Питательная среда для размножения in vitro косточковой культуры вц-13 (вишня) на стадии ризогенеза

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагается питательная среда, содержащая (мг/л): неорганические соединения из группы: аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, борная кислота, калий йодистый, а также комплексы марганца (II), цинка(II), молибдена (VI), меди(П), кобальта(П) с оксиэтилидендифосфоновой кислотой (ОЭДФ), комплекс железа (III) с трилоном Б, и органическую составляющую, включающую миоинозит, тиамин гидрохлорид, пиродоксин гидрохлорид, никотинамид, индолилмасляную кислоту, при следующем весовом соотношении компонентов смеси, мг/л: аммоний азотнокислый 825.0, калий азотнокислый 950.0, кальций хлористый 220.0, магний сернокислый 185.0, калий фосфорнокислый 85.0, борную кислоту 6.2, калий йодистый 0.83, комплексы микроэлементов с оксиэтилидендифосфоновой кислотой: железный(III) 24.5- 27.6, марганцевый 26.4-29.3, цинковый 8.2- 9.1, молибденовокислый 0.33-0.37, медный 0.027-0.030, кобальтовый 0.029 -0.032, а также органическую составляющую, включающую миоинозит 0.5, тиамин гидрохлорид 0.5, пиродоксин гидрохлорид 0.5, индолилмасляную кислоту 0.2, сахарозу 15000, агар-агар 6000 и остальное - вода до 1 л. Предлагаемая питательная среда характеризуется высокой эффективностью для размножения вишни ВЦ-13 in vitro на стадии ризогенеза, которая заключается в обеспечении практически количественной степени укоренения растений-регенерантов с образованием коротких прочных корней, которые легко отмываются. 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства и непосредственно касается питательной среды, содержащей наряду с макро- и мезо-элементами, регуляторами роста и другими добавками, комплексы микроэлементов с оксиэтилендифосфоновой кислотой (ОЭДФ), которая может быть использована при размножении in vitro подвоя косточковой культуры ВЦ-13 (вишня).

Питательные среды различного минерального и органического состава, предназначенные для размножения in vitro ягодных культур, были описаны ранее, например, в широко известных протоколах Мурасиге-Скуга, Коврина-Лепуавра и других информационных источниках [Murashige Т., Skoog F. А revised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue culture. Physiol. Plantarum. 1962, V. 15. №3. P. 473-497; М.Г. Упадышев. Питательная среда для размножения ягодных и плодовых культур. Пат. 2063682 RU; Hunkova G, Libiakova G, Fejer J., Vugovic T. // Genetika. 2018. V. 50. №1. P. 351-356].

Микроэлементы наряду с макро- и мезо-элементами являются необходимыми компонентами подобных питательных сред. При этом в качестве микроэлементов используются их минеральные соли. Исключение составляет железо (III), которое вводится в питательные растворы вместе с динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (трилон Б) и позиционируется как комплекс Fe(III) ЭДТА. Существует, однако, высокая вероятность отсутствия комплекса в растворе, поскольку для комплексообразования требуются специальные условия (температура, рН, продолжительность реакции).

При использовании подобных питательных растворов при размножении in vitro косточковых культур (яблони, груши, крыжовник, вишня) на стадии ризогенеза не удается преодолеть трудности по укоренению микрорастений-регенерантов и последующей адаптации к нестерильным условиям, являющиеся основным препятствием размножения растений [Vaez-Livari В., Salehi-Soghadi Z.2006.IV-th IS on Pistachios and Almonds Eds.: A Javanshan et al. // Acta Hort.ln vitro Rooting of Hybrid GF677(Prunus dulcis x Prunus persica),P.726; Tsipouridies C, Thomidis Т., Bladenopoulou S. 2006. // Scientia Horticulturae,V. 108. Rhizogenesis of GF677, Early Crest, May Crest].

Это в полной мере относится и к питательным растворам по протоколу Мурасиге-Скуга (MS) [Physiol. Plantarum. 1962. V. 15. P. 473-497].

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является увеличение степени укоренения и количества качественных корней клонового подвоя косточковой культуры ВЦ-13(вишня) на стадии ризогенеза.

Для выполнения поставленной задачи предлагается питательная среда для размножения ВЦ-13(вишня) in vitro на стадии ризогенеза, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, борную кислоту, калий йодистый, а также комплексы железа (III), марганца (II), цинка(II), молибдена (VI), меди(II) и кобальта(II) с оксиэтилидендифосфоновой кислотой (ОЭДФ) и органическую составляющую, включающую миоинозит, тиамин гидрохлорид, пиродоксин гидрохлорид, никотинамид, индолилмасляную кислоту при следующем весовом соотношении компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый 825.0, калий азотнокислый 950.0, кальций хлористый 220.0, магний сернокислый 185.0, калий фосфорнокислый 85.0, борная кислота 6.2, калий йодистый 0.83, комплексы микроэлементов с ОЭДФ: железный(III) 24.5-27.6, марганцевый 26.4-29.3, цинковый 8.2-9.1, молибденовокислый 0.33-0.37, медный 0.027-0.030, кобальтовый 0.029-0.032, а также органическая составляющая, включающая миоинозит 0.5, тиамин гидрохлорид 0.5, пиродоксин гидрохлорид 0.5, индолилмасляную кислоту 0.2, сахарозу 15000, агар-агар 6000, и воду до 1 л.

Основное отличие предлагаемой среды от известных питательных сред, применяемых для размножения плодовых и ягодных культур, является то, что взамен минеральных солей микроэлементов в состав данной среды в качестве источников микроэлементов вводятся их комплексы с ОЭДФ и при этом редуцируется среда MS допо макроэлементам.

В предлагаемой питательной среде подобраны оптимальные концентрации всех входящих элементов, что позволило при использовании предложенной питательной среды для размножения in vitro косточковой культуры ВЦ-13(вишня) достичь высокой степени укоренения (80-100%) и образования качественных корней на стадии ризогенеза. Полученные результаты в сопоставлении с результатами, получаемыми на питательной среде MS, представлены в табл. 1.

Результаты использования предложенной питательной среды для микроразмножения клонового подвоя косточковой культуры ВЦ-13(вишня) на стадии ризогенеза подтверждают высокую эффективность новой питательной среды для данной культуры, а именно достижение высокой (80-100%) степени укоренения и числа (5-6 ш.) качественных корней. Для сравнения эффективности комплексов микроэлементов с ОЭДФ в составе питательного раствора с аналогичными ранее известными комплексами этих элементов с трилоном Б были проведены дополнительные исследования, которые показали полное отсутствие эффекта в случае трилонатных комплексов в интервале исследованных концентраций.

Ниже приводятся примеры составов предлагаемой питательной среды (Питательная среда I и Питательная среда II) и способы их использования.

Пример 1.

Питательная среда I содержит (мг/л): аммоний азотнокислый 825.0, калий азотнокислый 950.0, кальций хлористый 220.0, магний сернокислый 185.0, калий фосфорнокислый 85.0, борная кислота 6.2, калий йодистый 0.83, комплексы микроэлементов с ОЭДФ: железный(III) 27.6, марганцевый 29.3, цинковый 9.1, молибденовокислый 0.37, медный 0.030, кобальтовый 0.032, миоинозит 0.5, тиамин гидрохлорид 0.5, пиродоксин гидрохлорид 0.5, индолилмасляная кислота 0.2, сахароза 15000, агар-агар 6000, остальное вода до 1 л.

Питательную среду I получают внесением компонентов в указанных выше концентрациях, объем раствора доводят до 1 л и при нагревании растворяют агар-агар. Питательную среду разливают в культуральные сосуды (стеклянные банки объемом 100 мл с покрытием из пленки) по 30 мл в каждый и подвергают стерилизации в автоклаве в течение 20 мин и давлении 0.2 МПа. В ламинарном боксе в каждый сосуд помещают по 5 микрочеренков длиной 2-3 узла. Субкультивирование опытных микрорастений проводят в культуральной комнате при интенсивном облучении 2500 люкс, 16-часовом фотопериоде, температуре 20-22°С. На 30 день субкультивирования проводят учет укореняемости и развития растений-регенерантов. Повторность опытов трехкратная по 12 эксплантов в одной повторности.

Использование разработанной питательной среды обеспечивает 100%-ную степень укоренения растений-регенерантов, при этом образуется 5-6 коротких прочных корней, которые легко отмываются с последующей высадкой на этап адаптации к нестерильным условиям (табл. 1) полученные результаты успешно проверены в большем объеме.

Пример 2.

Питательная среда II, содержащая (мг/л): аммоний азотнокислый 825.0, калий азотнокислый 950.0, кальций хлористый 220.0, магний сернокислый 185.0, калий фосфорнокислый 85.0, борная кислота 6.2, калий йодистый 0.83, комплексы микроэлементов с ОЭДФ: железный(III) 24.5, марганцевый 26.4-, цинковый 8.2, молибденовокислый 0.33, медный 0,0270, кобальтовый 0.029, миоинозит 0.5, тиамин гидрохлорид 0.5, пиродоксин гидрохлорид 0.5, индолилмасляная кислота 0.2, сахароза 15000, агар-агар 6000, остальное вода до 1 л.

Питательную среду II получают аналогично примеру 1 внесением компонентов состава в указанных выше концентрациях, объем раствора доводят до 1 л и при нагревании растворяют агар-агар и далее аналогично примеру 1.

Результаты размножения на предлагаемой среде представлены в табл. 1. Предложенная среда обеспечивает 80%-ную степень укоренения растений-регенерантов также с образование коротких прочных корней (4-5 шт.) (табл. 1)

При более низких концентрациях комплексов микроэлементов по сравнению с предложенным диапазоном концентраций значительно снижается степень укоренения растений-регенерантов.

Полученные результаты свидетельствуют о достижении высокой эффективности предлагаемой питательной среды для размножения in vitro косточковой культуры ВЦ-13 (вишня) на стадии ризогенеза, заключающуюся в обеспечении практически количественной степени укоренения растений-регенерантов с образованием коротких прочных корней, которые легко отмываются. На стадии ризогенеза это является основными показателями эффективности действия предлагаемой питательной среды.

Питательная среда для размножения in vitro косточковой культуры ВЦ-13 (вишня) на стадии ризогенеза, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, борную кислоту, калий йодистый, а также комплексы железа (III), марганца (II), цинка(II), молибдена (VI), меди(II) и кобальта(II) с оксиэтилидендифосфоновой кислотой и органическую составляющую, включающую миоинозит, тиамин гидрохлорид, пиродоксин гидрохлорид, никотинамид, индолилмасляную кислоту, при следующем весовом соотношении компонентов, мг/л:

• Аммоний азотнокислый	825.0
• Калий азотнокислый	950.0
• Кальций хлористый	220.0
• Магний сернокислый	185.0
• Калий фосфорнокислый	85.0
• Борная кислота	6.2
• Калий йодистый	0.83
• Комплексы микроэлементов с оксиэтилидендифосфоновой кислотой:
• железный(III)	24.5-27.6
• марганцевый	26.4-29.3
• цинковый	8.2-9.1
• молибденовокислый	0.33-0.37
• медный	0.027-0.030
• кобальтовый	0.029-0.032
• Миоинозит,	100.0
• Никотинамид,	0.5
• Тиамин гидрохдорид,	0.5
• Пиродоксин гидрохлорид	0.5
• Индолилмасляная кислота	0.2
• Сахароза	30000
• Агар-агар	6000
• Вода	до 1 л