Способ профилактики эшерихиоза у поросят
Владельцы патента RU 2766549:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" (RU)
Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к способу профилактики эшерихиоза у поросят. Способ включает двукратную иммунизацию супоросных свиноматок: первый раз за 30 дней до опороса, второй раз - за 20 дней, и поросят первый раз в возрасте 15-17 дней, а второй раз - в возрасте 28-30 дней вакциной, содержащей бесклеточную культуральную среду, включающую инактивированные формалином до его конечной концентрации 0,4% термолабильные, термостабильные и шигаподобные токсины Escherichia coli, а также в качестве адъювантов - раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл действующего вещества, и 3% водный раствор полиакриловой кислоты. Изобретение обеспечивает повышение эффективности специфической профилактики эшерихиоза у поросят. 2 табл., 7 пр.
Изобретение относится к области ветеринарии, касается способа профилактики инфекционных заболеваний поросят.
Эшерихиоз свиней - остро протекающая инфекционная болезнь поросят, характеризующаяся диареей, явлениями токсемии, реже септицемией, и сопровождающаяся высокой смертностью.
Известен способ профилактики колибактериоза поросят, включающий иммунизацию супоросных свиноматок вакциной против эшерихиоза животных (Коли-Вак К88, К99, 987Р, F41, ТЛ- и ГС-анатоксины) [Наставление по применению вакцины против эшерихиоза животных (Коли-Вак К88, К99, 987Р, F41, ТЛ- и ТС-анатоксины). / Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 20.06.1997 г] внутримышечно за полтора месяца до опороса с интервалом 10-15 дней, при этом первая и вторая доза составляет -5 см3.
Известен способ профилактики колибактериоза, включающий иммунизацию поросят вакциной против эшерихиоза животных (Коли-Вак К88, К99, 987Р, F41, ТЛ и ТС-анатоксины) внутримышечно перед отъемом с интервалом 10-15 дней; при этом первая доза составляет 1 см3, вторая - 1,5 см3 [Наставление по применению вакцины против эшерихиоза животных (Коли-Вак К88, К99, 987Р, F41, ТЛ- и ТС-анатоксины). / Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 20.06.1997 г.].
Также установлено, что эффективными средствами специфической профилактики эшерихиоза у животных являются вакцины, содержащие в своем составе инактивированные экзотоксины патогенных Escherichia coli (Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных / М.К. Пирожков // Дисс. док. вет. наук. - Москва. 2002. - 298 с.). В настоящее время есть исследования по использованию биопрепаратов, которые включают сразу три вида токсинов патогенных эшерихий: термолабильный (LT) и термостабильный (ST) и шигаподобный (STX) токсины, как в чистом виде, так и в сочетании с адъювантами (Караев Я.М. Иммуногенные и протективные свойства эшерихиозного анатоксина : дис. … канд. вет. наук / Я.М. Караев. - Краснодар: КубГАУ, 2009. - 132 с.; Тищенко А.С. Влияние адъювантов на иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина : дис. … канд. вет. наук / А.С. Тищенко. - Краснодар: КубГАУ, 2011. - 124 с.). Однако, этими исследованиями было установлено, что эшерихиозный анатоксин стимулирует клеточные и гуморальные звенья иммунитета в первые сутки после введения препаратов, а использование адъювантов хоть и усиливает иммунный ответ, но на непродолжительное время. Учитывая данные обстоятельства, необходимо искать новые способы повышения иммуногенной активности вакцинных препаратов на основе инактивированных токсинов кишечной палочки.
Известно применение пирогенала и полиакриловой кислоты по-отдельности в качестве адъювантов для усиления иммуногенности эшерихиозного анатоксина, содержащим инактивированные токсины (TL, TS, STX) Е. coli (Терехов, В.И. Влияние различных адъювантов на иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина / В.И. Терехов, Я.М. Караев, А.С. Тищенко, А.В. Иванов // Тр. / КубГАУ. - 2009. - Вып. №1 (ч.1) Серия: Ветеринарные науки. - С. 100-102.; Тищенко А.С. и др. Влияние бактериального полисахарида и полиэлектролита на иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина // Молодой ученый. - 2016. - №20 (124). - С. 113-115.; Тищенко А.С, Терехов В.И., Сердюченко И.В. Иммуногенность эшерихиозного анатоксина при использовании с пирогеналом и полиакриловой кислотой // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: сб. ст. по материалам X Всерос. конф. молодых ученых. - Краснодар: КубГАУ, 2017 - С. 287-288.).
Недостатком известных исследований является то, что эшерихиозная вакцина с использованием в качестве адъюванта раствора пирогенала и эшерихиозной вакцины с использованием в качестве адъюванта раствора полиакриловой кислоты обладали низкими иммуногенными свойствами, что негативно сказывалось на формировании и продолжительности поствакцинальной защиты у животных против токсинов кишечной палочки. Кроме того, биологической моделью в этих исследованиях выступали белые крысы и кролики и неизвестно, как будут проявлять себя компоненты вакцины на поросятах.
Известно применение адъювантов, в том числе полиакриловой кислоты и пирогенала, в сочетании с эшерихиозным анатоксином в опытах на стельных коровах и супоросных свиноматках (Тищенко А.С. Влияние адъювантов на иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина: дис. канд. вет. наук / А.С. Тищенко. - Краснодар: КубГАУ, 2011. - 124 с.; Тищенко, А.С. Оценка гуморального иммунного ответа у супоросных свиноматок, иммунизированных эшерихиозным анатоксином в сочетании с адъювантами / А.С. Тищенко, В.И. Терехов // Тр. / КубГАУ. - 2011. - Вып. №2 (29). - С. 144-147; Терехов, В.И. Влияние адъювантов на иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина при вакцинации стельных коров / В.И. Терехов, А.С. Тищенко // Ветеринария Кубани. - 2011. - №3. - С. 19-21; Тищенко А.С., Новикова Е.Н., Винокурова Д.П., Киященко А.А., Кремянский В.В. Распространение эшерихиоза поросят и способ его специфической профилактики / Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2018. - №137. - С. 220-229), а также определена профилактическая эффективность данных препаратов (Тищенко, А.С. Профилактическая эффективность эшерихиозного анатоксина при эшерихиозе поросят / А.С. Тищенко, В.И. Терехов // Опыт международного сотрудничества в области экологии, лесного хозяйства, ветеринарной медицины и охотоведения: материалы II-й Междунар. науч. - практ. конф. / КубГАУ. - Краснодар, 2010. - С. 380-381).
Недостатком известных исследований является то, что эшерихиозная вакцина с использованием по отдельности в качестве адъювантов растворов пирогенала и полиакриловой кислоты обладали непродолжительным иммунным ответом, что отражалось на эффективности специфической профилактики эшерихиоза. Кроме того, адъювантные компоненты, применяемые с эшерихиозной вакциной по-отдельности, в целом обладают слабой иммуногенностью и могут проявлять ректогенность.
Известен способ получения эшерихиозного анатоксина (патент №2432174 от 27.10.2011, МПК А61К 39/108, C12N 1/20, А61Р 1/00), в котором, отбирают и раздельно культивируют эпизоотические штаммы Escherichia coli, обладающие генами термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов, на питательном бульоне при температуре 37°С в течение 6-7 дней с ежедневным двукратным перемешиванием. Инактивацию культур проводят путем добавления формалина до концентрации не более 0,4%, при температуре 37°С в течение 14 суток с ежедневным двукратным перемешиванием. После чего отбирают и смешивают культуры в равных соотношениях, отделяют бактериальную массу с помощью стерилизующей фильтрации и получают комплексный препарат.
Недостатком данного способа является отсутствие адъювантов, и как следствие низкая иммуногенная активность препарата, что недостаточно обеспечивает эффективность профилактики эшерихиоза у животных.
Известно использование высокоактивного неспецифического иммуномодулирующего препарата широкого спектра действия «Пирогенал», который вводят внутримышечно до родов в дозе 0,1 мкг/кг массы тела беременных животных, а именно в первую половину беременности выполнение в количестве 10 инъекций с интервалом 1 день, а во вторую половину беременности 5 инъекций с интервалом 2 дня, общим курсом 15 инъекций (патент РФ №2654563, кл. А01К 67/02, 2018 г.).
Наиболее близким по технической сущности является способ профилактики колибактериоза поросят, включающий двукратную иммунизацию поросят вакциной против эшерихиоза животных (Коли-Вак К88, К99, 987Р, F41, ТЛ- и ТС-анатоксины) и иммунизацию этой же вакциной супоросных свиноматок от которых получены поросята (патент РФ №2358758, кл. А61К 39/02, 2009 г.).
Недостатком известного способа является недостаточная эффективность специфической профилактики эшерихиоза у поросят.
Техническим результатом изобретения является повышение эффективности специфической профилактики эшерихиоза у поросят.
Технический результат достигается тем, что в способе профилактики эшерихиоза у поросят, включающем двукратную иммунизацию внутримышечно супоросных свиноматок первый раз за 30 дней до опороса в дозе 5,0 мл, второй раз - за 20 дней также в дозе 5 мл, и поросят первый раз в возрасте 15-17 дней в дозе 0,25 мл, а второй - в возрасте 28-30 дней в дозе 0,5 мл вакциной, содержащей бесклеточную культуральную среду, которую получают путем стерилизующей фильтрации бульонной культуры Escherichia coli, продуцирующей термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, согласно изобретению используют вакцину, которая в качестве адъювантов содержит раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл действующего вещества и 3% водный раствор полиакриловой кислоты, которые внесены поочередно с последующим перемешиванием в бесклеточную культуральную среду, содержащую инактивированные формалином до его конечной концентрации 0,4% термолабильные, термостабильные и шигаподобные токсины Escherichia coli, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл | |
| действующего вещества | 9-11 |
| 3% водный раствор полиакриловой кислоты | 9-11 |
| бесклеточная культуральная среда, содержащая | |
| инактивированные термолабильные, термостабильные | |
| и шигаподобные токсины Escherichia coli | до 100, |
при этом свиноматок иммунизируют внутримышечно в область основания ушной раковины, а поросят вакцинируют внутримышечно в область внутренней поверхности бедра.
Новизна технического решения состоит в том, что за счет использования бесклеточных культур эпизоотических штаммов Escherichia coli, продуцирующих термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, инактивированных формалином, при совместном использовании растворов пирогенала и полиакриловой кислоты обеспечивается повышение иммуногенных свойств вакцины и эффективности профилактики эшерихиоза у поросят, а также безвредность биопрепарата за счет отсутствия после применения, поствакцинальных реакций.
В патентной и научно-технической литературе не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявляемого предложения.
Предложенный способ профилактики эшерихиоза у поросят соответствует критерию «промышленная применимость», поскольку может быть широко использован в свиноводческих комплексах.
Способ профилактики эшерихиоза у поросят осуществляется следующим образом.
Для иммунизации поросят и супоросных свиноматок от которых получены поросята используют эшерихиозную вакцину (ЭВ), которая в качестве адъювантов: содержит раствор пирогенала, содержащий 100 мкг действующего вещества - липополисахарид (ЛПС), выделенный из клеток Salmonella typhi) (EAN: 4602379000047) - 8 мл (8 ампул по 1 мл) - (8%); 9 мл (9 ампул по 1 мл) - (9%); 10 мл (10 ампул по 1 мл) - (10%); 11 мл (11 ампул по 1 мл) -(11%) и 12 мл (12 ампул по 1 мл) - (12%);
- 3% водный раствор полиакриловой кислоты (ПАК) - 8 мл (8%); 9 мл (9%); 10 мл (10%); 11 мл(11%) и 12 мл(12%), которые внесят поочередно с последующим перемешиванием в бесклеточную культуральную среду, содержащую инактивированные формалином до его конечной концентрации 0,4% термолабильные, термостабильные и шигаподобные токсины Escherichia coli, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл | |
| действующего вещества | 9-11 |
| 3% водный раствор полиакриловой кислоты | 9-11 |
| бесклеточная культуральная среда, содержащая | |
| инактивированные термолабильные, термостабильные | |
| и шигаподобные токсины Escherichia coli | до 100 |
Супоросных свиноматок иммунизируют двукратно: первый раз за 30 дней до опороса в дозе 5 мл, второй раз - за 20 дней, также в дозе 5 мл внутримышечно в область основания ушной раковины, а поросят вакцинируют внутримышечно в область внутренней поверхности бедра - первый раз в возрасте 15-17 дней в дозе 0,25 мл, а второй - в возрасте 28-30 дней в дозе 0,5 мл.
Периоды двукратной иммунизации супоросных свиноматок обусловлены тем, что на последней стадии беременности начинает происходить образование молозива, которое необходимо наполнить антителами, путем иммунизации, поэтому первое введение препарата за 30 дней до опороса. Проводить иммунизацию раньше 30 дней до опороса не целесообразно, поскольку защитные антитела не накопятся в молозиве в достаточных титрах. Вторая иммунизация за 20 дней - проводится с целью увеличения молозивных антител, для повышения иммунного статуса организма супоросной свиноматки перед опоросом, что положительно влияет на плод, также, повышая его иммунитет перед эшерихиозной инфекцией.
Что касается двукратной дозы по 5 мл для свиноматок, то она была подобрана опытным путем. При введении меньших доз, не вырабатывается достаточное количество антител, при больших дозах выработка антител угнетается, кроме того, возможны местные поствакцинальные реакции.
Внутримышечное введение препарата в область основания ушной раковины проводится по общепринятой методике внутримышечного введения взрослым свиньям и является оптимальным.
Двукратное введение вакцины поросятам проводят в соответствии со следующими периодами:
- в возрасте 15-17 дней, так как в этот период содержание пассивно полученных молозивных антител у теленка уменьшается, и для поддержания иммунного статуса животного, необходимо ввести в их организм вакцину в количестве 0,25 мл, которое достаточно для создания собственного активного иммунитета и выработки необходимого количества антител;
- введение препарата в возрасте 28-30 дней обусловлено тем, что повторная иммунизация вакциной в дозе 0,5 мл будет обладать потенцирующим эффектом, и является достаточной для выработки необходимого количества собственных защитных антител против эшерихиозной инфекции, что особенно важно при стресс-факторах, связанных с отъемом поросят от матери в этот период. Если взять меньшее количество вакцины, то не будет обеспечиваться требуемый уровень антител, а при большем - возможна местная реакция в виде припухлостей и раздражений.
Вакцинацию осуществляют внутримышечно в область внутренней поверхности бедра, поскольку, у поросят эта область туловища менее травматична, т.к. не имеет большого количества кровеносных сосудов.
Пример конкретного осуществления способа профилактики эшерихиоза у поросят.
В хозяйстве длительно неблагополучном по эшерихиозу поросят сформировали 5 групп супоросных свиноматок по 5 животных в каждой.
В первой группе свиноматок и полученных от них поросят иммунизировали предлагаемой вакциной (ЭВ+ЛПС+ПАК). Свиноматок иммунизировали первый раз за 30 дней до опороса в дозе 5 мл, второй раз - за 20 дней в дозе 5 мл внутримышечно в область основания ушной раковины. Поросят иммунизировали дважды первый раз в возрасте 15-17 дней в дозе 0,25 мл, а второй в возрасте 28-30 дней в дозе 0,5 дней внутримышечно в области внутренней поверхности бедра.
Вторую группу свиноматок и полученных от них поросят иммунизировали эшерихиозной вакциной с раствором пирогенала (ЭВ+ЛПС) по схеме и в дозах аналогичных в первой группе.
Третью группу свиноматок и полученных от них поросят иммунизировали эшерихиозной вакциной с полиакриловой кислотой (ЭВ+ПАК) по схеме и в дозах аналогичных в первой группе.
Четвертую группу свиноматок и полученных от них поросят иммунизировали эшерихиозной вакциной без адъювантов (ЭВ) по схеме и в дозах аналогичных в первой группе.
Пятая группа свиноматок была контрольной, они и полученные от них поросята не иммунизировались.
За поросятами в течение 90 дней вели клиническое наблюдение, учитывали количество заболевших и павших животных. Результаты проведенного исследования представлены в таблице 1.
Из материалов таблицы 1 видно, что в 1-й группе от 5 свиноматок было получено 53 поросят, из которых заболело 8 голов и пало 2. Заболеваемость по группе составила 15,1%, смертность 3,8%. Следовательно, профилактическая эффективность заявляемого способа составила 84,9% при сохранности поросят в группе 96,2%.
Во 2-й группе, где свиноматки иммунизировались вакциной с раствором пирогенала, родилось 52 поросенка, из которых 12 заболело и 4 пало. Заболеваемость по этой группе составила 23,1%, смертность 7,7%, профилактическая эффективность 78,9%, при сохранности 92,3%.
В 3-й группе было получено 54 поросенка, из них 14 заболело, 6 пало. Заболеваемость составила 25,9%, смертность 11,1%, профилактическая эффективность 74,1%, а сохранность 88,8%.
В четвертой группе, где свиноматки вакцинировались вакциной без адъювантов, родилось 53 поросенка, из них 20 заболело, 8 пало. Заболеваемость составила 37,7%, смертность 15,1%, профилактическая эффективность 62,3%, а сохранность 84,9%.
В 5-й группе было получено 53 поросенка, из них 28 заболело, 9 пало. Заболеваемость составила 52,8%, смертность 17%), сохранность 83%).
Следовательно, применение вакцины против эшерихиоза, полученной по заявляемому способу позволило более эффективно профилактировать заболевание поросят с эшерихиозной инфекцией. При этом заболеваемость снизилась по сравнению с аналогом 1 на 8%, аналогом 2 на 10,8%, аналогом 3 на 22,6%, а в сравнении с группой (контроль) на 37,7%, при этом падеж сократился в 2-4,5 раза, что свидетельствует о высокой эффективности заявляемой вакцины.
Иммуногенные свойства эшерихиозной вакцины изучали у поросят, полученных от вакцинированных супоросных свиноматок. Сыворотку крови для определения наличия антитоксических антител в реакции диффузной преципитации отбирали через 7, 14, 28 и 56 дней после последней их вакцинации.
Влияние применения вакцин на титр антител у поросят представлены в таблице 2.
Из материалов таблицы 2 видно, что иммунизация свиноматок и поросят заявляемым способом обеспечивает более напряженный и продолжительный специфический иммунитет против эшерихиозной инфекции. Об этом свидетельствуют количество антител к токсинам кишечной палочки у поросят, которых у животных первой группы в 2-32 раза больше, чем у животных из остальных групп.
Эффективность вакцины против эшерихиоза поросят зависит от свойств подобранных эпизоотических штаммов Escherichia coli, последовательности приготовления и процентного соотношения компонентов входящий в ее состав, таких как: - пирогенал (фармацевтический препарат, выпускается в ампулах, в виде раствора для внутримышечного введения в дозе 1 мл которого, содержится 100 мкг действующего вещества - липополисахарид (ЛИС), выделенный из клеток Salmonella typhi) (EAN: 4602379000047); - 3% водный раствор полиакриловой кислоты.
Количественные значения ввода адъювантов подобраны экспериментальным путем, при этом учитывалась иммуногенная активность вакцины. При вводе растворов пирогенала и полиакриловой кислоты в объеме 8% иммуногенная активность повышалась, но все же была не достаточной для длительного сохранения поствакцинального иммунитета. При вводе адъювантов в объеме 12%, увеличения продукции специфических антител более значения, чем при их вводе в объеме 9-11% не происходило, а экономические затраты возрастали. Кроме того, вслед за повышением ввода раствора полиакриловой кислоты возрастала опасность развития местной воспалительной реакции из-за раздражения тканей.
Приведено пять примеров (1-5) зависимости эффективности вакцины против эшерихиоза поросят от соотношения заявленных компонентов из расчета на 100 мл вакцины.
Для примеров 1-5 использовали эпизоотические штаммы Escherichia coli, обладающие генами термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов, проводили их культивирование на питательном бульоне при температуре 37°С в течение 6-7 дней с ежедневным двукратным перемешиванием, затем их инактивировали формалином до его конечной концентрации 0,4% в течение 14 суток с ежедневным двукратным перемешиванием, после чего отбирали и смешивали культуры в равных соотношениях, отделяли бактериальную массу с помощью стерилизующей фильтрации, для получения бесклеточной культуральной среды, в которую поочередно с последующим перемешиванием вносили адъюванты со следующими объемными количествами и процентным соотношением:
Пример 1 - при следующем соотношении компонентов, масс. %:
| раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл | |
| действующего вещества | 8 |
| 3% водный раствор полиакриловой кислоты | 8 |
| бесклеточная культуральная среда, содержащая | |
| инактивированные термолабильные, термостабильные | |
| и шигаподобные токсины Escherichia coli | до 100 |
При данном соотношении компонентов вакцина обладает слабой протективной активностью и защищает от эшерихиозной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli телят в 75%, а поросят в 72% случаев.
Пример 2. При следующем соотношении компонентов, масс. %:
| раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл | |
| действующего вещества | 9 |
| 3% водный раствор полиакриловой кислоты | 9 |
| бесклеточная культуральная среда, содержащая | |
| инактивированные термолабильные, термостабильпые | |
| и шигаподобные токсины Escherichia coli | до 100 |
При данном соотношении компонентов вакцина защищает от эшерихиозной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, в 86%, а поросят в 82% случаев.
Пример 3. При следующем соотношении компонентов, масс. %:
| раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл | |
| действующего вещества | 10 |
| 3% водный раствор полиакриловой кислоты | 10 |
| бесклеточная культуральная среда, содержащая | |
| инактивированные термолабильные, термостабильные | |
| и шигаподобные токсины Escherichia coli | до 100 |
При данном соотношении компонентов вакцина защищает от эшерихиозной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, в 92%, а поросят в 87% случаев.
Пример 4. При следующем соотношении компонентов, масс. %:
| раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл | |
| действующего вещества | 11 |
| 3% водный раствор полиакриловой кислоты | 11 |
| бесклеточная культуральная среда, содержащая | |
| инактивированные термолабильные, термостабильные | |
| и шигаподобные токсины Escherichia coli | до 100 |
При данном соотношении компонентов вакцина защищает от эшерихиозной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, в 94%, а поросят в 90% случаев.
Пример 5. При следующем соотношении компонентов, масс. %:
| раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл | |
| действующего вещества | 12 |
| 3% водный раствор полиакриловой кислоты | 12 |
| бесклеточная культуральная среда, содержащая | |
| инактивированные термолабильные, термостабильные | |
| и шигаподобные токсины Escherichia coli | до 100 |
При данном соотношении компонентов вакцина защищает от эшерихиозной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, в 84%, а поросят в 80% случаев. На месте введения у отдельных животных, особенно из числа поросят развились плотные болезненные припухлости и повышение температуры тела.
Вакцину против эшерихиоза поросят производят следующим образом.
Первоначальные этапы получения эшерихиозной вакцины осуществляли по патенту РФ на изобретение №2432174 от 27.10.2011, МПК А61К 39/108, C12N 1/20, А61Р 1/00.
Предварительно из эпизоотических штаммов Escherichia coli отобрали штаммы, обладающие генами термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов. Для этого использовали тест-системы «АмплиСенс E.coli-tox» (Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии М3 РФ, г. Москва). Подтверждение токсинообразования на искусственной питательной среде осуществляли с помощью биотеста на инфузориях-стилонихиях (патент РФ на изобретение 2262529 от 20.10.2005, МПК C12N 1/10, C12Q 1/10). По известному патенту, для испытания по выживаемости инфузорий использовали культуру кишечной палочки, выращенную на бульоне Хоттингера со сроком инкубации 1-3 суток, затем среду с инфузориями смешивали с бульонной культурой кишечной палочки в соотношении 3:1. При наличии в культуральной среде экзотоксинов, количество погибших инфузорий должно быть не менее 70-80%, в то время как количество погибших инфузорий в контрольной пробе, не содержащей токсин, не должно превышать 5%.
Отобранные штаммы по отдельности засевали в пробирки с 10 мл питательного бульона для накопления токсинов кишечной палочки, в состав которой входят кислотный гидролизат крови (9-11%), аутолизат пекарских дрожжей (9-11%), пептон (0,9-1,1%), пария хлорид (0,4-0,6%), двузамещенный фосфорнокислый натрий (0,05-0,15%) и калия хлорид (0,01-0,03%) (патент РФ на изобретение 2342425 от 27.12.2008, МПК C12N 1/20, C12Q 1/04). Затем их помещали в термостат и культивировали при 37°С в течение 6-8 ч до появления легкой мути, свидетельствующей о росте микроорганизмов. Далее полученные культуры переносили в колбы с 200-300 мл аналогичного питательного бульона и инкубировали при 37°С в течение: продуцирующие термолабильный и термостабильный - 6 суток, а продуцирующие шигаподобный токсин - 7 суток. Ежедневно 2 раза в сутки колбы встряхивали. Перед окончанием инкубирования из каждой колбы отобрали по 10 мл культуральной жидкости, центрифугировали при 10 тыс.об/мин в течение 30 мин и определяли методом биотестирования на инфузориях наличия токсинов.
При наличии токсинов в оставшиеся культуры добавили формалин до концентрации 0,3-0,4%. Инактивацию культур проводили в течение 14 суток при температуре 37°С с ежедневным двукратным перемешиванием. После завершения инактивации равные объемы культур объединяли, получив, таким образом, комплексный препарат, содержащий 3 вида антигенов. С помощью стерилизующей фильтрации отделили микробную массу от среды культивирования, получая, таким образом, бесклеточную культуральную среду Escherichia coli (эшерихиозный антигенный токсоидный компонент). Далее в бесклеточную культуральную среду Escherichia coli: вносили адъюванты: препарат раствор пирогенала (липополисахарид, выделенный из микробных клеток Salmonella typhi, производитель ФГБУ НИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи Минздрава России) в 0,01% концентрации и 3% раствор полиакриловой кислоты (производства ООО Химдирект сервис, Москва) при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл | |
| действующего вещества | 9-11 |
| 3% водный раствор полиакриловой кислоты | 9-11 |
| бесклеточная культуральная среда, содержащая | |
| инактивированные термолабильные, термостабильные | |
| и шигаподобные токсины Escherichia coli | до 100 |
Использование вакцины в заявляемом способе позволяет обеспечить защиту поросят от эшерихиозной инфекции продолжительностью не менее 6 месяцев (срок наблюдения).
Способ профилактики эшерихиоза у поросят, включающий двукратную иммунизацию внутримышечно супоросных свиноматок: первый раз за 30 дней до опороса в дозе 5,0 мл, второй раз - за 20 дней также в дозе 5 мл, и поросят первый раз в возрасте 15-17 дней в дозе 0,25 мл, а второй - в возрасте 28-30 дней в дозе 0,5 мл вакциной, содержащей бесклеточную культуральную среду, которую получают путем стерилизующей фильтрации бульонной культуры Escherichia coli, продуцирующей термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, отличающийся тем, что используют вакцину, которая в качестве адъювантов содержит раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл действующего вещества и 3% водный раствор полиакриловой кислоты, которые внесены поочередно с последующим перемешиванием в бесклеточную культуральную среду, содержащую инактивированные формалином до его конечной концентрации 0,4% термолабильные, термостабильные и шигаподобные токсины Escherichia coli, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл | |
| действующего вещества | 9-11 |
| 3% водный раствор полиакриловой кислоты | 9-11 |
| бесклеточная культуральная среда, содержащая | |
| инактивированные термолабильные, термостабильные | |
| и шигаподобные токсины Escherichia coli | до 100, |
при этом свиноматок иммунизируют внутримышечно в область основания ушной раковины, а поросят вакцинируют внутримышечно в область внутренней поверхности бедра.
