Оптимизированные гены и экспрессионные кассеты cln1, и их применение

Настоящая группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид PPT1 или его фрагмент, экспрессионная кассета, экспрессионный вектор, трансформированная клетка, фармацевтическая композиция, способы их применения для доставки ORF CLN1 в клетку или субъекту и способу лечения расстройства, связанного с аберрантной экспрессией гена CLN1 или аберрантной активностью продукта гена CLN1 у субъекта. Изобретение позволяет получить полинуклеотид, который содержит оптимизированную открытую рамку считывания CLN1 и применяется для лечения инфантильного нейронального липофусциноза (инфантильной болезни Баттена). 8 н. и 31 з.п. ф-лы, 14 ил., 3 табл., 1 пр.

 

Заявление о приоритете

[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки США № 62/349411, поданной 13 июня 2016 года, полное содержание которой включено здесь посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

[0002] Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, содержащим оптимизированные последовательности открытой рамки считывания (ORF) CLN1, векторам (вирусным или невирусным векторам), содержащим полинуклеотиды, и способам применения полинуклеотидов для доставки ORF CLN1 в клетку или субъекту, и способам применения полинуклеотидов для лечения инфантильного нейронального цероидного липофусциноза (инфантильной болезни Баттена).

Уровень техники

[0003] Нейрональный цероидный липофусциноз (NCL) относится к семейству, по меньшей мере, восьми генетически различных нейродегенеративных расстройств, которые являются результатом избыточного накопления липопигментов (липофусцина) в тканях организма. Эти липопигменты состоят из жиров и белков. Липофусцины образуются в нейронных клетках и многих органах, включая печень, селезенку, миокард и почки.

[0004] Инфантильная форма заболевания, известного как инфантильный нейрональный цероидный липофусциноз (INCL) или инфантильная болезнь Баттена, вызвана мутациями в гене CLN1 и является аутосомно-рецессивным заболеванием. У некоторые детей с мутациями в CLN1 наступает более позднее начало проявления симптомов и более медленное прогрессирование заболевания, которое напоминает заболевание с началом в юношеском возрасте и чаще ассоциируется с мутациями в гене CLN3. Ген CLN1, расположенный в 1p32, кодирует лизосомальный фермент, называемый пальмитоилпротеинтиоэстеразой-1 (PPT1). Недостаточность PPT1 приводит к аномальному отложению белков и липидов в нейронах и других клетках и нарушенной клеточной функции.

[0005] Эффективные способы лечения INCL отсутствуют, хотя предпринимались попытки лечения заместительной ферментной терапией (см., например, патент США № 7442372) и генной терапией. Также тестировали введение нейрональных стволовых клеток и других агентов (см., например, патент США № 8242086, публикацию заявки на патент США № 2015/0313863), но клиническая эффективность таких способов все еще исследуется.

[0006] Следовательно, существует потребность в новой эффективной терапии для лечения расстройств, связанных с экспрессией CLN1, таких как INCL.

Сущность изобретения

[0007] Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на разработке оптимизированных генов CLN1, экспрессионных кассет и векторов, способных обеспечивать терапевтические уровни экспрессии CLN1 для лечения расстройств, связанных с экспрессией CLN1, таких как INCL.

[0008] Таким образом, один аспект изобретения относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид PPT1 или его фрагмент, где нуклеотидная последовательность кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке человека. В одном варианте осуществления полинуклеотид содержит открытую рамку считывания CLN1 человека.

[0009] Еще один аспект изобретения относится к экспрессионной кассете, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид PPT1 или его фрагмент, и векторам, трансформированным клеткам и трансгенным животным, содержащим полинуклеотид по изобретению. В одном варианте осуществления полинуклеотид содержит открытую рамку считывания CLN1 человека.

[0010] Еще один аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей полинуклеотид, экспрессионную кассету, вектор и/ или трансформированную клетку по изобретению, в фармацевтически приемлемом носителе.

[0011] Еще один аспект изобретения относится к способу экспрессии полинуклеотида, кодирующего PPT1 или ее фрагмент в клетке, включающий контактирование клетки с полинуклеотидом, экспрессионной кассетой и/или вектором по изобретению, тем самым обеспечивая экспрессию полинуклеотида или его фрагмента в клетке. В одном варианте осуществления полинуклеотид содержит открытую рамку считывания CLN1. В еще одном варианте осуществления открытая рамка считывания CLN1 представляет открытую рамку считывания CLN1 человека. В еще одном варианте осуществления открытая рамка считывания CLN1 кодон-оптимизирована для экспрессии в клетках человека.

[0012] Еще один аспект изобретения относится к способу экспрессии полипептида PPT1 или его фрагмента у субъекта, включающему доставку субъекту полинуклеотида, экспрессионной кассеты, вектора и/или трансформированной клетки по изобретению, тем самым обеспечивая экспрессию полипептида PPT1 или его фрагмента у субъекта. В одном варианте осуществления полинуклеотид содержит открытую рамку считывания CLN1. В еще одном варианте осуществления открытая рамка считывания CLN1 представляет открытую рамку считывания CLN1 человека.

[0013] Дополнительный аспект изобретения относится к способу лечения расстройства, связанного с аберрантной экспрессией гена CLN1 или полипептида PPT1 или аберрантной активностью продукта гена CLN1 у субъекта, нуждающегося в этом, включающему доставку субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, экспрессионной кассеты, вектора и/или трансформированной клетки по изобретению, тем самым обеспечивая лечение расстройства, связанного с аберрантной экспрессией гена CLN1 у субъекта или полипептида PPT1.

[0014] Еще один аспект изобретения относится к полинуклеотиду, экспрессионной кассете, вектору и/или трансформированной клетке по изобретению для применения в способе лечения расстройства, связанного с аберрантной экспрессией гена CLN1 у субъекта, в нуждаются в этом.

[0015] Эти и другие аспекты изобретения более подробно описаны ниже в описании изобретения.

Краткое описание фигур

[0016] На фиг. 1 показана карта экспрессионной кассеты CLN1.

[0017] На фиг. 2 приведены кривые выживаемости для всех групп мышей с нокаутом гена CLN1, обработанных CLA1 AAV вектором по изобретению. NIV = новорожденные мыши с в/в введением; IT = люмбальная интратекальная инъекция; IV = внутривенная инъекция; ICM = инъекция в мостомозжечковую цистерну; d.o. = возраст в сутках; w.o. = возраст в неделях; KO = нокаут. Возраст представляет возраст, когда проводили инъекционное введение. «Гибель» оценивали по 20% снижению массы тела или тяжелой степени заболеваемости, требующей эвтаназии.

[0018] На фиг. 3 приведены кривые выживаемости для групп мышей с нокаутом гена CLN1, обработанных CLN1 AAV вектором по изобретению в возрасте 4 недель.

[0019] На фиг. 4 приведены кривые выживаемости для групп мышей с нокаутом гена CLN1, обработанных CLN1 AAV вектором по изобретению в возрасте 26 недель.

[0020] На фиг. 5 приведены кривые выживаемости для групп мышей с нокаутом гена CLN1 с внутривенным введением, обработанных CLN1 AAV вектором по изобретению.

[0021] На фиг. 6 показаны кривые выживаемости для групп мышей с нокаутом гена CLN1 с интратекальным введением, обработанных CLN1 AAV вектором по изобретению.

[0022] На фиг. 7A-7B показано, что обработка scAAV9/CLN1 повышает уровни PPT1 в сыворотке крови и увеличивает выживаемость мышей. A. Мышей с нокаутом гена CLN1 обрабатывали интратекально в указанном возрасте и сыворотку отбирали через 3 месяца или в гуманной конечной точке. Данные выражены в виде нмоль субстрата в ч на мл сыворотки. Необработанные мыши KO выпадают из масштаба (значения <1), поэтому не показаны. B. На кривых Каплана-Мейера проводится сравнение мышей, обработанных в низкой дозе (верхняя панель) и высокой дозе (нижняя панель) в разном возрасте. Необработанные мыши KO показаны на обеих панелях в качестве стандарта.

[0023] На фиг. 8A-8B показаны результаты поведенческого теста с вращающимся стержнем в режиме ускорения. Каждая точка представляет средний латентный период для каждой мыши в двух испытаниях в определенном возрасте проведения испытания. A. Группы с началом проведения поведенческого теста в возрасте < 1 года. B. Группа с началом проведения поведенческого теста в возрасте > 1 года. Односторонний ANOVA с апостериорным множественным сравнением Тьюки использовали для оценки различий в средних значениях по группам по сравнению с необработанными HET (*) или необработанными KO (#): */# p <0,05, **/## p <0,01, ***/### p <0,001.

[0024] На фиг. 9A-9B показаны результаты оценки скорости плавания в водном лабиринте Морриса. Каждая точка представляет скорость плавания для каждой мыши в возрасте проведения испытания, усредненная за 2-3 суток с 4 испытаниями в сутки. A. Группы с началом проведения поведенческого теста в возрасте < 1 года. Односторонний ANOVA с апостериорным множественным сравнением Тьюки использовали для оценки различий в средних значениях по группам по сравнению с необработанными HET (*) или необработанными KO (#): */# p <0,05, **/## p <0,01, ***/### p <0,001. B. Группа с началом проведения поведенческого теста в возрасте > 1 года. Различия в средних значениях по группам определяли непарным t-тестом Стьюдента: **p < 0,01.

[0025] На фиг. 10A-10B показаны результаты по времени поиска нахождения платформы в водном лабиринте Морриса. Каждая точка представляет время поиска нахождения платформы для каждой мыши в возрасте проведения испытания, усредненное за 2-3 суток с 4 испытаниями в сутки. A. Группы с началом проведения поведенческого теста в возрасте < 1 года. Односторонний ANOVA с апостериорным множественным сравнением Тьюки использовали для оценки различий средних значений по группам по сравнению с необработанными HET (*) или необработанными KO (#):*/# p <0,05, **/## p <0,01, ***/### p <0,001. B. Группа с началом проведения поведенческого теста в возрасте > 1 года. Различия в средних значениях по группам определяли непарным t-тестом Стьюдента: **p <0,01, ***p <0,001.

[0026] На фиг. 11A-11B приведены результаты определения расстояния плавания в водном лабиринте Морриса. Каждая точка представляет расстояние плавания для каждой мыши в возрасте проведения испытания, усредненное за 2-3 суток с 4 испытаниями в сутки. A. Группы с началом проведения поведенческого теста в возрасте < 1 года. Односторонний ANOVA с апостериорным множественным сравнением Тьюки использовали для оценки различий средних значений по группам по сравнению с необработанными HET (*) или необработанными КО (#): **/## p <0,01, ***/### p < 0,001. B. Группа с началом проведения поведенческого теста в возрасте > 1 года. Различия в средних значениях по группам определяли непарным t-тестом Стьюдента: ** p <0,01.

[0027] На фиг. 12A-12B приведены результаты оценки времени удерживания до падения с перевернутой подвешенной проволоки. Каждая точка представляет данные для каждой мыши в возрасте проведения испытания. A. Группы с началом проведения поведенческого теста в возрасте < 1 года. Односторонний ANOVA с апостериорным множественным сравнением Тьюки использовали для оценки различий в средних значениях по группам по сравнению с необработанными HET (*) или необработанными KO (#): ***/### p <0,001. B. Группа с началом проведения поведенческого теста в возрасте > 1 года. Различия в средних значениях по группам определяли непарным t-тестом Стьюдента.

[0028] На фиг. 13A-13B приведены результаты оценки координации в тесте с перевернутой подвешенной проволокой. Каждая точка представляет данные для каждой мыши в возрасте проведения испытания. A. Группы с началом проведения поведенческого теста в возрасте < 1 года. Односторонний ANOVA с апостериорным множественным сравнением Тьюки использовали для оценки различий в средних значениях по группам по сравнению с необработанными HET (*) или необработанными KO (#): ***/### p < 0,001. B. Группа с началом проведения поведенческого теста в возрасте > 1 года. Различия в средних значениях по группам определяли непарным t-тестом Стьюдента.

[0029] На фиг. 14A-14H приведены данные по мышам CLN KO и HET, обработанным в/в, и новорожденные мыши имеют нормальную продолжительность жизни и поведение. Все кривые относятся к новорожденным мышам. А. Кривая Каплана-Мейера. указывает, что NIV-обработанные животные HET были здоровы, но были подвергнуты эвтаназии через 18 месяцев для проведения анализа. B. Анализ активности PPT1 в сыворотке крови, показывающий сравнение NIV-обработанных мышей против необработанных HET. C. Тест на вращающемся стержне в режиме ускорения. D. Время поиска нахождения платформы в водном лабиринте Морриса. E. Оценка скорости плавания в водном лабиринте Морриса. F. Расстояние плавания в водном лабиринте Морриса. G. Время удерживания до падения с перевернутой подвешенной проволоки. H. Оценка координации в тесте с перевернутой подвешенной проволокой. Различия в средних значениях для обработанных групп и необработанных групп HET определяли непарным t-тестом Стьюдента: * p <0,05.

Подробное описание изобретения

[0030] Настоящее изобретение поясняется более подробно ниже. Данное описание не предназначено для подробного перечня всех различных способов реализации изобретения или всех признаков, которые могут быть добавлены к настоящему изобретению. Например, признаки, иллюстрированные в отношении одного варианта осуществления, могут быть включены в другие варианты осуществления, и признаки, иллюстрированные в отношении конкретного варианта осуществления, могут быть удалены из данного варианта осуществления. Кроме того, многочисленные варианты и дополнения к различным вариантам осуществления, предложенным здесь, будут очевидны специалистам в данной области в свете настоящего раскрытия, не отступая от сущности и объема настоящего изобретения. Следовательно, следующее описание предназначено для иллюстрации некоторых конкретных вариантов осуществления изобретения, и не для исчерпывающего определения всех перестановок, комбинаций и их вариантов.

[0031] Если контекст не указывает иное, то специфически предусматривается, что различные признаки изобретения, описанные здесь, могут использоваться в любой комбинации. Кроме того, настоящее изобретение также предусматривает, что в некоторых вариантах осуществления изобретения любой признак или комбинация признаков, изложенных здесь, могут быть исключены или опущены. Для иллюстрации, если в описании указано, что комплекс включает компоненты А, В и С, то специфически предусматривается, что любой из А, В или С или их комбинация могут быть опущены и исключены по отдельности или в любой комбинации.

[0032] Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится настоящее изобретение. Терминология, используемая в описании настоящего изобретения, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения изобретения.

[0033] Нуклеотидные последовательности представлены здесь только одной цепью в направлении от 5' к 3', слева направо, если конкретно не указано иное. Нуклеотиды и аминокислоты представлены здесь символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB, или (для аминокислот) однобуквенным кодом или трехбуквенным кодом, в соответствии с правилами, изложенными в 37 C.F.R. 1.822, и как установлено для использования.

[0034] Если не указано иное, то стандартные методы, известные специалистам в данной области, могут использоваться для получения рекомбинантных и синтетических полипептидов, антител или их антигенсвязывающих фрагментов, манипулирования с последовательностями нуклеиновых кислот, получения трансформированных клеток, получения конструкций rAAV, модифицированных капсидных белков, упаковочных векторов, экспрессирующих последовательности rep и/или cap AAV, и транзиторно и стабильно трансфицированных пакующих клеток. Такие методы известны специалистам в данной области техники. См., например, SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2^nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); F. M. AUSUBEL et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York).

[0035] Все публикации, заявки на патент, патенты, нуклеотидные последовательности, аминокислотные последовательности и другие источники, упомянутые здесь, включены посредством ссылки во всей их полноте.

Определения

[0036] Как используется в описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, единственные формы «a», «an» и «the» также включают множественные формы, если контекст явно не указывает иное.

[0037] Как здесь используется, выражение «и/или» относится и включает любой и все возможные комбинации одного или более связанных перечисленных пунктов, а также к отсутствию комбинаций при интерпретации в альтернативе («или»).

[0038] Кроме того, настоящее изобретение также предусматривает, что в некоторых вариантах осуществления изобретения любой признак или комбинация признаков, изложенных здесь, могут быть исключены или опущены.

[0039] Кроме того, как здесь используется, термин «примерно», когда он относится к измеряемой величине, такой как количество соединения или агента по настоящему изобретению, доза, время, температура и тому подобное, предназначен для охвата вариаций ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,5% или даже ±0,1% от указанного количества.

[0040] Как здесь используется, переходная фраза «состоящий в основном из» должна интерпретироваться как охватывающая указанные вещества или стадии и те, которые не оказывают существенного влияния на существенный и новый признак(и) заявленного изобретения. Таким образом, как здесь используется, выражение «состоящий в основном из» не должна интерпретироваться в качестве эквивалента «содержащий».

[0041] Выражение «состоит по существу из» (и грамматические варианты), применительно к полинуклеотидной или полипептидной последовательности по настоящему изобретению, означает полинуклеотид или полипептид, который состоит из указанной последовательности (например, SEQ ID NO) и в целом из десяти или менее (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) дополнительных нуклеотидов или аминокислот на 5' и/или 3', или N-терминальном и/или C-терминальном концах указанной последовательности или между двумя концами (например, между доменами), так что функция полинуклеотида или полипептида существенно не изменяется. В целом десять или менее дополнительных нуклеотидов или аминокислот включает общее количество дополнительных нуклеотидов или аминокислот, добавленных вместе. Выражение «существенно изменяется» применительно к полинуклеотидам по изобретению относится к повышению или снижению способности экспрессировать кодированный полипептид, по меньшей мере, примерно на 50% или более по сравнению с уровнем экспрессии полинуклеотида, состоящего из указанной последовательности. Термин «существенно изменяется» применительно к полипептидам по изобретению относится к повышению или снижению биологической активности, по меньшей мере, примерно на 50% или более по сравнению с активностью полипептида, состоящего из указанной последовательности.

[0042] Как здесь используется, термин «парвовирус» охватывает семейство Parvoviridae, включая автономно реплицирующие парвовирусы и депендовирусы. Автономные парвовирусы включают членов родов Parvovirus, Erythrovirus, Densovirus, Iteravirus и Contravirus. Типичные автономные парвовирусы включают, не ограничиваясь этим, мелкий вирус мышей, парвовирус крупного рогатого скота, парвовирус собак, парвовирус кур, вирус панлейкопении кошек, парвовирус кошачьих, парвовирус гусей, парвовирус H1, парвовирус индоуток, парвовирус змей и вирус B19. Другие автономные парвовирусы известны специалистам в данной области техники. См., например, FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4^th ed., Lippincott-Raven Publishers).

[0043] Род Dependovirus включает аденоассоциированные вирусы (AAV), включая, не ограничиваясь этим, AAV типа 1, AAV типа 2, AAV типа 3 (включая типы 3A и 3B), AAV типа 4, AAV типа 5, AAV типа 6, AAV типа 7, AAV типа 8, AAV типа 9, AAV типа 10, AAV типа 11, AAV типа 12, AAV типа 13, птичий AAV, коровий AAV, собачий AAV, козий AAV, змеиный AAV, лошадиный AAV и овечий AAV. См., например, FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4^th ed., Lippincott-Raven Publishers); и таблицу 1.

[0044] Термин «аденоассоциированный вирус» (AAV) в контексте настоящего изобретения включает без ограничения AAV типа 1, AAV типа 2, AAV типа 3 (включая типы 3A и 3B), AAV типа 4, AAV типа 5, AAV типа 6, AAV типа 7, AAV типа 8, AAV типа 9, AAV типа 10, AAV типа 11, птичий AAV, коровий AAV, собачий AAV, лошадиный AAV и овечий AAV и любой другой AAV, который известен в настоящее время или будет открыт позднее. См., например, FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4^th ed., Lippincott-Raven Publishers). Был идентифицирован ряд дополнительных серотипов и кладов AAV (см., например, Gao et al., (2004) J. Virol. 78: 6381-6388 и таблицу 1), которые также охватываются термином «AAV».

[0045] Парвовирусные частицы и геномы по настоящему изобретению могут быть происходить, не ограничиваясь этим, из AAV. В данной области известны геномные последовательности различных серотипов AAV и автономных парвовирусов, а также последовательности нативных ITR, белков Rep и капсидных субъединиц. Такие последовательности можно найти в литературе или в публичных базах данных, таких как GenBank. См., например, инвентарные номера GenBank NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, AY631966, AX753250, EU285562, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852 и AY530579; раскрытие которых включено здесь посредством ссылки для получения информации по нуклеиновокислотным и аминокислотным последовательностям парвовирусов и AAV. См. также, например, Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virol., 73: 939; Chiorini et al. (1997) J. Virol., 71: 6823; Chiorini et al. (1999) J. Virol., 73: 1309; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 99: 11854; Moris et al. (2004) Virol. 33: 375-383; Mori et al. (2004) Virol., 330: 375; Muramatsu et al. (1996) Virol., 221: 208; Ruffing et al. (1994) J. Gen. Virol., 75: 3385; Rutledge et al. (1998) J. Virol., 72: 309; Schmidt et al. (2008) J. Virol., 82: 8911; Shade et al. (1986) J. Virol., 58: 921; Srivastava et al. (1983) J. Virol., 45: 555; Xiao et al. (1999) J. Virol., 73: 3994; международные патентные публикации WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; и патент США № 6156303; раскрытие которых включено здесь посредством ссылки для получения информации по нуклеиновокислотным и аминокислотным последовательностям парвовирусов и AAV. См. также таблицу 1. Раннее описание последовательностей ITR AAV1, AAV2 и AAV3 было представлено в публикации Xiao X. (1996) «Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration,» Ph.D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA (включена здесь во всей ее полноте).

[0046] «Химерная» нуклеиновая кислота, кодирующая капсид AAV или капсидный белок AAV, представляет последовательность, которая объединяет участки двух или более капсидных последовательностей. «Химерный» вирион AAV или «химерная» частица AAV содержит химерный капсидный белок AAV.

[0047] Как здесь используется, термин «тропизм» относится к предпочтительному проникновению вируса в определенные типы клеток и тканей и/или предпочтительному взаимодействию с поверхностью клетки, что облегчает вход в определенные типы клеток или тканей, необязательно и предпочтительно с последующей экспрессией (например, транскрипции и, необязательно, трансляции) последовательностей, переносимых вирусным геномом в клетку, например, для рекомбинантного вируса, экспрессии гетерологичной нуклеотидной последовательности(и). Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что транскрипция гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты из вирусного генома не может инициироваться в отсутствии транс-действующих факторов, например, индуцибельного промотора или регулируемой иначе последовательности нуклеиновой кислоты. В случае генома rAAV экспрессия гена из вирусного генома может иметь место из стабильно интегрированного провируса и/или из неинтегрированной эписомы, а также любой другой формы, которую вирусная нуклеиновая кислота может принимать внутри клетки.

Таблица 1
Полные геномы	Инвентарный номер в GenBank			Инвентарный номер в GenBank			Инвентарный номер в GenBank
			Hu T88	AY695375		Hu42	AY530605
Аденоассоциированный вирус 1	NC_002077,AF063497		Hu T71	AY695374		Hu67	AY530627
Аденоассоциированный вирус 2	NC_001401		Hu T70	AY695373		Hu40	AY530603
Аденоассоциированный вирус 3	NC_001729		Hu T40	AY695372		Hu41	AY530604
Аденоассоциированный вирус 3B	NC_001863		Hu T32	AY695371		Hu37	AY530600
Аденоассоциированный вирус 4	NC_001829		Hu T17	AY695370		Rh40	AY530559
Аденоассоциированный вирус 5	Y18065, AF085716		Hu LG15	AY695377		Rh2	AY243007
Аденоассоциированный вирус 6	NC_001862		Клад C			Bb1	AY243023
Птичий AAV ATCC VR-865	AY186198, AY629583, NC_004828		Hu9	AY530629		Bb2	AY243022
Птичий AAV штамм DA-1	NC_006263, AY629583		Hu10	AY530576		Rh10	AY243015
Коровий AAV	NC_005889, AY388617		Hu11	AY530577		Hu17	AY530582
Клад A			Hu53	AY530615		Hu6	AY530621
AAV1	NC_002077,AF063497		Hu55	AY530617		Rh25	AY530557
AAV6	NC_001862		Hu54	AY530616		Pi2	AY530554
Hu.48	AY530611		Hu7	AY530628		Pi1	AY530553
Hu 43	AY530606		Hu18	AY530583		Pi3	AY530555
Hu 44	AY530607		Hu15	AY530580		Rh57	AY530569
Hu 46	AY530609		Hu16	AY530581		Rh50	AY530563
Клад B			Hu25	AY530591		Rh49	AY530562
Hu. 19	AY530584		Hu60	AY530622		Hu39	AY530601
Hu. 20	AY530586		Ch5	AY243021		Rh58	AY530570
Hu 23	AY530589		Hu3	AY530595		Rh61	AY530572
Hu22	AY530588		Hu1	AY530575		Rh52	AY530565
Hu24	AY530590		Hu4	AY530602		Rh53	AY530566
Hu21	AY530587		Hu2	AY530585		Rh51	AY530564
Hu27	AY530592		Hu61	AY530623		Rh64	AY530574
Hu28	AY530593		Клад D			Rh43	AY530560
Hu 29	AY530594		Rh62	AY530573		AAV8	AF513852
Hu63	AY530624		Rh48	AY530561		Rh8	AY242997
Hu64	AY530625		Rh54	AY530567		Rh1	AY530556
Hu13	AY530578		Rh55	AY530568		Клад F
Hu56	AY530618		Cy2	AY243020		Hu14 (AAV9)	AY530579
Hu57	AY530619		AAV7	AF513851		Hu31	AY530596
Hu49	AY530612		Rh35	AY243000		Hu32	AY530597
Hu58	AY530620		Rh37	AY242998		Клональный изолят
Hu34	AY530598		Rh36	AY242999		AAV5	Y18065, AF085716
Hu35	AY530599		Cy6	AY243016		AAV 3	NC_001729
AAV2	NC_001401		Cy4	AY243018		AAV 3B	NC_001863
Hu45	AY530608		Cy3	AY243019		AAV4	NC_001829
Hu47	AY530610		Cy5	AY243017		Rh34	AY243001
Hu51	AY530613		Rh13	AY243013		Rh33	AY243002
Hu52	AY530614		Клад E			Rh32	AY243003
Hu T41	AY695378		Rh38	AY530558
Hu S17	AY695376		Hu66	AY530626

[0048] Термин «профиль тропизма» относится к паттерну трансдукции одной или более клеток-мишеней, тканей и/или органов. Репрезентативные примеры химерных капсидов AAV имеют профиль тропизма, характеризующийся эффективной трансдукцией клеток ЦНС с низкой трансдукцией клеток периферических органов.

[0049] Как здесь используется, термин «расстройство, связанное с аберрантной экспрессией гена CLN1» относится к заболеванию, расстройству, синдрому или патологическому состоянию, вызванному или являющемуся симптомом пониженной или измененной экспрессии гена CLN1 у субъекта относительно уровня экспрессии или активности у нормального субъекта или в популяции.

[0050] Как здесь используется, термин «трансдукция» клетки вирусным вектором (например, вектором AAV) означает вхождение вектора в клетку и передачу генетического материала в клетку посредством включения нуклеиновой кислоты в вирусный вектор и последующего переноса в клетку вирусным вектором.

[0051] Если не указано иное, то «эффективная трансдукция» или «эффективный тропизм» или аналогичные термины можно определить по отношению к подходящему положительному или отрицательному контролю (например, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более от трансдукции или тропизма соответственно положительного контроля или, по меньшей мере, примерно 110%, 120%, 150%, 200%, 300%, 500%, 1000% или более от трансдукция или тропизма соответственно отрицательного контроля).

[0052] Аналогично можно определить, действительно ли вирус «не трансформирует эффективно» или «не имеет эффективного тропизма» для ткани-мишени или аналогичные термины при сравнении с подходящим контролем. В конкретных вариантах осуществления вирусный вектор не трансдуцирует эффективно (т.е. не обладает эффективным тропизмом для) ткани вне ЦНС, например, печень, почки, гонады и/или зародышевые клетки. В конкретных вариантах осуществления нежелательная трансдукция ткани(-ей) (например, печени) составляет 20% или менее, 10% или менее, 5% или менее, 1% или менее, 0,1% или менее от уровня трансдукции желаемой ткани-мишени (тканей-мишеней) (например, клетки ЦНС).

[0053] Термины «5'-участок» и «3'-участок» являются относительными терминами для определения пространственной связи между двумя или более элементами. Так, например, «3'-участок» полинуклеотида указывает на сегмент полинуклеотида, который находится даунстрим от другого сегмента. Термин «3'-участок» не предназначен для указания того, что сегмент обязательно находится на 3'-конце полинуклеотида или даже что он обязательно находится в 3'-половине полинуклеотида, хотя это может быть. Аналогично, «5'-участок» полинуклеотида указывает на сегмент полинуклеотида, который находится апстрим от другого сегмента. Термин «5'-участок» не означает, что сегмент обязательно находится на 5'-конце полинуклеотида или даже что он обязательно находится в 5'-половине полинуклеотида, хотя это может быть.

[0054] Как здесь используется, термин «полипептид» охватывает как пептиды, так и белки, если не указано иное. Как здесь используется, термин «фрагмент» данного пептида относится к любому пептидному элементу пептида. В одном варианте осуществления фрагмент содержит, по меньшей мере, две смежные аминокислоты последовательности пептида. В еще одном варианте осуществления фрагмент содержит, по меньшей мере, 4, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 6, по меньшей мере, 8, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 40, по меньшей мере, 50, по меньшей мере, 60, по меньшей мере, 70, по меньшей мере, 80, по меньшей мере, 90 или, по меньшей мере, 100 смежных аминокислот пептида. В некоторых вариантах осуществления фрагмент имеет последовательность, составляющую, по меньшей мере, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от последовательности данного пептида.

[0055] «Полинуклеотид», «нуклеиновая кислота» или «нуклеотидная последовательность» представляет последовательность нуклеотидных оснований и может представлять последовательности РНК, ДНК или гибрида ДНК-РНК (включающие как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе нуклеотиды), но предпочтительно представляет последовательность одно- или двухцепочечной ДНК.

[0056] Как здесь используется, термин «открытая рамка считывания (ORF)» относится к участку полинуклеотида, например, гену, который кодирует полипептид.

[0057] Как здесь используется, термин «кодон-оптимизированная» относится к кодирующей последовательности, которая оптимизирована относительно кодирующей последовательности дикого типа (например, кодирующей последовательности PPT1) для повышения экспрессии кодирующей последовательности посредством замены одного или более кодонов, обычно присутствующих в кодирующей последовательности на кодон той же (синонимичной) аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления замены сводят к минимуму редкие кодоны (например, человеческие кодоны), увеличивают общее содержание GC, уменьшают содержание CpG, удаляют криптографические донорные или акцепторные сайты сплайсинга и/или добавляют или удаляют сайты входа в рибосому, такие как последовательности Козак.

[0058] Как здесь используется, термин «идентичность последовательности» имеет обычный смысл, понимаемый в данной области. Как известно в данной области техники, для определения того, насколько полинуклеотид или полипептид обладает идентичностью или сходством последовательности с известной последовательностью, можно использовать ряд различных программ. Идентичность или сходство последовательности можно определить с использованием стандартных методов, известных в данной области, включая, не ограничиваясь этим, алгоритм определения локальной гомологии последовательности Смита-Ватермана, Adv. Appl. Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), алгоритм определения гомологии последовательности выравниванием Нидлмана-Вунша, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), метод поиска подобий Пирсона и Липмана, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), посредством компьютеризованных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакетах программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, W1), программы наилучшей подгонки последовательностей, описанные Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12: 387 (1984), предпочтительно используя настройки по умолчанию, или проверкой.

[0059] Примером пригодного алгоритма является PILEUP. PILEUP создает множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием постепенных парных выравниваний. Она также строит дерево, показывающее кластерные взаимосвязи, используемые для создания выравнивание. PILEUP использует упрощение способа постепенного выравнивания Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351 (1987); метод аналогичен методу, описанному Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151 (1989).

[0060] Еще одним примером пригодного алгоритма является алгоритм BLAST, описанный в публикации Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990) и Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. США, 90: 5873 (1993). Особенно подходящей программой BLAST является программа WU-BLAST-2, которая получена из публикации Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460-480, (1996); blast.wustl/edu/blast/README.html. В программе WU-BLAST-2 используется несколько параметров поиска, которые предпочтительно принимаются как величины по умолчанию. Параметры представляют динамические величины, и эти параметры устанавливаются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных, в которой осуществляется поиск представляющей интерес последовательности; однако для повышения чувствительности эти величины могут быть скорректированы.

[0061] Дополнительным пригодным алгоритмом является алгоритм BLAST с введением гэпов, описанный Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389 (1997).

[0062] Процентная идентичность аминокислотной последовательности определяется числом совпадающих идентичных остатков, деленным на общее количество остатков «более длинной» последовательности в выравненной области. «Более длинная» последовательность представляет последовательность, которая имеет наиболее истинные остатки в выравненной области (гэпы, введенные WU-Blast-2, для максимизирования оценки выравнивания, игнорируются).

[0063] Аналогичным образом, процент идентичности нуклеиновокислотной последовательности определяется как процент нуклеотидных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны нуклеотидам в полинуклеотиде, конкретно раскрытом здесь.

[0064] Выравнивание может включать введение гэпов в последовательности, подлежащие выравниванию. Кроме того, для последовательностей, которые содержат либо больше, либо меньше нуклеотидов, чем полинуклеотиды, конкретно раскрытые здесь, должно быть понятно, что в одном варианте осуществления процент идентичности последовательности будет определяться на основе числа идентичных нуклеотидов по отношению к общему числу нуклеотидов. Так, например, идентичность последовательностей, которые короче чем последовательность, конкретно раскрытая здесь, будет определяться с использованием числа нуклеотидов в более короткой последовательности в одном варианте осуществления. При расчетах процентной идентичности относительный вес не присваивается различным проявлениям изменения последовательности, таким как вставки, удаления, замены и т. д.

[0065] В одном варианте осуществления положительно оцениваются (+1) только идентичности, и всем формам вариации последовательности, включая гэпы, присваивается значение «0», что устраняет необходимость во взвешенной шкале или параметрах, как описано ниже, для расчета сходства последовательности. Процентную идентичность последовательности можно рассчитать, например, делением числа совпадающих идентичных остатков на общее число остатков в «более короткой» последовательности в выравненной области и умножением на 100. «Более длинная» последовательность представляет последовательность, которая имеет наиболее истинные остатки в выравненной области.

[0066] Как здесь используется, термин «выделенная» нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность (например, «выделенная ДНК» или «выделенная РНК») означает нуклеиновую кислоту или нуклеотидную последовательность, которая отделена или по существу не содержит, по меньшей мере, некоторые другие компоненты встречающегося в природе организма или вируса, например, клеточные или вирусные структурные компоненты или другие полипептиды или нуклеиновые кислоты, которые обычно находят ассоциированными с нуклеиновой кислотой или нуклеотидной последовательностью.

[0067] Аналогично, «выделенный» полипептид означает полипептид, который отделен или по существу не содержит, по меньшей мере, некоторые другие компоненты встречающегося в природе организма или вируса, например, клеточные или вирусные структурные компоненты или другие полипептиды или нуклеиновые кислоты, которые обычно находят ассоциированными с полипептидом.

[0068] Как здесь используется, термин «модифицированный» применительно к полинуклеотидной или полипептидной последовательности относится к последовательности, которая отличается от последовательности дикого типа за счет одной или более делеций, добавок, замен или любой их комбинации.

[0069] Как здесь используется, термин «выделять» или «очищать» (или грамматические эквиваленты) вирусный вектор означает, что вирусный вектор, по меньшей мере, частично отделен от некоторых других компонентов, присутствующих в исходном материале.

[0070] Термины «лечить», «проводить лечение» или «лечение» (или грамматически эквивалентные термины) означают, что тяжесть патологического состояния у субъекта снижается или, по меньшей мере, частично уменьшается или ослабляется, и/или что достигается некоторое облегчение, ослабление или снижение, по меньшей мере, одного клинического симптома и/или замедление в прогрессировании патологического состояния.

[0071] Как здесь используется, термины «профилактировать», «проводить профилактику» или «профилактика» (и их грамматические эквиваленты) относятся к замедлению начала развития заболевания или расстройства или ослаблению симптомов при наступлении заболевания или расстройства. Термины не означают полную отмену заболевания и охватывают любые виды профилактического лечения, которые снижают заболеваемость или задерживают начало развития и/или прогрессирование заболевания.

[0072] Как здесь используется, «терапевтически эффективное количество» представляет собой количество, которое является достаточным для обеспечения некоторого улучшения или положительного эффекта для субъекта. В качестве альтернативы указывается, что «терапевтически эффективное количество» представляет количество, которое обеспечивает некоторое облегчение, ослабление, снижение или стабилизацию, по меньшей мере, одного клинического симптома у субъекта. Специалистам в данной области должно быть понятно, что терапевтические эффекты не обязательно должны быть полными или излечивающими, если субъекту обеспечивается некое благоприятное действие.

[0073] Как здесь используется, «профилактически эффективное» количество представляет собой количество, которое является достаточным для предупреждения и/или замедления начала развития заболевания, расстройства и/или клинических симптомов у субъекта и/или для снижения и/или замедления тяжести начала заболевания, расстройства и/или клинических симптомов у субъекта относительно того, что будет иметь место в отсутствии способов по изобретению. Специалистам в данной области должно быть понятно, что степень профилактики не обязательно должна быть полной, если субъекту обеспечивается некое благоприятное действие.

[0074] «Гетерологичная нуклеотидная последовательность» или «гетерологичная нуклеиновая кислота» представляет последовательность, которая не встречается естественным образом в вирусе. Как правило, гетерологичная нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность содержит открытую рамку считывания, которая кодирует полипептид и/или нетранслируемую РНК.

[0075] Как здесь используется, термин «вектор» или «вектор для доставки» (и аналогичные термины) относится к фрагменту ДНК, нуклеотидной молекуле или частице, которая способна к доставке в клетку или субъекту. Вектор включает вирусный или невирусный вектор. В одном варианте осуществления вектор включает бактериальную плазмиду, фаг, дрожжевую плазмиду, вирус растительных клеток, вирусный вектор клеток млекопитающих или другие векторы. В еще одном варианте осуществления вектор включает наночастицу. Термин «вирусный вектор» обычно относится к вирусной частице, которая функционирует в качестве носителя для доставки нуклеиновой кислоты и которая содержит вирусную нуклеиновую кислоту (т.е. векторный геном), упакованную внутри вириона. Вирусные векторы по настоящему изобретению включают, не ограничиваясь этим, химерный капсид AAV по изобретению и могут упаковывать геном AAV или rAAV или любую другую нуклеиновую кислоту, включая вирусные нуклеиновые кислоты. Альтернативно, в некоторых контекстах термины «вектор», «вирусный вектор», «вектор для доставки» (и аналогичные термины) могут использоваться для обозначения векторного генома (например, vДНК) в отсутствии вириона и/или вирусного капсида, который функционирует в качестве транспортера для доставки молекул, «привязанных» к капсиду или упакованных в капсид. Термин «невирусный вектор» относится к вектору, плазмиде, конструкции, молекуле или частице, которые не включают вирусный элемент. Невирусная частица, в некоторых вариантах осуществления, содержит, состоит по существу из или состоит из бактериальной плазмиды, дрожжевой плазмиды, рекомбинантного вектора, наночастицы или других векторов. В одном варианте осуществления невирусная частица включает наночастицу. Невирусные векторы могут быть доставлены в клетку или субъекту различными способами, которые включают, не ограничиваясь этим, инъекцию, электропорацию, генную пушку, обработку ультразвуком, магнетофекцию, гидродинамическую доставку или другие физические или химические методы.

[0076] Вирусные векторы по изобретению могут дополнительно представлять собой дуплексные парвовирусные частицы, описанные в международной патентной публикации WO 01/92551 (раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки во всей ее полноте). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления могут быть упакованы двухцепочечные (дуплексные) геномы.

[0077] «Геном рекомбинантного AAV вектора» или «геном rAAV» представляет геном AAV (т.е. vДНК), который содержит, по меньшей мере, один инвертированный концевой повтор (например, один, два или три инвертированных концевых повтора) и одну или более гетерологичных нуклеотидных последовательностей. rAAV векторы обычно сохраняют 145 оснований концевого повтора (TR (s)) в цис-положении для генерации вируса; однако модифицированные AAV TR и не-AAV TR, включая частично или полностью синтетические последовательности, также могут служить для этой цели. Все другие вирусные последовательности являются необязательными и могут поставляться в транс-положении (Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol, 158: 97). rAAV вектор необязательно содержит два TR (например, AAV TR), которые обычно будут находиться на 5'- и 3'-концах гетерологичной нуклеотидной последовательности(ей), но не обязательно должны быть смежными с ними. TR могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Векторный геном может также содержать один ITR на своем 3'- или 5'-конце.

[0078] Термин «концевой повтор» или «TR» включает любой вирусный концевой повтор или синтетическую последовательность, которая образует структуру «шпильки» и функционирует в качестве инвертированного концевого повтора (т.е. опосредует желаемые функции, такие как репликация, упаковка вируса, интеграция и/или спасение провируса и тому подобное). TR может представлять AAV TR или не-AAV TR. Например, последовательность не-AAV TR, такая как из других парвовирусов (например, собачьего парвовируса (CPV), мышиного парвовируса (MVM), парвовируса B-19 человека) или шпилька в SV40, которая служит в качестве ориджина репликации SV40, может использоваться в качестве TR, который может быть дополнительно модифицирован усечением, заменой, делецией, вставкой и/или добавлением. Кроме того, TR может быть частично или полностью синтетическим, таким как «двойная-D последовательность», как описано в патенте США № 5477745, Samulski et al.

[0079] Парвовирусные геномы имеют палиндромные последовательности как на их 5'-, так и на 3'-концах. Палиндромный характер последовательностей приводит к образованию шпилечной структуры, которая стабилизируется образованием водородных связей между комплементарными парами оснований. Полагается, что эта шпилечная структура принимает форму «Y» или «T». См., например, et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4^th ed., Lippincott-Raven Publishers).

[0080] «AAV концевой повтор» или «AAV TR» может происходить из любого AAV, включая, не ограничиваясь этим, серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 или любые другие AAV, известные в настоящее время или которые будут открыты позднее (см., например, таблицу 1). В некоторых вариантах осуществления AAV концевой повтор не имеет последовательности нативного концевого повтора (например, последовательность нативного AAV TR может быть изменена посредством вставки, делеции, усечения и/или миссенс-мутаций), когда концевой повтор опосредует желаемые функции, например, репликацию, упаковку вируса, интеграцию и/или спасение провируса и т.п. В еще одном варианте осуществления концевой повтор AAV имеет последовательность нативного концевого повтора.

[0081] Термины «частица rAAV» и «вирион rAAV» используются здесь взаимозаменяемо. «Частица rAAV» или «вирион rAAV» содержит геном rAAV-вектора, упакованный в капсид AAV.

[0082] Вирусные векторы по изобретению также могут представлять «нацеленные» вирусные векторы (например, с нацеленным тропизмом) и/или «гибридный» парвовирус (т.е. в котором вирусные ITR и вирусный капсид происходят из разных парвовирусов), описанных в международной патентной публикации WO 00/28004 и Chao et al. (2000) Mol. Therapy, 2: 619.

[0083] Кроме того, вирусный капсид или геномные элементы могут содержать другие модификации, включая вставки, делеции и/или замены.

[0084] Как здесь используется, термин «аминокислота» охватывает любые природные аминокислоты, их модифицированные формы и синтетические аминокислоты.

[0085] Встречающиеся в природе, левовращающие (L-) аминокислоты показаны в таблице 2.

Таблица 2
Аминокислотный остаток	Сокращенное обозначение
Трехбуквенный код	Однобуквенный код
Аланин	Ala	A
Аргинин	Arg	R
Аспарагин	Asn	N
Аспарагиновая кислота (аспартат)	Asp	D
Цистеин	Cys	C
Глутамин	Gln	Q
Глутаминовая кислота (глутамат)	Glu	E
Глицин	Gly	G
Гистидин	His	H
Изолейцин	Ile	I
Лейцин	Leu	L
Лизин	Lys	K
Метионин	Met	M
Фенилаланин	Phe	F
Пролин	Pro	P
Серин	Ser	S
Треонин	Thr	T
Триптофан	Trp	W
Тирозин	Tyr	Y
Валин	Val	V

[0086] Альтернативно, аминокислота может представлять модифицированный аминокислотный остаток (неограничивающие примеры показаны в таблице 3) или может быть аминокислотой, которая модифицирована посттрансляционной модификацией (например, ацетилированием, амидированием, формилированием, гидроксилированием, метилированием, фосфорилированием или сульфатацией).

Таблица 3
Производные аминокислотных остатков
Модифицированный аминокислотный остаток	Сокращенное обозначение
2-аминоадипиновая кислота	Aad
3-аминоадипиновая кислота	bAad
бета-аланин, бета-аминопропионовая кислота	bAla
2-аминомасляная кислота	Abu
4-аминомасляная кислота, пиперидиновая кислота	4Abu
6-аминокапроновая кислота	Acp
2-аминогептановая кислота	Ahe
2-аминоизомасляная кислота	Aib
3-аминоизомасляная кислота	bAib
2-аминопимелиновая кислота	Apm
трет-бутилаланин	t-BuA
цитруллин	Cit
циклогексилаланин	Cha
2,4-диаминомасляная кислота	Dbu
десмозин	Des
2,2'-диаминопимелиновая кислота	Dpm
2,3-диаминопропионовая кислота	Dpr
N-этилглицин	EtGly
N-этиласпарагин	EtAsn
гомоаргинин	hArg
гомоцистеин	hCys
гомосерин	hSer
гидроксилизин	Hyl
аллогидроксилизин	aHyl
3-гидроксипролин	3Hyp
4-гидроксипролин	4Hyp
изодесмозин	Ide
аллоизолейцин	aIle
метионина сульфоксид	MSO
N-метилглицин, саркозин	MeGly
N-метилизолейцин	MeIle
6-N-метиллизин	MeLys
N-метилвалин	MeVal
2-нафтилаланин	2-Nal
норвалин	Nva
норлейцин	Nle
орнитин	Orn
4-хлорфенилаланин	Phe(4-Cl)
2-фторфенилаланин	Phe(2-F)
3-фторфенилаланин	Phe(3-F)
4-фторфенилаланин	Phe(4-F)
фенилглицин	Phg
бета-2-тиенилаланин	Thi

[0087] Кроме того, не встречающаяся в природе аминокислота может представлять «необычную» аминокислоту, как описано Wang et al. (2006) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 35:225-49. Данные необычные аминокислоты могут преимущественно использоваться для химического связывания молекул, представляющих интерес, с капсидным белком AAV.

[0088] Как здесь используется, термин «матрица» или «субстрат» относится к полинуклеотидной последовательности, которая может реплицироваться с продукцией вирусной ДНК парвовируса. Для целей продукции вектора матрицу обычно вставляют в более крупную нуклеотидную последовательность или конструкцию, включая, не ограничиваясь этим, плазмиду, «голую» ДНК-вектор, бактериальную искусственную хромосому (BAC), дрожжевую искусственную хромосому (YAC) или вирусный вектор (например, аденовирусный, герпесвирусный, на основе вируса Эпштейна-Барра, AAV, бакуловирусный, ретровирусный векторы и тому подобное). Альтернативно, матрица может быть стабильно включена в хромосому пакующей клетки.

[0089] Как здесь используется, парвовирусные или AAV «последовательности, кодирующие Rep» указывают на последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют парвовирусные или AAV неструктурные белки, которые опосредуют репликацию вируса и продуцируют новые вирусные частицы. Гены и белки репликации парвовируса и AAV описаны, например, в FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4^th ed., Lippincott-Raven Publishers).

[0090] «Последовательности, кодирующие Rep» необязательно кодируют все парвовирусные или AAV белки Rep. Например, в отношении AAV, то необязательно последовательности, кодирующие Rep, должны кодировать все четыре белка Rep AAV (Rep78, Rep 68, Rep52 и Rep40), фактически полагается, что AAV5 экспрессирует только сплайсированные белки Rep68 и Rep40. В репрезентативных вариантах осуществления последовательности, кодирующие Rep, кодируют, по меньшей мере, такие репликационные белки, которые необходимы для репликации вирусного генома и упаковки в новые вирионы. Последовательности, кодирующие Rep, как правило, кодируют, по меньшей мере, один большой белок Rep (т.е. Rep78/68) и один малый белок Rep (т.е. Rep52/40). В конкретных вариантах осуществления последовательности, кодирующие Rep, кодируют белок Rep78 AAV и белки Rep52 и/или Rep40 AAV. В еще одних вариантах осуществления последовательности, кодирующие Rep, кодируют белки Rep68 и Rep52 и/или Rep40. В еще одном варианте осуществления последовательности, кодирующие Rep, кодируют белки Rep68 и Rep52, белки Rep68 и Rep40, белки Rep78 и Rep52, или белки Rep78 и Rep40.

[0091] Как здесь используется, термин «большой белок Rep» относится к Rep68 и/или Rep78. Большие белки Rep по заявленному изобретению могут представлять белки дикого типа или синтетические белки. Большой белок Rep дикого типа может происходить из любого парвовируса или AAV, включая, не ограничиваясь этим, серотипы 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 13 или любой другой AAV, который известен в настоящее время или будет открыт позднее (см., например, таблицу 1). Синтетический большой белок Rep может быть изменен посредством инсерции, делеции, усечения и/или миссенс-мутаций.

[0092] Специалисты в данной области техники также должны понимать, что необязательно, чтобы репликационные белки кодировались одним и тем же полинуклеотидом. Например, для MVM белки NS-1 и NS-2 (которые являются вариантами сплайсинга) могут экспрессироваться независимо друг от друга. Аналогично, для AAV промотор p19 может быть инактивирован, и большой белок(и) Rep экспрессируется из одного полинуклеотида, и малый белок(и) Rep экспрессируется из другого полинуклеотида. Как правило, однако, будет более удобно экспрессировать репликационные белки из одной конструкции. В некоторых системах вирусные промоторы (например, промотор p19 AAV) могут не распознаваться клеткой, и, следовательно, необходимо экспрессировать большой и малый белки Rep из отдельных экспрессионных кассет. В других случаях может быть желательным экспрессировать большой Rep и малый Rep белки по отдельности, т.е. под контролем отдельных регуляторных элементов транскрипции и/или трансляции. Например, может быть желательным регулировать экспрессию больших белков Rep, чтобы уменьшить отношение больших и малых белков Rep. В случае клеток насекомых может быть преимущественным снизить уровень экспрессии больших белков Rep (например, Rep78/68), чтобы избежать токсичности для клеток (см., например, Urabe et al. (2002) Human Gene Therapy, 13: 1935).

[0093] Как здесь используется, парвовирусные или AAV «последовательности, кодирующие cap», кодируют структурные белки, которые образуют функциональный парвовирусный или AAV капсид (т.е. могут упаковывать ДНК и инфицировать клетки-мишени). Как правило, последовательности, кодирующие cap, кодируют все парвовирусные или AAV капсидные субъединицы, но меньше, чем все субъединицы капсида могут кодироваться при условии, что генерируется функциональный капсид. Обычно, но необязательно, последовательности, кодирующие cap, будут находиться в одной молекуле нуклеиновой кислоты.

[0094] Капсидная структура автономных парвовирусов и AAV более подробно описана в монографии BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4^th ed., Lippincott-Raven Publishers).

[0095] Под выражением «существенно сохранять» активность подразумевается, что, по меньшей мере, примерно 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% активности (например, активность или другая оцениваемая характеристика) сохраняется.

экспрессионные кассеты и векторы CLN1

[0096] Настоящее изобретение относится к конструированию экспрессионной кассеты CLN1, для обеспечения максимальной экспрессии пальмитоилпротеинтиоэстеразы-1 (PPT1), фермента, кодируемого геном CLN1, и применению экспрессионной кассеты для достижения терапевтических уровней PPT1 у субъекта.

[0097] Таким образом, один аспект изобретения относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид пальмитоилпротеинтиоэстеразы-1 (PPT1) или его фрагмент, где нуклеотидная последовательность кодон-оптимизирована для экспрессии в клетках человека. В одном варианте осуществления полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (или ее комплемент) или последовательность, по меньшей мере, примерно на 90% идентичную ей или ее комплемент. В еще одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность кодирует полипептид PPT1 или его фрагмент. Полипептидные последовательности PPT1 можно найти в GenBank, которые включают, не ограничиваясь этим, инвентарные номера: NP_071947.1, NP_776579.1, NP_032943.2, AAM49613.1 и AAH08426.1. В еще одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке. Клетка включает, не ограничиваясь этим, клетку человека, клетку крысы, клетку мыши, клетку собаки или клетки любых млекопитающих или растений. В одном варианте осуществления клетка представляет клетку человека. В еще одном варианте осуществления полинуклеотид содержит открытую рамку считывания CLN1 человека, крысы, мыши, крупного рогатого скота или любых других видов. В еще одном варианте осуществления полинуклеотид содержит открытую рамку считывания CLN1 человека. Открытая рамка считывания представляет участок гена CLN1, который кодирует PPT1.

[0098] В некоторых вариантах осуществления кодон-оптимизированная открытая рамка считывания CLN1 содержит, состоит по существу или состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или последовательности, по меньшей мере, примерно на 70% идентичной ей, например, по меньшей мере, примерно на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичной ей.

SEQ ID NO: 1: человеческая кодон-оптимизированная открытая рамка считывания CLN1 (добавленный стоп-кодон подчеркнут):

atggcttctccggggtgtctgtggctgctggcagtggcactccttccctggacttgcgccagccgggctctgcagcacctcgaccctccagcccctcttccactggtgatttggcacggaatgggtgattcctgctgtaatcccctgtcaatgggagccatcaagaagatggtggagaagaagatccctggaatctacgtgctgtcactggagattggaaagaccctgatggaggacgtcgagaactccttcttcctcaatgtcaactctcaagtgaccaccgtctgccaggccctggccaaggacccgaagctgcagcaggggtataatgctatggggttcagccagggaggacagttccttcgggctgtggcccaacgctgccctagcccacccatgatcaacctgatctcagtgggtggccagcatcagggcgtgttcggacttccccggtgtcccggggaatcctctcatatctgcgacttcatccgcaaaactctcaatgcaggcgcttattcaaaggtcgtccaagagaggctggtgcaagccgagtactggcacgatcccattaaggaggacgtgtacagaaatcactcaatctttctggccgacattaaccaggagaggggaattaacgaatcatataagaagaatctcatggccctcaaaaagttcgtcatggtgaagttccttaacgatagcattgtggacccagtggacagcgaatggttcggattttaccgctcaggccaggcaaaagaaaccatccctctccaagagacttctctttacacccaagacagacttgggcttaaggaaatggataacgctggtcagctggtgttcctcgccaccgaaggtgaccatctgcagctcagcgaagagtggttctacgctcatatcatcccgtttcttggttgataa

[0099] Еще один аспект изобретения относится к экспрессионной кассете, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид PPT1 или его фрагмент. В одном варианте осуществления полинуклеотид содержит открытую рамку считывания CLN1 любого вида. В еще одном варианте осуществления полинуклеотид содержит открытую рамку считывания CLN1 человека. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид представляет человеческую кодон-оптимизированную последовательность, например, полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, или последовательность, по меньшей мере, примерно на 70% идентичную ей, например, по меньшей мере, примерно на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную ей.

[0100] Полинуклеотид в экспрессионной кассете может быть операбельно связан с одним или более элементами экспрессии, которые могут усилить экспрессию кодированного полипептида. В одном варианте осуществления полинуклеотид CLN1 в экспрессионной кассете операбельно связан с одним или более элементами экспрессии, которые могут усилить экспрессию CLN1. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид операбельно связан с промотором, например, промотором бета-актина курицы, например, промотором, содержащим, состоящим по существу или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления промотор дополнительно содержит экзон 1 и интрон 1 бета-актина курицы, например, содержащий, состоящий по существу или состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 2: промотор бета-актина курицы

TACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG

SEQ ID NO: 3: экзон 1 и интрон 1 бета-актина курицы

GGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGC

[0101] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид операбельно связан с энхансером, например, энхансером цитомегаловируса, например, энхансером, содержащим, по существу состоящим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 4: энхансер цитомегаловируса

TACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTGTGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATC

[0102] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид операбельно связан с интроном, например, гибридным/модифицированным интроном MVM, например интроном, содержащим, состоящим по существу или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5. Интрон может располагаться в любой части экспрессионной кассеты, где он эффективен для усиления экспрессии, например, до ORF, внутри ORF или между ORF и сайтом полиаденилирования.

SEQ ID NO: 5: гибридный/модифицированный интрон MVM

AAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCAGGTTGG

[0103] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид операбельно связан с сигналом полиаденилирования, например, сигналом полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота, например, сигналом полиаденилирования, содержащим, состоящим по существу или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 6: сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота

CTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAACAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCT

[0104] Специалисты в данной области техники также должны понимать, что в зависимости от требуемого уровня и тканеспецифической экспрессии можно использовать различные промоторные/энхансерные элементы. Как здесь используется, термин «промотор» указывает на область ДНК, с которой связывается РНК-полимераза с инициацией транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты (например, гена), которая операбельно связана с промотором. Промотор может быть вирусным или невирусным промотором. Вирусный промотор включает, не ограничиваясь этим, промоторы pCMV, SV40, MMTV. Невирусный промотор включает, не ограничиваясь этим, промоторы UbC, EF или PGK. Термин «энхансер» относится к цис-действующему регуляторному элементу транскрипции. В одном варианте осуществления энхансер обеспечивает аспект общей модуляции экспрессии гена. В еще одном варианте осуществления энхансерные элементы связывают ДНК-связывающие белки и/или влияют на топологию ДНК, создавая локальные конформации, которые избирательно разрешают или ограничивают доступ РНК-полимеразы к ДНК-матрице или которые способствуют избирательному раскрытию двойной спирали в сайте инициации транскрипции. Неограничивающий список энхансеров можно найти в VISTA Enhancer Browser, который доступен на сайте enhancer.lbl.gov/?. Термин «интрон» относится к нетранслируемой последовательности ДНК между экзонами вместе с 5'- и 3'-нетранслируемыми областями, связанными с генетическим локусом. Промотор/энхансер может быть конститутивным или индуцибельным, в зависимости от требуемого паттерна экспрессии. Промотор/энхансер может быть нативным или чужеродным и может представлять природную или синтетическую последовательность. Под термином «чужеродный» понимается то, что область инициации транскрипции не обнаружена у хозяина дикого типа, в который вводится область инициации транскрипции.

[0105] Промоторные/энхансерные элементы могут быть нативными для клетки-мишени или субъекта, которые подлежат обработке, и/или нативными для последовательности гетерологичной нуклеиновой кислоты. Промоторный/энхансерный элемент обычно выбирают таким образом, чтобы он функционировал в клетке-мишени, представляющей интерес. В репрезентативных вариантах осуществления промоторный/энхансерный элемент представляет собой промоторный/энхансерный элемент млекопитающего. Промоторный/энхансерный элемент может быть конститутивным или индуцибельным.

[0106] Индуцибельные регуляторные элементы экспрессии обычно используются в тех применениях, в которых желательно обеспечить регуляцию экспрессии последовательности(й) гетерологичной нуклеиновой кислоты. Индуцибельные промоторные/энхансерные элементы для доставки гена могут быть тканеспецифическими или тканепредпочтительными промоторными/энхансерными элементами и включают специфические или предпочтительные для мышечной ткани (включая сердечную, скелетную и/или гладкую мышцу), специфические или предпочтительные для нервной ткани (включая специфические для головного мозга), для глаза (включая специфические для сетчатки и специфические для роговицы), специфические или предпочтительные для печени, специфические или предпочтительные для костного мозга, специфические или предпочтительные для поджелудочной железы, специфические или предпочтительные для селезенки или специфические или предпочтительные для легких промоторные/энхансерные элементы. Другие индуцибельные промоторные/энхансерные элементы включают гормон-индуцибельные и металл-индуцибельные элементы. Иллюстративные индуцибельные промоторные/энхансерные элементы включают, не ограничиваясь, элемент включения/выключения Tet, RU486-индуцибельный промотор, экдизон-индуцибельный промотор, рапамицин-индуцибельный промотор и промотор металлотионеина.

[0107] В вариантах осуществления, где ORF CLN1 транскрибируется, и затем транслируется в клетках-мишенях, специфические сигналы инициации обычно используются для эффективной трансляции вставленных последовательностей, кодирующих белок. Эти экзогенные регуляторные последовательности трансляции, которые могут включать кодон инициации ATG и смежные последовательности, могут происходить из множества источников, как природных, так и синтетических.

[0108] В некоторых вариантах осуществления экспрессионная кассета дополнительно содержит, по меньшей мере, один инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), например, два AAV ITR. Два ITR могут иметь одну и ту же нуклеотидную последовательность или различные нуклеотидные последовательности. AAV ITR могут происходить из любого серотипа AAV, например, AAV2. Каждый ITR независимо может представлять последовательность дикого типа или модифицированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная кассета представляет геном AAV, например, самокомплементарный геном AAV.

[0109] В некоторых вариантах осуществления экспрессионная кассета содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид PPT1 или его фрагмент. В одном варианте осуществления экспрессионная кассета содержит открытую рамку считывания CLN1 человека и любую комбинацию одного или более из промотора, экзона, интрона, энхансера и сигнала полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная кассета включает полинуклеотид, содержащий открытую рамку считывания CLN1 человека и любую комбинацию одного или более из промотора, экзона, интрона, энхансера и сигнала полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная кассета содержит энхансер, промотор, интрон, открытую рамку считывания CLN1 человека и сайт полиаденилирования, необязательно в указанном порядке. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная кассета содержит AAV ITR, энхансер, промотор, интрон, открытую рамку считывания CLN1 человека, сайт полиаденилирования и AAV ITR, необязательно в указанном порядке. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная кассета содержит энхансер CMV, промотор бета-актина курицы, гибридный/модифицированный интрон MVM, открытую рамку считывания CLN1 человека и сайт полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота, необязательно в указанном порядке. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная кассета содержит мутантный AAV ITR, энхансер CMV, промотор бета-актина курицы, гибридный/модифицированный интрон MVM, открытую рамку считывания CLN1 человека, сайт полиаденилирования крупного рогатого скота и AAV ITR дикого типа, необязательно в указанном порядке.

[0110] В некоторых вариантах осуществления экспрессионная кассета содержит, состоит по существу или состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 7 или последовательности, по меньшей мере, примерно на 70% идентичной ей, например, по меньшей мере, примерно на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичной ей.

SEQ ID NO: 7: экспрессионная кассета CLN1

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGGGTTCGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTGTGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCTGAGCAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCAGGTTGGACCGGTCGCCACCATGGCTTCTCCGGGGTGTCTGTGGCTGCTGGCAGTGGCACTCCTTCCCTGGACTTGCGCCAGCCGGGCTCTGCAGCACCTCGACCCTCCAGCCCCTCTTCCACTGGTGATTTGGCACGGAATGGGTGATTCCTGCTGTAATCCCCTGTCAATGGGAGCCATCAAGAAGATGGTGGAGAAGAAGATCCCTGGAATCTACGTGCTGTCACTGGAGATTGGAAAGACCCTGATGGAGGACGTCGAGAACTCCTTCTTCCTCAATGTCAACTCTCAAGTGACCACCGTCTGCCAGGCCCTGGCCAAGGACCCGAAGCTGCAGCAGGGGTATAATGCTATGGGGTTCAGCCAGGGAGGACAGTTCCTTCGGGCTGTGGCCCAACGCTGCCCTAGCCCACCCATGATCAACCTGATCTCAGTGGGTGGCCAGCATCAGGGCGTGTTCGGACTTCCCCGGTGTCCCGGGGAATCCTCTCATATCTGCGACTTCATCCGCAAAACTCTCAATGCAGGCGCTTATTCAAAGGTCGTCCAAGAGAGGCTGGTGCAAGCCGAGTACTGGCACGATCCCATTAAGGAGGACGTGTACAGAAATCACTCAATCTTTCTGGCCGACATTAACCAGGAGAGGGGAATTAACGAATCATATAAGAAGAATCTCATGGCCCTCAAAAAGTTCGTCATGGTGAAGTTCCTTAACGATAGCATTGTGGACCCAGTGGACAGCGAATGGTTCGGATTTTACCGCTCAGGCCAGGCAAAAGAAACCATCCCTCTCCAAGAGACTTCTCTTTACACCCAAGACAGACTTGGGCTTAAGGAAATGGATAACGCTGGTCAGCTGGTGTTCCTCGCCACCGAAGGTGACCATCTGCAGCTCAGCGAAGAGTGGTTCTACGCTCATATCATCCCGTTTCTTGGTTGATAAGCGGCCGCGGGGATCCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAACAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTTTGGACGCGTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTC

[0111] Дополнительный аспект изобретения относится к вектору, содержащему полинуклеотид или экспрессионную кассету по изобретению. Подходящие векторы включают, не ограничиваясь этим, плазмиду, фаг, вирусный вектор (например, AAV вектор, аденовирусный вектор, герпесвирусный вектор, альфавирусный или бакуловирусный вектор), бактериальную искусственную хромосому (BAC) или дрожжевую искусственную хромосому (YAC). Например, нуклеиновая кислота может содержать, состоять или состоять по существу из AAV вектора, содержащего 5'- и/или 3'-концевой повтор (например, 5'- и/или 3'-концевой повтор AAV).

[0112] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, например, AAV вектор. AAV вектор может быть любым серотипом AAV, например, AAV9. В некоторых вариантах осуществления AAV вектор может содержать капсидные белки дикого типа. В еще одних вариантах осуществления AAV вектор может содержать модифицированный капсидный белок с измененным тропизмом по сравнению с капсидным белком дикого типа, например, с модифицированным капсидным белком, который не нацелен на печень или имеет повышенный тропизм для клеток нервной системы. Примеры модифицированных капсидных белков с тропизмом для клеток нервной системы включают, без ограничения, белки, описанные в патенте США № 9636370 (например, колонка 48, строчки 54-65, таблица 2) и международной публикации WO 2016/081811 (например, в абзацах [0144] и [0087]), которые включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.

[0113] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет самокомплементарный или дуплексный вектор AAV (scAAV). scAAV-векторы описаны в международной патентной публикации WO 01/92551 (раскрытие которой включено здесь посредством ссылки во всей ее полноте). Использование scAAV для экспрессии ORF CLN1 может обеспечить увеличение числа трансдуцированных клеток, числа копий на каждую трансдуцированную клетку или и то, и другое.

[0114] Дополнительный аспект изобретения относится к трансформированной клетке, содержащей полинуклеотид, экспрессионную кассету и/или вектор по изобретению. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, экспрессионная кассета и/ или вектор стабильно включены в геном клетки. Трансформированная клетка может представлять клетку in vitro, ex vivo или in vivo. В некоторых вариантах осуществления трансформированная клетка представляет клетку, подходящую для получения AAV векторов, как описано ниже.

[0115] Еще один аспект изобретения относится к трансгенному животному, содержащему полинуклеотид, экспрессионную кассету, вектор, полипептид и/или трансформированную клетку по изобретению. В некоторых вариантах осуществления трансгенное животное является лабораторным животным, например, крысой, мышью, собакой или обезьяной. В некоторых вариантах осуществления животное представляет модель заболевания.

[0116] Дополнительный аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей полинуклеотид, экспрессионную кассету, вектор и/или трансформированную клетку по изобретению в фармацевтически приемлемом носителе, как описано ниже.

Способы получения вирусных векторов

[0117] Настоящее изобретение также относится к способам получения вирусных векторов. В одном конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантной частицы AAV, включающему обеспечение клетке возможности репликации AAV: (a) матрицы рекомбинантного AAV, содержащей (i) полинуклеотид или экспрессионную кассету по изобретению и (ii) ITR; (b) полинуклеотида, содержащего последовательности, кодирующие Rep, и последовательности, кодирующие Cap; в условиях, достаточных для репликации и упаковки матрицы рекомбинантного AAV; посредством чего в клетке образуются рекомбинантные частицы AAV. Условиями, достаточными для репликации и упаковки матрицы рекомбинантного AAV, может быть, например, наличие последовательностей AAV, достаточных для репликации матрицы AAV и инкапсидирования в капсиды AAV (например, последовательностей rep AAV и последовательностей cap AAV) и хелперных последовательностей из аденовируса и/или герпесвируса. В конкретных вариантах осуществления матрица AAV содержит две последовательности AAV ITR, которые расположены на 5' и 3' в полинуклеотиде по изобретению, хотя они необязательно должны быть непосредственно смежными с ними.

[0118] В некоторых вариантах осуществления матрица рекомбинантного AAV содержит ITR, который не отщепляется Rep с образованием дуплексных AAV векторов, как описано в международной патентной публикации WO 01/92551.

[0119] Матрицы AAV и последовательности rep и cap AAV обеспечиваются в таких условиях, что вирусный вектор, содержащий матрицу AAV, упакованную в капсид AAV, продуцируется в клетке. Способ может дополнительно содержать стадию получения вирусного вектора из клетки. Вирусный вектор можно получить из среды и/или лизированием клетки.

[0120] Клетка может представлять клетку, которая обеспечивает возможность вирусной репликации AAV. Можно использовать любую подходящую клетку, известную в данной области. В конкретных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего (например, клетку примата или человека). В качестве еще одного варианта, клетка может представлять транс-комплементирующую пакующую клеточную линию, которая обеспечивает функции, делецированные из дефектного по репликации хелперного вируса, например, клеток 293 или других транс-комплементирующих клеток E1a.

[0121] Последовательности, кодирующие репликацию и капсид AAV, могут быть обеспечены любым способом, известным в данной области. Имеющиеся в настоящее время протоколы обычно экспрессируют гены rep/cap AAV в одной плазмиде. Последовательности, кодирующие репликацию и упаковку AAV, не обязательно должны обеспечиваться вместе, хотя это может иметь место. Последовательности rep и/или cap AAV могут быть обеспечены любым вирусным или невирусным вектором. Например, последовательности rep/cap могут быть обеспечены гибридным аденовирусным или герпесвирусным вектором (например, вставлены в области E1a или E3 делецированного аденовирусного вектора). Векторы EBV также можно использовать для экспрессии генов cap и rep AAV. Одним преимуществом данного способа является то, что векторы EBV являются эписомальными, но при этом поддерживают высокое число копий во всех последовательных клеточных делениях (т. е. стабильно интегрируются в клетку в виде внехромосомных элементов, обозначаемых как «ядерная эписома на основе EBV», см. Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun., 158: 67).

[0122] В качестве дополнительной альтернативы последовательности rep/cap могут стабильно включаться в клетку.

[0123] Обычно последовательности rep/cap AAV не должны быть фланкированы TR для предупреждения спасения и/или упаковки этих последовательностей.

[0124] Матрицу AAV можно обеспечить в клетке с использованием любого способа, известного в данной области техники. Например, матрица может поставляться невирусным (например, плазмидой) или вирусным вектором. В конкретных вариантах осуществления матрица AAV доставляется герпесвирусным или аденовирусным вектором (например, вставлена в области E1a или E3 делецированного аденовируса). В качестве еще одной иллюстрации, Palombo et al. (1998) J. Virology, 72: 5025 описывают бакуловирусный вектор, несущий репортерный ген, фланкированный AAV TR. Векторы EBV также можно использовать для доставки матрицы, как описано выше в отношении генов rep/cap.

[0125] В еще одном репрезентативном варианте осуществления матрица AAV обеспечивается реплицирующимся вирусом rAAV. В еще одних вариантах осуществления провирус AAV, содержащий матрицу AAV, стабильно интегрируется в хромосому клетки.

[0126] Для повышения титров вируса клетке могут быть предоставлены функции хелперного вируса (например, аденовируса или герпесвируса), которые способствуют продуктивному инфицированию AAV. Последовательности хелперного вируса, необходимые для репликации AAV, известны в данной области. Как правило, данные последовательности будут предоставляться хелперным аденовирусным или герпесвирусным вектором. Альтернативно, последовательности аденовируса или герпесвируса могут быть обеспечены другим невирусным или вирусным вектором, например, в виде неинфекционной аденовирусной миниплазмиды, которая несет все хелперные гены, которые способствуют эффективной продукции AAV, как описано в публикации Ferrari et al. (1997)) Nature Med., 3: 1295 и в патентах США № 4040183 и 6093570.

[0127] Кроме того, функции хелперного вируса могут быть обеспечены пакующей клеткой с хелперными последовательностями, встроенными в хромосому или поддерживаемые в виде стабильного внехромосомного элемента. Как правило, последовательности хелперных вирусов не могут быть упакованы в вирионы AAV, например, не фланкированные ITR.

[0128] Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что может быть преимущественным обеспечить репликацию AAV и капсидные последовательности и последовательности хелперных вирусов (например, последовательности аденовируса) в одной хелперной конструкции. Данная хелперная конструкция может представлять невирусную или вирусную конструкцию. В качестве одной неограничивающей иллюстрации хелперная конструкция может представлять гибридный аденовирус или гибридный герпесвирус, содержащий гены rep/cap AAV.

[0129] В одном конкретном варианте осуществления последовательности rep/cap AAV и последовательности аденовируса-хелпера поставляются одним аденовирусным хелперным вектором. Данный вектор может дополнительно содержать матрицу AAV. Последовательности rep/cap AAV и/или матрица AAV могут быть вставлены в делецированную область (например, области E1a или E3) аденовируса.

[0130] В дополнительном варианте осуществления последовательности rep/cap AAV и последовательности хелперного аденовируса поставляются одним аденовирусным хелперным вектором. Согласно данному варианту осуществления матрица AAV может быть обеспечена в виде плазмидной матрицы.

[0131] В еще одном иллюстративном варианте осуществления последовательности rep/cap AAV и аденовирусные хелперные последовательности поставляются одним аденовирусным хелперным вектором, и матрица AAV интегрируется в клетку в виде провируса. Альтернативно, матрица AAV обеспечивается вектором EBV, который поддерживается внутри клетки в виде внехромосомного элемента (например, в виде ядерной эписомы на основе EBV).

[0132] В еще одном примерном варианте осуществления последовательности rep/cap AAV и аденовирусные хелперные последовательности обеспечивает один аденовирус-хелпер. Матрица AAV может обеспечиваться в виде отдельного реплицирующегося вирусного вектора. Например, матрица AAV может быть обеспечена частицей AAV или второй рекомбинантной аденовирусной частицей.

[0133] В соответствии с вышеописанными способами гибридный аденовирусный вектор обычно содержит 5' и 3' последовательности в цис-положении аденовируса, достаточные для репликации и упаковки аденовируса (т.е. аденовирусные концевые повторы и последовательности РАС). Последовательности rep/cap AAV и, если она присутствует, матрица AAV встраиваются в остов аденовируса и фланкируются 5'- и 3'-последовательностями в цис-положении, так что эти последовательности могут быть упакованы в капсиды аденовируса. Как описано выше, последовательности аденовируса-хелпера и последовательности rep/cap AAV обычно не фланкированы ITR, так что эти последовательности не упаковываются в вирионы AAV.

[0134] Zhang et al., ((2001) Gene Ther., 18: 704-12) описывают химерный хелпер, включающий как гены аденовируса, так и гены rep и cap AAV.

[0135] Герпесвирус также можно использовать в качестве хелперного вируса в способах упаковки AAV. Гибридные герпесвирусы, кодирующие белок(и) Rep AAV, могут преимущественно способствовать масштабируемой продукции AAV векторов. Описан гибридный вектор на основе вируса простого герпеса типа I (HSV-1), экспрессирующий гены rep и cap AAV-2 (Conway et al., (1999) Gene Ther. 6: 986 и WO 00/17377.

[0136] В качестве дополнительной альтернативы вирусные векторы по изобретению можно получить в клетках насекомых с использованием бакуловирусных векторов для доставки генов rep/cap и матрицы AAV, как описано, например, Urabe et al. (2002) Human Gene Ther., 13: 1935-43.

[0137] Стоки AAV векторов, не содержащих загрязняющего хелперного вируса, можно получить любым способом, известным в данной области. Например, AAV и хелперный вирус можно легко дифференцировать по размеру. AAV также можно отделить от хелперного вируса на основе аффинности к гепариновому субстрату (Zolotukhin et al. (1999) Gene Therapy 6: 973). Делецированные дефектные по репликации хелперные вирусы можно использовать таким образом, чтобы любой загрязняющий хелперный вирус не был компетентным по репликации. В качестве еще одной альтернативы можно использовать аденовирус-хелпер, не обладающий экспрессией поздних генов, поскольку для опосредования упаковки AAV требуется только экспрессия ранних генов аденовируса. В данной области известны мутанты аденовирусов, дефектные по поздней экспрессии генов (например, мутанты аденовирусов ts100K и ts149).

Способы применения векторов CLN1

[0138] Настоящее изобретение также относится к способам доставки ORF CLN1 в клетку или субъекту, для повышения продукции PPT1, например, для терапевтических или исследовательских целей in vitro, ex vivo или in vivo. Таким образом, один аспект изобретения относится к способу экспрессии полипептида PPT1 или открытой рамки считывания CLN1 в клетке, включающему контактирование клетки с полинуклеотидом, экспрессионной кассетой и/или вектором по изобретению, тем самым обеспечивая экспрессию полипептида PPT1 или открытой рамки считывания CLN1 в клетке. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет клетку in vitro, клетку ex vivo или клетку in vivo.

[0139] Еще один аспект изобретения относится к способу экспрессии полипептида PPT1 или открытой рамки считывания CLN1 у субъекта, включающему доставку субъекту полинуклеотида, экспрессионной кассеты, вектора и/или трансформированной клетки по изобретению, тем самым обеспечивая экспрессию полипептида PPT1 или открытой рамки считывания CLN1 у субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет животную модель нейронального цероидного липофусциноза или другого расстройства, связанного с аберрантной экспрессией гена CLN1.

[0140] Дополнительный аспект изобретения относится к способу лечения расстройства, связанного с аберрантной экспрессией гена CLN1 или аберрантной активностью продукта гена CLN1 у субъекта, нуждающегося в этом, включающего доставку субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, экспрессионной кассеты, вектора и/или трансформированной клетки по изобретению, тем самым обеспечивая лечение расстройства, связанного с аберрантной экспрессией гена CLN1 у субъекта. В некоторых вариантах осуществления расстройство, связанное с экспрессией гена CLN1, представляет инфантильный нейрональный цероидный липофусциноз или форму нейронального цероидного липофусциноза с более поздним началом, которая включает, не ограничиваясь этим, поздний инфантильный, ювенильный нейрональный цероидный липофусциноз или нейрональный цероидный липофусциноз с началом во взрослом возрасте.

[0141] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, экспрессионная кассета, вектор и/или трансформированная клетка доставляются в нервную систему субъекта, например, непосредственно в нервную систему субъекта. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, экспрессионная кассета, вектор и/или трансформированная клетка доставляются интратекальной, интрацеребральной, внутрижелудочковой, интраназальной, внутриушной, интраокулярной или периокулярной доставкой или любой их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, экспрессионная кассета, вектор и/или трансформированная клетка доставляются внутривенно. В еще одном варианте осуществления полинуклеотид, экспрессионная кассета и/или вектор доставляются посредством инъекции, электропорации, генной пушки, обработки ультразвуком, магнитофекции, гидродинамической доставки или других физических или химических методов.

[0142] Рекомбинантные вирусные векторы по настоящему изобретению найдут применение в ветеринарных и медицинских применениях. Подходящие субъекты включают птиц и млекопитающих. Как здесь используется, термин «птица» включает, не ограничиваясь этим, цыплят, уток, гусей, перепелов, индеек, фазанов, попугаев, длиннохвостых попугаев. Как здесь используется, термин «млекопитающее» включает, не ограничиваясь этим, людей, приматов, отличных от человека (например, обезьян и бабуинов), крупный рогатый скот, овец, коз, свиней, лошадей, кошек, собак, кроликов, грызунов (например, крыс, мышей, хомяков и т.п.) и т.д. Субъекты-люди включают новорожденных, младенцев, несовершеннолетних и взрослых. Необязательно, субъект «нуждается» в способах по настоящему изобретению, например, потому что у субъекта имеет место или полагается, что имеется риск развития расстройства, включая описанные здесь, или для которого будет полезна доставка полинуклеотида, включая описанные здесь. В качестве дополнительного варианта субъектом может быть лабораторное животное и/или животная модель заболевания.

[0143] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид по изобретению вводится субъекту, нуждающемуся в этом, как можно раньше в течение жизни субъекта, например, как только у субъекта диагностируется аберрантная экспрессия CLN1 и/или аберрантная активность PPT1. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид вводят новорожденному субъекту, например, после того, как результаты скрининга новорожденных выявили аберрантную экспрессию CLN1 и/или аберрантную активность PPT1. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид вводят плоду в матке, например, после того, как пренатальный скрининг выявил аберрантную экспрессию CLN1 и/или аберрантную активность PPT1. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид вводят субъекту, как только у субъекта развиваются симптомы, связанные с аберрантной экспрессией CLN1 и/или аберрантной активностью PPT1, или субъекту, который подозревается или диагностируется как имеющий аберрантную экспрессию CLN1 и/или аберрантную активность PPT1. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид вводят субъекту до того, как у субъекта развиваются симптомы, связанные с аберрантной экспрессией CLN1 и/или аберрантной активностью PPT1, например, субъекту, который подозревается или диагностируется как имеющий аберрантную экспрессию CLN1 и/или аберрантную активность PPT1, но у которого еще не начали проявляться симптомы.

[0144] В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции или фармацевтическому составу, содержащими вирусный вектор по изобретению в фармацевтически приемлемом носителе, и необязательно с другими лекарственными средствами, фармацевтическими агентами, стабилизирующими агентами, буферами, носителями, адъювантами, разбавителями и т.д. Для инъекционного введения носитель обычно представляет собой жидкость. Для других способов введения носитель может быть твердым или жидким. Для ингаляционного введения носитель должен быть вдыхаемым и предпочтительно будет находиться в твердой или жидкой форме в виде частиц.

[0145] Под термином «фармацевтически приемлемое» подразумевается вещество, которое не является токсичным или иным образом нежелательным, т.е. вещество можно вводить субъекту без проявления каких-либо нежелательных биологических эффектов.

[0146] Одним из аспектов настоящего изобретения является способ переноса полинуклеотида, кодирующего полипептид PPT1, или ORF CLN1 в клетку in vitro. Вирусный вектор может быть введен в клетки при соответствующей множественности инфекции в соответствии со стандартными методами трансдукции, подходящими для конкретных клеток-мишеней. Титры вирусного вектора или капсида для введения могут варьироваться в зависимости от типа и количества клеток-мишеней и конкретного вирусного вектора или капсида, и могут быть определены специалистами в данной области без излишнего экспериментирования. В конкретных вариантах осуществления в клетку вводят, по меньшей мере, примерно 10³ инфекционных единиц, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 10⁵ инфекционных единиц.

[0147] Клетка(и), в которую может быть введен вектор (например, вирусный или невирусный вектор), может быть любого типа, включая, не ограничиваясь этим, нейральные клетки (включая клетки периферической и центральной нервной систем, в частности, клетки головного мозга, такие как нейроны, олигодендроциты, глиальные клетки, астроциты), клетки легких, клетки глаза (включая клетки сетчатки, пигментный эпителий сетчатки и клетки роговицы), эпителиальные клетки (например, клетки эпителия пищеварительного тракта и дыхательных путей), клетки скелетных мышц (включая миобласты, миотубы и миоволокна), клетки диафрагмы, дендритные клетки, клетки поджелудочной железы (включая клетки островков Лангерганса), клетки печени, клетки желудочно-кишечного тракта (включая клетки гладкой мускулатуры, эпителиальные клетки), клетки сердца (в том числе кардиомиоциты), клетки костной ткани (например, стволовые клетки костного мозга), гемопоэтические стволовые клетки, клетки селезенки, кератиноциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки предстательной железы, клетки суставов (включая, например, хрящ, мениск, синовиальную оболочку и костный мозг), зародышевые клетки и тому подобное. Альтернативно, клетка может быть любой клеткой-предшественником. В качестве дополнительной альтернативы клетка может представлять стволовую клетку (например, нейрональную стволовую клетку, стволовую клетку печени). В качестве еще одной альтернативы клетка может представлять собой раковую или опухолевую клетку (типы рака и опухоли описаны выше). Более того, клетки по происхождению могут происходить от любых видов, как указано выше.

[0148] Вирусные или невирусные векторы могут быть введены в клетки in vitro с целью введения модифицированной клетки субъекту. В конкретных вариантах осуществления клетки извлекают из организма субъекта, в них вводится вектор, и затем клетки вводят обратно субъекту. Способы извлечения клеток из организма субъекта для лечения ex vivo с последующим введением обратно субъекту известны в данной области (см., например, патент США № 5399346). Альтернативно, рекомбинантный вирусный вектор вводят в клетки от другого субъекта, в культивируемые клетки или в клетки из любого другого подходящего источника, и затем клетки вводят субъекту, нуждающемуся в этом.

[0149] Подходящие клетки для генной терапии ex vivo представляют клетки, описанные выше. Дозировки клеток для введения субъекту будут варьироваться в зависимости от возраста, состояния и вида субъекта, типа клетки, нуклеиновой кислоты, экспрессируемой клеткой, способа введения и тому подобное. Как правило, по меньшей мере, примерно от 10² до примерно 10⁸ или примерно от 10³ до примерно 10⁶ клеток вводят на дозу в фармацевтически приемлемом носителе. В конкретных вариантах осуществления клетки, трансдуцированные вирусным вектором, вводят субъекту в эффективном количестве в комбинации с фармацевтическим носителем.

[0150] Дополнительным аспектом изобретения является способ введения вирусных векторов по изобретению субъекту. В конкретных вариантах осуществления способ включает способ доставки полинуклеотида, кодирующего полипептид PPT1 или его фрагмент, или ORF CLN1 животному, где способ включает: введение эффективного количества вирусного вектора по изобретению животному-субъекту. Введение вирусных векторов по настоящему изобретению человеку или животному, нуждающемуся в этом, может представлять любой способ, известный в данной области. Необязательно, вирусный вектор доставляется в эффективной дозе в фармацевтически приемлемом носителе.

[0151] Дозировки вирусных векторов, которые должны вводиться субъекту, будут зависеть от способа введения, заболевания или патологического состояния, подлежащего лечению, статуса отдельного субъекта, конкретного вирусного вектора и нуклеиновой кислоты, которая должна быть доставлена, и могут определяться обычным образом. Типичными дозами для достижения терапевтического эффекта являются титры вируса, по меньшей мере, примерно 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 10¹⁷ или 10¹⁸ трансдуцирующих единиц или более, например, примерно 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹5 или 10¹⁶, например, от 10¹² до 10¹⁴ трансдуцирующих единиц.

[0152] В конкретных вариантах осуществления может быть использовано более чем одно введение (например, два, три, четыре или более введений) для достижения требуемого уровня экспрессии гена в течение периода с различными интервалами, например, раз в час, раз в день, раз в неделю, раз в месяц, раз в год и т.д. Каждое введение может проводиться одним и тем же или разными путями, например, два введения с интервалом 1 ч различными путями.

[0153] Типичные способы введения включают пероральный, ректальный, трансмукозальный, местный, интраназальный, ингаляционный (например, с использованием аэрозоля), буккальный (например, сублингвальный), интравагинальный, интратекальный, интраокулярный, чрескожный, в матку (или in ovo), парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрикожный, внутримышечный (включая введение в скелетную, диафрагмальную и/или сердечную мышцу), внутрикожный, интраплевральный, интрацеребральный и интраартикулярный), местный (например, на поверхности кожи и слизистых оболочек, включая поверхности дыхательных путей, и чрескожное введение), внутрилимфатический и тому подобное, а также прямую инъекцию в ткани или органы (например, в печень, скелетную мышцу, сердечную мышцу, диафрагмальную мышцу или головной мозг). Введение также может представлять введение в опухоль (например, в опухоль или рядом с опухолью или в лимфатический узел). Наиболее подходящий путь в любом конкретном случае будет зависеть от характера и тяжести патологического состояния, которое лечится, и от природы конкретного вектора, который используется.

[0154] В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор вводится в ЦНС, периферическую нервную систему, или в обе.

[0155] В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор вводится непосредственно в ЦНС, например, в головной мозг или спинной мозг. Прямое введение может привести к высокой специфичности трансдукции клеток ЦНС, например, где, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более трансдуцированных клеток представляют клетки ЦНС. Можно использовать любой способ, известный в данной области, для введения векторов непосредственно в ЦНС. Вектор можно вводить в спинной мозг, ствол головного мозга (продолговатый мозг, варолиев мост), средний мозг (гипоталамус, таламус, эпиталамус, гипофиз, черную субстанцию, шишковидную железу), мозжечок, конечный мозг (полосатое тело, большой мозг, включая затылочную, височную, теменную и лобную доли, кору головного мозга, базальный ганглий, гиппокамп и мозжечковую миндалину), лимбическую систему, неокортекс, полосатое тело, большой мозг и нижний холмик. Вектор также можно вводить в разные области глаза, такие как сетчатка, роговица или зрительный нерв. Вектор может быть доставлен в спинномозговую жидкость (например, с помощью люмбальной пункции) для более дисперсного введения вектора.

[0156] Вектор для доставки можно вводить в требуемую область(и) ЦНС любым способом, известным в данной области, включая, не ограничиваясь этим, интратекальную, интрацеребральную, внутрижелудочковую, интраназальную, внутриушную, интраокулярную (например, в стекловидное тело, субретинальное пространство, переднюю камеру) и периокулярную (например, в субтеноновое пространство) доставку или любую их комбинацию.

[0157] Вектор для доставки можно вводить таким образом, чтобы получить более широко распространенную, диффузную трансдукцию тканей, включая ЦНС, периферическую нервную систему и/или другие ткани.

[0158] Как правило, вирусный вектор вводится в жидком составе прямой инъекцией (например, стереотаксической инъекцией) в требуемую область или отдел в ЦНС и/или другие ткани. В некоторых вариантах осуществления вектор может быть доставлен с помощью резервуара и/или насоса. В еще одних вариантах осуществления вектор можно применить местной аппликацией на требуемую область или интраназальным введением аэрозольного состава. Введение в глаз или в ухо может быть обеспечено местным применением капель жидкого состава. В качестве дополнительной альтернативы вектор можно вводить в виде твердого состава с замедленным высвобождением. Контролируемое высвобождение парвовирусных и AAV векторов описано в международной патентной публикации WO 01/91803.

[0159] Инъекционные составы можно приготовить в обычных формах в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, пригодных для приготовления раствора или суспензии в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Альтернативно, вирусный вектор можно вводить местным, а не системным путем, например, в виде препарата-депо или препарата с замедленным высвобождением. Кроме того, вирусный вектор может быть доставлен сухим в виде хирургически имплантированного матрикса, такого как заменитель костного трансплантата, шов, стент и тому подобное (например, как описано в патенте США № 7201898).

[0160] Термин «фармацевтическая композиция» относится к любым лекарственным формам, которые включают, не ограничиваясь этим, таблетки, таблетку с покрытием, порошок, порошок для восстановления, гранулы, шарики, минитаблетки, многослойную таблетку, бислойную таблетку, таблетку-в-таблетке, пилюли, микрогранулы, небольшие однокомпонентные таблетки, MUPS (многокомпонентную систему частиц), дезинтегрируемые таблетки, диспергируемые таблетки, гранулы, микросферы, лекарственную форму из множества частиц, капсулы (заполненные порошком, порошком для восстановления, гранулами, шариками, минитаблетками, пилюлями, микрогранулами, небольшими однокомпонентными таблетками, MUPS, дезинтегрируемыми MUPS для орального введения, дезинтегрируемыми таблетками, диспергируемыми таблетками, гранулами, гранулами для вскрытия и высыпания в пищу, микросферами и лекарственной формой из множества частиц), саше (заполненные порошком, порошком для восстановления, гранулами, шариками, минитаблетками, пилюлями, микрогранулами, небольшими однокомпонентными таблетками, MUPS, дезинтегрируемыми таблетками, диспергируемыми таблетками, таблетками или капсулами с модифицированным высвобождением, шипучими гранулами, гранулами, гранулами для вскрытия и высыпания в пищу, микросферами и лекарственной формой из множества частиц) или капсулы, заполненные гранулами, для вскрытия и высыпания в пищу. Фармацевтические композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в дискретных разовых формах, таких как капсулы, облатки, леденцы или таблетки, каждая из которых содержит заданное количество композиции по настоящему изобретению; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости; или в виде эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле. Пероральное введение можно выполнить путем комплексообразования вирусного вектора по настоящему изобретению с носителем, способным защищать вектор от деградации под действием пищеварительных ферментов в пищеварительном тракте животного. Примеры таких носителей включают пластиковые капсулы или таблетки, известные в данной области. Такие препараты получают любым подходящим способом, известным в фармации, который включает стадию объединения композиции и подходящего носителя (который может включать один или более вспомогательных ингредиентов, указанных выше). В общем, фармацевтическую композицию согласно вариантам осуществления настоящего изобретения получают равномерным и тщательным смешиванием композиции с жидким или мелко измельченным твердым носителем или обоими, и затем, при необходимости, формованием полученной смеси. Например, таблетку можно приготовить прессованием или формованием порошка или гранул, содержащих композицию, необязательно с одним или более вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки готовят прессованием композиции на подходящей машине для изготовления таблеток в сыпучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанные со связующим веществом, смазывающим веществом, инертным разбавителем и/или поверхностно-активным/диспергирующим агентом(и). Формованные таблетки изготавливают формованием порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким связующим веществом на соответствующей машине. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит фармацевтический состав, который относится к смеси или раствору, содержащему терапевтически эффективное количество активного фармацевтического ингредиента. Активные фармацевтические ингредиенты включают, не ограничиваясь этим, химическое вещество, полипептид, нуклеотид, антитело или липид.

[0161] Фармацевтические композиции, подходящие для буккального (сублигвального) введения, включают леденцы, содержащие композицию по настоящему изобретению в ароматизированной основе, обычно сахарозе и аравийской камеди или трагаканте; и пастилки, содержащие композицию в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь.

[0162] Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, могут включать стерильные водные и неводные инъекционные растворы композиции по настоящему изобретению, где препараты необязательно являются изотоничными с кровью предполагаемого реципиента. Эти препараты могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной с кровью предполагаемого реципиента. Водные и неводные стерильные суспензии, растворы и эмульсии могут содержать суспендирующие агенты и загустители. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и забуференную среду. Носители для парентерального введения включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактированный раствор Рингера или нелетучие масла. Носители для внутривенного введения включают жидкость и добавки питательных веществ, добавки электролитов (такие как на основе раствора декстрозы Рингера) и тому подобное. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы и тому подобное.

[0163] Композиции могут быть представлены в однодозовых или мультидозовых контейнерах, например, в герметичных ампулах и флаконах и могут храниться в высушенном замораживанием (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, солевого раствора или воды для инъекций непосредственно перед применением.

[0164] Инъекционные растворы и суспензии для приготовления экстемпоре можно приготовить из стерильных порошков, гранул и таблеток, описанных ранее. Например, может быть обеспечена инъекционная стабильная стерильная композиция по настоящему изобретению в виде разовой лекарственной формы в герметичном контейнере. Композиция может быть обеспечена в виде лиофилизата, который можно восстановить подходящим фармацевтически приемлемым носителем с образованием жидкой композиции, подходящей для инъекции субъекту. Разовая лекарственная форма может составлять примерно от 1 мкг до примерно 10 г композиции по настоящему изобретению. Когда композиция является по существу нерастворимой в воде, то достаточное количество эмульгирующего агента, который является физиологически приемлемым, можно включить в достаточном количестве для эмульгирования композиции в водном носителе. Одним из таких пригодных эмульгаторов является фосфатидилхолин.

[0165] Фармацевтические композиции, подходящие для ректального введения, могут быть представлены в виде суппозиториев с разовой дозой. Они могут быть получены смешиванием композиции с одним или более обычными твердыми носителями, такими как, например, какао-масло, и затем формованием полученной смеси.

[0166] Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, подходящие для местного нанесения на кожу, могут иметь форму мази, крема, лосьона, пасты, геля, спрея, аэрозоля или масла. Носители, которые могут использоваться, включают, не ограничиваясь этим, вазелин, ланолин, полиэтиленгликоли, спирты, усилители чрескожного всасывания и комбинации двух или более из них. В некоторых вариантах осуществления, например, местная доставка может быть выполнена смешиванием фармацевтической композиции по настоящему изобретению с липофильным реагентом (например, ДМСО), который способен проникать в кожу.

[0167] Фармацевтические композиции, подходящие для чрескожного введения, могут находиться в виде дискретных пластырей, приспособленных для сохранения тесного контакта с эпидермисом субъекта. Композиции, подходящие для чрескожного введения, также могут быть доставлены ионтофорезом (см., например, Pharm. Res. 3: 318 (1986)) и обычно имеют форму необязательно забуференного водного раствора композиции по настоящему изобретению. Подходящие составы могут содержать цитратный или бис/трис-буфер (рН 6) или смесь этанол/вода, и могут содержать от 0,1 до 0,2 М активного ингредиента.

[0168] Вирусные векторы, раскрытые здесь, можно вводить в легкие субъекта любым подходящим способом, например, введением аэрозольной суспензии вдыхаемых частиц, состоящих из вирусных векторов, которые субъект вдыхает. Вдыхаемые частицы могут быть жидкими или твердыми. Аэрозоли жидких частиц, содержащие вирусные векторы, могут быть получены любыми подходящими средствами, такими как аэрозольный распылитель под давлением или ультразвуковой распылитель, известными специалистам в данной области техники. См., например, патент США № 4501729. Аэрозоли твердых частиц, содержащие вирусные векторы, также могут быть получены с помощью любого генератора твердых аэрозольных частиц лекарственного средства, с помощью методов, известных в области фармации.

[0169] Описав настоящее изобретение, оно будет более подробно пояснено в следующих примерах, которые включены здесь только для иллюстративных целей и которые не предназначены для ограничения изобретения.

Пример 1

AAV векторы, содержащие оптимизированный CLN1

[0170] Разработали кассету с геномом AAV вектора для экспрессии ORF CLN1. Данная кассета была сконструирована для обеспечения максимальной экспрессии из генома самокомлементарного AAV, который должен быть упакован в многочисленные капсиды AAV. Кассета состоит из, в следующем порядке: мутантного AAV2 ITR, энхансера CMV, промотора бета-актина курицы, гибридного/модифицированного интрона MVM, кодон-оптимизированной ORF CLN1 человека, сайта полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота и ITA AAV2 дикого типа (WT) (фиг. 1). Экспрессию CLN1 подтверждали трансфекцией экспрессионной кассеты в клетки HEK293, и экспрессированный белок детектировали в клетках и средах с помощью вестерн-блоттинга.

[0171] Экспрессионную кассету CLN1 упаковывали в капсид AAV9, и полученный вектор использовали для введения мышам с нокаутом гена CLN1 интратекально, внутривенно или введением в мостомозжечковую цистерну. Для интратекальной инъекции использовали капсид AAV9 дикого типа, а для внутривенной инъекции использовали капсид AAV9, не нацеленный на печень (AAV9.47). Вектор AAV9 вводили интратекально в дозах 7×10¹⁰, 2,2×10¹¹ или 7×10¹¹ векторных геномов или при рождении внутривенно в дозе 2,8×10¹¹ векторных геномов. Вектор AAV9.47 вводили в дозе 1×10¹² векторных геномов. Векторы вводили при рождении, в возрасте 7-10 дней, 4 недель, 20 недель или 26 недель. Результаты показаны на фиг. 2 для всех групп и на фиг. 3-6 для разных групп.

[0172] Результаты данных исследований показали, что, когда 7×10¹⁰ vg scAAV9/CLN1 вводили интратекально, то продолжительность жизни мышей удваивалась от 8 месяцев до 16 месяцев. Было установлено, что этот вектор также проявляет терапевтический эффект при внутривенном введении.

[0173] На фиг. 7А показано повышение уровней PPT1 в сыворотке мышей, которым проводили терапию scAAV9/CLN1. Вектор вводили интратекально мышам дикого типа, гетерологичным мышам и мышам с нокаутом гена CLN1 в дозах 7×10¹⁰ и 7×10¹¹ vg в возрасте 4, 20 и 26 недель. Уровни сывороточной PPT1 измеряли через 3 месяца после введения или в гуманной конечной точке. Супрафизиологические уровни PPT1 наблюдали на всех временных точках и во всех дозах. На фиг. 7В показаны кривые выживаемости для групп мышей, которым вводили scAAV9/CLN1 в разном возрасте в дозах 7×10¹⁰ и 7×10¹¹ vg. Выживаемость повышалась при более раннем введении в обеих дозах.

[0174] Поведенческие тесты проводили на обработанных мышах для выявления улучшений в поведении после введения вектора.

[0175] В тесте оценки координации движений мышей (гетерологичных необработанных, нокаутных необработанных, нокаутных обработанных в низкой дозе (7×10¹⁰ vg), средней дозе (2,2×10¹¹ vg) или высокой дозе (7×10¹¹ vg) в разном возрасте) размещали на вершине вращающегося стержня с начальной скоростью 3 об/мин. Скорость постепенно увеличивали до 30 об/мин в течение 300-секундного испытания. Измеряли латентный период удерживания до падения с верхушки стержня. Испытания проводили в разном возрасте. Результаты приведены на фиг. 8А (проведение поведенческих тестов начали в возрасте <1 года), и на фиг. 8B (проведение поведенческих тестов начали в возрасте > 1 года). Перенос гена экспрессионной кассеты CLN1 AAV-вектором обеспечивал некоторый положительный эффект в моторной функции у нокаутных мышей во всех дозах и возрастах, где более раннее введение в более высокой дозе обеспечивало наиболее высокий эффект.

[0176] При тестировании способности к плаванию и визуальной функции мышей (гетерологичных необработанных, нокаутных необработанных, нокаутных обработанных в низкой дозе (7×10¹⁰ vg), средней дозе (2,2×10¹¹ vg) или высокой дозе (7×10¹¹ vg) в разном возрасте) помещали в водный лабиринт Морриса, состоящий из бассейна диаметром 122 см, заполненного водой на глубину 45 см, расположенный в комнате с многочисленными визуальными ориентирами. С каждой мышью проводили 4 испытания в день, в течение 2-3 дней, с плаванием к спасательной платформе, с ориентиром в виде фигурного цилиндра, выступающим над поверхностью воды. Для каждого испытания мышь помещали в бассейн в 1 из 4 возможных мест (произвольно упорядоченных), и затем давали 60 с, чтобы найти видимую платформу. Если мышь находила платформу, то испытание заканчивали, и животное оставалось 10 с на платформе до начала следующего испытания. Если платформа не была найдена, то мышь помещали на платформу на 10 с, и затем проводили следующее испытание. Испытания проводили в разном возрасте. Измеряли скорость плавания (фиг. 9А-9В), время поиска нахождения платформы (фиг. 10А-10В) и расстояние плавания (фиг. 11А-11В). Обработанные нокаутные мыши лучше справлялись с этими задачами, чем необработанные контрольные нокаутные мыши, где более раннее введение в более высокой дозе обеспечивало наиболее высокий эффект.

[0177] В тесте на силу хватки (гетерологичных необработанных, нокаутных необработанных, нокаутных обработанных в низкой дозе (7×10¹⁰ vg), средней дозе (2,2×10¹¹ vg) или высокой дозе (7×10¹¹ vg) в разном возрасте) помещали на большую металлическую крышку клетки. Крышку осторожно встряхивали, чтобы побудить мышь к захвату металлической сетки. Затем верхнюю часть клетки перевертывали, и регистрировали латентный период удерживания у мыши до падения с крышки. Максимальная продолжительность испытания составляла 60 с. Также оценивали в баллах хватку, где -6 = мышь немедленно падает или в течение 15 с (если мышь падает за счет первоначального неустойчивого помещения на крышке, то дается второе испытание); -4 = мышь проявляет низкую способность хватки передними или задними лапами, пропуская проволоку лапами, очень неустойчива на проволоке (обычно падает в течение 30 с); -2 = мышь захватывает проволоку, в основном, конечностями, а не лапами; низкая способность к переворачиванию, очень неустойчивая на проволоке; и 0 = мышь имеет нормальное, хорошо скоординированную хватку передними и задними конечностями, хорошую способность к переворачиванию. Испытания проводили в разном возрасте. Регистрировали время удерживания до падения (фиг. 12А-12В) и оценивали координацию (фиг. 13А-13В). Обработанные нокаутные мыши лучше справлялись с этими задачами, чем необработанные контрольные нокаутные мыши, где более раннее введение в более высокой дозе обеспечивало наиболее высокий эффект.

[0178] Оценивали эффект обработки scAAV9/CLN1 у новорожденных мышей. Новорожденным гетерологичным мышам и мышам с нокаутом CLN1 вводили вектор (2,8×10¹¹ vg) внутривенно. В разном возрасте измеряли выживаемость (фиг. 14А), уровни PPT1 в сыворотке (фиг. 14В), поведение на вращающемся стержне в режиме ускорения (фиг. 14С), время удерживания до падения (фиг. 14D), балл координации (фиг. 14Е), скорость плавания (фиг. 14F), время поиска нахождения платформы (фиг. 14G) и расстояние плавания (фиг. 14H). Результаты этих тестов показывают достоверно более высокую функцию у обработанных нокаутных мышей по сравнению с необработанными контрольными мышами с нокаутом во всех оцененных тестах, в том числе, пролонгированную выживаемость. Результаты не демонстрируют какого-либо отрицательного эффекта на обработанных гетерозиготных мышах по любому оцененному показателю, несмотря на длительную экспрессию супрафизиологических уровней активности фермента PPT1 в сыворотке.

[0179] Вышеизложенное иллюстрирует настоящее изобретение и не должно истолковываться как его ограничение.

[0180] Использование термина «или» в формуле изобретения используется для обозначения «и/или», если явно не указано, что они относятся только к альтернативам или альтернативы являются взаимоисключающими, хотя раскрытие поддерживает определение, которое относится только к альтернативам и «и/или».

[0181] Изобретение определяется следующей формулой изобретения, с эквивалентами формулы изобретения, которые должны быть включены в нее.

--->

Список последовательностей

<110> The University of North Carolina at Chapel Hill

Gray, Steven

<120> ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ ГЕНЫ И ЭКСПРЕССИОННЫЕ КАССЕТЫ CLN1, И

ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 5470-788WO

<150> US 62/349,411

<151> 2016-06-13

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 924

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Человеческая кодон-оптимизированная открытая рамка

считывания CLN1

<400> 1

atggcttctc cggggtgtct gtggctgctg gcagtggcac tccttccctg gacttgcgcc 60

agccgggctc tgcagcacct cgaccctcca gcccctcttc cactggtgat ttggcacgga 120

atgggtgatt cctgctgtaa tcccctgtca atgggagcca tcaagaagat ggtggagaag 180

aagatccctg gaatctacgt gctgtcactg gagattggaa agaccctgat ggaggacgtc 240

gagaactcct tcttcctcaa tgtcaactct caagtgacca ccgtctgcca ggccctggcc 300

aaggacccga agctgcagca ggggtataat gctatggggt tcagccaggg aggacagttc 360

cttcgggctg tggcccaacg ctgccctagc ccacccatga tcaacctgat ctcagtgggt 420

ggccagcatc agggcgtgtt cggacttccc cggtgtcccg gggaatcctc tcatatctgc 480

gacttcatcc gcaaaactct caatgcaggc gcttattcaa aggtcgtcca agagaggctg 540

gtgcaagccg agtactggca cgatcccatt aaggaggacg tgtacagaaa tcactcaatc 600

tttctggccg acattaacca ggagagggga attaacgaat catataagaa gaatctcatg 660

gccctcaaaa agttcgtcat ggtgaagttc cttaacgata gcattgtgga cccagtggac 720

agcgaatggt tcggatttta ccgctcaggc caggcaaaag aaaccatccc tctccaagag 780

acttctcttt acacccaaga cagacttggg cttaaggaaa tggataacgc tggtcagctg 840

gtgttcctcg ccaccgaagg tgaccatctg cagctcagcg aagagtggtt ctacgctcat 900

atcatcccgt ttcttggttg ataa 924

<210> 2

<211> 306

<212> ДНК

<213> Промотор бета-актина курицы

<400> 2

tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc 60

cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt 120

gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag 180

gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga 240

aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg 300

cgggcg 306

<210> 3

<211> 137

<212> ДНК

<213> Экзон 1 и интрон 1 бета-актина курицы

<400> 3

ggagtcgctg cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 60

gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 120

tccgggctgt aattagc 137

<210> 4

<211> 256

<212> ДНК

<213> Энхансер цитомегаловируса

<400> 4

tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 60

gtcaatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 120

aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 180

caatgacggt aaatggcccg cctggcattg tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 240

tacttggcag tacatc 256

<210> 5

<211> 92

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Гибридный/модифицированный интрон MVM

<400> 5

aagaggtaag ggtttaaggg atggttggtt ggtggggtat taatgtttaa ttacctggag 60

cacctgcctg aaatcacttt ttttcaggtt gg 92

<210> 6

<211> 254

<212> ДНК

<213> Сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого

скота

<400> 6

ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 60

gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 120

ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 180

ggattgggaa gacaacagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 240

ggaaagaacc agct 254

<210> 7

<211> 2302

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экспрессионная кассета CLN1

<400> 7

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggggtt cggtacccgt 120

tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 180

gtcaatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 240

aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 300

caatgacggt aaatggcccg cctggcattg tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 360

tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 420

gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 480

tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 540

ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 600

gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 660

aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgacgctg ccttcgcccc gtgccccgct 720

ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 780

gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 840

agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 900

ctttttttca ggttggaccg gtcgccacca tggcttctcc ggggtgtctg tggctgctgg 960

cagtggcact ccttccctgg acttgcgcca gccgggctct gcagcacctc gaccctccag 1020

cccctcttcc actggtgatt tggcacggaa tgggtgattc ctgctgtaat cccctgtcaa 1080

tgggagccat caagaagatg gtggagaaga agatccctgg aatctacgtg ctgtcactgg 1140

agattggaaa gaccctgatg gaggacgtcg agaactcctt cttcctcaat gtcaactctc 1200

aagtgaccac cgtctgccag gccctggcca aggacccgaa gctgcagcag gggtataatg 1260

ctatggggtt cagccaggga ggacagttcc ttcgggctgt ggcccaacgc tgccctagcc 1320

cacccatgat caacctgatc tcagtgggtg gccagcatca gggcgtgttc ggacttcccc 1380

ggtgtcccgg ggaatcctct catatctgcg acttcatccg caaaactctc aatgcaggcg 1440

cttattcaaa ggtcgtccaa gagaggctgg tgcaagccga gtactggcac gatcccatta 1500

aggaggacgt gtacagaaat cactcaatct ttctggccga cattaaccag gagaggggaa 1560

ttaacgaatc atataagaag aatctcatgg ccctcaaaaa gttcgtcatg gtgaagttcc 1620

ttaacgatag cattgtggac ccagtggaca gcgaatggtt cggattttac cgctcaggcc 1680

aggcaaaaga aaccatccct ctccaagaga cttctcttta cacccaagac agacttgggc 1740

ttaaggaaat ggataacgct ggtcagctgg tgttcctcgc caccgaaggt gaccatctgc 1800

agctcagcga agagtggttc tacgctcata tcatcccgtt tcttggttga taagcggccg 1860

cggggatccc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 1920

gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 1980

tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 2040

caagggggag gattgggaag acaacagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc 2100

ttctgaggcg gaaagaacca gctttggacg cgtaggaacc cctagtgatg gagttggcca 2160

ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc 2220

cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctggcgt aatagcgaag 2280

aggcccgcac cgatcgccct tc 2302

<---

1. Полинуклеотид, кодирующий полипептид PPT1 человека или его фрагмент, где указанный полинуклеотид содержит открытую рамку считывания CLN1 человека, где указанная открытая рамка считывания CLN1 человека содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность, обладающую, по меньшей мере, примерно 90% идентичностью с ней или ее комплемент.

2. Полинуклеотид по п.1, где указанный полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее комплемент.

3. Экспрессионная кассета, включающая полинуклеотид по п.1.

4. Экспрессионная кассета по п.3, где полинуклеотид операбельно связан с промотором.

5. Экспрессионная кассета по п.4, где промотор представляет собой промотор бета-актина курицы.

6. Экспрессионная кассета по любому из пп.3-5, где полинуклеотид операбельно связан с энхансером.

7. Экспрессионная кассета по п.6, где энхансер является энхансером цитомегаловируса.

8. Экспрессионная кассета по любому из пп.3-7, где полинуклеотид операбельно связан с интроном.

9. Экспрессионная кассета по п.8, где интрон представляет гибридный/модифицированный интрон MVM.

10. Экспрессионная кассета по любому из пп.3-9, где полинуклеотид операбельно связан с сигналом полиаденилирования.

11. Экспрессионная кассета по п.10, где сигнал полиаденилирования является сигналом полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота.

12. Экспрессионная кассета по любому из пп.3-11, дополнительно содержащая, по меньшей мере, один инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV).

13. Экспрессионная кассета по п.12, где экспрессионная кассета содержит два AAV ITR.

14. Экспрессионная кассета по п.13, где два AAV ITR имеют одинаковую нуклеотидную последовательность.

15. Экспрессионная кассета по п.13, где два AAV ITR имеют разные нуклеотидные последовательности.

16. Экспрессионная кассета по любому из пп.12-15, где AAV ITR представляют AAV2 ITR.

17. Экспрессионная кассета по любому из пп.3-16, где экспрессионная кассета представляет геном самокомплементарного AAV.

18. Экспрессионная кассета по любому из пп.3-17, где экспрессионная кассета содержит энхансер, промотор, интрон, открытую рамку считывания CLN1 человека и сайт полиаденилирования.

19. Экспрессионная кассета по п.18, где экспрессионная кассета содержит AAV ITR, энхансер, промотор, интрон, открытую рамку считывания CLN1 человека, сайт полиаденилирования и AAV ITR.

20. Экспрессионная кассета по любому из пп.3-17, где экспрессионная кассета содержит энхансер CMV, промотор бета-актина курицы, гибридный/модифицированный интрон MVM, открытую рамку считывания CLN1 человека и сайт полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота.

21. Экспрессионная кассета по п.20, где экспрессионная кассета содержит мутантный AAV ITR, энхансер CMV, промотор бета-актина курицы, гибридный/модифицированный интрон MVM, открытую рамку считывания CLN1 человека, сайт полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота и AAV ITR дикого типа.

22. Экспрессионная кассета по п.21, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7 или последовательность, по меньшей мере, примерно на 90% идентичную ей.

23. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п.1 или 2 или экспрессионную кассету по любому из пп.3-15.

24. Экспрессионный вектор по п.23, где вектор представляет вирусный вектор.

25. Экспрессионный вектор по п.24, где вектор представляет AAV вектор.

26. Экспрессионный вектор по п.25, где вектор AAV представляет AAV9 вектор.

27. Экспрессионный вектор по п.26, где AAV вектор содержит белки капсида дикого типа.

28. Экспрессионный вектор по п.26, где AAV вектор содержит модифицированный капсидный белок с измененным тропизмом по сравнению с капсидным белком дикого типа.

29. Экспрессионный вектор по п.28, где модифицированный капсидный белок не нацелен на печень.

30. Трансформированная клетка для экспрессирования PPT1, содержащая полинуклеотид по п.1 или 2, экспрессионную кассету по любому из пп.3-22 и/или экспрессионный вектор по любому из пп.23-29.

31. Трансформированная клетка по п.30, где полинуклеотид, экспрессионная кассета и/или вектор стабильно включаются в геном клетки.

32. Фармацевтическая композиция для лечения расстройства, связанного с аберрантной экспрессией гена CLN1 или аберрантной активностью продукта гена CLN1, содержащая эффективное количество полинуклеотида по п.1 или 2, экспрессионной кассеты по любому из пп.3-22, экспрессионного вектора по любому из пп.23-29 и/или трансформированной клетки по п.30 или 31 в фармацевтически приемлемом носителе.

33. Способ экспрессии открытой рамки считывания CLN1 в клетке, включающий контактирование клетки с полинуклеотидом по п.1 или 2, экспрессионной кассетой по любому из пп.3-22 и/или экспрессионным вектором по любому из пп. 23-29, тем самым обеспечивая экспрессию открытой рамки считывания CLN1 в клетке.

34. Способ экспрессии открытой рамки считывания CLN1 у субъекта, включающий доставку субъекту полинуклеотида по п.1 или 2, экспрессионной кассеты по любому из пп.3-22, экспрессионного вектора по любому из пп.23-29 и/или трансформированной клетки по п.30 или 31, тем самым обеспечивая экспрессию открытой рамки считывания CLN1 у субъекта.

35. Способ лечения расстройства, связанного с аберрантной экспрессией гена CLN1 или аберрантной активностью продукта гена CLN1 у субъекта, нуждающегося в этом, включающий доставку субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида по п.1 или 2, экспрессионной кассеты по любому из пп.3-22, экспрессионного вектора по любому из пп.23-29 и/или трансформированной клетки по п.30 или 31, тем самым обеспечивая лечение расстройства, связанного с аберрантной экспрессией гена CLN1 у субъекта.

36. Способ по п.35, где расстройство, связанное с экспрессией гена CLN1, представляет инфантильный, поздний инфантильный, ювенильный нейрональный цероидный липофусциноз или нейрональный цероидный липофусциноз с началом во взрослом возрасте.

37. Способ по любому из пп.34-36, где полинуклеотид, экспрессионную кассету, экспрессионный вектор и/или трансформированную клетку доставляют в нервную систему субъекта.

38. Способ по п.37, где полинуклеотид, экспрессионную кассету, экспрессионный вектор и/или трансформированную клетку доставляют интратекальной, интрацеребральной, внутрижелудочковой, интраназальной, внутриушной, интраокулярной или периокулярной доставкой или любой их комбинацией.

39. Способ по любому из пп.34-36, где полинуклеотид, экспрессионную кассету, экспрессионный вектор и/или трансформированную клетку доставляют внутривенно.