Способ формирования коллекции и длительного депонирования винограда in vitro

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ формирования коллекции и длительного депонирования винограда in vitro, относится к сельскому хозяйству, в частности к виноградарству, и может быть использован для длительного хранения ценных и редких сортов винограда в коллекции in vitro. Способ включает введение в культуру апикальных меристем и формирование на их основе коллекции, с предварительным культивированием на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга, высадку на хранение. При этом апикальные меристемы размером 0,1÷0,2 мм, выделенные из пробирочных растений, ранее введенных в культуру, выдерживают на питательной среде с добавлением регулятора роста Мелафен при разведении 10^-5÷10^-11, а образовавшиеся побеги выдерживают на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей Цефотаксим в концентрации 50÷450 мг/л, и производят высадку на хранение микрочеренков оздоровленных растений, выделенных из верхних частей побегов. Способ обеспечивает беспересадочное хранение микрорастений винограда в стандартных условиях культивирования до 10÷12 месяцев при сохранении генетической стабильности образцов, оздоровление растений винограда от вирусной и фитоплазменной инфекции и при этом повышает экономическую эффективность хранения генофонда винограда in vitro. 5 табл.

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к виноградарству и может быть использовано для длительного хранения ценных и редких сортов винограда в коллекции invitro, способствует сохранению биоразнообразия.

Наряду с традиционными способами сохранения биоразнообразия растительного мира, в настоящее время широко используются методы биотехнологии растений, в том числе поддержание культур редких видов на питательной среде в генетических банках invitro.

При хранении коллекций invitro в оптимальных условиях роста (t=20÷25°C), возникает необходимость частого переноса растений на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения образца и увеличивает риск его инфицирования различными микроорганизмами. Кроме того, частое пассирование микропобегов стимулирует активное деление клеток, что может приводить к возникновению сомаклональных вариантов.

Для увеличения интервала между пассажами используют различные методы и приемы, основанные на замедлении роста пробирочных растений.

Известен способ депонирования растений винограда «Способ длительного сохранения invitro растений винограда» (патент RU №2110172). Ограничение роста растений достигают за счет питательной среды, в состав которой вводят тонкоизмельченные семена винограда в таком количестве, что они являются естественными ингибиторами роста.

Недостаток этого способа заключается в трудности определения необходимой концентрации ингибиторов, содержащихся в семенах (абсцизовой и хлорогеновой кислот, фенолов, рутина, свободных ауксиов и цитохининов), которая колеблется в зависимости от сортовых особенностей, времени сбора и продолжительности срока хранения семян.

Известны способы сохранение редких и исчезающих видов растений invitro при помощи, которых создана коллекция из 72 видов растений, относящихся к 25 семействам (Сохранение редких и исчезающих видов растений при помощи методов биотехнологии. Жолобова О.О. и др. Современные проблемы науки и образования, 2012, №1).

Следует отметить, что для оптимизации питательных сред применяли большое количество регуляторов роста: кинетин, 6-бензиламинопурин, тидиазурон, зеатин, рибозид, ИМК (индолилмасляная кислота) ИУК (индолилуксусная кислота), что может способствовать появлению сомаклональной изменчивости и генетической нестабильности образцов.

Известен способ длительного хранения invitro микрорастений березы (патент RU 2634409). Для замедления роста микрорастений и их длительного хранения использовались пониженная положительная температура при различных световых режимах и питательные среды с различным содержанием агара, аскорбиновой кислоты, с добавлением ретардантахлорхолинхлорид (ССС), лимитирующего рост побегов, или активированного угля. Режимы депонирования: 1) температура +4…+7°С, фотопериод 8 часов (8 ч день/16 ч ночь), интенсивность освещения 0,5 лкс; 2) температура +4…+7°С, темнота.

К недостаткам данного способа следует отнести одновременное использование нескольких факторов: пониженной температуры, оптимально упрощенного состава питательной среды (без фитогормонов, с повышенным содержанием аскорбиновой кислоты) и изменения режима освещения (в темноте), что усложняет формирование и хранение коллекции.

Известен способ стерилизации зеленых растительных эксплантов винограда перед вводом в культуру invitro (патент RU №2720916), заключающийся в том, что при заготовке растительного материала используют верхушки побегов 10÷15 см активно вегетирующих растений, а стерилизация эксплантов осуществляется последовательно в два этапа: водным раствором этанола, а затем - 20÷30% водным раствором препарата «Дезавид+».

Недостатком этого способа является поверхностная стерилизация эксплантов, которая является первым шагом для получения асептических культур. Для ввода в культуру необходимо помимо поверхностной стерилизации, оздоровить их от внутренней вирусной и фитоплазменной инфекции с помощью противовирусных препаратов и антибиотиков.

Следует отметить, что во всех рассмотренных способах при формировании коллекции отсутствует процедура оздоровления растений от внутренней вирусной и фитоплазменной инфекции, которая способствует длительному хранению генофонда в коллекции invitro.

Задачей настоящего изобретения является, разработка способа формирования коллекции и длительного депонирования винограда invitro, позволяющего за счет увеличения продолжительности беспересадочного хранения, сокращения трудозатрат и исключения дорогостоящих реактивов повысить экономическую эффективность хранения генофонда винограда invitro и обеспечить сохранность генетической стабильности образцов.

Поставленная задача достигается с помощью предложенного способа формирования коллекции и длительного депонирования винограда invitro, включающего введение в культуру апикальных меристем и формирование на их основе коллекции, с предварительным культивированием на твердой питательной среде Мурасиге Скуга, высадку на хранение. При этом, апикальные меристемы размером 0,1÷0,2 мм, выделенные из пробирочных растений, ранее введенных в культуру, выдерживают на питательной среде с добавлением регулятора роста Мелафен при разведении 10^-5÷10^-11, а образовавшиеся побеги выдерживают на питательной среде Мурасиге Скуга, содержащей Цефотаксим в концентрации 50÷450 мг/л и производят высадку на хранение микрочеренков оздоровленных растений, выделенных из верхних частей побегов.

Предложенный способ включает вычленение в асептических условиях меристематических эксплантов размером 0,1÷0,2 мм из пробирочных растений, регенерацию растений на питательной среде Мурасиге Скуга (МС), содержащей Цефотаксим, высадку микрочеренков восстановленных растений, на твердую питательную среду МС без гормонов. При этом микрочеренки выделяют из верхних частей побегов растений.

Новым и существенным в предложенном способе является то, что для формирования коллекции в культуру вводятся меристемы пробирочных растений из лабораторной коллекции, размером 0,1÷0,2 мм в отличие от обычно применяемых глазков побегов виноградных кустов из полевых коллекций. Малый размер экспланта обеспечивает элиминацию вирусов, а использование пробирочных, предварительно оздоровленных растений, способствует оздоровлению растений от вирусной инфекции. Введение в питательную среду регулятора роста Мелафен обеспечивает улучшение регенерации меристем на этапе ввода. Кроме того, для оздоровления от микоплазменной инфекции растения, восстановленные из меристем, черенкуют и высаживают на питательную среду МС, в состав которой вводят антибиотик Цефотаксим.

Технический результат выражается в том, что предложенный способ обеспечивает оздоровление растений винограда от вирусной и фитоплазменной инфекции и беспересадочное хранение микрорастений винограда в стандартных условиях культивирования до 10÷12 месяцев при сохранении генетической стабильности образцов, при этом позволяет снизить трудозатраты и исключить использование дорогостоящих реактивов, что повышает экономическую эффективность хранения генофонда винограда invitro.

Согласно предложенному способу из растений, оздоровленных от вирусной и микоплазменной инфекции, формируют коллекцию. Для хранения используют растения, выросшие на питательной среде с Цефотаксимом, черенкуют их, разделяя на нижнюю, среднюю и верхнюю части. Предварительное оздоровление растений, выбор места расположения микрочеренков (верхняя часть побега) обеспечивают беспересадочное хранение растений в коллекции в течение 10÷12 месяцев. Используемая питательная среда не содержит гормонов, регуляторов роста, антибиотиков, что способствует сохранению генетической стабильности.

Преимущество данного способа заключается в следующем.

Во-первых, производится предварительная подготовка к хранению, состоящая в оздоровлении от вирусной и, особенно, микоплазменной инфекции, которая отсутствует во всех известных нам способах.

Во-вторых, постановка на хранение микрочеренков оздоровленных растений из верхней части побегов обеспечивает замедление ростовых процессов и продолжительное беспересадочное хранение в течение 10÷12 месяцев.

В-третьих, отменяется необходимость модификации питательных сред, применения в их составе большого количества регуляторов роста (кинетин, 6-бензиламинопурин, тидиазурон, зеатин, рибозид, ИМК (индолилмасляная кислота), ИУК (индолилуксусная кислота), ретардантахлорхолинхлорид, активированного угля, аскорбиновой кислоты и др., что способствует сохранению генетической стабильности растений в коллекции.

В-четвертых, упрощаются режимы депонирования, такие как пониженная температура (+4÷7°С), изменение продолжительности фотопериода и интенсивности режима освещения, что усложняет технологию формирования и дальнейшего хранение коллекции. Благодаря снижению трудозатрат и материальных затрат на приобретение дорогостоящих реактивов, повышается экономическая эффективность процесса формирования и депонирования коллекции винограда invitro.

Способ формирования коллекции и длительного депонирования винограда invitro осуществляют следующим образом.

Для ввода в культуру из коллекции лаборатории отбирают пробирки с хорошо развитыми растениями с прямыми стеблями, зелеными листьями без пятен, чистой питательной средой.

Затем приступают к подготовке питательной среды. Все исследования проводили на питательной среде Мурасиге Скуга, модифицированной для каждого этапа культивирования (Голодрига П.Я. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда / П.Я. Голодрига и др.; ВНИИВиПП «Магарач». - Ялта, 1986. - 56 с.).

Состав питательной среды для ввода: макроэлементы: NH₄NO₃ - 1237,5; KNO₃ - 1425; MgSO₄⋅7H₂O - 277,5; KH₂PO₄ - 127,5; CaCl₂⋅6H₂O - 330,0 мг/л; микроэлементы: H₃BO₃ - 6,2; MnSO₄⋅4H₂OMnSO₄⋅5H₂O, MnSO₄ - 22,3; CuSO₄⋅5H₂O - 0,025; CoCl₂⋅6H₂O - 0,025; ZnSO₄⋅7H₂O - 8,6; Na₂MoO₄2H₂O, Na₂MoO₄ - 0,25; KJ - 0,83 мг/л; хелат железа: FeSO₄⋅7H₂O - 27,8; Na₂ ЭДТА⋅2H₂O - 37,3 мг/л; NaH₂PO₄ - 170; NaH₂PO₄⋅2H₂O - 221,0 мг/л; витамины: мезоинозит - 100,0; тиамин HCl - 0,5 мг/л; 6-БАП - 0,5 мг/л; сахароза - 30,0 г/л, агар - 7,5 г/л.

Так как пробирочные растения были оздоровлены ранее, для ввода их в культуру необходима лишь поверхностная стерилизация, в результате технология ввода меристем в культуру упрощается.

Работа по выделению меристем, микрочеренкованию растений проводилась в ламинарном боксе под бинокулярным микроскопом при 25-кратном увеличении. При помощи пинцета и скальпеля из побегов вычленяют апикальные меристемы. Для ввода используют пробирки размером 20×72 мм.

В каждую пробирку высаживают по одной меристеме на автоклавированную и охлажденную твердую питательную среду. Пробирки закрывают фольгой и размещают в культуральной комнате на 2÷3 недели при температуре 23÷28°С. Освещенность в первую неделю 800÷1000 лкс, затем увеличивают до 2÷5 тыс. лкс.

Введение в состав среды регулятора роста Мелафен способствует регенерации меристем, улучшению образования побегов и, как следствие, повышению эффективности клонального размножения.

В Таблице 1 представлены сравнительные характеристики образования побегов при различных концентрациях Мелафена.

По достижению меристемами размеров 3 мм и более их переносят на жидкую питательную среду для прохождения этапа пролиферации в конические колбы Эрленмейера (100 мл) с мостиками из фильтровальной бумаги. Толщина слоя среды в колбе 2 мм (что соответствует объему 10÷12 мл). Учеты и пересадка эксплантов на свежую питательную среду проводится через 14 дней.

Состав жидкой питательной среды для пролиферации пазушных почек и побегов (мг/л) следующий. Макроэлементы NH₄NO₃ - 1650; KNO₃ - 1900; MgSO₄⋅7H₂O - 370; KH₂PO₄ - 170; CaCl₂⋅6H₂O - 440. Микроэлементы: H₃BO₃ - 6.2; MnSO₄⋅4H₂OMnSO₄⋅5H₂O, MnSO₄⋅ - 22.3; CuSO₄⋅5H₂O - 0.025; CoCl₂⋅6H₂O - 0.025; ZnSO₄⋅7H₂O 8.6; Na₂MoO₄2H₂O, Na₂MoO₄ - 0.25; KJ - 0.83; FeSO₄⋅7H₂O - 27.8; Na₂ ЭДТА⋅2H₂O - 37.3; NaH₂PO₄, NaH₂PO₄⋅2H₂O - 170, 221. Витамины: Мезоинозит 50; Тиамин HCl - 0,5; Сахароза - 30 г/л; 6-БАП - 0,5-2,0; РН - 5,1.

Питательная среда для укоренения побегов, полученных в результате пролиферации (мг/л). Макроэлементы: NH₄NO₃ - 212; KNO₃ - 903; MgSO₄⋅7H₂O - 72; KH₂PO₄ - 51; CaCl₂ - 366. Микроэлементы: H₃BO₃ - 1,6; MnSO₄⋅5H₂O - 6,0; CuSO₄⋅5H₂O - 0,006; CoCl₂⋅6H₂O - 0,006; ZnSO₄-7H₂O - 2,2; Na₂MoO₄2H₂O - 0,6; KJ - 0,21; Хелат железа: FeSO₄⋅7H₂O - 7,0; Na₂ ЭДТА⋅2H₂O - 9,3; витамины: Мезоинозит - 50; Никотиновая кислота - 0,2; ИУК - 0,1; Сахароза - 10 г/л; РН - 5,0÷5,2.

После образования побегов высотой 20÷25 мм с 3÷5 листьями, их отделяют от конгломератов и высаживают на укоренение на твердую питательную среду МС с уменьшенным содержанием макроэлементов: сахарозы - 10 г/л и ИУК - 0,1 мг/л. Укоренение побегов проводят при освещенности 3÷5 тыс. люкс на протяжении 14÷16 часов при температуре 20÷25°С в темный и 25÷30°С в световой периоды.

Для оздоровления от микоплазменной инфекции в состав питательной среды вводится антибиотик Цефотаксим, концентрация которого колеблется 50÷450 мг/л в зависимости от степени инфицирования растений. Исследования, проведенные на целом ряде сортов, показали, что при слабом инфицировании применение антибиотика улучшает приживаемость растений на 5,0÷15,0% по сравнению с контролем. В данном случае эффективны низкие концентрации Цефотаксима 50÷250 мг/л. При заражении 15,0÷50,0% растений эффективность применения Цефотаксима возрастает: приживаемость микрочеренков увеличивается по сравнению с контролем на 35,0÷45,0%. При этом эффективны концентрации 250÷450 мг/л. При сильной степени инфицирования (выше 50,0%) наиболее четко проявляется деконтаминация растений при всех концентрациях антибиотика. Лучшие результаты оздоровления получены при концентрациях 350÷450 мг/л.

Для постановки на хранение растения, выросшие на питательной среде с Цефотаксимом, разделяют на верхнюю, среднюю, нижнюю части и черенкуют. Размер микрочеренка 10÷12 мм с глазком. Микрочеренки средней и верхней части побегов высаживают на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга и культивируют в стандартных условиях при температуре 22÷25°С и освещенности 2000 лкс. Питательная среда не содержит гормонов, регуляторов роста, антибиотиков, что способствует сохранению генетической стабильности.

Место расположения микрочеренков оказывает влияние на приживаемость и продолжительность беспересадочного хранения растений, что подтверждается результатами экспериментов на сортах Фиолетовый ранний (Табл. 2), Платовский (Табл. 3), Каберне Совиньон (Табл. 4), в которых представлены сравнительные характеристики роста и развития растений, выделенных из разных частей побегов.

У сорта Фиолетовый ранний растения, полученные из верхней части побегов, при стопроцентной приживаемости, сохранились в течение 341 суток (Табл. 2), в то время как растения из нижней части побегов сохранились лишь 117 суток, а растения из средней части побегов 147 суток. При этом следует отметить умеренное развитие ризогенной зоны, побегов, облиственности и сочетания развития корней и побегов у растений из верхней части побегов.

Подобное положение сложилось у растений сорта Платовский, полученных из микрочеренков разной части побегов (Табл. 3). Несмотря на то, что лучшее развитие отмечено у растений, выделенных из средней и, особенно, нижней части побегов, более продолжительная сохранность выявлена у растений из микрочеренков верхней части - 280 суток. При этом показано умеренное, развитие ризогенной зоны, побегов и скорости роста.

Лучшая приживаемость, образование корней и сохранность растений сорта Каберне Совиньон (Табл. 4) отмечена на протяжении всего периода культивирования у микрочеренков, выделенных из верхней части побегов. Продолжительность их беспересадочного культивирования составила 375 дней. Причем у сохранившихся растений наблюдался достаточно высокий потенциал, который можно использовать при перезакладке коллекции.

Экспериментально доказано, что у растений сортов Каберне Совиньон, Платовский, Фиолетовый ранний продолжительность беспересадочного хранения растений, выделенных из микрочеренков различных частей побегов: нижней, средней и верхней значительно различается (Табл. 5).

Сохранность растений в коллекции и продолжительность беспересадочного хранения, увеличивается до 10,0 и более месяцев у растений, полученных из верхних частей побегов, что в 1,7 раза превышает эти показатели у растений, полученных из микрочеренков средней и нижней части побегов.

Таким образом, предложенный способ формирования коллекции и длительного депонирования винограда invitro обеспечивает беспересадочное хранение микрорастений винограда в стандартных условиях культивирования до 10÷12 месяцев при сохранении генетической стабильности образцов, оздоровление растений винограда от вирусной и фитоплазменной инфекции и при этом повышает экономическую эффективность хранения генофонда винограда invitro за счет снижения трудозатрат и исключения дорогостоящих реактивов.

Способ формирования коллекции винограда in vitro, включающий введение в культуру апикальных меристем и формирование на их основе коллекции, с предварительным культивированием на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга, высадку на хранение, отличающийся тем, что апикальные меристемы размером 0,1÷0,2 мм, выделенные из пробирочных растений, ранее введенных в культуру, выдерживают на питательной среде с добавлением регулятора роста Мелафен при разведении 10^-5÷10^-11, а образовавшиеся побеги выдерживают на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей Цефотаксим в концентрации 50÷450 мг/л, и производят высадку на хранение микрочеренков оздоровленных растений, выделенных из верхних частей побегов.