Способ получения антител против амн и их применение

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения антител против AMH млекопитающих. Указанный способ предусматривает иммунизацию животного полипептидом AMH или полинуклеотидом, кодирующим указанный полипептид AMH, получение гибридом из клеток лимфоидного органа животного, получившего иммуноген, отбор гибридом, секретирующих антитела, распознающие полипептид AMH, и получение антитела. Изобретение эффективно для получения антител, которые распознают только нелинейные эпитопы в конкретной зоне AMH, причем эти антитела позволяют проводить стабильный и надежный анализ AMH, который можно использовать в обычной медицинской практике и который является надежным, точным и воспроизводимым независимо от преаналитических условий или условия хранения образца. 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл., 9 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области детектирования in vitro антимюллерова гормона, также известного как AMH. В частности, настоящее изобретение относится к получению антител против AMH, к антителам против AMH и к их применению для определения концентрации AMH, в частности в контексте исследований, связанных с фертильностью у женщин или самок животных детородного возраста.

Антимюллеров гормон (также известный как AMH) является димерным гликопротеином размером 144 кДа семейства трансформирующих факторов роста (TGF-β), причем это семейство содержит множество факторов, которые влияют на рост и дифференцировку. AMH является димерным прогормоном: он состоит из двух идентичных субъединиц, которые связаны дисульфидными мостиками. Для приобретения биологической активности и превращения в зрелый гормон этот прогормон подвергается протеолитическому расщеплению вблизи C-концевой области. После расщепления молекулярный комплекс остается связанным и может быть проанализирован в крови с помощью иммуноанализа, обеспечивающего уровни чувствительности, подходящие для мониторинга изменения овариального резерва от рождения до менопаузы (Kelsey TW, et al., 2011). Этот белок также известен как MIF (мюллеров ингибирующий фактор), MIH (мюллеров ингибирующий гормон) и MIS (мюллерово ингибирующее вещество).

AMH присутствует у всех млекопитающих. Его длина и последовательность аминокислот зависят от вида. Так, у человеческого AMH 560 аминокислот и следующий состав: короткий сигнальный пептид (аминокислоты 1-18), часть-предшественник (аминокислоты 19-25), N-концевая часть (аминокислоты 26-451) и C-концевая часть (аминокислоты 452-560). У AMH лошадей 573 аминокислоты и следующий состав: короткий сигнальный пептид (аминокислоты 1-22), нет части-предшественника, N-концевая часть (аминокислоты 23-464) и C-концевая часть (аминокислоты 465-573). У AMH собак 572 аминокислоты и следующий состав: короткий сигнальный пептид (аминокислоты 1-21), нет части-предшественника, N-концевая часть (аминокислоты 22-463) и C-концевая часть (аминокислоты 464-572). У бычьего AMH, со своей стороны, 575 аминокислот и следующий состав: короткий сигнальный пептид (аминокислоты 1-17), часть-предшественник (аминокислоты 18-24), N-концевая часть (аминокислоты 25-466) и C-концевая часть (аминокислоты 467-575). Независимо от вида, N-концевая часть AMH называется "про-областью", а C-концевая часть называется "зрелой областью".

AMH синтезируется в форме полипептидного предшественника, содержащего сигнальный пептид, за которым следует препрогормон (у людей и крупного рогатого скота) или прогормон (у лошадей или собак). Сигнальный пептид, который делает возможным миграцию в эндоплазматический ретикулум, отщепляется после транслокации. В эндоплазматическом ретикулуме полипептидный предшественник подвергается посттрансляционным модификациям, а именно (i) гомодимеризации и (ii) гликозилированию, для достижения своей нативной конформации. У людей это димерный гликопротеин размером 144 кДа, соответствующий аминокислотам 26-560. Каждый мономер, размером 72 кДа у людей, содержит про-область (58 кДа у людей), за которой следует зрелая область (12 кДа у людей). Перед секрецией во внеклеточную среду и в кровоток гликопротеин AMH претерпевает окончательное посттрансляционное созревание путем расщепления. Таким образом, у людей и крупного рогатого скота препрогормон превращается в прогормон путем расщепления части-предшественника. Прогормон также расщепляется между N-концевой частью и C-концевой частью для получения зрелого гормона (имеющего биологическую активность). Однако эти две части остаются нековалентно связаны (Zec I., et al., 2011). Сообщалось о различной степени расщепления У людей в зависимости от исследования: между 5% и 20% у Zec et al. и 67% у мальчиков или, альтернативно, 81% у женщин у Pankhurst et al. (2016). Таким образом, в кровотоке обнаруживаются расщепленный AMH и нерасщепленный AMH.

AMH продуцируется у мужчин клетками Сертоли и участвует в начале их жизни в дифференцировке мужского тракта. У женщин AMH продуцируется гранулезными клетками растущих мелких фолликулов и поэтому, напротив, включается начиная с периода полового созревания. Таким образом, у женщин AMH показал себя полезным в различных областях, в частности связанных с фертильностью (Dewailly D, et al. 2014). Например, анализ AMH в циркуляции позволяет оценить количество антральных и преантральных фолликулов, присутствующих в яичниках, независимо от циклов (Dewailly D, et al., 2014). Кроме того, анализ AMH показан для помощи женщинам в управлении планированием беременности в качестве показателя естественного снижения овариального резерва и, следовательно, возникающего риска гипофертильности. В контексте вспомогательных репродуктивных технологий анализ AMH способствует выбору наилучшей стратегии для пациента благодаря оптимизации, в частности, этапа контролируемой стимуляции яичников при одновременном предотвращении риска гиперстимуляции (Arce JC, et al., 2014). Анализ AMH также позволяет отслеживать изменения овариального резерва у молодых девушек или женщин, получивших лечение гонадотропными гормонами в случае, например, рака (Chai J and Howie AF., 2014). Для женщин, которые имеют расстройства овуляции, определение уровней AMH в сыворотке позволяет лучше охарактеризовать тип дисфункции яичников, в частности гипергонадотропной ановуляции, связанной с недостаточностью яичников, такой как синдром поликистозных яичников (Fong SL, et al., 2015). У молодых мальчиков AMH продуцируется в очень значительном количестве тестикулами плода новорожденного и поэтому участвует в дифференцировке мужского тракта на ранних стадиях. Таким образом, было обнаружено, что анализ AMH полезен для мальчиков до наступления половой зрелости в контексте нарушений, связанных с половой дифференциацией.

Анализ AMH проводится с помощью сэндвич-иммуноанализа и требует применения теста, который является одновременно чувствительным, специфичным и воспроизводимым. Однако, несмотря на предложение в литературе различных способов (Hudson, 1990; Long, 2000) или, альтернативно, доступность на рынке различных наборов, анализ, который объединяет все эти характеристики, все еще недоступен. Одна из основных трудностей, которые предстоит разрешить, была выявлена еще в 1996 году: отсутствие наблюдаемой стабильности AMH в биологическом образце. Поэтому условия хранения (время, продолжительность, циклы замораживания и т.д.) могут вызывать изменения в измеренных концентрациях (Lee, 1996). Эти изменения, конечно, являются артефактом и могут приводить к неправильной интерпретации биологических результатов.

На рынке представлены различные наборы. Антитела, используемые в этих наборах распознают различные области AMH. Первое поколение анализов AMH соответствует наборам EIA/MIS/AMH (Immunotech) и набору Active MIS/AMH ELISA (DSL). Антитела, используемые в этих наборах, не идентичны, но в каждом используется первое антитело, которое распознает про-область AMH, и другое антитело, распознающее зрелую область. В 2010 году компания Beckman Coulter, которая их продавала, заменила их на набор второго поколения (AMH Gen II Assay), который, по их мнению, повысил уровень производительности. Действительно, по мнению авторов этот набор является высокоспецифичным, и на измерение AMH, как полагают, не влияет протеолиз, поскольку каждое из двух используемых моноклональных антител распознает зрелую область (Kumar, 2015; US 7 897 350). Авторы считают, что зрелая область, которая содержит несколько остатков цистеина, предположительно, более стабильна в случае протеолиза, чем про-область. При применении на практике при обычном клиническом использовании быстро оказалось, что набор AMH Gen II не оправдал надежд. Широкое ретроспективное исследование подтвердило отсутствие стабильности анализа AMH с точки зрения условий хранения пробирок для образцов (Rustamov O, 2012) и показало, что набор AMH Gen II оказался чрезвычайно чувствителен к этим изменениям. Для объяснения наблюдаемых флуктуаций было выдвинуто несколько гипотез. Одна из возможных интерпретаций может быть связана с тем фактом, что молекула AMH претерпевает конформационные изменения после взятия образца крови, которые варьируются от одного индивидуума к другому.

Эти результаты быстро были повторены и подтверждены независимой группой (Xan et al., 2014). Кроме того, эта группа описала решение для обеспечения стабильности AMH во время хранения образца: перед анализом они провели предварительное разведение, что позволило улучшить общую воспроизводимость анализа AMH с помощью Gen II. Однако это решение, которое, действительно, легко реализовать, имеет некоторые недостатки:

(i) Концентрации AMH, измеренные после предварительного разведения, увеличиваются. Это увеличение варьируется от одного индивидуума к другому (от 1,35 раза до 3,06 раза для доступных данных). Поэтому необходимо экспериментально переопределить эталонные значения по широкой когорте, а также правила клинической интерпретации.

(ii) Осуществляемое разведение не является незначительным (1/5, т.е. 60 мкл образца в 300 мкл буфера). Это, действительно, позволяет освободиться от наблюдаемых помех, но в результате приводит к снижению чувствительности анализа, что значимо для многих клинических применений.

(iii) Причина нестабильности AMH до сих пор не установлена. Следовательно, невозможно подтвердить, что разведение сможет решить проблему отсутствия стабильности для всех образцов.

Кроме того, Lukaszuk et al. (2014) описали снижение средней концентрации AMH, измеренной с помощью набора AMH Gen II Assay, и снижение чувствительности. Их вывод заключается в том, что "очень опасно внедрять протокол стимуляции на основе результатов набора Gen II".

Поэтому важно обеспечить надежный набор, для которого измеренная концентрация AMH является точной и воспроизводимой независимо от времени между взятием образца и выполнением анализа и независимо от условий хранения (доза, не зависящая от преаналитических условий).

Патентная заявка WO 2014/074835 предлагает различные способы анализа различных изоформ AMH (только димерный AMH, нерасщепленный AMH, AMH, расщепленный, а затем повторно ассоциированный, и т.д.), для того чтобы определить, может ли конкретная изоформа или переход от одной изоформы к другой иметь клинический смысл. Таким образом, заявка описывает многочисленные антитела, направленные против большого количества линейных эпитопов, расположенных или в про-области, или в зрелой области AMH. Авторы утверждают, что раскрытые композиции и способы соответствуют требованию точного, воспроизводимого и стандартизированного анализа. Эта заявка раскрывает 18 эпитопов, т.е. всего 324 (18×18) способа конструирования сэндвич-иммуноанализов путем комбинирования антител, которые распознают эти эпитопы. Учитывая многочисленные преаналитические проблемы, с которыми сталкиваются различные анализы AMH, трудно поверить без экспериментальной демонстрации, что каждая из этих комбинаций эпитопов, а следовательно, комбинаций антител, позволяет получить надежный тест. Кроме того, никакие данные в этой патентной заявке не демонстрируют, что применение описанных антител обеспечивает анализ, который можно будет использовать в обычной медицинской практике, который будет надежным, точным, воспроизводимым и стандартизированным, и, в частности, результат которого не будет зависеть от преаналитических условий. Единственные данные, представленные в заявке, относятся к данным стабильности, основанным на анализах типа "одноэпитопный сэндвич или SES", а именно анализах с использованием одного и того же моноклонального антитела для захвата и детектирования. Кроме того, эти тесты детектируют исключительно димерную форму AMH, клинический интерес которой на данный момент неизвестен (поскольку измеренные концентрации сильно отличаются от концентраций, полученных с помощью анализов общего AMH, которые используются в обычной медицинской практике).

Заявитель неожиданно обнаружил, что можно преодолеть недостатки предшествующего уровня техники путем получения новых антител, которые распознают только нелинейные эпитопы в конкретной зоне AMH, расположенной в средней части про-области AMH (между аминокислотами 157 и 255 у людей), причем эти антитела позволяют проводить стабильный и надежный анализ AMH, который можно использовать в обычной медицинской практике, и который является надежным, точным и воспроизводимым независимо от преаналитических условий или условия хранения образца. При выборе этой конкретной зоны AMH, которая, как описано, имеет зону расщепления (WO 2014/074835), анализ AMH с помощью этих антител, которые распознают нелинейный эпитоп из определенной зоны, детектирует, неожиданно и вопреки всем ожиданиям, все AMH, представляющие биологический интерес, присутствующие в биологическом образце.

Таким образом, первый предмет настоящего изобретения относится к способу получения антител против AMH (антимюллерова гормона) млекопитающих, отличающийся тем, что он содержит стадии:

(i) иммунизации животного полипептидом AMH или полинуклеотидом, кодирующим этот полипептид AMH, причем указанный полипептид AMH содержит по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1, и не более 560 аминокислот последовательности SEQ ID NO:2 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:2,

(ii) получения гибридом из клеток лимфоидного органа животного, получившего иммуноген,

(iii) отбора гибридом, секретирующих антитела, распознающие полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1, и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:8, но не распознающие ни (a) полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 131 аминокислоту последовательности SEQ ID NO:13 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:13, и не более 156 аминокислот последовательности SEQ ID NO:11 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1, ни (b) любой линейный эпитоп, расположенный в последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1, и

(iv) получения антител.

Второй предмет настоящего изобретения относится к моноклональным антителам или моноклональным фрагментам антител против AMH млекопитающих, распознающим полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1, и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:8, но не распознающим ни (a) полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 131 аминокислоту последовательности SEQ ID NO:13 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:13, и не более 156 аминокислот последовательности SEQ ID NO:11 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:11, ни любой линейный эпитоп, расположенный в последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1.

Третий предмет настоящего изобретения относится к конъюгатам, содержащим (i) моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела против AMH, определенные выше или полученные в соответствии со способом, определенным выше, и (ii) метку, способную генерировать испускание детектируемого сигнала для визуализации иммунологической реакции между этим конъюгатом и AMH биологического образца.

Четвертый предмет настоящего изобретения относится к способу количественного определения AMH млекопитающих с помощью сэндвич-иммуноанализа в биологическом образце, который может содержать AMH, который содержит следующие стадии:

- приведение упомянутого биологического образца в контакт с двумя связывающими AMH партнерами, причем по меньшей мере один из упомянутых партнеров которого представляет собой антитело или фрагмент антитела, определенные выше или полученные в соответствии со способом, определенным выше, или же конъюгат, определенный выше,

- детектирование сигнала, испускаемого при связывании между упомянутыми связывающими партнерами и AMH, если он присутствует, с использованием метки, способной к испусканию детектируемого сигнала, и

- преобразование детектируемого сигнала в концентрацию AMH.

Пятый предмет настоящего изобретения относится к применению способа количественного определения AMH, определенного выше, в качестве вспомогательного средства для диагностики нарушений, связанных с дисфункцией яичников у женщин детородного возраста, или в качестве вспомогательного средства для оценки овариального фолликулярного резерва у молодых девушек старше 12 лет и женщин или же в качестве вспомогательного средства для оценки нарушений, связанных с половой дифференциацией у мальчиков до наступления половой зрелости.

Наконец, последний предмет настоящего изобретения относится к набору, содержащему антитело или фрагмент антитела, определенные выше или полученные в соответствии со способом, определенным выше, или же конъюгат, определенный выше.

Заявитель неожиданно обнаружил, что использование средней части про-области AMH для отбора моноклональных антител против AMH в процессе их получения при одновременном отказе от антител, которые распознают на этой части линейные эпитопы, позволяет, когда эти таким образом выбранные антитела используют для анализа AMH, получить надежный и воспроизводимый анализ.

Эпитоп, также известный как антигенная детерминанта, является наименьшей частью антигена, которая может быть распознана паратопом, который является вариабельной частью антитела. Структура эпитопа комплементарна паратопу антитела. Участвующая структура может быть первичной структурой в случае линейного эпитопа, также известного как последовательный эпитоп или непрерывный эпитоп, поскольку он содержит последовательные аминокислоты, или третичной структурой в случае прерывистого эпитопа, также известного как нелинейный эпитоп. Когда антиген имеет белковую природу, как в настоящем случае, линейные эпитопы соответствуют пептидной последовательности переменной длины.

Последовательность линейного эпитопа может содержать "консервативные" модификации, которые значительно не изменяют связывание между эпитопом и антителом с точки зрения специфичности.

Следовательно, антитела, полученные в соответствии со способом настоящего изобретения, не распознают линейные эпитопы на средней части про-области AMH, но распознают эту среднюю часть.

Предполагается, что выражение "моноклональные антитела, распознающие среднюю часть про-области AMH" означает, что антитела способны к связыванию с AMH, например с цельным AMH, если эта часть присутствует, но не способны к связыванию с полипептидом AMH, когда эта часть отсутствует.

Без ограничения какой-либо теорией, одна из гипотез aposteriori может состоять в том, что средняя часть про-области AMH, на которую направлены антитела, может соответствовать зоне, в которой AMH может подвергаться протеолизу в биологическом образце, в котором его анализируют, например в плазме, так что эта зона может оставаться четко представлена в своей оригинальной конформации, или же что на ее конформацию не влияют модификации, которые могут влиять на окружающие зоны молекулы.

Млекопитающими, для которых желательно продуцировать антитела, направленные на среднюю часть про-области их AMH, являются все млекопитающие, для которых анализ AMH является вспомогательным средством. В качестве примера можно упомянуть людей (женщин и мужчин, включая мальчиков), лошадей (в частности, кобыл), собак (в частности, сук), крупный рогатый скот, представителей пород мелкого рогатого скота и семейство кошачьих.

AMH, секретируемые млекопитающими, не идентичны, но близки. Идентичность последовательности по меньшей мере на 75% наблюдается между человеческим AMH и AMH других млекопитающих, для которых анализ AMH является вспомогательным средством. В настоящем изобретении роль эталонного AMH будет играть человеческий AMH.

Термины "идентичность" или "процентная идентичность" в контексте двух или более полипептидных последовательностей означают, что две сравниваемые последовательности имеют определенный процент аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми на протяжении максимальной длины, которая может быть выровнена, когда их выравнивают с максимальным соответствием. Такое выравнивание и расчеты процентной идентичности могут быть выполнены с использованием алгоритмов и/или программного обеспечения сравнения последовательностей (Emboss Needle, LAlign, Blast, Clustal и т.д.) или, в простых случаях, путем визуального рассмотрения.

Как указано выше, AMH состоит из про-области и зрелой области. У людей про-область заканчивается в положении 451, а зрелая область начинается в положении 452. Средняя часть про-области AMH, распознаваемая антителами, полученными в соответствии с настоящим изобретением, начинается у людей в положении 157 и заканчивается в положении 255. Она состоит из 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1. У лошадей средняя часть про-области AMH, распознаваемая антителами, полученными в соответствии с настоящим изобретением, начинается в положении 167, заканчивается в положении 265 и соответствует 99 аминокислотам последовательности SEQ ID NO:14. Средняя часть про-области AMH собак, распознаваемая антителами, полученными в соответствии с настоящим изобретением, начинается, в свою очередь, в положении 166, заканчивается в положении 264 и соответствует 99 аминокислотам последовательности SEQ ID NO:23. Что касается крупного рогатого скота, средняя часть про-области AMH, распознаваемая антителами, полученными в соответствии с настоящим изобретением, начинается в положении 171, заканчивается в положении 270 и соответствует 100 аминокислотам последовательности SEQ ID NO:32.

Для получения этих особенных и полезных антител против AMH способ настоящего изобретения содержит в качестве первого этапа иммунизацию животного иммуногеном. Этот иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, который должен содержать по меньшей мере зону, которую антитела должны распознавать, а именно по меньшей мере среднюю часть про-области AMH. Таким образом, используемый иммуноген содержит по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1.

Иммуноген также содержит, самое большее, цельный AMH рассматриваемого вида или полинуклеотид, кодирующий цельный AMH рассматриваемого вида, а именно, в случае человеческого AMH, 560 аминокислот последовательности SEQ ID NO:2 (номер доступа Uniprot KB F2YMM5), тогда как другие AMH имеют идентичность по меньшей мере 75% с последовательностью SEQ ID NO:2. Например, весь полипептид AMH лошадей содержит 573 аминокислоты последовательности SEQ ID NO:15 (номер доступа Uniprot KB F2YMM5), весь полипептид AMH собак содержит 572 аминокислоты последовательности SEQ ID NO:24 (номер доступа Uniprot KB A0A0E3N0I3), а весь полипептид бычьего AMH (номер доступа Uniprot KB P03972) содержит 575 аминокислот последовательности SEQ ID NO:33.

В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления используемый иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, лишенный, по сравнению с полной последовательностью AMH, всех аминокислот, расположенных после средней части про-области AMH, а именно полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 230 аминокислот последовательности SEQ ID NO:10 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:10, и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:8, предпочтительно выбранный из полипептидов AMH последовательностей SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10 или последовательностей, имеющих идентичность по меньшей мере 75% с этими последовательностями. Последовательность SEQ ID NO:8 соответствует аминокислотам 1-255 человеческого AMH (называемого AMH-2), последовательность SEQ ID NO:9 соответствует аминокислотам 19-255 человеческого AMH, а именно последовательности SEQ ID NO:8 без сигнального пептида (называемой AMH-2 без сигнального пептида), и последовательность SEQ ID NO:10 соответствует аминокислотам 26-255 человеческого AMH, а именно последовательности SEQ ID NO:8 без сигнального пептида или части-предшественника (называемой AMH-2 без сигнального пептида или части-предшественника).

В соответствии с другим вариантом осуществления используемый иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, который соответствует всему AMH со всем сигнальным пептидом или его частью и, необязательно, со всей частью-предшественником или ее частью. Таким образом, полипептид AMH содержит по меньшей мере 535 аминокислот последовательности SEQ ID NO:4 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:4, предпочтительно выбранной из полипептидов AMH последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 или последовательностей, имеющих идентичность по меньшей мере 75% с этими последовательностями. Последовательность SEQ ID NO:2 соответствует аминокислотам 1-560 человеческого AMH, последовательность SEQ ID NO:3 соответствует аминокислотам 19-560 человеческого AMH, а именно последовательности SEQ ID NO:2 без сигнального пептида, и последовательность SEQ ID NO:3 соответствует аминокислотам 26-560 человеческого AMH, а именно последовательности SEQ ID NO:2 без сигнального пептида или части-предшественника.

В соответствии с другим вариантом осуществления используемый иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, который соответствует всему AMH со всем сигнальным пептидом или его частью и, необязательно, со всей частью-предшественником или ее частью, но без зрелой области. Таким образом, полипептид AMH содержит по меньшей мере 426 аминокислот последовательности SEQ ID NO:7 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:7, и не более 451 аминокислоты последовательности SEQ ID NO:5 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:5, предпочтительно выбранной из полипептидов AMH последовательностей SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7 или последовательностей, имеющих идентичность по меньшей мере 75% с этими последовательностями. Последовательность SEQ ID NO:5 соответствует аминокислотам 1-451 человеческого AMH (называемого AMH-3), последовательность SEQ ID NO:6 соответствует аминокислотам 19-451 человеческого AMH, а именно последовательности SEQ ID NO:5 без сигнального пептида (называемой AMH-3 без сигнального пептида), а последовательность SEQ ID NO:7 соответствует аминокислотам 26-451 человеческого AMH, а именно последовательности SEQ ID NO:5 без сигнального пептида или части-предшественника (называемой AMH-3 без сигнального пептида или части-предшественника).

Таблица ниже (таблица 1) представляет различные полипептиды AMH, которые используют в контексте настоящего изобретения, в частности некоторые в качестве иммуногена, с указанием положения аминокислот и соответствующих SEQ ID (в скобках) в соответствии с видом млекопитающего.

Таблица 1

	Человеческие	Лошадиные	Собачьи	Бычьи
Средняя часть про-области AMH	157-255 (SEQ ID NO:1)	167-265 (SEQ ID NO:14)	166-264 (SEQ ID NO:23)	171-270 (SEQ ID NO:32)
Весь AMH	1-560 (SEQ ID NO:2)	1-573 (SEQ ID NO:15)	1-572 (SEQ ID NO:24)	1-575 (SEQ ID NO:33)
Весь AMH без сигнального пептида	19-560 (SEQ ID NO:3)	23-573 (SEQ ID NO:16)	22-572 (SEQ ID NO:25)	18-575 (SEQ ID NO:34)
Весь AMH без сигнального пептида или части-предшественника	26-560 (SEQ ID NO:4)	н.п.	н.п.	25-575 (SEQ ID NO:35)
Весь AMH-3	1-451 (SEQ ID NO:5)	1-464 (SEQ ID NO:17)	1-463 (SEQ ID NO:26)	1-466 (SEQ ID NO:36)
Весь AMH-3 без сигнального пептида	19-451 (SEQ ID NO:6)	23-464 (SEQ ID NO:18)	22-463 (SEQ ID NO:27)	18-466 (SEQ ID NO:37)
Весь AMH-3 без сигнального пептида или части-предшественника	26-451 (SEQ ID NO:7)	н.п.	н.п.	25-466 (SEQ ID NO:38)
Весь AMH-2	1-255 (SEQ ID NO:8)	1-265 (SEQ ID NO:19)	1-264 (SEQ ID NO:28)	1-270 (SEQ ID NO:39)
Весь AMH-2 без сигнального пептида	19-255 (SEQ ID NO:9)	23-265 (SEQ ID NO:20	22-264 (SEQ ID NO:29)	18-270 (SEQ ID NO:40)
Весь AMH-2 без сигнального пептида или части-предшественника	26-255 (SEQ ID NO:10)	н.п.	н.п.	25-270 (SEQ ID NO:41)

н.п.=неприменимо, поскольку у рассматриваемого AMH нет части-предшественника

Конечно, помимо аминокислот, описанных в этих последовательностях, иммуноген, когда он находится в полипептидной форме, может также содержать другие аминокислоты, используемые для получения полипептида и его очистки, например полигистидиновый хвост.

Способы получения полипептидов хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, полипептиды AMH могут быть получены с помощью генной инженерии с использованием этапов, хорошо известных специалистам в данной области техники, включая:

- наличие доступной ДНК, кодирующей полипептиды AMH, причем упомянутая ДНК получена в соответствии с обычными способы,

- введение этой ДНК путем клонирования в вектор экспрессии, такой как плазмида, космида, фаг λ или вирусный вектор (бакуловирус (вирус ядерного полиэдроза совки калифорнийской люцерновой), вирус осповакцины, вирус леса Семлики, аденовирусный вирус, лентивирусный вирус и т.д.), причем этот вектор также содержит точку начала репликации (для плазмид или космид) или систему репликации, обеспечивающие его амплификацию в клетке-хозяине, и один или несколько промоторов, обеспечивающих транскрипцию информационных РНК, которые будут транслироваться в белки,

- введение вектора с представляющим интерес геном для экспрессии в клетку-хозяина, такую как прокариотическая клетка (например, бактерия, например Escherichia coli, Bacillus subtilis), путем трансформации или инфицирования, или эукариотическая клетка (например, дрожжи (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris), клетки насекомых (клетки Sf9, Sf21, High5), клетки млекопитающих (CHO, 293, Per.C6, BHK-21, Vero и т.д.) путем временной или постоянной трансфекции или же вирусного инфицирования,

- культивирование и, необязательно, размножение клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, с необязательной амплификацией вектора в клетке-хозяине,

- при необходимости, индукцию транскрипции и синтеза белка для получения рекомбинантных полипептидов AMH и

- очистку для экстрагирования упомянутых полипептидов, например с помощью полигистидинового хвоста. При этом полипептиды называются рекомбинантными.

Когда иммуноген является полинуклеотидом, можно, например, использовать ту же ДНК, которая была бы использована для получения полипептида AMH с помощью генной инженерии.

Животное, используемое для иммунизации, представляет собой любое животное, обычно используемое для получения моноклональных антител, такое как, например, мышь, крыса, кролик, коза или овца.

Условия и параметры иммунизации, такие как концентрация иммуногена, режим иммунизации и т.д., хорошо известны специалистам в данной области техники, которые могут обратиться к методикам, описанным Köhler и Milstein еще в 1975 году, и в частности в руководстве "Current protocols in Cell Biology" (Yokoyama WM, 2001).

Второй этап способа настоящего изобретения представляет собой обычный этап и заключается в получении гибридом из клеток лимфоидного органа животного, получившего иммуноген, такого как например, селезенка, лимфатические узлы и миндалины. Такой этап описан в любом руководстве по получению моноклональных антител. Однако необходимо использовать партнера по слиянию, подходящего для каждого вида. Таким образом, например, для мышей можно использовать линию cGPS CHO-Sa, для кроликов можно использовать линию 240E-W (US 7 429 487), а для овец можно использовать SFP1 (WO 92/15699).

Третий этап способа состоит из конкретного отбора полученных гибридом. Для этого гибридомы вначале культивируют в подходящей среде, хорошо известной специалистам в данной области техники, содержащей, в частности, питательные вещества для их размножения и стимуляторы роста. Затем клоны, секретирующие представляющие интерес антитела, отбирают с использованием распознаваемого антителами антигена в соответствии с методами, известными специалистам в данной области техники, такими как непосредственное детектирование без метки (спонтанное осаждение после реакции антиген-антитело), косвенное детектирование (например, ELISA или иммуноанализ другого типа), поверхностный плазмонный резонанс (BIAcore^®) и интерферометрия (Octet). Новизна этого этапа заключается в особом отборе гибридом, который может быть проведен за 2 последовательных скрининга в любом порядке с определенными полипептидами и пептидами.

Первый скрининг, называемый скрининг 1, заключается в сохранении только тех гибридом, которые производят антитела, распознающие среднюю часть про-области, как описано ранее, причем известно, что упомянутая зона при этом содержит участок расщепления, который должен быть исключен. Для этого можно использовать два способа:

Способ 1:

Вначале отбирают гибридомы, секретирующие антитела, распознающие AMH-2, а именно, для человеческого AMH-2, аминокислоты 1-255 (SEQ ID NO:8), где это уместно, без всего сигнального пептида или его части и всей части-предшественника или ее части, или любую последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере 75% с этой последовательностью. В соответствии с одним вариантом осуществления распознаваемый антителами полипептид AMH-2 представляет собой полипептид последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, и последовательностей, имеющих идентичность по меньшей мере 75% с этими последовательностями.

Затем исключают гибридомы, которые продуцируют антитела, распознающие часть AMH, расположенную до средней части про-области AMH, а именно, для человеческого AMH, аминокислоты 1-156 (SEQ ID NO:11), где это уместно, без всего сигнального пептида или его части и всей части-предшественника или ее части, и любую последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере 75% с этой последовательностью. Этот полипептид AMH называется полипептидом AMH (a), не распознаваемым антителами, полученными в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с одним вариантом осуществления полипептид AMH (a), не распознаваемый антителами, представляет собой полипептид последовательностей, выбранных из: SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13, и последовательностей, имеющих идентичность по меньшей мере 75% с этими последовательностями. Последовательность SEQ ID NO:11 соответствует аминокислотам 1-156 человеческого AMH (называемого AMH-1), последовательность SEQ ID NO:12 соответствует аминокислотам 19-156 человеческого AMH, а именно последовательности SEQ ID NO:11 без сигнального пептида (называемой AMH-1 без сигнального пептида), а последовательность SEQ ID NO:13 соответствует аминокислотам 26-156 человеческого AMH, а именно последовательности SEQ ID NO:11 без сигнального пептида или части-предшественника (называемой AMH-1 без сигнального пептида или части-предшественника).

Способ 2:

Выбирают гибридомы, секретирующие антитела, распознающие среднюю часть про-области AMH, а именно, для человеческого AMH, аминокислоты 157-255 (SEQ ID NO:1), и любую последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере 75% с этой последовательностью.

Таблица ниже (таблица 2) представляет различные полипептиды AMH (a), которые не распознаются, и которые используют в контексте настоящего изобретения, с указанием положения аминокислот и соответствующих SEQ ID (в скобках) в соответствии с видом млекопитающего.

Таблица 2

	Человеческие	Лошадиные	Собачьи	Бычьи
Весь AMH-1	1-156 (SEQ ID NO:11)	1-166 (SEQ ID NO:21)	1-165 (SEQ ID NO:30)	1-170 (SEQ ID NO:42)
Весь AMH-1 без сигнального пептида	19-156 (SEQ ID NO:12)	23-166 (SEQ ID NO:22)	22-165 (SEQ ID NO:31)	18-170 (SEQ ID NO:43)
Весь AMH-1 без сигнального пептида или части-предшественника	26-156 (SEQ ID NO:13)	н.п.	н.п.	25-170 (SEQ ID NO:44)

н.п.=неприменимо, поскольку у рассматриваемого AMH нет части-предшественника

Таким образом, в соответствии с одним конкретным вариантом осуществления последовательности, имеющие идентичность по меньшей мере 75% с последовательностями SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13, выбирают из последовательностей: SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 и SEQ ID NO:44.

Полипептиды AMH (a) могут быть получены, как описано ранее, и могут содержать другие аминокислоты, не принадлежащие AMH.

Второй скрининг, называемый скрининг 2, заключается в исключении гибридом, которые продуцируют антитела, которые распознают линейные эпитопы в средней части про-области AMH, а именно в последовательности SEQ ID NO:1 или любой последовательности, имеющей идентичность 75% с последовательностью SEQ ID NO:1. Эти эпитопы называются линейными эпитопами (b).

Определение линейных эпитопов на аминокислотной последовательности хорошо известно специалистам в данной области техники. Оно заключается в нарезании представляющей интерес последовательности на перекрывающиеся пептиды заданной длины, например 10, 12 или 15 аминокислот, а затем идентификации среди этих пептидов тех, которые распознаются моноклональными или поликлональными антителами. Конечно, в соответствии с их определением линейные эпитопы содержат последовательные аминокислоты представляющей интерес последовательности.

Таблица ниже (таблица 3) представляет различные линейные эпитопы (b), определенные в средней части про-области AMH, которые используются в контексте настоящего изобретения, с указанием SEQ ID в соответствии с видом млекопитающего.

Таблица 3

	Человеческие	Лошадиные	Собачьи	Бычьи
Линейные эпитопы на средней части про-области	SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47	SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:50	SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:53	SEQ ID NO:54 SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:56

Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления линейные эпитопы (b), не распознаваемые антителами, имеют последовательности с SEQ ID NO:45 по SEQ ID NO:56.

Как и ранее, эпитопы получают в соответствии с обычными способами, как описано ранее. Они также могут быть получены пептидным синтезом, который часто является предпочтительным.

Один конкретный вариант осуществления содержит по меньшей мере следующие характеристики для этапа отбора (iii):

скрининг 1 с использованием способа 1;

скрининг 1 проводят до скрининга 2.

Между всеми этапами скрининга, если требуется, антитела, содержащиеся в гибридомных супернатантах, очищают в соответствии с обычными методами, например аффинной хроматографией на белке A. После проведения отбора и/или, если требуется, между всеми этапами скрининга гибридомы клонируют, для того чтобы гарантировать стабилизированную и гомогенную линию. Это хорошо известно специалистам в данной области техники.

Последний этап способа настоящего изобретения состоит из получения представляющих интерес антител, этот этап также хорошо известен специалистам в данной области техники и описан во всех руководствах по получению моноклональных антител, например в руководстве "Current Protocols in Cell Biology".

Помимо вышеуказанных этапов, общая процедура которых хорошо описана, способ настоящего изобретения может также содержать другие стадии, такие как стадии промывания, хранения и превращения антител в фрагменты.

В способе получения антител против AMH настоящего изобретения иммуноген (полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1, и не более 560 аминокислот последовательности SEQ ID NO:2 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:2), средняя часть про-области AMH (полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1, и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:8), полипептид (a), не распознаваемый представляющими интерес антителами (полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 131 аминокислоту последовательности SEQ ID NO:13 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:13, и не более 156 аминокислот последовательности SEQ ID NO:11 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:11), и линейные эпитопы (расположенные в последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1), предпочтительно, принадлежат одному виду.

В соответствии с одним вариантом осуществления:

- млекопитающее является человеком, иммуноген представляет собой пептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, который содержит по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 и не более 560 аминокислот последовательности SEQ ID NO:2, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8, а полипептид AMH (a), не распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 131 аминокислоту последовательности SEQ ID NO:13 и не более 156 аминокислот последовательности SEQ ID NO:11, или

- млекопитающее представляет собой лошадь, иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, который содержит по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:14 и не более 573 аминокислот последовательности SEQ ID NO:15, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:14 и не более 265 аминокислот последовательности SEQ ID NO:19, и полипептид AMH (a), не распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 144 аминокислоты последовательности SEQ ID NO:22 и не более 166 аминокислот последовательности SEQ ID NO:21, или

- млекопитающее представляет собой собаку, иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, который содержит по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:23 и не более 572 аминокислот последовательности SEQ ID NO:24, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:23 и не более 264 аминокислот последовательности SEQ ID NO:28, и полипептид AMH (a), не распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 144 аминокислоты последовательности SEQ ID NO:31 и не более 165 аминокислот последовательности SEQ ID NO:30, или

- млекопитающее представляет собой корову, иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, который содержит по меньшей мере 100 аминокислот последовательности SEQ ID NO:32 и не более 575 аминокислот последовательности SEQ ID NO:33, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 100 аминокислот последовательности SEQ ID NO:32 и не более 270 аминокислот последовательности SEQ ID NO:39, и полипептид AMH (a), не распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 146 аминокислот последовательности SEQ ID NO:44 и не более 270 аминокислот последовательности SEQ ID NO:42.

В частности:

- млекопитающее является человеком, иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательностей SEQ ID NO:2-10, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательностей SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:8-10, и полипептид AMH (a), не распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательностей SEQ ID NO:11-13, или

- млекопитающее представляет собой лошадь, иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательностей SEQ ID NO:15-20, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательностей SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:19 и 20, и полипептид AMH (a), не распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательностей SEQ ID NO:21 и 22, или

- млекопитающее представляет собой собаку, иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательностей SEQ ID NO:24-29, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательностей SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:28 и 29, и полипептид AMH (a), не распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательностей SEQ ID NO:30 и 31, или

- млекопитающее представляет собой корову, иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательностей SEQ ID NO:33-41, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательности SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:39-41, и полипептид AMH (a), не распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, выбранный из полипептидов последовательностей SEQ ID NO:42-44.

Антитела, получаемые с помощью способа настоящего изобретения, являются новыми и могут быть получены с помощью другого способа, при условии, что они сохраняют те же характеристики. Таким образом, другой предмет настоящего изобретения относится к моноклональным антителам или фрагментам антител против AMH млекопитающих, распознающим полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1, и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:8, но не распознающим ни (a) полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 131 аминокислоту последовательности SEQ ID NO:13 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:13, и не более 156 аминокислот последовательности SEQ ID NO:11 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:11, ни любой линейный эпитоп, расположенный в последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:1.

Термин "фрагмент моноклонального антитела" предназначен для обозначения любой части антитела, которая обладает такими же характеристиками иммунологического распознавания, что и антитело, из которого оно получено; в данном случае оно способно к распознаванию средней части про-области AMH, а также цельного AMH. В качестве примеров фрагментов можно упомянуть фрагменты Fab, Fab' и F(ab')2, а также фрагменты scFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент) и dsFv (двухцепочечный вариабельный фрагмент). Эти функциональные фрагменты могут, в частности, быть получены с помощью генной инженерии или же с помощью специфического протеолитического расщепления, а затем очистки.

Характеристики и определения, приведенные ранее для способа настоящего изобретения, также применимы к антителам настоящего изобретения.

Таким образом, антитела настоящего изобретения могут удовлетворять одному или нескольким из следующих условий:

- нераспознаваемый полипептид AMH (a) представляет собой полипептид последовательностей, выбранных из: SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13, или последовательностей, имеющих идентичность по меньшей мере 75% с этими последовательностями,

- последовательности, имеющие идентичность по меньшей мере 75% с последовательностями SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13, выбраны из последовательностей: SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 и SEQ ID NO:44,

- линейные эпитопы (b), не распознаваемые антителами, имеют последовательности с SEQ ID NO:45 по SEQ ID NO:56.

В частности,

- млекопитающее является человеком, распознаваемый полипептид AMH представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8, и нераспознаваемый полипептид AMH (a) представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 131 аминокислоту последовательности SEQ ID NO:13 и не более 156 аминокислот последовательности SEQ ID NO:11, или

- млекопитающее представляет собой лошадь, распознаваемый полипептид AMH представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:14 и не более 265 аминокислот последовательности SEQ ID NO:19, и нераспознаваемый полипептид AMH (a) представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 144 аминокислоты последовательности SEQ ID NO:22 и не более 166 аминокислот последовательности SEQ ID NO:21, или

- млекопитающее представляет собой собаку, распознаваемый полипептид AMH представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:23 и не более 264 аминокислот последовательности SEQ ID NO:28, и нераспознаваемый полипептид AMH (a) представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 144 аминокислоты последовательности SEQ ID NO:31 и не более 165 аминокислот последовательности SEQ ID NO:30, или

- млекопитающее представляет собой корову, распознаваемый полипептид AMH представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 100 аминокислот последовательности SEQ ID NO:32 и не более 270 аминокислот последовательности SEQ ID NO:39, и нераспознаваемый полипептид AMH (a) представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 146 аминокислот последовательности SEQ ID NO:44 и не более 270 аминокислот последовательности SEQ ID NO:42.

Антитела против AMH настоящего изобретения особенно полезны для анализа AMH в биологическом образце, который может содержать AMH. Их можно использовать, как они есть, в целой или фрагментарной форме и/или в форме, конъюгированной с меткой, способной генерировать испускание детектируемого сигнала для визуализации иммунологической реакции после связывания с AMH образца, что образует другой предмет настоящего изобретения.

Под меткой экспрессии, способной генерировать испускание детектируемого сигнала для визуализации иммунологической реакции, понимается любая молекула, содержащая группу, которая реагирует с группой антитела или фрагмента антитела непосредственно без химической модификации или после химической модификации для введения такой группы, причем эта молекула способна непосредственно или косвенно генерировать детектируемый сигнал, который будет использоваться для определения искомого количества.

Связывание между меткой и антителом или фрагментом антитела настоящего изобретения может быть осуществлено с помощью любого способа, известного специалистам в данной области техники, и в частности с помощью сшивания.

Примеры меток содержат, в частности:

- ферменты, которые производят сигнал, который можно детектировать, например, с помощью колориметрии, флуоресценции или люминесценции, такие как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза или глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа,

- хромофоры, такие как флуоресцентные, люминесцентные или красящие соединения,

- радиоактивные молекулы, такие как P32, S35 или I125,

- флуоресцентные молекулы, такие как Alexas или фикоцианины, и

- электрохемилюминесцентные соли, такие как металлоорганические производные на основе акридиния или рутения.

Примеры систем косвенного детектирования содержат, например, лиганды, способные реагировать с антилигандом. В этом случае лиганд соответствует метке таким образом, чтобы образовывать конъюгат с антителом или фрагментом антитела.

Пары лиганд/антилиганд хорошо известны специалистам в данной области техники и содержат, например, следующие пары: биотин/стрептавидин, гаптен/антитело, антиген/антитело, пептид/антитело, сахар/лектин, полинуклеотид/последовательность, комплементарная полинуклеотиду.

Затем антилиганд может быть непосредственно детектирован с помощью меток для непосредственного детектирования, описанных ранее, или может сам быть детектирован с помощью другой пары лиганд/антилиганд и т.д.

Анализ AMH проводят с помощью сэндвич-иммуноанализа, который является анализом, хорошо известным специалистам в данной области техники. Кратко говоря, он заключается в определения аналита, в данном случае AMH млекопитающих, с использованием двух связывающих аналит партнеров, в данном случае по меньшей мере одного антитела или фрагмента антитела настоящего изобретения.

Конечно, префикс "иммуно" в термине "иммуноанализ", например, не должен восприниматься в настоящей заявке как строго указывающий на то, что связывающий партнер, отличный от антитела или фрагмента антитела настоящего изобретения, обязательно является партнером иммунологического происхождения, таким как антитело или фрагмент антитела. Действительно, как хорошо известно специалистам в данной области техники, этот термин более широко используется для обозначения также тестов и способов, в которых связывающий партнер не является партнером иммунологического происхождения/природы, но состоит, например, из рецептора аналита, который желательно детектировать и/или количественно оценить. Существенным условием является то, что рассматриваемый связывающий партнер способен к связыванию с искомым аналитом, в данном случае AMH, предпочтительно специфически. Таким образом, известной практикой является использование термина "ELISA-анализ" для анализов, в которых используются связывающие партнеры, которые не являются иммунологическими в строгом смысле, что более широко называется "анализом связывания лиганда", хотя термин "иммуно" включен в полное название, соответствующее сокращению ELISA. Для ясности и единообразия термин "иммуно" используется в настоящей заявке для обозначения любого биологического анализа с использованием по меньшей мере одного связывающего партнера, подходящего для связывания с искомым аналитом и для его количественного определения, предпочтительно специфически, даже если связывающий партнер, отличный от антитела или фрагмента антитела настоящего изобретения, не является иммунологическим по природе или происхождению в строгом смысле.

Другой предмет настоящего изобретения, таким образом, относится к способу количественного определения AMH млекопитающих с помощью сэндвич-иммуноанализа в биологическом образце, который может содержать AMH, который содержит или состоит из следующих этапов:

- приведение упомянутого биологического образца в контакт с двумя связывающими AMH партнерами, причем по меньшей мере один из упомянутых партнеров которого представляет собой антитело, фрагмент антитела или конъюгат настоящего изобретения,

- детектирование сигнала, испускаемого при связывании между упомянутыми связывающими партнерами и AMH, если он присутствует, с использованием метки, способной генерировать испускание детектируемого сигнала, и

- преобразование детектируемого сигнала в концентрацию AMH.

Первый этап этого способа определения количества содержит или состоит из приведения биологического образца в контакт с двумя связывающими AMH партнерами, причем по меньшей мере один из упомянутых партнеров которого представляет собой антитело, фрагмент антитела или конъюгат настоящего изобретения.

Биологическими образцами, которые могут содержать AMH млекопитающих, являются образцы крови, сыворотки, плазмы, фолликулярной жидкости и спермы. В соответствии с одним вариантом осуществления биологический образец представляет собой образец крови, сыворотки или плазмы.

Связывающий партнер, отличный от антитела или фрагмента антитела настоящего изобретения, необязательно в форме конъюгата, содержит любую молекулу, способную к связыванию с AMH. В качестве примера такого связывающего партнера можно упомянуть поликлональные антитела против AMH, моноклональные антитела против AMH, фрагменты моноклональных антител против AMH, аналоги антител (молекулы, способные имитировать антитела), такие как нанофитины, аптамеры или же "дарпины", или любую другую молекулу, о которой известно, что она взаимодействует с AMH.

Аналоги антител нанофитины являются небольшими белками, которые, как и антитела, способны к связыванию с биологической мишенью, что делает возможным ее детектирование, ее захват или просто нацеливание на нее в организме.

Аналоги антител аптамеры являются олигонуклеотидами, обычно РНК или ДНК, которые идентифицируют в библиотеках, содержащих вплоть до 1015 различных последовательностей, комбинаторным способом отбора in vitro, известным как SELEX, "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment" (Ellington AD and Szostak JW., 1990). Большинство аптамеров состоят из РНК из-за способности РНК принимать разнообразные и сложные структуры, что позволяет создавать на ее поверхности полости различной геометрии, что делает возможным связывание различных лигандов. Они являются интересными биохимическими инструментами, которые можно использовать в биотехнологических, диагностических или терапевтических применениях. По селективности и лиганд-связывающим свойствам они сравнимы с антителами.

Аналоги антител "дарпины", где DARPins означает Designed Ankyrin Repeat ProteINS (Boersma YL and Plütckthun A, 2011), представляют собой другой класс белков, позволяющий имитировать антитела и связываться с высокой аффинностью и высокой селективностью с белками-мишениями. Они происходят из семейства анкириновых белков, которые являются адапторными белками, что позволяет им связывать интегральные мембранные белки с спектрин-актиновой сетью, которая составляет "позвоночный столб" клеточной плазматической мембраны. Структура анкиринов основана на повторении мотива из примерно 33 аминокислот, и то же самое относится и к дарпинам. Каждый мотив имеет вторичную структуру типа спираль-поворот-спираль. Дарпины содержат по меньшей мере три, предпочтительно от четырех до пяти повторяющихся звеньев, и их получают путем скрининга комбинаторных библиотек.

Поликлональные антитела, моноклональные антитела и фрагменты антител против AMH могут быть получены обычным способом, хорошо известным специалистам в данной области техники. Некоторые антитела доступны на рынке, например от AnshLabs (США).

Заявитель также получил другие моноклональные антитела, которые особенно полезны в контексте анализа AMH с использованием того же способа получения моноклональных антител, что и описанный ранее для изобретения, с единственным отличием в том, что зоной распознавания антител является C-концевая часть про-области AMH, а именно, для человеческого AMH, аминокислоты 256-451 (196 аминокислот SEQ ID NO:57); для AMH лошадей аминокислоты 266-464 (199 аминокислот SEQ ID NO:58), для AMH собак аминокислоты 265-463 (199 аминокислот SEQ ID NO:59) и для бычьего AMH аминокислоты 271-466 (199 аминокислот SEQ ID NO:60). C-концевая часть представляющей интерес про-области представляет собой, таким образом, полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 196 аминокислот последовательности SEQ ID NO:57 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:57. Неожиданно оказалось, что антитела, распознающие C-концевую часть про-области AMH, не нужно использовать в большом количестве в анализе, в котором их применяют, в отличие от антител предшествующего уровня техники.

Для получения этих антител, распознающих C-концевую часть AMH, используют иммуноген, представляющий собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, который должен содержать по меньшей мере часть, которую должны распознавать антитела, а именно по меньшей мере C-концевую часть про-области AMH, а именно по меньшей мере 196 аминокислот последовательности SEQ ID NO:57 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:57. Иммуноген также содержит, самое большее, цельный AMH рассматриваемого вида или полинуклеотид, кодирующий цельный AMH рассматриваемого вида, а именно, в случае человеческого AMH, 560 аминокислот последовательности SEQ ID NO:2, тогда как другие AMH имеют идентичность по меньшей мере 75% с последовательностью SEQ ID NO:2. Конкретный иммуноген может быть выбран из следующих:

- полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, лишенный, по сравнению с полной последовательностью AMH, всех аминокислот, расположенных после C-концевой части про-области AMH, а именно полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 426 аминокислот последовательности SEQ ID NO:7 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:7, и не более 451 аминокислоты последовательности SEQ ID NO:5 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:5, предпочтительно выбранный из полипептидов AMH последовательностей SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7 или последовательностей, имеющих идентичность по меньшей мере 75% с этими последовательностями, например последовательностей SEQ ID NO:17, 18, 26, 27, 36, 37 или 38. Это соответствует AMH-3, где это уместно, без сигнального пептида и, необязательно, без части-предшественника;

- полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, который соответствует всему AMH со всем сигнальным пептидом или его частью и, необязательно, всей частью-предшественником или ее частью, а именно который содержит по меньшей мере 535 аминокислот последовательности SEQ ID NO:4 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:4, предпочтительно выбранный из полипептидов AMH последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 или последовательностей, имеющих идентичность по меньшей мере 75% с этими последовательностями, например последовательностей SEQ ID NO:15, 16, 24, 25, 33, 34 или 35.

Отбор гибридом также проводят с использованием 2 этапов скрининга в любом порядке с конкретными полипептидами и пептидами.

Первый скрининг, называемый скрининг 1, заключается в сохранении только гибридом, которые продуцируют антитела, распознающие C-концевую часть про-области, как описано ранее. Для этого можно использовать два способа:

Способ 1: вначале отбирают гибридомы, секретирующие антитела, распознающие AMH-3, а именно, для человеческого AMH-3, аминокислоты 1-451 (SEQ ID NO:5), где это уместно, без всего сигнального пептида или его части и всей части-предшественника или ее части, или любую последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере 75% с этой последовательностью. В соответствии с одним вариантом осуществления распознаваемый антителами полипептид AMH-3 представляет собой полипептид последовательностей, выбранных из: SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7, и последовательностей, имеющих идентичность по меньшей мере 75% с этими последовательностями. Затем исключают гибридомы, которые продуцируют антитела, распознающие часть AMH, расположенную до C-концевой части про-области AMH, а именно, для человеческого AMH, аминокислоты 1-255 (SEQ ID NO:8 - AMH-2), где это уместно, без всего сигнального пептида или его части и всей части-предшественника или ее части, и любую последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере 75% с этой последовательностью. Этот полипептид AMH называется полипептидом AMH (a), не распознаваемым антителами, полученными в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с одним вариантом осуществления полипептид AMH (a), не распознаваемый антителами, представляет собой полипептид последовательностей, выбранных из: SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, и последовательностей, имеющих идентичность по меньшей мере 75% с этими последовательностями.

Способ 2: выбирают гибридомы, секретирующие антитела, распознающие C-концевую часть про-области AMH, а именно, для человеческого AMH, аминокислоты 256-451 (SEQ ID NO:57), или любую последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере 75% с этой последовательностью.

Второй скрининг, называемый скрининг 2, заключается в исключении гибридом, которые продуцируют антитела, которые распознают линейные эпитопы (b) в C-концевой части про-области AMH, а именно в последовательности SEQ ID NO:57 или любой последовательности, имеющей 75% с последовательностью SEQ ID NO:57.

Таблица ниже (таблица 4) представляет различный линейные эпитопы (b), определенные в C-концевой части про-области AMH, которые используются для получения этих антител, с указанием SEQ ID в соответствии с видом млекопитающего.

Таблица 4

	Человеческие	Лошадиные	Собачьи	Бычьи
Линейные эпитопы на C-концевой части про-области	SEQ ID NO:61-68	SEQ ID NO:69-74 SEQ ID NO:62 и 63	SEQ ID NO:75-81 SEQ ID NO:73	SEQ ID NO:82-85 SEQ ID NO:62, 63, 70 и 73

Таким образом полученные антитела против AMH обладают следующими характеристиками: они распознают полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 196 аминокислот последовательности SEQ ID NO:57 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:57, они не распознают ни (a) полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 230 аминокислот последовательности SEQ ID NO:10 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:10, и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:8, ни (b) линейный эпитоп, расположенный в последовательности SEQ ID NO:57 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:57, например последовательностях SEQ ID NO:61-85.

Все характеристики и определения, приведенные ранее для способа получения антител настоящего изобретения и для антител настоящего изобретения, также применимы здесь.

Один из двух связывающих партнеров может быть связан с меткой с образованием конъюгата или индикатора. Другой связывающий партнер может быть захвачен на твердой подложке как непосредственно, так и опосредованно. Далее рассматриваются партнеры по захвату для второго и партнеры по детектированию для первого.

Пары связывающих AMH партнеров, используемые в способе количественного определения AMH настоящего изобретения, могут распознавать или про-область и зрелую область AMH, или только про-область, в частности когда с антителами настоящего изобретения используется антитело против AMH, распознающее C-концевую часть про-области. Таким образом, в соответствии с одним конкретным вариантом осуществления второй связывающий AMH партнер, используемый в способе определения количества, представляет собой антитело, распознающее полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 196 аминокислот последовательности SEQ ID NO:57 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:57, но не распознающее ни (a) полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 230 аминокислот последовательности SEQ ID NO:10 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:10, и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:8, ни (b) линейный эпитоп, расположенный в последовательности SEQ ID NO:57 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:57, причем последний может иметь форму фрагмента и/или конъюгата с меткой, способной генерировать испускание детектируемого сигнала для визуализации иммунологической реакции между этим конъюгатом и AMH биологического образца.

Приведение биологического образца в контакт с двумя связывающими AMH партнерами может проходить в одну стадию или в две стадии, как хорошо известно специалистам в данной области техники. Кратко говоря, одностадийный иммуноанализ содержит приведение тестового образца одновременно в контакт с двумя связывающими партнерами, включая антитела, фрагменты антител или конъюгаты настоящего изобретения как определено ранее, тогда как двухстадийный иммуноанализ содержит сначала приведение тестового образца в контакт с первым связывающим партнером, а затем таким образом образованный комплекс аналит-первый связывающий партнер приводят в контакт со вторым связывающим партнером, причем один из двух связывающих партнеров, конечно, представляет собой антитело, фрагмент антитела или конъюгат настоящего изобретения, как определено ранее.

Способ может также содержать другие стадии, известные специалистам в данной области техники, такие как стадии промывания и стадии инкубации.

Второй этап способа определения количества настоящего изобретения содержит или состоит в детектировании сигнала, испускаемого при связывании между упомянутыми связывающими партнерами и AMH, если он присутствует, с использованием метки, способной генерировать испускание детектируемого сигнала как определено ранее. Этот метка может быть конъюгирована с одним из упомянутых связывающих AMH партнеров.

В зависимости от типа используемой метки специалисты в данной области техники могут добавлять реагенты, которые делают возможной визуализацию метки или испускание детектируемого сигнала с помощью подходящего устройства измерения любого типа, например спектрофотометра, спектрофлуориметра, денситометра, люминометра или же камеры высокой четкости.

Последний этап способа количественного определения AMH содержит или состоит в преобразовании детектируемого сигнала в концентрацию AMH. Также рассматриваются уровни или количества AMH. Общий принцип заключается в том, что измеренный сигнал, испускаемый во время иммуноанализа, пропорционален количеству AMH в биологическом образце.

Этот этап преобразования детектируемого сигнала в концентрацию AMH хорошо известен специалистам в данной области техники. Он заключается в использовании заранее определенной математической модели на основе стандартного диапазона. Этот стандартный диапазон получают заранее известным способом. Кратко говоря, получение стандартного диапазона заключается в измерении сигнала, генерируемого при увеличении известных количеств или концентраций целевого аналита (AMH), построении кривой, дающей сигнал как функцию уровня AMH, и поиске математической модели, которая представляет эту взаимосвязь как можно точнее. Математическую модель используют для определения неизвестных количеств, титров или концентраций AMH, содержащегося в биологическом образце, подлежащем тестированию.

Определение концентрации AMH можно использовать для разных целей, и в частности в контексте фертильности у женщин, для оценки овариального резерва у женщин, например у женщин, которые должны подвергаться продолжительному лечению, которое несет риск разрушения фолликул, а также у мальчиков до наступления половой зрелости, например в случае нарушений, связанных с половой дифференциацией.

Таким образом, другой предмет настоящего изобретения относится к применению антител, фрагментов антител или конъюгатов настоящего изобретения, не зависимо от того, получены ли они с использованием способа настоящего изобретения или, альтернативно, способа определения количества настоящего изобретения, в качестве вспомогательного средства:

- для диагностики нарушений, связанных с дисфункцией яичников у женщин детородного возраста, или

- в оценке овариального фолликулярного резерва у молодых девушек старше 12 лет и женщин или

- в оценке нарушений, связанных с половой дифференциацией у мальчиков до наступления половой зрелости.

Для осуществления способов настоящего изобретения, используемых, в частности, в соответствии с применениями, описанными выше, антитела, фрагменты или конъюгаты настоящего изобретения могут входить в состав наборов.

Таким образом, другой предмет настоящего изобретения относится к наборам, содержащим антитело или фрагмент антитела, как определено или получено ранее, и/или конъюгат, как определено ранее.

И в этом случае характеристики и определения, приведенные ранее в контексте антител и способов настоящего изобретения, применимы к наборам настоящего изобретения.

В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления наборы также включают в себя или содержат по меньшей мере один положительный контроль. Этот положительный контроль содержит соединение, способное к связыванию с связывающими партнерами, используемыми во время применения набора, причем данное соединение присутствует в предварительно определенном количестве.

В качестве неограничивающих примеров таких соединений можно упомянуть весь AMH последовательности SEQ ID NO:2 или последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO:2, где это уместно, со всем сигнальным пептидом или его частью и, необязательно, всей частью-предшественником или ее частью.

Наборы могут также содержать все соединения, необходимые для демонстрации реакции между связывающими партнерами и AMH, такие как буферы для промывания или реагенты, обеспечивающие визуализацию метки или испускание детектируемого сигнала.

Настоящее изобретение будет более понятным из следующих примеров, которые приведены в качестве неограничивающей иллюстрации, а также из фигур 1-4, на которых:

- Фигура 1 представляет собой схематическое представление структуры человеческого белка AMH и человеческих беловых конструкций AMH-1, AMH-2 и AMH-3, которые происходят от него.

- Фигура 2 представляет собой анализ с помощью вестерн-блоттинга клеточных лизатов, полученных с помощью трансфекций генных конструкций AMH-1, AMH-2, AMH-3 и цельного AMH в клетки HEK293T, после разделения с помощью электрофореза на геле Bis-Tris 4-12%. Лунки 1, 2: лизат отрицательного контроля (клетки, трансфицированные пустой плазмидой); лунки 3, 4: лизат AMH-1; лунки 5, 12: стандарт молекулярного веса; лунки 6, 7: лизат AMH-2; лунки 8, 9: лизат AMH-3; лунки 10, 11: лизат цельного AMH. Лунки 1, 3, 6, 8 и 10 соответствуют условию A: загруженные образцы нагревали и восстанавливали. Лунки 2, 4, 7, 9 и 11 соответствуют условию B: загруженные образцы нагревали, но не восстанавливали. Фигура 2A представляет собой фотографию мембраны, протестированной с антителом против β-актина, которое служит для верификации загрузки в каждую лунку эквивалентных количеств общего белка. Фигура 2B представляет собой фотографию мембраны, протестированной с антителом против гистидина (Qiagen). Полосы, которые соответствуют сконструированным продуктам экспрессии AMH, заключены в прямоугольную рамку.

- Фигура 3 представляет собой анализ с помощью вестерн-блоттинга белков AMH-2 и AMH-3, очищенных от супернатантов трансфекций генетических конструкций в клетки HEK293T, после разделения с помощью электрофореза на геле Bis-Tris 4-12%. Лунка 1: отрицательный контроль (клетки, трансфицированные пустой плазмидой); лунка 2: AMH-2; лунка 3: AMH-3; лунка 5: стандарт молекулярного веса. Загруженные образцы нагревали, но не восстанавливали. Было получено пять идентичных мембран (фигуры 3A-3E), и каждую тестировали или с антителом против AMH, или с антителом против гистидина (Qiagen).

- Фигура 4 представляет собой анализ в ДСН-ПААГ рекомбинантного белка AMH CHO-AMH5 3F1, очищенного с помощью аффинной хроматографии. Гель ДСН-ПААГ окрашивали нитратом серебра для визуализации общего белка. Лунка 1: стандарт молекулярного веса; лунка 2: рекомбинантный AMH, нагретый, но не восстановленный; лунка 3: рекомбинантный AMH, нагретый и восстановленный.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Клонирование фрагментов ДНК, соответствующих полной последовательности человеческого AMH или усеченным последовательностям, и временная трансфекция в клетки HEK 293T

1.1. Генетические конструкции

Полная экспрессируемая последовательность AMH представляет собой последовательность человеческого AMH, которая содержит 560 аминокислот (SEQ ID NO:2, которая соответствует номеру доступа P03971 в базе данных Uniprot KB); эта конструкция называется AMH-560. Она содержит сигнальный пептид (аминокислоты 1-18) и часть-предшественник (аминокислоты 19-25), которые отщепляются во время посттрансляционного созревания белка.

Были получены три другие белковые конструкции, называемые AMH-1, AMH-2 и AMH-3, соответствующие последовательностям аминокислот AMH 1-156 (SEQ ID NO:11), 1-255 (SEQ ID NO:8) и 1-451 (SEQ ID NO:5), соответственно. Для этих 4 конструкций с C-концевой стороны добавляли полигистидиновую (8-His) метку для облегчения очистки (метка не добавлена в списки последовательностей).

Фрагменты ДНК, соответствующие конструкциям AMH-1, AMH-2, AMH-3 и цельного AMH, последовательности которых приведены в таблице 5 ниже, были получены в форме синтетических генов от компании GeneArt^® (Life Technologies). Каждый фрагмент ДНК (AMH-1, AMH-2, AMH-3 и цельного AMH) клонировали между сайтами Eco RI и Not I в векторе pCMV6-XL5 под контролем промотора CMV. Полученные плазмиды верифицировали секвенированием на уровне вставок, чтобы убедиться, что они не содержат ошибок.

Таблица 5

Название	Полинуклеотид AMH	Соответствующий фрагмент ДНК SEQ ID NO:X-8HIS-стоп-кодон
AMH-1	SEQ ID NO:86	SEQ ID NO:86-CACCACCATCATCACCATCACCAC-TGA
AMH-2	SEQ ID NO:87	SEQ ID NO:87-CACCACCATCATCACCATCACCAC-TGA
AMH-3	SEQ ID NO:88	SEQ ID NO:88-CACCACCATCATCACCATCACCAC-TGA
Цельный AMH	SEQ ID NO:89	SEQ ID NO:89-CACCACCATCATCACCATCACCAC-TGA

1.2. Временная трансфекция в клетки HEK293T

Культивирование. Клетки HEK-293T/17 SF (ATCC ACS-4500^TM) культивировали без сыворотки в среде HEK Plus SFM (ATCC # 8006386597), обогащенной глутамином (Gibco # 250030,24), в соответствии с инструкциями поставщика. Клетки культивировали в F75 культуральных колбах и выдерживали в инкубаторе при 37°C с 5% CO₂ до трансфекции.

Трансфекция. Клетки HEK293T SF (10⁶ клеток) трансфицировали путем нуклеофекции с использованием нуклеофектора Amaxa (Lonza) с применением протокола, входящего в набор Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V (#VCA-1003), и с использованием 5 мкг ДНК для 1 миллиона клеток на трансфекцию. Кратко говоря, 1 миллион клеток центрифугируют при 200 g в течение 10 минут, для того чтобы их собрать. Клеточный сгусток затем ресуспендируют в 100 мкл раствора V (входящего в набор). К клеточной суспензии добавляют 5 мкг плазмиды. Всю смесь аккуратно перемешивают и переносят в кювету Amaxa (также входящую в набор). Кювету вставляют в нуклеофектор, на котором устанавливают программу Amaxa Q-001, и затем активируют нуклеофекцию. Затем образец немедленно переносят в теплую среду в 6-луночный планшет для культивирования клеток, который инкубируют при 37°C, 5% CO₂. Клетки HEK293T SF культивируют в течение 48 часов.

Лизис и сбор. Через 48 часов после трансфекции супернатанты собирают и затем замораживают при -80°C после добавления ингибиторов протеаз (cOmplete^TM, таблетки со смесью ингибиторов протеаз без ЭДТА от Roche). Сгустки трансфицированных клеток (по 6×10⁶ клеток на сгусток) обрабатывают 1,8 мл 5,5 мМ фосфатного буфера для лизиса, содержащего 130 мМ NaCl, 0,5% Triton X-100, 5 ед/мл нуклеазы бензоназы (Novagen), 0,48 г/л MgCl₂ и ингибиторы протеаз (cOmplete^TM, таблетки со смесью ингибиторов протеаз без ЭДТА, Roche, кат. № 045-6642, 1 таблетка на 50 мл, pH 7,4). Клеточный лизат затем помещают в лед на 30 минут, потом центрифугируют в течение 15 минут при 13000 g, 4°C. Полученные супернатанты содержат белки AMH-1, AMH-2, AMH-3 и цельного AMH, и их хранят при -80°C.

1.3. Анализ экспресси белка с помощью вестерн-блоттинга

Первое определение характеристик продуктов экспрессии, полученных на этапе 1.2, проводили с помощью анализа в ДСН-ПААГ на геле NuPAGE^® Bis-Tris 4-12% в буфере NuPAGE^® MES SDS (Life Technologies). Перед загрузкой на гель (14 мкл на лунку) трансфекционные супернатанты и лизаты разводили в NuPAGE^® LDS 4X Sample Buffer 4X (Life Technologies) (3/1, об/об) и подвергали различным обработкам. Восстановление проводят путем добавления конечной концентрации 55 мМ дитиотреитола (ДТТ). Нагревание проводят в течение 5 мин при 75°C.

Условие A: НАГРЕВАЛИ и ВОССТАНАВЛИВАЛИ (с ДТТ)

Условие B: НАГРЕВАЛИ и НЕ ВОССТАНАВЛИВАЛИ (без ДТТ).

После миграции геля белки, разделенные с помощью электрофореза, переносят на нитроцеллюлозную мембрану 0,45 мкм при постоянном токе 350 мА в течение 50 минут в 1X Tris-глициновом буфере, содержащем 20% метанола. Пассивацию мембраны проводят в присутствии 3% БСА (бычий сывороточный альбумин) в 5,5 мМ фосфатном буфере, содержащем 130 мМ NaCl, в течение ночи при +2/8°C. После пассивации мышиное антигистидиновое моноклональное антитело (Qiagen, кат. № 34660) разводят до 1/2000 в 5,5 мМ фосфатном буфере, содержащем 130 мМ NaCl и 0,05% Tween 20, затем 10 мл этого разведения инкубируют с мембраной в течение 1 ч при +18/25°C. Вторую мембрану, полученную точно так же, инкубируют в то же время и в тех же условиях с мышиным моноклональным антителом против β-актина (клон AC-15, Life Technologies, кат. № AM4302) вместо антитела против гистидина. Эта мембрана служит для верификации того, что во всех лунках анализу подвергаются сравнимые количества общего белка (контроль эквивалентного режима).

После промывания мембран для удаления несвязанных антител (5 промываний в течение 5 мин в 5,5 мМ фосфатном буфере, содержащем 130 мМ NaCl и 0,05% Tween 20), их инкубируют в течение 1 ч с конъюгированным с пероксидазой хрена антимышиным вторичным антителом (Jacskon Immunoresearch, кат. № 115-036-003), разведенным до 1/20000 в 1X ФСБ, содержащем 0,2% Tween 20. После 5 промываний по 5 минут в 1X ФСБ, содержащем 0,2% Tween 20, проводят визуализацию путем инкубирования мембран в растворе субстрата для вестерн-блоттинга Clarity (Biorad, кат. № 170-5061) в течение 5 минут при перемешивании перед получением данных с помощью хемилюминесценции (Chemidoc XRS, Biorad).

Результаты представлены на фигуре 2. На мембране, визуализированной антителом против β-актина (фигура 2A), наблюдается одна полоса на лунку, и интенсивности этих полос эквивалентны, за исключением лунок с AMH-1 (3 и 4), которые немного менее интенсивны. Таким образом, этот контроль пройден. На мембране, визуализированной антителом против гистидина (фигура 2B), полосы обнаруживаются в лунках отрицательного контроля. Однако упомянутые лунки содержат лизат клеток, трансфицированных контролем без плазмиды. Это случай неспецифической реактивности антитела против гистидина с некоторыми белками в лизате, которые находятся во всех лунках. Помимо этих неспецифических полос лунки AMH-1, AMH-2, AMH-3 и цельного AMH содержат специфические полосы, то есть полосы, отсутствующие в лунках отрицательного контроля. Эти специфические полосы заключены в прямоугольную рамку на фигуре 2B. Их кажущаяся молекулярная масса для условий нагревания и восстановления составляет приблизительно 20, 30, 55 и 65 кДа, соответственно, для конструкций AMH-1, AMH-2, AMH-3 и цельного AMH (лунки 3, 6, 8, 10). Кажущаяся молекулярная масса для условий нагревания без восстановления составляет приблизительно 36, 50, 100 и 120 кДа, соответственно, для конструкций AMH-1, AMH-2, AMH-3 и цельного AMH (лунки 4, 7, 9, 11). Эти оценки молекулярной массы соответствуют димеризации конструкций AMH в условиях без восстановления. Важно отметить, что димеризация также происходит в отсутствие зрелой области и несмотря на значительные случайные C-концевые усечения в конструкциях AMH-1 и AMH-2.

В заключение, этот анализ с помощью вестерн-блоттинга показывает, что плазмидные конструкции AMH-1, AMH-2, AMH-3 и цельного AMH явно позволяют экспрессировать белки, содержащие гистидиновую метку, кажущаяся молекулярная масса которых соответствуют ожидаемым молекулярным массам в соответствии с нуклеотидными последовательностями.

Пример 2: стабильная экспрессия белка AMH в клетках CHO и очистка

Стабильный клон рекомбинантных клеток CHO (яичника китайского хомячка), экспрессирующих цельный AMH, получали с использованием набора cGPS CHO-Sa CEMAX от Cellectis (кат. № CHOSa-0011-05 и CHOSa-0011-10) в соответствии с прилагаемым протоколом. Этот набор обеспечивает целевую внутрихромосомную интеграцию экзогенного гена в клетках CHO. Он состоит из клеточной линии cGPS CHO-Sa (адгезивные клетки), интегративного вектора, в который клонируется представляющий интерес ген, вектора, постоянно экспрессирующего мегануклеазу I-Sce I, и набора реагентов для трансфекции TransMessenger^TM (Qiagen, кат. № 301525). Генетически модифицированная клеточная линия cGPS CHO-Sa отличается тем, что содержит в своем геноме большой и уникальный специфический сайт, распознаваемый мегануклеазой I-Sce I, которая обладает эндонуклеазной активностью.

2.1. Клонирование

Синтетический ген, кодирующий цельный белок человеческого AMH (а.к. 1-560), связанный с C-концевой меткой из 8 гистидинов, был заказан в компании Geneart. Ген оптимизировали для экспрессии в хозяине CHO. Этот ген AMH клонировали в интегративный вектор pIM.LP2.Zeo, продаваемый Cellectis, между сайтами Eco RI и Not I под контролем промотора CMV. Интеграционный вектор pIM.LP2.Zeo отличается содержанием 2 областей, которые гомологичны, соответственно, областям выше и ниже уникального сайта, распознаваемого мегануклеазой I-Sce I в геноме CHO. Эти 2 конкретных области обрамляют сайт множественного клонирования, в который вставлен ген, кодирующий AMH. Кроме того, эта интегративная плазмида дает трансфицированным клеткам CHO 2 селективных преимущества. Первым является ген резистентности к зеоцину, контролируемый промотором CMV. Вторым является ген резистентности к неомицину, контролируемый промотором SV40. Этот ген также обеспечивает резистентность к генетицину (G418), антибиотику, близкому к неомицину.

2.2. Трансфекция

За один день до трансфекции (D-1) высевают по 2×10⁵ адгезивных клеток cGPS CHO-Sa CEMAX на чашку Петри 10 см в среде F-12K, дополненной L-глутамином 2 мМ, пенициллином (100 МЕ/мл), стрептомицином (100 мкг/мл), амфотерицином B (Fongizone) (0,25 мкг/мл) и 10% фетальной телячьей сыворотки.

В день трансфекции (D) 1 мкг интегративного вектора (pIM.LP2.Zeo), содержащего ген AMH и 1 мкг мРНК мегануклеазы, разводят в буфере EC-R (доступном в наборе реагентов для трансфекции TransMessenger^TM). Затем добавляют 4 мкл реагента Enhancer [отношение нуклеиновая кислота (мг)/Enhancer (мл)=1/2]. Общий объем реакции должен составлять 100 мкл. Затем раствор инкубируют в течение 5 минут при температуре окружающей среды. Затем добавляют 16 мкл реагента TransMessenger^TM, и затем всю смесь инкубируют в течение 10 минут при +18/25°C, перед тем, как нанести ее на 2×10⁵ клеток, культуральную среду которых заранее заменили на 900 мкл среды F-12k без сыворотки и антибиотиков.

2.3 Отбор клонов и определение характеристик клонов

Рекомбинантные клоны AMH отбирали в соответствии с их резистентностью к зеоцину и генетицину (G418).

Через 24 ч после трансфекции (D+1) культуральную среду заменяют на 10 мл полной среды, дополненной 0,6 мг/мл G418, затем, начиная с 6-го дня (D+6), культуральную среду регулярно заменяют свежей средой, дополненной 0,6 мг/мл G418 и 0,4 мг/мл зеоцина. Через 15 дней после трансфекции (D+15) клетки выделяют путем предельных разведений в 96-луночном планшете. После этого клонирования клеток клоны амплифицируют путем культивирования и затем тестируют:

- с помощью ПЦР на геномной ДНК, экстрагированной из клеток CHO, с использованием праймеров, специфичных для 5' и 3'-концов гена AMH,

- с помощью вестерн-блоттинга для верификации экспрессии белка AMH.

Среди клонов, положительных как в ПЦР, так и в вестерн-блоттинге, выбрали клон AMH5 3F1. Для этого клона продукт ПЦР, полученный путем амплификации гена AMH, полностью секвенировали для верификации целостности гена и обеспечения того, что во время отбора не были внесены мутации.

2.4. Экспрессия рекомбинантного AMH с использованием стабильного клона CHO-AMH5 3F1

Клон AMH5 3F1 культивируют в культуральной чашке 225 см² в количестве 9×10⁶ клеток в 60 мл культуральной среды Excell 302 (Sigma, кат. № 4324C), дополненной 1% об/об антибиотиков и противогрибковых средств (Gibco, кат. № 15240), 12 мМ L-глутамина (Gibco кат. № 25030), 6 г/л глюкозы (Sigma, кат. № G8769), 0,4 мМ цитрата железа (Sigma, кат. № F6129), 2% гипоксантина-тимидина (Gibco, кат. № 41065), 1% глицерина и 1 мг/л пепстатина A (Sigma, кат. № P4265). Культуральные чашки инкубируют в инкубаторе при 37°C в атмосфере 7,5% CO₂. Через 4 дня культивирования (амплификации) полученную клеточную суспензию (приблизительно 66×10⁶ клеток) повторно высевают в 7 культуральных чашек F225 в соответствии с те же протоколом. Супернатанты этих культур собирают, затем центрифугируют при 5000 g и замораживают при -25°C до очистки.

2.5. Очистка рекомбинантного белка AMH CHO-AMH5 3F1

Культуральные супернатанты, собранные ранее, оттаивают и объединяют. Затем объем супернатанта 5 литров фильтруют на мембране 0,8 мкм (Nalgene, VWR, кат. № 7345084), а затем на мембране 0,22 мкм (Nalgene aPES Rapid Flow). Затем образец концентрируют в 20 раз на полом волокне с порогом отсечения 30 кДа (GE, кат. № 564110-18). Приблизительно 100 мл ретентата затем подвергают диафильтрации против своего 5-кратного объема с помощью 50 мМ калий-натрий-фосфатного буфера, pH7,8, содержащего 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,9 г/л азида. Добавляют две таблетки с ингибиторами протеаз без ЭДТА Complete (Roche, кат. № 11 873 580 001). Этот ретентат очищают с помощью аффинной хроматографии на колонке с сефарозой Hi-trap NHS, связанной с (поликлональным или моноклональным) антителом против AMH в соотношении 10 мг антитела на мл геля, в соответствии с протоколом поставщика (GE, кат. № 17-0716-01). Аффинную колонку уравновешивают в диафильтрационном буфере, затем в колонку вводят 50 мл ретентата на скорости 0,5 мл/мин. Затем проводят промывание в 50 мМ Tris HCl буфере, pH 7,9, содержащем 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА. Затем проводят элюирование белка AMH с помощью 0,1 M буфера глицин-HCl, pH 2,9, на скорости 0,5 мл/мин. Собранные фракции элюирования немедленно нейтрализуют до pH 7-8, добавляют туда ингибиторы протеаз, и фракции объединяют и хранят при -80°C в буфере для хранения 0,2 M NaHCO₃, содержащем 0,5 M NaCl, pH 7,5, и 20% этанола. На фигуре 4 приведена фотография мембраны после анализа рекомбинантного белка AMH CHO-AMH5 3F1 в ДСН-ПААГ в соответствии с протоколом примера 1.3. Вместо вестерн-блоттинга общий белок окрашивали нитратом серебра. Очищенный белок оказался очень чистым.

Пример 3: Получение антител против AMH настоящего изобретения путем иммунизации мышей

3.1. Иммуногены

Плазмиды с цельным AMH и AMH-3, полученные в примере 1, амплифицировали путем культивирования в бактерии E. Coli, затем очищали с использованием набора EndoFree Plasmid Mega от Qiagen (кат. № 12381) или эквивалентного набора. Для получения картриджей Gene Gun (Bio-Rad) 2 мкг плазмидной ДНК осаждали на 0,22 мг золотых гранул диаметром 1 мкм в присутствии CaCl₂ и спермидина в соответствии с инструкциями поставщика. Полученные таким образом гранулы можно хранить при +2/8°C в темноте в присутствии поглотителя влаги (пакетика с десикантом).

Рекомбинантный белок AMH CHO-AMH5 3F1, полученный в примере 2, смешивали в равных объемах с адъювантом Фрейнда (Sigma), приготовленным в форме эмульсии вода-в-масле, о котором известно, что он обладает хорошей адъювантной способностью. Это получение проводили непосредственно перед каждой инъекцией.

3.2. Иммунизации

Эксперименты по иммунизации проводили на самках мышей BALB/c (H-2^d) в возрасте от шести до восьми недель на момент первой иммунизации. Выполняли различные протоколы:

- 4 дозы по 4 мкг на инъекцию ДНК цельного AMH на 0, 2, 4 и 6 неделю,

- 4 дозы по 4 мкг на инъекцию ДНК AMH-2 на 0, 2, 4 и 6 неделю,

- 4 дозы по 4 мкг на инъекцию ДНК AMH-3 на 0, 2, 4 и 6 неделю,

- 3 дозы по 10 мкг на инъекцию белка AMH на 0, 2, и 4 неделю.

Для иммунизаций ДНК мышам брили живот. Для инъецирования покрытых ДНК золотых гранул в кожу мышей использовали систему доставки Helios Gene Gun (Bio-Rad) при давлении 2750 кПа. Для иммунизаций белком инъекцию проводили подкожно.

Для контроля появления антител у мышей регулярно брали образцы крови. Присутствие антител против AMH в этих сыворотках проверяли с помощью ELISA на 96-луночном микропланшете. Рекомбинантный белок AMH CHO-AMH5 3F1 использовали в режиме захвата (1 мкг на лунку); после насыщения этот антиген реагировал с различными разведениями тестируемых сывороток (инкубация при 37°C в течение 1 ч). Антитела против AMH, присутствующие в сыворотке, выявляли с использованием козьего антимышиного IgG антитела AffiniPure, конъюгированного с щелочным фосфатом (H+L, Jacskon Immunoresearch, кат. № 115-055-146), которое связывается с искомым антителом (0,1 мкг на лунку). Таким образом среди иммунизированных мышей идентифицировали мышей, у которых выработались антитела против AMH.

Между 50 и 70 днями после первых инъекций мышей, у которых появился гуморальный ответ на AMH, повторно стимулировали путем внутривенной инъекции 100 мкг белка AMH.

3.3. Получение гибридом

Через три дня после этой последней инъекции отвечающих мышей умерщвляли: удаляли кровь и селезенку. Спленоциты, полученные из селезенки, культивировали с клетками миеломы Sp2/0-Ag14, чтобы они слились и стали бессмертными, в соответствии с протоколом, описанным Kohler и Milstein (Kohler and Milstein 1975, Kohler et al., 1976). После периода культивирования 12-14 дней супернатанты полученных гибридом подвергали скринингу для определения присутствия антител против AMH с использованием ELISA-анализа, описанного в предыдущем разделе.

3.4. Отбор супернатантов гибридом, распознающих область 157-255 или область 256-451 человеческого белка AMH

Кроличье антитело против 6-гистидина (Sigma Aldrich, кат. № SAB4301134, или эквивалент) разводили в 1X ФСБ и адсорбировали на 96-луночном микротитровальном планшете в количестве 1 мкг на лунку путем инкубации в течение ночи при +18/25°C. Затем планшет промывали 3 раза в буфере ФСБ-0,05% Tween 20 (ФСБ-T), затем пассивировали путем инкубации в буфере ФСБ-T, содержащем 10 г/л БСА, и снова промывали 3 раза в буфере ФСБ-T.

Лизаты, полученные в примере 1 и сохраненные при -80°C, размораживали и разводили от 1/2 до 1/10 в буфере 1X ФСБ. 100 мкл каждого из лизатов (отрицательный контроль, AMH-1, AMH-2, AMH-3 и цельный AMH) распределяли по нескольким лункам планшета и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. Затем планшет опорожняли и промывали 4 раза в буфере ФСБ-T, содержащем 300 мМ NaCl. Затем добавляли супернатанты гибридом, подлежащих тестированию (100 мкл), в каждый из 5 различных лизатов и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. После следующего этапа из 4 промываний в ФСБ-T, содержащем 300 мМ NaCl, добавляли вторичное антитело, которое представляет собой антимышиный IgG AffiniPure, продуцируемый в козах, конъюгированное с пероксидазой (H+L, Jacskon Immunoresearch, кат. № 115-035-166). После следующего этапа из 3 промываний в ФСБ-T, содержащем 300 мМ NaCl, реакцию визуализировали путем инкубирования планшета в течение 10 мин при +18/25°C в присутствии субстрата SureBlue™ TMB Microwell Peroxidase (KLP, кат. № 52-00-01). Планшет считывали путем измерения OD на 450 и 630 нм.

Отбор супернатантов гибридом, распознающих область 157-255. Из результатов ELISA отбирали гибридомы, супернатанты которых содержат антитела, которые распознают лизат AMH-2 и не распознают лизат AMH-1. Конечно, лизаты AMH-3 и цельного AMH также распознаются супернатантами отобранных гибридом. Таким образом были отобраны гибридомы 5G5 1B11.

Отбор супернатантов гибридом, распознающих область 256-451. Из результатов ELISA отбирали гибридомы, супернатанты которых содержат антитела, которые распознают лизат AMH-3 и не распознают лизат AMH-2 или лизат AMH-1. Конечно, лизат целого AMH также распознается супернатантами отобранных гибридом. Таким образом были отобраны гибридомы 3H8, 4C7 и 4G10.

После отбора отобранные гибридомы клонировали в соответствии с методом предельного разведения, хорошо известным специалистам в данной области техники, для уверенности в клональности. Таким образом, оказалось возможным получить моноклональные гибридомы, секретирующие следующие антитела против AMH:

- 5G5A10 и 1B11B1, которые распознают область 157-255 человеческого AMH,

- 3H8E2, 4C7E12 и 4G10E12, которые распознают область 256-451 человеческого AMH.

Масштабное производство моноклональных антител проводили путем культивирования гибридом в биореакторе miniPERM™ в соответствии с протоколом из публикации Falkenberg (1998). Затем моноклональные антитела очищали от культурального супернатанта с помощью аффинной хроматографии на белке A.

Пример 4: Отбор моноклональных антител против AMH, распознающих нелинейные эпитопы

Среди моноклональных антител, полученных в примере 3, определяли те, которые направлены на линейные эпитопы, для того чтобы отобрать те, которые распознают нелинейные эпитопы. Для этого синтезировали 80 синтетических пептидов, охватывающих всю аминокислотную последовательность человеческого AMH. Связывание антител с каждым из этих пептидов тестировали с помощью ELISA.

4.1. Синтез пептидов

Синтезировали 80 пептидов из 16 аминокислот. Из 16 аминокислот 12 соответствуют последовательности AMH и перекрываются на 5 аминокислот, тем самым охватывая всю последовательность человеческого AMH (аминокислоты 1-560). Биотин, а затем последовательность SGSG (спейсерную ножку) добавляли к N-концевой области для облегчения анализа этих пептидов с помощью ELISA. Эти пептиды не очищены и находятся в растворе (вода/ацетонитрил). Их верифицировали с помощью LC/MS масс-спектрометрии. Синтезированные последовательности представлены в таблице 6.

Таблица 6. Последовательности пептидов человеческого AMH

№ пептида	Пептид AMH (SEQ ID №)	Положения	Общая последовательность
1	MRDLPLTSLALV (SEQ ID NO:90)	1-12	Bio-SGSG-MRDLPLTSLALV-амид
2	SLALVLSALGAL (SEQ ID NO:91)	8-19	Bio-SGSG-SLALVLSALGAL-амид
3	ALGALLGTEALR (SEQ ID NO:92)	15-26	Bio-SGSG-ALGALLGTEALR-амид
4	TEALRAEEPAVG (SEQ ID NO:93)	22-33	Bio-SGSG-TEALRAEEPAVG-амид
5	EPAVGTSGLIFR (SEQ ID NO:94)	29-40	Bio-SGSG-EPAVGTSGLIFR-амид
6	GLIFREDLDWPP (SEQ ID NO:95)	36-47	Bio-SGSG-GLIFREDLDWPP-амид
7	LDWPPGSPQEPL (SEQ ID NO:96)	43-54	Bio-SGSG-LDWPPGSPQEPL-амид
8	PQEPLCLVALGG (SEQ ID NO:97)	50-61	Bio-SGSG-PQEPLCLVALGG-амид
9	VALGGDSNGSSS (SEQ ID NO:98)	57-68	Bio-SGSG-VALGGDSNGSSS-амид
10	NGSSSPLRVVGA (SEQ ID NO:99)	64-75	Bio-SGSG-NGSSSPLRVVGA-амид
11	RVVGALSAYEQA (SEQ ID NO:100)	71-82	Bio-SGSG-RVVGALSAYEQA-амид
12	AYEQAFLGAVQR (SEQ ID NO:101)	78-89	Bio-SGSG-AYEQAFLGAVQR-амид
13	GAVQRARWGPRD (SEQ ID NO:102)	85-96	Bio-SGSG-GAVQRARWGPRD-амид
14	WGPRDLATFGVC (SEQ ID NO:103)	92-103	Bio-SGSG-WGPRDLATFGVC-амид
15	TFGVCNTGDRQA (SEQ ID NO:104)	99-110	Bio-SGSG-TFGVCNTGDRQA-амид
16	GDRQAALPSLRR (SEQ ID NO:105)	106-117	Bio-SGSG-GDRQAALPSLRR-амид
17	PSLRRLGAWLRD (SEQ ID NO:106)	113-124	Bio-SGSG-PSLRRLGAWLRD-амид
18	AWLRDPGGQRLV (SEQ ID NO:107)	120-131	Bio-SGSG-AWLRDPGGQRLV-амид
19	GQRLVVLHLEEV (SEQ ID NO:108)	127-138	Bio-SGSG-GQRLVVLHLEEV-амид
20	HLEEVTWEPTPS (SEQ ID NO:109)	134-145	Bio-SGSG-HLEEVTWEPTPS-амид
21	EPTPSLRFQEPP (SEQ ID NO:110)	141-152	Bio-SGSG-EPTPSLRFQEPP-амид
22	FQEPPPGGAGPP (SEQ ID NO:111)	148-159	Bio-SGSG-FQEPPPGGAGPP-амид
23	GAGPPELALLVL (SEQ ID NO:112)	155-166	Bio-SGSG-GAGPPELALLVL-амид
24	ALLVLYPGPGPE (SEQ ID NO:113)	162-173	Bio-SGSG-ALLVLYPGPGPE-амид
25	GPGPEVTVTRAG (SEQ ID NO:114)	169-180	Bio-SGSG-GPGPEVTVTRAG-амид
26	VTRAGLPGAQSL (SEQ ID NO:115)	176-187	Bio-SGSG-VTRAGLPGAQSL-амид
27	GAQSLCPSRDTR (SEQ ID NO:116)	183-194	Bio-SGSG-GAQSLCPSRDTR-амид
28	SRDTRYLVLAVD (SEQ ID NO:117)	190-201	Bio-SGSG-SRDTRYLVLAVD-амид
29	VLAVDRPAGAWR (SEQ ID NO:45)	197-208	Bio-SGSG-VLAVDRPAGAWR-амид
30	AGAWRGSGLALT (SEQ ID NO:118)	204-215	Bio-SGSG-AGAWRGSGLALT-амид
31	GLALTLQPRGED (SEQ ID NO:119)	211-222	Bio-SGSG-GLALTLQPRGED-амид
32	PRGEDSRLSTAR (SEQ ID NO:46)	218-229	Bio-SGSG-PRGEDSRLSTAR-амид
33	LSTARLQALLFG (SEQ ID NO:120)	225-236	Bio-SGSG-LSTARLQALLFG-амид
34	ALLFGDDHRCFT (SEQ ID NO:121)	232-243	Bio-SGSG-ALLFGDDHRCFT-амид
35	HRCFTRMTPALL (SEQ ID NO:47)	239-250	Bio-SGSG-HRCFTRMTPALL-амид
36	TPALLLLPRSEP (SEQ ID NO:122)	246-257	Bio-SGSG-TPALLLLPRSEP-амид
37	PRSEPAPLPAHG (SEQ ID NO:123)	253-264	Bio-SGSG-PRSEPAPLPAHG-амид
38	LPAHGQLDTVPF (SEQ ID NO:61)	260-271	Bio-SGSG-LPAHGQLDTVPF-амид
39	DTVPFPPPRPSA (SEQ ID NO:124)	267-278	Bio-SGSG-DTVPFPPPRPSA-амид
40	PRPSAELEESPP (SEQ ID NO:125)	274-285	Bio-SGSG-PRPSAELEESPP-амид
41	EESPPSADPFLE (SEQ ID NO:126)	281-292	Bio-SGSG-EESPPSADPFLE-амид
42	DPFLETLTRLVR (SEQ ID NO:127)	288-299	Bio-SGSG-DPFLETLTRLVR-амид
43	TRLVRALRVPPA (SEQ ID NO:128)	295-306	Bio-SGSG-TRLVRALRVPPA-амид
44	RVPPARASAPRL (SEQ ID NO:129)	302-313	Bio-SGSG-RVPPARASAPRL-амид
45	SAPRLALDPDAL (SEQ ID NO:130)	309-320	Bio-SGSG-SAPRLALDPDAL-амид
46	DPDALAGFPQGL (SEQ ID NO:131)	316-327	Bio-SGSG-DPDALAGFPQGL-амид
47	FPQGLVNLSDPA (SEQ ID NO:132)	323-334	Bio-SGSG-FPQGLVNLSDPA-амид
48	LSDPAALERLLD (SEQ ID NO:62)	330-341	Bio-SGSG-LSDPAALERLLD-амид
49	ERLLDGEEPLLL (SEQ ID NO:63)	337-348	Bio-SGSG-ERLLDGEEPLLL-амид
50	EPLLLLLRPTAA (SEQ ID NO:64)	344-355	Bio-SGSG-EPLLLLLRPTAA-амид
51	RPTAATTGDPAP (SEQ ID NO:133)	351-362	Bio-SGSG-RPTAATTGDPAP-амид
52	GDPAPLHDPTSA (SEQ ID NO:65)	358-369	Bio-SGSG-GDPAPLHDPTSA-амид
53	DPTSAPWATALA (SEQ ID NO:66)	365-376	Bio-SGSG-DPTSAPWATALA-амид
54	ATALARRVAAEL (SEQ ID NO:134)	372-383	Bio-SGSG-ATALARRVAAEL-амид
55	VAAELQAAAAEL (SEQ ID NO:135)	379-390	Bio-SGSG-VAAELQAAAAEL-амид
56	AAAELRSLPGLP (SEQ ID NO:136)	386-397	Bio-SGSG-AAAELRSLPGLP-амид
57	LPGLPPATAPLL (SEQ ID NO:137)	393-404	Bio-SGSG-LPGLPPATAPLL-амид
58	TAPLLARLLALC (SEQ ID NO:138)	400-411	Bio-SGSG-TAPLLARLLALC-амид
59	LLALCPGGPGGL (SEQ ID NO:139)	407-418	Bio-SGSG-LLALCPGGPGGL-амид
60	GPGGLGDPLRAL (SEQ ID NO:140)	414-425	Bio-SGSG-GPGGLGDPLRAL-амид
61	PLRALLLLKALQ (SEQ ID NO:141)	421-432	Bio-SGSG-PLRALLLLKALQ-амид
62	LKALQGLRVEWR (SEQ ID NO:67)	428-439	Bio-SGSG-LKALQGLRVEWR-амид
63	RVEWRGRDPRGP (SEQ ID NO:68)	435-446	Bio-SGSG-RVEWRGRDPRGP-амид
64	DPRGPGRAQRSA (SEQ ID NO:142)	442-453	Bio-SGSG-DPRGPGRAQRSA-амид
65	AQRSAGATAADG (SEQ ID NO:143)	449-460	Bio-SGSG-AQRSAGATAADG-амид
66	TAADGPCALREL (SEQ ID NO:144)	456-467	Bio-SGSG-TAADGPCALREL-амид
67	ALRELSVDLRAE (SEQ ID NO:145)	463-474	Bio-SGSG-ALRELSVDLRAE-амид
68	DLRAERSVLIPE (SEQ ID NO:146)	470-481	Bio-SGSG-DLRAERSVLIPE-амид
69	VLIPETYQANNC (SEQ ID NO:147)	477-488	Bio-SGSG-VLIPETYQANNC-амид
70	QANNCQGVCGWP (SEQ ID NO:148)	484-495	Bio-SGSG-QANNCQGVCGWP-амид
71	VCGWPQSDRNPR (SEQ ID NO:149)	491-502	Bio-SGSG-VCGWPQSDRNPR-амид
72	DRNPRYGNHVVL (SEQ ID NO:150)	498-509	Bio-SGSG-DRNPRYGNHVVL-амид
73	NHVVLLLKMQVR (SEQ ID NO:151)	505-516	Bio-SGSG-NHVVLLLKMQVR-амид
74	KMQVRGAALARP (SEQ ID NO:152)	512-523	Bio-SGSG-KMQVRGAALARP-амид
75	ALARPPCCVPTA (SEQ ID NO:153)	519-530	Bio-SGSG-ALARPPCCVPTA-амид
76	CVPTAYAGKLLI (SEQ ID NO:154)	526-537	Bio-SGSG-CVPTAYAGKLLI-амид
77	GKLLISLSEERI (SEQ ID NO:155)	533-544	Bio-SGSG-GKLLISLSEERI-амид
78	SEERISAHHVPN (SEQ ID NO:156)	540-551	Bio-SGSG-SEERISAHHVPN-амид
79	HHVPNMVATECG (SEQ ID NO:157)	547-558	Bio-SGSG-HHVPNMVATECG-амид
80	VPNMVATECGCR (SEQ ID NO:158)	549-560	Bio-SGSG-VPNMVATECGCR-амид

4.2. ELISA

96-луночные микропланшеты покрывают стрептавидином (10 мкг/мл, 1 мкг на лунку) в буфере 1X ФСБ в течение 1 ч при 37°C и затем пассивируют в буфере ФСБ-0,05% Tween 20 (ФСБ-T), содержащем 10 г/л БСА в течение ночи при температуре окружающей среды. Пассивирующий раствор удаляют, затем вносят биотинилированные пептиды (10 мкг/мл в буфере 1X ФСБ, 1 мкг на лунку) и инкубируют в течение 1 ч при 37°C. После 4 промываний в ФСБ-T добавляют подлежащее тестированию моноклональное антитело в концентрации 1 мкг/мл. После инкубации в течение 1 ч 30 мин при 37°C и 4 промываний ФСБ-T добавляют конъюгированное с пероксидазой антимышиное IgG антитело. Визуализацию проводят с помощью субстрата TMB с измерением оптической плотности (OD) на 450 нм.

Для валидации формата ELISA в качестве положительного контроля использовали коммерческое антитело против AMH. Оно представляет собой клон AA011 от компании AnshLabs. Это антитело специфически распознает пептид 52 (SEQ ID NO:137), полученный OD сигнал больше 1. Среди 5 моноклональных антител, полученных в примере 3, клон 4C7E12 также распознает пептид 52. Таким образом, клон 4C7E12 распознает тот же эпитоп, что и клон AA011. Его не оставили. Моноклональные антитела 5G5A10, 1B11B1, 3H8E2 и 4G10E12 не распознают ни один из 80 протестированных пептидов AMH. Таким образом, их эпитопы нелинейны. Именно эти четыре нелинейных антитела 5G5A10, 1B11B1, 3H8E2 и 4G10E12 были отобраны для разработки способа количественного определения белка AMH в биологических образцах.

Пример 5: Определение характеристик антител против AMH 5G5A10, 1B11B1, 3H8E2 и 4G10E12

5.1. Сравнение захватывающей способности антител против AMH 5G5A10, 1B11B1, 3H8E2 и 4G10E12 с помощью ELISA

Захватывающие антитела (5G5A10, 1B11B1, 3H8E2 и 4G10E12), разведенные до 5 мкг/мл в 200 мМ Tris, pH 6,2, вносят в 96-луночный микротитровальный планшет в количестве 0,5 мкг на лунку и инкубируют в течение 1 ч 30 мин при 37°C. Затем планшет промывают 3 раза в буфере ФСБ-0,05% Tween 20 (ФСБ-T), затем пассивируют в течение 2 ч путем инкубации в буфере ФСБ-T, содержащем 10 г/л БСА, и снова промывают 3 раза в буфере ФСБ-T.

Лизаты, полученные в примере 1 и сохраненные при -80°C, размораживают и разводят до 1/20 в 1X ФСБ. Отмеряют по 100 мкл каждого из лизатов (отрицательный контроль, AMH-1, AMH-2, AMH-3 и цельный AMH) и инкубируют в течение ночи при 37°C. Затем планшет опорожняют и промывают 4 раза в буфере ФСБ-T, содержащем 300 мМ NaCl. Вносят биотинилированное антитело против гистидина (Qiagen, кат. № 34440), разведенное до 1/1000 в пассивационном буфере, и затем инкубируют в течение 1 ч 30 мин при 37°C. Планшет снова промывают 3 раза перед инкубацией с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза (Jackson Immunoresearch, кат. № 016-030-034), разведенным до 1/2000 в пассивационном буфере, в течение 1 ч 30 при 37°C. После следующего этапа из 3 промываний в ФСБ-T реакцию визуализируют путем инкубирования планшета в течение 10 мин при +18/25°C в присутствии субстрата SureBlue™ TMB Microwell Peroxidase (KLP, кат. № 52-00-01). Планшет считывают путем измерения OD на 450 и 630 нм.

Полученные результаты представлены в таблице 7. Значения OD, измеренные для отрицательного контроля, которым являются ФСБ и лизат, трансфицированный без плазмиды, составляют не более 0,28, что соответствует неспецифическому сигналу.

Таблица 7. Захватывающая способность антител против AMH (значения OD_{450 нм})

	Ab 1B11B1	Ab 5G5A10	Ab 3H8E2	Ab 4G10E12
Отр. контроль ФСБ	0,129	0,141	0,196	0,246	0,137	0,132	0,178	0,122
Отр. контроль лизат	0,199	0,189	0,210	0,223	0,165	0,159	0,168	0,281
Лизат AMH-1	0,221	0,236	0,257	0,266	0,244	0,198	0,218	0,203
Лизат AMH-2	4,244	4,246	4,316	4,191	0,176	0,197	0,184	0,168
Лизат AMH-3	3,683	3,774	3,186	3,365	1,859	1,815	1,801	1,622
Лизат цельного AMH	3,184	3,351	3,296	3,360	1,667	1,711	2,132	1,812

Результаты в таблице 7 показывают, что антитела 1B11B1 и 5G5A10 захватывают лизаты AMH-2, AMH-3 и цельного AMH (OD>3). Антитела 3H8E2 и 4G10E12 захватывают лизаты AMH-3 и цельного AMH (OD>1,6). Лизат AMH-1 (аминокислоты 1-156) не захватывается ни одним из протестированных моноклональных антител.

Кроме того, антитела 1B11B1 и 5G5A10, которые распознают область 157-255 человеческого белка AMH, обладают большей захватывающей способностью, чем антитела 3H8E2 и 4G10E12, которые распознают область 256-451. Действительно, в случае распознавания (затененные значения в таблице 2) для любого отдельного лизата значения OD, полученные с антителами 1B11B1 и 5G5A10, выше, чем полученные с антителами 3H8E2 и 4G10E12. Поэтому целесообразно преимущественно использовать в режиме захвата антитело 1B11B1 или антитело 5G5A10.

5.2. Определение характеристик по вестерн-блоттингу

Для того чтобы лучше охарактеризовать реактивность моноклональных антител против AMH, провели анализы с помощью вестерн-блоттинга.

Очистка белка. Трансфекции осуществляли в соответствии с протоколом примера 1 с плазмидами, кодирующими конструкции AMH-2 и AMH-3, а также с отрицательным контролем (без плазмиды). Получали культуральные супернатанты, и белки AMH, которые в них обнаруживали, очищали с помощью периодической металл-хелатной аффинной хроматографии в соответствии с их полигистидиновыми метками. Для этого супернатанты от трансфекций инкубировали в течение ночи при +2/8°C при перемешивании со смолой Ni-NTA (Roche, кат. № 115-26-70), уравновешенной в 11 мМ фосфатном буфере, содержащем 260 мМ NaCl, pH 7,4. Затем смолу извлекали центрифугированием в течение 3 мин при 3000 g, и удаляли супернатант, содержащий неабсорбированный материал. После 3 промываний уравновешивающим буфером белок элюировали 5,5 мМ фосфатным буфером, содержащим 130 мМ NaCl, pH 7,4, и содержащим 500 мМ имидазола и ингибиторы протеаз, pH которого доводили 7,6. Элюирование проводили путем инкубации при +2/8°C при перемешивании в течение ночи. Затем собирали супернатант, содержащий AMH, после центрифугирования смолы в течение 3 минут при 3000 g. Этот этап очистки необходим для того, чтобы сконцентрировать белки AMH, и, особенно, чтобы удалить большие количества БСА, присутствующего в супернатантах, нарушающие миграцию гелей ДСН-ПААГ.

Вестерн-блоттинг. Этот анализ проводили в соответствии с протоколом, описанным в примере 1, раздел 1.3, или с использованием антитела против гистидина, или с его заменой на антитело против AMH (1 мкг на мембрану).

Результаты. Результаты этого анализа представлены на фигуре 3. Образцы анализировали после нагревания, но без восстановления. Два очищенных белка AMH-2 и AMH-3 обнаруживаются на мембране, визуализированной с помощью антитела против гистидина (фигура 3A), и в лунке отрицательного контроля, как и ожидалось, реактивности не наблюдается. Среди протестированных антител против AMH все распознают белок AMH-3, но только клон 1B11B1 также распознает белок AMH-2 с гораздо более низкой реактивностью, чем в отношении AMH-3. Для клонов 4G10E12 и 3H8E2 этот результат согласуется с результатами, полученными с помощью ELISA. Действительно, связывающая зона этих антител расположена в области 256-451 AMH, которой нет в конструкции AMH-2. По ELISA клоны 1B11B1 и 5C5A10 проявляют сходную реактивность и хорошо распознают AMH-2 и AMH-3. По вестерн-блоттингу антитело 1B11B10 дает сильный сигнал с AMH-3, тогда как сигнал, полученный с AMH-2, гораздо слабее, хотя белок присутствует в сравнимом количестве, как можно видеть на мембране, визуализированной с помощью анти-His антитела. Из этого можно сделать вывод, что вестерн-блоттинг, который является частично денатурирующим методом, не подходит для изучения антигенности белка AMH-2. Антитело 5G5A10, которое дает очень хорошую реактивность по ELISA, дает слабый сигнал или вообще не дает его при Вестерн-блоттинге. Учитывая его слабое связывание с AMH-3 в условиях эксперимента, нормально не наблюдать никакой реактивности с AMH-2. В целом, этот эксперимент показывает, что вестерн-блоттинг не подходит для изучения распознавания нелинейных антител, которые чувствительны к тепловой денатурации, таких как 5G5A10 или, в определенной степени, 1B11B1. Поэтому анализы, проводимые с помощью вестерн-блоттинга на антителах против AMH в литературе следует интерпретировать с большой осторожностью, и следует по возможности отдавать предпочтение анализам с помощью ELISA, а не с помощью вестерн-блоттинга.

Пример 6: Детектирование AMH с помощью сэндвич-иммуноанализа

В коммерческих наборах AMH наблюдалась значительная разница между концентрациями, полученными для образца, как функция времени, в которое анализ проводился после взятия образца. Такое непостоянство недопустимо в клинической практике, поэтому важно иметь доступный и надежный набор, для которого измеренная концентрация AMH является точной и воспроизводимой, и который позволит хранить образцы до анализа при +2/8°C или при -19/-31°C. Такой анализ проводили путем выбора антитела, направленного против аминокислот 157-255 человеческого AMH.

6.1. Процедура автоматического иммуноанализа

Детектирование AMH в биологических образцах проводили с помощью одностадийного сэндвич-иммуноанализа с использованием устройства для автоматического иммуноанализа VIDAS^® (bioMérieux). Одноразовый наконечник действует в качестве как твердой фазы для реакции, так и ее системы пипетированя. Картридж автоматического устройства состоит из 10 лунок (X0-X9), покрытых герметичной и маркированной алюминиевой фольгой. Первая лунка (X0) содержит часть, которая предварительно разрезана для облегчения введения образца. Последняя лунка (X9) представляет собой оптическую кювету, в которой измеряется флуоресценция субстрата. В промежуточных лунках содержатся различные реагенты, необходимые для анализа. Таким образом, все стадии анализа автоматически выполняются прибором. Они состоят из последовательности циклов всасывания/слива реакционной среды.

Сенсибилизация и пассивация наконечиков. Наконечники сенсибилизировали с помощью 270 мкл раствора моноклонального антитела 5G5A10 для пары C1 или моноклонального антитела 8C5B10H5 для пары C2, оба 7 мкг/мл в Tris-буфере, pH 6,2. После приблизительно 20 ч инкубации при +18/25°C с сенсибилизирующим раствором наконечники опорожняли. Затем добавляли 300 мкл этого же раствора, содержащего 5 г/л бычьего альбумина для пассивации наконечников при +18/25°C в течение приблизительно 20 ч. Затем наконечники опорожняли, сушили, затем хранили при +4°C до использования в сухом месте.

Получение растворов конъюгированных антител. Для пары C1 раствор конъюгата содержит моноклональное антитело 4G10E12 в форме фрагмента Fab', связанное с щелочной фосфатазой. Для пары C2 раствор конъюгата содержит моноклональное антитело 5G5A10, в форме фрагмента Fab', связанное с щелочной фосфатазой. Конъюгированные антитела разводили до приблизительно 0,1 мкг/мл в буфере Tris/NaCl БСА, pH 6,5.

Иммуноанализ. Как только наконечник VIDAS^® приходит в контакт с образцом, начинается иммунологическая реакция, поскольку на этом наконечнике иммобилизованы захватывающие антитела. Автоматическое устройство смешивает подлежащий тестированию образец (89,6 мкл) с 226 мкл раствора конъюгата. Инкубация продолжается приблизительно 10 минут при 37°C и делает возможным специфическое связывание AMH с одной стороны с антителом, адсорбированным на конусе, а с другой стороны с конъюгированным антителом (детектирующим антителом). Несвязанные компоненты затем удаляют с помощью 3 промываний 54 мМ Tris-буфером, pH 7,3, содержащим 154 мМ NaCl и 0,55% Tween 20. Во время заключительного этапа визуализации субстрат 4-метилумбеллиферилфосфат засасывают в наконечник, а затем сливают; фермент конъюгированных антител катализирует реакцию гидролиза этого субстрата до 4-метилумбеллиферона, испускаемую флуоресценцию которого измеряют на 450 нм. Значение сигнала флуоресценции (RFV=относительное значение флуоресценции) пропорционально концентрации антигена, присутствующего в образце.

6.2. Анализ AMH в образцах, которые подвергались различным условиям хранения

Восемь пулов природных образцов от женщин в возрасте от 19 до 52 лет анализировали параллельно с коммерческим набором AMH Gen II Assay (Beckman Coulter) и с двумя парами антител (C1 и C2) на автоматическом устройстве VIDAS^®. Каждый пул образцов состоит из 3 сывороток от женщин, которые получены из Etablissement Français du Sang (EFS) [Французский банк крови] региона Рона-Альпы.

Эти образцы тестировали менее чем через 4 часа после отбора образцов, что соответствует времени T0, затем после 24 часов хранения при +2/8°C, после 7 дней хранения при +2/8°C и после 7 дней хранения при -19/-31°C, что соответствует различным условиям хранения этих образцов.

Для набора в форме микропланшета соответствующие дозы рассчитывали как функцию диапазона, рекомендованного производителем. Затем были рассчитаны отношения доз, полученных для каждого условия хранения, к дозе, полученной при T0. Для автоматического устройства VIDAS^® сигналы флуоресценции (RFV=относительное значение флуоресценции), полученные с каждой из 2 пар антител для каждого условия хранения, использовали для расчета отношений к сигналам флуоресценции, полученным при T0. Полученные результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8: отношение доз или сигналов AMH, полученных после хранения в различных условиях и при T0 (отношение T/T0).

	24 ч. при +2/8°C	7 дней при +2/8°C	7 дней при -19/-31°C
	C1	C2	REF	C1	C2	REF	C1	C2	REF
Пул 001	0,99	1,00	1,10	0,95	1,06	1,14	0,98	0,99	1,20
Пул 002	0,98	1,04	1,27	0,96	1,13	1,20	0,99	1,03	1,30
Пул 003	0,98	1,00	1,14	0,96	1,04	1,05	1,01	1,02	1,07
Пул 004	1,01	0,99	1,58	0,97	1,08	1,57	0,99	1,02	1,73
Пул 005	0,96	1,02	1,46	0,95	1,09	1,33	0,97	1,01	1,24
Пул 006	1,00	1,01	1,35	0,97	1,10	1,40	0,97	0,99	1,35
Пул 007	0,97	1,03	1,43	0,96	1,11	1,66	0,95	1,01	1,51
Пул 008	0,99	1,06	1,34	0,95	1,07	1,34	1,00	1,03	1,35
Среднее	0,99	1,02	1,33	0,96	1,09	1,34	0,98	1,01	1,34
Min	0,96	0,99	1,10	0,95	1,04	1,05	0,95	0,99	1,07
Max	1,01	1,06	1,58	0,97	1,13	1,66	1,01	1,03	1,73

C1: анализ VIDAS^® с 5G5A10 в качестве захватывающего антитела и 4G10E12 в качестве детектирующего антитела; C2: анализ VIDAS^® с 8C5B10H5 в качестве захватывающего антитела и 5G5A10 в качестве детектирующего антитела; REF: анализ с помощью микропланшета AMH Gen II.

Чем ближе отношение T/T0 к 1, тем меньше вариабельность детектируемого количества AMH со временем или в соответствии с условиями хранения. Анализы AMH с использованием пар C1 или C2 всегда дают тот же результат независимо от предыдущих условий хранения образца: отношение T/T0 составляет в среднем 0,99 (C1) и 1,02 (C2), если образец хранился в течение 24 ч при +2/8°C. Эти значения очень близки к 1, тогда как в эталонном наборе среднее соотношение составляет 1,33, что указывает на то, что измеренная доза в среднем умножается на 1,33. Такой же тип наблюдения проводят для других тестируемых условий хранения.

Таким образом, антитело 5G5A10 распознает нелинейный эпитоп зоны 157-255 человеческого AMH, антитело 4G10E12 распознает нелинейный эпитоп зоны 256-451 человеческого AMH, антитело 8C5B10H5 распознает линейный эпитоп (а.к. 508-519 человеческого AMH) в зрелой области AMH, оба антитела набора AMH Gen II Assay направлены на линейные эпитопы зрелой области.

Пары антител C1 и C2 делают возможной разработку иммуноанализов AMH, которые будут надежными, и результат которых не изменяется как функция условий предшествующего хранения образца.

Пример 7: Аналитическая чувствительность AMH VIDAS^®

Аналитическую чувствительность иммуноанализа AMH VIDAS^® (пара C1), описанного в примере 6, сравнивали с чувствительностью предшествующего уровня техники. Для того чтобы иметь возможность сравнивать пары антител в одинаковых условиях, весь эксперимент проводили на автоматическом устройстве VIDAS^®. Наконечники покрывали или антителом 5G5A10 (антитело, распознающее C-концевую часть про-области AMH), или антителом AA012 (коммерческое антитело - AnshLabs) в соответствии с процедурой, описанной в примере 6. Для этапа детектирования сравнивали два конъюгата: антитело 4G10E12 и антитело AA011 (коммерческое антитело - AnshLabs). Оба были конъюгированы с щелочной фосфатазой в соответствии с процедурой примера 6. Конъюгат 4G10E12 использовали в концентрации 180 нг/мл, конъюгат AA011 в концентрации 500 нг/мл. Конъюгат 4G10E12, который распознает C-концевую часть про-области AMH, использовали, таким образом, в гораздо меньшем количестве по сравнению с коммерческим антителом, что совершенно неожиданно.

Стандартный диапазон в пределах от 0,055 до 11 нг/мл AMH получали разведением сывороток, для которых были известны концентрации AMH, в сыворотке женщины в менопаузе (пренебрежимо малая концентрация AMH), затем измеряли с использованием следующих 3 форматов анализа:

Пара C1:	захват 5G5A10+детектирование 4G10E12
Пара AnshLabs:	захват AA012+детектирование AA011
Смешанная пара:	захват 5G5A10+детектирование AA011

Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9. Сравнение сигналов RFV и отношений S/N, полученных с различными парами антител с помощью VIDAS^® для стандартного диапазона

	Сигнал VIDAS RFV		VIDAS RFV/RFV0
Захват	5G5A10	AA012	5G5A10		5G5A10	AA012	5G5A10
Детектирование (конц. нг/мл)	4G10E12 (180)	AA011 (500)	AA011 (500)		4G10E12 (180)	AA011 (500)	AA011 (500)
AMH нг/мл	RFV	RFV	RFV		S/N	S/N	S/N
0	1	45	7
0,055	51	81	53		51	2	8
0,11	92	113	91		92	3	13
0,275	224	209	221		224	5	32
0,9	916	735	910		916	16	130
2,1	2113	1602	2097		2113	36	300
4	3817	2938	3816		3817	65	545
6,3	4839	3915	4891		4839	87	699
8,7	5672	4810	5764		5672	107	823
11	6335	5392	6404		6335	120	915

S/N=отношение "сигнал/шум". Отношение сигнала RFV к сигналу RFV в точке 0 диапазона (без AMH) для данного формата анализа.

Пара C1 (5G5A10 и 4G10E12) демонстрирует отличную динамику сигнала и чрезвычайно низкий фоновый шум (RFV 1 в точке 0). Пара в соответствии с предшествующим уровнем техники AA012 и AA011 демонстрирует худшую динамику сигнала (RFV 5392 для 11 нг/мл вместо RFV 6335 для пары C1) и, особенно, значительный фоновый шум RFV 45. Смешанная пара (5G5A10 и AA011) имеет динамику сигнала, сравнимую с парой C1 (то же захватывающее антитело). Фоновый шум (RFV 7) значительно ниже, чем для пары AA012 и AA011, но остается выше, чем для пары C1. Как можно видеть, с точки зрения отношения сигнал/шум (S/N) аналитически наиболее чувствительным анализом является тот, в котором используют пару C1, за ним идет анализ со смешанной парой, и на последнем месте анализ с парой AnshLabs.

Пример 8: Аналитическая специфичность анализа AMH VIDAS

Аналитическую специфичность анализа AMH VIDAS (пара C1), описанного в примере 6, определяли путем анализа соединений с перекрестной реактивностью. Эти соединения добавляли в излишнем количестве к образцам сывороток, содержащим 1 нг/мл и 4 нг/мл AMH. Результаты этого исследования обобщены в таблице 10:

Таблица 10. Перекрестная реактивность анализа AMH VIDAS^®

Тестируемое соединение	Тестируемая концентрация	% Перекрестной реактивности
Активин A	100 нг/мл	≤ 0,10%
Ингибин A	100 нг/мл	≤ 0,12%
LH	500 МЕ/л	≤ 0,21%
FSH	500 МЕ/л	≤ 0,23%

При тестируемых концентрациях не было обнаружено значительной перекрестной реактивности. Анализ AMH VIDAS демонстрирует превосходную аналитическую специфичность.

Пример 9: Точность анализа AMH VIDAS

Исследование точности анализа AMH VIDAS (пара C1) проводили с использованием панели человеческих образцов, представляющих 5 уровней концентрации диапазона измерения. Для каждого уровня концентрации оценивали повторяемость (точность в пределах серии), внутрисерийную точность и внутрилабораторную точность (внутреннюю межсерийную точность прибора). Значения, полученные во время этого исследования, приведены в таблице 11:

Таблица 11. Точность анализа AMH VIDAS

N (число повторений)	Уровень концентрации (нг/мл)	Повторяемость CV, %	Внутрисерийная точность CV, %	Внутрилабораторная точность CV в %
519	0,22	4,1	6,6	8,3
520	1,08	4,4	8,0	9,9
520	2,99	4,4	7,4	9,8
520	5,45	4,8	7,6	8,9
520	7,37	4,4	8,2	10,6

Как показывает это очень широкое исследование, анализ AMH VIDAS демонстрирует хорошую воспроизводимость: коэффициент вариации (CV) между различными партиями не превышает 11%.

Список литературы

- Arce JC, et al., 2014, Fertility and Sterility, 102(6): 1633-40.

- Boersma YL, Plückthun A, 2011, Curr. Opin. Biotechnol, 22: 849-857.

- Chai J and Howie AF, 2014, European Journal of Cancer, 50(14): 2367-74.

- Dewailly D, et al., 2014, The physiology and clinical utility of anti-Müllerian hormone in women, Human Reproduction Update, 20(3): 370-85.

- Ellington AD and Szostak JW., 1990, Nature, 346: 818-822.

- Falkenberg FW, 1998, Res Immunol 149(6): 560-570.

- Fong SL, et al., 2015, European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 186: 75-9.

- Han X et al., 2014, Hum Reprod, 29(5): 1042-1048.

- Hudson PL et al., 1990, J Clin Endocrinol Metab, 70: 16-22.

- Kelsey TW, et al., 2011, PLoS ONE, 6(7): e22024.

- Kohler G and Milstein C, 1975, Nature, 256: 495-497.

- Kohler G et al., 1976, Eur J Immunol, 6: 292-295.

- Kumar A et al., 2010, J Immunol Methods, 362: 51-59.

- Lee M et al., 1996, J Clin Endocrinol Metab, 81: 571-576.

- Long WQ et al., 2000, J Clin Endocrinol Metab, 85(2): 540-544.

- Lukaszuk K et al., 2014, Hum Reprod, 27(10): 3085-3091.

- Panhurst M.W. et al, 2016, Physiological Reports, 4(9): 1-10.

- Zec I et al., 2011, Biochemia Medica, 21(3):219-30.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> БИОМЕРЬЕ

<120> Способ получения антител против AMH и их применение

<130> ANTIAMH-DK1778

<150> EP16175041.9

<151> 2016-06-17

<160> 158

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 99

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 1

Gly Pro Pro Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro

1 5 10 15

Glu Val Thr Val Thr Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys

20 25 30

Pro Ser Arg Asp Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp Arg Pro Ala

35 40 45

Gly Ala Trp Arg Gly Ser Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly

50 55 60

Glu Asp Ser Arg Leu Ser Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly

65 70 75 80

Asp Asp His Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu

85 90 95

Pro Arg Ser

<210> 2

<211> 560

<212> БЕЛОК

<213> человек

<400> 2

Met Arg Asp Leu Pro Leu Thr Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Gly Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val

20 25 30

Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly

35 40 45

Ser Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn

50 55 60

Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp

85 90 95

Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu

100 105 110

Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln

115 120 125

Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro

130 135 140

Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu

145 150 155 160

Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val

165 170 175

Thr Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp

180 185 190

Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg

195 200 205

Gly Ser Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg

210 215 220

Leu Ser Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Asp Asp His Arg

225 230 235 240

Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Arg Ser Glu

245 250 255

Pro Ala Pro Leu Pro Ala His Gly Gln Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro

260 265 270

Pro Pro Arg Pro Ser Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Pro Ser Ala Asp

275 280 285

Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Val Pro

290 295 300

Pro Ala Arg Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Asp Ala Leu

305 310 315 320

Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu

325 330 335

Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro

340 345 350

Thr Ala Ala Thr Thr Gly Asp Pro Ala Pro Leu His Asp Pro Thr Ser

355 360 365

Ala Pro Trp Ala Thr Ala Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln

370 375 380

Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Thr

385 390 395 400

Ala Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Pro Gly

405 410 415

Gly Leu Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln

420 425 430

Gly Leu Arg Val Glu Trp Arg Gly Arg Asp Pro Arg Gly Pro Gly Arg

435 440 445

Ala Gln Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu

450 455 460

Arg Glu Leu Ser Val Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro

465 470 475 480

Glu Thr Tyr Gln Ala Asn Asn Cys Gln Gly Val Cys Gly Trp Pro Gln

485 490 495

Ser Asp Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys

500 505 510

Met Gln Val Arg Gly Ala Ala Leu Ala Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro

515 520 525

Thr Ala Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile

530 535 540

Ser Ala His His Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

545 550 555 560

<210> 3

<211> 542

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 3

Leu Leu Gly Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val Gly Thr

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro

20 25 30

Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn Gly Ser

35 40 45

Ser Ser Pro Leu Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Ala

50 55 60

Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp Leu Ala

65 70 75 80

Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu Pro Ser

85 90 95

Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln Arg Leu

100 105 110

Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu

115 120 125

Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu Leu Ala

130 135 140

Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Arg

145 150 155 160

Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp Thr Arg

165 170 175

Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg Gly Ser

180 185 190

Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg Leu Ser

195 200 205

Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Asp Asp His Arg Cys Phe

210 215 220

Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Arg Ser Glu Pro Ala

225 230 235 240

Pro Leu Pro Ala His Gly Gln Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro Pro Pro

245 250 255

Arg Pro Ser Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe

260 265 270

Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Val Pro Pro Ala

275 280 285

Arg Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Asp Ala Leu Ala Gly

290 295 300

Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg

305 310 315 320

Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Thr Ala

325 330 335

Ala Thr Thr Gly Asp Pro Ala Pro Leu His Asp Pro Thr Ser Ala Pro

340 345 350

Trp Ala Thr Ala Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Ala

355 360 365

Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Thr Ala Pro

370 375 380

Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Pro Gly Gly Leu

385 390 395 400

Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu

405 410 415

Arg Val Glu Trp Arg Gly Arg Asp Pro Arg Gly Pro Gly Arg Ala Gln

420 425 430

Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu

435 440 445

Leu Ser Val Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr

450 455 460

Tyr Gln Ala Asn Asn Cys Gln Gly Val Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp

465 470 475 480

Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln

485 490 495

Val Arg Gly Ala Ala Leu Ala Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala

500 505 510

Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala

515 520 525

His His Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

530 535 540

<210> 4

<211> 535

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 4

Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu

1 5 10 15

Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val

20 25 30

Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val Val

35 40 45

Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg

50 55 60

Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr

65 70 75 80

Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp

85 90 95

Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu

100 105 110

Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro

115 120 125

Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly

130 135 140

Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln

145 150 155 160

Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp

165 170 175

Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg Gly Ser Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln

180 185 190

Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg Leu Ser Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu

195 200 205

Leu Phe Gly Asp Asp His Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu

210 215 220

Leu Leu Leu Pro Arg Ser Glu Pro Ala Pro Leu Pro Ala His Gly Gln

225 230 235 240

Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro Pro Pro Arg Pro Ser Ala Glu Leu Glu

245 250 255

Glu Ser Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu

260 265 270

Val Arg Ala Leu Arg Val Pro Pro Ala Arg Ala Ser Ala Pro Arg Leu

275 280 285

Ala Leu Asp Pro Asp Ala Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn

290 295 300

Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro

305 310 315 320

Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Thr Ala Ala Thr Thr Gly Asp Pro Ala

325 330 335

Pro Leu His Asp Pro Thr Ser Ala Pro Trp Ala Thr Ala Leu Ala Arg

340 345 350

Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu

355 360 365

Pro Gly Leu Pro Pro Ala Thr Ala Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala

370 375 380

Leu Cys Pro Gly Gly Pro Gly Gly Leu Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu

385 390 395 400

Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Val Glu Trp Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Arg Gly Pro Gly Arg Ala Gln Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ala

420 425 430

Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu Leu Ser Val Asp Leu Arg Ala

435 440 445

Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr Tyr Gln Ala Asn Asn Cys Gln

450 455 460

Gly Val Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn

465 470 475 480

His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln Val Arg Gly Ala Ala Leu Ala

485 490 495

Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Ile

500 505 510

Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala His His Val Pro Asn Met Val

515 520 525

Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

530 535

<210> 5

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 5

Met Arg Asp Leu Pro Leu Thr Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Gly Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val

20 25 30

Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly

35 40 45

Ser Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn

50 55 60

Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp

85 90 95

Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu

100 105 110

Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln

115 120 125

Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro

130 135 140

Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu

145 150 155 160

Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val

165 170 175

Thr Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp

180 185 190

Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg

195 200 205

Gly Ser Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg

210 215 220

Leu Ser Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Asp Asp His Arg

225 230 235 240

Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Arg Ser Glu

245 250 255

Pro Ala Pro Leu Pro Ala His Gly Gln Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro

260 265 270

Pro Pro Arg Pro Ser Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Pro Ser Ala Asp

275 280 285

Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Val Pro

290 295 300

Pro Ala Arg Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Asp Ala Leu

305 310 315 320

Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu

325 330 335

Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro

340 345 350

Thr Ala Ala Thr Thr Gly Asp Pro Ala Pro Leu His Asp Pro Thr Ser

355 360 365

Ala Pro Trp Ala Thr Ala Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln

370 375 380

Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Thr

385 390 395 400

Ala Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Pro Gly

405 410 415

Gly Leu Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln

420 425 430

Gly Leu Arg Val Glu Trp Arg Gly Arg Asp Pro Arg Gly Pro Gly Arg

435 440 445

Ala Gln Arg

450

<210> 6

<211> 433

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 6

Leu Leu Gly Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val Gly Thr

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro

20 25 30

Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn Gly Ser

35 40 45

Ser Ser Pro Leu Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Ala

50 55 60

Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp Leu Ala

65 70 75 80

Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu Pro Ser

85 90 95

Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln Arg Leu

100 105 110

Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu

115 120 125

Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu Leu Ala

130 135 140

Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Arg

145 150 155 160

Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp Thr Arg

165 170 175

Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg Gly Ser

180 185 190

Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg Leu Ser

195 200 205

Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Asp Asp His Arg Cys Phe

210 215 220

Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Arg Ser Glu Pro Ala

225 230 235 240

Pro Leu Pro Ala His Gly Gln Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro Pro Pro

245 250 255

Arg Pro Ser Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe

260 265 270

Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Val Pro Pro Ala

275 280 285

Arg Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Asp Ala Leu Ala Gly

290 295 300

Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg

305 310 315 320

Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Thr Ala

325 330 335

Ala Thr Thr Gly Asp Pro Ala Pro Leu His Asp Pro Thr Ser Ala Pro

340 345 350

Trp Ala Thr Ala Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Ala

355 360 365

Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Thr Ala Pro

370 375 380

Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Pro Gly Gly Leu

385 390 395 400

Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu

405 410 415

Arg Val Glu Trp Arg Gly Arg Asp Pro Arg Gly Pro Gly Arg Ala Gln

420 425 430

Arg

<210> 7

<211> 426

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 7

Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu

1 5 10 15

Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val

20 25 30

Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val Val

35 40 45

Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg

50 55 60

Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr

65 70 75 80

Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp

85 90 95

Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu

100 105 110

Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro

115 120 125

Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly

130 135 140

Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln

145 150 155 160

Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp

165 170 175

Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg Gly Ser Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln

180 185 190

Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg Leu Ser Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu

195 200 205

Leu Phe Gly Asp Asp His Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu

210 215 220

Leu Leu Leu Pro Arg Ser Glu Pro Ala Pro Leu Pro Ala His Gly Gln

225 230 235 240

Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro Pro Pro Arg Pro Ser Ala Glu Leu Glu

245 250 255

Glu Ser Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu

260 265 270

Val Arg Ala Leu Arg Val Pro Pro Ala Arg Ala Ser Ala Pro Arg Leu

275 280 285

Ala Leu Asp Pro Asp Ala Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn

290 295 300

Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro

305 310 315 320

Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Thr Ala Ala Thr Thr Gly Asp Pro Ala

325 330 335

Pro Leu His Asp Pro Thr Ser Ala Pro Trp Ala Thr Ala Leu Ala Arg

340 345 350

Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu

355 360 365

Pro Gly Leu Pro Pro Ala Thr Ala Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala

370 375 380

Leu Cys Pro Gly Gly Pro Gly Gly Leu Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu

385 390 395 400

Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Val Glu Trp Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Arg Gly Pro Gly Arg Ala Gln Arg

420 425

<210> 8

<211> 255

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 8

Met Arg Asp Leu Pro Leu Thr Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Gly Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val

20 25 30

Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly

35 40 45

Ser Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn

50 55 60

Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp

85 90 95

Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu

100 105 110

Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln

115 120 125

Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro

130 135 140

Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu

145 150 155 160

Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val

165 170 175

Thr Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp

180 185 190

Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg

195 200 205

Gly Ser Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg

210 215 220

Leu Ser Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Asp Asp His Arg

225 230 235 240

Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Arg Ser

245 250 255

<210> 9

<211> 237

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 9

Leu Leu Gly Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val Gly Thr

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro

20 25 30

Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn Gly Ser

35 40 45

Ser Ser Pro Leu Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Ala

50 55 60

Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp Leu Ala

65 70 75 80

Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu Pro Ser

85 90 95

Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln Arg Leu

100 105 110

Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu

115 120 125

Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu Leu Ala

130 135 140

Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Arg

145 150 155 160

Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp Thr Arg

165 170 175

Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg Gly Ser

180 185 190

Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg Leu Ser

195 200 205

Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Asp Asp His Arg Cys Phe

210 215 220

Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Arg Ser

225 230 235

<210> 10

<211> 230

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 10

Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu

1 5 10 15

Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val

20 25 30

Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val Val

35 40 45

Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg

50 55 60

Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr

65 70 75 80

Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp

85 90 95

Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu

100 105 110

Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro

115 120 125

Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly

130 135 140

Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln

145 150 155 160

Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp

165 170 175

Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg Gly Ser Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln

180 185 190

Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg Leu Ser Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu

195 200 205

Leu Phe Gly Asp Asp His Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu

210 215 220

Leu Leu Leu Pro Arg Ser

225 230

<210> 11

<211> 156

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 11

Met Arg Asp Leu Pro Leu Thr Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Gly Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val

20 25 30

Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly

35 40 45

Ser Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn

50 55 60

Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp

85 90 95

Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu

100 105 110

Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln

115 120 125

Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro

130 135 140

Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala

145 150 155

<210> 12

<211> 138

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 12

Leu Leu Gly Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val Gly Thr

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro

20 25 30

Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn Gly Ser

35 40 45

Ser Ser Pro Leu Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Ala

50 55 60

Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp Leu Ala

65 70 75 80

Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu Pro Ser

85 90 95

Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln Arg Leu

100 105 110

Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu

115 120 125

Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala

130 135

<210> 13

<211> 131

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 13

Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu

1 5 10 15

Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val

20 25 30

Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val Val

35 40 45

Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg

50 55 60

Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr

65 70 75 80

Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp

85 90 95

Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu

100 105 110

Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro

115 120 125

Gly Gly Ala

130

<210> 14

<211> 99

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 14

Asn Pro Leu Glu Pro Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ala Gly Pro Gly Pro

1 5 10 15

Glu Val Thr Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys

20 25 30

Pro Ser Pro Asp Thr Arg Tyr Leu Ala Leu Ala Val Asp His Pro Ala

35 40 45

Arg Ala Trp Arg His Pro Gly Leu Ile Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly

50 55 60

Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Ala Gln Leu Gln Thr Leu Leu Phe Gly

65 70 75 80

Ala Asp Pro Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Phe Leu Leu

85 90 95

Gln Arg Pro

<210> 15

<211> 573

<212> БЕЛОК

<213> лошадь

<400> 15

Met Arg Ala Pro Ser Leu Ser Trp Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Val

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr Pro Gly Glu Glu Val Ser Ser Thr

20 25 30

Pro Ala Leu Pro Gly Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Ile Phe

35 40 45

His Gln Asp Trp Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Gly

50 55 60

Cys Leu Val Thr Leu Asp Glu Gly Gly Asn Gln Ser Ser Ala Pro Leu

65 70 75 80

Arg Val Ala Gly Ala Leu Ser Gly Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala

85 90 95

Val Gln Arg Thr His Trp Ser Pro Arg Asp Leu Pro Thr Phe Gly Val

100 105 110

Cys Ser Pro Ala Asp Arg Gln Ala Ala Val Pro Ser Leu Gln Arg Leu

115 120 125

Gln Ala Trp Leu Gly Ala Pro Trp Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His

130 135 140

Leu Glu Glu Val Met Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu

145 150 155 160

Pro Pro Ser Gly Gly Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ala Leu Leu Val Leu

165 170 175

Tyr Ala Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro

180 185 190

Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Pro Asp Thr Arg Tyr Leu Ala Leu

195 200 205

Ala Val Asp His Pro Ala Arg Ala Trp Arg His Pro Gly Leu Ile Leu

210 215 220

Thr Leu Gln Pro Arg Gly Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Ala Gln Leu

225 230 235 240

Gln Thr Leu Leu Phe Gly Ala Asp Pro Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr

245 250 255

Pro Ala Leu Phe Leu Leu Gln Arg Pro Gly Pro Ala Pro Met Pro Ala

260 265 270

His Gly Arg Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro Pro Ala Arg Pro Ser Pro

275 280 285

Glu Pro Glu Glu Pro Arg Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu

290 295 300

Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Gly Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro

305 310 315 320

Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala Leu Ala Ser Phe Pro Gln Gly

325 330 335

Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly

340 345 350

Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Thr Ala Ala Ala Ala Gly

355 360 365

Asp Pro Ala Pro Leu Pro Asp Pro Ala Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly

370 375 380

Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu

385 390 395 400

Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Ala Glu Pro Leu Leu Ala Arg

405 410 415

Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Asp Ala Glu Asp Gln Gly Gly Pro Gly

420 425 430

Gly Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg

435 440 445

Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Ser Gly Pro Gly Arg Ala Gln Arg

450 455 460

Asn Ala Gly Ala Gly Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu Leu

465 470 475 480

Arg Val Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr Tyr

485 490 495

Gln Ala Asn Asn Cys Gln Gly Ala Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp Arg

500 505 510

Asn Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln Ala

515 520 525

Arg Gly Ala Ala Leu Ala Arg Ala Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala Tyr

530 535 540

Ala Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala His

545 550 555 560

His Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

565 570

<210> 16

<211> 551

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 16

Gly Thr Pro Gly Glu Glu Val Ser Ser Thr Pro Ala Leu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Ile Phe His Gln Asp Trp Asp Trp

20 25 30

Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Gly Cys Leu Val Thr Leu Asp

35 40 45

Glu Gly Gly Asn Gln Ser Ser Ala Pro Leu Arg Val Ala Gly Ala Leu

50 55 60

Ser Gly Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala Val Gln Arg Thr His Trp

65 70 75 80

Ser Pro Arg Asp Leu Pro Thr Phe Gly Val Cys Ser Pro Ala Asp Arg

85 90 95

Gln Ala Ala Val Pro Ser Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Ala

100 105 110

Pro Trp Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Met Trp

115 120 125

Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Asn Pro Leu Glu Pro Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ala Gly Pro Gly Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys

165 170 175

Pro Ser Pro Asp Thr Arg Tyr Leu Ala Leu Ala Val Asp His Pro Ala

180 185 190

Arg Ala Trp Arg His Pro Gly Leu Ile Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly

195 200 205

Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Ala Gln Leu Gln Thr Leu Leu Phe Gly

210 215 220

Ala Asp Pro Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Phe Leu Leu

225 230 235 240

Gln Arg Pro Gly Pro Ala Pro Met Pro Ala His Gly Arg Leu Asp Thr

245 250 255

Val Pro Phe Pro Pro Ala Arg Pro Ser Pro Glu Pro Glu Glu Pro Arg

260 265 270

Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala

275 280 285

Leu Arg Gly Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp

290 295 300

Pro Gly Ala Leu Ala Ser Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp

305 310 315 320

Pro Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu

325 330 335

Leu Leu Pro Pro Thr Ala Ala Ala Ala Gly Asp Pro Ala Pro Leu Pro

340 345 350

Asp Pro Ala Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly Leu Ala Arg Arg Val Ala

355 360 365

Ala Glu Leu Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu

370 375 380

Pro Pro Ala Ala Glu Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro

385 390 395 400

Gly Asp Ala Glu Asp Gln Gly Gly Pro Gly Gly Pro Leu Arg Ala Leu

405 410 415

Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg

420 425 430

Glu Arg Ser Gly Pro Gly Arg Ala Gln Arg Asn Ala Gly Ala Gly Ala

435 440 445

Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu Leu Arg Val Asp Leu Arg Ala

450 455 460

Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr Tyr Gln Ala Asn Asn Cys Gln

465 470 475 480

Gly Ala Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn

485 490 495

His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala

500 505 510

Arg Ala Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Ile

515 520 525

Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala His His Val Pro Asn Met Val

530 535 540

Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

545 550

<210> 17

<211> 464

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 17

Met Arg Ala Pro Ser Leu Ser Trp Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Val

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr Pro Gly Glu Glu Val Ser Ser Thr

20 25 30

Pro Ala Leu Pro Gly Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Ile Phe

35 40 45

His Gln Asp Trp Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Gly

50 55 60

Cys Leu Val Thr Leu Asp Glu Gly Gly Asn Gln Ser Ser Ala Pro Leu

65 70 75 80

Arg Val Ala Gly Ala Leu Ser Gly Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala

85 90 95

Val Gln Arg Thr His Trp Ser Pro Arg Asp Leu Pro Thr Phe Gly Val

100 105 110

Cys Ser Pro Ala Asp Arg Gln Ala Ala Val Pro Ser Leu Gln Arg Leu

115 120 125

Gln Ala Trp Leu Gly Ala Pro Trp Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His

130 135 140

Leu Glu Glu Val Met Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu

145 150 155 160

Pro Pro Ser Gly Gly Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ala Leu Leu Val Leu

165 170 175

Tyr Ala Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro

180 185 190

Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Pro Asp Thr Arg Tyr Leu Ala Leu

195 200 205

Ala Val Asp His Pro Ala Arg Ala Trp Arg His Pro Gly Leu Ile Leu

210 215 220

Thr Leu Gln Pro Arg Gly Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Ala Gln Leu

225 230 235 240

Gln Thr Leu Leu Phe Gly Ala Asp Pro Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr

245 250 255

Pro Ala Leu Phe Leu Leu Gln Arg Pro Gly Pro Ala Pro Met Pro Ala

260 265 270

His Gly Arg Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro Pro Ala Arg Pro Ser Pro

275 280 285

Glu Pro Glu Glu Pro Arg Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu

290 295 300

Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Gly Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro

305 310 315 320

Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala Leu Ala Ser Phe Pro Gln Gly

325 330 335

Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly

340 345 350

Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Thr Ala Ala Ala Ala Gly

355 360 365

Asp Pro Ala Pro Leu Pro Asp Pro Ala Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly

370 375 380

Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu

385 390 395 400

Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Ala Glu Pro Leu Leu Ala Arg

405 410 415

Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Asp Ala Glu Asp Gln Gly Gly Pro Gly

420 425 430

Gly Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg

435 440 445

Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Ser Gly Pro Gly Arg Ala Gln Arg

450 455 460

<210> 18

<211> 442

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 18

Gly Thr Pro Gly Glu Glu Val Ser Ser Thr Pro Ala Leu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Ile Phe His Gln Asp Trp Asp Trp

20 25 30

Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Gly Cys Leu Val Thr Leu Asp

35 40 45

Glu Gly Gly Asn Gln Ser Ser Ala Pro Leu Arg Val Ala Gly Ala Leu

50 55 60

Ser Gly Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala Val Gln Arg Thr His Trp

65 70 75 80

Ser Pro Arg Asp Leu Pro Thr Phe Gly Val Cys Ser Pro Ala Asp Arg

85 90 95

Gln Ala Ala Val Pro Ser Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Ala

100 105 110

Pro Trp Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Met Trp

115 120 125

Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Asn Pro Leu Glu Pro Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ala Gly Pro Gly Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys

165 170 175

Pro Ser Pro Asp Thr Arg Tyr Leu Ala Leu Ala Val Asp His Pro Ala

180 185 190

Arg Ala Trp Arg His Pro Gly Leu Ile Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly

195 200 205

Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Ala Gln Leu Gln Thr Leu Leu Phe Gly

210 215 220

Ala Asp Pro Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Phe Leu Leu

225 230 235 240

Gln Arg Pro Gly Pro Ala Pro Met Pro Ala His Gly Arg Leu Asp Thr

245 250 255

Val Pro Phe Pro Pro Ala Arg Pro Ser Pro Glu Pro Glu Glu Pro Arg

260 265 270

Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala

275 280 285

Leu Arg Gly Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp

290 295 300

Pro Gly Ala Leu Ala Ser Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp

305 310 315 320

Pro Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu

325 330 335

Leu Leu Pro Pro Thr Ala Ala Ala Ala Gly Asp Pro Ala Pro Leu Pro

340 345 350

Asp Pro Ala Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly Leu Ala Arg Arg Val Ala

355 360 365

Ala Glu Leu Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu

370 375 380

Pro Pro Ala Ala Glu Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro

385 390 395 400

Gly Asp Ala Glu Asp Gln Gly Gly Pro Gly Gly Pro Leu Arg Ala Leu

405 410 415

Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg

420 425 430

Glu Arg Ser Gly Pro Gly Arg Ala Gln Arg

435 440

<210> 19

<211> 265

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 19

Met Arg Ala Pro Ser Leu Ser Trp Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Val

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr Pro Gly Glu Glu Val Ser Ser Thr

20 25 30

Pro Ala Leu Pro Gly Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Ile Phe

35 40 45

His Gln Asp Trp Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Gly

50 55 60

Cys Leu Val Thr Leu Asp Glu Gly Gly Asn Gln Ser Ser Ala Pro Leu

65 70 75 80

Arg Val Ala Gly Ala Leu Ser Gly Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala

85 90 95

Val Gln Arg Thr His Trp Ser Pro Arg Asp Leu Pro Thr Phe Gly Val

100 105 110

Cys Ser Pro Ala Asp Arg Gln Ala Ala Val Pro Ser Leu Gln Arg Leu

115 120 125

Gln Ala Trp Leu Gly Ala Pro Trp Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His

130 135 140

Leu Glu Glu Val Met Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu

145 150 155 160

Pro Pro Ser Gly Gly Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ala Leu Leu Val Leu

165 170 175

Tyr Ala Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro

180 185 190

Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Pro Asp Thr Arg Tyr Leu Ala Leu

195 200 205

Ala Val Asp His Pro Ala Arg Ala Trp Arg His Pro Gly Leu Ile Leu

210 215 220

Thr Leu Gln Pro Arg Gly Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Ala Gln Leu

225 230 235 240

Gln Thr Leu Leu Phe Gly Ala Asp Pro Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr

245 250 255

Pro Ala Leu Phe Leu Leu Gln Arg Pro

260 265

<210> 20

<211> 243

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 20

Gly Thr Pro Gly Glu Glu Val Ser Ser Thr Pro Ala Leu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Ile Phe His Gln Asp Trp Asp Trp

20 25 30

Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Gly Cys Leu Val Thr Leu Asp

35 40 45

Glu Gly Gly Asn Gln Ser Ser Ala Pro Leu Arg Val Ala Gly Ala Leu

50 55 60

Ser Gly Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala Val Gln Arg Thr His Trp

65 70 75 80

Ser Pro Arg Asp Leu Pro Thr Phe Gly Val Cys Ser Pro Ala Asp Arg

85 90 95

Gln Ala Ala Val Pro Ser Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Ala

100 105 110

Pro Trp Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Met Trp

115 120 125

Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Asn Pro Leu Glu Pro Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ala Gly Pro Gly Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys

165 170 175

Pro Ser Pro Asp Thr Arg Tyr Leu Ala Leu Ala Val Asp His Pro Ala

180 185 190

Arg Ala Trp Arg His Pro Gly Leu Ile Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly

195 200 205

Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Ala Gln Leu Gln Thr Leu Leu Phe Gly

210 215 220

Ala Asp Pro Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Phe Leu Leu

225 230 235 240

Gln Arg Pro

<210> 21

<211> 166

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 21

Met Arg Ala Pro Ser Leu Ser Trp Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Val

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr Pro Gly Glu Glu Val Ser Ser Thr

20 25 30

Pro Ala Leu Pro Gly Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Ile Phe

35 40 45

His Gln Asp Trp Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Gly

50 55 60

Cys Leu Val Thr Leu Asp Glu Gly Gly Asn Gln Ser Ser Ala Pro Leu

65 70 75 80

Arg Val Ala Gly Ala Leu Ser Gly Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala

85 90 95

Val Gln Arg Thr His Trp Ser Pro Arg Asp Leu Pro Thr Phe Gly Val

100 105 110

Cys Ser Pro Ala Asp Arg Gln Ala Ala Val Pro Ser Leu Gln Arg Leu

115 120 125

Gln Ala Trp Leu Gly Ala Pro Trp Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His

130 135 140

Leu Glu Glu Val Met Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu

145 150 155 160

Pro Pro Ser Gly Gly Ala

165

<210> 22

<211> 144

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 22

Gly Thr Pro Gly Glu Glu Val Ser Ser Thr Pro Ala Leu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Ile Phe His Gln Asp Trp Asp Trp

20 25 30

Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Gly Cys Leu Val Thr Leu Asp

35 40 45

Glu Gly Gly Asn Gln Ser Ser Ala Pro Leu Arg Val Ala Gly Ala Leu

50 55 60

Ser Gly Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala Val Gln Arg Thr His Trp

65 70 75 80

Ser Pro Arg Asp Leu Pro Thr Phe Gly Val Cys Ser Pro Ala Asp Arg

85 90 95

Gln Ala Ala Val Pro Ser Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Ala

100 105 110

Pro Trp Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Met Trp

115 120 125

Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Ser Gly Gly Ala

130 135 140

<210> 23

<211> 99

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 23

Ser Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro

1 5 10 15

Glu Val Ala Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Thr Gln Asn Leu Cys

20 25 30

Arg Ser Arg Asn Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Leu Asp His Pro Val

35 40 45

Gly Ala Trp His Ser Pro Arg Val Thr Leu Thr Val His Ala Arg Gly

50 55 60

Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Pro Gln Leu Gln Glu Leu Leu Phe Gly

65 70 75 80

Pro Asp Ala Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Val Leu

85 90 95

Arg Leu Pro

<210> 24

<211> 572

<212> БЕЛОК

<213> собака

<400> 24

Met Gly Ala Leu Ala Leu Trp Pro Leu Ala Leu Ala Leu Ser Gly Met

1 5 10 15

Gly Pro Leu Leu Gly Ala Glu Ala Pro Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr

20 25 30

Pro Ala Ser Pro Gly Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Leu Phe

35 40 45

Gln Pro Asp Trp Asp Trp Pro Pro Ser Ala Pro Gln Asp Pro Leu Cys

50 55 60

Leu Val Thr Leu Asp Lys Gly Gly Asn Gly Ser Ser Pro Pro Leu Arg

65 70 75 80

Val Ala Gly Ala Leu Arg Gly Tyr Glu His Thr Phe Leu Glu Ala Val

85 90 95

Arg Arg Ala Arg Trp Gly Pro His Asp Leu Ala Thr Phe Gly Ala Cys

100 105 110

Ala Ala Ser Asp Gly Arg Thr Thr Gln Leu Ser Leu Arg Gln Leu Gln

115 120 125

Ala Trp Leu Gly Ala Pro Gly Gly Arg Arg Leu Val Val Leu His Leu

130 135 140

Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Ala Leu Ser Leu Lys Phe Gln Glu Pro

145 150 155 160

Pro Pro Gly Gly Ala Ser Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr

165 170 175

Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Ala Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly

180 185 190

Thr Gln Asn Leu Cys Arg Ser Arg Asn Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala

195 200 205

Leu Asp His Pro Val Gly Ala Trp His Ser Pro Arg Val Thr Leu Thr

210 215 220

Val His Ala Arg Gly Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Pro Gln Leu Gln

225 230 235 240

Glu Leu Leu Phe Gly Pro Asp Ala Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro

245 250 255

Ala Leu Leu Val Leu Arg Leu Pro Gly Pro Thr Ala Val Pro Ala Arg

260 265 270

Gly Leu Leu Asp Leu Val Pro Phe Pro Pro Pro Arg Pro Ser Arg Glu

275 280 285

Pro Ala Glu Pro Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr

290 295 300

Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Gly Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro Pro

305 310 315 320

Arg Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu

325 330 335

Leu Asn Leu Ser Asp Pro Ala Thr Gln Glu Arg Leu Leu Gly Gly Glu

340 345 350

Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Thr Ala Ala Ala Gly Pro

355 360 365

Pro Ala Pro Pro Pro Arg Pro Ala Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly Leu

370 375 380

Ala Leu Arg Val Ala Ala Glu Leu Arg Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg

385 390 395 400

Gly Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Ala Ala Pro Leu Leu Glu Arg Leu

405 410 415

Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Asp

420 425 430

Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Ala

435 440 445

Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Gly Gly Pro Pro Arg Ala Gln Arg Ser

450 455 460

Ala Gly Ala Gly Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu Leu Ser

465 470 475 480

Val Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr Tyr Gln

485 490 495

Ala Asn Asn Cys Gln Gly Ala Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp Arg Asn

500 505 510

Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln Ala Arg

515 520 525

Gly Ala Ala Leu Ala Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala Tyr Gly

530 535 540

Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala His His

545 550 555 560

Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

565 570

<210> 25

<211> 551

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 25

Ala Glu Ala Pro Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr Pro Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Leu Phe Gln Pro Asp Trp Asp

20 25 30

Trp Pro Pro Ser Ala Pro Gln Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu Asp

35 40 45

Lys Gly Gly Asn Gly Ser Ser Pro Pro Leu Arg Val Ala Gly Ala Leu

50 55 60

Arg Gly Tyr Glu His Thr Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Ala Arg Trp

65 70 75 80

Gly Pro His Asp Leu Ala Thr Phe Gly Ala Cys Ala Ala Ser Asp Gly

85 90 95

Arg Thr Thr Gln Leu Ser Leu Arg Gln Leu Gln Ala Trp Leu Gly Ala

100 105 110

Pro Gly Gly Arg Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp

115 120 125

Glu Pro Ala Leu Ser Leu Lys Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro

145 150 155 160

Glu Val Ala Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Thr Gln Asn Leu Cys

165 170 175

Arg Ser Arg Asn Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Leu Asp His Pro Val

180 185 190

Gly Ala Trp His Ser Pro Arg Val Thr Leu Thr Val His Ala Arg Gly

195 200 205

Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Pro Gln Leu Gln Glu Leu Leu Phe Gly

210 215 220

Pro Asp Ala Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Val Leu

225 230 235 240

Arg Leu Pro Gly Pro Thr Ala Val Pro Ala Arg Gly Leu Leu Asp Leu

245 250 255

Val Pro Phe Pro Pro Pro Arg Pro Ser Arg Glu Pro Ala Glu Pro Pro

260 265 270

Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala

275 280 285

Leu Arg Gly Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp

290 295 300

Pro Gly Ala Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu Leu Asn Leu Ser Asp

305 310 315 320

Pro Ala Thr Gln Glu Arg Leu Leu Gly Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu

325 330 335

Leu Leu Pro Pro Pro Thr Ala Ala Ala Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro

340 345 350

Arg Pro Ala Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly Leu Ala Leu Arg Val Ala

355 360 365

Ala Glu Leu Arg Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Gly Leu Pro Gly Leu

370 375 380

Pro Pro Ala Ala Ala Pro Leu Leu Glu Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu

405 410 415

Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg

420 425 430

Glu Arg Gly Gly Pro Pro Arg Ala Gln Arg Ser Ala Gly Ala Gly Ala

435 440 445

Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu Leu Ser Val Asp Leu Arg Ala

450 455 460

Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr Tyr Gln Ala Asn Asn Cys Gln

465 470 475 480

Gly Ala Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn

485 490 495

His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala

500 505 510

Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala Tyr Gly Gly Lys Leu Leu Ile

515 520 525

Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala His His Val Pro Asn Met Val

530 535 540

Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

545 550

<210> 26

<211> 463

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 26

Met Gly Ala Leu Ala Leu Trp Pro Leu Ala Leu Ala Leu Ser Gly Met

1 5 10 15

Gly Pro Leu Leu Gly Ala Glu Ala Pro Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr

20 25 30

Pro Ala Ser Pro Gly Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Leu Phe

35 40 45

Gln Pro Asp Trp Asp Trp Pro Pro Ser Ala Pro Gln Asp Pro Leu Cys

50 55 60

Leu Val Thr Leu Asp Lys Gly Gly Asn Gly Ser Ser Pro Pro Leu Arg

65 70 75 80

Val Ala Gly Ala Leu Arg Gly Tyr Glu His Thr Phe Leu Glu Ala Val

85 90 95

Arg Arg Ala Arg Trp Gly Pro His Asp Leu Ala Thr Phe Gly Ala Cys

100 105 110

Ala Ala Ser Asp Gly Arg Thr Thr Gln Leu Ser Leu Arg Gln Leu Gln

115 120 125

Ala Trp Leu Gly Ala Pro Gly Gly Arg Arg Leu Val Val Leu His Leu

130 135 140

Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Ala Leu Ser Leu Lys Phe Gln Glu Pro

145 150 155 160

Pro Pro Gly Gly Ala Ser Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr

165 170 175

Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Ala Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly

180 185 190

Thr Gln Asn Leu Cys Arg Ser Arg Asn Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala

195 200 205

Leu Asp His Pro Val Gly Ala Trp His Ser Pro Arg Val Thr Leu Thr

210 215 220

Val His Ala Arg Gly Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Pro Gln Leu Gln

225 230 235 240

Glu Leu Leu Phe Gly Pro Asp Ala Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro

245 250 255

Ala Leu Leu Val Leu Arg Leu Pro Gly Pro Thr Ala Val Pro Ala Arg

260 265 270

Gly Leu Leu Asp Leu Val Pro Phe Pro Pro Pro Arg Pro Ser Arg Glu

275 280 285

Pro Ala Glu Pro Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr

290 295 300

Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Gly Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro Pro

305 310 315 320

Arg Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu

325 330 335

Leu Asn Leu Ser Asp Pro Ala Thr Gln Glu Arg Leu Leu Gly Gly Glu

340 345 350

Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Thr Ala Ala Ala Gly Pro

355 360 365

Pro Ala Pro Pro Pro Arg Pro Ala Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly Leu

370 375 380

Ala Leu Arg Val Ala Ala Glu Leu Arg Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg

385 390 395 400

Gly Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Ala Ala Pro Leu Leu Glu Arg Leu

405 410 415

Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Asp

420 425 430

Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Ala

435 440 445

Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Gly Gly Pro Pro Arg Ala Gln Arg

450 455 460

<210> 27

<211> 442

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 27

Ala Glu Ala Pro Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr Pro Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Leu Phe Gln Pro Asp Trp Asp

20 25 30

Trp Pro Pro Ser Ala Pro Gln Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu Asp

35 40 45

Lys Gly Gly Asn Gly Ser Ser Pro Pro Leu Arg Val Ala Gly Ala Leu

50 55 60

Arg Gly Tyr Glu His Thr Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Ala Arg Trp

65 70 75 80

Gly Pro His Asp Leu Ala Thr Phe Gly Ala Cys Ala Ala Ser Asp Gly

85 90 95

Arg Thr Thr Gln Leu Ser Leu Arg Gln Leu Gln Ala Trp Leu Gly Ala

100 105 110

Pro Gly Gly Arg Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp

115 120 125

Glu Pro Ala Leu Ser Leu Lys Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro

145 150 155 160

Glu Val Ala Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Thr Gln Asn Leu Cys

165 170 175

Arg Ser Arg Asn Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Leu Asp His Pro Val

180 185 190

Gly Ala Trp His Ser Pro Arg Val Thr Leu Thr Val His Ala Arg Gly

195 200 205

Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Pro Gln Leu Gln Glu Leu Leu Phe Gly

210 215 220

Pro Asp Ala Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Val Leu

225 230 235 240

Arg Leu Pro Gly Pro Thr Ala Val Pro Ala Arg Gly Leu Leu Asp Leu

245 250 255

Val Pro Phe Pro Pro Pro Arg Pro Ser Arg Glu Pro Ala Glu Pro Pro

260 265 270

Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala

275 280 285

Leu Arg Gly Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp

290 295 300

Pro Gly Ala Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu Leu Asn Leu Ser Asp

305 310 315 320

Pro Ala Thr Gln Glu Arg Leu Leu Gly Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu

325 330 335

Leu Leu Pro Pro Pro Thr Ala Ala Ala Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro

340 345 350

Arg Pro Ala Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly Leu Ala Leu Arg Val Ala

355 360 365

Ala Glu Leu Arg Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Gly Leu Pro Gly Leu

370 375 380

Pro Pro Ala Ala Ala Pro Leu Leu Glu Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu

405 410 415

Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg

420 425 430

Glu Arg Gly Gly Pro Pro Arg Ala Gln Arg

435 440

<210> 28

<211> 264

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 28

Met Gly Ala Leu Ala Leu Trp Pro Leu Ala Leu Ala Leu Ser Gly Met

1 5 10 15

Gly Pro Leu Leu Gly Ala Glu Ala Pro Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr

20 25 30

Pro Ala Ser Pro Gly Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Leu Phe

35 40 45

Gln Pro Asp Trp Asp Trp Pro Pro Ser Ala Pro Gln Asp Pro Leu Cys

50 55 60

Leu Val Thr Leu Asp Lys Gly Gly Asn Gly Ser Ser Pro Pro Leu Arg

65 70 75 80

Val Ala Gly Ala Leu Arg Gly Tyr Glu His Thr Phe Leu Glu Ala Val

85 90 95

Arg Arg Ala Arg Trp Gly Pro His Asp Leu Ala Thr Phe Gly Ala Cys

100 105 110

Ala Ala Ser Asp Gly Arg Thr Thr Gln Leu Ser Leu Arg Gln Leu Gln

115 120 125

Ala Trp Leu Gly Ala Pro Gly Gly Arg Arg Leu Val Val Leu His Leu

130 135 140

Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Ala Leu Ser Leu Lys Phe Gln Glu Pro

145 150 155 160

Pro Pro Gly Gly Ala Ser Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr

165 170 175

Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Ala Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly

180 185 190

Thr Gln Asn Leu Cys Arg Ser Arg Asn Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala

195 200 205

Leu Asp His Pro Val Gly Ala Trp His Ser Pro Arg Val Thr Leu Thr

210 215 220

Val His Ala Arg Gly Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Pro Gln Leu Gln

225 230 235 240

Glu Leu Leu Phe Gly Pro Asp Ala Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro

245 250 255

Ala Leu Leu Val Leu Arg Leu Pro

260

<210> 29

<211> 243

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 29

Ala Glu Ala Pro Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr Pro Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Leu Phe Gln Pro Asp Trp Asp

20 25 30

Trp Pro Pro Ser Ala Pro Gln Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu Asp

35 40 45

Lys Gly Gly Asn Gly Ser Ser Pro Pro Leu Arg Val Ala Gly Ala Leu

50 55 60

Arg Gly Tyr Glu His Thr Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Ala Arg Trp

65 70 75 80

Gly Pro His Asp Leu Ala Thr Phe Gly Ala Cys Ala Ala Ser Asp Gly

85 90 95

Arg Thr Thr Gln Leu Ser Leu Arg Gln Leu Gln Ala Trp Leu Gly Ala

100 105 110

Pro Gly Gly Arg Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp

115 120 125

Glu Pro Ala Leu Ser Leu Lys Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro

145 150 155 160

Glu Val Ala Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Thr Gln Asn Leu Cys

165 170 175

Arg Ser Arg Asn Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Leu Asp His Pro Val

180 185 190

Gly Ala Trp His Ser Pro Arg Val Thr Leu Thr Val His Ala Arg Gly

195 200 205

Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Pro Gln Leu Gln Glu Leu Leu Phe Gly

210 215 220

Pro Asp Ala Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Val Leu

225 230 235 240

Arg Leu Pro

<210> 30

<211> 165

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 30

Met Gly Ala Leu Ala Leu Trp Pro Leu Ala Leu Ala Leu Ser Gly Met

1 5 10 15

Gly Pro Leu Leu Gly Ala Glu Ala Pro Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr

20 25 30

Pro Ala Ser Pro Gly Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Leu Phe

35 40 45

Gln Pro Asp Trp Asp Trp Pro Pro Ser Ala Pro Gln Asp Pro Leu Cys

50 55 60

Leu Val Thr Leu Asp Lys Gly Gly Asn Gly Ser Ser Pro Pro Leu Arg

65 70 75 80

Val Ala Gly Ala Leu Arg Gly Tyr Glu His Thr Phe Leu Glu Ala Val

85 90 95

Arg Arg Ala Arg Trp Gly Pro His Asp Leu Ala Thr Phe Gly Ala Cys

100 105 110

Ala Ala Ser Asp Gly Arg Thr Thr Gln Leu Ser Leu Arg Gln Leu Gln

115 120 125

Ala Trp Leu Gly Ala Pro Gly Gly Arg Arg Leu Val Val Leu His Leu

130 135 140

Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Ala Leu Ser Leu Lys Phe Gln Glu Pro

145 150 155 160

Pro Pro Gly Gly Ala

165

<210> 31

<211> 144

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 31

Ala Glu Ala Pro Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr Pro Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Leu Phe Gln Pro Asp Trp Asp

20 25 30

Trp Pro Pro Ser Ala Pro Gln Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu Asp

35 40 45

Lys Gly Gly Asn Gly Ser Ser Pro Pro Leu Arg Val Ala Gly Ala Leu

50 55 60

Arg Gly Tyr Glu His Thr Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Ala Arg Trp

65 70 75 80

Gly Pro His Asp Leu Ala Thr Phe Gly Ala Cys Ala Ala Ser Asp Gly

85 90 95

Arg Thr Thr Gln Leu Ser Leu Arg Gln Leu Gln Ala Trp Leu Gly Ala

100 105 110

Pro Gly Gly Arg Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp

115 120 125

Glu Pro Ala Leu Ser Leu Lys Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala

130 135 140

<210> 32

<211> 100

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 32

Ser Pro Pro Glu Leu Ala Leu Leu Val Val Tyr Pro Gly Pro Gly Leu

1 5 10 15

Glu Val Thr Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Thr Gln Ser Leu Cys

20 25 30

Leu Thr Ala Asp Ser Asp Phe Leu Ala Leu Val Val Asp His Pro Glu

35 40 45

Gly Ala Trp Arg Arg Pro Gly Leu Ala Leu Thr Leu Arg Arg Arg Gly

50 55 60

Asn Gly Ala Leu Leu Ser Thr Ala Gln Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly

65 70 75 80

Ala Asp Ser Arg Cys Phe Thr Arg Lys Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu

85 90 95

Leu Pro Ala Arg

100

<210> 33

<211> 575

<212> БЕЛОК

<213> корова

<400> 33

Met Pro Gly Pro Ser Leu Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Met Gly

1 5 10 15

Ala Leu Leu Arg Pro Gly Thr Pro Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser

20 25 30

Ala Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln

35 40 45

Gln Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro

50 55 60

Leu Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser

65 70 75 80

Arg Ala Pro Leu Arg Val Val Gly Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala

85 90 95

Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr

100 105 110

Thr Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His

115 120 125

Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu

130 135 140

Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu

145 150 155 160

Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Ser Pro Pro Glu Leu Ala

165 170 175

Leu Leu Val Val Tyr Pro Gly Pro Gly Leu Glu Val Thr Val Thr Gly

180 185 190

Ala Gly Leu Pro Gly Thr Gln Ser Leu Cys Leu Thr Ala Asp Ser Asp

195 200 205

Phe Leu Ala Leu Val Val Asp His Pro Glu Gly Ala Trp Arg Arg Pro

210 215 220

Gly Leu Ala Leu Thr Leu Arg Arg Arg Gly Asn Gly Ala Leu Leu Ser

225 230 235 240

Thr Ala Gln Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Ala Asp Ser Arg Cys Phe

245 250 255

Thr Arg Lys Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Arg Ser Ser

260 265 270

Ala Pro Met Pro Ala His Gly Arg Leu Asp Leu Val Pro Phe Pro Gln

275 280 285

Pro Arg Ala Ser Pro Glu Pro Glu Glu Ala Pro Pro Ser Ala Asp Pro

290 295 300

Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Ala Gly Pro Pro

305 310 315 320

Ala Arg Ala Ser Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala Leu Ala

325 330 335

Gly Phe Pro Gln Gly Gln Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu

340 345 350

Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Thr

355 360 365

Ala Ala Thr Thr Gly Val Pro Ala Thr Pro Gln Gly Pro Lys Ser Pro

370 375 380

Leu Trp Ala Ala Gly Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala

385 390 395 400

Val Ala Ala Glu Leu Arg Ala Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Ala Pro

405 410 415

Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Asn Pro Asp Ser

420 425 430

Pro Gly Gly Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly

435 440 445

Leu Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Ser Gly Ser Ala Arg Ala

450 455 460

Gln Arg Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg

465 470 475 480

Glu Leu Ser Val Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu

485 490 495

Thr Tyr Gln Ala Asn Asn Cys Gln Gly Ala Cys Gly Trp Pro Gln Ser

500 505 510

Asp Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys Met

515 520 525

Gln Ala Arg Gly Ala Thr Leu Ala Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro Thr

530 535 540

Ala Tyr Thr Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser

545 550 555 560

Ala His His Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

565 570 575

<210> 34

<211> 558

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 34

Leu Leu Arg Pro Gly Thr Pro Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser Ala

1 5 10 15

Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln Gln

20 25 30

Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro Leu

35 40 45

Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser Arg

50 55 60

Ala Pro Leu Arg Val Val Gly Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala Phe

65 70 75 80

Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr Thr

85 90 95

Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His Leu

100 105 110

Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu Val

115 120 125

Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu Arg

130 135 140

Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Ser Pro Pro Glu Leu Ala Leu

145 150 155 160

Leu Val Val Tyr Pro Gly Pro Gly Leu Glu Val Thr Val Thr Gly Ala

165 170 175

Gly Leu Pro Gly Thr Gln Ser Leu Cys Leu Thr Ala Asp Ser Asp Phe

180 185 190

Leu Ala Leu Val Val Asp His Pro Glu Gly Ala Trp Arg Arg Pro Gly

195 200 205

Leu Ala Leu Thr Leu Arg Arg Arg Gly Asn Gly Ala Leu Leu Ser Thr

210 215 220

Ala Gln Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Ala Asp Ser Arg Cys Phe Thr

225 230 235 240

Arg Lys Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Arg Ser Ser Ala

245 250 255

Pro Met Pro Ala His Gly Arg Leu Asp Leu Val Pro Phe Pro Gln Pro

260 265 270

Arg Ala Ser Pro Glu Pro Glu Glu Ala Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe

275 280 285

Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Ala Gly Pro Pro Ala

290 295 300

Arg Ala Ser Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala Leu Ala Gly

305 310 315 320

Phe Pro Gln Gly Gln Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg

325 330 335

Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Thr Ala

340 345 350

Ala Thr Thr Gly Val Pro Ala Thr Pro Gln Gly Pro Lys Ser Pro Leu

355 360 365

Trp Ala Ala Gly Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Val

370 375 380

Ala Ala Glu Leu Arg Ala Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Ala Pro Pro

385 390 395 400

Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Asn Pro Asp Ser Pro

405 410 415

Gly Gly Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu

420 425 430

Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Ser Gly Ser Ala Arg Ala Gln

435 440 445

Arg Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu

450 455 460

Leu Ser Val Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr

465 470 475 480

Tyr Gln Ala Asn Asn Cys Gln Gly Ala Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp

485 490 495

Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln

500 505 510

Ala Arg Gly Ala Thr Leu Ala Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala

515 520 525

Tyr Thr Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala

530 535 540

His His Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

545 550 555

<210> 35

<211> 551

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 35

Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser Ala Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln Gln Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser

20 25 30

Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro Leu Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr

35 40 45

Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser Arg Ala Pro Leu Arg Val Val Gly

50 55 60

Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr

65 70 75 80

His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr Thr Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly

85 90 95

Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu

100 105 110

Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val

115 120 125

Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly

130 135 140

Gly Ala Ser Pro Pro Glu Leu Ala Leu Leu Val Val Tyr Pro Gly Pro

145 150 155 160

Gly Leu Glu Val Thr Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Thr Gln Ser

165 170 175

Leu Cys Leu Thr Ala Asp Ser Asp Phe Leu Ala Leu Val Val Asp His

180 185 190

Pro Glu Gly Ala Trp Arg Arg Pro Gly Leu Ala Leu Thr Leu Arg Arg

195 200 205

Arg Gly Asn Gly Ala Leu Leu Ser Thr Ala Gln Leu Gln Ala Leu Leu

210 215 220

Phe Gly Ala Asp Ser Arg Cys Phe Thr Arg Lys Thr Pro Ala Leu Leu

225 230 235 240

Leu Leu Leu Pro Ala Arg Ser Ser Ala Pro Met Pro Ala His Gly Arg

245 250 255

Leu Asp Leu Val Pro Phe Pro Gln Pro Arg Ala Ser Pro Glu Pro Glu

260 265 270

Glu Ala Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu

275 280 285

Val Arg Ala Leu Ala Gly Pro Pro Ala Arg Ala Ser Pro Pro Arg Leu

290 295 300

Ala Leu Asp Pro Gly Ala Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Gln Val Asn

305 310 315 320

Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro

325 330 335

Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Thr Ala Ala Thr Thr Gly Val Pro Ala

340 345 350

Thr Pro Gln Gly Pro Lys Ser Pro Leu Trp Ala Ala Gly Leu Ala Arg

355 360 365

Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Val Ala Ala Glu Leu Arg Ala Leu

370 375 380

Pro Gly Leu Pro Pro Ala Ala Pro Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala

385 390 395 400

Leu Cys Pro Gly Asn Pro Asp Ser Pro Gly Gly Pro Leu Arg Ala Leu

405 410 415

Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg

420 425 430

Glu Arg Ser Gly Ser Ala Arg Ala Gln Arg Ser Ala Gly Ala Ala Ala

435 440 445

Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu Leu Ser Val Asp Leu Arg Ala

450 455 460

Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr Tyr Gln Ala Asn Asn Cys Gln

465 470 475 480

Gly Ala Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn

485 490 495

His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln Ala Arg Gly Ala Thr Leu Ala

500 505 510

Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala Tyr Thr Gly Lys Leu Leu Ile

515 520 525

Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala His His Val Pro Asn Met Val

530 535 540

Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

545 550

<210> 36

<211> 466

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 36

Met Pro Gly Pro Ser Leu Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Met Gly

1 5 10 15

Ala Leu Leu Arg Pro Gly Thr Pro Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser

20 25 30

Ala Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln

35 40 45

Gln Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro

50 55 60

Leu Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser

65 70 75 80

Arg Ala Pro Leu Arg Val Val Gly Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala

85 90 95

Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr

100 105 110

Thr Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His

115 120 125

Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu

130 135 140

Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu

145 150 155 160

Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Ser Pro Pro Glu Leu Ala

165 170 175

Leu Leu Val Val Tyr Pro Gly Pro Gly Leu Glu Val Thr Val Thr Gly

180 185 190

Ala Gly Leu Pro Gly Thr Gln Ser Leu Cys Leu Thr Ala Asp Ser Asp

195 200 205

Phe Leu Ala Leu Val Val Asp His Pro Glu Gly Ala Trp Arg Arg Pro

210 215 220

Gly Leu Ala Leu Thr Leu Arg Arg Arg Gly Asn Gly Ala Leu Leu Ser

225 230 235 240

Thr Ala Gln Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Ala Asp Ser Arg Cys Phe

245 250 255

Thr Arg Lys Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Arg Ser Ser

260 265 270

Ala Pro Met Pro Ala His Gly Arg Leu Asp Leu Val Pro Phe Pro Gln

275 280 285

Pro Arg Ala Ser Pro Glu Pro Glu Glu Ala Pro Pro Ser Ala Asp Pro

290 295 300

Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Ala Gly Pro Pro

305 310 315 320

Ala Arg Ala Ser Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala Leu Ala

325 330 335

Gly Phe Pro Gln Gly Gln Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu

340 345 350

Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Thr

355 360 365

Ala Ala Thr Thr Gly Val Pro Ala Thr Pro Gln Gly Pro Lys Ser Pro

370 375 380

Leu Trp Ala Ala Gly Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala

385 390 395 400

Val Ala Ala Glu Leu Arg Ala Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Ala Pro

405 410 415

Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Asn Pro Asp Ser

420 425 430

Pro Gly Gly Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly

435 440 445

Leu Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Ser Gly Ser Ala Arg Ala

450 455 460

Gln Arg

465

<210> 37

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 37

Leu Leu Arg Pro Gly Thr Pro Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser Ala

1 5 10 15

Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln Gln

20 25 30

Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro Leu

35 40 45

Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser Arg

50 55 60

Ala Pro Leu Arg Val Val Gly Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala Phe

65 70 75 80

Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr Thr

85 90 95

Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His Leu

100 105 110

Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu Val

115 120 125

Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu Arg

130 135 140

Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Ser Pro Pro Glu Leu Ala Leu

145 150 155 160

Leu Val Val Tyr Pro Gly Pro Gly Leu Glu Val Thr Val Thr Gly Ala

165 170 175

Gly Leu Pro Gly Thr Gln Ser Leu Cys Leu Thr Ala Asp Ser Asp Phe

180 185 190

Leu Ala Leu Val Val Asp His Pro Glu Gly Ala Trp Arg Arg Pro Gly

195 200 205

Leu Ala Leu Thr Leu Arg Arg Arg Gly Asn Gly Ala Leu Leu Ser Thr

210 215 220

Ala Gln Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Ala Asp Ser Arg Cys Phe Thr

225 230 235 240

Arg Lys Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Arg Ser Ser Ala

245 250 255

Pro Met Pro Ala His Gly Arg Leu Asp Leu Val Pro Phe Pro Gln Pro

260 265 270

Arg Ala Ser Pro Glu Pro Glu Glu Ala Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe

275 280 285

Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Ala Gly Pro Pro Ala

290 295 300

Arg Ala Ser Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala Leu Ala Gly

305 310 315 320

Phe Pro Gln Gly Gln Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg

325 330 335

Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Thr Ala

340 345 350

Ala Thr Thr Gly Val Pro Ala Thr Pro Gln Gly Pro Lys Ser Pro Leu

355 360 365

Trp Ala Ala Gly Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Val

370 375 380

Ala Ala Glu Leu Arg Ala Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Ala Pro Pro

385 390 395 400

Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Asn Pro Asp Ser Pro

405 410 415

Gly Gly Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu

420 425 430

Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Ser Gly Ser Ala Arg Ala Gln

435 440 445

Arg

<210> 38

<211> 442

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 38

Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser Ala Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln Gln Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser

20 25 30

Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro Leu Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr

35 40 45

Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser Arg Ala Pro Leu Arg Val Val Gly

50 55 60

Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr

65 70 75 80

His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr Thr Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly

85 90 95

Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu

100 105 110

Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val

115 120 125

Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly

130 135 140

Gly Ala Ser Pro Pro Glu Leu Ala Leu Leu Val Val Tyr Pro Gly Pro

145 150 155 160

Gly Leu Glu Val Thr Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Thr Gln Ser

165 170 175

Leu Cys Leu Thr Ala Asp Ser Asp Phe Leu Ala Leu Val Val Asp His

180 185 190

Pro Glu Gly Ala Trp Arg Arg Pro Gly Leu Ala Leu Thr Leu Arg Arg

195 200 205

Arg Gly Asn Gly Ala Leu Leu Ser Thr Ala Gln Leu Gln Ala Leu Leu

210 215 220

Phe Gly Ala Asp Ser Arg Cys Phe Thr Arg Lys Thr Pro Ala Leu Leu

225 230 235 240

Leu Leu Leu Pro Ala Arg Ser Ser Ala Pro Met Pro Ala His Gly Arg

245 250 255

Leu Asp Leu Val Pro Phe Pro Gln Pro Arg Ala Ser Pro Glu Pro Glu

260 265 270

Glu Ala Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu

275 280 285

Val Arg Ala Leu Ala Gly Pro Pro Ala Arg Ala Ser Pro Pro Arg Leu

290 295 300

Ala Leu Asp Pro Gly Ala Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Gln Val Asn

305 310 315 320

Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro

325 330 335

Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Thr Ala Ala Thr Thr Gly Val Pro Ala

340 345 350

Thr Pro Gln Gly Pro Lys Ser Pro Leu Trp Ala Ala Gly Leu Ala Arg

355 360 365

Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Val Ala Ala Glu Leu Arg Ala Leu

370 375 380

Pro Gly Leu Pro Pro Ala Ala Pro Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala

385 390 395 400

Leu Cys Pro Gly Asn Pro Asp Ser Pro Gly Gly Pro Leu Arg Ala Leu

405 410 415

Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg

420 425 430

Glu Arg Ser Gly Ser Ala Arg Ala Gln Arg

435 440

<210> 39

<211> 270

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 39

Met Pro Gly Pro Ser Leu Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Met Gly

1 5 10 15

Ala Leu Leu Arg Pro Gly Thr Pro Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser

20 25 30

Ala Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln

35 40 45

Gln Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro

50 55 60

Leu Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser

65 70 75 80

Arg Ala Pro Leu Arg Val Val Gly Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala

85 90 95

Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr

100 105 110

Thr Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His

115 120 125

Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu

130 135 140

Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu

145 150 155 160

Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Ser Pro Pro Glu Leu Ala

165 170 175

Leu Leu Val Val Tyr Pro Gly Pro Gly Leu Glu Val Thr Val Thr Gly

180 185 190

Ala Gly Leu Pro Gly Thr Gln Ser Leu Cys Leu Thr Ala Asp Ser Asp

195 200 205

Phe Leu Ala Leu Val Val Asp His Pro Glu Gly Ala Trp Arg Arg Pro

210 215 220

Gly Leu Ala Leu Thr Leu Arg Arg Arg Gly Asn Gly Ala Leu Leu Ser

225 230 235 240

Thr Ala Gln Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Ala Asp Ser Arg Cys Phe

245 250 255

Thr Arg Lys Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Arg

260 265 270

<210> 40

<211> 253

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 40

Leu Leu Arg Pro Gly Thr Pro Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser Ala

1 5 10 15

Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln Gln

20 25 30

Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro Leu

35 40 45

Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser Arg

50 55 60

Ala Pro Leu Arg Val Val Gly Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala Phe

65 70 75 80

Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr Thr

85 90 95

Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His Leu

100 105 110

Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu Val

115 120 125

Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu Arg

130 135 140

Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Ser Pro Pro Glu Leu Ala Leu

145 150 155 160

Leu Val Val Tyr Pro Gly Pro Gly Leu Glu Val Thr Val Thr Gly Ala

165 170 175

Gly Leu Pro Gly Thr Gln Ser Leu Cys Leu Thr Ala Asp Ser Asp Phe

180 185 190

Leu Ala Leu Val Val Asp His Pro Glu Gly Ala Trp Arg Arg Pro Gly

195 200 205

Leu Ala Leu Thr Leu Arg Arg Arg Gly Asn Gly Ala Leu Leu Ser Thr

210 215 220

Ala Gln Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Ala Asp Ser Arg Cys Phe Thr

225 230 235 240

Arg Lys Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Arg

245 250

<210> 41

<211> 246

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 41

Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser Ala Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln Gln Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser

20 25 30

Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro Leu Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr

35 40 45

Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser Arg Ala Pro Leu Arg Val Val Gly

50 55 60

Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr

65 70 75 80

His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr Thr Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly

85 90 95

Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu

100 105 110

Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val

115 120 125

Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly

130 135 140

Gly Ala Ser Pro Pro Glu Leu Ala Leu Leu Val Val Tyr Pro Gly Pro

145 150 155 160

Gly Leu Glu Val Thr Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly Thr Gln Ser

165 170 175

Leu Cys Leu Thr Ala Asp Ser Asp Phe Leu Ala Leu Val Val Asp His

180 185 190

Pro Glu Gly Ala Trp Arg Arg Pro Gly Leu Ala Leu Thr Leu Arg Arg

195 200 205

Arg Gly Asn Gly Ala Leu Leu Ser Thr Ala Gln Leu Gln Ala Leu Leu

210 215 220

Phe Gly Ala Asp Ser Arg Cys Phe Thr Arg Lys Thr Pro Ala Leu Leu

225 230 235 240

Leu Leu Leu Pro Ala Arg

245

<210> 42

<211> 170

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 42

Met Pro Gly Pro Ser Leu Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Met Gly

1 5 10 15

Ala Leu Leu Arg Pro Gly Thr Pro Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser

20 25 30

Ala Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln

35 40 45

Gln Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro

50 55 60

Leu Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser

65 70 75 80

Arg Ala Pro Leu Arg Val Val Gly Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala

85 90 95

Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr

100 105 110

Thr Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His

115 120 125

Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu

130 135 140

Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu

145 150 155 160

Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala

165 170

<210> 43

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 43

Leu Leu Arg Pro Gly Thr Pro Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser Ala

1 5 10 15

Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln Gln

20 25 30

Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro Leu

35 40 45

Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser Arg

50 55 60

Ala Pro Leu Arg Val Val Gly Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala Phe

65 70 75 80

Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr Thr

85 90 95

Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His Leu

100 105 110

Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu Val

115 120 125

Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu Arg

130 135 140

Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala

145 150

<210> 44

<211> 146

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 44

Arg Glu Glu Val Phe Ser Thr Ser Ala Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Gln Gln Ala Trp Asp Trp Pro Leu Ser

20 25 30

Ser Leu Trp Leu Pro Gly Ser Pro Leu Asp Pro Leu Cys Leu Val Thr

35 40 45

Leu His Gly Ser Gly Asn Gly Ser Arg Ala Pro Leu Arg Val Val Gly

50 55 60

Val Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Glu Ala Val Arg Arg Thr

65 70 75 80

His Trp Gly Leu Ser Asp Leu Thr Thr Phe Ala Val Cys Pro Ala Gly

85 90 95

Asn Gly Gln Pro Val Leu Pro His Leu Gln Arg Leu Gln Ala Trp Leu

100 105 110

Gly Glu Pro Gly Gly Arg Trp Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val

115 120 125

Thr Trp Glu Pro Thr Pro Leu Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly

130 135 140

Gly Ala

145

<210> 45

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 45

Val Leu Ala Val Asp Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg

1 5 10

<210> 46

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 46

Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg Leu Ser Thr Ala Arg

1 5 10

<210> 47

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 47

His Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu

1 5 10

<210> 48

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 48

Ala Leu Ala Val Asp His Pro Ala Arg Ala Trp Arg

1 5 10

<210> 49

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 49

Pro Arg Gly Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Ala Gln

1 5 10

<210> 50

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 50

Pro Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Phe

1 5 10

<210> 51

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 51

Val Leu Ala Leu Asp His Pro Val Gly Ala Trp His

1 5 10

<210> 52

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 52

Ala Arg Gly Asp Gly Ala Pro Leu Ser Thr Pro Gln

1 5 10

<210> 53

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 53

Ala Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu

1 5 10

<210> 54

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 54

Ala Leu Val Val Asp His Pro Glu Gly Ala Trp Arg

1 5 10

<210> 55

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 55

Arg Arg Gly Asn Gly Ala Leu Leu Ser Thr Ala Gln

1 5 10

<210> 56

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 56

Ser Arg Cys Phe Thr Arg Lys Thr Pro Ala Leu Leu

1 5 10

<210> 57

<211> 196

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 57

Glu Pro Ala Pro Leu Pro Ala His Gly Gln Leu Asp Thr Val Pro Phe

1 5 10 15

Pro Pro Pro Arg Pro Ser Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Pro Ser Ala

20 25 30

Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Val

35 40 45

Pro Pro Ala Arg Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Asp Ala

50 55 60

Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala

65 70 75 80

Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg

85 90 95

Pro Thr Ala Ala Thr Thr Gly Asp Pro Ala Pro Leu His Asp Pro Thr

100 105 110

Ser Ala Pro Trp Ala Thr Ala Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala

130 135 140

Thr Ala Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Pro

145 150 155 160

Gly Gly Leu Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu

165 170 175

Gln Gly Leu Arg Val Glu Trp Arg Gly Arg Asp Pro Arg Gly Pro Gly

180 185 190

Arg Ala Gln Arg

195

<210> 58

<211> 199

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 58

Gly Pro Ala Pro Met Pro Ala His Gly Arg Leu Asp Thr Val Pro Phe

1 5 10 15

Pro Pro Ala Arg Pro Ser Pro Glu Pro Glu Glu Pro Arg Pro Ser Ala

20 25 30

Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Gly

35 40 45

Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala

50 55 60

Leu Ala Ser Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala

65 70 75 80

Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro

85 90 95

Pro Thr Ala Ala Ala Ala Gly Asp Pro Ala Pro Leu Pro Asp Pro Ala

100 105 110

Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala

130 135 140

Ala Glu Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Asp Ala

145 150 155 160

Glu Asp Gln Gly Gly Pro Gly Gly Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu

165 170 175

Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Ser

180 185 190

Gly Pro Gly Arg Ala Gln Arg

195

<210> 59

<211> 199

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 59

Gly Pro Thr Ala Val Pro Ala Arg Gly Leu Leu Asp Leu Val Pro Phe

1 5 10 15

Pro Pro Pro Arg Pro Ser Arg Glu Pro Ala Glu Pro Pro Pro Ser Ala

20 25 30

Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Gly

35 40 45

Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala

50 55 60

Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu Leu Asn Leu Ser Asp Pro Ala Thr

65 70 75 80

Gln Glu Arg Leu Leu Gly Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro

85 90 95

Pro Pro Thr Ala Ala Ala Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Arg Pro Ala

100 105 110

Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly Leu Ala Leu Arg Val Ala Ala Glu Leu

115 120 125

Arg Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Gly Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala

130 135 140

Ala Ala Pro Leu Leu Glu Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu

165 170 175

Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Gly

180 185 190

Gly Pro Pro Arg Ala Gln Arg

195

<210> 60

<211> 196

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид

<400> 60

Ser Ser Ala Pro Met Pro Ala His Gly Arg Leu Asp Leu Val Pro Phe

1 5 10 15

Pro Gln Pro Arg Ala Ser Pro Glu Pro Glu Glu Ala Pro Pro Ser Ala

20 25 30

Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Ala Gly

35 40 45

Pro Pro Ala Arg Ala Ser Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala

50 55 60

Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Gln Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala

65 70 75 80

Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro

85 90 95

Pro Thr Ala Ala Thr Thr Gly Val Pro Ala Thr Pro Gln Gly Pro Lys

100 105 110

Ser Pro Leu Trp Ala Ala Gly Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Val Ala Ala Glu Leu Arg Ala Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala

130 135 140

Ala Pro Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Asn Pro

145 150 155 160

Asp Ser Pro Gly Gly Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu

165 170 175

Gln Gly Leu Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Ser Gly Ser Ala

180 185 190

Arg Ala Gln Arg

195

<210> 61

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 61

Leu Pro Ala His Gly Gln Leu Asp Thr Val Pro Phe

1 5 10

<210> 62

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 62

Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu Asp

1 5 10

<210> 63

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 63

Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu

1 5 10

<210> 64

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 64

Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Thr Ala Ala

1 5 10

<210> 65

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 65

Gly Asp Pro Ala Pro Leu His Asp Pro Thr Ser Ala

1 5 10

<210> 66

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 66

Asp Pro Thr Ser Ala Pro Trp Ala Thr Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 67

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 67

Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Val Glu Trp Arg

1 5 10

<210> 68

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 68

Arg Val Glu Trp Arg Gly Arg Asp Pro Arg Gly Pro

1 5 10

<210> 69

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 69

Met Pro Ala His Gly Arg Leu Asp Thr Val Pro Phe

1 5 10

<210> 70

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 70

Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Thr Ala Ala

1 5 10

<210> 71

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 71

Gly Asp Pro Ala Pro Leu Pro Asp Pro Ala Ser Ala

1 5 10

<210> 72

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 72

Asp Pro Ala Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly Leu Ala

1 5 10

<210> 73

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 73

Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Ala Glu Trp Arg

1 5 10

<210> 74

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 74

Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Ser Gly Pro

1 5 10

<210> 75

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 75

Val Pro Ala Arg Gly Leu Leu Asp Leu Val Pro Phe

1 5 10

<210> 76

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 76

Leu Ser Asp Pro Ala Thr Gln Glu Arg Leu Leu Gly

1 5 10

<210> 77

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 77

Glu Arg Leu Leu Gly Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu

1 5 10

<210> 78

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 78

Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Thr Ala Ala

1 5 10

<210> 79

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 79

Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Arg Pro Ala Ser Ala

1 5 10

<210> 80

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 80

Arg Pro Ala Ser Ala Pro Trp Ala Ala Gly Leu Ala

1 5 10

<210> 81

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 81

Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Gly Gly Pro

1 5 10

<210> 82

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 82

Met Pro Ala His Gly Arg Leu Asp Leu Val Pro Phe

1 5 10

<210> 83

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 83

Gly Val Pro Ala Thr Pro Gln Gly Pro Lys Ser Pro

1 5 10

<210> 84

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 84

Gly Pro Lys Ser Pro Leu Trp Ala Ala Gly Leu Ala

1 5 10

<210> 85

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> эпитоп

<400> 85

Arg Ala Glu Trp Arg Gly Arg Glu Arg Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 86

<211> 468

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полинуклеотид

<400> 86

atgcgggacc tgcccctgac aagcctggct ctggtgctgt ctgctctggg agccctcctg 60

ggaacagaag ccctgagagc cgaagaacct gccgtgggca catccggcct gatcttcaga 120

gaggacctgg actggcctcc cggcagccct caggaacctc tctgtctggt cgctctgggc 180

ggcgacagca atggctctag cagccctctg agagtcgtgg gcgccctgtc tgcctacgag 240

caggcttttc tgggagccgt gcagagggct agatggggcc ctagagatct ggccaccttc 300

ggcgtgtgca acaccggcga tagacaggcc gctctgccca gcctgagaag gctgggagct 360

tggctgagag atcctggcgg ccagagactg gtggtgctgc acctggaaga agtgacctgg 420

gagcctaccc ctagcctgcg gtttcaggaa ccacctcctg gcggagcc 468

<210> 87

<211> 765

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полинуклеотид

<400> 87

atgcgggacc tgcccctgac aagcctggct ctggtgctgt ctgctctggg agccctcctg 60

ggaacagaag ccctgagagc cgaagaacct gccgtgggca catccggcct gatcttcaga 120

gaggacctgg actggcctcc cggcagccct caggaacctc tctgtctggt cgctctgggc 180

ggcgacagca atggctctag cagccctctg agagtcgtgg gcgccctgtc tgcctacgag 240

caggcttttc tgggagccgt gcagagggct agatggggcc ctagagatct ggccaccttc 300

ggcgtgtgca acaccggcga tagacaggcc gctctgccca gcctgagaag gctgggagct 360

tggctgagag atcctggcgg ccagagactg gtggtgctgc acctggaaga agtgacctgg 420

gagcctaccc ctagcctgcg gtttcaggaa ccacctcctg gcggagccgg acctcctgaa 480

ctggctctgc tggtcctgta tcctggccct ggccccgaag tgaccgtgac aagagctgga 540

ctgcctggcg cccagtccct gtgccctagc agagacacca gatacctggt gctggccgtg 600

gacagacctg ccggcgcttg gagaggaagt ggcctggcac tgaccctgca gcccagaggc 660

gaggatagca gactgagcac cgccagactg caggccctgc tgtttggcga cgaccaccgg 720

tgcttcacca gaatgacccc tgccctgctg ctgctcccca gatct 765

<210> 88

<211> 1353

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полинуклеотид

<400> 88

atgcgggacc tgcccctgac aagcctggct ctggtgctgt ctgctctggg agccctcctg 60

ggaacagaag ccctgagagc cgaagaacct gccgtgggca catccggcct gatcttcaga 120

gaggacctgg actggcctcc cggcagccct caggaacctc tctgtctggt cgctctgggc 180

ggcgacagca atggctctag cagccctctg agagtcgtgg gcgccctgtc tgcctacgag 240

caggcttttc tgggagccgt gcagagggct agatggggcc ctagagatct ggccaccttc 300

ggcgtgtgca acaccggcga tagacaggcc gctctgccca gcctgagaag gctgggagct 360

tggctgagag atcctggcgg ccagagactg gtggtgctgc acctggaaga agtgacctgg 420

gagcctaccc ctagcctgcg gtttcaggaa ccacctcctg gcggagccgg acctcctgaa 480

ctggctctgc tggtcctgta tcctggccct ggccccgaag tgaccgtgac aagagctgga 540

ctgcctggcg cccagtccct gtgccctagc agagacacca gatacctggt gctggccgtg 600

gacagacctg ccggcgcttg gagaggaagt ggcctggcac tgaccctgca gcccagaggc 660

gaggatagca gactgagcac cgccagactg caggccctgc tgtttggcga cgaccaccgg 720

tgcttcacca gaatgacccc tgccctgctg ctgctcccca gatctgaacc tgctcctctg 780

cctgcccacg gacagctgga taccgtgcct ttcccaccac ctagacccag cgccgagctg 840

gaagagtctc ctcctagcgc cgaccccttc ctggaaaccc tgactagact cgtgcgggcc 900

ctgagggtgc caccagctag agcatctgcc cctagactgg cactggatcc cgatgccctg 960

gccggctttc ctcagggact cgtgaacctg tctgacccag ccgctctgga aagactgctg 1020

gacggcgaag aaccactcct cctgctgctc agacctaccg ccgccacaac aggcgatcct 1080

gcccctctgc atgatcccac atctgctcca tgggccaccg ccctggctag aagagtggct 1140

gctgaactgc aggctgccgc cgctgagctg agatctctgc caggactgcc tcctgccaca 1200

gccccactgc tggctagact gctcgctctg tgtccaggcg gacctggcgg actgggagat 1260

ccactgagag cactgctgct cctcaaggcc ctccagggcc tcagggtcga atggcgggga 1320

agagatccta gaggcccagg cagagcccag aga 1353

<210> 89

<211> 1679

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полинуклеотид

<400> 89

atgcgggacc tgcccctgac aagcctggct ctggtgctgt ctgctctggg agccctcctg 60

ggaacagaag ccctgagagc cgaagaacct gccgtgggca catccggcct gatcttcaga 120

gaggacctgg actggcctcc cggcagccct caggaacctc tctgtctggt cgctctgggc 180

ggcgacagca atggctctag cagccctctg agagtcgtgg gcgccctgtc tgcctacgag 240

caggcttttc tgggagccgt gcagagggct agatggggcc ctagagatct ggccaccttc 300

ggcgtgtgca acaccggcga tagacaggcc gctctgccca gcctgagaag gctgggagct 360

tggctgagag atcctggcgg ccagagactg gtggtgctgc acctggaaga agtgacctgg 420

gagcctaccc ctagcctgcg gtttcaggaa ccacctcctg gcggagccgg acctcctgaa 480

ctggctctgc tggtcctgta tcctggccct ggccccgaag tgaccgtgac aagagctgga 540

ctgcctggcg cccagtccct gtgccctagc agagacacca gatacctggt gctggccgtg 600

gacagacctg ccggcgcttg gagaggaagt ggcctggcac tgaccctgca gcccagaggc 660

gaggatagca gactgagcac cgccagactg caggccctgc tgtttggcga cgaccaccgg 720

tgcttcacca gaatgacccc tgccctgctg ctgctcccca gatctgaacc tgctcctctg 780

cctgcccacg gacagctgga taccgtgcct ttcccaccac ctagacccag cgccgagctg 840

gaagagtctc ctcctagcgc cgaccccttc ctggaaaccc tgactagact cgtgcgggcc 900

ctgagggtgc caccagctag agcatctgcc cctagactgg cactggatcc cgatgccctg 960

gccggctttc ctcagggact cgtgaacctg tctgacccag ccgctctgga aagactgctg 1020

gacggcgaag aaccactcct cctgctgctc agacctaccg ccgccacaac aggcgatcct 1080

gcccctctgc atgatcccac atctgctcca tgggccaccg ccctggctag aagagtggct 1140

gctgaactgc aggctgccgc cgctgagctg agatctctgc caggactgcc tcctgccaca 1200

gccccactgc tggctagact gctcgctctg tgtccaggcg gacctggcgg actgggagat 1260

ccactgagag cactgctgct cctcaaggcc ctccagggcc tcagggtcga atggcgggga 1320

agagatccta gaggcccagg cagagcccag agaagcgctg gcgctacagc tgccgatgga 1380

ccttgcgctc tgcgggaact gagcgtggac ctgagggccg agagaagcgt cctgatcccc 1440

gagacatacc aggccaacaa ctgccagggc gtgtgcggct ggcctcagag cgacagaaac 1500

cccagatacg gcaatcacgt ggtgctgctg ctgaagatgc aagtccgagg cgccgctctg 1560

gcaagacctc cttgttgtgt gcctaccgcc tacgccggca agctgctgat ctccctgagc 1620

gaggaacgga tagcgcccac cacgtgccca acatggtggc cacagagtgc ggctgccgg 1679

<210> 90

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 90

Met Arg Asp Leu Pro Leu Thr Ser Leu Ala Leu Val

1 5 10

<210> 91

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 91

Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Leu Gly Ala Leu

1 5 10

<210> 92

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 92

Ala Leu Gly Ala Leu Leu Gly Thr Glu Ala Leu Arg

1 5 10

<210> 93

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 93

Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val Gly

1 5 10

<210> 94

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 94

Glu Pro Ala Val Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg

1 5 10

<210> 95

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 95

Gly Leu Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro

1 5 10

<210> 96

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 96

Leu Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu

1 5 10

<210> 97

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 97

Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly

1 5 10

<210> 98

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 98

Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn Gly Ser Ser Ser

1 5 10

<210> 99

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 99

Asn Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val Val Gly Ala

1 5 10

<210> 100

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 100

Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Ala

1 5 10

<210> 101

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 101

Ala Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg

1 5 10

<210> 102

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 102

Gly Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp

1 5 10

<210> 103

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 103

Trp Gly Pro Arg Asp Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys

1 5 10

<210> 104

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 104

Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala

1 5 10

<210> 105

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 105

Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu Pro Ser Leu Arg Arg

1 5 10

<210> 106

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 106

Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Arg Asp

1 5 10

<210> 107

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 107

Ala Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln Arg Leu Val

1 5 10

<210> 108

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 108

Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val

1 5 10

<210> 109

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 109

His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Ser

1 5 10

<210> 110

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 110

Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro

1 5 10

<210> 111

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 111

Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gly Pro Pro

1 5 10

<210> 112

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 112

Gly Ala Gly Pro Pro Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu

1 5 10

<210> 113

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 113

Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Glu

1 5 10

<210> 114

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 114

Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Arg Ala Gly

1 5 10

<210> 115

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 115

Val Thr Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu

1 5 10

<210> 116

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 116

Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp Thr Arg

1 5 10

<210> 117

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 117

Ser Arg Asp Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp

1 5 10

<210> 118

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 118

Ala Gly Ala Trp Arg Gly Ser Gly Leu Ala Leu Thr

1 5 10

<210> 119

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 119

Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly Glu Asp

1 5 10

<210> 120

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 120

Leu Ser Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly

1 5 10

<210> 121

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 121

Ala Leu Leu Phe Gly Asp Asp His Arg Cys Phe Thr

1 5 10

<210> 122

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 122

Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Arg Ser Glu Pro

1 5 10

<210> 123

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 123

Pro Arg Ser Glu Pro Ala Pro Leu Pro Ala His Gly

1 5 10

<210> 124

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 124

Asp Thr Val Pro Phe Pro Pro Pro Arg Pro Ser Ala

1 5 10

<210> 125

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 125

Pro Arg Pro Ser Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Pro

1 5 10

<210> 126

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 126

Glu Glu Ser Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu

1 5 10

<210> 127

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 127

Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg

1 5 10

<210> 128

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 128

Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Val Pro Pro Ala

1 5 10

<210> 129

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 129

Arg Val Pro Pro Ala Arg Ala Ser Ala Pro Arg Leu

1 5 10

<210> 130

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 130

Ser Ala Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Asp Ala Leu

1 5 10

<210> 131

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 131

Asp Pro Asp Ala Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu

1 5 10

<210> 132

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 132

Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala

1 5 10

<210> 133

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 133

Arg Pro Thr Ala Ala Thr Thr Gly Asp Pro Ala Pro

1 5 10

<210> 134

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 134

Ala Thr Ala Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu

1 5 10

<210> 135

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 135

Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu

1 5 10

<210> 136

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 136

Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro

1 5 10

<210> 137

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 137

Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Thr Ala Pro Leu Leu

1 5 10

<210> 138

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 138

Thr Ala Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys

1 5 10

<210> 139

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 139

Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Pro Gly Gly Leu

1 5 10

<210> 140

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 140

Gly Pro Gly Gly Leu Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu

1 5 10

<210> 141

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 141

Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln

1 5 10

<210> 142

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 142

Asp Pro Arg Gly Pro Gly Arg Ala Gln Arg Ser Ala

1 5 10

<210> 143

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 143

Ala Gln Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ala Ala Asp Gly

1 5 10

<210> 144

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 144

Thr Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu Leu

1 5 10

<210> 145

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 145

Ala Leu Arg Glu Leu Ser Val Asp Leu Arg Ala Glu

1 5 10

<210> 146

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 146

Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu

1 5 10

<210> 147

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 147

Val Leu Ile Pro Glu Thr Tyr Gln Ala Asn Asn Cys

1 5 10

<210> 148

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 148

Gln Ala Asn Asn Cys Gln Gly Val Cys Gly Trp Pro

1 5 10

<210> 149

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 149

Val Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp Arg Asn Pro Arg

1 5 10

<210> 150

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 150

Asp Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu

1 5 10

<210> 151

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 151

Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln Val Arg

1 5 10

<210> 152

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 152

Lys Met Gln Val Arg Gly Ala Ala Leu Ala Arg Pro

1 5 10

<210> 153

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 153

Ala Leu Ala Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala

1 5 10

<210> 154

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 154

Cys Val Pro Thr Ala Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Ile

1 5 10

<210> 155

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 155

Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile

1 5 10

<210> 156

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 156

Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala His His Val Pro Asn

1 5 10

<210> 157

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 157

His His Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly

1 5 10

<210> 158

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 158

Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

1 5 10

<---

1. Способ получения антител против AMH млекопитающих (антимюллеров гормон млекопитающих), отличающийся тем, что содержит стадии:

(i) иммунизации животного полипептидом AMH или полинуклеотидом, кодирующим указанный полипептид AMH, где указанный полипептид AMH выбран из:

- последовательности человека, содержащей по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 и не более 560 аминокислот последовательности SEQ ID NO:2,

- последовательности лошади, содержащей по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:14 и не более 573 аминокислот последовательности SEQ ID NO:15;

- последовательности собаки, содержащей по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:23 и не более 572 аминокислот последовательности SEQ ID NO:24, и

- бычьей последовательности, содержащей по меньшей мере 100 аминокислот последовательности SEQ ID NO:32 и не более 572 аминокислот последовательности SEQ ID NO:33;

(ii) получения гибридом из клеток лимфоидного органа животного, получившего иммуноген,

(iii) отбора гибридом, секретирующих антитела, распознающие полипептид AMH, выбранные из:

- антител, распознающих полипептид AMH человека, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NО:1 и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8, но не распознающих ни (a) полипептид AMH человека, содержащий по меньшей мере 131 аминокислот последовательности SEQ ID NO:13 и не более 156 аминокислот последовательности SEQ ID NО:11, ни (b) любой линейный эпитоп, расположенный в последовательности SEQ ID NО:1,

- антител, распознающих полипептид AMH лошади, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NО:14 и не более 573 аминокислот последовательности SEQ ID NO:15, но не распознающих ни (a) полипептид AMH лошади с последовательностью SEQ ID NО:21 или с последовательностью SEQ ID NО:22, ни (b) любой линейный эпитоп, расположенный в последовательности SEQ ID NО:14,

- антител, распознающих последовательность собаки, содержащую по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NО:23 и не более 572 аминокислот последовательности SEQ ID NО:24, но не распознающих ни (a) полипептид AMH собаки с последовательностью SEQ ID NО:30 или с последовательностью SEQ ID NО:31, ни (b) любой линейный эпитоп, расположенный в последовательности SEQ ID NО:23,

- антител, распознающих бычью последовательность, содержащую по меньшей мере 100 аминокислот последовательности SEQ ID NО:32 и не более 575 аминокислот последовательности SEQ ID NО:33, но не распознающих ни (a) полипептид бычьего AMH, содержащий по меньшей мере 146 аминокислот последовательности SEQ ID NО:44 или по меньшей мере 170 аминокислот последовательности SEQ ID NО:42, ни (b) любой линейный эпитоп, расположенный в последовательности SEQ ID NО:32, и

(iv) получения антител.

2. Способ получения антител против AMH по п.1, где используемый иммуноген представляет собой полипептид AMH человека или полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид AMH человека, который содержит по меньшей мере 230 аминокислот последовательности SEQ ID NO:10 и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8, предпочтительно выбранный из полипептидов AMH последовательностей SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10.

3. Способ получения антител против AMH по п.1, где используемый иммуноген представляет собой полипептид AMH человека или полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид AMH человека, который содержит по меньшей мере 535 аминокислот последовательности SEQ ID NO:4, предпочтительно выбранный из полипептидов AMH последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4.

4. Способ получения антител против AMH по любому из пп.1-3, где полипептид AMH человека (a), который не распознается антителами, представляет собой полипептид с последовательностями, выбранными из: SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13.

5. Способ получения антител против AMH по любому из пп.1-4, где линейные эпитопы (b), которые не распознаются антителами, представляют собой последовательности SEQ ID NO:45-56.

6. Способ получения антител против AMH по любому из пп.1-4, где

- млекопитающее является человеком, иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид AMH, который содержит по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 и не более 560 аминокислот последовательности SEQ ID NO:2, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:1 и не более 255 аминокислот последовательности SEQ ID NO:8, и полипептид AMH (a), который не распознается антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 131 аминокислоту последовательности SEQ ID NO:13 и не более 156 аминокислот последовательности SEQ ID NO:11, или

- млекопитающее представляет собой лошадь, иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, который содержит по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:14 и не более 573 аминокислот последовательности SEQ ID NO:15, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:14 и не более 265 аминокислот последовательности SEQ ID NO:19, и полипептид AMH (a), не распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 144 аминокислоты последовательности SEQ ID NO:22 и не более 166 аминокислот последовательности SEQ ID NO:21, или

- млекопитающее представляет собой собаку, иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, который содержит по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:23 и не более 572 аминокислот последовательности SEQ ID NO:24, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 99 аминокислот последовательности SEQ ID NO:23 и не более 264 аминокислот последовательности SEQ ID NO:28, и полипептид AMH (a), который не распознается антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 144 аминокислоты последовательности SEQ ID NO:31 и не более 165 аминокислот последовательности SEQ ID NO:30, или

- млекопитающее относится к крупному рогатому скоту, иммуноген представляет собой полипептид AMH или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид AMH, который содержит по меньшей мере 100 аминокислот последовательности SEQ ID NO:32 и не более 575 аминокислот последовательности SEQ ID NO:33, полипептид AMH, распознаваемый антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 100 аминокислот последовательности SEQ ID NO:32 и не более 270 аминокислот последовательности SEQ ID NO:39, и полипептид AMH (a), который не распознается антителами, секретируемыми гибридомами, представляет собой полипептид AMH, содержащий по меньшей мере 146 аминокислот последовательности SEQ ID NO:44 и не более 270 аминокислот последовательности SEQ ID NO:42.