Способ борьбы с биологическими плёнками

Изобретение относится к областям микробиологии, эпидемиологии, санитарии, гигиены и предназначено для борьбы с биологическими плёнками бактерий. Способ борьбы с биологическими плёнками включает две ступени, при этом на первой ступени обнаруживают биологические пленки при помощи каталазного теста и проводят микробиологические смывы с поверхностей при помощи энзимных препаратов, а на второй ступени уничтожают микроорганизмы в состоянии биологических пленок препаратами на основе мультиферментных смесей. При этом на первом этапе первой ступени используют индикатор для проведения каталазной реакции, содержащий пероксид водорода в количестве от 0,5 до 3,0%, а на втором этапе первой ступени используют экспресс-тест, разрушающий экзополисахаридный матрикс (ЭПМ) биоплёнки, при этом индикатор для теста содержит смесь ферментов класса карбогидраз. На второй ступени используют мультиферментную смесь и активно действующие вещества, обладающие бактерицидным и фунгицидным действием в отношении отдельно растущих планктонных форм бактерий и грибов. Изобретение обеспечивает повышение эффективности борьбы с биологическими плёнками. 4 з.п. ф-лы.

 

Область техники.

Заявляемое техническое решение относится к областям микробиологии, эпидемиологии, фармакологии, биохимии, санитарии, гигиены и может быть использовано для борьбы с биологическими плёнками бактерий на различных объектах и поверхностях.

Уровень техники.

Биологические плёнки представляют собой микробные ассоциации, защищающиеся от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды посредством выработки протективного экзополисахаридного матрикса (Т. А. Смирнова, Л. В. Диденко, Р. Р. Азизбекян, Ю. М. Романова. «Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок». Микробиология, 2010, том 79, № 4, с. 435–446 2010 г., [1]).

Бактерии в прикрепленном состоянии, будучи интегрированными в биоплёнку, защищены от повреждающих факторов внешней среды и антибактериальных препаратов и дезинфицирующих средств. Более 95% всех бактерий обитают на абиотических и биотических поверхностях в состоянии биоплёнки, а не в виде планктонных (свободноживущих) форм (А. Г. Афиногенова, Е. Н. Даровская Микробные биопленки ран: состояние вопроса. ТравматологияиортопедияРоссии. – 2011. – No 3(61). – С. 119-125., [2]; O’Toole G.A., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol. Microbiol. 1998. V.30: 295-304, [3]; Микробиология - Гусев М.В., Минеева Л.А., M.: Изд-во Московского университета им. Ломоносова, 1985, [4]).

Экзополисахаридный матрикс (ЭПМ) защищающий бактерии от неблагоприятных факторов внешней среды у различных видов бактерий неодинаков по физическим свойствам и химическому составу, но, как правило, представляет собой анионный полимер. ЭПМ состоит в основном из гомо- и гетерополисахаридов, белков, ДНК, липидов и липополисахаридов. Как анионный полимер, экзополисахаридный матрикс препятствует проникновению катионных антимикробных препаратов внутрь биопленки (Adverse Influences of Antimicrobial Strategy against Mature Oral Biofilm.Shoji Takenaka, Masataka Oda, Hisanori Domon, Rika Wakamatsu, Tatsuya Ohsumi, Yutaka Terao and YuichiroNoiri. Additional information is available at the end of the chapter http://dx.doi.org/10.5772/63564, [5]).

В настоящее время обнаружение и идентификация бактерий в состоянии биоплёнки затруднена, поскольку экзополисахаридный матрикс препятствует механическому переносу бактерий на питательные среды для последующей идентификации (Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Смирнова Т.А. и др. Способность к формированию биопленок в искусственных системах у различных штаммов Salmonella typhimurium. Журнал. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2006. N4: 38-42, [6]; Диденко Л.В., Иванов А.И, Смирнова Т.А., Толордава Э.Р., Зубашева М.В., Кардаш Г.Г., Емшанов О.В. Действие третичных алкиламинов на планктонные культуры и биопленки ESCHERICHIA COLI и STAPHYLOCOCCUS AUREUS. Фармация, 2014. N7:-С.44-49, [7]; Диденко Л.В., Смирнова Т.А., Толордава Э.Р., Зубашева М.В., Кардаш Г.Г., Емшанов О.В. Влияние третичных алкиламинов на биопленки, образованные ESCHERICHIA COLI и STAPHYLOCOCCUS AUREUS (бактериологическое и электронно-микроскопическое исследование). Дезинфекционное дело, 2014. N2. - С.40-45, [8]).

Как анионный полимер, ЭПМ препятствует проникновению катионных антимикробных препаратов внутрь биоплёнки и определяет следующие механизмы устойчивости биопленки при воздействии антимикробных средств:

1) замедляет проникновение биоцидов;

2) некоторые микроорганизмы в биопленке снижают метаболическую активность в ответ на антимикробный стресс;

3) матрикс в более глубокой области биопленки изменяется и уплотняется, чтобы противостоять уничтожению;

4) появляются бактериальные клетки-персистеры в высокой концентрации, которые фенотипически устойчивы к действию антибиотиков, поскольку активные молекулярные мишени последних у персистеров не выражены (Ю. М. Романова, А. В. Тутельян, А. П. Синицын, В. М. Писарев, Н. В.  Алексеева, Н. И. Филипова, Э. Р. Толордава, О. А. Синицына, О. В. Емшанов. «Ферменты из группы карбогидраз разрушают структуру матрикса биопленок грамположительных и грамотрицательных бактерий».Медицинский алфавит № 34 (409), 2019, том № 4, Стоматология. 2019, [9]. M. Ayrapetyan,T. C. Williams, R. Baxter and J. D. Oliver. Viable but Nonculturable and Persister Cells Coexist Stochastically and Are Induced by Human Serum//Infection and Immunity. November 2015 Volume 83 Number 11. [10]).

Одним из перспективных подходов к борьбе с биоплёнко-ассоциированной инфекцией является нарушение структурной целостности и дезорганизация микробной биоплёнки с последующим высвобождением бактерий, доступных для антибактериального воздействия (биоцидные препараты, антибиотики). С этой целью применяют ферменты, способные разрушать полисахариды матрикса. Высвобождаемые от протективного барьера бактерии могут быть в последующем уничтожены.

Ранее различными исследователями были продемонстрированы возможности группы ферментов карбогидраз (подкласс гликозидаз КФ 3.2.1), расщепляющих О гликозидные связи, разрушать полисахариды ЭПМ биопленки. При этом различные гидралазы и лиазы имели разную активность в отношении разных полисахаридов [9].

Ферментативные способы предотвращения образования и/или уменьшения биопленок были описаны и ранее в PCT-заявках на патенты WO 2006031554 [10], WO 2001098214 [11], WO 1998026807 [12], WO 2004041988 [13], WO 1999014312 [14] и WO 2001053010 [15]. Однако потребность в создании наиболее эффективных препаратов и их композиций, способных контролировать рост биопленок в клинических условиях, предотвращая тем самым распространение угрожающих жизни инфекций, все еще остается.

В настоящее время обнаружение и идентификация бактерий в состоянии биоплёнки затруднено, поскольку экзополисахаридный матрикс (ЭПМ) препятствует механическому переносу бактерий на питательные среды для последующей идентификации [9].

Известен способ ферментативного удаления биопленки (патент РФ на изобретение № 2495098, МПК C11D3/386; C12N9/00, 10.10. 2013, [16]), включающий применение фермента пергидролазы и смеси ферментов для удаления к указанной биопленке в течение времени, достаточного для сокращения указанной биопленки по меньшей мере на 25%, которое составляет 45 мин. В течение этого времени указанную смесь ферментов выбирают из протеазы, глюканазы и эстеразы или протеазы, глюканазы, эстеразы и маннаназы или протеазы, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы или трех протеаз, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы или трех протеаз, глюканазы и маннаназы или двух протеаз, целлюлазы, глюканаз, фосфолипазы и маннаназы или протеазы, глюканазы и маннаназы или протеазы, целлюлазы, фосфолипазы и эстеразы или двух протеаз, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы или двух протеаз, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы или трех протеаз, целлюлазы, фосфолипазы и глюканазы или трех протеаз, целлюлазы, фосфолипазы и маннаназы или трех протеаз, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы или протеазы, целлюлазы, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы или по меньшей мере двух амилаз и глюканазы, или по меньшей мере трех амилаз, или по меньшей мере двух амилаз, глюканазы и протеазы

Известны, например, варианты обнаружения биологических пленок на различных абиотических объектах (патент РФ на изобретение № 2722795, МПК G01N33/52; C12Q1/00, 03.06.2020, [17]; патент РФ на изобретение № 2718910, МПК C12Q1/04; G01N33/50, 15.04.2020, [18]), в которых используют индикаторы, которые выявляют грамположительные и грамотрицательные бактерии в состоянии биоплёнки на различных абиотических поверхностях.

В качестве прототипа к заявляемому техническому решению принят аналог [17].

Решаемой технической проблемой является необходимость создания эффективных мероприятий по обнаружению и уничтожению биологических пленок на различных поверхностях и объектах.

У аналога [16] используемые ферменты класса карбогидраз не обладают специфичностью к экзополисахаридам матрикса бактерий и поэтому состав полиферментной смеси для разрушения экзополисахаридного матрикса биопленок бактерий недостаточно эффективен и не позволяет в достаточной мере извлечь бактерии из полимерного защитного матрикса биопленки. Аналог [16] и прототип [17] имеют недостаточную эффективность.

Раскрытие заявляемого технического решения.

Техническим результатом, обеспечиваемым заявляемым техническим решением, является повышение эффективности способа борьбы с биологическими плёнками.

Сущность заявленного технического решения состоит в том, что способ борьбы с биологическими плёнками включает две ступени, при этом на первой ступени обнаруживают биологические пленки при помощи каталазного теста и проводят микробиологические смывы с поверхностей при помощи энзимных препаратов, а на второй ступени уничтожают микроорганизмы в состоянии биологических пленок препаратами на основе мультиферментных смесей. Отличается тем, что:

- на первом этапе первой ступени используют индикатор для проведения каталазной реакции, содержащий пероксид водорода в количестве от 0,5% до 3,0 %, технологические компоненты, представляющие собой стабилизаторы перекиси водорода, ингибиторы коррозии, комплексообразователи и загустители, в количестве от 0,25% до 5,0% и краситель;

- на втором этапе первой ступени используют экспресс-тест, разрушающий экзополисахаридный матрикс (ЭПМ) биоплёнки, при этом индикатор для теста содержит смесь ферментов класса карбогидраз, одновременно все ферменты или раздельно в форме смеси двух, трех, четырех или пяти ферментов: декстраназу, альгинат лиазу, целлюлазу, эндоглюканазы, пергидралазу, эстэразы, манноназу, хитиназу, мутаназу;

- на второй ступени используют мультиферментную смесь содержащую одновременно все ферменты или раздельно в форме смеси двух, трех, четырех или пяти ферментов: амилазы, липазы, протеазы, целлюлазы, декстраназы, эстеразы, манноназы, мутаназы, альгинат лиазы, пергидролазы, хитиназы - содержание в готовом растворе от 0,05 % до 1 %, содержание в концентрате или в порошке для приготовления растворов – от 1,0 % до 5,0 %;

- на второй ступени применяют активно действующие вещества, обладающие бактерицидным и фунгицидным действием в отношении отдельно растущих планктонных форм бактерий и грибов – химические активно действующие вещества дезинфицирующих средств, включая антисептические действующие вещества, или антибиотики, входящие в состав комбинированных с мультиферментными смесями препаратов.

Вышеуказанная сущность является совокупностью существенных признаков заявленного технического решения, обеспечивающих достижение заявленного технического результата.

В частных случаях допустимо выполнять техническое решение следующим образом.

На втором этапе первой ступени в состав индикатора для теста может входить функциональный компонент – поверхностно-активное вещество (ПАВ) N-Cocoalkyl-N,N-dimethylamine oxide в количестве от 0,25 % до 3,0 %.

На второй ступени в мультиферментные смеси желательно добавляют ПАВ - N-Cocoalkyl-N,N-dimethylamine oxide в количестве от 0,1 % до 10,0 %, как синергист для разрушения полисахаридов матрикса для усиления эффективности мультиферментной субстанции.

Химически активно действующими веществами преимущественно являются:

- NN-бис(3-аминопропил)-додециламин в количестве от 0,1 % до 10,0 %;

- четвертичные аммониевые соединения в количестве от 0,1 % до 50,0 %;

- хлоргексидина биглюконат в количестве от 0,1 % до 10,0 %;

- пероксид водорода в количестве от 0,1 % до 10,0 %;

- перкарбонат натрия 50 % и ТАЕД 25 % в виде гранулированного порошка;

- повидон-йод в количестве от 1,0 % до 10,0 %;

- спирт изопропиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

- спирт пропиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

- спирт этиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

- коллоидное серебро в количестве от 0,00025 % до 1,0 %;

- смеси всех вышеперечисленных веществ.

Антисептическими действующими веществами и антибиотиками преимущественно являются:

- четвертичные аммониевые соединения в количестве от 0,1 % до 50,0%;

- хлоргексидина биглюконат в количестве от 0,1 % до 10,0%;

- пероксид водорода в количестве от 0,1 % до 10,0 %;

- повидон-йод в количестве от 1,0 % до 10,0 %;

- спирт изопропиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

- спирт пропиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

- спирт этиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

- коллоидное серебро в количестве от 0,00025 % до 1,0 %;

- антибиотики пенициллинового ряда;

- цефалоспорины;

- карбапенемы;

- макролиды;

- тетрациклины;

- аминогликозиды;

- левомицетины;

- гликопептидные антибиотики;

- линкозамиды;

- фторхинолоны;

- смеси всех вышеперечисленных веществ.

Авторами заявленного технического решения изготовлен опытный образец этого решения, испытания которого подтвердили достижение технического результата.

Осуществление технического решения.

Способ борьбы с биологическими пленками включает две ступени:

1. На первой ступени обнаруживают биологические пленки при помощи каталазного теста и проводятмикробиологические смывы с поверхностей при помощи энзимных препаратов.

1.1 На первом этапе первой ступени используют индикатор для проведения каталазной реакции, содержащий:

- пероксид водорода в количестве от 0,5 % до 3,0 %;

- технологические компоненты в количестве от 0,25 % до 5,0 %;

- краситель.

Технологическими компонентами являются, например,стабилизаторы перекиси водорода, ингибиторы коррозии, комплексообразователи, загуститель.

Каталаза является основным первичным антиоксидантом системы защиты, который катализирует разложение перекиси водорода до воды. Перекись водорода разрушается двумя классами родственных ферментов, катализирующих ее двухэлектронное восстановление до H₂O и использующих в качестве донора электронов H₂O₂ в случае каталазы или различные органические соединения — в случае пероксидазы.

Индикатор наносят аккуратно, без взбалтывания раствора.

На одну обрабатываемую точку необходимо по меньшей мере от 2 до 3 мл раствора, исходя из площади обрабатываемого участка поверхности.

Положительная реакция – это образование мелкой специфической пены (барботирование – реакция бактериального фермента каталазы с пероксидом водорода).

Пена, которая образуется после нанесения индикатора в течение 5-30 с., показывает, где именно остаются после мытья и дезинфекции опасные уровни клинически значимых микроорганизмов. Чувствительность индикатора находится в пределах от 10⁴ до 10⁶ кл/мл.

1.2 Второй этап первой ступени способа представляет собой экспресс-тест, позволяющий разрушить экзополисахаридный матрикс (ЭПМ) биоплёнки и тем самым открыть защищаемые им бактерии для воздействия или различных манипуляций.

В отличие от прототипа индикатор, используемый для проведения данного теста, содержит смесь ферментов класса карбогидраз, которые разрушают специфические полисахариды экзополисахаридного матрикса биоплёнки: декстраназу, альгинат лиазу, целлюлазу, эндоглюканазы, пергидралазу, эстэразы, манноназу, хитиназу, мутаназу.

Смесь ферментов класса карбогидраз разрушающие специфические полисахариды экзополисахаридного матрикса биоплёнки различаются по составу в зависимости от предполагаемых видов биолпёнкообразующих бактерий.

Пример 1. Для разрушения экзополисахаридного матрикса биоплёнок микобактерий туберкулёза и золотистого стафилококка в ферментной смеси используют фермент альгинат-лиазу для разрушения специфических полисахаридов, выделяемых этими видами бактерий – альгинатов.

Пример 2. Для разрушения полисахаридов, выделяемых стафилоккокками и стрептококками, используют целлюлазу, декстраназу и манноназу.

Пример 3. Для разрушения биопленок, содержащих патогенные и плесневые грибы, используют мультиферментные смеси содержащие специфичные для таких видов матрикса ферменты – хитиназа и мутаназа.

Пример 4. Для разрушения матрикса смешанных, поливидовых биопленок грамположительных и грамотрицательных бактерий с включениями грибов используют мультиферментные смеси состоящие из максимального количества приведенных выше ферментов, учитывая возможный бактериальный состав.

В состав индикатора может входить функциональный компонент – ПАВ, N-Cocoalkyl-N,N-dimethylamine oxide в количестве от 0,25 % до 3,0 %.

Индикатор обладает высокой активностью в отношении полисахаридов, белков, липидов и других структурных составляющих экзополисахаридного матрикса (ЭПМ) биологических пленок грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Индикатор разрушает составляющие ЭПМ биопленок, в результате чего планктонные бактерии лишаются своего протективного (защитного) барьера и становятся доступными для различных манипуляций.

Индикатор имеет время экспозиции от 5 до 60 минут, в зависимости от вида и концентрации ферментов, в период которого он эффективно воздействует на структуры экзополисахаридного матрикса биоплёнки в зависимости от степени зрелости биоплёнки.

Индикатор должен быть стерильным.

Индикатор наносят на исследуемые поверхности и через 5 - 10 минут (времени, в течение которого разрушается ЭПМ биоплёнки), без смывания индикатора, производят взятие смывов на диагностические питательные среды.

2. На второй ступени уничтожают микроорганизмы в состоянии биологических пленок препаратами на основе мультиферментных смесей. Уничтожение биологических плёнок подразумевает полное разрушение защитного экзополисахаридного мартикса биоплёнки и умерщвление микроорганизмов внутри биоплёнки.

Уничтожение биологических плёнок на абиотических поверхностях основано на применении химических препаратов, содержащих в своем составе два основных компонента:

- мультиферментные смеси, разрушающие структуры экзополисахаридного мартикса биоплёнки;

- активно действующие вещества, обладающие бактерицидным и фунгицидным действием в отношении планктонных (отдельно растущих, не биопленочных) форм бактерий и грибов.

2.1 Смеси ферментов для разрушения экзополисахаридного матрикса биопленки.

Мультиферментная смесь позволяет разрушить экзополисахаридный матрикс (ЭПМ) биоплёнки и тем самым открыть защищаемые им микроорганизмы для различных манипуляций.

Мультиферментная смесь имеет время экспозиции или время воздействия на структуры экзополисахаридного матрикса биоплёнки от 5 до 60 минут в зависимости от вида и концентрации ферментов и от степени зрелости биоплёнки.

Мультиферментная смесь сохраняет свою стабильность на поверхности долгое время, а при нанесении на поверхность в виде плотной пены - предотвращает контакт поверхности с воздухом, что способствует максимально эффективному воздействию активных веществ индикатора на структурные составляющие биологической пленки.

Композиции мультиферментных смесей отличаются от известных аналогов наличием ферментов из группы карбогидраз, а именно наличием в составе новых ферментов: дополнительно к амилазе, липазе и протеазе используют манноназы, целлюлазы, декстраназы, гидролазы, глюканазы, а также пергидролазы, хитиназы, мутаназы и альгинат лиазы в смесях. В полной рецептуре препаратов смеси ферментов используют ПАВ, которые также разрушают полисахариды экзополисахаридного матрикса и работают с ферментами смеси, как синергисты.

В составе мультиферментной смеси содержится комплекс ферментов и применяется, как одновременно все, так и раздельно в форме смеси двух, трех, четырех, пяти ферментов: амилазы, липазы, протеазы, целлюлазы, декстраназы, эстеразы, манноназы, мутаназы, альгинат лиазы, пергидролазы, хитиназы - содержание в готовом растворе от 0,05 % до 1 %, содержание в концентрате или в порошке для приготовления растворов – от 1,0 % до 5,0 %.

В мультиферментную смесь могут быть добавлены ПАВ - N-Cocoalkyl-N,N-dimethylamine oxide в количестве от 0,1 % до 10,0 %, как синергист для разрушения полисахаридов матрикса для усиления эффективности мультиферментной субстанции.

2.2 Активно действующие вещества, обладающие бактерицидным и фунгицидным действием в отношении планктонных (отдельно растущих, не биопленочных) форм бактерий и грибов – химические активно действующие вещества дезинфицирующих средств или антибиотики, входящие в состав комбинированных с мультиферментными смесями препаратов.

2.2.1 В состав дезинфицирующих препаратов, включая кожные антисептики, для уничтожения биологических пленок на абиотических поверхностях как обязательный компонент входят следующие химические активно действующие вещества:

1) NN-бис(3-аминопропил)-додециламин в количестве от 0,1 % до 10,0 %;

2) Четвертичные аммониевые соединения в количестве от 0,1 % до 50,0 %;

3) Хлоргексидина биглюконат в количестве от 0,1 % до 10,0 %;

4) Пероксид водорода в количестве от 0,1 % до 10,0 %;

5) Перкарбонат натрия 50 % и ТАЕД 25 % в виде гранулированного порошка;

6) повидон-йод в количестве от 1,0 % до 10,0 %;

7) Спирт изопропиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

8) Спирт пропиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

9) Спирт этиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

10) Коллоидное серебро в количестве от 0,00025 % до 1,0 %;

11) Смеси всех вышеперечисленных веществ.

Дезинфицирующие препараты могут быть выполнены в виде готовых к применению растворов, в виде жидких концентратов, в виде гранулированных смесей.

2.2.2 В состав лекарственных препаратов для наружного и внутреннего применения для уничтожения биологических пленок на живых поверхностях (кожа, слизистые оболочки, раневые поверхности) как обязательный компонент входят следующие антисептические действующие вещества и антибиотики:

1) четвертичные аммониевые соединения в количестве от 0,1 % до 50,0 %;

2) хлоргексидина биглюконат в количестве от 0,1 % до 10,0 %;

3) пероксид водорода в количестве от 0,1 % до 10,0 %;

4) повидон-йод в количестве от 1,0 % до 10,0 %;

5) спирт изопропиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

6) спирт пропиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

7) спирт этиловый в количестве от 30,0 % до 80,0 %;

8) коллоидное серебро в количестве от 0,00025 % до 1,0 %;

9) антибиотики пенициллинового ряда:

- пенициллины естественного происхождения - бензилпенициллин и феноксиметилпенициллин;

- полусинтетические пенициллины - метициллин, оксациллин, нафциллин;

- аминопенициллины – амоксициллин, ампициллин;

- карбоксипенициллины - тикарциллин, карбенициллин;

- уреидопенициллины - мезлоциллин, азлоциллин;

- амидинопенициллины – мециллам;

10) цефалоспорины;

- I поколения – цефалоридин, цефалотин, цефапирин, цефрадин, цефазолин, цефалексин, цефадрксил;

- II поколения – цефуроксим, цефаклор, цефамандол, цефотиам, цефсулодин, цефокситин;

- III поколения – цефотаксим, цефоперазон, цефтриаксон, цефтибутен, цефтазидим, цефиксим, цефлодоксим, цефодизим, цефетамет;

- IV поколения - цефпиром, цефепим;

- V поколения - цефтобипрол, цефтаролин, цефтолозан;

11) карбапенемы: биапенем, эртапенем, дорипенем, фаропенем, меропенем, имипенем;

12) макролиды;

- природные: эритромицин, олеандомицин, мидекамицин, спирамицин, лейкомицин, джозамицин;

- эфиры эритромицина, соли эритромицина, соли эфиров эритромицина, соли олеандомицина, эфиры олеандомицина, соли мидекамицина;

- полусинтетические: рокситромицин, кларитромицин, диритромицин, флуритромицин, телитромицин, рокитомицин;

13) тетрациклины;

14) аминогликозиды;

- I поколения – стрептомицин, канамицин, неомицин;

- II поколения – гентамицин, тобрамицин, нетилмицин, сизомицин;

- III поколения - амикацин;

- IV поколения – изепамицин, плазомицин;

15) левомицетины;

16) гликопептидные антибиотики;

17) линкозамиды;

18) фторхинолоны;

- первое поколение: налидиксовая кислота, оксолиновая кислота, пипемидовая кислота;

- второе поколение: ципрофлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, ломефлоксацин;

- третье поколение: спарфлоксацин, левофлоксацин, марбофлоксацин.

- четвертое поколение: моксифлоксацин, гемифлоксацин, гатифлоксацин, ситафлоксацин, тровафлоксацин, делафлоксацин;

19) смеси всех вышеперечисленных веществ.

Мультиферментные смеси на второй ступени могут быть использованы как в составе двухкомпонентных препаратов совместно с антибактериальными веществами, так и отдельно, для приготовления моющих средств, обладающих активностью в отношении экзополисахаридного матрикса биоплёнок, разрушающих биопленки различной степени зрелости.

Такие препараты обладают моющими, дезодорирующими и антиадгезивными свойствами.

В составе таких препаратов, помимо мультиферментных смесей, описанных в пункте 1 смеси ферментов для разрушения экзополисахаридного матрикса биопленки, могут присутствовать анионные и неионогенные ПАВы, имеющие как высоко пенные, так и низкопенные характеристики.

Мультиферментные смеси могут быть использованы для изготовления и входить в состав:

- жидкого гигиенического мыла;

- жидкого антисептического мыла с присутствием антибактериальных компонентов из списка 2.1 данного описания.

- моющего средства для обработки поверхностей из различных материалов, аппаратуры и оборудования;

- низкопенных моющих средств для автоматизированной СИП-мойки (SIP) оборудования в пищевой промышленности;

- моющих средств для применения в автоматизированных пенных мойках;

- моющих средств для ручной и автоматизированной обработки специального оборудования и аппаратуры на предприятиях и производствах пищевой, текстильной, парфюмерной, фармацевтической, целлюлозно-бумажной, холодильной и прочей промышленности;

- препаратов для антиадгезивной обработки поверхностей с целью предотвращения образования биологических пленок;

- препаратов для борьбы с биоплёнками при обработке внутренних поверхностей судов различной тоннажности для очистки после сброса балластных вод;

- препаратов для борьбы с биоплёнками для обработки внутренней поверхности трубопроводов в нефтегазодобывающей промышленности и градирен различного назначения.

Промышленная применимость.

Активность мультиферментных смесей протестирована в ходе НИОКР в рамках Договора №3099ГС1/48651 о предоставлении гранта на проведение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ от 19 июля 2019 г. с Федеральное государственное бюджетное учреждение «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» (Фонд содействия инновациям). Результаты зафиксированы в Научном отчете № Госрегистрации АААА-А19-119072390056-1 (УДК 615.4:613/614) «Разработка опытных образцов индикаторов биологических пленок (на основе перекисных соединений, на основе флуорохромного красителя и на основе полиферментной смеси) и исследование их целевой эффективности для детекции (обнаружения) биологических плёнок бактерий».

Испытания индикаторов и ферментных смесей проводились на Договорной основе в НИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи в 2019 – 2020 годах. На основании официальных отчетов разработан Научный отчет № Госрегистрации АААА-А19-119072390056-1 от июля 2020 года.

1. Способ борьбы с биологическими плёнками, включающий две ступени, при этом на первой ступени обнаруживают биологические пленки при помощи каталазного теста и проводят микробиологические смывы с поверхностей при помощи энзимных препаратов, а на второй ступени уничтожают микроорганизмы в состоянии биологических пленок препаратами на основе мультиферментных смесей, отличающийся тем, что

- на первом этапе первой ступени используют индикатор для проведения каталазной реакции, содержащий пероксид водорода в количестве от 0,5 до 3,0%, технологические компоненты, представляющие собой стабилизаторы перекиси водорода, ингибиторы коррозии, комплексообразователи и загустители, в количестве от 0,25 до 5,0% и краситель;

- на втором этапе первой ступени используют экспресс-тест, разрушающий экзополисахаридный матрикс (ЭПМ) биоплёнки, при этом индикатор для теста содержит смесь ферментов класса карбогидраз, одновременно все ферменты или раздельно в форме смеси двух, трех, четырех или пяти ферментов: декстраназу, альгинат лиазу, целлюлазу, эндоглюканазы, пергидралазу, эстэразы, манноназу, хитиназу, мутаназу;

- на второй ступени используют мультиферментную смесь, содержащую одновременно все ферменты или раздельно в форме смеси двух, трех, четырех или пяти ферментов: амилазы, липазы, протеазы, целлюлазы, декстраназы, эстеразы, манноназы, мутаназы, альгинат лиазы, пергидролазы, хитиназы - содержание в готовом растворе от 0,05 до 1%, содержание в концентрате или в порошке для приготовления растворов – от 1,0 до 5,0%;

- на второй ступени применяют активно действующие вещества, обладающие бактерицидным и фунгицидным действием в отношении отдельно растущих планктонных форм бактерий и грибов – химические активно действующие вещества дезинфицирующих средств, включая антисептические действующие вещества, или антибиотики, входящие в состав комбинированных с мультиферментными смесями препаратов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на втором этапе первой ступени в состав индикатора для теста входит функциональный компонент – поверхностно-активное вещество (ПАВ) N-Cocoalkyl-N,N-dimethylamine oxide в количестве от 0,25 до 3,0%.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на второй ступени в мультиферментные смеси добавляют ПАВ - N-Cocoalkyl-N,N-dimethylamine oxide в количестве от 0,1 до 10,0%, как синергист для разрушения полисахаридов матрикса для усиления эффективности мультиферментной субстанции.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что химически активно действующими веществами являются:

- NN-бис(3-аминопропил)-додециламин в количестве от 0,1 до 10,0%;

- четвертичные аммониевые соединения в количестве от 0,1 до 50,0%;

- хлоргексидина биглюконат в количестве от 0,1 до 10,0%;

- пероксид водорода в количестве от 0,1 до 10,0%;

- перкарбонат натрия 50% и ТАЕД 25% в виде гранулированного порошка;

- повидон-йод в количестве от 1,0 до 10,0%;

- спирт изопропиловый в количестве от 30,0 до 80,0%;

- спирт пропиловый в количестве от 30,0 до 80,0%;

- спирт этиловый в количестве от 30,0 до 80,0%;

- коллоидное серебро в количестве от 0,00025 до 1,0%;

- смеси всех вышеперечисленных веществ.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антисептическими действующими веществами и антибиотиками являются:

- четвертичные аммониевые соединения в количестве от 0,1 до 50,0%;

- хлоргексидина биглюконат в количестве от 0,1 до 10,0%;

- пероксид водорода в количестве от 0,1 до 10,0%;

- повидон-йод в количестве от 1,0 до 10,0%;

- спирт изопропиловый в количестве от 30,0 до 80,0%;

- спирт пропиловый в количестве от 30,0 до 80,0%;

- спирт этиловый в количестве от 30,0 до 80,0%;

- коллоидное серебро в количестве от 0,00025 до 1,0%;

- антибиотики пенициллинового ряда;

- цефалоспорины;

- карбапенемы;

- макролиды;

- тетрациклины;

- аминогликозиды;

- левомицетины;

- гликопептидные антибиотики;

- линкозамиды;

- фторхинолоны;

- смеси всех вышеперечисленных веществ.