Комбинированная вакцина для свиней

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к ветеринарии, иммунологии и вирусологии, и предназначена для вакцинирования свиней против заболевания, ассоциированного с инфекцией цирковируса свиней типа 2 (PCV2) и вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV). Комбинированная вакцина содержит неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 и живой PRRSV. Вакцина представляет собой эмульсию масло-в-воде, содержащую сквалан и ацетат витамина E. Также, представлены способы получения указанной комбинированной вакцины. В другом воплощении представлена эмульсия масло-в-воде, содержащая сквалан и ацетат витамина E, неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 и живой PRRSV. В другом воплощении представлено применение неспособного к воспроизведению антигена из PCV2 и живого PRRSV для изготовления комбинированной вакцины. Кроме того, представлен способ вакцинации свиней против PCV2 и PRRSV посредством введения указанной комбинированной вакцины. Использование группы изобретений позволяет комбинировать живой вирус PRRSV с инактивированным антигеном из PCV2, обеспечивая безопасную и эффективную вакцину против заболевания, ассоциированного с инфекцией PCV2 и PRRSV. 7 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области ветеринарной вакцинологии, а именно, к комбинированным вакцинам для свиней. В частности, изобретение относится к комбинированной вакцине, содержащей неспособный к воспроизведению антиген из цирковируса свиней типа 2 и живой вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней. А также, изобретение относится к набору из частей, воплощающему комбинированную вакцину и к способам и применениям для комбинированной вакцины.

В настоящее время интенсивное свиноводство сильно зависит от ветеринарных медицинских продуктов для сохранения здоровья животных и обеспечения экономических операций. После оптимизации систем питания и организации производства на ферме, множество обработок используют регулярно: обработку лекарственными средствами, такими как гормоны или антибиотики, и вакцинацию против бактериальных или вирусных патогенов. Некоторые из наиболее выраженных заболеваний, поражающих свиней с молодого возраста и далее, вызваны бактериями, такими как: Mycoplasma hyopneumoniae и Lawsonia intracellularis; и вирусами, такими как цирковирус свиней типа 2 и вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней.

Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) представляет собой первичный агент, вызывающий (свиную) энзоотическую пневмонию, хроническое респираторное заболевание у свиней, возникающее во всем мире. Особенно молодые поросята подвержены этому высоко контагиозному заболеванию. Бактерия является относительно небольшой, лишена клеточной стенки и принадлежит к роду Mollicutes. Эти бактерии проживают жизнь как паразиты на или в клетках-хозяевах.

Заболевание легких из-за Mhyo является по большей части иммуноопосредованной патологией, приводящей к консолидированной пневмонии. Бактерия колонизирует и повреждает реснитчатый эпителий, что приводит к потере активности ресничек. В зависимости от условий содержания и внешнего стресса, наиболее проблематичным последствием этого заболевания является то, что оно вызывает предрасположенность к различным вторичным инфекциям респираторной системы свиней посредством других бактериальных и вирусных патогенов. Это приводит к так называемому: комплексу респираторных заболеваний у свиней (PRDC), проявляющему серьезные очаги в легких. Наряду с дискомфортом для животного, энзоотическая пневмония и PRDC вызывают важные экономические потери в индустрии свиноводства из-за уменьшенных эффективности скорости роста и коэффициента усвоения корма, так же как из-за затрат на ветеринарное обслуживание и использование антибиотиков.

Lawsonia intracellularis (Lawsonia) вызывает пролиферативную энтеропатию, также известную как илеит, представляющий собой распространенное заболевание кишечника поросят после отъема во всем мире. Характерным повреждением является пролиферация незрелых энтероцитов в илеальных кишечных криптах, где эти клетки содержат вызывающие заболевание бактерии. Выведение бактерий из энтероцитов приводит к разрешению ассоциированных пролиферативных очагов. Гистологические очаги можно подтверждать как положительные по Lawsonia посредством визуализации бактерий длиной 1,5-2,5 мкм, вибриоидной формы, в энтероцитах, но также внутри макрофагов кишечника. Бактерии можно детектировать посредством ПЦР в клинических или в субклинических случаях. Клинические случаи обычно представлены в периоде выращивания-второго периода откорма.

Бактерии Lawsonia впервые описаны в 1995 г. (McOrist et al., Int. J. Syst. Bact., vol. 45, p. 820-825). Они представляют собой облигатные внутриклеточные и неподвижные грамотрицательные бациллы, из семейства Desulfovibrionaceae.

Цирковирус свиней типа 2 (PCV2) связан с синдромом мультисистемного послеотъемного истощения (PMWS), наблюдаемым у молодых поросят. Клинические признаки и патология опубликованы в 1996 г. и включают прогрессивное истощение, диспноэ, тахипноэ, и эпизодически иктерус и желтуху. Этот новый агент назван PCV2 как отличный от известного PCV, который являлся естественным организмом, заражающим клетки PK-15.

PCV2 является очень небольшим безоболочечным вирусом из рода Circovirus. Он содержит геном из кольцевой одноцепочечной ДНК с двумя главными генами. Ген ORF2 кодирует белок вирусного капсида из приблизительно 233 аминокислот. Экспрессированные рекомбинантным способом белки ORF2 PCV2 формируют вирусоподобные частицы, которые являются высоко эффективными в качестве субъединичной вакцины.

Вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) впервые опубликован в 1987 г., и в ранние 1990 гг. стал пандемичным. Он является небольшим оболочечным РНК-вирусом из рода Arterivirus, который содержит одноцепочечный, положительно-смысловой РНК-геном. Этот вирус вызывает значительные потери в индустрии свиноводства из-за репродуктивных нарушений и задержки роста. Подобно Mhyo, PRRSV играет важную роль в многофакторном PRDC. Клинические симптомы представляют собой выкидыши и наличие мертворожденных или мумифицированных плодов, и цианоз уха и вульвы. У новорожденных поросят, вирус вызывает респираторный дистресс, с увеличенной чувствительностью к вторичным респираторным инфекциям, таким как болезнь Глассера (вызываемая Haemophilus parasuis). Однако субклинические инфекции также являются распространенными. Вирус является довольно изменчивым: наряду с европейским вариантом (тип 1) и с североамериканским вариантом (тип 2), в настоящее время существует третий генотип: высоко патогенный вариант, возникший в Китае в 2000 г., и в настоящее время вызываеющий тяжелое заболевание у свиней в Азии.

Существуют коммерческие вакцины против каждого из этих патогенов:

Существует множество коммерческих вакцин против Mhyo, и они являются общепринятыми в большинстве коммерческих операций в свиноводстве. Как правило, эти вакцины содержат неспособные к воспроизведению иммуногены, такие как субъединицы белков и/или бактерины (т.е. убитые бактерии, интактные или нет), которые, как правило, вводят посредством парентеральной инъекции. Некоторыми примерами являются: RespiSure™ (Zoetis), Ingelvac™ M. hyo (Boehringer Ingelheim) и M+Pac™ (Merck Animal Health).

Вакцины против Lawsonia являются коммерчески доступными, например, Enterisol™ Ileitis (Boehringer Ingelheim Vetmedica, USA), представляющая собой живую ослабленную вакцину, и Porcilis™ Ileitis (Merck Animal Health, USA), представляющая собой бактерин с адъювантом.

Вакцина против инфекции PCV2 может быть основана на полноразмерном инактивированном вирусе PCV2, например, Circovac™ (Merial), или инактивированном химерном вирусе PCV1/PCV2 (Suvaxyn™ PCV, Zoetis). Более распространенными являются субъединичные вакцины из экспрессированного рекомбинантным способом белка ORF2 PCV2, например, из системы экспрессии на основе бакуловируса-клетки насекомого. Примерами являются: Porcilis™ PCV (MSD Animal Health) и Ingelvac CircoFlex™ (Boehringer Ingelheim).

Вакцины против PRRSV на основе инактивированного вируса описаны и являются коммерчески доступными. Однако вакцины на основе живого ослабленного вируса считают более эффективными. Примерами являются: Porcilis™ PRRS (MSD Animal Health), Ingelvac PRRS™ MLV (Boehringer Ingelheim) и Fostera™ PRRS (Zoetis).

Для ограничения стресса для животных, и оплаты и трудозатрат ухаживающего персонала, некоторые вакцины для свиней получены в форме комбинированной вакцины. Примерами являются: Fostera™ PCV MH (Zoetis) и Porcilis PCV Mhyo (MSD Animal Health), объединяющие антигены из PCV2 и Mhyo.

В Патентной заявке WO 2013/152086 (Zoetis) описана трехвалентная комбинированная вакцина для свиней, объединяющая антигены из PCV2 и Mhyo с живым PRRSV, однако описанная вакцина не является коммерчески доступной. Следовательно, в данной области существует заинтересованность в эффективных комбинированных вакцинах для свиней против соответствующих заболеваний свиней.

Важным компонентом вакцин, содержащих неспособные к воспроизведению антигены, является адъювант. Это обеспечивает иммуностимуляцию для неспособного к воспроизведению антигена, который может в ином случае не являться иммуногенным. Это может запускать различные пути иммунной системы, лежащие в основе механизмы не полностью понятны. В ветеринарных вакцинах, широкое множество соединений можно использовать в качестве адъюванта, например: минеральное масло, например, байоль™ или маркол™, монтанид™ или парафиновое масло; неминеральное масло, такое как сквален, сквалан или растительные масла, например, этилолеат; соли алюминия, например, гидроксид алюминия или фосфат алюминия; пептиды, такие как диметилглицин, или тафтсин; компоненты бактериальной клеточной стенки, такие как липид A и мурамилдипептид; (синтетические) полимеры, такие как плюроники, декстраны, карбомеры, пиран или сапонин; цитокины; и стимуляторы toll-подобных рецепторов, такие как иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды, содержащие неметилированные CpG-группы; и т.д.

Основной проблемой для преодоления при получении адъювантных комбинированных вакцин является предотвращение взаимодействия между различными компонентами вакцины, которое может отрицательно влиять на иммунный ответ или на безопасность или стабильность вакцины. Такое взаимодействие может, например, возникать между собственно антигенами, например, поскольку некоторые являются довольно неочищенными продуктами, такие как бактерины из Mhyo и из Lawsonia. А также, адъювант может создавать помехи для антигена вакцины, или даже разрушать его. Такое неблагоприятное взаимодействие имеет особенную важность, когда комбинация содержит живой микроорганизм. Это известно также регистрирующим органам, предоставляющим регистрационные удостоверения, например: USDA настаивает на предписании 9CFR 113.35 для детекции вироцидной активности в инактивированной вакцине, содержащей живой вирус.

Эти потенциальные проблемы в развитии комплексных комбинированных вакцин являются общеизвестными; см., например, публикацию EMEA: «Note for guidance: requirements for combined veterinary products» (EMEA, 2000, CVMP/IWP/52/97-FINAL); и публикацию U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologies Evaluation and Research, from April 1997: «Guidance for Industry, for the evaluation of combination vaccines for preventable diseases: Production, Testing and Clinical Studies», Docket No. 97N-0029. В обеих этих публикациях предупреждают об эффектах влияний на эффективность и безопасность вакцины, при объединении антигенов и адъювантов.

Таким образом, является сложной разработка комбинированной вакцины, индуцирующей эффективный иммунный ответ против комбинации неспособных к воспроизведению антигенов и способного к воспроизведению микроорганизма, особенно для комплексных комбинаций, относящихся к множеству видов патогенов. Кроме того, комбинированная вакцина должна быть безопасной при использовании для животных, т.е., не вызывать значительных побочных реакций, таких как лихорадка, местное набухание, потеря аппетита и т.д., а также, более практические свойства являются важными: комбинированная вакцина должна в идеале обеспечивать возможность экономически выгодного производства, являться достаточно стабильной в ходе составления и хранения, и позволять способы тестирования активности каждого антигена, в присутствии других антигенов.

Таким образом, целью настоящего изобретения является преодоление одного или нескольких недостатков предшествующего уровня техники, и удовлетворение необходимости в данной области посредством предоставления эффективной и безопасной комбинированной вакцины для свиней против заболевания, ассоциированного с инфекцией PCV2 и PRRSV.

К сожалению, непосредственная комбинация неспособного к воспроизведению антигена PCV2 и живого вируса PRRS в существующем адъювантном составе не являлась успешной. Например: адъювантный состав, используемый для нескольких других вакцин для свиней, представляет собой Xsolve™ (ранее называемый: Microsol-Diluvac Forte™; MSD Animal health). Он содержит комбинацию адъювантов легкого минерального масла и ацетата витамина E с эмульгатором Tween™ 80. Его используют, например, для: Porcilis PCV (содержащей антиген ORF2 PCV2), Porcilis Ileitis (содержащей бактерин Lawsonia) и Circumvent PCV-M G2 (содержащей антигены PCV2 и Mhyo)

Однако комбинированная вакцина из неспособных к воспроизведению антигенов из Mhyo, Lawsonia и PCV2 с живым PRRSV в Xsolve не являлась единообразно эффективной. Это в основном обусловлено вироцидным эффектом на компонент живого PRRSV. Кроме того, Xsolve, подобно другим адъювантам, содержащим минеральное масло, индуцирует относительно сильные реакции на вакцинацию. В то время как они находятся полностью в допустимых пределах, улучшение является желательным.

Подобным образом, для комбинации из этих 4 антигенов в адъюванте, известном как Amphigen™ (Zoetis), также показан вироцидный эффект на PRRSV. Amphigen содержит минеральное масло в качестве адъюванта и лецитин в качестве эмульгатора.

А также, адъювант Emunade (минеральное масло+гидроксид алюминия) являлся вироцидным для живого PRRSV.

Один из адъювантных составов, описанных в WO 2013/152086 ('086) уже не является значительно вироцидным для живого PRRSV: 10% разведение состава, называемого «масло SP». Этот адъювант является коммерчески доступным как Metastim™. К сожалению, точный состав тестированного препарата не описан, но предпочтительные диапазоны составов масла SP приведены в разделе, охватывающем страницы 24-25 из '086. Использование этого масла SP в 10% разведении в вакцине, таким образом означает, что тестированная вакцина содержит: 0,1-0,3% об./об. плюроника™, 0,3-0,6% об./об. сквалана и 0,01-0,05% об./об. Tween 80.

В '086 рекомендован также ряд других «пригодных» адъювантов ('086, страница 25, строки 7-15), среди которых присутствуют Amphigen и Xsolve. Однако на практике они оказались непригодными; некоторое из этого также очевидно из фигуры 10 из '086.

Другим известным адъювантом для вакцин является AS03™ (GSK), содержащий 2,1% масс./об. сквалена и 2,4% масс./об. витамина E, с 1,0% масс./об. Tween 80 в качестве эмульгатора. Однако этот адъювант описан для применения для человека, и для антигена из единственного вида патогена, в основном, инактивированного вируса гриппа человека. Кроме того, использование AS03 в научных исследованиях связали с увеличенным риском анафилаксии, и с индукцией аутоиммунных нарушений.

Кроме того, в то время как одновалентная вакцина Porcilis™ Mhyo составлена в водном солюбилизате ацетата витамина E, обнаружено, однако, что в комбинации с антигеном PCV2, полностью отличный адъювант и состав являлись оптимальными: двухвалентная комбинированная вакцина Porcilis PCV Mhyo снабжена адъювантом Emunade™, смесью минерального масла и гидроксида алюминия, и антигены необходимо комбинировать конкретным способом, как описано в WO 2016/091998.

Серии вакцин ProSystem™ (Merck Animal Health) представляют собой серии вакцин для свиней, содержащих множество неспособных к воспроизведению антигенов из различных видов бактерий. Эти вакцины представляют собой водные составы, снабженные адъювантом гелем гидроксида алюминия. Они лицензированы для ресуспендирования лиофилизированных вакцин для свиней с живыми ослабленными вирусами, такими как вирус инфекционного гастроэнтерита и ротавирус.

Также отличной, применительно к составу и использованному адъюванту, является трехвалентная комбинированная вакцина 3Flex™ (Boehringer Ingelheim). Ее поставляют на рынок в форме 3 отдельных бутылей с неспособными к воспроизведению антигенами из Mhyo и PCV2, объединенными с живым PRRSV. Их также следует смешивать на месте, для формирования водной композиции, с адъювантом, называемым Impranflex™, содержащим карбопол.

Из этого множества вариантов, авторы изобретения не получили указаний, какой тип состава и какой тип адъюванта(адъювантов) использовать для разработки комбинированной вакцины, являющейся безопасной и стабильной, и эффективной против заболевания, ассоциированного с инфекцией PCV2 и PRRSV.

Неожиданно обнаружено, что этой цели можно достигнуть, и следовательно, один или несколько недостатков предшествующего уровня техники можно преодолеть, посредством предоставления комбинированной вакцины для свиней, содержащей неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 и живой PRRSV, при этом вакцину составляют в форме эмульсии масло-в-воде и снабжают адъювантом скваланом и ацетатом витамина E.

Обнаружено, что комбинированная вакцина этого типа и композиция являлись невироцидными для живого PRRSV, и являлись эффективными для защиты свиней против инфекции PCV2 и PRRSV. А также, вакцина являлась безопасной для животных-мишеней, обеспечивала возможность экономически выгодного производства, являлась стабильной в ходе составления и хранения, и позволяла тестирование активности всех антигенов в конечной вакцине.

Точно не известно, почему этот конкретный состав и этот конкретный выбор адъювантов обеспечивает такие преимущества для этой комбинации антигенов. Несмотря на то, что авторы изобретения не желают быть связанными какой-либо теорией или моделью, которая может объяснить эти обнаружения, они выдвинули гипотезу, что конкретная комбинация сквалана и ацетата витамина E, в составе масло-в-воде, просто обеспечивает правильный уровень иммуностимуляции для этих антигенов, чтобы являться эффективными против связанных с ними заболеваний. Это присутствует без вызова значительных побочных реакций на вакцинацию, и по-видимому, защищает живой PRRSV от значительного вироцидного эффекта адъюванта и других антигенов.

Это совсем не являлось очевидным из предшествующего уровня техники, поскольку не существует другой комбинированной вакцины, содержащей эти антигены. А также, некоторые адъюванты, описанные для других комбинированных вакцин для свиней, оказалось невозможным использовать для этой конкретной комбинации.

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к комбинированная вакцине, содержащей неспособный к воспроизведению антиген из цирковируса свиней типа 2 (PCV2) и живой вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), отличающейся тем, что вакцина представляет собой эмульсию масло-в-воде, содержащую сквалан и ацетат витамина E.

«Комбинированная вакцина» представляет собой вакцину, содержащую антигены из более, чем одного вида микроорганизма.

Хорошо известно, что «вакцина» представляет собой композицию, имеющую медицинский эффект. Вакцина содержит иммунологически активный компонент и фармацевтически приемлемый носитель. «Иммунологически активный компонент» представляет собой одну или несколько антигенных молекулу(молекул), в настоящем описании: неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 и живой PRRSV. Они поддаются узнаванию иммунной системой свиней-мишеней и индуцируют защитный иммунологический ответ. Этот ответ может происходить из врожденной и/или из приобретенной иммунной системы мишени, и может относиться к клеточному и/или гуморальному типу.

Вакцина, как правило, является эффективной для уменьшения тяжести инфекции, например, посредством уменьшения количества патогенов, или уменьшения длительности воспроизведения патогена в животном-хозяине.

В дополнение к этому или возможно, в результате этого, вакцина, как правило, является эффективной для уменьшения или облегчения (клинических) симптомов заболевания, которые могут быть вызваны такими инфекцией или воспроизведением, или ответом животного на такие инфекцию или воспроизведение.

Комбинированная вакцина по изобретению индуцирует у свиней-мишеней защитный иммунный ответ, эффектом которого является предотвращение или уменьшение тяжести инфекции PCV2 и PRRSV. А также, комбинированная вакцина предотвращает или уменьшает один или несколько признаков заболевания, ассоциированных с такими инфекцией или воспроизведением. Это переводит положительный эффект в экономические параметры, такие как: коэффициент усвоения корма, средний ежесуточный прирост массы тела, качество туши, и объем и качество помета. Наблюдаемыми эффектами комбинированной вакцины по изобретению являются:

для PCV2: уменьшение вирусной нагрузки в крови и лимфатических тканях; у откармливаемых поросят: уменьшение смертности и потери массы тела;

и для PRRSV: для откармливания поросят: уменьшение респираторных заболеваний с некротизирующей интерстициальной пневмонией, приводящее к улучшенному росту и коэффициенту усвоения корма. Для разведения поросят: уменьшение переноса вируса через плаценту и улучшение применительно к репродуктивным нарушениям, таким как: преждевременный опорос и наличие мертворожденных или мумифицированных поросят, и слабость и респираторное заболевание после отъема у выживших поросят.

Для инфекции PCV2 и PRRSV, индукцию иммунной защиты и таким образом, активность комбинированной вакцины по изобретению, можно детектировать серологически как увеличение уровня в сыворотке специфических для патогена антител, легко поддающееся детекции с использованием способов на основе ELISA.

На комбинированную вакцину по изобретению можно ссылаться просто как на вакцину «против» PCV2 и PRRSV; или как на вакцину из PCV2 и PRRSV.

Детали и предпочтения для комбинированной вакцины по изобретению описаны в настоящем описании ниже.

«Фармацевтически приемлемый носитель» по изобретению представляет собой водную жидкость высокой степени чистоты и, предпочтительно, стерильную, например: воду, физиологический солевой раствор, или раствор фосфатно-солевого буфера. Носитель может содержать дополнительные наполнители, такие как стабилизаторы или консерванты.

Термин «содержащий» (так же как варианты, такие как «содержать», «содержит» и «содержащийся»), в рамках изобретения, предназначен для обозначения всех элементов, и в любой возможной комбинации, допустимой по изобретению, охваченной или включенной в раздел, абзац текста, пункт формулы изобретения и т.д., в которых использован этот термин, даже если такие элементы или комбинации не перечислены в явной форме; а не для исключения какого-либо из таких элемента(элементов) или комбинаций.

Таким образом, любой такой раздел, абзац текста, пункт формулы изобретения и т.д., может, таким образом, относиться к одному или нескольким варианту(вариантам) осуществления, где термин «содержащий» (или его варианты) заменены такими терминами, как «состоит из», «состоящий из» или «состоит в основном из».

«Антиген» относится к молекулам, которые могут индуцировать иммунологический ответ в подходящих условиях. Антиген может быть получен синтетически или может происходить из биологического источника, например, он может представлять собой микроорганизм или его часть.

«Неспособный к воспроизведению» антиген относится к молекулам, таким как белки, углеводы, липиды или нуклеиновые кислоты, или представляет собой их комплексные комбинации, более или менее чистые. При получении из микроорганизма, неспособный к воспроизведению антиген может относится к интактному, но убитому (т.е. неспособному к воспроизведению) микроорганизму, или может представлять собой его часть, такую как экстракт, фракция, гомогенат или соникат. А также, неспособный к воспроизведению антиген может представлять собой продукт на основе нуклеиновой кислоты или рекомбинантный продукт, такой как экспрессирующий вектор или экспрессированный белок, или продукт системы для экспрессии in vitro. Все это хорошо известно в данной области.

По изобретению, PRRSV является способным к воспроизведению.

«Живой PRRSV» относится к живому PRRSV, пригодному для использования в качестве компонента вакцины, т.е. имеющему уменьшенный уровень патогенности, также известному как ослабленный или модифицированный живой.

«Ослабленный» по изобретению определяют как вызывающий меньший уровень очагов и/или имеющий уменьшенную скорость инфекции или воспроизведения. Все это по сравнению с немодифицированным или относящимся к «дикому типу» PRRSV.

Ослабление PRRSV можно получать in vitro, например, посредством пассирования через экспериментальных животных или в культуре клеток и отбора, или посредством технологии рекомбинантной ДНК, все хорошо известно в данной области.

В то время как является биологически некорректным обозначать вирус как являющийся «живым», это является общепринятым способом обозначения вируса, который не является инактивированным. Следовательно, по изобретению, термин «живой», применительно к PRRSV, относится к вирусу PRRS, который является способным к воспроизведению в подходящих условиях, например, в подходящих клетках-хозяевах или животных.

«Цирковирус свиней типа 2» и «вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней» все хорошо известны в данной области как вирусы, принадлежащие к соответствующим родам и семействам. Они индуцируют заболевания, как описано в хорошо известных руководствах, таких как: «The Merck veterinary manual» (10th ed., 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X), или: «Diseases of Swine», 10th ed., Zimmerman edt., Wiley-Blackwell, Ames, IA., USA, ISBN: 081382267X.

Каждый из этих патогенов проявляет характерные признаки членов своей таксономической группы, такие как морфологические, геномные и биохимические характеристики, так же как биологические характеристики, такие как физиологическое, иммунологическое или патологическое поведение.

Как известно в данной области, классификация микроорганизма как конкретного вида основана на комбинации таких признаков. Изобретение, таким образом, включает также PCV2 или PRRSV, подклассифицированные из них каким-либо образом, например, такие как подвид, штамм, изолят, генотип, вариант, подтип или подгруппа и т.п.

Специалисту в данной области очевидно что в то время как конкретный PCV2 или PRRSV по изобретению можно в настоящее время приписать конкретному виду, это представляет собой таксономическую классификацию, которая может измениться со временем, поскольку новые открытия могут привести к переклассификации в новую или отличную таксономическую группу. Однако, поскольку это не изменяет собственно микроорганизм или его антигенный репертуар, но только его научное наименование или классификацию, такие переклассифицированные микроорганизмы остаются в объеме изобретения.

PCV2 и PRRSV для использования по изобретению можно получать из множества источников, например, как полевой изолят из свиней в дикой природе или на ферме, или из различных лабораторий, (депозитарных) учреждений или (ветеринарных) университетов.

«Эмульсия масло-в-воде» представляет собой хорошо известную композицию, содержащую внешнюю водную фазу, содержащую внутреннюю диспергированную масляную фазу. Посредством выбора подходящих вида и концентрации эмульгатора(эмульгаторов), можно формировать такую эмульсию. Способы и оборудование для получения эмульсии масло-в-воде для использования в качестве вакцины хорошо известны в данной области, и описаны, например, в руководствах, таких как: «Remington: the science and practice of pharmacy» (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), и: «Veterinary vaccinology» (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).

По изобретению, внешняя водная фаза содержит неспособный к воспроизведению антиген из PCV2, и живой PRRSV в фармацевтически приемлемом носителе; и масляная фаза содержит сквалан и ацетат витамина E в качестве адъювантов.

Обнаружено, что комбинированная вакцина по изобретению является очень эффективной, безопасной и стабильной, при получении в форме эмульсии масло-в-воде.

Варианты осуществления и предпочтения для изготовления эмульсии масло-в-воде для комбинированной вакцины по изобретению описаны в настоящем описании ниже.

«Сквалан» относится к химическому соединению с номером CAS 111-01-3. Некоторые альтернативные наименования представляют собой: гидрогенизированное масло из печени акулы, гексаметилтетракозан или пергидросквален. Его не следует путать с скваленом (CAS номер 111-02-4), который представляет собой поли-ненасыщенное масло C30 и поддается метаболизму как соединение пути холестерина. Однако сквалан является полностью гидрогенизированной формой сквалена и таким образом, не подвержен окислению. Таким образом, в то время как сквалан не является минеральным маслом и подвергается транспорту от участка инъекции, он не подвергается метаболизму.

Исходно, предшественник сквалана получали из печени акулы, но из-за опасений по поводу окружающей среды, перешли на другие природные источники, такие как оливковое масло, или на химический синтез. Таким образом, в определение сквалана включены природные, синтетические или полусинтетические формы, или их смеси. Сквалан является коммерчески доступным во множестве квалификаций чистоты, например: из растительного источника, из Worlee (сквалан, растительный) или Croda (сквалан Pripure); или синтетический, например, из Kuraray (сквалан-PE). По изобретению, высокая чистота сквалана является предпочтительной: предпочтительно, чистота более 75%, более предпочтительно, чистота более 80, 90 или даже более 95%, в таком порядке предпочтения.

«Ацетат витамина E» относится к химическому соединению с номером CAS 58-95-7. Некоторые альтернативные наименования представляют собой: ацетат токоферола, или ацетат альфа-токоферола. Ацетат витамина E представляет собой ацетатный сложный эфир витамина E (токоферола) и может быть получен из растительных материалов, таких как семена, орехи, фрукты или листья, или из жирного мяса, но может быть также получен синтетически. Таким образом, в определение ацетата витамина E включены природные, синтетические или полусинтетические формы, или их смеси. Ацетат витамина E является коммерчески доступным, с различными степенями чистоты.

По изобретению, неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 предпочтительно представляет собой: белок ORF2.

Каждый из антигенов в комбинированной вакцине по изобретению может принадлежать к одному типу или может принадлежать к множеству типов, например, из одного или из более, чем одного штамма соответствующего патогена.

Сквалан в комбинированной вакцине по изобретению присутствует в количестве между приблизительно 1 и приблизительно 9% масс./об. вакцины. Более предпочтительно, сквалан присутствует в количестве между 2-7% масс./об., или даже 2-5% масс./об. вакцины, в таком порядке предпочтения.

Наиболее предпочтительно: сквалан присутствует в количестве приблизительно 3,4% масс./об. вакцины.

Таким образом, в одном варианте осуществления комбинированной вакцины по изобретению, вакцина содержит сквалан в количестве между приблизительно 1 и приблизительно 9% масс./об.

По изобретению «приблизительно» показывает, что количество может меняться между±25% около его указанного значения. Предпочтительно, «приблизительно» обозначает±20% около его значения, более предпочтительно, «приблизительно» обозначает±15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2% около его значения, или даже «приблизительно» обозначает±1% около его значения, в таком порядке предпочтения.

Ацетат витамина E в комбинированной вакцине по изобретению присутствует в количестве между приблизительно 1 и приблизительно 10% масс./об. вакцины. Более предпочтительно, ацетат витамина E присутствует в количестве между 2-8% масс./об., или даже 3-5% масс./об. вакцины, в таком порядке предпочтения.

Наиболее предпочтительно: ацетат витамина E присутствует в количестве приблизительно 4% масс./об. вакцины.

Таким образом, в одном варианте осуществления комбинированной вакцины по изобретению, вакцина содержит ацетат витамина E в количестве между приблизительно 1 и приблизительно 10% масс./об.

Авторы изобретения обнаружили, что использование сквалана и ацетата витамина E в этих количествах в комбинированной вакцине по изобретению в качестве адъювантов обеспечивало преимущества для иммунного ответа против каждого из патогенов: PCV2 и PRRSV, и обеспечения стабильности. Однако неожиданно, что это как не вызывало никаких значительных побочных реакций на вакцинацию при введении свиньям-мишеням, так и не вызывало никакого значительного вироцидного эффекта на живой PRRSV.

Ацетат витамина E для использования в комбинированной вакцине по изобретению предпочтительно представляет собой DL-альфа-токоферол-ацетат, который является рацематом химического вещества с номером CAS: 7695-91-2.

В одном варианте осуществления комбинированной вакцины по изобретению, антигены представляют собой:

Для неспособного к воспроизведению антигена из PCV2: белок ORF2 получают из рекомбинантной системы экспрессии, или доставляют и экспрессируют посредством частицы репликона; частица репликона представляет собой частицу дефектного альфавируса, как разработано в AlphaVax. Родительский PCV2 для последовательности ORF2, которую экспрессируют, может представлять собой любой из серотипов PCV2 a, b, c или d, или может происходить из химеры из одного или нескольких из этих серотипов.

Для PRRSV: живой ослабленный вирус происходит из одного или нескольких генотипов, например, типа 1, типа 2 и/или типа 3. Более предпочтительно: живой PRRSV представляет собой ослабленный вариант штамм DV или штамм Небраска.

В одном варианте осуществления вакцины по изобретению, фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду. Предпочтительно, вода имеет высокую степень чистоты, например, дважды дистиллированная, подвергнутая микрофильтрации или обратному осмосу вода. Более предпочтительно: вода представляет собой воду для инъекций, и является стерильной и в основном свободной от пирогенов.

Удобным признаком вакцин на основе эмульсий масло-в-воде является то, что антигены обычно находятся в водной фазе. Это означает, что масляную фазу можно получать и эмульгировать в воде отдельно, с использованием способов и технологий, которые, как таковые, могут не являться совместимыми с сохранением качества или жизнеспособности антигенов вакцины. Например, использование высокоэнергетической эмульгации при высоких температурах. Это образует масляную эмульсию по изобретению, представляющую собой эмульсию масло-в-воде сквалана, ацетата витамина E и полисорбата 80 в воде.

Для получения комбинированной вакцины по изобретению, водную фазу с антигенами и масляную эмульсию с адъювантами объединяют посредством осторожного смешивания при комнатной температуре.

Объединение двух композиций вызывает разведение каждой из них. Следовательно, каждую необходимо получать в форме промежуточной композиции, в которой концентрация различных компонентов выше, чем она будет в конечной вакцине, с кратностью, равной разведению, которое будет использовано. Как правило, водную фазу и масляную эмульсию можно смешивать в объемном соотношении в любой точке между 10:90 и 90:10.

Комбинированная вакцина по изобретению, предпочтительно, содержит водную фазу и масляную эмульсию - обе, как описано -, в объемном соотношении между приблизительно 20:80 и приблизительно 80:20.

Таким образом, в одном варианте осуществления, комбинированная вакцина по изобретению получена из смеси водной фазы и масляной эмульсии, в объемном соотношении между приблизительно 20:80 и приблизительно 80:20.

Предпочтительно, объемное соотношение составляет между приблизительно 30:70 и приблизительно 70: 30; между приблизительно 40:60 и приблизительно 60:40; или даже объемное соотношение составляет приблизительно 50:50, в таком порядке предпочтения.

Очевидно, когда соотношение в комбинации водной фазы и масляной эмульсии составляет 50:50, тогда каждая из двух композиций должна содержать ее различные компоненты в количестве или в концентрации, в два раза более высоких, чем желательные в конечном вакцинном составе, подлежащем получению из комбинации двух промежуточных композиций.

В предпочтительном варианте осуществления, масляную эмульсию по изобретению получают с использованием эмульгатора с значением HLB (гидрофильно-липофильного баланса) между приблизительно 8 и приблизительно 20; предпочтительным эмульгатором является полисорбат 80.

Полисорбат 80 относится к химическому реактиву с номером CAS 9005-65-6, названному также: моноолеат полиоксиэтиленсорбитана. Он имеет значение HLB 14 и является широко коммерчески доступным, например, как Tween 80.

Предпочтительно, полисорбат 80 присутствует в комбинированной вакцине по изобретению в количестве между приблизительно 0,1 и приблизительно 5% масс./об. вакцины. Более предпочтительно, полисорбат 80 присутствует в количестве между 0,3-3% масс./об., 0,5-2,5%, или даже 1-2% масс./об. вакцины, в таком порядке предпочтения.

Наиболее предпочтительно: полисорбат 80 присутствует в количестве приблизительно 1,6% масс./об. вакцины.

Таким образом, в одном варианте осуществления, комбинированная вакцина по изобретению содержит полисорбат 80 в количестве между приблизительно 0,1 и приблизительно 5% масс./об.

Масляную эмульсию по изобретению можно получать в любом масштабе и с использованием любого подходящего оборудования для гомогенизации, например, из: Silverson, Ultra Turrax™ или реактора Dispax (IKA). Специалист в данной области может осуществлять и оптимизировать такой способ эмульгации для контроля размера частиц диспергированной фазы (в настоящем описании: масляные адъюванты). Совместно с выбором типа и концентрации эмульгатора(эмульгаторов), это обеспечивает контроль фармацевтических свойств эмульсии, а также ее стабильности. Основными параметрами собственно способа эмульгации являются: затраты энергии (мощность и об./мин), температура, продолжительность и количество повторяющихся циклов. Детали вариантов осуществления способа эмульгации представлены ниже.

Размер частиц диспергированной фазы предпочтительно является достаточно небольшим. Когда диаметр частиц диспергированной фазы ниже приблизительно 1 микрометра, такие эмульсии обычно называют «субмикронной эмульсией».

В одном варианте осуществления эмульсии масло-в-воде комбинированной вакцины по изобретению, эмульсия представляет собой субмикронную эмульсию.

Оборудование для измерения размеров частиц 1 микрометр или менее обычно является доступным, например, посредством измерения лазерной дифракции. Как правило, размер частиц выражают в нанометрах (нм), и как средний размер частиц, также известный как медианный диаметр, выраженный как D50 кумулятивного распределения размера частиц.

По изобретению, размер частиц выражают в нм D50, как определено с использованием Mastersizer™ (Malvern Instruments). Измерения размера частиц можно проводить в (концентрированной) масляной эмульсии или в комбинированной вакцине; показатель преломления частиц масляной фазы по изобретению составляет 1,48. В отчете Malvern Mastersizer об анализе размера D50 представлен как D(0,50). Все это хорошо известно специалисту в данной области.

Существует множество способов, доступных для получения таких субмикронных эмульсий, как правило, с использованием способа высокоэнергетической эмульгации, например, с использованием: гомогенизаторов высокого давления, роторно-статорных устройств, измельчителей, ультразвуковых волн, микропористых мембран или микроканальных устройств.

Предпочтительным способом высокоэнергетической эмульгации по изобретению является использование гомогенизатора высокого давления, предпочтительно, Microfluidiser™ (Microfluidics). Как правило, 3 проходов при давлении между 500-1500 бар (т.е. 7000-22000 фунт/кв. дюйм) достаточно.

Эмульсии, полученные этим способом, как правило, имеют частицы диспергированной фазы с D50 500 нм или менее, и имеют узкое распределение размеров; по изобретению, диспергированные фазы представляют собой капельки масляных адъювантов.

Как правило, эмульсии с такими частицами диспергированной фазы очень тонкого размера получают за несколько стадий. По этому способу, начальную относительно грубую масляную эмульсию получают посредством низкоэнергетического смешивания, за которым следует одна или несколько последующих высокоэнергетических обработок для достижения дальнейшего уменьшения размера частиц.

Затем, подвергнутую «микрофлюидизации» масляную эмульсию, содержащую адъюванты и эмульгатор в воде, объединяют с водной фазой, содержащей антигены, для получения комбинированной вакцины по изобретению.

Таким образом, в одном варианте осуществления субмикронной эмульсии масло-в-воде комбинированной вакцины по изобретению, масляные капельки имеют D50 500 нм или менее; предпочтительно, D50 составляет 250 нм или менее. Более предпочтительно: D50 составляет 150 нм или менее.

Из соображений единообразия и качества продукта, не только медианный диаметр частиц, но также распространение размеров частиц, также известное как распределение размеров, можно преимущественным образом мониторировать и контролировать. Распределение размеров масляных капелек в субмикронной эмульсии масло-в-воде комбинированной вакцины по изобретению, предпочтительно, является относительно узким. Показателем распределения размера частиц является D90 кумулятивного распределения размера частиц.

Таким образом, в одном варианте осуществления субмикронной эмульсии масло-в-воде комбинированной вакцины по изобретению, масляные капельки имеют D90 ниже 900 нм, более предпочтительно, D90 составляет ниже 500 нм, 400 нм или даже ниже 300 нм, в таком порядке предпочтения. Наиболее предпочтительно: D90 составляет приблизительно 250 нм.

Одним из преимуществ эмульсий, имеющих такие небольшой размер частиц и распределение, является то, что их затем можно стерилизовать посредством фильтрации, без значительной потери материала. Это обусловлено тем, что типичные фильтры для стерилизации имеют размер пор приблизительно 0,2 микрометра. Такая стерилизация фильтрацией позволяет обойти необходимость в других способах стерилизации, которые могут нарушать качество компонентов масляной эмульсии, например, посредством: нагревания, химических веществ или облучения.

В зависимости от условий намеченного использования комбинированной вакцины по изобретению, например, в полевых условиях, или специфики видов-мишеней, может являться предпочтительной оптимизация вакцины. Это полностью находится в компетенции специалиста в данной области, и, как правило, включает тонкую регулировку эффективности, безопасности или стабильности вакцины.

Комбинированная вакцина по изобретению содержит неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 и живой PRRSV, в количествах, которые способны индуцировать у свиней-мишеней защитный иммунный ответ против ассоциированных с ними заболеваний, как описано выше.

Полностью в компетенции специалиста в области, к которой относится изобретение, находится возможность определения эффективности комбинированной вакцины по изобретению, например, посредством мониторирования иммунологического ответа после вакцинации или после заражения инфекцией, например, посредством мониторирования признаков заболевания, клинических оценок в баллах у мишени, или посредством повторного выделения патогена, и сравнения этих результатов с ответом на вакцинацию-заражение, наблюдаемым у животных после ложной вакцинации.

В качестве показателя, количества антигенов, подлежащие использованию в комбинированной вакцине по изобретению, могут быть основаны на количествах, используемых в соответствующих одновалентных или комбинированных вакцинах с этими антигенами. Например, комбинированная вакцина по изобретению может содержать на миллилитр: PCV2: 1-50 мкг ORF2; и PRRSV: 10^3-10^6 TCID50. Способы количественной оценки этих антигенов хорошо известны в данной области, и могут включать также основанную на ELISA количественную оценку по сравнению со специфическими стандартами.

Комбинированную вакцину по изобретению можно преимущественным образом объединять с одним или несколькими дополнительными антигенами, способными к воспроизведению или неспособными к воспроизведению, полноразмерными или разрушенными. Однако комбинацию предпочтительно составляют с осторожностью, чтобы сохранять стабильность и эффективность суммарной комбинированной вакцины, и жизнеспособность способных к воспроизведению компонентов вакцины. Такой выбор полностью находится в компетенции обычного специалиста в данной области.

Таким образом, в одном варианте осуществления, комбинированная вакцина по изобретению содержит по меньшей мере один дополнительный антиген.

Дополнительный антиген либо представляет собой ослабленную форму микроорганизма, который является патогенным для свиней, либо представляет собой неспособный к воспроизведению антиген, происходящий из микроорганизма, патогенного для свиней. Микроорганизм может представлять собой любые вирус, бактерию, паразита, гриб, риккетсию, простейшее и/или паразита, которые являются патогенными для свиней.

Примерами таких микроорганизмов, патогенных для свиней, являются: вирус псевдобешенства, парвовирус свиней, вирус классической лихорадки свиней, вирус гриппа свиней, вирус ящура, вирус эпизоотической диареи свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита, респираторный коронавирус свиней, вирус везикулярного стоматита, Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Brachyspira, E. coli, Haemophilus, Streptococcus, Salmonella, Clostridia, Pasteurella, Erysipelothrix, Leptospira, Bordetella, Toxoplasma, Isospora и Trichinella.

Предпочтительными дополнительными антигенами является один или несколько из: Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Brachyspira hyodysenteriae и вируса гриппа свиней.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления комбинированная вакцина по изобретению содержит также неспособный к воспроизведению антиген из Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo).

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления комбинированная вакцина по изобретению содержит также неспособный к воспроизведению антиген из Lawsonia intracellularis (Lawsonia).

Неспособные к воспроизведению антигены из Mhyo и Lawsonia предпочтительно представляют собой бактерин.

По изобретению, «бактерин» представляет собой композицию, содержащую инактивированные (убитые) бактерии, при этом инактивированные бактерии могут представлять собой цельные интактные клетки, или могут становиться поврежденными до некоторой степени посредством инактивации, или их смесь, например, в форме инактивированной культуры цельных клеток.

Бактерин Mhyo или Lawsonia предпочтительно представляет собой убитую культуру цельных клеток. Бактерин Mhyo предпочтительно происходит из штамма 11 или штамма J. NB: Mhyo ранее называли M. suipneumoniae.

Количества антигенов, подлежащих использованию в комбинированной вакцине по изобретению, могут представлять собой: для Mhyo: 2-20% масс./об. инактивированной концентрированной культуры Mhyo; и/или для Lawsonia: инактивированные цельные клетки при между 1×10^7 и 1×10^10 клеток.

Наблюдаемые эффекты комбинированной вакцины по изобретению представляют собой:

для Mhyo: предотвращение или уменьшение очагов в легких, вызванных Mhyo, таких как консолидированная пневмония, и хроническое респираторное заболевание;

для Lawsonia: уменьшение колонизации и выделения с фекалиями Lawsonia, и уменьшение признаков илеита с гиперплазией кишечника, геморрагической энтеропатии свиней или кишечного аденоматоза свиней;

для Lawsonia, активность комбинированной вакцины по изобретению, можно детектировать серологически как увеличение уровня в сыворотке специфических для Lawsonia антител, легко поддающихся детекции с использованием способов на основе ELISA.

Для Mhyo, наиболее надежным показателем активности вакцины является уменьшение оценки в баллах очагов в легких после заражения инфекцией Mhyo. Такие очаги, как правило, оценивают в баллах в ходе некропсии посредством макроскопической оценки консолидации легких, на основании шкалы Гудвина (Goodwin et al., 1969, J. Hyg. Camb., vol. 67, p. 465-476); эта шкала простирается от нуля до максимум 55 пунктов/животное для полностью пораженных легких.

Комбинированную вакцину по изобретению можно преимущественным образом объединять с фармацевтическим соединением, таким как антибиотик, гормон и/или противовоспалительное лекарственное средство.

Комбинированная вакцина по изобретению может содержать дополнительные наполнители, для оптимизации эффективности или стабильности вакцины, такие как стабилизаторы или консерванты. Примерами стабилизаторов являются: молочный порошок, желатин, сывороточный альбумин, сорбит, трегалоза, аминокислоты, спермидин, декстран или поливинилпирролидон. Примерами консервантов являются: тимеросал, мертиолат, фенольные соединения или гентамицин.

Когда антигены, используемые в комбинированной вакцине по изобретению, выбраны специальным образом, комбинированную вакцину можно использовать в качестве так называемой маркерной вакцины. Это означает, что иммунитет, вызванный вакциной против одного из патогенов, можно отличать посредством некоторого способа детекции от иммунного ответа, который может возникать при инфекции мишени патогеном дикого типа. Это также известно как DIVA: «установление отличий инфицированных от вакцинированных животных». Эта вакцина, таким образом, имеет положительный или отрицательный «маркер» по сравнению с инфекцией дикого типа.

Таким образом, в одном варианте осуществления, комбинированная вакцина по изобретению представляет собой маркерную вакцину.

В одном варианте осуществления, комбинированная вакцина предназначена для свиней.

Термин «свиньи» относится к животным из семейства Suidae, и предпочтительно, к животным из рода Sus, которых также обозначают как свинообразные. Примерами являются: дикая или домашняя свинья, хряк, дикий кабан, бабирусса или бородавочник. Это также включает свиней, указанных по их условным наименованиям, например, применительно к их полу или возрасту, таких как: свиноматка, матка, кабан, боров, хряк, подсвинок, отъемыш или поросенок.

Кроме того, термин свиньи относится к свинообразным животным любого типа, например, разводимого или откармливаемого типа, и к родительским линиям для любого из этих типов.

Следующие или дополнительные варианты осуществления комбинированной вакцины по изобретению являются возможными и полностью достижимыми для специалиста в данной области. А также, эти дополнительные варианты осуществления можно использовать в одной или нескольких комбинации(комбинациях) с уже описанными вариантами осуществления.

Таким образом, в одном варианте осуществления комбинированной вакцины по изобретению, используют одно, несколько или все из условий, выбранных из группы, состоящей из:

- комбинированная вакцина содержит сквалан в количестве между приблизительно 1 и приблизительно 9% масс./об.; предпочтительно, сквалан содержится в количестве между 2-5% масс./об.;

- комбинированная вакцина содержит ацетат витамина E в количестве между приблизительно 1 и приблизительно 10% масс./об.; предпочтительно, ацетат витамина E содержится в количестве между 3-5% масс./об.;

- ацетат витамина E, предпочтительно, представляет собой DL-альфа-токоферол-ацетат;

- комбинированная вакцина получена из смеси водной фазы и масляной эмульсии, в объемном соотношении между приблизительно 20:80 и приблизительно 80:20;

- комбинированная вакцина содержит полисорбат 80 в количестве между приблизительно 0,1 и приблизительно 5% масс./об.; предпочтительно, полисорбат 80 содержится в количестве между 1-2% масс./об.;

- эмульсия масло-в-воде представляет собой субмикронную эмульсию; более предпочтительно, масляные капельки имеют D50 500 нм или менее.

- комбинированная вакцина содержит по меньшей мере один дополнительный антиген; предпочтительно, один или несколько антигенов из: Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Brachyspira hyodysenteriae и вируса гриппа свиней;

- комбинированная вакцина содержит также неспособный к воспроизведению антиген из Mycoplasma hyopneumoniae;

- комбинированная вакцина содержит также неспособный к воспроизведению антиген из Lawsonia intracellularis;

- комбинированная вакцина представляет собой маркерную вакцину; и

- комбинированная вакцина предназначена для свиней.

В одном варианте осуществления комбинированной вакцины по изобретению, вакцина содержит сквалан в количестве между приблизительно 1 и приблизительно 9% масс./об.; вакцина содержит ацетат витамина E в количестве между приблизительно 1 и приблизительно 10% масс./об.; ацетат витамина E представляет собой DL-альфа-токоферол-ацетат; вакцина получена из смеси водной фазы и масляной эмульсии, в объемном соотношении между приблизительно 20:80 и приблизительно 80:20; вакцина содержит полисорбат 80 в количестве между приблизительно 0,1 и приблизительно 5% масс./об.; эмульсия масло-в-воде представляет собой субмикронную эмульсию; и вакцина предназначена для свиней.

Комбинированную вакцину по изобретению можно составлять различными способами, как описано в настоящем описании.

Одним из преимущественных способов получения комбинированной вакцины по изобретению является разведение лиофилизированного препарата живого PRRSV. Например, неполный вариант комбинированной вакцины по изобретению, еще не содержащий PRRSV, можно использовать в качестве разбавителя для лиофилизированного препарата живого ослабленного PRRSV, удобным образом: существующей лиофилизированной вакцины из живого PRRSV, например, такой как Porcilis PRRSV, или Prime Pac™ PRRS+.

Следовательно, комбинированную вакцину по изобретению можно получать из набора из частей, содержащего по меньшей мере два контейнера: один контейнер, содержащий все компоненты комбинированной вакцины по изобретению, за исключением живого вируса PRRSV; и один контейнер, содержащий живой ослабленный PRRSV в лиофилизированной форме. Затем элементы набора из частей вместе составляют комбинированную вакцину по изобретению.

Таким образом, в следующем аспекте, изобретение относится к набору из частей, содержащему по меньшей мере два контейнера: один контейнер, содержащий неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 в эмульсии масло-в-воде, содержащей сквалан и ацетат витамина E; и один контейнер, содержащий живой PRRSV в лиофилизированной форме.

После разведения живого PRRSV, формируется полная комбинированная вакцина по изобретению. Это также обозначают как смешивание вакцины «на месте» или смешивание «в поле».

Несмотря на то, что комбинированная вакцина не является вироцидной для PRRSV, является предпочтительным осуществлять разведение непосредственно перед введением вакцины, для обеспечения наилучшего качества вакцины. Предпочтительно, разведение проводят в пределах 8 часов от введения, более предпочтительно, в пределах 6, 5, 4, 3 или даже в пределах 2 часов перед введением, в таком порядке предпочтения.

Набор из частей по изобретению и его элементы могут содержать любой из вариантов осуществления (предпочтительный или нет), как описано в настоящем описании для комбинированной вакцины по изобретению, или любую комбинацию из двух или более из этих вариантов осуществления комбинированной вакцины по изобретению.

Дополнительным преимущественным применением набора из частей по изобретению, является применение, где как неспособный к воспроизведению антиген из Lawsonia, так и живой PRRSV включают в комбинированную вакцину по изобретению посредством разведения лиофилизированного препарата.

Таким образом, в одном варианте осуществления, набор из частей по изобретению содержит по меньшей мере три контейнера: один контейнер, содержащий неспособный к воспроизведению антиген из PCV2, в эмульсии масло-в-воде, содержащей сквалан и ацетат витамина E; один контейнер, содержащий живой PRRSV в лиофилизированной форме; и один контейнер, содержащий неспособный к воспроизведению антиген из Lawsonia в лиофилизированной форме.

В предпочтительном варианте осуществления набора из частей по изобретению, содержащего по меньшей мере три контейнера, контейнер, содержащий неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 в эмульсии масло-в-воде, содержащей сквалан и ацетат витамина E, также содержит неспособный к воспроизведению антиген из Mhyo.

Лиофилизированная форма может представлять собой лиофилизированный осадок в контейнере, например, бутыли, но может также представлять собой лиосферу, как используют в технологии Sphereon™.

Из-за характера лиофилизированного вещества, его разведение незначительно (т.е. менее, чем приблизительно на 5%; более предпочтительно: менее, чем приблизительно на 1%) изменяет объем использованного разбавителя. Следовательно, препараты комбинированной вакцины по изобретению со всеми компонентами, за исключением живого PRRSV, или со всеми компонентами, за исключением живого PRRSV и неспособного к воспроизведению антигена из Lawsonia, подлежащие предоставлению в наборе из частей по изобретению, можно предоставлять со всеми их другими компонентами в конечных количествах или в их конечных концентрациях.

Комбинированную вакцину по изобретению можно получать из соответствующих антигенов и наполнителей, способами, которые хорошо известны в данной области, и которые находятся в компетенции обычного специалиста в данной области. Например: ORF2 PCV2 можно экспрессировать посредством рекомбинантного бакуловируса в культуре клеток насекомых и собирать; альтернативно, белок ORF2 PCV2 можно доставлять и экспрессировать с использованием частицы репликона (выше). PRRSV можно культивировать в подходящих клетках-хозяевах, например, первичных макрофагах свиньи, или в линии клеток, такой как Marc-145 или MA104.

Эти антигены количественно оценивают, и поглощают в водной фазе в необходимых количествах. Это может происходить в присутствии или в отсутствие неспособных к воспроизведению антигенов из Mhyo, Lawsonia и/или живого PRRSV; это в том случае, когда комбинированная вакцина по изобретению предназначена для коммерциализации в форме набора из частей по изобретению.

По отдельности, масляную эмульсию с адъювантами и эмульгатором в воде, получают способом эмульгации. Затем, ее смешивают с водной фазой с антигенами, в желательном объемном соотношении.

Различные стадии производственного процесса мониторируют посредством адекватных тестов, например, посредством микробиологических и иммунологических тестов на качество и количество бактерий и вирусов, или любых дополнительных антигенов; посредством тестов на отсутствие посторонних веществ; тестов на химическую и биологическую стабильность; и, в конечном счете, посредством экспериментов in vitro или in vivo для определения эффективности и безопасности вакцины. Все они хорошо известны специалисту в данной области, и предписаны в Государственных нормативных актах, таких как Фармакопея, и в руководствах, таких как: Remington и Pastoret (оба выше).

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к способу получения комбинированной вакцины по изобретению, включающему стадии:

- получения водной фазы, содержащей неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 и живой PRRSV, и

- смешивания указанной водной фазы с масляной эмульсией, содержащей сквалан и ацетат витамина E.

Как описано, способ получения комбинированной вакцины по изобретению можно преимущественным образом адаптировать для включения антигена из Mhyo или из Lawsonia, и/или живого PRRSV на более поздней стадии, например, посредством разведения отдельных лиофилизированных препаратов этих антигенов.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к способу получения комбинированной вакцины по изобретению, включающему стадии:

- получения живого PRRSV в лиофилизированной форме,

- получения водной фазы, содержащей неспособный к воспроизведению антиген из PCV2,

- смешивания указанной водной фазы с масляной эмульсией, содержащей сквалан и ацетат витамина E, и

- разведения указанного лиофилизированного живого PRRSV указанной смесью водной фазы и масляной эмульсии.

Водная фаза, содержащая неспособный к воспроизведению антиген из PCV2, необязательно, содержит неспособный к воспроизведению антиген из Mhyo.

Подобным образом,

в следующем аспекте изобретение относится к способу получения комбинированной вакцины по изобретению, включающему стадии:

- получения живого PRRSV в лиофилизированной форме,

- получения неспособного к воспроизведению антигена Lawsonia в лиофилизированной форме,

- получения водной фазы, содержащей неспособный к воспроизведению антиген из PCV2,

- смешивания указанной водной фазы с масляной эмульсией, содержащей сквалан и ацетат витамина E, и

- разведения указанного лиофилизированного живого PRRSV и указанного неспособного к воспроизведению антигена Lawsonia указанной смесью водной фазы и масляной эмульсии.

Водная фаза, содержащая неспособный к воспроизведению антиген из PCV2, необязательно, содержит неспособный к воспроизведению антиген из Mhyo.

Или, в сходном варианте осуществления: изобретение относится к способу получения комбинированной вакцины по изобретению, включающему стадии:

- получения смеси водной фазы, содержащей неспособный к воспроизведению антиген из PCV2, и масляной эмульсии, содержащей сквалан и ацетат витамина E, и

- разведения живого PRRSV в лиофилизированной форме указанной смесью.

Водная фаза, содержащая неспособный к воспроизведению антиген из PCV2, необязательно, содержит неспособный к воспроизведению антиген из Mhyo.

В различных точках в этих способах, можно добавлять дополнительные стадии, например, для дополнительных обработок, например, для очистки или хранения. А также, способ получения может включать смешивание с дополнительным антигеном или фармацевтически приемлемыми наполнителями, такими как стабилизаторы или консерванты.

Эти варианты, и необязательно, многие другие, можно включать в качестве дополнительной стадии в подходящей точке в способе получения по изобретению.

Таким образом, способы получения по изобретению могут включать любой из вариантов осуществления (предпочтительный или нет), как описано в настоящем описании для комбинированной вакцины по изобретению, или любую комбинацию из двух или более из этих вариантов осуществления комбинированной вакцины по изобретению.

Как описано, комбинированную вакцину по изобретению, которую можно получать способом по изобретению, можно преимущественным образом использовать для введения свиньям, для защиты против инфекции и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией PCV2 и PRRSV.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к эмульсии масло-в-воде, содержащей сквалан и ацетат витамина E, неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 и живой PRRSV, для использования в вакцинации свиней против PCV2 и PRRSV.

Альтернативно:

В следующем аспекте изобретение относится к использованию неспособного к воспроизведению антигена из PCV2 и живого PRRSV, для изготовления комбинированной вакцины для свиней, отличающийся тем, что вакцина представляет собой эмульсию масло-в-воде, содержащую сквалан и ацетат витамина E.

Комбинированную вакцину по изобретению можно использовать для вакцинации свиней против PCV2 и PRRSV.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к способу вакцинации свиней против PCV2 и PRRSV, посредством введения указанным свиньям эмульсии масло-в-воде, содержащей сквалан и ацетат витамина E, неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 и живой PRRSV.

Или в сходном варианте осуществления: изобретение относится к способу вакцинации свиней против PCV2 и PRRSV, посредством введения указанным свиньям комбинированной вакцины по изобретению.

Эмульсию масло-в-воде, такую как комбинированная вакцина по изобретению, предпочтительно, вводят некоторым способом парентерального введения, например, посредством всех способов инъекции в или через кожу: например, внутримышечного, внутривенного, внутрибрюшинного, внутрикожного, субмукозного или подкожного. Это можно осуществлять различными способами, например, с использованием классического шприца и иглы для подкожных инъекций.

Альтернативно, парентеральное введение можно осуществлять посредством некоторого способа безыгольной инъекции, доставки вакцины посредством внутрикожного или чрескожного аппликатора, такого как IDAL™.

В одном варианте осуществления способа вакцинации по изобретению, введение осуществляют внутримышечным способом.

Объем дозы для животного комбинированной вакцины по изобретению не является критическим, при условии получения эффективной иммунной защиты. Он может отличаться для различных способов введения, таких как: внутримышечный, подкожный или внутрикожный. Предпочтительно, объем одной дозы для животного составляет между приблизительно 0,1 и 10 мл на животное; более предпочтительно, между 0,2 и 5 мл, 0,5 и 3, или даже между 0,5 и 2 мл на дозу для животного, в таком порядке предпочтения.

Таким образом, в одном варианте осуществления способа введения по изобретению, комбинированную вакцину по изобретению вводят в дозе между приблизительно 0,1 и 10 мл на животное.

Режим введения вакцинации по способу вакцинации по изобретению свиньям-мишеням можно осуществлять в однократных или множественных дозах, способом, совместимым с составом вакцины и с практическими аспектами условий содержания свиней.

При необходимости, свиней-мишеней можно подвергать второму или следующим введениям комбинации по изобретению, позже на протяжении их жизни, так называемым бустер-вакцинациям. Однако комбинированную вакцину по изобретению оптимизируют таким образом, что однократной дозы для вакцинации, как правило, достаточно для обеспечения иммунной защиты во время соответствующего периода жизни свиней, например, во время стадии откармливания свиней возрастом вплоть до 6 месяцев.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления, комбинированную вакцину по изобретению вводят только один раз на свинью-мишень, т.е. она представляет собой вакцину в однократной дозе.

Предпочтительно, режим для способа вакцинации интегрируют в существующие расписания вакцинации других вакцин, которые могут требоваться для свиней-мишеней, чтобы дополнительно уменьшить стресс для животных и уменьшить затраты на оплату труда. Эти другие вакцины можно вводить одновременным, параллельным или последовательным образом, способом, совместимым с зарегистрированным для них применением.

Таким образом, в одном варианте осуществления способа вакцинации свиней по изобретению, комбинированную вакцину по изобретению вводят в комбинации с другой вакциной для свиней.

Свиньи-мишени для вакцинации по изобретению могут находиться в любом возрасте, в котором они являются чувствительными к вакцинации, и/или являются чувствительными к заболеванию или инфекции, против которых защищает вакцина.

Кроме того, масса, пол, иммунологический статус и т.д. свиней-мишеней для вакцинации по изобретению, не являются критическими, хотя является благоприятным вакцинировать здоровых мишеней, и вакцинировать настолько рано, насколько возможно, для предотвращения (последствий) ранней инфекции Mhyo, Lawsonia, PCV2 или PRRSV.

Таким образом, в одном варианте осуществления способа вакцинации свиней по изобретению, комбинированную вакцину по изобретению вводят молодым свиньям.

По изобретению, «молодые свиньи» представляют собой свиней в возрасте до приблизительно 2 месяцев.

Из-за высокого преобладания Mhyo, Lawsonia, PCV2 и PRRSV, и из-за широкого применения вакцин против одного или нескольких из этих патогенов, множество свиноматок могут являться сероположительными по антителам против одного или нескольких из Mhyo, Lawsonia, PCV2 и PRRSV. Следовательно, молодые свиньи, потребляющие молозиво от таких свиноматок, могут являться MDA+ (положительными по материнским антителам). Это не является помехой для эффективности комбинированной вакцины по изобретению, поскольку она является эффективной также у MDA+ свиней.

Таким образом, в одном варианте осуществления способа вакцинации по изобретению, комбинированную вакцину по изобретению вводят MDA+ свиньям.

PRRSV специфически индуцирует респираторное заболевание у взрослых свиней.

Таким образом, в одном варианте осуществления способа вакцинации свиней по изобретению, комбинированную вакцину по изобретению вводят взрослым свиньям.

По изобретению, «взрослые свиньи» представляют собой свиней в возрасте от приблизительно 6 месяцев.

Введение комбинированной вакцины по изобретению можно проводить либо как профилактическое, либо как терапевтическое лечение, или оба, поскольку оно создает помехи как для развития, так и для прогрессирования инфекции Mhyo, Lawsonia, PCV2 и PRRSV.

Использование комбинированной вакцины по изобретению может помогать уменьшению инфекции одним или всеми из Mhyo, Lawsonia, PCV2 и PRRSV, в стаде свиней, на ферме или у свиней в географическом районе.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к способу уменьшения инфекции Mhyo, Lawsonia, PCV2 или PRRSV, или ассоциированных признаков заболевания у свиней, отличающемуся тем, что способ включает введение указанным свиньям комбинированной вакцины по изобретению.

Изобретение в настоящее время далее описано посредством следующих, неограничивающих, примеров.

Примеры

1. Получение комбинированной вакцины

Комбинированную вакцин по изобретению получали следующим образом:

Масляная эмульсия в 2x концентрации содержит на 100 г:

Полисорбат 80 (Tween 80): 3,24 г;

Сквалан: 6,75 г;

Ацетат DL-альфа токоферола: 7,94 г;

вода для инъекций: 82,07 г.

Эту масляную эмульсию получали в соответствии со следующими последовательными стадиями способа:

- необходимые количества Tween 80 и сквалана взвешивали, и объединяли в мерном стакане

- смесь Tween 80/сквалана гомогенизировали посредством низкоэнергетического перемешивания (магнитная мешалка), при комнатной температуре,

- необходимое количество ацетата DL-альфа-токоферола взвешивали, и добавляли к смеси гомогенизированного Tween 80/сквалана

- объединенную смесь снова гомогенизировали, посредством низкоэнергетического перемешивания при комнатной температуре,

- смесь нагревали до 65-75°C

- воду для инъекций нагревали до 65-75°C

- нагретые масляную фазу и воду предварительно смешивали с использованием высокоэнергетического перемешивания посредством Ultra Turrax с мешалкой N18, в течение 5-15 минут; температуру уменьшали от 65 до 55°C.

- предварительную смесь 3 раза пропускали через Microfluidiser при 800 бар; температуру поддерживали ниже 50°C с использованием охлаждающей спирали.

- подвергнутую микрофлюидизации масляную эмульсию стерилизовали посредством фильтрации через фильтр 0,2 микрометра (Pall, Ultipor™ N66); фильтр предварительно нагревали до 55-75°C через его двойную стенку.

Для конечной масляной эмульсии (2x концентрата), полноту и уровень гомогенизации проверяли посредством световой микроскопии. Дополнительно проверяли также pH (7,34) и осмоляльность (221 мОсм/кг). Измерения размера частиц выявили: D100=300 нм; D99=250 нм; D90=200 нм, и D50=130 нм.

Водную фазу (в 2x концентрации) получали посредством взятия необходимого количества каждого из неспособных к воспроизведению антигенов: Mhyo: 6% об./об. из 10 x концентрированной инактивированной культуры; Lawsonia: 2×10^9 инактивированных клеток; и PCV: 50 мкг ORF2.

Затем, обе концентрированные композиции (масляную эмульсию с адъювантами, и водную фазу с антигенами) объединяли в объемном соотношении 50:50, посредством низкоэнергетического перемешивания при комнатной температуре.

Эту смесь вакцины использовали для ресуспендирования ампул Porcilis PRRS, с использованием необходимого объема каждого для получения полной дозы PRRSV (10^5 TCID50) на 2 мл комбинированной вакцины.

Конечная комбинированная вакцина содержала: 3,375% масс./об. сквалана; 3,97% масс./об. ацетата витамина E и 1,62% масс./об. Tween 80, и имела плотность 0,9913 г/мл. Продукты хранили при 2-8 °C.

2. Тестирование вироцидного эффекта

Масляную эмульсию по изобретению инкубировали с образцом живого PRRSV, для определения того, будет ли возникать какой-либо вироцидный эффект.

Кратко: ампулу Porcilis PRRSV разводили в PBS до конечного объема 7 мл, для получения титра 6 Log10 TCID50/мл. Образец 50 мкл этой суспензии вируса объединяли с 450 мкл комбинированной вакцины без живого PRRSV, полученной, как в примере 1, и содержащей: сквалан, ацетат витамина E и полисорбат 80, подвергнутые микрофлюидизации в воде, с неспособными к воспроизведению антигенами из Mhyo, Lawsonia и PCV2. Контрольный образец PRRSV смешивали с 450 мкл PBS. Оба образца инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем инкубированные образцы титровали для определения оставшегося титра PRRSV.

Титрование проводили на монослоях клеток MA104 в возрасте 1 сутки. В 10 рядов исходных лунок вводили 25 мкл инкубированного образца вируса, их разводили 1:10 через 7 последовательных лунок. 2 ряда необработанных клеток служили в качестве отрицательного контроля. Это проводили в двух повторах. Затем планшеты инкубировали в течение 3 суток при 37°C в атмосфере 5% CO2. Наконец, воспроизведение вируса PRRSV детектировали посредством иммунофлуоресценции с использованием моноклонального антитела против PRRSV и меченного флуоресцентной меткой антитела для детекции. Титры рассчитывали с использованием алгоритма Спирмана-Кербера.

Образец	Титр(1) (Log10 TCID50/мл)
комбинированная вакцина (0,9x)	4,6
контроль	4,8

(1) Титр является средним из двух определений

С использованием распределения значений, обнаруженных при титровании±0,2 Log10 TCID50, результаты показали, что образцы живого PRRSV, инкубированные в 0,9x концентрированной комбинированной вакцине по изобретению, не испытывали значительного уменьшения титра.

3. Эксперимент вакцинации-заражения

3.1. Введение

Комбинированную вакцину без живого PRRSV, полученную, как в примере 1, и содержащую: сквалан, ацетат витамина E и полисорбат 80, подвергнутые микрофлюидизации в воде, с неспособными к воспроизведению антигенами из Mhyo, Lawsonia и PCV2, тестировали у животных. Вакцинацию проводили в форме однократной дозы, внутримышечным способом, в возрасте 3 недели. Эффективность для Mhyo тестировали посредством заражения инфекцией, через 4 недели после вакцинации. Сравнивали несколько других адъювантов.

3.2. Дизайн исследования

84 SPF поросят использовали для этого исследования. 6 групп из 12 животных вакцинировали один раз внутримышечно в возрасте три недели (+/- трое суток). Одну группу из 12 поросят оставляли невакцинированными, и она служила в качестве группы заражения-контроля. До вакцинации и через двое суток после вакцинации измеряли ректальную температуру. Кроме того, для группы SVEA, участки инъекции еженедельно пальпировали для анализа местных реакций. Через четыре недели после вакцинации всех животных инфицировали вирулентным штаммом Mhyo. Через три недели после заражения всех животных подвергали эвтаназии и исследовали посмертно очаги в легких. Для всех животных отбирали образцы крови: до вакцинации, до заражения и посмертно.

Таблица 1: Расписание обработки из примера 3

Группа	Вакцина-адъювант
1	Amphigen
2	SVEA
3	SVEA+Al(OH)3
4	MF59+DDA
5	масло SP (Metastim)
6	Vaxliant S5
7	без вакцины

3.3. Тестированные адъюванты

Тестировали ряд вакцинных составов, отличающихся только применительно к использованным типу состава и адъюванта; содержание антигена являлось одинаковым. Тестировали следующие адъюванты:

• Amphigen: масло-в-воде из минерального масла с лецитином

• SVEA: подвергнутая микрофлюидизации эмульсия масло-в-воде с скваланом, ацетатом витамина E и Tween 80

• SVEA+Al(OH)3: SVEA с 0,2% масс./об. гидроксида алюминия (такой как в Porcilis PCV Mhyo)

• MF59+ DDA: MF59 в эмульсии масло-в-воде с скваленом, полисорбатом 80 и Span 85; DDA представляет собой катионный липид: диметилдиоктадециламмоний.

• масло SP: плюроник, сквалан и Tween, как описано в WO 2013/152086.

• Vaxliant™ S5: запатентованный адъювант неизвестного состава

3.4. Способы и материалы

Заражение:

Материал для заражения представлял собой Mhyo, вирулентный полевой штамм, свежую 3-суточную культуру в среде FRIIS с свиной сывороткой. На животное вводили 10 мл культуры, содержащей 9 CCU, интратрахеально, в двое последовательных суток. Всех животных подвергали регулярной ветеринарной проверке

Вакцинация:

Вакцинацию проводили на третьей неделе, когда животные все еще находились со своей свиноматкой. Доза составляла 3 мл, введенные внутримышечно, в правую сторону шеи. Отъем проводили в возрасте 4 недели. За одну неделю до заражения поросят переводили в помещения для заражения.

Серология:

Образцы крови (из яремной вены) отбирали непосредственно перед вакцинацией (T=0), непосредственно перед заражением (T=4) и посмертно (T=7). Образцы сохраняли при температуре окружающей среды, пока не получали сыворотку. Присутствие соответствующих антител в образцах сыворотки для PCV2 (посредством Elisa) или для Lawsonia, определяли в соответствии со стандартными способами.

Пальпация

В участках инъекции в группе SVEA проверяли местные реакции: непосредственно перед вакцинацией, через четыре часа после вакцинации, ежесуточно в течение двух суток и еженедельно в течение пяти недель после вакцинации. Животных, для которых все еще показывали местные реакции через пять недель после вакцинации, индивидуально подвергали пальпации еженедельно, пока местные реакции не исчезали.

Ректальная температура и клинические наблюдения

Ректальную температуру измеряли и клинические наблюдения (0=норма; 1=уменьшение активности; 2=рвота; 3=лежачее положение) проводили за одни сутки до и непосредственно перед вакцинацией, через четыре часа и одни, и двое суток после вакцинации.

Посмертное обследование:

В конце этого эксперимента, через 3 недели после заражения, всех поросят подвергали эвтаназии. В участках инъекции исследовали местные реакции у индивидуальных животных. Оценку в баллах процента очагов в легких регистрировали для каждой свиньи индивидуально в соответствии со шкалой Гудвина и Уитлстоуна.

3.5. Результаты

Таблица 2: Результаты для примера 3

Группа	Адъювант для вакцины	Mhyo LLS(1)	Титр Ab против PCV2(2) через x недель p.v.	Титр Ab против Lawsonia через x недель p.v.
			0	4	7	0	4	7
1	Amphigen	1,5	8,2	8,1	<6,7	<4,2	<5,7	<6,8
2	SVEA	0,75	8,2	9,3	8,9	<4,1	7,3	9,1
3	SVEA+Al(OH)3	2	8,1	8,7	<7,6	<4,2	7,6	9,6
4	MF59+DDA	0,5	<7,9	7,7	<6,4	<4,2	<4,7	<4,6
5	Масло SP (Metastim)	0	8,6	8,0	<6,9	<4,2	6,7	8,4
6	Vaxliant S5	0	7,5	<7,1	<6,3	<4,0	<4,6	<6,1
7	без вакцины	3,5	8,0	<6,4	<4,8	<4,1	<4,1	<3,9

(1) Mhyo LLS=медианная оценка в баллах очагов в легких

Результаты для пальпации и температуры:

Группа, которую мониторировали посредством пальпации участка вакцинации и проверяли по температуре, представляла собой группу, в которой вводили вакцину, снабженную адъювантом SVEA (группу 2). Показано, что ни поддающегося детекции местного набухания, и ни повышения температуры не наблюдали на протяжения периода мониторирования.

3.6. Заключения

В таблице 2 показано, что широкой эффективности для комбинированной вакцины трудно достигнуть; несколько из тестированных адъювантов индуцировали иммунитет против одного или даже двух из патогенов, который можно было оценивать как защитный; это либо в отношении низкой оценки в баллах очагов в легких для Mhyo, либо как достаточно высокий титр специфических антител для PCV2 и Lawsonia. Однако только для вакцины, снабженной адъювантом SVEA, защита была от достаточной до хорошей для всех трех патогенов. Ни один из других адъювантов не дошел до этого уровня широкой эффективности.

Данные из примера 2, по отсутствию вироцидного эффекта снабженной адъювантом SVEA комбинированной вакцины на живой PRRSV, позволяют прогнозировать, что комбинированная вакцина с адъювантом SVEA может также являться эффективной против PRRSV.

Совместно это демонстрирует, что комбинированная вакцина по изобретению является иммунологически эффективной против каждого из патогенов Mhyo, Lawsonia, PCV2 и PRRSV. Кроме того, она является безопасной для свиней.

4. Эксперименты четырех-направленной вакцинации-заражения

Проводили дополнительные эксперименты вакцинации-заражения, при этом поросят вакцинировали четырех-направленной комбинированной вакциной по изобретению, и в 4 отдельных экспериментах эту вакцину тестировали по эффективности всех 4 компонентов: Mhyo, Lawsonia, PCV и PRRSV.

Конкретно, получали 3-направленную комбинированную вакцину, как описано в примерах 1 и 3, содержащую субмикронную эмульсию сквалана, ацетата витамина E и Tween 8, смешанную 1:1 с водной фазой, содержащей инактивированные антигены из Mhyo и Lawsonia, и рекомбинантный продукт экспрессии PCV2-Orf2. Затем, и непосредственно перед вакцинацией поросят, эту 3-направленную вакцину использовали для растворения ампулы лиофилизированной коммерческой вакцины PRRS, с использованием необходимого объема для получения полной дозы PRRSV 10^5 TCID50, на 2 мл дозы для животного 4-направленной комбинированной вакцины. Вакцинацию проводили в форме однократной дозы, внутримышечным способом, для поросят в возрасте 3 недели.

Последующий анализ эффективности вакцины для каждого из четырех антигенов вакцины выполняли в отдельных экспериментах, посредством заражения инфекцией вакцинированных и контрольных особей, чтобы позволить сфокусироваться на конкретных симптомах инфекции и заболевания для этих различных условий.

Однако не ожидали различий в исходе эффективности вакцинации против заражения любой из этих инфекций по сравнению с результатами, описанными в примере 3 выше; было очень маловероятно, что может присутствовать какой-либо различный эффект использования 3-направленной по сравнению с 4-направленной вакциной, применительно к защите против инактивированных антигенов. Иными словами, невозможно было ожидать, что присутствие вируса PRRSV в 4-направленной комбинированной вакцине влияет на эффективность этой комбинированной вакцины против заражения какой-либо из инфекций Mhyo, Lawsonia или PCV. Кроме того, не ожидали эффекта на жизнеспособность и эффективность компонента живого PRRSV, поскольку предшествующие эксперименты уже показали, что не присутствовало значительного эффекта 3-направленной вакцины в адъюванте SVEA на жизнеспособность вируса PRRS. Следовательно, поскольку вирус PRRS не являлся убитым, или его инфекционность не являлась поврежденной при смешивании в 3-направленную вакцину, не существовало причины, по которой он не должен являться способным индуцировать эффективную защиту.

Эти ожидания были действительно подтверждены результатами 4 экспериментов заражения, описанных ниже: обнаружено, что 4-направленная комбинированная вакцина по изобретению индуцирует эффективную иммунную защиту против инфекции и признаков заболевания, индуцированного посредством заражения инфекцией патогеном из каждого из ее 4 компонентов. А также, не присутствовало отрицательного эффекта или помех из-за их комбинации.

4.1. Эффективность для M. hyopneumoniae

4-направленную комбинированную вакцину получали, как описано выше, с использованием лиофилизированной вакцины Porcilis PRRS.

Описание эксперимента

24 SPF поросят использовали для этого исследования. 1 группу из 12 животных вакцинировали один раз внутримышечно в возрасте приблизительно три недели. Одну группу из 12 поросят оставляли невакцинированной, и она служила в качестве группы заражения-контроля. Через четыре недели после вакцинации всех животных подвергали заражению-инфекции вирулентным штаммом Mhyo. Через три недели после заражения всех животных подвергали эвтаназии и исследовали посмертно очаги в легких. У всех животных отбирали образцы крови: до вакцинации, до заражения и посмертно.

Детали эксперимента

Материал для заражения получен из вирулентного полевого штамма Mhyo, в форме свежей 3-суточной культуры в среде FRIIS с свиной сывороткой. На животное вводили 10 мл культуры, содержащей 10 и 9 CCU, соответственно, интратрахеально, в двое последовательных суток. Всех животных подвергали регулярной ветеринарной проверке

Вакцинацию проводили в возрасте три недели, когда животные все еще находились со своей свиноматкой. Доза составляла 2 мл, введенные внутримышечно, в правую сторону шеи. Отъем проводили в возрасте 4 недели. За одну неделю до заражения поросят переводили в помещения для заражения.

Образцы крови (из яремной вены) отбирали непосредственно перед вакцинацией (T=0 недель), непосредственно перед заражением (T=4 недели) и посмертно (T=7 недель). Образцы сохраняли при температуре окружающей среды, пока не получали сыворотку. Присутствие соответствующих антител в образцах сыворотки для PCV2 или для Lawsonia определяли посредством ELISA в соответствии со стандартными способами.

Анализ данных:

В конце этого эксперимента, через 3 недели после заражения, всех поросят подвергали эвтаназии. Оценку в баллах процента очагов в легких регистрировали для каждой свиньи индивидуально в соответствии со шкалой Гудвина и Уитлстоуна (выше).

Результаты

Таблица 3: Результаты данных для Mhyo и серологии из примера 4.1

Группа	Вакцинация	Mhyo LLS (1)	Титр Ab против PCV2 через 7 недель p.v.	Титр Ab против Lawsonia через 7 недель p.v.
			0	4	7	0	4	7
1	4-направленная в SVEA	8,0	<4,8	10,6	9,9	<3,9	<6,6	9,2
2	без вакцины	12,7	5,4	<4,8	<4,3	<3,9	<3,9	<3,9

(1) Mhyo LLS=медианная оценка в баллах очагов в легких

Заключение:

Вакцинация поросят с использованием 4-направленной комбинированной вакцины по изобретению являлась эффективной для защиты против инфекции и признаков заболевания, индуцированного посредством заражения инфекцией Mhyo. А также, существовало хорошее развитие защиты против Lawsonia и PCV2, как измерено посредством серологии.

4.2. Эффективность для PCV2

4-направленную комбинированную вакцину получали, как описано выше, с использованием лиофилизированной вакцины Porcilis PRRS.

Описание эксперимента и детали эксперимента

Поросят распределяли по группам обработки по 10 поросят каждая. Поросят вакцинировали внутрикожно или внутримышечно, когда они были в возрасте приблизительно пять недель:

- одну группу вакцинировали внутримышечно с использованием 4-направленной комбинированной вакцины в адъюванте SVEA: однократной 2 мл дозы вакцины, составленной с использованием PCV2-Orf2 (2500 AU/мл), Mhyo (1,0 PCVU/мл), Lawsonia (5000 AU/мл) и PRRSV при 105 TCID50/дозу. Время между растворением вакцины PRRS и вакцинацией составляло 1 час.

- группа 2 представляла собой положительный контроль, и ее вакцинировали с использованием коммерческой вакцины Porcilis PCV ID и Porcillis PRRS ID, обе внутрикожным способом, но не смешанные и введенные в различные участки на спине поросят.

- поросят в третьей группе не подвергали вакцинации (группа отрицательного контроля), но подвергали заражению.

Через три недели после вакцинации (возраст 8 недель, 3 недели после вакцинации, дата образца [SD] 22 сутки) всех животных подвергали заражению с использованием 5,0 log10 TCID₅₀/мл вируса для заражения PCV2b дикого типа, штамм I12/11, при инокуляции интраназально, по 3 мл на ноздрю.

Через три недели после заражения, всех животных подвергали некрописии и отбирали образцы пахового лимфатического узла, брыжеечного лимфатического узла, миндалины и легкого для детекции PCV2, посредством qПЦР и посредством иммуногистохимии.

Всех поросят ежесуточно обследовали после вакцинации по клиническим признакам. Температуру измеряли на SD-1, SD0, SD0+4 часа и SD1.

Образцы сыворотки собирали от всех животных, их тестировали на антитела против PCV2, PRRSV и Lawsonia.

Сыворотку, ткань и образцы фекального и назального мазка собирали от всех животных, и проверяли на нуклеиновую кислоту PCV посредством qПЦР.

Анализ данных и результаты:

Для считываний температуры не показано значимых результатов.

Объединенные серологические результаты представлены в таблице 4 ниже.

Серология PCV2:

Все поросята из двух вакцинированных групп достигали 100% сероконверсии по антителам против PCV2 уже для даты образца 22 (3 недели p.v.). Фактические титры увеличивались несколько больше после этого и достигали плато с SD35. Невакцинированные контроли проявляли сероконверсию только после заражения, но никогда не достигали более 20% сероконверсии.

IHC и qПЦР PCV2:

Иммуногистологический скрининг и оценку в баллах проводили по признакам PCV в лимфатических узлах и миндалинах. Результаты показали, что в обеих вакцинированных группах баллы составляли в среднем 0,3, в то время как в невакцинированной-зараженной контрольной группе баллы IHC составляли в среднем 1,6.

Результаты qПЦР показали, что в обеих вакцинированных группах поросята имели очень небольшое количество PCV2, присутствующего в сыворотке, назальных или фекальных мазках, или образцах ткани (лимфатические узлы, миндалины, и легкие). Однако контрольная группа становилась сильно положительной по нуклеиновым кислотам PCV2 после заражения.

Серология Lawsonia

Серология Lawsonia для группы 1 показала увеличение титра с SD22, в то время как в контрольной группе для титра Lawsonia показано неуклонное уменьшение.

Серология PRRSV

Серологические результаты для PRRSV, как правило, выражали как соотношение SP (образца к положительному контролю). Когда это соотношение выше 0,4, образец считают положительным по сероконверсии PRRSV. В разделе таблицы 4 для PRRSV представлены эти значения SP. Они показали, что животные в группе 2 положительного контроля (вакцины PRRSV, введенной id способом) являлись сильно положительными по сероконверсии PRRSV; тем не менее, животные в группе 1 (4-направленной комбинированной вакцины, введенной im способом) также достигали хороших уровней сероконверсии. Для невакцинированного контроля почти не показано сероконверсии для PRRSV, поскольку не обнаружено соотношений SP выше 0,05.

Таблица 4: Объединенные серологические результаты из примера 4.2

	Серология для группы	SD0	SD22	SD28	SD35	SD43
	PCV
	1. 4-направленная вакцина, im	3,7	7,2	7,7	10,0	10,4
	2. Porcillis PCV ID+Porcilis PRRS ID	3,7	7,0	8,1	9,5	9,9
	3. невакцинированный контроль	4,2	2,3	2,1	3,5	5,7
	Lawsonia
	1. 4-направленная вакцина, im	4,7	4,3	5,0	5,7	6,3
	3. невакцинированный контроль	3,3	3,3	3,3	2,9	2,9
	PRRSV (соотношения SP)
	1. 4-направленная вакцина, im	0,0	0,9	1,3	1,3	1,4
	2. Porcillis PCV ID+Porcilis PRRS ID	0,0	1,6	1,8	2,1	2,3
	3. невакцинированный контроль	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0

Заключения:

Вакцинация поросят с использованием 4-направленной комбинированной вакцины по изобретению являлась эффективной для защиты против инфекции и признаков заболевания, индуцированного заражением инфекцией PCV2. А также, происходило хорошее развитие защиты против Lawsonia и PRRSV, как измерено посредством серологии.

4.3. Эффективность для Lawsonia

4-направленную комбинированную вакцину получали, как описано выше, с использованием лиофилизированной вакцины Prime Pac PRRS.

Описание эксперимента

Три группы поросят в возрасте три недели вакцинировали с использованием 4-направленной комбинированной вакцины, и подвергали заражению инфекцией вирулентными бактериями Lawsonia через 5 недель. В одной группе вводили полную 4-направленную вакцину, в другой группе вводили контрольную вакцину, содержащую все те же ингредиенты, за исключением антигена Lawsonia. В третьей группе вводили контрольную вакцину, но без заражения, поскольку ее подвергали некрописии на время заражения для подтверждения отсутствия инфекции Lawsonia в стаде до заражения.

Группы сравнивали для определения эффективности однократной дозы комбинированной вакцины против заболевания, вызванного заражением Lawsonia: илеита, колонизации подвздошной кишки Lawsonia, выделения Lawsonia и эффекта на прирост массы.

У всех поросят каждые вторые сутки оценивали местные и системные реакции в течение 21 суток после вакцинации или до разрешения. Образцы фекалий собирали для подтверждения отсутствия полевой инфекции Lawsonia до заражения. Образцы крови собирали на протяжении исследования для оценки ответов антител на вакцинацию и заражение, образцы фекалий собирали также для qПЦР Lawsonia, и регистрировали данные массы тела.

Через три недели после заражения (в возрасте 11 недель) всех оставшихся животных подвергали некрописии и определяли оценки в баллах для макроскопических очагов в подвздошной кишке, и соскобы слизистой оболочки собирали для количественной ПЦР (qПЦР) Lawsonia. А также, срезы подвздошной кишки собирали для иммуногистохимии (IHC) и гистопатологии.

Детали эксперимента

Поросята имели смешанный пол, и относились к смешанной породе американский йоркшир-ландрас-дюрок. Воду и подходящий по возрасту корм предоставляли по желанию.

Полная 4-направленная вакцина содержала на дозу для животного 2 мл: 2,0 RP антигена Mhyo; 6000 единиц по Elisa антигена Lawsonia/мл; 5,7 мкг/мл антигена Orf2 PCV2; и 10^5 TCID50 PRRSV.

Непосредственно перед заражением, 2 поросят, вакцинированных контрольной вакциной, подвергали некрописии, для подтверждения отсутствия инфекции Lawsonia до заражения.

Заражение Lawsonia проводили пероральным способом, через 5 недель после вакцинации (в возрасте приблизительно 8 недель), с использованием инокулята 4,6 10Log TCID50 живой вирулентной Lawsonia на животное.

Оценку в баллах очагов в подвздошной кишке проводили на 2,5 см срезе подвздошной кишки, вырезанном и собранном в 10% забуференный формалин, который использовали для гистопатологического обследования, и для анализа присутствия Lawsonia посредством иммуногистохимии.

Остальную часть подвздошной кишки открывали, и поверхность слизистой оболочки визуально проверяли на присутствие ассоциированных с Lawsonia очагов илеита (также называемого пролиферативным энтеритом свиней или PPE), включая пролиферацию слизистой оболочки с утолщением стенки кишечника, отек, гиперемию, закупорку, некроз и геморрагию. Макроскопическим очагам присваивали оценку в баллах в диапазоне от 0 (нормальная слизистая оболочка) до 5 (тяжелый PPE с геморрагией и/или некрозом). А также, соскобы подвздошной кишки собирали и замораживали до анализа.

Анализ данных:

Оценка в баллах илеита была основана на оценке в баллах микроскопических очагов илеита посредством гистопатологии, и на оценке в баллах тяжести макроскопических очагов подвздошной кишки.

Инфекцию (колонизацию) Lawsonia определяли на основании оценки в баллах микроскопической IHC.

qПЦР использовали для оценки в баллах присутствия Lawsonia в ректальных мазках и соскобах слизистой оболочки кишечника, и for выделения с фекалиями.

Результаты

Выделение с фекалиями:

Не обнаружено значимых различий между группами через 14 суток после заражения (dpc). Однако результаты для выделения с фекалиями на 20 dpc показали, что вакцинированные поросята выделяли значимо меньше Lawsonia, чем в группе плацебо в это время (p=0,0134), что показывает более раннее восстановление для вакцинированных особей.

Колонизация:

Посредством qПЦР илеальных соскобов, собранных на 20 dpc, показали значимо большую колонизацию Lawsonia в группе, в которой вводили вакцину плацебо (p=0,0094).

Ежесуточный прирост массы:

После заражения, ежесуточный прирост массы также являлся значимо улучшенным у поросят, вакцинированных 4-направленной вакциной, по сравнению с группой, в которой водили вакцину плацебо (p=0,0337).

Заключение:

Вакцинация поросят с использованием 4-направленной комбинированной вакцины по изобретению, являлась эффективной для защиты против инфекции и признаков заболевания, индуцированного заражением инфекцией Lawsonia.

4.4. Эффективность для PRRSV

4-направленную комбинированную вакцину получали, как описано выше, и включали PRRSV в результате разведения ампулы вакцины PrimePac™ PRRS, непосредственно перед вакцинацией.

Описание эксперимента

Целью этого исследования являлась оценка иммуногенности фракции PRRS комбинированной вакцины по изобретению, посредством вакцинации поросят в возрасте три недели и заражения вирулентным PRRSV через 4,5 недель.

Две группы по 25 здоровых поросят каждая, отрицательных по антителам против PRRSV и виремии PCV2, вакцинировали в возрасте три недели внутримышечным способом с использованием дозы 2 мл 4-направленной комбинированной вакцины, или с использованием вакцины плацебо (3-направленной), не содержащей PRRSV. Все антигены присутствовали в ожидаемых в поле уровнях дозы.

В возрасте приблизительно 7,5 недели, поросят подвергали интраназальному заражению вирусом PRRS штамма NADC-20. На протяжении периода после заражения, поросят обследовали посредством клинических наблюдений и клинических оценок в баллах, и собирали образцы крови и назальных мазков. Через 14 суток после заражения, всех поросят подвергали эвтаназии и некропсии. Макроскопические очаги в легких оценивали в баллах, и срезы легких и лимфатические узлы собирали для гистопатологии и иммуногистохимии (IHC). Результаты оценивали для определения эффективности однократной дозы комбинированной вакцины для уменьшения респираторного заболевания, виремии и/или выделения PRRSV после заражения инфекцией.

Массу тела регистрировали на время вакцинации, при заражении и в конце теста.

Детали эксперимента

Заражение PRRSV проводили интраназальным способом с использованием 2 мл разведенного материала для заражения на ноздрю. Вирус для заражения получали непосредственно перед введением и сохраняли на льду до и во время использования. Общая доза для заражения составляла приблизительно 4,2 log₁₀ TCID₅₀ на животное.

Полная 4-направленная вакцина содержала на дозу для животного 2 мл: 2,0 RP антигена Mhyo; 7000 единиц по Elisa антигена Lawsonia/мл; 5,7 мкг/мл антигена Orf2 PCV2; и 10^5 TCID50 PRRSV.

Анализ данных

Клинические наблюдения респираторного дистресса и летаргии регистрировали непосредственно до и впоследствии после заражения. Показателями являлись клинические оценки в баллах в диапазоне от 0: норма, до 3: тяжелое диспноэ и/или тахипноэ и/или выраженное брюшное дыхание при стрессе, при этом стресс индуцировали, побуждая свиней к быстрому передвижению.

Оценку в баллах легких проводили в соответствии с Halbur et.al. (1995, Vet. Pathol., vol. 32, p. 648-660 [Appendix 7, Ref. 1]). Макроскопическим очагам в легких присваивали балл для оценки процента легкого, пораженного пневмонией. Каждой доле легкого присваивали некоторое количество баллов для отражения приблизительного процента от объема целого легкого, представленного этой долей. Десять возможных баллов (5 для верхней, 5 для нижней) присваивали каждой из правой передней доли, правой средней доли, передней части левой передней доли и задней части левой передней доли. Добавочной доле присваивали 5 возможных баллов, и 27,5 возможных баллов (15 для верхней и 12,5 для нижней) присваивали каждой из правой и левой задних долей для получения всего 100 возможных баллов. Макроскопические оценки в баллах очагов в легких регистрировали как количество баллов, отражающее приблизительный процент объема этой доли, пораженного ассоциированной с PRRS пневмонией. Общую оценку в баллах очагов в легких для каждого легкого рассчитывали как сумму этих оценок в баллах макроскопических очагов в легких для всех долей.

Образцы легких отбирали у каждой свиньи для гистопатологического обследования, конкретно: верхушку левой средней доли, фрагмент добавочной доли и переднюю часть правой задней доли. Кроме того, отбирали срезы из медиастинальных и бронхиальных лимфатических узлов. Ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине для гистопатологии и IHC.

Дополнительно собирали образцы сыворотки, для детекции антител против PRRSV; назальные мазки, для детекции нуклеиновой кислоты PRRSV посредством количественной RT-ПЦР; и образцы тканей, для микроскопического анализа и IHC.

Образцы PRRSV титровали на линии клеток MARC145. Для каждого повтора, серийные 10-кратные разведения добавляли в десять лунок 96-луночного планшета, содержащего предварительно сформированные монослои клеток, и планшеты инкубировали с 5% CO2 при 35-39°C в течение пяти суток. Затем планшеты фиксировали и окрашивали с использованием флуоресцентного антитела против PRRSV, и оценивали в баллах посредством IFT.

Выходные переменные для эффективности вакцинации оценивали посредством анализа в период после заражения клинических признаков и клинических оценок в баллах, температуры тела, массы тела, назального выделения и виремии, как определено посредством ПЦР, так же как макроскопического и микроскопического анализа очагов в легких через 14 суток после заражения. Респираторное заболевание оценивали посредством макроскопической оценки в баллах очагов в легких

Вторичные переменные для эффективности в результате анализа тканей посредством гистопатологии и IHC, максимальный уровень виремии, максимальный уровень выделения, прирост массы после заражения, клинические наблюдения после заражения и респираторные клинические оценки в баллах после заражения.

Результаты

Медианы оценки в баллах очагов в легких, в % затронутого легкого, составляли: 20% для группы вакцины плацебо, по сравнению с 7% для группы 4-направленной вакцины (p=0,0014).

Гистопатологию трех собранных образцов легких оценивали в баллах по шкале от 0 (норма) до 4 (тяжелая интерстициальная пневмония). Максимальные оценки в баллах составляли: 3 для группы вакцины плацебо, по сравнению с 2 для группы 4-направленной вакцины (p=0,0010).

Иммуногистохимию образца легкого оценивали в баллах по шкале от 0 (отсутствие положительных по антигену PRRSV клеток) до 4 (> 100 положительных клеток на срез ткани). Максимальные значения оценок в баллах трех собранных образцов легких составляли 2 для группы вакцины плацебо, по сравнению с 1 для группы 4-направленной вакцины (p=0,0006).

Заключение:

Вакцинация поросят с использованием 4-направленной комбинированной вакцины по изобретению являлась эффективной для защиты против инфекции и признаков заболевания, индуцированного заражением инфекцией PRRSV.

1. Комбинированная вакцина, содержащая неспособный к воспроизведению антиген из цирковируса свиней типа 2 (PCV2) и живой вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), отличающаяся тем, что вакцина представляет собой эмульсию масло-в-воде, содержащую сквалан и ацетат витамина E.

2. Комбинированная вакцина по п.1, содержащая сквалан в количестве между 1 и 9% масс./об.

3. Комбинированная вакцина по п.1 или 2, содержащая ацетат витамина E в количестве между 1 и 10% масс./об.

4. Комбинированная вакцина по любому из пп. 1-3, где эмульсия масло-в-воде представляет собой субмикронную эмульсию.

5. Комбинированная вакцина по любому из пп. 1-4, также содержащая неспособный к воспроизведению антиген из Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo).

6. Комбинированная вакцина по любому из пп. 1-5, также содержащая неспособный к воспроизведению антиген из Lawsonia intracellularis (Lawsonia).

7. Способ получения комбинированной вакцины по любому из пп. 1-6, включающий стадии:

- получения водной фазы, содержащей неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 и живой PRRSV, и

- смешивания указанной водной фазы с масляной эмульсией, содержащей сквалан и ацетат витамина E.

8. Способ получения комбинированной вакцины по любому из пп. 1-6, включающий стадии:

- получения живого PRRSV в лиофилизированной форме,

- получения водной фазы, содержащей неспособный к воспроизведению антиген из PCV2,

- смешивания указанной водной фазы с масляной эмульсией, содержащей сквалан и ацетат витамина E, и

- разведения указанного лиофилизированного живого PRRSV указанной смесью водной фазы и масляной эмульсии.

9. Способ получения комбинированной вакцины по любому из пп. 1-6, включающий стадии:

- получения смеси водной фазы, содержащей неспособный к воспроизведению антиген из PCV2, и масляной эмульсии, содержащей сквалан и ацетат витамина E, и

- разведения живого PRRSV в лиофилизированной форме указанной смесью.

10. Эмульсия масло-в-воде, содержащая сквалан и ацетат витамина E, неспособный к воспроизведению антиген из PCV2 и живой PRRSV, для использования в вакцинации свиней против PCV2 и PRRSV.

11. Применение неспособного к воспроизведению антигена из PCV2 и живого PRRSV для изготовления комбинированной вакцины для свиней, отличающееся тем, что вакцина представляет собой эмульсию масло-в-воде, содержащую сквалан и ацетат витамина E.

12. Способ вакцинации свиней против PCV2 и PRRSV посредством введения указанным свиньям комбинированной вакцины по любому из пп. 1-6.