Комбинация, включающая иммуностимулирующие олигонуклеотиды

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, обладающую иммуностимулирующими свойствами, фармацевтическую композицию для лечения инфекционного заболевания, содержащую вышеуказанную линейную некодирующую молекулу ДНК, способ лечения инфекционного заболевания и применение линейной некодирующей молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью или фармацевтической композиции при изготовлении лекарственного средства для лечения инфекционного заболевания. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения инфекционных заболеваний. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 13 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение представляет собой комбинированную методику и используется для лечения заболеваний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Термин «иммунотерапия» означает лечение заболеваний путем стимулирования, индукции, усиления или подавления иммунного ответа. Стратегия иммунотерапии заключается в борьбе с болезнями (раком, инфекционными заболеваниями, аллергией и астмой).

Известны различные активные агенты, так называемые иммуномодуляторы, имеющие потенциал к использованию в иммунотерапии. Большинство известных иммуномодуляторов относятся к малым молекулам или нуклеиновым кислотам, многие из которых взаимодействуют с толл-подобной рецепторной системой. Самые известные иммуномодулирующие короткие последовательности ДНК содержат неметилированный цитозино-гуаниновый мотив (CG-мотив), который был описан в работе Krieg et al. (Nature 1995 374: 6522 546-549). В геноме эукариотов возникновение неметилированных CG-мотивов в значительной степени подавляется, в отличие от прокариотов или вирусов. Поэтому молекулы ДНК, содержащие такой мотив, эволюционировали в естественный «предупреждающий сигнал», запускающий борьбу иммунной системы с прокариотическими или вирусными патогенами. Такой эффект можно использовать в терапевтических или профилактических целях путем применения подобных последовательностей для лечения или профилактики инфекционных заболеваний при помощи с иммунотерапии. В последние годы особое внимание уделяется использованию таких иммуномодуляторов в лечении онкологических заболеваний, чтобы активировать собственную иммунную систему пациента для борьбы с опухолями.

ДНК-конструкты, содержащие неметилированные CG-мотивы, вызывают интенсивную физиологическую реакцию, активно стимулируя эффекторные клетки врожденной иммунной системы, включая дендритные клетки, макрофаги, естественные киллеры (NK) и NKT-клетки. Неметилированные CG-мотивы обнаруживаются рецептором распознавания мотива, присущим врожденному иммунитету, - толл-подобным рецептором-9 (TLR9). Несмотря на то, что точный механизм такого распознавания еще не до конца изучен, ученые уже достигли значительного прогресса в определении основных путей его действия (А. Krieg, Nat. Rev. Drug Disc, 5: 471-484, 2006).

Предполагается, что при связывании ДНК-конструктов, содержащих неметилированные CG-мотивы, и рецептора в реактивных клетках активируются многочисленные сигнальные каскады. Подобная активизация соответствующих поверхностных молекул и секреции цитокинов запускает приобретенный иммунитет с преобладанием Th1-клеток. Такие конструкты можно использовать в комбинации, например, с антителами, химиотерапией или лучевой терапией, вакцинами или цитокинами. Аллергические заболевания и астма являются преимущественно Th2-опосредованными. При увеличении соотношения Th1/Th2, Th2-опосредованные реакции ослабевают, что можно использовать для лечения или профилактики вышеуказанных заболеваний.

Поверхностные молекулы, не регулируемые TLR9, включают, в частности, CD40, CD69, CD80, CD86 или CD169, в зависимости от типа клетки. Усиленная секреция цитокинов также характерна для различных типов клеток; цитокины включают, например, макрофагальные воспалительные белки (МВБ)-1α, МВБ-1β, интерлейкин-6 (ИЛ-6), ИЛ-8, интерферон-α (ИФН-α), фактор некроза опухоли-α (ФНО-α), ИФН-γ, моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) или ИФН-γ-индуцированный белок молекулярной массой 10 кДа (IP-10).

При профилактике или лечении заболеваний крайне эффективным подходом представляется вакцинация. Для обеспечения мощного и долговременного иммунного ответа адъюванты, способные стимулировать антигенпредставляющие клетки (например, дендритные клетки), обычно вводят вместе с антигеном. В этом отношении, агонисты TLR9 доказанно являются мощными иммуностимуляторами.

Доклинические и текущие клинические исследования подтверждают эффективность использования агонистов TLR9 в качестве иммуномодуляторов и/или адъювантов, а также эффективность их борьбы с опухолями путем усиления гуморальных и клеточных ответов.

Даже при отсутствии объяснений основополагающих механизмов, с помощью которых неметилированные CG-мотивы влияют или модулируют иммунный ответ, ученые разработали ряд различных подходов для модуляции иммунной системы с использованием таких мотивов. Патент WO 1998/018810 описывает иммуностимулирующие последовательности, содержащие неметилированные CG-мотивы. Такие мотивы демонстрируют повышенную эффективность при нахождении в одной цепи. Однако введение молекулы с одноцепочечной ДНК с незамкнутой цепью нецелесообразно из-за быстрой деградации одноцепочечных нуклеиновых кислот. Ввиду этого были разработаны различные способы защиты одно- или двухцепочечных ДНК-конструктов, содержащих неметилированный CG-мотив.

Для достижения устойчивости к деградации ДНК-нуклеазами фосфодиэфирные связи в основе полимера нуклеиновой кислоты часто модифицируют до фосфоротиоатов. Кроме более слабой стимулирующей активности таких защищенных фосфоротиоатом нуклеиновых кислот, выявленной в последние годы, их применение в каких-либо фармкомпозициях или медикаментах исключено или в значительной степени ограничено токсичностью защиты фосфоротиоатом.

Из четырех классов известных активаторов с различными профилями иммуномодуляции практически все вещества (кроме двух) содержат линейные молекулы ДНК. Одно из исключений указано в ЕР 1196178. В этом документе описаны молекулы с короткой цепью дезоксирибонуклеиновой кислоты, содержащие частично одноцепочечную, гантелевидную, ковалентно замкнутую последовательность нуклеотидных остатков с CG-мотивами («dSLIM»), полностью состоящих из естественной ДНК. Согласно документу ЕР 1196178, CG-мотивы расположены в одноцепочечных петлях на обоих концах двухцепочечного стебля описанной молекулы или внутри него. Одноцепочечные петли шпилек защищают двухцепочечный стебель от разрушения ДНК-нуклеазами внутри или снаружи клетки. В документе GB 1402847.6 описана в определенной степени аналогичная гантелевидная структура, использующая несколько иную последовательность.

Еще одно исключение из линейных олигонуклеотидов раскрыто в патенте WO 2012/085291. В этом документе описаны ДНК-конструкты, содержащие нуклеотиды в L-образной конформации. Согласно данным, представленным в патенте WO 2012/085291, количество нуклеотидов в L-образной конформации и их расположение в ДНК-конструкте влияет на иммуностимулирующую способность такого ДНК-конструкта. К примеру, ДНК-конструкт, содержащий исключительно нуклеотиды в L-образной конформации, слабо стимулирует иммунную систему.

В документе WO 2010/039137 описано использование иммуномодулирующих олигонуклеотидов в качестве антагонистов для TLR-опосредованных заболеваний. Такие заболевания имеют одну или несколько химических модификаций в последовательности, фланкирующей иммуностимулирующий мотив, и/или в олигонуклеотидном мотиве, иммуностимулирующий эффект которого сопряжен с его модификацией. Таким образом, цель использования олигонуклеотидов, описанных в WO 2010/039137, заключается в подавлении иммунного ответа, вызванного TLR.

В патенте WO 2005/042018 описаны новые, так называемые CpG-олигонуклеотиды, где олигонуклеотид с-класса характеризуется CpG-последовательностями, обычно расположенными на 5'- или 3'-конце молекулы или вблизи него. Также документ касается палиндромного мотива с большим количеством GC, обычно расположенного на другом конце молекулы или вблизи него. В документе раскрыты вариации палиндромной последовательности ДНК с-класса.

В патенте WO 2015/124614 описан ковалентно замкнутый ДНК-конструкт, фармацевтическая композиция и вакцина, а также их использование для модуляции иммунной системы, в которой ДНК-конструкт содержит определенные последовательности ДНК.

Интенсивная стимуляция клеточного иммунного ответа позволяет влиять на регуляторные цепи, и без такого вмешательства невозможно обеспечить достаточную иммунную активность. Подобная активность включает индуцирование ответа на «слабые» антигены, т.е. не активированные с помощью КТС-I, например пептиды контрольной точки из хромосомных транслокаций или мутированных онкогенов, часто встречающиеся при опухолевых заболеваниях (Melief CJ, Kast WM; T-cell immunotherapy of cancer; Res Immunol 1991 Jun-Aug; 142(5-6): 425-9; также: Pasternak G, Hochhaus A, Schultheis B, Hehlmann R; Chronic myelogenous leukemia: molecular and cellular aspects; J Cancer Res Clin Oncol 1998; 124(12): 643-60). Кроме того, вероятно, будет необходимо снизить толерантность к аутентичным антигенам (таким как тирозиназа или тирозингидроксилаза), экспрессируемым в опухолевых клетках злокачественной меланомы и представленным в КТС-I. (Weber LW, Bowne WB, Wolchok JD, Sriniva-san R, Qin J, Moroi Y, Clynes R, Song P, Lewis JJ, Houghton AN; Tumor immunity and autoimmunity induced by immunization with homologous DNA; J Clin Invest 1998 Sep 15;102(6):1258-64; Surman DR, Irvine KR, Shulman EP, Allweis TM, Rosenberg SA, Restifo NJ; Generation of polyclonal rabbit antisera to mouse melanoma associated antigens using gene gun immunization; Immunol Methods; 1998 May 1; 214(l-2): 51-62).

Другим чрезвычайно важным аспектом является адъювантный эффект иммуностимулирующей последовательности при профилактических вакцинациях, а также возможность повторной поляризации реакции на существующую инфекцию с реакции второго типа на реакцию первого типа, что позволяет контролировать патоген (Kovarik J, et al. CpG oligodeoxynucleotides can circumvent the Th2 polarization of neonatal responses to vaccines but may fail to fully redirect Th2 responses established by neonatal priming; J Immunol. 1999 Feb 1; 162(3): 1611-7). По результатам обширного анализа патогенов было выявлено, что тип иммунного ответа оказывает решающее влияние на течение инфекции, а также на выживание пациента. Поскольку аллергические реакции представляют собой реакцию избыточного регулирования второго типа, ожидается, что иммуностимулирующая последовательность окажет терапевтический эффект и на аналогичные заболевания.

Согласно наблюдениям, некоторые последовательности с CpG характеризуются нейтрализацией стимуляции, активизированной иммуностимулирующей последовательностью. Иными словами, последовательности такого рода способны подавлять стимулирующий эффект иммуностимулирующей последовательности при их применении (Krieg AM, Wu Т, Weeratna R, Efler SM, Love-Homan L, Yang L, Yi AK, Short D, Davis HL; Sequence motifs in adenoviral DNA block immune activation by stimulatory CpG motifs; Proc Natl Acad Sci USA 1998 Oct 13; 95(21): 12631-6). При отсутствии полноценного объяснения основного механизма влияния мотивов последовательности, считающихся нейтрализующими CpG-мотивами («CpG-N»), авторы публикации, цитируемой в настоящем документе, полагают, что подобный эффект ограничен блокированием стимуляции, активированной иммуностимулирующей последовательностью. Пока механизм иммунной индукции с помощью иммуностимулирующей последовательности не будет до конца изучен, нельзя исключать, что такие нейтрализующие CpG-мотивы обладают иными терапевтически значимыми иммуномодулирующими свойствами.

Существует по крайней мере одно заболевание человека, при котором наличие антител к двухцепочечной ДНК в сыворотке пациента доказано: это системная красная волчанка. Есть подозрение, что реакция на бактериальную иммуностимулирующую последовательность имеет этиологические причины (Krieg AM, CpG DNA: a pathogenic factor in systemic lupus erythematosus?, J Clin Immunol 1995 Nov; 15(6): 284-92). В этих случаях, а также в ряде других заболеваний, было бы полезно блокировать основные механизмы с помощью нейтрализующих CpG-мотивов.

Независимо от характера объяснения основных механизмов потенциал CpG-последовательностей в части влияния на иммунный ответ высок. Данный вопрос внезапно привлек внимание обширной части научного сообщества. В частности, внимание ученых сосредоточено на изучении возможностей терапевтического и профилактического применения таких последовательностей в случае инфекции, опухоли и нарушений работы иммуной системы.

В литературе об иммуностимулирующих последовательностях (см. в частности, патент WO 09818810A1, стр. 17, ll 29-30) представлена информация, подтверждаемая описываемым изобретением (см. ниже), что иммуностимулирующие последовательности с CpG эффективнее в случае использования одноцепочечных конструктов. Введение коротких одноцепочечных олигодезоксинуклеотидов с иммуностимулирующей последовательностью для иммунной модификации является следующим логическим шагом и предметом многочисленных экспериментальных подходов к лечению инфекционных, аутоиммунных заболеваний и опухолей. Однако незамкнутые одноцепочечные олигодезоксинуклеотиды очень быстро разрушаются под влиянием внеклеточных и внутриклеточных экзонуклеаз. Именно поэтому их сложно использовать in vivo. Вышеупомянутые нуклеазы демонстрируют значительно меньшую ферментативную активность по сравнению с модифицированными фосфоэфирными связями в основной цепи полимеров нуклеиновых кислот. Такое поведение приводит к образованию тиоэфиров фосфора («тиоатов») или восстановленных фосфорных связей (фосфонатов) в хиральной или ахиральной формах, используемых при необходимости введения пациенту одноцепочечных молекул нуклеиновой кислоты. Такие модифицированные соединения могут быть получены с помощью твердофазного синтеза, однако лишь в определенной степени, так как они требуют применения значительно более сложных методик по сравнению с классическим синтезом амидита ДНК. Данные соединения известны благодаря исследованиям антисмысловых технологий. Тем не менее, в клинических исследованиях антисмысловых стратегий было обнаружено, что они сопряжены со значительными побочными эффектами, особенно в отношении системы свертывания крови и системы комплемента (см. Sheehan and Lan, Blood 92, 1617-1625 (1998)). Что касается использования производных тиофосфорной кислоты для защиты нуклеазы иммуностимулирующей последовательности, ученые обнаружили, что последовательности проявляют меньшую стимулирующую активность в случае, если цитозин-гуанозиновые остатки, которые действительно эффективны, сами по себе защищены фланкирующими последовательностями, необходимыми для их активности (см. WO 98/18810).

Использование и производство иммуностимулирующих последовательностей, содержащих CpG, подробно описаны в патенте WO 98/18810, а также в источниках, цитируемых в настоящем документе. Необходимость защиты олигодезоксинуклеотидов от экзонуклеаз подробно описана в патенте WO 98/18810. Что касается проблемы недостаточной стабильности in vivo, уже были предложены решения, которые все же ограничиваются одноцепочечными линейными ОДН. Кроме прочего, среди решений упоминаются тиофосфатные эфиры, ди-тиофосфатные эфиры или фосфонаты. Возможность стабилизации ОДН путем создания вторичных структур (в частности, стебля-петли), указана в патенте WO 98/18810. Получение и использование олигомеров фосфоротиоатов в связи с иммуностимулирующими последовательностями описано в патентах US 5,663,153, US 5,723,335 и US 5,856,462.

Другая стратегия защиты одноцепочечных последовательностей описана в патенте US 5,750,669. В данном документе концы олигомеров и нуклеозидные остатки имеют связи 5'-5' и 3'-3', что препятствует экзонуклеолитической деградации.

Данные о двойном конструкте «стебель-петля» или ковалентно замкнутых гантелеобразных ОДН были получены при использовании экспериментального подхода в исследованиях, сосредоточенных на конкурентной борьбе ДНК-связующих белков за участки связи, а также на факторах транскрипции (Lim et al. 1997, Nuc. Acids Res. 25, 575-581; Blumenfeld et al., Nuc. Acids Res. 1993, 21, 3405-3411).

Т-клеточный ответ иммунной системы человека регулируется несколькими молекулами, контролирующими Т-клетки, во избежание чрезмерной реакции иммунной системы в отношении здоровых клеток (Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012; 12(4): 252-264; Sharma P, Wagner K, Wolchok JD, Allison JP. Nat Rev Cancer. 2011; 11(11): 805-812). В рамках настоящего изобретения такие молекулы, контролирующие Т-клетки, в совокупности называют «Т-клеточными регуляторами». Они содержат ингибиторы контрольных точек и сопутствующие стимуляторы. Опухолевые клетки часто используют такие системы регуляции для предотвращения своего обнаружения иммунной системой. Ингибирование контрольной точки иммунной системы и сопутствующая стимуляция Т-клеточной системы может усилить противоопухолевый иммунный ответ. Методика блокирования иммунных контрольных точек и последующее выделение опухолеспецифичных Т-клеток для осуществления ими эффекторной функции в отношении опухолевых клеток доказала свою эффективность в борьбе с онкологическими заболевания. Клинические испытания продолжаются (Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, et al. N Engl J Med. 2010; 363(8): 711-723; Robert C, Thomas L, Bondarenko I, et al. N Engl J Med. 2011; 364(26): 2517-2526; Wolchok JD, H. Kluger, M.K. Callahan, et al. N Engl J Med, 369 (2013), pp. 122-133).

Цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген-4 (CTLA-4) и программируемая клеточная гибель-1 (PD-1) представляют собой две контрольные точки, которые являются наиболее интенсивно изучаемыми объектами в рамках лечения онкологических заболеваний на сегодняшний день. CTLA-4 является мощным сопутствующим ингибитором, который, согласно исследованиям, ошибочно активизируется на поверхности Т-клеток при определенных видах рака. Он ослабляет активацию Т-клеток как реакцию на опухолевые клетки и, таким образом, способствует толерантности Т-лимфоцитов на ранней стадии. Было обнаружено, что PD-1 активируется при определенных видах опухоли, ингибируя функцию Т-клеток, помогая опухоли остаться незамеченной иммунной системой благодаря сохранению толерантности периферических Т-лимфоцитов (Keir ME, Butte MJ, Freeman GJ, Sharpe AH, et al. Annu Rev Immunol. 2008; 26: 677-704; Mahoney KM, Freeman GJ, McDermott DF. Clinical Therapeutics 37(4): 764-782, 2015).

Первый ингибитор иммунной контрольной точки, одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в 2011 г., был ипилимумаб - моноклональное антитело, блокирующее CTLA-4 и применяемое для лечения метастатической меланомы. Также сообщалось, что блокирование взаимодействия между PD-1 и одним из его лигандов - PD-L1 (также известного как В7-Н1 и CD274) стимулирует противоопухолевый ответ (Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012; 12(4): 252-264).

Другая ингибирующая молекула - ген активации лимфоцитов-3 (LAG-3), гомолог CD4, связывающийся с молекулами КТС-II, экспрессируется на активированных Т-клетках, В-клетках, NK-клетках и инфильтрационных опухолевых лимфоцитах. Также считается, что они негативно регулируют экспансию Т-клеток, ограничивая их активацию (Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012; 12(4): 252-264; Goldberg MV, Drake CG. Curr Top Microbiol Immunol 2011; 344: 269-78). Ее блокирование способствует пролиферации Т-клеток и усиливает противоопухолевые их ответы (Nguyen LT, Nat Rev Immunol, 2015).

Кроме того, Т-клеточный иммуноглобулин и домен муцина, содержащий молекулу-3 (TIM-3), лигандом которого является галектин-9 (активизируется при различных видах рака), экспрессируется Т-клетками-хелперами, выделяющими ИФН (ТН-1), а также дендритными клетками, моноцитами и Т-клетками [Ngiow SF, Teng MW, Smyth MJ. Cancer Res. 2011; 71(21):6567-71]. Он ингибирует ответ Т-клеток-хелперов-1, а антитела TIM-3 усиливают противоопухолевый иммунитет (Anderson AC. Curr Opin Immunol 2012; 24: 213-6). При связи с его лигандом галектином-9 TIM-3 вызывает гибель клеток ТН-1 (Zhu С, Anderson AC, Schubart A, et al. Nat Immunol. 2005; 6(12): 1245-52). Исследования на мышах с дефицитом TIM-3 свидетельствуют о том, что путь TIM-3 ингибирует экспансивные и эффекторные функции клеток ТН-1 и может быть важным элементом для обеспечения толерантности клеток ТН-1 (Sabatos СА, Chakravarti S, Cha Е, et al. Nat Immunol. 2003; 4(11): 1102-10). Известно, что TIM-3 экспрессируется совместно с PD-1 на опухолеспецифичных CD8+ Т-клетках, а двойное блокирование обеих молекул значительно усиливает пролиферацию in vitro и продуцирование цитокинов Т-клеток человека. Сообщалось, что у животных координационная блокада PD-1 и TIM-3 усиливает противоопухолевые иммунные реакции и отторжение опухолей (Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012; 12(4): 252-264).

Исследования показали, что В- и Т-лимфоцитарный аттенюатор (BTLA/CD272), являющийся ингибирующим рецептором на Т-клетках, и медиатор проникновения вируса герпеса HVEM/TNFRSF14, экспрессирующийся на опухолевых клетках, а также на опухолесодержащих эндотелиальных клетках, выступают в качестве лигандов BTLA. Экспрессия BTLA находится на высоком уровне в случае опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (ОИЛ) у пациентов с меланомой, а BTLA-экспрессирующие Т-клетки ингибируются в присутствии лиганда HVEM. BTLA может ингибировать функцию опухолеспецифичных CD8+ Т-клеток человека (Paulos CM, June СН. J Clin Invest 2010; 120: 76-80). Таким образом, BTLA также может быть соответствующим ингибирующим рецептором для Т-клеток в опухолевой микросреде и участвовать в стратегиях ингибирования контрольных точек (Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012; 12(4): 252-264).

OX40 (CD134/TNFRSF4) является членом суперсемейства рецептора фактора некроза опухоли (TNFR) и экспрессируется CD4 и CD8 Т-клетками во время антиген-специфического прайминга. Лигирование ОХ40 на CD8 и CD4 Т-клетках способствует их выживанию и экспансии. Кроме того, активирование ОХ40 повышает выработку реакционноспособных эффекторных Т-клеток и ингибирует Т-клеточную функцию. Доклинические исследования показали, что лечение опухолей агонистами ОХ40 приводило к уменьшению опухоли в нескольких доклинических моделях (Linch SN, McNamara MJ, Redmond WL. Front Oncol. 2015 5:34).

Ко-стимулирующий рецептор CD137 (4-1BB/TNFSF9 обладает непревзойденной способностью как для активации, так и для провоспалительной поляризации противоопухолевых лимфоцитов. Ко-стимулирующий рецептор CD 137/4-1 ВВ активирует множественные сигнальные каскады внутри Т-клеток, в значительной степени усиливая их активацию. Стимуляция CD137 на примированных антигеном Т-лимфоцитах повышает иммунитет к опухолям, а монотерапия CD137 способна опосредовать значительный регресс опухолей и даже вылечить разнообразные выявленные опухоли у мышей (Bartkowiak Т, Curran MA. Front Oncol. 2015 5:117).

Исходя из известного уровня техники, целью настоящего изобретения является описание эффективной комбинации, включающей иммуностимулирующие ДНК-конструкты, и их использование в качестве лекарственного средства.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Исходя из известного уровня техники, целью настоящего изобретения является описание комбинации молекулы, связанной с Т-клеточным регулятором и иммуномодулирующим ДНК-конструктом в форме некодирующей последовательности дезоксирибонуклеотидов.

Настоящее изобретение представляет собой описание комбинации, включающей компоненты химических или молекулярных связей, по меньшей мере, с одной из молекул группы PD-1, PD-L1, ОХ40, TIM-3, LAG3, CD137 (4-1ВВ) для изменения их функции в качестве ингибиторов контрольной точки или ко-стимуляторов. Кроме того, документ содержит описание некодирующей последовательности дезоксирибонуклеиновых кислот, включающей по меньшей мере один фрагмент последовательности N¹N²CGN³N⁴, где N является нуклеотидом, содержащим А, С, Т или G (где С - дезоксицитидин; G - дезоксигуанозин; А - дезоксиаденозин; а Т - дезокситимидин).

Молекулы, связанные с Т-клеточным регулятором, могут быть либо белками, либо пептидами (например, антителом, производимом синтетическим или биологическим методом).

Комбинация, представленная в настоящем изобретении, может содержать N¹N² (элемент групп GT, GG, GA, AT и АА) и N³N⁴ (элемент групп СТ, TG и ТТ).

Некодирующая последовательность дезоксирибонуклеиновых кислот может быть представлена в следующих видах: линейная последовательность с незамкнутой с двух сторон цепью; линейная последовательность с незамкнутой двойной цепью с одной стороны и одноцепочечной шпилькой с другой; гантелеобразный конструкт, частично одноцепочечный, с ковалентно замкнутой цепью дезоксирибонуклеиновых кислот.

Комбинация должна включать по меньшей мере три мотива последовательности N¹N²CGN³N⁴.

Она предназначена для линейной некодирующей последовательности дезоксирибонуклеиновых кислот, которая может включать по крайней мере один нуклеотид в L-образной конформации, где один из пяти концевых нуклеотидов, расположенных на 5'- и/или 3'-конце одиночной цепи ДНК с линейной некодирующей последовательностью дезоксирибонуклеиновых кислот с неразветвленной цепью, может находится в L-образной конформации.

Также, комбинация, представленная в настоящем документе, может дополнительно содержать по меньшей мере одну из следующих некодирующих последовательностей дезоксирибонуклеотидов:

а. GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC (SEQ ID NO: 1); или

б. ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA (SEQ ID NO: 2), или

в. AACGTTCTTCGGGG CGTT (SEQ ID NO: 3), или

г. AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT (SEQ ID NO: 4).

Также, комбинация может содержать некодирующую последовательность дезоксирибонуклеиновых кислот длиной от 40 до 200 нуклеотидов или от 48 до 116 нуклеотидов.

Планируется, что вышеуказанная последовательность AACGTTCTTCGGGG CGTT (SEQ ID NO: 3) может быть частью последовательности CCTAGGGGTT АССАССТТСА TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT АССАССТТСА TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC (SEQ ID NO: 5).

Мотив последовательности N¹N²CGN³N⁴ может быть частью одноцепочечного участка некодирующей последовательности дезоксирибонуклеотидов, являющейся частью комбинации, описываемой в настоящем документе.

Комбинация может включать компоненты обеих групп в твердой, жидкой или газообразной форме. Вводимая доза составляет 15 мг/кг веса максимально. Это означает, что дозировку следует определять пропорционально массе организма пациента, получающего комбинацию.

Способ, включающий в себя этап введения компонентов комбинации, являющейся предметом настоящего изобретения, одновременно, с чередованием или последовательно, является еще одной задачей изобретения. Некодирующую последовательность дезоксирибонуклеиновых кислот можно вводить перед химическим веществом или молекулой для воздействия на Т-клеточный регулятор или наоборот.

Еще одной целью настоящего изобретения является описание использования указанной комбинации в качестве лекарственного средства или для лечения таких заболеваний, как рак, аутоиммунные заболевания и воспаление.

Соединения описываемой комбинации вводят одновременно, с чередованием или последовательно для лечения рака, аутоиммунных заболеваний и воспаления.

Использование описываемой комбинации для изготовления фармкомпозиции или фармацевтического препарата (в том числе вакцины), включающих допустимые фармацевтические соли, является сопутствующей целью настоящего изобретения. Фармкомпозиция может высвобождать соединения описываемой комбинации одновременно, с чередованием или последовательно.

Наконец, цель настоящего изобретения заключается в использовании комбинации, являющейся предметом настоящего документа, в качестве адъюванта при терапевтической или профилактической вакцинации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Описание изобретения основано на фигурах. Очевидно, что варианты осуществления и аспекты изобретения, показанные на фигурах, являются исключительно примерами и не ограничивают область охранительного действия формулы изобретения каким-либо образом. Изобретение определяется формулой изобретения и ее эквивалентами. Специалист в данной области должен понимать, что признаки одного аспекта или варианта осуществления изобретения можно комбинировать с признаком другого аспекта (или аспектов) других вариантов осуществления изобретения. На фигурах представлена следующая информация:

Фиг. 1А, В Противоопухолевая активность комбинации (SEQ ID NO: 5) с анти-PD-1.

Фиг. 2 Стимуляция in vitro МКПК человека пептидами HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов.

Фиг. 3А, В Противоопухолевая активность комбинации (SEQ ID NO: 5) с анти-PD-L1.

Фиг. 4А, В Противоопухолевая активность комбинации (SEQ ID NO: 6) с анти-PD-1.

Фиг. 5 Стимуляция in vitro МКПК человека пептидами HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов (SEQ ID NO: 6) с анти-PD.

Фиг. 6А, В Противоопухолевая активность комбинации (SEQ ID NO: 7) с анти- CTLA-4.

Фиг. 7А, В Противоопухолевая активность комбинации (SEQ ID NO: 7) с анти-PD-L1.

Фиг. 8А-С Стимуляция in vitro МКПК человека пептидами HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов (SEQ ID NO: 9) с анти-PD.

Фиг. 9А, В Противоопухолевая активность комбинации (SEQ ID NO: 10) с анти-PD-1.

Фиг. 10А, В Противоопухолевая активность комбинации (SEQ ID NO: 10) с анти- CTLA-4.

Фиг. 11 Стимуляция in vitro МКПК человека пептидами HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов (SEQ ID NO: 10) с анти-PD.

Фиг. 12 Стимуляция in vitro МКПК человека пептидами HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов (SEQ ID NO: 11) с анти-PD-1.

Фиг. 13 Стимуляция in vitro МКПК человека пептидами HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов, EnanDIM362 и анти-PD-1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет собой комбинацию молекулы, связанную с так называемым регулятором Т-клеток и некодирующей последовательностью дезоксирибонуклеиновых кислот.

В рамках настоящего изобретения линейная незамкнутая последовательность ДНК называется «олигонуклеотид» (ОДН). Указанная последовательность ДНК может быть одноцепочечной или частично или полностью двухцепочечной. Термины «олиго», «олигонуклеотид» и «олигодезоксинуклеотид» являются синонимами. Они никоим образом не означают ограничение длины соответствующей последовательности ДНК. Единственными компонентами олигонуклеотидов являются нуклеотиды.

Олиго-формулы можно производить с помощью синтетического и частично или полностью биологического методов. Биологическое происхождение включает генетически обоснованные методики получения последовательностей ДНК.

L-образные цепи ДНК или нуклеотиды в L-образной конформации означают нуклеотиды, которые включают L-дезоксирибозу в качестве остатка сахара вместо естественной D-дезоксирибозы. L-дезоксирибоза представляет собой энантиомер (зеркальное изображение) D-дезоксирибозы. Олигонуклеотиды, частично или полностью состоящие из нуклеотидов в L-образной конформации, могут быть частично или полностью одно- или двухцепочечными; однако нуклеотиды в L-образной конформации не могут гибридизоваться с нуклеотидами для получения D-образной конформации (Hauser et al., Nucleic Acid Res. 2006 34: 5101-11). Растворимость и селективность L-образной ДНК не отличается от D-образной ДНК. Тем не менее, L-образная цепь ДНК устойчива к ферментативной экзоактивности природных ферментов, особенно экзонуклеаз, и, следовательно, такая ДНК защищена от внутриклеточной деградации (Urata et al., Nucleic Acids Res. 1992 20: 3325-32). Именно поэтому L-образную цепь ДНК столь широко применяют.

В рамках настоящего изобретения «стебель» означает двойную цепь ДНК, образованную спариванием оснований в пределах либо одного олигонуклеотида (который впоследствии является частично самокомплементарным), либо различных олигонуклеотидов (которые являются частично или полностью комплементарными). Внутримолекулярное спаривание оснований означает спаривание оснований внутри одного и того же олигонуклеотида, а спаривание оснований между различными олигонуклеотидами называется межмолекулярным спариванием оснований.

В рамках настоящего изобретения «петля» означает непарный одноцепочечный участок как в пределах, так и на конце структуры стебля. «Шпилька» представляет собой особую комбинацию стебля и петли, возникающую, когда две самокомплементарные области одного олигонуклеотида гибридизуются, образуя стебель с неспаренной петлей на одном конце.

«Твердая фаза», с которой нуклеотиды ковалентно или нековалентно связаны, включает, без ограничений, колонку, матрицу, гранулы, стекло, включая модифицированные или функционализированные стекла, кремний или материалы на основе кремния, включая силикон и модифицированный силикон, пластмассы (содержащие полипропилен, полиэтилен, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, акрилы, полибутилен, полиуретаны и т.д.), нейлон или нитроцеллюлозу, смолы, полисахариды, углерод, а также неорганические стекла и пластмассы. Таким образом, микротитрационные планшеты также относятся к твердой фазе в соответствии с настоящим документом.

«Иммуномодуляция» в рамках настоящего изобретения означает иммуностимуляцию и иммуносупрессию. Иммуностимуляция, главным образом, означает стимулирование эффекторных клеток иммунной системы для их пролиферации, миграции, дифференциации или активации иным образом. Например, В-клеточную пролиферацию можно индуцировать без сопутствующих стимулирующих сигналов иммуностимулирующими олигонуклеотидами, которые обычно требуют сопутствующего стимулирующего сигнала от вспомогательных тимоцитов.

Под иммуносупрессией, с другой стороны, следует понимать снижение активации или эффективности иммунной системы. В целом, иммуносуппрессию вызывают намеренно, к примеру, для предотвращения отторжения трансплантированного органа, лечения заболевания «трансплантат против хозяина» после трансплантации костного мозга или лечения аутоиммунного заболевания, например, ревматоидного артрита или болезни Крона.

В этом контексте термин «иммуномодуляция» также может относиться к влиянию природы или характера иммунной реакции, либо путем оказания воздействия, либо путем модификации иммунной реакции, находящейся на стадии развития или созревания, либо путем модуляции характера установившейся иммунной реакции. Таким образом, в контексте ингибиторов контрольных точек «воздействие» означает подавление их ингибирующего эффекта, а в контексте стимулирующих молекул - их активацию.

Термин «рак» означает раковые заболевания или опухоль, в отношении которых проводят лечение или профилактику. К данному термину относится следующая группа заболеваний: карцинома молочной железы, меланома, новообразования кожи, опухоли желудочно-кишечного тракта (включая карциному толстой кишки, карциному желудка, карциному поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак тонкой кишки), карцинома яичника, карцинома шейки матки, рак легких, рак предстательной железы, карцинома почек и/или метастазы в печени.

Аутоиммунные заболевания в рамках настоящего изобретения означают ревматоидный артрит, болезнь Крона, системную красную волчанку (СКВ), аутоиммунный тиреоидит, тиреоидит Хашимото, рассеянный склероз, болезнь Грейвса, миастению, целиакию и болезнь Аддисона.

В рамках настоящего изобретения и в соответствии с общепринятым определением «агонист» означает химическое вещество или молекулу, связанную с другой молекулой (например, рецептором или лигандом) и, таким образом, активирующую такую молекулу. В отличие от активирующего агониста, под «антагонистом» понимают химическое вещество или молекулу, блокирующие взаимодействие молекулы, с которой связан антагонист, с соответствующим агонистом. В зависимости от контекста, в рамках настоящего изобретения антагонист может также привести к активации процесса, так как антагонист блокирует взаимодействие другого антагониста, например, с рецептором.

В рамках настоящего изобретения термин «фармацевтически применимые или приемлемые соли» означают соли, входящие в состав комбинации и подготовленные при помощи соответствующих нетоксичных (т.е. фармацевтически приемлемыми) кислот или оснований, в зависимости от индивидуальных заместителей в соединении, являющемся предметом настоящего изобретения. Например, если соединение, являющееся предметом настоящего документа, имеет кислотные свойства, соли присоединения основания можно получить путем сочетания нейтральных форм таких соединений с достаточным количеством желаемого основания, либо в неразбавленном виде, либо в соответствующем инертном растворе. Среди примеров фармацевтически приемлемых солей присоединения основания можно назвать соли натрия, калия, кальция, аммония, органических аминокислот или соли магния и аналогичные соли. Если соединение, являющееся предметом настоящего документа, имеет свойства основания, соли присоединения кислоты можно получить путем сочетания нейтральных форм таких соединений с достаточным количеством желаемой кислоты, либо в неразбавленном виде, либо в соответствующем инертном растворе. Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты включают, без ограничений, следующие соли, полученные из неорганических кислот: соляная, бромистоводородная, азотная, карбоновая, фосфорная, частично нейтрализованная фосфорная кислота, серная, частично нейтрализованная серная, иодистоводородная или фосфористая кислоты и аналогичные им; а также соли, полученные из относительно нетоксичных органических кислот: уксусная, пропионовая, изомасляная, малеиновая, малоновая, бензойная, янтарная, субериновая, фумаровая, миндальная, фталевая, бензолсульфоновая, п-толилсульфоновая, лимонная, винная, метансульфоновая и аналогичные им. Также включены соли аминокислот (такие как аргинат и аналогичные им) и соли органических кислот (таких как глюкуроновая или галактуроновая кислоты и аналогичные). Некоторые отдельные соединения, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут содержать как основные, так и кислотные функциональные группы, которые позволяют превращать соединения в соли основания или кислоты. Взаимодействие соли с основанием может восстановить нейтральные формы соединений, являющихся предметом настоящего изобретения, или кислоты, и выделение исходного соединения обычным способом. Родительская форма соединения отличается от различных солевых форм некоторыми физическими свойствами, такими как растворимость в полярных растворителях, но в остальном соли эквивалентны исходной форме соединения в рамках настоящего изобретения. Соединения, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут содержать хиральные или асимметричные атомы углерода (оптические центры) и/или двойные связи. Настоящее изобретение охватывает рацематы, диастереомеры, геометрические изомеры и отдельные оптические изомеры. Соединения, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут существовать в неразбавленных и в разбавленных формах, включая гидратированные формы. Как правило, разбавленные формы эквивалентны неразбавленным формам и также относятся к настоящему изобретению. Соединения, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут, кроме того, существовать в нескольких кристаллических или аморфных формах.

Молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты, состоящие из частично одноцепочечной гантелеобразной ковалентно замкнутой цепи дезоксирибонуклеозидных остатков, содержащие одну или несколько последовательностей основания N¹N²CGN³N⁴, где N¹N² представляет собой элемент группы GT, GG, GA, AT или АА, a N³N⁴ является элементом группы СТ или ТТ, а также детоксицитозин С, дезоксигуанозин G, деоксиаденозин А и дезокситимидин Т, используют в комбинации с химическими веществами или молекулами, обладающими способностью образовывать связи с Т-клеточным регулятором иммунной системы для иммуностимуляции у человека или высших животных.

Молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты, являющиеся предметом настоящего документа, могут иметь длину до 200 нуклеотидов. В частности, речь идет о последовательности длиной от 48 до 116 нуклеотидов.

Гантелеобразные некодирующие последовательности молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты могут содержать последовательность оснований N¹N²CGN³N⁴ на одноцепочечных участках.

Иммуностимуляцию выполняют in vitro или in vivo.

Настоящее изобретение также описывает линейную незамкнутую последовательность ДНК, содержащую по меньшей мере один CpG-мотив и по меньшей мере один нуклеотид в L-образной конформации. Из-за частичной/полной L-образной конформации последовательность ДНК лишена 5'- или 3'-концов, доступных для экзонуклеаз. В случае, если конструкция имеет на одном конце двойной цепи одноцепочечную петлю, конец также защищен от деградации. Таким образом, ОДН полностью защищены от деградации клеток, при отсутствии необходимости использовать фосфоротиоатную основу, которая, как было показано, является токсичной. Кроме того, ОДН состоят только из минимального количества нуклеотидов, что делает их небольшими по размеру и, следовательно, легко трансфицируются в клетки.

Некодирующая последовательность дезоксирибонуклеиновых кислот, включающая по меньшей мере один фрагмент последовательности N¹N²CGN³N⁴, может быть одноцепочечной или частично или полностью двухцепочечной. Она включает спаривание оснований в пределах либо одной молекулы (внутримолекулярное спаривание), либо нескольких молекул (межмолекулярное спаривание) или любую их комбинацию. Также возможно, что конструкция содержит по меньшей мере одну непарную одноцепочечную область. Дополнительным вариантом осуществления являются структуры-«шпильки». Из-за частичной или полной L-образной конформации обеспечивается более длительный период полувыведения конструкции, поскольку нуклеотиды в L-образной конформации не подвержены разрушению.

Также в рамках настоящего изобретения авторы сообщают, что по меньшей мере две молекулы, являющиеся одноцепочечными или частично или полностью двухцепочечными, могут лигироваться друг с другом, образуя многомерные конструкции. Таким образом, такие многомерные конструкции включают по меньшей мере столько CpG-мотивов, сколько партнеров по лигированию они имеют. Все мотивы плотно упакованы в одну молекулу и, как ожидается, также будут вызывать значительный иммунный ответ как часть комбинации с Т-клеточными регуляторами. Полученные одноцепочечные или частично или полностью двухцепочечные многомерные конструкции могут быть либо ковалентно замкнуты (включая нуклеотиды в L-образной конформации внутри молекулы), либо незамкнуты и содержать нуклеотиды в L-образной конформации на 5'- и/или 3'-конце для защиты от клеточной деградации.

Кроме того, в настоящем изобретении раскрыты химические модификации по меньшей мере одного нуклеотида в некодирующей последовательности дезоксирибонуклеиновых кислот как минимум с одним мотивом последовательности N¹N²CGN³N⁴ с функциональной группой, отобранной из следующей группы веществ: карбоксил, амин, амид, альдимин, кеталь, ацеталь, сложный эфир, эфир, дисульфид, тиол, альдегид. Они позволяют связать ДНК-конструкт с соединением, выбранным из следующей группы: пептиды, белки, углеводы, антитела, синтетические молекулы, полимеры, бомбардирующие микрочастицы, металлические частицы или твердая фаза. Такую связь обеспечивают, например, путем адсорбции, ковалентной или ионной связи.

Модификацию выбирают на индивидуальной основе для выполнения соответствующей цели. Таким образом, конструкт можно использовать, например, для доставки других молекул в конкретную клетку, реагирующую на внедрение CpG-мотива(-ов). Кроме того, благодаря таким модификациям можно соединить конструкт с бомбардирующими микрочастицами, потенциально используемыми для доставки конструкта в клетку. Конструкт также может быть соединен с твердой фазой, например, микротитровальным планшетом.

Описанные ниже опыты были проведены для изучения сочетания некодирующих последовательностей дезоксирибонуклеиновых кислот с Т-клеточными регуляторами. Эксперименты проводили на гантелевидном конструкте, содержащем мотив последовательности N¹N²CGN³N⁴ - незамкнутой линейной кодирующей последовательности дезоксирибонуклеиновых кислот, содержащей последовательность N¹N²CGN³N⁴, где такие конструкты содержат нуклеотиды в L-образной конформации для предотвращения их деградации. Кроме того, было исследовано влияние сочетания Т-клеточных регуляторов с некодирующей последовательностью дезоксирибонуклеиновых кислот, содержащей N¹N²CGN³N⁴ и дважды последовательность SEQ ID NO: 4.

Т-клеточные регуляторы антител, связывающиеся с PD-1, PD-L1, ОХ40, LAG-3, TIM3 и CD137 (4-1ВВ), использовали на модели мыши с введенными клетками опухоли человека. Влияние на терапию после фазы роста более подробно описано ниже, в части о росте опухолей по сравнению с контрольными группами.

В рамках эксперимента проводили сравнение режима дозирования с введением компонентов комбинации, являющейся предметом настоящего документа, одновременно, с чередованием или последовательно. В дополнение к качественному применению соединений был исследован вопрос: необходимо ли уменьшать количество Т-клеточного регулятора для достижения аналогичных или даже лучших результатов применения ингибитора контрольной точки без использования некодирующей последовательности ДНК, содержащей мотив последовательности N¹N²CGN³N⁴.

Анализ in vitro комбинаторного потенциала агонистов TLR9 с молекулами, связывающимися с Т-клеточными регуляторами, включает использование системы культивирования клеток in vitro МКПК человека для оценки реакции Т-клеток после стимуляции. Стимуляции МКПК достигают с помощью смеси иммуногенных пептидов из CMV, VEB, гриппа и токсина столбняка в присутствии антител против иммунологических Т-клеточных регуляторов (например, PD-1, PD-L1 и т.д.) и агонистов TLR9 (т.е. последовательностей с идентификационными номерами 5, 7, 10 и 6).

Также были проведены исследования по количественной оценке цитокинов (ИЛ-2 и ИФН-γ) в супернатантах клеточной культуры. Хотя такая система культивирования клеток in vitro не может отражать сложные взаимодействия иммунных клеток in vivo, она подтверждает преимущество такой комбинации агонистов TLR9.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

К удивлению, комбинация (SEQ ID NO: 5) с анти-PD-1 продемонстрировала в значительной степени повышенный противоопухолевый эффект по сравнению с монотерапией анти-PD-1 или последовательностью SEQ ID NO: 5 на модели мыши с опухолью А20.

Неожиданно, но рост опухоли был почти полностью ингибирован комбинацией последовательности SEQ ID NO: 5 и PD-1 (Фиг. 1А, В). 9-12 мышам в каждой группе инокулировали подкожно опухолевые клетки мыши А20 и выполняли инъекцию последовательности SEQ ID NO: 5 (250 мкг/разовое применение, внутриопухолевая инъекция, на 14, 16, 19, 21, 23, 26, 28, 30, 33 и 35 день), анти-PD-1 (100 мкг/разовое применение, внутрибрюшинно, на 8, 11, 16 и 19 день) или двух веществ сразу. Инъекция среды (внутриопухолевая инъекция) служила в качестве контроля. На Фиг. 1А показан средний рост трансплантированной опухоли, среднее ингибирование роста опухоли с 18 по 32 день (на 29 день: 46,0% для последовательности SEQ ID NO: 5; 54,2% для анти-PD-1; 99,9% для комбинации). На Фиг. 1В показан график выживания Каплана-Мейера.

Синергический комбинаторный эффект последовательности SEQ ID NO: 5 с анти-PD-1, показанный на Фиг. 1А, В, был подтвержден in vitro. В исследовании мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) инкубировали с антигенными пептидами и комбинацией последовательности SEQ ID NO: 5 и анти-PD-1. Пептиды извлекали из HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов (CMV, VEB, гриппа; в совокупности именуемые «CEF»), и комбинация с последовательностью SEQ ID NO: 5 явно увеличивала секрецию ИФН-γ МКПК по сравнению с инъекцией последовательности SEQ ID NO: 5 или только анти-PD-1 (Фиг. 2). Конечная концентрация пептидов составляла 1 мкг/мл на каждый пептид, последовательность SEQ ID NO: 5 использовали в концентрации 3 мкМ и анти-МКГ-1 в концентрации 10 мкг/мл (n=4). Секрецию ИФН-γ анализировали как маркер иммунного ответа. Она нормализовалась до уровня ИФН-γ после стимуляции МКПК исключительно CEF-пептидами. Мышиный IgG (10 мкг/мл) использовали в качестве контроля для анти-PD-1.

Кроме того, неожиданно, в модели опухолевых клеток СТ26 благоприятные эффекты комбинированной терапии анти-PD-L1 и последовательностью SEQ ID NO: 5 также явно превосходили монотерапию последовательностью SEQ ID NO: 5 или анти-PD-L1. Темпы роста опухоли снизились (Фиг. 3А), а выживаемость повысилась (Фиг. 3В). 10 мышам в каждой группе инокулировали подкожно опухолевые клетки мыши СТ26 и выполняли инъекцию последовательности SEQ ID NO: 5 (250 мкг/разовое применение, подкожно, на 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19, 21, 24 и 26 день), анти-PD-L1 (10 мкг/разовое применение, внутрибрюшинно, на 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 день) или двух веществ сразу. Инъекция среды (подкожно) служила в качестве контроля. На Фиг. 3А показан средний рост трансплантированной опухоли, среднее ингибирование роста опухоли с 17 по 27 день (на 20 день: 23,0% для лефитолимода, без ингибирования анти-PD-L1, 39,9% для комбинации). На Фиг. 1 В показан график выживания Каплана-Мейера.

Также, были проведены исследования комбинаторного эффекта применения последовательности SEQ ID NO: 6 с последовательностью петли TCATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTCTT.

Последовательность SEQ ID NO: 6 вводили вместе с анти-PD-1 в опухолевой модели мыши СТ26. Удивительно, но такая комбинация в значительной степени усилила противоопухолевый эффект по сравнению с монотерапией последовательностью SEQ ID NO: 6 или анти-PD-1 (Фиг. 4А, В). Опять же, 10 мышам в каждой группе инокулировали подкожно опухолевые клетки мыши СТ26 и выполняли инъекцию последовательности SEQ ID NO: 6 (250 мкг/разовое применение, внутриопухолевая инъекция, на 15, 17, 19, 22, 24, 26, 29, 31 день), анти-PD-1 (100 мкг/разовое применение, внутрибрюшинно, на 3, 6, 10 и 13 день) или двух веществ сразу. Инъекция среды (внутриопухолевая инъекция) служила в качестве контроля. На Фиг. 4А показан средний рост трансплантированной опухоли, среднее ингибирование роста опухоли с 15 по 29 день (на 23 день: 48,2% для последовательности SEQ ID NO: 6; без ингибирования анти-PD-1; 75,4% для комбинации). На Фиг. 1В показан график выживания Каплана-Мейера.

Результаты, показанные на Фиг. 4, соответствуют данным стимуляции in vitro МКПК человека антигенными пептидами, что также неожиданно продемонстрировало преимущество комбинации при однократном использовании соединений (Фиг. 5). Пептиды извлекали из HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов (CMV, VEB, гриппа; в совокупности именуемые «CEF») с конечной концентрацией пептидов 1 мкг/мл на каждый пептид, последовательности SEQ ID NO: 6 (3 мкМ) и анти-МКГ-1 (10 мкг/мл) (n=4). Секрецию ИФН-γ использовали как маркер иммунного ответа. Она нормализуется до уровня ИФН-γ после стимуляции МКПК исключительно CEF-пептидами. Мышиный IgG (10 мкг/мл) использовали в качестве контроля для анти-PD-1.

В дальнейших исследованиях использовали олигонуклеотиды с нуклеотидами в L-конформации. Такие олигогруппы содержат L-нуклеотиды в указанных положениях. Молекулы ДНК использовали с последовательностью ядра [yTCATTxCGTGACGTGACGTTCzv] (у=2-8G, защищенная с помощью 1-3 L-дезоксирибозы или без нее, х=3-4A, z=2-6Т, защищенные с помощью 1-3 L-дезоксирибозы, v=A, G, С, Т).

Такие молекулы, содержащие L-нуклеотид, демонстрировали улучшенные иммуномодулирующие и противоопухолевые свойства в сочетании с ингибиторами контрольных точек. Например, комбинация последовательности SEQ ID NO: 7 (GGGGTCATT AAAACGTGACGTGACGTTCTTTTT, подчеркнуты основания, содержащие L-дезоксирибозу) с анти-CTLA-4 в опухолевой модели СТ26 мыши приводила к неожиданно эффективному снижению темпов роста опухоли по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 7 или анти- CTLA-4 (Фиг. 6). 10 мышам в каждой группе инокулировали подкожно опухолевые клетки мыши СТ26 и выполняли инъекцию последовательности SEQ ID NO: 7 (200 мкг/разовое применение, подкожно, на 3, 7, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 22, 14 и 26 день), анти-CTLA-L1 (100 мкг/разовое применение, на 8 день; 50 мкг/разовое применение на 11 и 14 день, внутрибрюшинно) или двух веществ сразу. Инъекция среды (подкожно) служила в качестве контроля. На Фиг. 6А показан средний рост трансплантированной опухоли, среднее ингибирование роста опухоли с 15 по 30 день (на 22 день: 19,8% для последовательности SEQ ID NO: 7; 59,1% для анти-PD-1; 65,3% для комбинации). На Фиг. 6 В показан график выживания Каплана-Мейера.

Комбинация последовательности SEQ ID NO: 7 с анти-PD-L1 также продемонстрировала сравнительно лучший противоопухолевый эффект по сравнению с эффектом применения только последовательности SEQ ID NO: 7 или анти-PD-L1 в опухолевой модели СТ26 мыши (Фиг. 7). 10 мышам в каждой группе инокулировали подкожно опухолевые клетки мыши СТ26 и выполняли инъекцию последовательности SEQ ID NO: 7 (подкожно, на 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19, 21, 24 и 26 день), анти-PD-L1 (10 мкг/разовое применение, внутрибрюшинно, на 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 день) или двух методик сразу. Инъекция среды (подкожно) служит в качестве контроля. На Фиг. 7А показан средний рост трансплантированной опухоли, среднее ингибирование роста опухоли с 13 по 27 день (на 20 день: 16,3% для последовательности SEQ ID NO: 7, без ингибирования анти-PD-L1; 33,3% для комбинации). На Фиг. 7В показан график выживания Каплана-Мейера.

В исследованиях in vitro были выявлены преимущества комбинации анти-PD-1 с последовательностью SEQ ID NO: 7, последовательностью SEQ ID NO: 8 (GGGGGGGGGTCATTAAAACGTGACGTGACGTTCTTTTT, основания, содержащие L-дезоксирибозу, подчеркнуты) и последовательностью SEQ ID NO: 9 (GGGGTCATTAAACGTGACGTGA CGTTCTTTTT, основания, содержащие L-дезоксирибозу, подчеркнуты) в отношении секреции ИФН-γ из МКПК, стимулированного антигенными пептидами (Фиг. 8). Пептиды извлекали из HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов (CMV, VEB, гриппа; в совокупности именуемые «CEF»; конечная концентрация 1 мкг/мл на пептид), последовательности SEQ ID NO: 7 (А, n=12), последовательности SEQ ID NO: 8 (В, n=2), последовательности SEQ ID NO: 9 (С, n=4). Каждая молекула ДНК имела конечную концентрацию 3 мкМ; и анти-PD-1 (10 мкг/мл). Секрецию ИФН-γ анализировали как маркер иммунного ответа. Она нормализуется до уровня ИФН-γ после стимуляции исключительно CEF-пептидами. Мышиный IgG (10 мкг/мл) использовали в качестве контроля анти-PD-1.

В другой серии экспериментов молекулы ДНК использовали с последовательностью ядра [yTCATTxCGTTCTTCGGGGCGTTCzv] (у=2-8G, защищенная с помощью 1-3 L-дезоксирибозы или без нее, х=3-4A, z=2-6Т, защищенные с помощью 1-3 L-дезоксирибозы, v=A, G, С, Т).

Касательно данной группы, исследования также доказали комбинаторный эффект иммуномодуляции и противоопухолевого эффекта. Например, в этой группе для изучения комбинации анти-PD-1 использовали последовательность SEQ ID NO: 10 (GGGGTCATTAAACGTTCTTCGGGG CGTTCTTTTT, основания, содержащие L-дезоксирибозу, подчеркнуты).

Комбинация привела к значительному снижению темпов роста опухоли в опухолевой модели СТ26 мыши (Фиг. 9). 10 мышам в каждой группе инокулировали подкожно опухолевые клетки мыши СТ26 и выполняли инъекцию последовательности SEQ ID NO: 10 (200 мкг/разовое применение, подкожно, на 3, 5, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 22, 14 и 26 день), анти-PD-1 (200 мкг/разовое применение, внутрибрюшинно, на 3, 6, 10 и 14 день) или двух веществ сразу. Инъекция среды (подкожно) служила в качестве контроля. На Фиг. 9А показан средний рост трансплантированной опухоли, среднее ингибирование роста опухоли с 14 по 32 день (на 25 день: 17,8% для последовательности SEQ ID NO: 10; 51,9% для анти-PD-1; 74,6% для комбинации). На Фиг. 9В показан график выживания Каплана-Мейера.

Кроме того, комбинация последовательности SEQ ID NO: 10 с анти-CTLA-4 приводит к уменьшению темпов роста опухоли в опухолевой модели СТ26 мыши по сравнению с лечением с помощью отдельных агентов, последовательностью SEQ ID NO: 10 или анти-CTLA-4 (Фиг. 10). 10 мышам в каждой группе инокулировали подкожно опухолевые клетки мыши СТ26 и выполняли инъекцию последовательности SEQ ID NO: 10 (200 мкг/разовое применение, подкожно, на 3, 10, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 22, 14 и 26 день), анти-CTLA-4 (100 мкг/разовое применение, на 8 день; 50 мкг/разовое применение на 11 и 14 день, внутрибрюшинно) или двух веществ сразу. Инъекция среды (подкожно) служила в качестве контроля. На Фиг. 10А показан средний рост трансплантированной опухоли, среднее ингибирование роста опухоли с 15 по 30 день (на 22 день: 49,7% для последовательности SEQ ID NO: 10; 59,1% для анти-PD-1; 70,3% для комбинации). На Фиг. 10В показан график выживания Каплана-Мейера.

Кроме того, комбинацию последовательности SEQ ID NO: 10 и анти-PD-1 оценивали в исследованиях стимуляции МКПК in vitro и продемонстрировали улучшенное воздействие на секрецию ИФН-γ по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 10 или только анти-PD-1 (Фиг. 11). Пептиды извлекали из HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов (CMB, VEB, гриппа, в совокупности именуемые «CEF», с конечной концентрацией пептидов 1 мкг/мл на каждый пептид), последовательности SEQ ID NO: 10 (3 мкМ) и анти-МКГ-1 (10 мкг/мл) (n=5). Секрецию ИФН-γ анализировали как маркер иммунного ответа. Она нормализуется до уровня ИФН-γ после стимуляции исключительно CEF-пептидами. Мышиный IgG (10 мкг/мл) использовали в качестве контроля для анти-PD-1.

В дальнейших экспериментах, молекулы ДНК использовали с последовательностью ядра [yTCATTxTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGzv] (у=2-8G, защищенная с помощью 1-3 L-дезоксирибозы или без нее, х=3-4A, z=2-6Т, защищенные с помощью 1-3 L-дезоксирибозы, v=A, G, С, Т).

Например, в этой группе использовали последовательность SEQ ID NO: 11 (GGGGTCATTAAATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTT, основания, содержащие L-дезоксирибозу, подчеркнуты). При комбинировании последовательности SEQ ID NO: 11 с анти-PD-1 in vitro при исследованиях МКПК, неожиданно было выявлено повышение секреции ИФН-γ по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 11 или исключительно анти-PD-1 (Фиг. 12), Пептиды извлекали из HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов (CMV, VEB, гриппа, в совокупности именуемые «CEF», с конечной концентрацией пептидов 1 мкг/мл на каждый пептид), последовательности SEQ ID NO: 10 (3 мкМ) и анти-МКГ-1 в концентрации 11 мкг/мл (n=4). Секрецию ИФН-γ анализировали как маркер иммунного ответа. Она нормализуется до уровня ИФН-γ после стимуляции исключительно CEF-пептидами. Мышиный IgG (10 мкг/мл) использовали в качестве контроля для анти-PD-1.

Наконец, молекулы ДНК использовали с последовательностью ядра [yACGATCGTCwT] (у=2-8G, защищенная с помощью 1-3 L-дезоксирибозы или без нее, w=4-2 G, защищенные с помощью 1-3 L-дезоксирибозы) для изучения влияния применения комбинации.

Например, в этой группе применяют последовательность SEQ ID NO: 12 (GGGGGACGATCGTCGGGGGGT, основания, содержащие L-дезоксирибозу, подчеркнуты). В исследованиях стимуляции in vitro на примере МКПК человека оценивали комбинацию с анти-PD-1. Такое применение привело к в значительной степени усиленному иммунному ответу по сравнению с применением отдельных соединений (Фиг. 13). Пептиды извлекали из HLA-класса I-ограниченных Т-клеточных эпитопов сенсибилизирующих антигенов (CMV, VEB, гриппа; в совокупности именуемые «CEF», с конечной концентрацией пептидов 1 мкг/мл на каждый пептид), последовательности SEQ ID NO: 10 (3 мкМ) и анти-МКГ-1 (12 мкг/мл) (n=4). Секрецию ИФН-γ анализировали как маркер иммунного ответа. Она нормализуется до уровня ИФН-γ после стимуляции исключительно CEF-пептидами. Мышиный IgG (10 мкг/мл) использовали в качестве контроля для анти-PD-1.

Принимая во внимание описанные выше экспериментальные условия и вес мыши, равный примерно 20 г, количество применяемой ДНК составляет примерно 12,5 мг/кг веса. Таким образом, для получения подобных значительных результатов требуется 15 мг/кг максимум.

Так как анти-PD-1 применяли в концентрации 10 мг/кг веса, для получения значительных результатов необходимо применение максимальной концентрации, равной 15 мг/кг веса.

--->

Перечень последовательностей

<110> МОЛОГЕН АГ

<120> КОМБИНАЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ

<130> 58 164 K

<150> LU92821

<151> 2015-09-09

<160> 12

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид

<400> 1

gttcctggag acgttcttag gaacgttctc cttgacgttg gagagaac 48

<210> 2

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид

<400> 2

accttccttg tactaacgtt gcctcaagga aggttgatct tcataacgtt gcctagatca 60

<210> 3

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид

<400> 3

aacgttcttc ggggcgtt 18

<210> 4

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид

<400> 4

aggtggtaac ccctaggggt taccaccttc atcgtcgttt tgtcgttttg tcgttctt 58

<210> 5

<211> 116

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид

<400> 5

cctaggggtt accaccttca ttggaaaacg ttcttcgggg cgttcttagg tggtaacccc 60

taggggttac caccttcatt ggaaaacgtt cttcggggcg ttcttaggtg gtaacc 116

<210> 6

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид

<400> 6

aggtggtaac ccctaggggt taccaccttc atcgtcgttt tgtcgttttg tcgttctt 58

<210> 7

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид; Позиция 31 и 32 в

L-образной конформации

<400> 7

ggggtcatta aaacgtgacg tgacgttctt ttt 33

<210> 8

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид; Позиции 1, 2 и 35 и 36 в

L-образной конформации

<400> 8

ggggggggtc attaaaacgt gacgtgacgt tcttttt 37

<210> 9

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид; позиции 30 и 31 в

L-образной конформации

<400> 9

ggggtcatta aacgtgacgt gacgttcttt tt 32

<210> 10

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид; позиции 32 и 33 в

L-образной конформации

<400> 10

ggggtcatta aacgttcttc ggggcgttct tttt 34

<210> 11

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид; позиции 37 и 38 в

L-образной конформации

<400> 11

ggggtcatta aatcgtcgtt ttgtcgtttt gtcgttttt 39

<210> 12

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигодезоксинуклеотид; позиции 1, 2 и 19 и 20 в

L-образной конформации

<400> 12

gggggacgat cgtcgggggg t 21

<---

1. Линейная некодирующая молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, обладающая иммуностимулирующими свойствами, выбранная из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11.

2. Линейная некодирующая молекула с незамкнутой цепью по п. 1, имеющая SEQ ID NO: 7.

3. Линейная некодирующая молекула с незамкнутой цепью по п. 1, имеющая SEQ ID NO: 8.

4. Линейная некодирующая молекула с незамкнутой цепью по п. 1, имеющая SEQ ID NO: 9.

5. Линейная некодирующая молекула с незамкнутой цепью по п. 1, имеющая SEQ ID NO: 11.

6. Фармацевтическая композиция для лечения инфекционного заболевания, содержащая линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью по любому из пп. 1-5 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

7. Фармацевтическая композиция по п. 6, где композиция представляет собой вакцину.

8. Фармацевтическая композиция по п. 6, содержащая:

(1) PD-L1 антитело и линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 7;

(2) CTLA4 антитело и линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 7;

(3) PD-1 антитело и линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 8;

(4) PD-1 антитело и линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 9; или

(5) PD-1 антитело и линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 11.

9. Фармацевтическая композиция по п. 6, содержащая (а) PD-L1 антитело и (b) линейную некодирующую молекулу с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 7.

10. Фармацевтическая композиция по п. 6, содержащая (а) CTLA4 антитело и (b) линейную некодирующую молекулу с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 7.

11. Способ лечения инфекционного заболевания, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту линейной некодирующей молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью по любому из пп. 1-5 или фармацевтической композиции по п. 6.

12. Способ по п. 11, включающий введение:

(1) PD-L1 антитела и линейной некодирующей молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющей SEQ ID NO: 7;

(2) CTLA4 антитела и линейной некодирующей молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющей SEQ ID NO: 7;

(3) PD-1 антитела и линейной некодирующей молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющей SEQ ID NO: 8;

(4) PD-1 антитела и линейной некодирующей молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющей SEQ ID NO: 9; или

(5) PD-1 антитела и линейной некодирующей молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющей SEQ ID NO: 11.

13. Способ по п. 11, включающий введение: (а) PD-L1 антитела и (b) линейной некодирующей молекулы с незамкнутой цепью, имеющей SEQ ID NO: 7.

14. Способ по п. 11, включающий введение: (а) CTLA4 антитела и (b) линейной некодирующей молекулы с незамкнутой цепью, имеющей SEQ ID NO: 7.

15. Применение линейной некодирующей молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью по любому из пп. 1-5 или фармацевтической композиции по п. 6 при изготовлении лекарственного средства для лечения инфекционного заболевания.

16. Применение по п. 15, где лекарственное средство дополнительно содержит:

(1) PD-L1 антитело и линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 7;

(2) CTLA4 антитело и линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 7;

(3) PD-1 антитело и линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 8;

(4) PD-1 антитело и линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 9; или

(5) PD-1 антитело и линейную некодирующую молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 11.

17. Применение по п. 15, где лекарственное средство дополнительно содержит: (а) PD-L1 антитело и (b) линейную некодирующую молекулу с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 7.

18. Применение по п. 15, где лекарственное средство дополнительно содержит: (а) CTLA4 антитело и (b) линейную некодирующую молекулу с незамкнутой цепью, имеющую SEQ ID NO: 7.

19. Применение по п. 15, где лекарственное средство представляет собой адъювант при терапевтической или профилактической вакцинации.