Способ получения оздоровленного посадочного материала гладиолуса гибридного (gladiolus hybridus hort.)

Изобретение относится к области биотехнологии. Клубнепочки гладиолуса гибридного подвергают двухэтапной стерилизации. Клубнепочки помещают в раствор нейтрального детергента и выдерживают 4 мин, периодически помешивают. Затем клубнепочки промывают холодной проточной водой в течение 5 минут. В ламинарном боксе заливают 0,02 – 0,06 % раствором гипохлорита натрия и выдерживают 8 мин при периодическом помешивании и после помещают на 10 секунд в 96% этанол. Промывают 3 раза по 3 минуты стерильной бидистиллированной водой. В качестве экспланта используют извлеченную верхушечную почку возобновления, который помещают на стерильную агаризованную модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением НУК 2 мг/л и 6- БАП 2 мг/л в Чашки Петри. Чашки Петри держат в помещении с заданными световыми (16ч – день; 8 ч – ночь) и температурными (21-22°С) условиями. Каждые 30 дней экспланты помещают на вышеописанную свежую питательную среду МС. На 3-4 раз переносят на питательную среду без добавления регуляторов роста 6-БАП и НУК. В течение 2-3 месяцев происходит формирование зачатков растений-регенерантов, а в последующем растений-регенерантов с образованием у них клубнелуковичек. Изобретение позволяет сократить получение клубнелуковиц гибридного гладиолуса до 5-7 месяцев. 1 табл.

 

Изобретение относится к области растениеводства, а именно, к цветоводству, которое может быть использовано для получения в короткие сроки оздоровленного посадочного материала гладиолуса гибридного в искусственных условиях.

Гладиолус гибридный имеет продолжительный вегетационный период, зависящий от сорта, который от посадки до цветения клубнелуковицы составляет порядка 60-100 дней, помимо этого примерно 30-40 дней требуется для формирования его подземной части – клубнелуковицы, которая необходима для выращивания растения в следующем вегетационном периоде для получения срезочного цветка (Былов В.Н. Основы сравнительной сортооценки декоративных растений // Интродукция и селекция цветочно-декоративных растений. - М.: Наука, 1978. - С. 7-31; Седельникова, Л.Л. Биологические особенности Gladiolus hybridus в связи с адаптацией в Сибирском регионе / Л.Л. Седельникова, И.Г. Воробьева // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. – 2020. – Т. 20. – № 4. – С. 417-426. – DOI 10.18500/1816-9775-2020-20-4-417-426).

Следует отметить, что посадочный материал гладиолуса может находиться в достаточно длительном периоде «покоя», при условии выполнения заданных параметров (температура +2…+5°С, влажность воздуха 60-70%), которые необходимы для их правильного хранения (Кузичев О.Б. Изучение влияния длительности хранения клубнепочек на рост и развитие растений гладиолуса гибридного (Gladiolus hybridus hort.) / О. Б. Кузичев // Инновационные подходы к разработке технологий производства, хранения и переработки продукции растениеводческого кластера: материалы Всероссийской научно-практической конференции, Мичуринск, 13 февраля 2020 года. – Мичуринск: Мичуринский государственный аграрный университет, 2020. – С. 75-78).

Нарушение данных условий приводит к ухудшению качества клубнелуковиц и, следовательно, нецелесообразности выращивания для получения цветка. Техника получения оздоровленного посадочного материала гладиолуса позволяет в короткие сроки (5-7 месяцев) получить значительное количество полностью здоровых клубнелуковичек гладиолуса гибридного из небольшого количества посаженных растительных эксплантов. Кроме этого полученные данным способом клубнелуковички, после высушивания, которое длится порядка 1 месяца, можно сразу помещать в заданные температурные условия для создания периода «покоя» клубнелуковиц, а позже использовать посадочный материал по мере необходимости.

На настоящее время есть ряд изобретений, которые позволяют размножать гладиолус гибридный в условиях in vitro используя методики, применяемые при микроклональном размножении.

Известен «Способ размножения гладиолуса in vitro» (RU № 2286053, МПК A01H4/00, A01H5/00, опубликовано 27.10.2006), согласно которому в качестве экспланта были использованы пазушные и апикальные почки гладиолуса, применяемые регуляторы роста - 0,5-1,5 мг/л 6-бензиламинопурин и 0,5-1,5 мг/л α-нафтилуксусная кислота, были такие же как и в заявляемом изобретении, но в более низких концентрациях. Однако в описании изобретения нет информации, сколько времени потребовалось для формирования полноценных клубнелуковиц гладиолуса. Кроме того, из описания следует, что для формирования клубнелуковиц необходимо переносить растения с агаризованной питательной среды в почву и выращивать растения обычным способом.

Известен также «Способ микроразмножения гладиолуса» (SU № 1695854, МПК A01H4/00, опубликовано 07.12.1991). Одной из целей которого являлось изучение влияния питательной среды на выход живых растений в процессе хранения, при этом фиксировался невысокий коэффициент размножения.

Наиболее близким аналогом, принятым за прототип, является «Способ микроклонального размножения гладиолуса» (RU № 2180165, МПК A01H4/00, опубликовано 10.03.2002). В качестве первичного экспланта использовали вырезанную апикальную почку, с прилегающими к ней участками ткани. Среди достоинств этого способа можно отметить то, что при использовании в среде культивирования сахарозы в концентрации 6-10% можно получить клубнелуковицы диаметром 18-23 мм. Среди недостатков этого изобретения можно указать следующие: длительная процедура стерилизации растительного материала; многоэтапный процесс получения клубнелуковиц гладиолуса гибридного, который состоит из нескольких смен состава и состояния питательной среды; требуется доращивание растений-регенерантов в горшках с субстратом.

Задачей заявляемого изобретения является создание технологии получения оздоровленного посадочного материала гладиолуса гибридного (Gladiolus hybridus Hort.).

Техническим результатом изобретения является получение оздоровленных клубнелуковиц гладиолуса, не требующее многоэтапности процесса выращивания и осуществляемое в короткие сроки в искусственных условиях.

Для достижения указанного технического результата клубнепочки сортосмеси гладиолуса гибридного подвергают двухэтапной стерилизации. Первоначально их заливают раствором нейтрального детергента (бидистиллированная вода, 100 мл; агент Tween 20, 40 мкл) на 4 мин, в течение этого времени их периодически помешивают. Затем клубнепочки промывают холодной проточной водой в течение 5 минут. После заливают 0,02 – 0,06 % раствором гипохлорита натрия на 8 мин, периодически перемешивают. Далее растительные объекты помещают на 10 секунд в 96% этанол. После указанных процедур клубнепочки промывают 3 раза по 3 минуты стерильной бидистиллированной водой. Стерильными инструментами извлекают верхушечную почку возобновления, которую используют в качестве экспланта. Экспланты помещают на предварительно разлитую и остывшую стерильную агаризованную модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) с регуляторами роста. После этого экспланты помещают в помещение со следующими световыми и температурными условиями. Периоды освещения: световой – с 8.00 до 24.00 (16 часов); темновой – с 24.00 до 8.00 (8 часов); температура воздуха 21-22°С. Каждые 30 дней экспланты переносят на свежую питательную среду МС. Через определенное время (5-7 пассажей), которое зависит от добавляемых регуляторов роста, происходит формирование регенерантов-растений из каллуса, а позже и клубнелуковичек гладиолуса гибридного.

Отличительные признаки, которые были выявлены, позволили сделать вывод о соответствии предлагаемого технологического решения критерию «новизна».

В процессе поиска и сравнительного анализа не было выявлено технических решений, которые бы характеризовались идентичной или аналогичной совокупностью существенных признаков с предлагаемым решением, а также из уровня техники не известно влияние отличительных признаков заявляемого решения на достигаемый технический результат, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Предложенный способ позволяет получить клубнелуковицы гибридного гладиолуса в течение 5-7 месяцев.

Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Для достижения указанного технического результата клубнепочки сортосмеси гладиолуса гибридного подвергают двухэтапной стерилизации. Первый этап проводят в нестерильных условиях. Очищенные от внешних защитных оболочек клубнепочки диаметром 3-10 мм помещают по 5-7 штук в стерильные колбы объемом 50 мл. Предварительно герметично закрытые колбы стерилизуют в сухожаровом шкафу, 150°С 2-3 часа. После этого клубнепочки заливают раствором нейтрального детергента (бидистиллированная вода, 100 мл; агент Tween 20, 40 мкл) и выдерживают 4 мин, периодически помешивают. Затем клубнепочки промывают холодной проточной водой в течение 5 минут. 2 этап проводят в стерильных условиях. В ламинарном боксе выполняют замену ранее использованных колб на другие стерильные колбы объемом 50 мл. Клубнепочки заливают 0,02 – 0,06 % раствором гипохлорита натрия и выдерживают 8 мин, периодически помешивают. Далее их помещают на 10 секунд в 96% этанол. После этого клубнепочки промывают 3 раза по 3 минуты стерильной бидистиллированной водой. Далее в стерильных условиях клубнепочки помещают на стерильную фильтровальную бумагу, и используют металлический пинцет и скальпель для фиксации и извлечения верхушечной почки возобновления, которую используют в качестве экспланта. Данный эксплант помещают на стерильную агаризованную модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) следующего состава: ½ состава макро- и микросолей; FeSO₄ · 7H₂O – 27,8 мг/л и Na₂ЭДТА – 37,3 мг/л; тиамин 0,6 мг/л; пиридоксин 0,3 мг/л; никотиновая кислота 0,3 мг/л; инозит 60 мг/л; пиклорам – 3 мг/л; сахароза 3,6%; агар 0,5-0,6%, pH=5,8±0.1. Перед использованием данную МС среду автоклавируют при 0,9 атм. в течение 30 минут и хранят в темном месте при комнатной температуре (26±2°С) в течение 1-7 дней, либо более длительно в холодильнике при температуре 4°С в течение 1-3 недель. Первоначально и после первой пересадки (пассажа) в качестве емкостей для эксплантов используют стандартные стеклянные круглые Чашки Петри (диаметром 90 мм). В последующем, при втором и последующих пассажах, используют пластиковые контейнеры с крышками (500 мл) из полипропилена. Чашки Петри перед использованием стерилизуют в сухожаровом шкафу 150°С 2-3 часа. Контейнеры перед использованием оставляют в открытом состоянии в ламинарном боксе под УФ на 40 минут. В день эксперимента агаризованную МС среду разогревают в микроволной печи вплоть до кипения и разливают по 30 мл в Чашки Петри, либо по 50 мл в контейнеры в стерильных условиях в стерильные емкости для выращивания. В контейнеры питательную среду МС заливают температурой 45°С - 60°С. После застывания и охлаждения до комнатной температуры питательной среды МС на поверхность помещают растительные экспланты, Чашки Петри заматывают в два ряда тонкой пленкой (парафильм). После этого Чашки Петри с растительными эксплантами помещают в помещение с заданными условиями. Периоды освещения: световой – с 8.00 до 24.00 (16 часов), люминесцентные лампы с интенсивностью освещения 2-5 тыс Люкс; темновой – с 24.00 до 8.00 (8 часов). Температурный режим: температура воздуха 21-22°С, которая поддерживалась с помощью кондиционеров. Каждые 30 дней экспланты помещают на вышеописанную свежую питательную среду МС. На 3-4 пассаж каллус переносят на питательную среду без добавления регулятора роста пиклорама. В дальнейшем происходит формирование зачатков растений-регенерантов, а в последующем растений-регенерантов с образованием у них клубнелуковичек.

Пример 2. Способ осуществляется аналогично примеру 1, различие состоит в составе питательной среды МС, в качестве регулятора роста добавляют альфа-нафтилуксусную кислоту 2 мг/л (НУК).

Пример 3. Способ осуществляется аналогично примеру 1, различие состоит в составе питательной среды МС, в качестве регулятора роста добавляют НУК 2 мг/л и 6-бензиламинопурин (6-БАП) 2 мг/л. На 3-4 пассаж каллус переносят на питательную среду без добавления регуляторов роста 6-БАП и НУК. В течение 2-3 пассажей сначала происходит формирование зачатков растений-регенерантов, и в последующем растений-регенерантов с образованием у них клубнелуковичек.

Использование данного способа позволяет достигать следующих результатов. Средний процент выхода стерильных эксплантов составляет 82,13%. Максимальный процент выхода каллуса фиксируется на среде с добавлением НУК 2 мг/л (Табл 1). Максимальное формирование клубнелуковичек было на питательной среде МС с добавлением пиклорама (3 мг/л), однако сохранность была невысокой, всего порядка 23%. Более высокая сохранность была у клубнелуковичек выращиваемых на питательных средах МС с добавлением НУК (2 мг/л), а также НУК (2 мг/л) совместно с 6-БАП (2 мг/л). Клубнелуковицы с максимальным диаметром (0,76 см) образовывались на среде с НУК (2 мг/л) и 6-БАП (2 мг/л).

Таблица 1. Процент выхода каллуса, количество сформированных клубнелуковичек гладиолуса гибридного, сохранность клубнелуковичек и их диаметр после периода покоя при добавлении в ½ МС: а) пиклорама 3 мг/л; б) НУК 2 мг/л; в) НУК 2 мг/л и 6-БАП 2 мг/л. При подсчете процента выхода каллуса за 100 % принято количество помещенных на питательную среду МС эксплантов (5-7). Период покоя - 5 месяцев, температура+4°С.

½ МС питательной среды	+Пиклорам 3 мг/л	+НУК 2 мг/л	+НУК 2 мг/л 6-БАП 2 мг/л
Процент выхода каллуса,%	42	63	50
Количество сформированных клубнелуковичек, шт.	73	31	17
Сохранность клубнелуковичек после периода покоя, шт.	17	15	7
Диаметр клубнелуковичек после периода покоя, см.	0,36	0,34	0,76

Применение способа получения оздоровленного посадочного материала гладиолуса гибридного (Gladiolus hybridus Hort.) в качестве способа для размножения клубнелуковиц гладиолуса, позволяет получить в короткие сроки оздоровленный материал для выращивания растений в открытом грунте с перспективой получения срезочного цветка.

Способ получения оздоровленного посадочного материала гладиолуса гибридного (Gladiolus hybridus Hort.), включающий стерилизацию клубнепочек гладиолуса раствором гипохлорита натрия и этанола, помещение клубнепочек на питательную среду, содержащую 1/2 концентраций макро- и микросолей по Мурасиге-Скуга, альфа-нафтилуксусную кислоту (НУК), 6-бензиламинопурин (6-БАП), сахарозу и агар, отличающийся тем, что клубнепочки подвергают двухэтапной стерилизации, причем на первом этапе стерилизацию проводят в нестерильных условиях, для этого очищенные от внешних защитных оболочек клубнепочки диаметром 3-10 мм помещают по 5-7 штук в стерильные колбы объемом 50 мл, предварительно герметично закрытые колбы стерилизуют в сухожаровом шкафу при температуре 150°С в течение 2-3 часов, после этого клубнепочки заливают раствором нейтрального детергента, в качестве которого используются бидистиллированная вода в количестве 100 мл и агент Tween 20 в количестве 40 мкл, и выдерживают в течение 4 мин, периодически помешивая, затем клубнепочки промывают холодной проточной водой в течение 5 минут, второй этап проводят в стерильных условиях, в ламинарном боксе выполняют замену ранее использованных колб на другие стерильные колбы объемом 50 мл, клубнепочки заливают 0,02 – 0,06 % раствором гипохлорита натрия и выдерживают в течение 8 мин, периодически помешивая, далее клубнепочки помещают на 10 секунд в 96% этанол, после этого клубнепочки промывают 3 раза по 3 минуты стерильной бидистиллированной водой, далее в стерильных условиях клубнепочки помещают на стерильную фильтровальную бумагу, и с помощью металлического пинцета и скальпеля осуществляют фиксацию и извлечение верхушечной почки возобновления, которую используют в качестве экспланта, данный эксплант помещают на стерильную агаризованную модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга (МС), содержащую 1/2 состава макро- и микросолей, FeSO₄ · 7 H₂O – 27,8 мг/л и Na₂ЭДТА – 37,3 мг/л, тиамин 0,6 мг/л, пиридоксин 0,3 мг/л, никотиновую кислоту 0,3 мг/л, инозит 60 мг/л, НУК 2 мг/л и 6-БАП 2 мг/л, сахарозу 3,6%; агар 0,5-0,6% при pH=5,8±0,1, перед использованием данную питательную среду автоклавируют при 0,9 атм. в течение 30 минут и хранят в темном месте при температуре 26±2°С в течение 1-7 дней, либо в холодильнике при температуре 4°С в течение 1-3 недель, первоначально и после первой пересадки (пассажа) в качестве емкостей для эксплантов используют стандартные стеклянные круглые Чашки Петри диаметром 90 мм, в последующем, при втором и последующих пассажах, используют пластиковые контейнеры емкостью 500 мл с крышками из полипропилена, Чашки Петри перед использованием стерилизуют в сухожаровом шкафу при температуре 150°С в течение 2-3 часов, контейнеры перед использованием оставляют в открытом состоянии в ламинарном боксе под ультрафиолетом на 40 минут, затем агаризованную питательную среду разогревают в микроволной печи вплоть до кипения и разливают по 30 мл в Чашки Петри, либо по 50 мл в контейнеры в стерильных условиях в стерильные емкости для выращивания, в контейнеры питательную среду заливают температурой 45°С - 60°С, после застывания и охлаждения до комнатной температуры питательной среды на поверхность помещают растительные экспланты, Чашки Петри заматывают в два ряда тонкой пленкой (парафильм), после этого Чашки Петри с растительными эксплантами помещают в помещение с заданными условиями, периоды освещения: световой – с 8.00 до 24.00 (16 часов), люминесцентные лампы с интенсивностью освещения 2-5 тыс Люкс; темновой – с 24.00 до 8.00 (8 часов); температурный режим: температура воздуха 21-22°С, которая поддерживается с помощью кондиционеров, каждые 30 дней экспланты помещают на вышеописанную свежую питательную среду, на 3-4 пассаж каллус переносят на питательную среду без добавления регуляторов роста НУК и 6-БАП.