Способ оценки эффективности терапии лепры с использованием полимеразной цепной реакции для амплификации видоспецифичных участков геномов лепры, человека или мыши
Владельцы патента RU 2759232:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к медицине и касается способа оценки эффективности химиотерапии лепры путем количественного анализа в тканях лабораторного животного или человека ДНК Mycobacterium leprae, где в полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием высокоспецифичных праймеров и гидролизующихся зондов проводят параллельную амплификацию видоспецифичного участка гена носителя, выбранного из участка гена бета-актина человека (АСТВ) или участка гена В2-микроглобулина мыши (В2М), и вариабельного участка RLEP генома возбудителя с последующим расчетом отношения полученных значений пороговых циклов Ct, на основании изменения которого в динамике лечения судят о снижении, стабилизации или росте бактериальной нагрузки, где при увеличении отношения полученных значений пороговых циклов Ct в процессе терапии констатируется увеличение бактериальной нагрузки, при сохранении неизменным - стабилизация состояния, при снижении - уменьшение бактериальной нагрузки, что позволяет оценивать эффективность терапии лепры, обратно пропорциональную бактериальной нагрузке. Изобретение обеспечивает оценку эффективности химиотерапии лепры. 5 ил., 1 табл., 2 пр.
Область техники настоящего изобретения
Изобретение относится медицине, а именно к лепрологии, и может
быть использовано для изучения эффективности как отдельных лекарственных, препаратов так и их комбинаций для лечения больных лепрой.
Лепра (болезнь Гансена) - хроническое гранулематозное заболевание, вызываемое микобактериями Mycobacterium leprae и Mycobacterium lepromatosis, поражающее преимущественно кожные покровы и периферическую нервную систему. Несмотря на относительно невысокую заболеваемость и эндемичность, до настоящего времени лепра является актуальной проблемой здравоохранения. Инкубационный период варьирует от 3 месяцев до 40 лет, что создает определенные сложности в выявлении инфицированных лиц и проведении противоэпидемических мероприятий [1 - World health organization/Leprosy. Available at: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs101/en/].
В Российской Федерации заболеваемость имеет спорадический характер, в последние годы регистрируются единичные новые случаи лепры. Однако, в мире ежегодно выявляется около 200 тыс.новых случаев лепры, в том числе в странах, имеющих тесные социально-экономические контакты с Российской Федерацией. Постановлением правительства Российской Федерации от 1 декабря 2004 г. №715 лепра включена в перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих, а приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 29 июня 2015 г. №384н лепра отнесена к инфекционным заболеваниям, представляющим опасность для окружающих и являющихся основанием для отказа в выдаче либо аннулирования разрешения на временное проживание иностранных граждан и лиц без гражданства, или вида на жительство, или патента, или разрешения на работу в Российской Федерации [2 - Приказ Министерства здравоохранения РФ от 29.06.2015 №384н].
Согласно рекомендациям ВОЗ [1], стандартизованная комбинированная лекарственная терапия лепры включает три препарата: дапсон, рифампицин, клофазимин, но только два из этих препаратов зарегистрированы в Российской Федерации (дапсон и рифампицин). В настоящее время в случае выявления больного лепрой - гражданина Российской Федерации обеспечить оказание лекарственной терапии в точном соответствии с рекомендациями ВОЗ не представляется возможным. Неполная комбинированная лекарственная терапия не защищает полностью от таких явлений, как рецидив заболевания, а также развитие резистентности возбудителя к препаратам химиотерапии. Большинство исследований схем комбинированной терапии фокусируются на попытках создания и тестирования новых схем лечения лепры, которых отличало бы меньшая длительность терапии и в то же время эффективность по отношению к возможной резистентности и рецидивам. В настоящее время курс комбинированной специфической терапии больных лепрой длится 6 месяцев [3 - Приказ МЗ РФ №1681 от 29.12.2012].
Современные схемы лечения - это фиксировано-временные схемы комбинированной лекарственной терапии, с комбинацией различных препаратов. Как правило, такие схемы имеют преимущества в комплаентности и эффективности при других заболеваниях, связанных с микобактерией (туберкулез), однако их использование имеет особенности при лечении лепры. Так, при лечении завершающей стадии малобактериальной формы лепры, когда результаты мазков негативны, сложнее принять решение о прекращении терапии, чем при многобактериальной форме, при которой результаты мазков - показатель активности заболевания. Кроме того, продолжавшаяся видимая клиническая активность процесса наблюдается по истечению 6 месяцев терапии, находясь в диапазоне от 10 до 67%.
Еще одним аспектом является развитие нежелательных явлений от применения современной схемы комбинированной лекарственной терапии, таких как дапсон-индуцируемая гемолитическая анемия и клофазимин-индуцируемая пигментация. Возможно, значимость таких явлений недооценена и разработка новых схем терапии могла бы их уменьшить; более того, офлоксацин и миноциклин показали себя более эффективными в отношении бактерицидных свойств по сравнению с дапсоном и клофазимином в клинических испытаниях и испытаниях на мышах. Например, клофазимин не зарегистрирован на территории Российской Федерации, и в качестве альтернативных схем лечения лепры можно применять комбинацию препаратов рифампицина и фторхинолонов (РОМ), выпускающихся на территории нашей страны. Отдельно стоит упомянуть сочетанное с рекомендованной ВОЗ терапией использование статинов для предотвращения образования покоящейся формы микобактерий лепры, существенно улучшающих показатель эффективности терапии [4 - Lobato et al., Statins increase rifampin mycobactericidal effect. Antimicrob. Agents Chemother. 2014. 58(10):5766-74]. Таким образом, для обеспечения лекарственной терапией больных лепрой, необходимо разработать схемы лечения заболевания препаратами с доказанной эффективностью. При этом оценка эффективности терапии должна быть точной и надежной, поскольку она является одним из основных критериев выбора терапии.
Моделирование лепрозной инфекции в эксперименте позволяет осуществлять скринирование препаратов с потенциальной противолепрозной активностью. Моделирование лепры в лабораторных условиях остается актуальной задачей еще и потому, что М. leprae не культивируется на искусственных питательных средах, и это в значительной степени затрудняет изучение его биологических свойств. С. Shepard в 1960 г. предложил первый успешный метод культивирования лепры на мышах [5 - Shepard С.С. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice. J. Exp.Med. - 1960. - Vol. 112. - P. 445-454]. Этот метод позволил выделить жизнеспособные бактерии из лепрозных высыпаний, разработать новые препараты для лечения лепры, изучить фармакологическую резистентность возбудителя лепры, а также провести множество иммунологических исследований этого заболевания, и продолжает использоваться в настоящее время для оценки эффективности разрабатываемых схем терапии лепры.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Анализ предшествующего уровня техники показал наличие нескольких близких прототипов патентуемого способа, каждый из которых уступает по описанным параметрам разработанному способу и алгоритму его применения.
Прототипом способа оценки эффективности лечения лепры может рассматриваться способ [6 - Патент RU 2688156 С2. Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции. Сароянц Л.В., Арнаудова К.Ш.], разработанный в ФГБУ "Научно-исследовательский институт по изучению лепры" в 2019 г., основанный на определении жизнеспособности Mycobacterium leprae, включающий применение ОТ-ПЦР с внешними и внутренними праймерами к участку гена 16 субъединицы рибосомальной РНК, с использованием выделения ДНК/РНК из биоптатов и скарификатов кожи, осуществления синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции и проведения такого анализа до начала и по истечении сроков 6 и 9 месяцев по окончании терапии. Согласно формуле изобретения, антибактериальная терапия лепры считается эффективной при снижении бактериоскопического индекса и процента положительных образцов, полученных через 6 и 9 месяцев после начала лечения.
Недостатками этого способа являются: быстрая деградация молекул мРНК после гибели клетки, высокая чувствительность очищенных препаратов РНК к воздействию окружающей среды, необходимость оценки бактериоскопического индекса, длительный период проведения терапии. Главным препятствием применения способа служит оценка присутствия жизнеспособных бактерий Mycobacterium leprae в анализируемом образце, в то время как оценка содержания микобактерий в покоящейся форме [7 - Шлеева и др. Покоящиеся формы микобактерий. Микробология 2010, том 79, №1, с. 3-15] не производится вообще.
Эти недостатки не представляют возможности получения конкретного технического результата - надежной оценки эффективности применения терапевтической схемы лечения.
Другим прототипом предлагаемого изобретения является способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой [8 - Патент RU 2247374 С1. Способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой. Ющенко и др.], разработанный в НИИ лепры Минздрава России в 2005 году, состоящий в исследовании метаболизма клеток гемопоэтического происхождения, отличающийся тем, что определяют средний цитохимический коэффициент степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови в условных единицах до начала терапии, и через 2-3 или 5-6, 10-12, 20-24 месяцев терапии. Соотношение коэффициентов позволяет упростить прогнозирование эффективности терапии у больных лепрой.
Недостатками этого способа являются сложность проведения анализа, его низкая точность вследствие большой погрешности из-за влияния дополнительных факторов, напрямую не связанных с развитием лепрозной инфекции. Использование современного метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) как правило, позволяет повысить точность результатов и достоверность анализа.
Из предшествующего уровня техники [9 - Mullis К.В., Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalysed chain reaction. Method Enzymol. 1987, 155, 335] известен метод ПЦР, суть которого состоит в том, в исследуемый образец, предположительно содержащий тот или иной инфекционный агент, вносятся короткие нуклеотидные последовательности -праймеры (прямой и обратный), комплементарные специфическим фрагментам генома искомого возбудителя. При последующей температурной обработке достигается денатурация двухспиральной ДНК возбудителя, делающая ее доступной для взаимодействия с праймерами, комплементарными соответствующим участкам геномной ДНК. На следующем этапе в присутствии в реакционной смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов и ДНК-полимеразы происходит избирательное размножение (амплификация) участка ДНК определенного размера, который задается при выборе праймеров. Циклическое повторение денатурации и ренатурации ДНК ведет к нарастающему в геометрической прогрессии накоплению специфических фрагментов ДНК, доступных для визуальной регистрации в агарозном или акриламидном гелях. Усовершенствованные варианты данного метода используют термостабильную ДНК-полимеразу термофильного микроорганизма Thermus aquaticus [10 - Patent US 4889818 A, Purified thermostable enzyme], позволяющую проводить ПЦР без добавления фермента в каждом цикле реакции, а также флуоресцентно-меченые зонды, позволяющие проводить измерение количества амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. В частности, наиболее распространенный метод детекции - применение гидролизующихся зондов (TaqMan) основывается на использовании флуоресцентно-меченного олигонуклеотида, комплементарного внутренней последовательности амплифицируемого фрагмента ДНК возбудителя, с флуоресцентной меткой в 5'-положении и гасителем флуоресценции в 3'-положении [11 - Patent US 20110300544 A1, Enhanced taqman probe based amplification].
На основе данного универсального принципа разработано и запатентовано множество способов выявления возбудителей бактериальных инфекций, различия между которыми заключаются в первичных нуклеотидных последовательностях используемых праймеров. При этом ключевым требованием является уникальность данной последовательности: (а) комплементарная ему последовательность (ген или фрагмент гена) должна присутствовать в геноме всех представителей детектируемого бактериального вида; (б) аналогичные последовательности должны отсутствовать в геномах других бактериальных видов. Соблюдение указанных требований обеспечивает реализуемым на их основе технологий ПЦР соответствие требованию «специфичность».
Из предшествующего уровня техники известен [12 - Патент RU 263645 С1. Способ повышения чувствительности полимеразной цепной реакции в реальном времени при обнаружении ДНК патогенных бактерий. Образцова О.А. и др.] способ повышения чувствительности полимеразной цепной реакции в реальном времени при обнаружении ДНК патогенных бактерий, разработанный в ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России в 2017 году. В рамках данного способа ДНК патогенных бактерий, в том числе Mycobacterium leprae, обнаруживают с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, а с целью повышения чувствительности способа в качестве праймеров и флуоресцентной пробы используют олигонуклеотиды, комплементарные специфическим повторяющимся элементам генома детектируемых бактерий, присутствующим в бактериальной хромосоме в количестве двух и более копий. При обнаружении ДНК Mycobacterium leprae используются прямой 5'-GCAGCAGTATCGTGTTAGTGAA-3', обратный 5'-CGCTAGAAGGTTGCCGTAT-3' праймеры и гидролизующийся зонд (ГЗ) 5'-CGCCGACGGCCGGATCATCGA-3' к специфическому элементу генома М. leprae имеющему 29 повторов в бактериальной хромосоме.
Аналогичным является способ [13 - Патент RU 2641060 С1. Способ идентификации ДНК микобактерий лепры с помощью полимеразной цепной реакции. Сароянц Л.В., Арнаудова К.Ш.], позволяющий подтвердить факт инфицированности микобактериями лепры при скрининговом обследовании населения. Биологический материал анализируется посредством проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием точно таких же внешних и внутренних праймеров и флуоресцентного зонда, на основании чего идентифицируется наличие возбудителя лепры.
Изобретение технической возможности осуществления ПЦР в реальном времени привело к раскрытию способов измерения количественной оценки содержания ДНК/РНК в анализируемом образце, что находит повсеместное применение например, в аналитической оценке присутствия чужеродной или трансгенной ДНК в образце, анализе количества представленности транскриптов и т.п. Базовый принцип расчета количества заключается в построении калибровочной кривой (уникальной для каждой комбинации праймеров при использовании конкретного прибора), имеющей вид обратной линейной зависимости концентрации исследуемого участка генома от величины порогового цикла Ct [14 - Patent USOO6303305B1-Method for quantification of an analyte].
Все описанное выше позволяет предположить, что осуществление оценки эффективности терапии лепры может быть усовершенствовано путем расчета изменения бактериальной нагрузки с использованием анализа видоспецифичных участков генома методом количественной ПЦР, осуществляемой в реальном времени.
Наиболее очевидным способом оценки степени бактериального обсеменения путем ПЦР в реальном времени является проведение совместной амплификации (коамплификации) участка геномов патогена и генома носителя патогена. Однако, нами выявлен существенный недостаток системы коамплификации в случае предлагаемого изобретения. Недостаток заключается в том, что очень высокая концентрация ДНК носителя (человека или мыши) по отношению к ДНК патогена значительно влияет на параметры функции изменения концентрации в зависимости от величины порогового цикла (стандартной кривой), что приводит к получению некорректных данных о концентрациях ДНК носителя и патогена (Фиг. 1, Фиг. 2). Техническим решением данного вопроса нами предлагается одновременное осуществление реакций ПЦР в реальном времени, но с использованием отдельных реакционных объемов для ДНК носителя и ДНК патогена. При этом в обеих реакциях используется один и тот же препарат ДНК, полученный из биоптата, и содержащий в себе как геномы патогена, так и его носителя.
Раскрытие изобретения
Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее: оценка эффективности химиотерапии лепры может осуществляться путем количественного анализа в тканях лабораторного животного или человека ДНК Mycobacterium leprae с осуществлением полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием видоспецифичных праймеров и гидролизующихся зондов при проведении одновременной амплификации видоспецифичного участка генома носителя и генома возбудителя заболевания. Последующий расчет отношения полученных значений пороговых циклов Ct, (либо соответствующих им результатов условного количества согласно калибровочной кривой) может быть представлен в виде коэффициэнта (К), на основании изменения которого в динамике лечения судят о снижении, стабилизации или росте бактериальной нагрузки.
Коэффициент К рассчитывают исходя из отношения количества условных единиц генома патогена к количеству условных единиц генома хозяина в исследуемом объеме образца. Коэффициент К рассчитывают до начала терапии, а также в ходе ее осуществления и по окончании. При увеличении К в процессе терапии констатируется увеличение бактериальной нагрузки, при сохранении неизменным - стабилизация состояния, при снижении - уменьшение бактериальной нагрузки, что позволяет оценивать эффективность терапии лепры, обратно пропорциональную бактериальной нагрузке.
Реализация заявляемого способа осуществляется следующими действиями:
1) Производится забор образцов биоптата кожи человека либо лапки мыши, из которых выделяется образец ДНК, содержащий как ДНК носителя, так и возможно, ДНК Mycobacterium leprae, например с использованием набора «Проба-НК» (ООО «НПО ДНК-технология», Россия) либо аналогов. Перед использованием набора образцы биоптата весом от 5 до 200 мг. гомогенизируют в 400 мкл. лизирующего буфера с использованием шаровой мельницы TissueLyser (QUIAGEN, Германия), после чего 100 мкл гомогената используют для выделения ДНК. Далее экстракцию ДНК проводят согласно инструкции производителя набора.
2) Исследование методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводят с использованием прибора StepOne5 (Applied Biosystems, США) либо его аналогов в 0,1 мл пробирках фирмы Axygen (США) с использованием отдельных реакционных объемов для ДНК носителя и ДНК патогена. При этом в обеих реакциях используется один и тот же препарат ДНК, полученный из биоптата. Реакцию осуществляют в 20 мкл смеси, включающей 0,1 мкМ каждого праймера и ГЗ пробы в объеме 1 мкл; 5 мкл реакционной смеси для ПЦР из коммерчески доступного набора qPCRMix-HS фирмы ЗАО «Евроген» (Россия), а также деионизированную воду. Амплификацию проводят по программе, включающей плавление ДНК и активацию полимеразы в течение 5 минут и последующими 40 циклами, включающими гибридизацию праймеров при 60°С (с одновременной детекцией флуоресценции) в течение минуты и плавление реакционной смеси при 95°С в течение 15 секунд. Анализ проводят в присутствии отрицательного контроля, содержащего деионизированную воду вместо ДНК. Считывание флуоресценции проводится для ГЗ RLEP по каналу FAM, для ГЗ к генам АСТВ человека и В2М мыши - по каналу ROX. Для обнаружения генетического материала М. leprae и получения количественных данных используют оригинальные праймеры и гидролизующиеся зонды к некодирующему многокопийному элементу генома лепры RLEP, для количественной оценки генома человека - участок гена бета-актина человека (АСТВ), для количественной оценки генома мыши - участок гена В2-микроглобулина мыши (В2М). Последовательности праймеров и ГЗ приведены в Таблице 1.
Результаты ПЦР-РВ представляются в виде значений порогового цикла Ct (момент начала интенсивного роста флуоресценции в результате разрушения гидролизующихся зондов) для анализируемых участков геномов лепры и человека или мыши.
3) Забор материала и проведение ПЦР-РВ осуществляется повторно по окончании терапии. Таким образом, получают результат в виде значений порогового цикла Ct2 для анализируемых участков геномов лепры и человека или мыши после проведения терапии.
4) Бактериальная нагрузка рассчитывается как соотношение Ct RLEP по отношению к Ct АСТВ человека или В2М мыши (либо соответствующих им результатов условного количества согласно калибровочной кривой) до начала (K1) и по окончании терапии (K2). Изменение данного коэффициэнта К в динамике лечения позволяет оценить происходящее снижение, стабилизацию или рост бактериальной нагрузки в ткани, иными словами позволяет оценить эффективность химиотерапии для лечения лепры.
Пример 1.
В рамках выполнения научно-исследовательской работы Сергиево-Посадским филиалом ФГБУ «ГНЦДК» воспроизведена экспериментальная модель лепры, предложенная Shepard С.С. [5], осуществленная при интраплантарном заражении мышей суспензией, содержащей Mycobacterium leprae. Ограниченный рост Mycobacterium leprae наблюдали в подушечках лап обычных мышей, тогда как более выраженный их рост достигнут у мышей с подавленным иммунитетом, например атимичных голых мышей линии BALB/c Nude [15 - Карамова и др. Опыт экспериментального моделирования лепры на мышах линий BALB/C, BALB/C NUDE, СВА и C57BL/6TNF-/-. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2020, Т. 169. №6. С. 784-787]. В соответствие с разработанным протоколом на следующий день после заражения осуществлялась апробация схемы лечения: терапия РММ: рифампицин 10 мг/кг, моксофлоксацин 150 мг/кг, миноциклин 25 мг/кг. Препараты в виде крахмальной суспензии вводили 1 раз в сутки 5 дней в неделю. Анализ ПЦР-РВ некодирующего многокопийного элемента генома лепры RLEP и В2М генома мыши проводили в биоматериале «лапка мыши» на второй месяц после заражения, а также по истечении двух месяцев осуществления терапии по схеме РММ. Полученные в ходе ПЦР-РВ графики накопления флуоресцентного сигнала некодирующего многокопийного элемента генома лепры RLEP перед началом и по окончании терапии представлены в качестве примера на Фиг. 3. Оценка условной концентрации микобактерий осуществлялась по калибровочным графикам RLEP лепры и В2М мыши, представленным на Фиг. 4. В результате анализа показано снижение отношений значений порогового цикла Ct RLEP/Ct B2M, которое составило 1/7 до начала терапии, и 1/70 по окончании терапии. Полученный результат свидетельствует о снижении бактериальной нагрузки при проведении противолепрозной терапии РММ и является показателем высокой эффективности такой схемы.
Пример 2.
Пациентка Р., 1967 г.р. находится на лечении в отделении клинической лепрологии Сергиево-Посадского филиала ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России с диагнозом «лепра многобактериальная, лепроматозная форма, активная стадия» с сентября 2017 г. С момента поступления получает комбинированную противолепрозную терапию в соответствии со Стандартом специализированной медицинской помощи при лепре, утвержденным приказом Минздрава России №1681н от 29.12.2012 (дапсон 100 мг/сутки ежедневно, рифампицин 600 мг/сутки 1 раз в месяц), адеметионин 400 мг по 2 таблетки в сутки 60 дней, актовегин 5 мл внутривенно ежедневно в течение двух недель. Через 3,5 года после начала лечения у пациентки развилось обострение лепрозного процесса по типу лепрозной узловатой эритемы [16 - Семенова и др., Узловатая эритема как лепрозная реакция. Вестник дерматологии и венерологии. 2020. Т. 96. №3. С. 68-74]. Забор биоматериала для анализа осуществлялся в 2018 и 2020 г, в т.ч. в виде кожного биоптата пораженного участка кожи правой ягодицы (вес биоптата около 100 мг). Анализ ПЦР-РВ некодирующего многокопийного элемента генома лепры RLEP и АСТВ генома человека проводили сразу после забора биоматериала и выделения ДНК. Полученные в ходе ПЦР-РВ графики накопления флуоресцентного сигнала некодирующего многокопийного элемента генома лепры RLEP перед началом и по окончании терапии представлены в качестве примера на Фиг. 5. Оценка условной концентрации микобактерий осуществлялась по калибровочным графикам RLEP лепры АСТВ генома человека, представленным на Фиг. 4. В результате анализа показана неизменность отношений значений порогового цикла Ct RLEP/Ct АСТВ, которое составило 0,55 до начала терапии, и 0,5 через два года проведения терапии. Полученный результат свидетельствует о сохранении бактериальной нагрузки на том же уровне при осуществлении противолепрозной терапии по схеме, утвержденной Стандартом специализированной медицинской помощи при лепре и является показателем эффективности такой схемы лишь в отношении стабилизации состояния пациента.
Полученные результаты подтверждают, что предлагаемый способ оценки изменения бактериальной нагрузки с использованием амплификации видоспецифичных участков генома лепры, а также человека или мыши можно использовать для оценки эффективности антимикобактериального лечения у больных лепрой и модельных животных (лабораторных мышей).
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1. Графики накопления интенсивности флуоресцентного сигнала в зависимости от количества циклов амплификации при исследовании образца биоматериала инфицированного суспензией М. leprae лабораторного животного мышь (сверху вниз по столбцам: разведения от 1 до 1000, максимальная концентрация приведена сверху) А: коамплификация ACTB/RLEP; Б: коамплификация B2M/RLEP.
Фиг. 2. Калибровочный график коамплификации гена человека АСТВ и некодирующего повторяющегося элемента генома Mycobacterium leprae RLEP.
Фиг. 3. Пример проведения исследования образца биоматериала инфицированного суспензией M. leprae лабораторного животного (мыши линии BALB/NUDE); А. до начала терапии; Б. по окончании терапии по схеме РММ.
Фиг. 4. Стандартные графики калибровки накопления флуоресцентного сигнала гидролизуемых зондов к генам мыши и человека АСТВ и В2М (разведения от 1000 до 1). А. калибровочный график амплификации гена человека АСТВ. Б. калибровочный график амплификации гена мыши В2М. В. калибровочный график амплификации некодирующего повторяющегося элемента генома Mycobacterium leprae RLEP.
Фиг. 5. Пример проведения исследования образца биоматериала пациента с диагнозом A30.5 Лепра. Лепроматозная форма; А. до начала терапии; Б. по окончании терапии по схеме РОМ.
Способ оценки эффективности химиотерапии лепры путем количественного анализа в тканях лабораторного животного или человека ДНК Mycobacterium leprae, отличающийся тем, что в полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием высокоспецифичных праймеров и гидролизующихся зондов проводят параллельную амплификацию видоспецифичного участка гена носителя, выбранного из участка гена бета-актина человека (АСТВ) или участка гена В2-микроглобулина мыши (В2М), и вариабельного участка RLEP генома возбудителя с последующим расчетом отношения полученных значений пороговых циклов Ct, на основании изменения которого в динамике лечения судят о снижении, стабилизации или росте бактериальной нагрузки, где при увеличении отношения полученных значений пороговых циклов Ct в процессе терапии констатируется увеличение бактериальной нагрузки, при сохранении неизменным - стабилизация состояния, при снижении - уменьшение бактериальной нагрузки, что позволяет оценивать эффективность терапии лепры, обратно пропорциональную бактериальной нагрузке.