Способ диагностики острого отторжения трансплантата у реципиентов трансплантированного сердца


G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2758994:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. академика В.И. Шумакова" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к области медицины, в частности к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике. Предложен способ диагностики острого отторжения трансплантата у реципиента трансплантированного сердца. В плазме венозной крови определяют уровень экспрессии микроРНК-101 по формуле Э=log2(2-(Ct1-Ct2)). При величине Э менее -8,63 диагностируют наличие острого отторжения трансплантата. Изобретение обеспечивает неинвазивность, снижение трудоемкости, времени проведения, повышение доступности диагностики острого отторжения трансплантата у реципиентов трансплантированного сердца при одновременном достижении достоверной диагностики острого отторжения (как клеточного, так и гуморального типов) у данного контингента пациентов. 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении реципиентов сердца для диагностики острого отторжения трансплантированного сердца.

Острое отторжение трансплантата является одним из основных факторов, ограничивающих выживаемость реципиентов сердца. Риск развития острого отторжения трансплантированного сердца более высок в раннем послеоперационном периоде, хотя кризы острого отторжения могут возникать в любые сроки после трансплантации. Поздние кризы отторжения чаще возникают при назначении недостаточных доз иммуносупрессивной терапии и несоблюдении реципиентами предписанного врачом режима приема лекарственных средств, а также возникшими вирусными инфекциями, приводящими к активации иммунной системы пациента.

Разработка малоинвазивных методов выявления осложнений в посттрансплантационном периоде и поиск новых биомаркеров, сигнализирующих об их развитии после трансплантации сердца проводится с целью улучшения доклинической диагностики и увеличения продолжительности жизни реципиентов.

В настоящее время ведутся активные исследования биологических агентов, способных быть индикаторами риска негативных событий, связанных с развитием острого отторжения, приводящего к дисфункции трансплантированного сердца. Отдельную группу сигнальных молекул, рассматриваемых в качестве перспективных кандидатов на роль таких биомаркеров, составляют МикроРНК. МикроРНК - это семейство малых эндогенных некодирующих одноцепочечных РНК длиной от 18 до 25 нуклеотидов, выступающих в качестве посттранскрипционных регуляторов, играющих ключевую роль во множестве биологических процессов. Исследования последних лет позволили выявить участие микроРНК в развитии и дифференцировке кроветворных клеток, пролиферации и апоптозе, нарушении обмена веществ, аутоиммунных заболеваниях, канцерогенезе и отторжении трансплантированных органов.

Показан диагностический потенциал оценки уровня экспрессии ряда микроРНК в образцах крови пациентов в отношении развития и течения сердечной недостаточности [The diagnostic value of circulating microRNAs in heart failure / Huang YM, Li WW, Wu J, Han M, Li ВН. // Exp Ther Med. - 2019. - 17(3): 1985-2003].

В работе Sukma Dewi et al. было показано различие уровней экспрессии микроРНК, в том числе микроРНК-101, у реципиентов с острым отторжением трансплантата и реципиентов без отторжения, на основании чего высказано только предположение о возможной диагностической роли микроРНК-101 при остром отторжении трансплантированного сердца[Association of Serum MiR-142-3р and MiR-101-3p Levels with Acute Cellular Rejection after Heart Transplantation / Sukma Dewi I, Hollander Z, Lam KK, et al. // PLoS One. - 2017. - 12(1): e0170842].

Однако исследованная группа пациентов включала в себя исключительно реципиентов с острым клеточным отторжением, несмотря на то, что около 20% случаев острого отторжения трансплантированного сердца протекает по гуморальному (антителоопосредованному) типу.

Кроме того, в исследовании не проводилось определение диагностической эффективности метода: не были установлены показатели чувствительности и специфичности, а также диагностически значимые пороговые значения экспрессии микроРНК-101, позволяющие выявлять реципиентов с острым отторжением трансплантата любого типа: клеточного и/или гуморального.

При этом в качестве материала исследования была выбрана сыворотка крови реципиентов, что осложняет процесс работы с образцами в отличие от использования плазмы венозной крови.

На сегодняшний день объективным методом верификации степени и характера острого отторжения трансплантированного сердца является эндомиокардиальная биопсия (ЭМБ) и коронографическое исследование [Веревкин А.А., Славинский А.А., Космачева Е.Д. и др. // Кубанский научный медицинский вестник. - 2017. - 24 (6). - С. 17-21] (прототип). ЭМБ выполняются в сроки после трансплантации, предусмотренные протоколом, а также при проявлении признаков нарушения функции трансплантированного сердца.

Однако ЭМБ имеет ряд ограничений и рисков, свойственных инвазивным методам диагностики. Кроме того, при получении биоптата исследуют локальный участок, который не всегда может отражать состояние целого трансплантированного органа [Ставенчук Т.А., Космачева Д.В., Шелестова Е.Д. и др. Оценка предикторов отторжения миокарда у пациентов после ортотопической трансплантации сердца с помощью трансторакальной эхокардиографии и методики speckle tracking echocardiography // Креативная кардиология. - 2015. - №3. - С. 56-66]. Многочисленные публикации зарубежных и отечественных авторов свидетельствуют о высоком риске осложнений и неблагоприятного исхода при использовании данного метода. В связи с его трудоемкостью существует очевидная необходимость в разработке нового неинвазивного диагностического средства, которое может не только выявить наличие острого отторжения трансплантата, но и контролировать лечение реципиента.

Нами поставлена задача - разработать доступный, достоверный способ неинвазивной диагностики острого отторжения трансплантата у реципиентов трансплантированного сердца клеточного и/или гуморального типов.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении неинвазивности, снижении трудоемкости, времени проведения, повышении доступности диагностики острого отторжения трансплантата у реципиентов трансплантированного сердца при одновременном достижении достоверной диагностики острого отторжения (как клеточного, так и гуморального типов) у данного контингента пациентов, а также повышении ее объективности за счет возможности вынесения суждения с учетом показателя, отражающего состояние всего сердца.

Предлагаемый способ позволяет повысить выживаемость пациентов с трансплантированным сердцем и улучшить результаты трансплантации сердца за счет своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии путем определения уровня экспрессии микроРНК-101 в плазме венозной крови.

Нами эмпирически установлен достоверный диагностический показатель развития острого отторжения трансплантированного сердца, основанный на оценке уровня экспрессии микроРНК-101 в плазме венозной крови реципиентов сердца.

Использование предполагаемого маркера позволяет ограничить круг пациентов, которым требуется проведение эндомиокардиальной биопсии для уточнения диагноза острого отторжения трансплантированного сердца.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для диагностики острого отторжения трансплантированного сердца (клеточного и/или гуморального типа) в плазме венозной крови реципиентов определяют уровень экспрессии микроРНК-101 по формуле:

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-101,

Ct1 - значение порогового цикла ПНР для образца микроРНК-101,

Ct2 - значение порогового цикла ПНР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39.

При величине Э менее -8,63 диагностируют наличие острого отторжения трансплантата.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве материала для исследования величины экспрессии микроРНК используется плазма венозной крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.

Кровь собирают в одноразовые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную плазму замораживают и хранят при температуре -20°С.

Уровень экспрессии микроРНК-101 определяют методом полимеразной цепной реакции, например, с помощью наборов реагентов SerumPlasma (Qiagen, США).

Определение проводится в соответствии с инструкцией к наборам. РНК выделяют из 100 мкл плазмы крови с использованием наборов SerumPlasma (Qiagen, США). После инкубации плазмы с фенольной смесью Qiazol добавляется 1,6×108 копий синтетической микроРНК Caenorhabditis elegans (Cel-miR-39) (Qiagen) в качестве внутреннего контроля экстракции РНК.

Выделенные образцы с тотальной РНК конвертируются путем проведения реакции обратной транскрипции в кДНК: при t°=37°C в течение 60 минут с последующей инкубацией при 95°С в течение 5 минут, охлаждением на льду и доведением объема образца деионизированной водой до 200 мкл. Далее для выявления исследуемых микроРНК выполняется полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени. Условия реакции ПЦР: 15 минут при t°=95°C с последующим проведением 40 циклов по 15 секунд при t°=94°C, 30 секунд при t°=55°C и 30 секунд при t°=70°C в амплификаторе.

Значение уровня экспрессии микроРНК исследуемых образцов плазмы венозной крови выражают в относительных единицах (отн.ед.) и рассчитывают по формуле:

Э=log2(2-(Ct1-Ct2)),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-101, отн.ед.

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-101 (то есть значение порогового цикла микроРНК-101 на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе),

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39 (то есть значение порогового цикла внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39, на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе).

У реципиентов сердца с величиной экспрессии микроРНК-101 Э ниже -8,63 отн. ед. в плазме венозной крови определяют наличие острого отторжения трансплантата.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1.

Пациенту Л., 48 лет, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Измеренный на 65 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-101 в плазме венозной крови составил Э = -10,13 отн. ед. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано развитие острого отторжения трансплантата. По данным морфологического исследования образца ЭМБ диагноз подтвержден: выявлен агрессивный очаг воспаления в интерстиции с деструкцией кардиомиоцитов, что соответствует степени R1G острого клеточного отторжения по классификации ISHLT-2014. Проведена коррекция иммуносупрессивной терапии, назначено лечение по показаниям.

Пример 2.

Пациенту Р., 67 лет, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Измеренный на 88 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-101 в плазме венозной крови составил Э=-9,09 отн. ед.

В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано развитие острого отторжения трансплантата. По данным морфологического исследования образца ЭМБ диагноз подтвержден: выявлена активация эндотелия в сосудах миокарда и периваскулярный клеточный инфильтрат, что соответствует степени pAMR-1 острого гуморального отторжения по классификации ISHLT-2013. Проведена коррекция иммуносупрессивной терапии, назначено лечение по показаниям.

Пример 3.

Пациенту Д., 61 года, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал без осложнений. В течение периода наблюдения (с первых суток и до 6 месяцев после трансплантации) у пациента данных о воспалительных процессах не получено. Измеренный на 184 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-101 в плазме венозной крови составил Э=-6,03 отн. ед. По данным морфологического исследования образца ЭМБ признаков острого отторжения трансплантата не выявлено.

Предложенный способ апробирован в клинической практике на 46 реципиентах сердца, среди них: острое клеточное отторжение наблюдалось у 20 реципиентов, гуморальное - у 6 реципиентов и смешанное - у 1 реципиента. Специфичность предлагаемого способа составляет 79,2%.

Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность диагностировать острое отторжение трансплантата у реципиентов сердца.

Способ диагностики острого отторжения трансплантата у реципиента трансплантированного сердца, отличающийся тем, что в плазме венозной крови определяют уровень экспрессии микроРНК-101 по формуле:

Э=log2(2-(Ct1-Ct2)),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-101,

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-101,

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39,

и при величине Э менее -8,63 диагностируют наличие острого отторжения трансплантата.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, в частности к сердечно-сосудистой хирургии, и предназначено для прогнозирования развития критической ишемии в срок до 5 лет от начала заболевания облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей. Осуществляют генотипирование полиморфизма -250 G>A гена LIPC.

Изобретение относится к области медицины. Описан способ оценки эритроцитарного химеризма при исследовании антигенов АВО, включающий формирование шкалы-идентификатора процента донорского химеризма, типирование антигенов АВО эритроцитов донора и реципиента, определение информативных антигенов, мониторинг эритроцитарного химеризма после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к прогнозированию развития хронической болезни почек (ХБП) через 5 лет у пациентов с сахарным диабетом (СД) 1 или 2 типа. Для случая наличия СД 1 типа определяют комплекс диагностически значимых показателей: пол, возраст на момент постановки диагноза, наличие инфаркта миокарда в анамнезе, наличие диабетической комы в анамнезе, наличие диабетической ретинопатии, значение индекса массы тела (ИМТ).

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к гуманизированной иммунодефицитной без ожирения с диабетом (NOD) мыши в качестве модели, а также к способу ее создания. Также раскрыто применение вышеуказанной мыши в способе прогнозирования ранжирования эффективности множества противоопухолевых средств для лечения опухоли, способе тестирования комбинированной терапии для лечения опухоли с применением двух или более кандидатных средств, способе определения эффективности режима дозирования для лечения опухоли с использованием средства, а также в способе определения безопасности режима дозирования для лечения опухоли с использованием средства.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к гуманизированной иммунодефицитной без ожирения с диабетом (NOD) мыши в качестве модели, а также к способу ее создания. Также раскрыто применение вышеуказанной мыши в способе прогнозирования ранжирования эффективности множества противоопухолевых средств для лечения опухоли, способе тестирования комбинированной терапии для лечения опухоли с применением двух или более кандидатных средств, способе определения эффективности режима дозирования для лечения опухоли с использованием средства, а также в способе определения безопасности режима дозирования для лечения опухоли с использованием средства.

Изобретение относится к медицине и предназначено для оценки метаболизма билирубина. Способ исследования метаболизма билирубина заключается в следующем: проводят определение вечером перед сном и утром натощак в плазме крови содержания общего и прямого билирубина, объема циркулирующей крови и гематокрита, после чего рассчитывают коэффициент метаболизма билирубина (К) по формуле.

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу определения функциональной активности классического пути системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции. Способ определения функциональной активности классического пути системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции включает проведение реакции лизиса эритроцитов человека группы А системы АВ0 (Е(А)), сенсибилизированных анти-А моноклональными IgM антителами (Е(А)мАт) и сыворотки в условиях вероналового солевого буфера (VBS2+), инкубирование полученной пробы, далее оценивают реакцию комплемент-зависимого лизиса Е(А)мАт турбидиметрически, по снижению оптической плотности суспензии Е(А)мАт при длине волны 620 нм определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах по калибровочному графику, где контроль Е(А)мАт представляет 0% лизиса, а контроль полного лизиса Е(А)мАт - 100% лизис, при определенных условиях, при этом повышенную функциональную активность классического пути системы комплемента человека отмечают при степени лизиса более 60%, при степени лизиса от 31% до 59% как нормальную и при степени лизиса менее 30% как пониженную функциональную активность системы комплемента человека.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, урологии, и может быть использовано для раннего выявления (проведения скрининга) рака мочевого пузыря, и касается способа раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи. Способ включает: забор первой утренней порции мочи обследуемого, центрифугирование ее при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов; слив супернатанта, добавление к осадку 2 мл PBS, ресуспендирование пипетированием на протяжении 1-2 мин и повторное центрифугирование при 2000 об/мин в течение 10 мин; процедуру отмывки проводят дважды; слив супернатанта, к осадку добавление 0,5 мл PBS, ресуспендирование пипетированием на протяжении 1-2 мин.

Изобретение относится к медицине, а именно к предоперационной дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных опухолей околощитовидных желез (ОЩЖ). Определяют комплекс диагностически значимых показателей: уровень кальция ионизированного в крови, уровень паратгормона в крови, объем опухоли по данным УЗИ околощитовидной железы, пол пациента и возраст, наличие осложнений со стороны почек: хроническая болезнь почек и/или нефролитиаз; наличие осложнений со стороны костной системы: остеопороз и/или наличие низкоэнергетических переломов; уровень фосфора в крови, наибольший диаметр опухоли по данным УЗИ околощитовидной железы.
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования возникновения гетеротопической оссификации у больных после оперативного лечения последствий травм локтевого сустава. На 1–14 день после оперативного лечения последствий травм локтевого сустава определяют концентрацию лактата, активность тартратрезистентной кислой фосфатазы в сыворотке крови, а также уровень гемоглобина в крови.

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к способу выявления остаточных, недифференцированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) в культуре клеток, дифференцировавшихся из iPSC. Для осуществления способа согласно изобретению сначала культивируют указанные клетки на субстрате, покрытом ламинином-521 и Е-кадгерином, в среде, содержащей ингибитор Rho-ассоциированной протеинкиназы, содержащей суперспираль (ROCK).

Изобретение относится к области медицины, в частности к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике. Предложен способ диагностики острого отторжения трансплантата у реципиента трансплантированного сердца. В плазме венозной крови определяют уровень экспрессии микроРНК-101 по формуле Эlog2). При величине Э менее -8,63 диагностируют наличие острого отторжения трансплантата. Изобретение обеспечивает неинвазивность, снижение трудоемкости, времени проведения, повышение доступности диагностики острого отторжения трансплантата у реципиентов трансплантированного сердца при одновременном достижении достоверной диагностики острого отторжения у данного контингента пациентов. 3 пр.

Наверх