопитающих стимулирует размножение и полноценное функционирования собственной микробиоты желудка и кишечника, что имеет немаловажное значение для поддержания готовности клеточного иммунитета к защите от патогенных вирусов и бактерий. Особо следует отметить безвредность препарата Скай-форс: даже увеличение вводимой животным суточной дозы препарата в 10-15 раз никак не сказывается на их состоянии [Глухова М.В. Изучение токсичности химиотерапевтического средства для ветеринарии // Международный научный журнал «Символ науки». 2015. – №4. – С. 212-214].

Хорошая растворимость препарата Скай-форс в воде, апирогенность, нетоксичность и безвредность водного раствора обуславливают возможность как перорального, так и парентерального введения в организм лабораторных и сельскохозяйственных животных, а также людей.

Цикл доклинических испытаний препарата Скай-форс в агрохозяйствах Белгородской области, а также в Федеральном исследовательском центре вирусологии и микробиологии (г. Покров), инструментальными методами проведен в соответствии с Руководством по инструментальным методам исследований и экспертизе качества лекарственных препаратов [М.: Изд-во «Пепо»: С.М Быковский (ред). – 2014. – 656 с], а также с Приказом Министерства сельского хозяйства Российской Федерации № 101 от 06.03 2018 г. «Об утверждении правил проведения доклинического исследования лекарственного средства для ветеринарного применения, клинического исследования лекарственного препарата для ветеринарного применения, исследования биоэквивалентности лекарственного препарата для ветеринарного применения».

Задачей изобретения является доказательство деструкции нуклеокапсида вирусов бактерий под воздействием наноструктурного препарата Скай-форс вследствие его модификационной перестройки после контакта с биологическим объектом – бактериофагом и повышения избирательной реакционной способности, проявляющейся фрагментацией структуры вирусов с утратой ими материальной основы патогенности и способности размножаться в здоровых клетках.

Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемого способа, заключается в том, что высокая вирулицидная активность в отношении вирусных частиц достигается вследствие индуцирования после контакта препарата Скай-форс с вирусной частицей или микробной клеткой модификационной перестройки с изменением кристаллической структуры и физико-химических свойств препарата, оказывающего селективное бактерицидное действие на бактериофаги и возбудителей инфекционных заболеваний с выраженным нарушением нормального функционирования с последующей фрагментацией их структуры, что обеспечивает полное освобождение от возбудителя инфекции.

Технический результат достигается тем, что заявляемый способ включает в себя следующие стадии:

- приготовление средства для осуществления предлагаемого способа, представляющего собой препарат Скай-форс, растворенный в дистиллированной воде в концентрации 100 мкг препарата Скай-форс на 1 мл дистиллированной воды.

- приготовление суспензии бактериофага на изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации 1х10⁹ фаговых частиц в 1 мл;

- внесение приготовленной суспензии бактериофага во флакон с раствором препарата Скай-форс с таким расчетом, чтобы концентрация фаговых частиц в реакционной смеси была 1х10⁸ в 1 мл, а препарата Скай-форс – 100 мкг в 1 мл;

- отбор проб реакционной смеси с разрушенными фаговыми частицами через 10 ÷ 20 мин и исследование ее с помощью устройств электронной микроскопии.

Основные физико-химические характеристики препарата Скай-форс представлены в описании изобретения [Тарасов М.Б., Погорельский И.П., Труш Р.В., Урванов К.А., Тарасова О.И. «Способ идентификации водорастворимого лекарственного вещества путем сравнения с эталоном». Патент РФ №2560692, G01N 33/15, G01N 31/16, G01 N 21/31, G01N 27/28, опубл. 20.08.2015 г.]. Препарат Скай-форс – это мелкодисперсный порошок песочно-красноватого цвета (по цифровой классификации 1 %-препарат FFFF99, 2 %-препарат FFCC99, 3 %-препарат FFCC66, 4 %-препарат FF9933, 6 %-препарат CC6600); плотность 1,52 г/см³; легко растворимый в воде (насыщенный раствор в дистиллированной воде при температуре 20 °С составляет 32 %); вкус сладковато-горький; запах – характерный, почти не ощущается. Водный раствор препарата апирогенный, нетоксичный и безвредный, что обуславливают возможность, в случае необходимости, вводить его в организм как при пероральном, так и парентеральном способе.

Положительные результаты лечения инфекции желудочно-кишечного тракта телят и поросят в агрохозяйствах Белгородской области, вызванной энтеровирусом и коронавирусом, послужили основанием для применения препарата Скай-форс как этиотропного средства в сочетании с симптоматической терапией в качестве вынужденного подхода (ввиду отсутствия продажи в аптеках официального антикоронавирусного препарата) к лечению коронавирусной инфекции, подтвержденной положительным результатом тестирования мазков, взятых из носовых ходов и горла, на коронавирус и появления явных признаков заболевания у четырех волонтеров, двое из которых являются соавторами настоящей заявки на изобретение. Прием препарата Скай-форс продолжался в течение 10 суток; суточная доза препарата, растворенного в молоке, составила 2,8 мг на 1 кг массы тела при пероральном применении. Полное излечение и исчезновение симптомов заболевания при одновременном очищении организма от коронавируса подтверждено отрицательным тестированием биоматериала мазков на коронавирус.

Для подтверждения возможности осуществления замысла изобретения и достижения технического результата готовят раствор препарата Скай-форс и проводят испытание его бактерицидной и вирулицидной активности в отношении бацилл Bacillus cereus АТСС 10702 как наиболее устойчивых к дезинфицирующим агентам, а также бактериофага (вируса бактерий) М.П. Покровской.

Оценку бактерицидного действия заявляемого препарата Скай-форс проводят суспензионным способом [Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств и оценки их эффективности и безопасности: Руководство Р 4.2. 2643-10: Утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителя и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 01.06.2010 г.]. Конечная концентрация бацилл в растворе препарата Скай-форс составляет 1х10⁸ КОЕ х мл^-1 (колониеобразующих единиц в 1 мл), а бактериофага – 1х10⁹ фаговых частиц в 1 мл. Концентрация препарата Скай-форс в реакционной смеси составляет 100 мкг в 1 мл. По окончании экспозиции проводят отбор реакционной смеси для электронной микроскопии.

Изучение структуры бацилл Bacillus cereus АТСС 10702 и вирусного бактериофага М.П. Покровской проводят с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEOL JEM (Япония) при ускоряющем напряжении 200 кВ.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана на следующих примерах.

Пример 1.

Готовят раствор препарата Скай-форс на дистиллированной воде в концентрации 100 мкг в 1 мл.

Выращивают культуру бацилл Bacillus cereus АТСС 10702 в течение 48 ч при температуре 37 °С, после чего готовят бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации 1х10⁹ КОЕ х мл^-1. Вносят приготовленную бактериальную суспензию во флакон с раствором препарата Скай-форс с таким расчетом, чтобы концентрация бацилл в реакционной смеси была 1х10⁸ КОЕ х мл^-1, а препарата Скай-форс – 100 мкг в 1 мл. Отбор проб реакционной смеси проводят через 10 и 15 мин и исследуют с помощью электронной микроскопии. Изменение структуры бацилл Bacillus cereus АТСС 10702 под влиянием препарата Скай-форс представлено на фиг. 2: А – исходная клетка (бацилла Bacillus cereus АТСС 10702 до взаимодействия); Б – клетка после контакта с препаратом в течение 10 мин. Характерные изменения клеток бацилл Bacillus cereus АТСС 10702 к 10 мин воздействия препарата Скай-форс, как это следует из данных электронной микроскопии (фиг. 2), однозначно свидетельствуют о деструкции микробных клеток с потерей их нативности и, соответственно, утрате жизнеспособности. Клеточная оболочка как таковая просматривается только частично. Оптическая плотность цитоплазмы снижена, отмечается коагуляция и выход образовавшихся комплексов цитоплазмы в окружающую среду через разрывы клеточной стенки. Процесс деструкции клеток настолько глубок, что лишает их способности формировать устойчивую к препарату популяцию микробных клеток.

Пример 2.

Готовят раствор препарата Скай-форс на дистиллированной воде в концентрации 100 мкг в 1 мл.

Готовят суспензию лизированных бактерий (фаголизат), полученную в результате лизиса микробных клеток под влиянием бактериофага М.П. Покровской. Полученный фаголизат фильтруют с целью удаления фрагментов лизированных бактерий. В стерильном фаголизате определяют количество фаговых частиц и доводят их количество изотоническим раствором хлорида натрия до концентрации 1х10⁹ фаговых частиц в 1 мл. Вносят приготовленную суспензию фаголизата во флакон с раствором препарата Скай-форс с таким расчетом, чтобы концентрация фаговых частиц в реакционной смеси была 1х10⁸ в 1 мл, а препарата Скай-форс – 100 мкг в 1 мл. Отбор проб реакционной смеси проводят через 15 и 20 мин и исследуют с помощью электронной микроскопии. Изменение структуры нуклеокапсида (вириона) бактериофага М.П. Покровской под влиянием препарата Скай-форс представлено на фиг. 3: А – исходная фаговая частица (вирус бактерий (бактериофаг) до взаимодействия); Б – фаговая частица после контакта с препаратом в течение 10 мин. Исходный бактериофаг (фиг.3 –А) – правильный гексаэдр со слегка сглаженными углами; отчетливо контурируется вирион (сердцевина) и гликопротеиновый комплекс, на поверхности которого расположены многочисленные отростки в виде «ресничек»; оптическая плотность вириона средняя, хорошо контурируется. После взаимодействия бактериофага с препаратом Скай-форс (фиг.3 – Б) отмечается выраженная деструкция гликопротеинового комплекса и нуклеокапсида: через разрушенные структуры сердцевина вирусной частиц (нуклеопротеин) в виде бесформенной массы выходит в окружающую среду. Видимые повреждения гликопротеинового комплекса и нуклеокапсида бактериофага, являющиеся следствием антифаговой активности препарата Скай-форс, свидетельствуют об утрате частицами бактериофага своей нативности и инфекционной активности.

Таким образом, заявляемое средство обеспечивает высокий уровень деструктивной активности в отношении бактерий и их вирусов, что создает перспективу его дальнейшего исследования, в том числе в практической инфектологии.

Препарат Скай-форс синтезирован как препарат первого выбора для практического применения в инфектологии, когда еще не установлен и не идентифицирован возбудитель инфекционного заболевания, но уже есть явные признак генерализации инфекционного процесса. В патологическом очаге при контакте с бактериями и вирусами происходит модификационная перестройка препарата Скай-форс с изменением его физико-химических свойств, что сопровождается одновременной активацией препарата, оказывающего бактерицидное и вирулицидное действие на инфекционные агенты. Визуализация с использованием электронной микроскопии процесса деструкции клеточной стенки бактерий и нуклеокапсида вирусов бактерий свидетельствует о перспективности внедрения препарата Скай-форс в практику инфектологии, как показавшего высокую эффективность при лечении вирусных инфекций у сельскохозяйственных животных, для оценки его пригодности в терапевтических целях для людей.

Способ деструкции нуклеокапсида бактериофага М.П. Покровской, включающий

приготовление средства для осуществления предлагаемого способа, включающего препарат Скай-форс, растворенный в дистиллированной воде в концентрации 100 мкг Скай-форс на 1 мл дистиллированной воды;

приготовление суспензии бактериофага М.П. Покровской на изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации 1×10⁹ фаговых частиц в 1 мл;

внесение приготовленной суспензии бактериофага во флакон с раствором препарата Скай-форс с таким расчетом, чтобы концентрация фаговых частиц в реакционной смеси составляла 1×10⁸ в 1 мл, а концентрация препарата Скай-форс составляла 100 мкг в 1 мл;

отбор проб реакционной смеси с разрушенными фаговыми частицами через 10-20 мин и исследование ее с помощью устройств электронной микроскопии.