Оценки риска на основе экспрессии варианта 7 фосфодиэстеразы 4d человека

Авторы патента:

АЛВЕС ДЕ ИНДА, Марсия (NL)

ХОФФМАНН, Ральф (NL)

ВАН СТРЕЙП, Дианне Арнольдина Маргарета Вильхельмина (NL)

ВАН БРЮССЕЛ, Анна Годефрида Катарина (NL)

ВРОБЕЛ, Яннеке (NL)

ВАН ЗОН, Йоаннес Баптист Адрианус Дионисиус (NL)

ДЕН БИЗЕН, Эвелин Катарина Анна Класина (NL)

G16B20/20 -

C12Q1/6886 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

C12Q1/68 - использующие нуклеиновые кислоты

Владельцы патента RU 2766885:

КОНИНКЛЕЙКЕ ФИЛИПС Н.В. (NL)

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ стратификации риска для пациентов со злокачественной опухолью предстательной железы и предоставления рекомендации по лечению пациенту на основе оценки риска по варианту 7 фосфодиэстеразы 4D (PDE4D7). Также описаны диагностический набор и применение профиля экспрессии гена для стратификации риска. Изобретение позволяет осуществить эффективную комбинированную оценку риска для пациентов со злокачественной опухолью предстательной железы. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 22 ил., 10 табл., 22 пр.

ПРЕДПОСЫЛКИ

Злокачественные опухоли представляют собой класс заболеваний, при которых группа клеток демонстрирует неконтролируемый рост, инвазию и иногда метастазирование. Эти три озлокачествленных свойства злокачественных опухолей отличают их от доброкачественных опухолей, которые самоограничены и не проявляют инвазию или метастазирование. Злокачественная опухоль предстательной железы (PCa) является наиболее часто встречающимся не кожным злокачественным новообразованием у мужчин. Из-за старения популяций, ожидают значительное увеличение заболеваемости PCa в будущем. Стандартное диагностирование посредством определения в крови уровней специфического антигена простаты (PSA), цифрового ректального исследования (DRE) и трансректального ультразвукового исследования (TRUS) ведет к значимой гипердиагностике не злокачественных, доброкачественных состояний предстательной железы. Приблизительно из 1 миллиона биопсий предстательной железы, ежегодно выполняемых в США, чтобы найти приблизительно 250000 новых случаев, приблизительно 75% выполняют без необходимости, что влечет как существенные осложнения (такие как уросепсис, кровотечение и задержка мочи) у пациентов, так и большие расходы. По меньшей мере 4 из 100 мужчин с отрицательной биопсией вероятно будут госпитализированы из-за побочных эффектов и 9 из 10000 пациентов, прошедших биопсию, имеют риск смерти от процедуры, используемой в настоящее время.

Из приблизительно 250000 случаев PCa, вновь обнаруживаемых в год в США, приблизительно 200000 изначально получают характеристику локализованного заболевания, т.е. злокачественной опухоли, находящейся в органе предстательная железа. Это состояние, до определенной степени, можно излечить с помощью подходов первичного лечения, таких как лучевая терапия или частичное или полное удаление предстательной железы посредством хирургической операции (простатэктомии). Однако этим вмешательствам обычно сопутствуют серьезные побочные эффекты, в частности, недержание мочи и/или эректильная дисфункция в качестве очень частых последствий простатэктомии. Кроме того, обычно применяемое лечение локализованной PCa является дорогостоящим.

Среди приблизительно 200000 мужчин в США с клинически локализованным заболеванием в диагнозе, вплоть до 50% имеют злокачественную опухоль с очень низким или низким риском. Соответственно, в National Comprehensive Cancer Network (NCCN) в последнее время пересмотрены их руководства по лечению PCa для того, чтобы расширить активное наблюдение (AS) в качестве мягкой и удобной лечебной альтернативы для пациентов с таким заболеванием с низким риском. Направление подходящих пациентов на AS привело к значительному усовершенствованию качества жизни у таких пациентов по сравнению с мужчинами, прошедшими первичное лечение, и сообщалось, что 5-летние расходы на AS значительно ниже.

Кроме того, в случае выбора хирургической операции (в сравнении с AS) в качестве лечения, предпочтительного для данного пациента, значимое преимущество состоит в стратификации по объему хирургической операции в соответствии с потенциальной агрессивностью опухоли пациента. Например, оперативные приемы с сохранением нервных окончаний могут быть в более общем случае применять для мужчин с заболеванием с предсказанным низким риском, чтобы минимизировать нежелательные эффекты, связанные с потенцией, при радикальной простатэктомии. Аналогичным образом, в соответствии с самыми последними Prostate Cancer Guidelines от European Association Of Urology (EAU), расширенное удаление лимфатических узлов рекомендовано в случае злокачественной опухоли с предсказанным высоким риском, несмотря на тот факт, что процедура сложна, требует времени и ассоциирована с более высокими частотами осложнений по сравнению с более ограниченными процедурами. Следовательно, хотя и показано, что при менее ограниченном удалении лимфатических узлов, пропускают приблизительно 50% метастазов в лимфатических узлах, тактика лечения для мужчин с локализованной злокачественной опухолью предстательной железы выиграет от высокоточных дохирургических предсказаний потенциала агрессивности индивидуальной опухоли, чтобы обеспечивать оптимальный уход для каждого пациента.

Побочные эффекты активных терапевтических возможностей (например, хирургической операции, лучевой терапии и т.д.) можно избегать или снижать посредством выбора активного наблюдения в качестве лечебной альтернативы. Однако поскольку опухоль не лечат при активном наблюдении, вероятность прогрессирования заболевания должна быть самой минимальной, чтобы гарантировать, что множество пациентов, которые могут прогрессировать при активном наблюдении, все еще имеют хороший шанс на излечение посредством переключения с активного наблюдения на активное вмешательство. Традиционные способы определения риска прогрессирования заболевания у пациента склонны относить многих пациентов к категориям активного вмешательства вместо AS, тем самым снижая качество жизни пациента и излишне подвергая таких пациентов нежелательным побочным эффектам инвазивного лечения. Таким образом, желательны новые способы стратификации риска пациента и предоставления пациентам усовершенствованных рекомендаций в отношении того, выбирать ли активное наблюдение или активное вмешательство.

В WO 2010/131194 A1 раскрыт способ диагностирования или обнаружения озлокачествленной, гормоночувствительной злокачественной опухоли предстательной железы посредством определения уровня экспрессии варианта PDE4D7 фосфодиэстеразы 4D. В документе также раскрыто использование PDE-Index для того, чтобы эффективно проводить различия между доброкачественными и озлокачествленными заболеваниями, где экспрессию PDE4D7 нормализуют по PDE4D5 в качестве внутреннего контроля.

В WO 2010/131195 A1 описан способ диагностирования гормонорезистентной злокачественной опухоли предстательной железы в сравнении с гормоночувствительной посредством определения уровня экспрессии PDE4D7. Уровень экспрессии PDE4D7 нормализуют по эталонному гену, которым может быть PDE4D5.

В Henderson, et al., «The cAMP phosphodiesterase-4D7 (PDE4D7) is downregulated in androgen-independent prostate cancer cells and mediates proliferation by compartmentalizing cAMP at the plasma membrane of VCaP prostate cancer cells», British Journal of Cancer, 110(5) 1278-1287 (2014), приведены доказательства того, что PDE4D7 сильно экспрессирована в клетках андрогенчувствительной злокачественной опухоли предстательной железы, но при этом находится под значительной понижающей регуляцией в клетках андрогеннечувствительной злокачественной опухоли предстательной железы, что указывает на потенциальное применение в качестве биомаркера для андрогеннечувствительной злокачественной опухоли предстательной железы, а также терапевтических возможностей.

В EP 1471153 A2 описан анализ транскрипционной активности для определения биологической активности соединения посредством анализа его способности модулировать экспрессию гена. Среди возможных целевых продуктов экспрессии имеют место изоферменты PDE4D. Соединения, идентифицированные в описанном скрининге, могут представлять собой антитела, которые имеют терапевтическое значение при лечении злокачественной опухоли молочной железы.

В WO 2010/059838 A2 описаны ингибиторы фосфодиэстеразы 4 (PDE4) и их использование в лечении и предотвращении инсульта, инфаркта миокарда, сердечнососудистых воспалительных заболеваний и нарушений, а также нарушений центральной нервной системы.

В WO 2004/090157 A1 раскрыто использование PDE4D, в частности PDE4D5 или PDE4D7, в качестве мишени для идентификации соединений, которые можно использовать для лечения атеросклероза или для лечения рестеноза.

В US 2003/220273 A1 описаны антисмысловые соединения, композиции и способы модулирования экспрессии фосфодиэстеразы 4D, а также использование этих соединений для лечения заболеваний, ассоциированных с экспрессией фосфодиэстеразы 4D.

В Merkle, et al., «Roles of cAMP and cAMP-зависим* бел*к kinase in the progression of prostate cancer: Cross-talk with the androgen receptor», Cellular Signalling, 23(3) 507-515, (2011) описано исследование ролей цАМФ и цАМФ-зависимой протеинкиназы при прогрессировании злокачественной опухоли предстательной железы. В контексте этого исследования установлено, что экспрессия PDE4D увеличена в тканях злокачественных опухолей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение относится к способам диагностирования, мониторинга или прогнозирования злокачественной опухоли предстательной железы или статуса прогрессирования злокачественной опухоли предстательной железы. В частности, это относится к способу стратификации риска для выбора терапии у пациента со злокачественной опухолью предстательной железы на основе уровня экспрессии варианта PDE4D, такого как PDE4D7, и к диагностическому набору, используемому для того, чтобы определять оценку риска для мужчин со злокачественной опухолью предстательной железы. PDE4D7 относится к фосфодиэстеразе циклических нуклеотидов (PDE) из семейства циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) (4), изоформе D, варианту 7.

В соответствии с одним аспектом образцового варианта осуществления, способ стратификации риска включает определение нормализованного профиля экспрессии гена для одного маркерного гена, состоящего из варианта 7 фосфодиэстеразы 4D (PDE4D7), по отношению к набору эталонных генов, выбранных из группы, состоящей из гипоксантинфосфорибозилтрансферазы 1 Homo sapiens (HPRT1), тубулина-α-1b (TUBA1B), члена РНК-связывающего семейства pumilio Homo sapiens (PUM1) и связывающего TATA-бокс белка Homo sapiens (TBP), а также их сочетаний. Способ дополнительно включает определение прогностической оценки риска с использованием оценочной функции, на основе нормализованного профиля экспрессии гена, оценочную функцию выводят из профилей экспрессии генов для биологических образцов, взятых у субъектов, у которых осуществляли мониторинг злокачественной опухоли предстательной железы. Способ дополнительно включает определение комбинированной прогностической оценки риска на основе прогностической оценки риска и второго определения риска, которое представляет собой классификацию National Comprehensive Cancer Network (NCCN).

В соответствии с другим аспектом, диагностический набор содержит по меньшей мере один праймер и/или зонд для определения уровня экспрессии по меньшей мере одного варианта фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), по меньшей мере одного варианта PDE4D, включая PDE4D7, и по меньшей мере один праймер и/или зонд для определения уровня экспрессии гена для по меньшей мере одного эталонного гена. Набор содержит инструкции для вычисления оценки риска на основе определяемых уровней экспрессии. Инструкции хранят в компьютерном программном продукте, который при исполнении с помощью компьютера выполняет способ, который включает определение нормализованного профиля экспрессии гена для варианта 7 фосфодиэстеразы 4D (PDE4D7), по отношению к по меньшей мере одному эталонному гену, и определение прогностической оценки риска с использованием оценочной функции, на основе нормализованного профиля экспрессии гена, и определение комбинированной прогностической оценки риска на основе прогностической оценки риска и второго определения риска, которое представляет собой классификацию National Comprehensive Cancer Network (NCCN).

В соответствии с другим аспектом, способ предоставления терапевтической рекомендации для субъекта со злокачественной опухолью предстательной железы включает определение профиля экспрессии гена в биологическом образце от субъекта. Профиль экспрессии гена включает уровень экспрессии для варианта 7 фосфодиэстеразы 4D (PDE4D7). Профиль экспрессии гена нормализуют с использованием уровня экспрессии для по меньшей мере одного эталонного гена, выбранного из HPRT1, TUBA1B, PUM1 и TBP. Прогностическую оценку риска определяют для субъекта на основе нормализованного профиля экспрессии гена. Субъекта относят к группе риска PDE4D7 на основе прогностической оценки риска. Способ также включает определение комбинированной прогностической оценки риска для субъекта на основе прогностической оценки риска и второго определения риска, которое представляет собой классификацию National Comprehensive Cancer Network (NCCN). Субъекта относят к группе риска на основе комбинированной прогностической оценки риска. Терапевтическую рекомендацию предоставляют для субъекта на основе группы риска.

В соответствии с другим аспектом, компьютерный программный продукт включает постоянную среду для регистрации, хранящую инструкции, которые при исполнении на компьютере управляют компьютером для того, чтобы осуществлять способ, включающий вычисление нормализованного профиля экспрессии гена для варианта 7 фосфодиэстеразы 4D (PDE4D7), по отношению к набору эталонных генов, выбранному из группы, состоящей из: гипоксантинфосфорибозилтрансферазы 1 Homo sapiens (HPRT1), тубулина-α-1b (TUBA1B), члена РНК-связывающего семейства pumilio Homo sapiens (PUM1) и связывающего TATA-бокс белка Homo sapiens (TBP), а также их сочетаний; и вычисление прогностической оценки риска для субъекта на основе профиля экспрессии гена с использованием оценочной функции. Оценочную функцию можно выводить из профилей экспрессии генов для биологических образцов, полученных у субъектов, у которых осуществляли мониторинг злокачественной опухоли предстательной железы. Способ дополнительно включает вычисление комбинированной прогностической оценки риска на основе прогностической оценки риска и второго определения риска, которое представляет собой классификацию National Comprehensive Cancer Network (NCCN).

Как указано выше, второе определение риска представляет собой классификацию National Comprehensive Cancer Network (NCCN), например, одно или несколько из очень низкого риска (VLR), низкого риска (LR), благоприятного промежуточного риска (FIR), неблагоприятного промежуточного риска (UIR) и высокого риска (HR). Комбинированную прогностическую оценку риска можно определять с использованием функции регрессии, получаемой у субъектов, у которых осуществляли мониторинг злокачественной опухоли предстательной железы.

В некоторых вариантах осуществления по любым указанным выше аспектам, профиль экспрессии гена превращают в по меньшей мере одну оценку риска PDE для злокачественной опухоли предстательной железы (прогностическая оценка риска), указывающую на присутствие и/или отсутствие злокачественной опухоли предстательной железы и/или статус прогрессирования злокачественной опухоли предстательной железы. Введение оценки риска PDE обеспечивает хорошее предсказание при диагностировании или прогнозировании злокачественной опухоли предстательной железы. В частности, оценку риска PDE4D7 можно использовать для того, чтобы стратифицировать субъекты со злокачественной опухолью предстательной железы на основе измеряемого уровня этой оценки риска, которая указывает, помещать ли таких субъектов под активное наблюдение (AS) вместо активного лечения (например, хирургической операции, лучевой терапии и т.д.), которое является стандартом лечения для этих субъектов.

Профиль экспрессии гена дополнительно может содержать уровень экспрессии для одного или нескольких других вариантов PDE4D. Например, другой вариант(ы) PDE4D может включать одно или несколько из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 и PDE4D9.

Профиль экспрессии гена может представлять собой профиль экспрессии гена биологического образца от индивидуума, такого как биоптат из предстательной железы индивидуума.

Профиль экспрессии гена может представлять собой нормализованный профиль экспрессии гена, который получают посредством нормализации уровня экспрессии по меньшей мере варианта PDE4D7 по экспрессии по меньшей мере одного эталонного гена. Способ может включать определение уровня экспрессии одного или нескольких эталонных генов в образце перед нормализацией уровня экспрессии по меньшей мере варианта PDE4D7.

Эталонный ген(ы) можно выбирать из гипоксантинфосфорибозилтрансферазы 1 Homo sapiens (HPRT1), тубулина-α-1b (TUBA1B), члена РНК-связывающего семейства pumilio Homo sapiens (PUM1) и связывающего TATA-бокс белка Homo sapiens (TBP), а также их сочетаний, таких как по меньшей мере два или по меньшей мере три или все из них.

Прогностическая оценка риска может быть основана на нормализованном профиле экспрессии гена, который содержит уровень экспрессии для PDE4D7.

Уровень экспрессии гена можно определять посредством обнаружения экспрессии мРНК, используя один или несколько праймеров и/или зондов и/или один или несколько наборов из них.

Уровень экспрессии гена можно определять посредством способа на основе амплификации и/или микрочипового анализа и/или РНК секвенирования.

Определение профиля экспрессии гена может включать выполнение количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-qPCR) с РНК, экстрагированной из биологического образца. В других вариантах осуществления уровень экспрессии гена определяют посредством РНК секвенирования, стандартной ПЦР (с использованием, например, анализа конечной точки посредством электрофореза в геле) или мультиплексной ПЦР.

В случае RT-qPCR, определение профиля экспрессии гена может включать определение значения порогового цикла (C_t) для PDE4D7 и каждого из по меньшей мере одного эталонного гена.

Определение прогностической оценки риска может включать нормализацию значения PDE4D7 с использованием значения каждого из по меньшей мере одного эталонного гена. Определение прогностической оценки риска может включать вычисление оценки риска в виде функции, такой как линейная функция, от нормализованного значения. Функцию можно выводить на основе исходов пациентов после получения биологического образца.

ПЦР можно осуществлять с использованием по меньшей мере одного праймера и/или зонда для измерения эталонного гена, выбранного из HPRT1, TUBA1B, PUM1 и TBP.

Прогностическая оценка риска для субъекта может представлять собой значение в предварительно определяемом диапазоне.

Способ дополнительно может включать отнесение субъекта к одной из предварительно определяемого набора групп риска, на основе комбинированной прогностической оценки риска. Могут иметь место по меньшей мере две или по меньшей мере три группы риска на основе комбинированной прогностической оценки риска.

Способ дополнительно может включать по меньшей мере одно из: a) предложения терапии для субъекта на основе присваиваемой группы риска, где по меньшей мере две из групп риска ассоциированы с различными потенциальными терапиями; b) вычисления предсказания риска прогрессирования заболевания у субъекта до или после хирургической операции на предстательной железе; и c) вычисления предсказания ответа на терапию для субъекта до или после хирургической операции на предстательной железе. В случае предложения терапии, предлагаемые терапии можно выбирать из: a) по меньшей мере частичной простатэктомии; b) активной терапии, выбранной из лечения излучением, гормональной терапии, химиотерапии и их сочетания; и c) наблюдения без выполнения a) или b). Предлагаемые терапии могут включать: хирургическую операцию на предстательной железе, удаление предстательной железы, химиотерапию, лучевую терапию, гормональную терапию и ограниченное или расширенное удаление лимфатических узлов или их сочетание.

Предлагаемая терапия на основе присваиваемой группы риска может отличаться от предлагаемой терапии на основе только второго определения риска.

Способ и набор могут включать чип нуклеиновых кислот, который содержит один или несколько олигонуклеотидных зондов, комплементарных и гибридизуемых с кодирующей последовательностью по меньшей мере одного варианта PDE4D, выбранного из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, и который дополнительно может содержать один или несколько олигонуклеотидных зондов, комплементарных и гибридизуемых с по меньшей мере одним из эталонных генов, выбранных из TBP, HPRT1, PUM1 и TUBA1B, для определения оценки риска как определено в настоящем описании.

Другой аспект образцового варианта осуществления относится к использованию варианта PDE4D7 и эталонных генов для стратификации риска.

Дополнительный аспект изобретения относится к реализованному на компьютере способу диагностирования, мониторинга или прогнозирования злокачественной опухоли предстательной железы или стратификации риск прогрессирования злокачественной опухоли предстательной железы, который включает стадии способа, как определено в настоящем описании.

Дополнительный аспект изобретения относится к компьютерному программному продукту, содержащему постоянную среду для регистрации, с инструкциями, хранимыми в ней, которые при исполнении на компьютере управляют компьютером для того, чтобы осуществлять способ, который включает вычисление нормализованного профиля экспрессии гена для варианта 7 фосфодиэстеразы 4D (PDE4D7) по отношению к набору эталонных генов, выбранных из группы, состоящей из: гипоксантинфосфорибозилтрансферазы 1 Homo sapiens (HPRT1), тубулина-α-1b (TUBA1B), члена РНК-связывающего семейства pumilio Homo sapiens (PUM1) и связывающего TATA-бокс белка Homo sapiens (TBP), а также их сочетаний, и вычисление прогностической оценки риска для субъекта на основе профиля экспрессии гена с использованием оценочной функции, которую получают из профилей экспрессии генов для биологических образцов, полученных у субъектов, у которых осуществляли мониторинг злокачественной опухоли предстательной железы. Способ дополнительно может включать вычисление комбинированной прогностической оценки риска на основе прогностической оценки риска и второго определения риска.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1 представлена блок-схема, иллюстрирующая способ стратификации риска для выбора терапии у пациента со злокачественной опухолью предстательной железы;

на фиг. 2 представлен нормализованный профиль экспрессии гена PDE4D7 (слева) и преобразование оценки риска PDE4D7 (справа);

на фиг. 3 представлен лесовидная диаграмма для отношений рисков (HR) и 95% доверительных областей (95% CI) после многомерного регрессионного анализа Кокса для полной когорты пациентов (включающей 503 пациента), где тестируемая клиническая конечная точка представляет собой время до биохимического рецидива (BCR) после хирургической операции;

на фиг. 4 представлен анализ Каплана-Мейера для времени до рецидива специфического антигена простаты (PSA) после простатэктомии для групп оценки риска PDE4D7. Также представлено число пациентов (т.е. мужчин) с риском для каждого 20-месячного временного интервала на группу оценки риска и сравнение отношений рисков по группам;

на фиг. 5 представлена лесовидная диаграмма для отношений рисков (HR) и 95% доверительных областей (95% CI) после многомерного регрессионного анализа Кокса полной когорты пациентов (503 пациента), где тестируемая клиническая конечная точка представляет собой время до биохимического рецидива (BCR) после хирургической операции;

на фиг. 6 представлена лесовидная диаграмма для отношений рисков и 95% доверительных областей (95% CI) для нескольких клинических конечных точек после хирургической операции, включая биохимический рецидив, спасительную лучевую терапию, спасительную терапию с андрогенной депривацией, клинический рецидив, специфическую смертность от злокачественной опухоли предстательной железы и общую смертность;

на фиг. 7 представлен график 5-летнего риска биохимического рецидива (BCR) в группах риска NCCN в сравнении с группами оценки риска PDE4D7;

на фиг. 8 представлен график 10-летнего риска клинического рецидива (CR) в группах риска NCCN в сравнении с группами оценки риска PDE4D7;

на фиг. 9 представлен график 10-летнего риска специфической смертности от злокачественной опухоли предстательной железы (PCSM) в группах риска NCCN в сравнении с группами оценки риска PDE4D7.

На фиг. 10 представлен график 10-летнего риска общей смертности (OM) в группах риска NCCN в сравнении с группами оценки риска PDE4D7.

Фиг. 11 иллюстрирует матрицу прогрессирования риска в клинических группах риска NCCN в сравнении с группами риска PDE4D7.

на фиг. 12 представлен анализ Каплана-Мейера для индекса Глисона биоптатов для биохимического рецидива в группе благоприятного промежуточного риска NCCN (128 пациентов). Индекс Глисона биоптатов s делят на группы степени по Глисону 3+3 (нижняя линия на фиг.) и 3+4 (верхняя линия на фиг.). Также проиллюстрировано попарное сравнение групп риска по отношениям рисков (HR).

На фиг. 13 представлен анализ Каплана-Мейера для групп оценки риска PDE4D7 для биохимического рецидива в группе благоприятного промежуточного риска NCCN (128 пациентов). Также проиллюстрировано попарное сравнение групп риска по отношениям рисков (HR).

На фиг. 14 представлен анализ Каплана-Мейера для индекса Глисона биоптатов для биохимического рецидива в группе неблагоприятного промежуточного и высокого риска NCCN (164 пациента). Индекс Глисона биоптатов делят на группы степени по Глисону 3+3, 3+4, 4+3 и ≥4+4. Также проиллюстрировано попарное сравнение групп риска по отношениям рисков (HR).

На фиг. 15 представлен анализ Каплана-Мейера для групп оценки риска PDE4D7 для биохимического рецидива в группе неблагоприятного промежуточного и высокого риска NCCN (164 пациента). Также проиллюстрировано попарное сравнение групп риска по отношениям рисков (HR).

На фиг. 18 представлен ROC анализ 2-летнего биохимического рецидива после хирургической операции (BCR) логистической регрессионной модели с оценками NCCN и PDE4D7 в когорте пациентов (449 пациентов) с полным 5-летним наблюдением.

На фиг. 20 представлен ROC анализ 10-летнего биохимического рецидива после хирургической операции (BCR) логистической регрессионной модели с оценками NCCN и PDE4D7 в когорте пациентов (379 пациентов) с полным 10-летним наблюдением.

На фиг. 21 представлен анализ предсказанного риска по группе NCCN в качестве функции оценки риска PDE4D7, который обнаруживал гетерогенное распределение 5-летнего риска прогрессирования (BCR) даже в группах наименьшего клинического риска NCCN.

На фиг. 22 представлены результаты анализа Каплана-Мейера выживаемости без биохимического рецидива (BCR) в субкогорте пациентов с 5-летним полным наблюдением (449 пациентов). Четыре категории риска определяли на основе вычисленной по логистической регрессионной модели 5-летней вероятности p перенести биохимический рецидив: группа риска 1 (от 0 до <0,1; 139 пациентов); группа риска 2 (от 0,1 до <0,25; 170 пациентов); группа риска 3 (от 0,25 до <0,5; 112 пациентов); группа риска 4 (от 0,5 до 1,0; 28 пациентов).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Аспекты образцового варианта осуществления относятся к идентификации и использованию профилей экспрессии генов, сигнатур или паттернов биомаркерных генов, представляющих интерес (также обозначаемых как маркерные гены или GOI (гены, представляющие интерес)), с клинической важностью для злокачественной опухоли предстательной железы. В частности, в способе используют генетический экспрессионный анализ нуклеиновых кислот, таких как транскрипты биомаркерных генов, которые получают из биологических образцов. Анализ экспрессии этих маркерных генов можно использовать для предоставления оценки риска PDE4D7 для злокачественной опухоли предстательной железы для стратификации риска достижения определенных клинических исходов пациентом.

Более конкретно, описан способ определения оценки риска на основе профиля экспрессии PDE4D7, который, как обнаружено, предоставляет уникальное средство для стратификации риска развития у пациента конкретных конечных точек до и после хирургической операции, включая биохимический рецидив, клинический рецидив, специфическую смертность от злокачественной опухоли предстательной железы и общую смертность. Оценка риска PDE предоставляет очень полезный параметр для персонализированной медицины в отношении диагностики, прогнозирования и лечения пациентов со злокачественной опухолью предстательной железы. Оценку риска PDE можно использовать отдельно или в комбинации с другими средствами и способами, которые предоставляют информацию о персональном состоянии заболевания или стадии заболевании пациента.

Врачи и/или патологи могут благоприятно использовать оценку риска PDE для того, чтобы подтверждать результаты, получаемые в других способах диагностирования, идентификации и прогнозирования пациентов. Способы и средства, предусмотренные изобретением, следовательно, помогают делать более точный диагноз, прогноз и т.д., чтобы находить наилучшее лечение для пациента и избегать не необходимой хирургической операции или другого лечения, которые опасны из-за побочных эффектов, и ведут к сокращению расходов.

Как используют в настоящем описании, термин «вариант транскрипта PDE4D» или «изоформа PDE4D» или «вариант PDE4D» относится к любому из сплайсированных вариантов PDE4D фосфодиэстеразы человека PDE4D, т.е. гена фосфодиэстеразы человека PDE4D, например, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9.

Термины «маркер», «маркерный ген», «GOI» или «маркерный вариант PDE4D» можно использовать взаимозаменяемо, и они относятся к гену, генетической единице или последовательности (нуклеотидной последовательности или аминокислотной или белковой последовательности), как определено выше в настоящем описании, уровень экспрессии который возрастает или снижается в клетках или тканях озлокачествленных или доброкачественных опухолей предстательной железы или образце в любого типа, включая такие клетки или ткани или их части или фрагменты, при сравнении с контрольным уровнем, при сравнении с экспрессией в нормальной ткани. Термин также относится к любому продукту экспрессии указанной генетической единицы или последовательности, в частности, к мРНК транскрипту варианта PDE4D, полипептиду или белку, кодируемому транскриптом варианта PDE4D или его фрагментами, а также к их гомологичным производным, как раскрыто в настоящем описании выше. В частности, термины «маркер», «маркерный ген», «GOI» или «маркерный вариант PDE4D» относятся к любому из сплайсированных вариантов PDE4D фосфодиэстеразы человека PDE4D, т.е. к гену фосфодиэстеразы человека PDE4D, например, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9.

Термин «фосфодиэстераза 4D1» или «PDE4D1» относится к сплайсированному варианту 1 фосфодиэстеразы человека PDE4D, т.е. к гену фосфодиэстеразы человека PDE4D1, например, к последовательности, как определено в эталонной последовательности NCBI: NM_001197222.1, в частности, к нуклеотидной последовательности как приведено в SEQ ID № 1, которая соответствует последовательности вышеуказанной эталонной последовательности NCBI транскрипта PDE4D1, а также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, например, как приведено в SEQ ID № 2, которая соответствует белковой последовательности, которая определена в эталонной белковой последовательность NCBI с номером доступа NP_001184151.1, кодирующей полипептид PDE4D1. Термин «фосфодиэстераза 4D1» или «PDE4D1» также относится к ампликону, который можно создавать с помощью пары праймеров PDE1D1D2_прям. (SEQ ID № 3) и PDE1D1D2_обратн. (SEQ ID № 4) и можно обнаруживать с помощью зонда SEQ ID № 5.

Термин «фосфодиэстераза 4D2» или «PDE4D2» относится к сплайсированному варианту 2 фосфодиэстеразы человека PDE4D, т.е. к гену фосфодиэстеразы человека PDE4D2, например, к последовательности, как определено в эталонной последовательности NCBI: NM_001197221.1, в частности, к нуклеотидной последовательности, как приведено в SEQ ID № 6, которая соответствует последовательности вышеуказанной эталонной последовательности NCBI транскрипта PDE4D2, а также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, например, как приведено в SEQ ID № 7, которая соответствует белковой последовательности, которая определена в эталонной белковой последовательности NCBI с номером доступа NP_001184150.1, кодирующей полипептид PDE4D2.

Термин «фосфодиэстераза 4D3» или «PDE4D3» относится к сплайсированному варианту 3 фосфодиэстеразы человека PDE4D, т.е. к гену фосфодиэстеразы человека PDE4D3, например, к последовательности, как определено в эталонной последовательности NCBI: NM_006203.4, в частности, к нуклеотидной последовательности, как приведено в SEQ ID № 8, которая соответствует последовательности вышеуказанной эталонной последовательности NCBI транскрипта PDE4D3, а также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, например, как приведено в SEQ ID № 9, которая соответствует белковой последовательности, которая определена в эталонной белковой последовательности NCBI с номером доступа NP_006194.2, кодирующей полипептид PDE4D3.

Термин «фосфодиэстераза 4D4» или «PDE4D4» относится к сплайсированному варианту 4 фосфодиэстеразы человека PDE4D, т.е. к гену фосфодиэстеразы человека PDE4D4, например, к последовательности, как определено в эталонной последовательности NCBI: NM_001104631.1, в частности, к нуклеотидной последовательности, как приведено в SEQ ID № 10, которая соответствует последовательности вышеуказанной эталонной последовательности NCBI транскрипта PDE4D4, а также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, например, как приведено в SEQ ID № 11, которая соответствует белковой последовательности, которая определена в эталонной белковой последовательности NCBI с номером доступа NP_001098101.1, кодирующей полипептид PDE4D4.

Термин «фосфодиэстераза 4D5» или «PDE4D5» относится к сплайсированному варианту 5 фосфодиэстеразы человека PDE4D, т.е. к гену фосфодиэстеразы человека PDE4D5, например, к последовательности, как определено в эталонной последовательности NCBI: NM_001197218.1, в частности, к нуклеотидной последовательности, как приведено в SEQ ID № 12, которая соответствует последовательности вышеуказанной эталонной последовательности NCBI транскрипта PDE4D5, а также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, например, как приведено в SEQ ID № 13, которая соответствует белковой последовательности, которая определена в эталонной белковой последовательности NCBI с номером доступа NP_001184147.1, кодирующей полипептид PDE4D5. Термин «фосфодиэстераза 4D5» или «PDE4D5» также относится к ампликону, который можно создавать с помощью пары праймеров PDE4D5_прям. (SEQ ID № 14) и PDE4D5_обратн. (SEQ ID № 15) и можно обнаруживать с помощью зонда SEQ ID № 16.

Термин «фосфодиэстераза 4D6» или «PDE4D6» относится к сплайсированному варианту 6 фосфодиэстеразы человека PDE4D, т.е. к гену фосфодиэстеразы человека PDE4D6, например, к последовательности, как определено в эталонной последовательности NCBI: NM_001197223.1, в частности, к нуклеотидной последовательности, как приведено в SEQ ID № 17, которая соответствует последовательности вышеуказанной эталонной последовательности NCBI транскрипта PDE4D6, а также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, например, как приведено в SEQ ID № 18, которая соответствует белковой последовательности, которая определена в эталонной белковой последовательности NCBI с номером доступа NP_001184152.1, кодирующей полипептид PDE4D6.

Термин «фосфодиэстераза 4D7» или «PDE4D7» относится к сплайсированному варианту 7 фосфодиэстеразы человека PDE4D, т.е. к гену фосфодиэстеразы человека PDE4D7, например, к последовательности, как определено в эталонной последовательности NCBI: NM_001165899.1, в частности, к нуклеотидной последовательности, как приведено в SEQ ID № 19, которая соответствует последовательности вышеуказанной эталонной последовательности NCBI транскрипта PDE4D7, а также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, например, как приведено в SEQ ID № 20, которая соответствует белковой последовательности, которая определена в эталонной белковой последовательности NCBI с номером доступа NP_001159371.1, кодирующей полипептид PDE4D7. Термин «фосфодиэстераза 4D7» или «PDE4D7» также относится к ампликону, который можно создавать с помощью пары праймеров PDE4D7_прям. (SEQ ID № 21) и PDE4D7_обратн. (SEQ ID № 22) и можно обнаруживать с помощью зонда SEQ ID № 23.

Полипептид PDE4D7 также можно обнаруживать с использованием пары праймеров PDE4D7-2_прям. (SEQ ID № 24) и PDE4D7_обратн. (SEQ ID № 25) и можно обнаруживать с помощью зонда SEQ ID № 26.

Термин «фосфодиэстераза 4D8» или «PDE4D8» относится к сплайсированному варианту 8 фосфодиэстеразы человека PDE4D, т.е. к гену фосфодиэстеразы человека PDE4D8, например, к последовательности, как определено в эталонной последовательности NCBI: NM_001197219.1, в частности, к нуклеотидной последовательности, как приведено в SEQ ID № 27, которая соответствует последовательности вышеуказанной эталонной последовательности NCBI транскрипта PDE4D8, а также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, например, как приведено в SEQ ID № 28, которая соответствует белковой последовательности, которая определена в эталонной белковой последовательности NCBI с номером доступа NP_001184148.1, кодирующей полипептид PDE4D8.

Термин «фосфодиэстераза 4D9» или «PDE4D9» относится к сплайсированному варианту 9 фосфодиэстеразы человека PDE4D, т.е. к гену фосфодиэстеразы человека PDE4D9, например, к последовательности, как определено в эталонной последовательности NCBI: NM_001197220.1, в частности, к нуклеотидной последовательности, как приведено в SEQ ID № 29, которая соответствует последовательности вышеуказанной эталонной последовательности NCBI транскрипта PDE4D9, а также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, например, как приведено в SEQ ID № 30, которая соответствует белковой последовательности, которая определена в эталонной белковой последовательности NCBI с номером доступа NP_001184149.1, кодирующей полипептид PDE4D9. Термин «фосфодиэстераза 4D9» или «PDE4D9» также относится к ампликону, который можно создавать с помощью пары праймеров PDE4D9_прям. (SEQ ID № 31) и PDE4D9_обратн. (SEQ ID № 32) и можно обнаруживать с помощью зонда SEQ ID № 33.

Термины «PDE4D1», «PDE4D2», «PDE4D3», «PDE4D4», «PDE4D5», «PDE4D6», «PDE4D7», «PDE4D8» и «PDE4D9» также включают нуклеотидные последовательности, демонстрирующие высокую степень гомологии с PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, соответственно, например, последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичные последовательности, как приведено в SEQ ID №№ 1, 6, 8, 10, 12, 17, 19, 27 или 29, соответственно, или аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичные последовательности, как приведено в SEQ ID №2, 7, 9, 11, 13, 18, 20, 28 или 30, соответственно, или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичные последовательности, как приведено в SEQ ID №2, 7, 9, 11, 13, 18, 20, 28 или 30, или аминокислотные последовательности, кодируемые последовательностями нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичными последовательности, как приведено в SEQ ID №1, 6, 8, 10, 12, 17, 19, 27 или 29.

Термин «уровень экспрессии», как используют в настоящем описании, относится к количеству транскрипта варианта PDE4D и/или белка PDE4D, получаемого из определенного числа клеток или определенной части ткани, в частности, к количеству транскрипта варианта PDE4D и/или белка варианта PDE4D, которое получают в стандартной процедуре экстрагирования нуклеиновой кислоты (например, РНК) или белка. Подходящие способы экстрагирования известны специалисту в данной области.

Термин «контрольный уровень» (или «контрольное состояние»), как используют в настоящем описании, относится к уровню экспрессии, который можно определять одновременно и/или в условиях, схожих или сравнимых с тестовым образцом, используя (a) образец(ы), предварительно собранный и сохраненный у субъекта/субъектов, у которых известно состояние или состояние заболевания, например, не злокачественное, нормальное или доброкачественная опухоль предстательной железы, запущенная злокачественная опухоль предстательной железы и т.д. Термин «состояние заболевания» или «состояние злокачественного заболевания» относится к любому состоянию или типу клеточного или молекулярного состояния между не злокачественным состоянием клетки и терминальным злокачественным состоянием клетки (включительно). В частности, термин включает различные стадии злокачественной пролиферации/развития или уровни развития опухоли в организме между (и исключая) не злокачественное состояние клетки и (включая) терминальное злокачественное состояние клетки. Такие стадии развития могут включать все стадии системы классификации злокачественных опухолей TNM (опухоль, узел, метастаз), как определено в UICC, например, стадии 0 и I-IV. Термин также включает стадии перед TNM стадией 0, например, стадии развития, на которых биомаркеры злокачественной опухоли, известные специалисту в данной области, демонстрируют модифицированную экспрессию или профиль экспрессии.

Уровень экспрессии, как указано выше, может представлять собой уровень экспрессии вариантов PDE4D, как определено в настоящем описании выше. Альтернативно или дополнительно, уровень экспрессии также может представлять собой уровень экспрессии любого другого подходящего гена или генетического элемента, экспрессируемых в клетке, например, уровень экспрессии эталонного гена или уровень экспрессии комбинации эталонных генов, например, одного или нескольких из гипоксантинфосфорибозилтрансферазы 1 Homo sapiens (HPRT1), тубулина-α-1b (TUBA1B), члена РНК-связывающего семейства pumilio Homo sapiens (PUM1) и связывающего TATA-бокс белка Homo sapiens (TBP). В одном из вариантов осуществления уровень экспрессии определяют для комбинации эталонных генов.

Термин «злокачественный» относится к состоянию злокачественного заболевания, как определено в настоящем описании. Термин «не злокачественный» относится к состоянию, в котором не поддается обнаружению ни доброкачественная, ни злокачественная пролиферация. Подходящие средства обнаружения известны в данной области.

Термин «злокачественная опухоль предстательной железы» относится к злокачественной опухоли предстательной железы в репродуктивной системе мужчины, которая возникает, когда клетки предстательной железы мутируют и начинают размножаться безконтрольно. Обычно злокачественная опухоль предстательной железы связана с повышенным уровнем специфического антигена простаты (PSA). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения термин «злокачественная опухоль предстательной железы» относится к злокачественной опухоли, демонстрирующей уровни PSA выше 4,0. В другом варианте осуществления термин относится к злокачественной опухоли, демонстрирующей уровни PSA выше 2,0. Термин «уровень PSA» относится к концентрации PSA в крови в нг/мл.

Термин «состояние не прогрессирующей злокачественной опухоли предстательной железы» обозначает, что образец индивидуума не демонстрирует значения параметров, указывающие на «биохимический рецидив» и/или «клинический рецидив».

Термин «состояние прогрессирующей злокачественной опухоли предстательной железы» обозначает, что образец индивидуума демонстрирует значения параметров, указывающие на «биохимический рецидив» и/или «клинический рецидив».

Термин «биохимический рецидив» в целом относится к рецидивным биологическим значениям повышенного PSA, что указывает на присутствие клеток злокачественной опухоли предстательной железы в образце. Однако также возможно использовать другие маркеры, которые можно использовать при обнаружении присутствия или которые вызывают подозрение на такое присутствие.

Термин «клинический рецидив» относится к присутствию клинических признаков, указывающих на присутствие опухолевых клеток, как измеряют, например, с использованием визуализации in vivo.

Термин «увеличенный» или «увеличенный уровень экспрессии» или «уровень экспрессии под повышающей регуляцией» или «увеличения уровня экспрессии» (что можно использовать синонимично) обозначает повышение уровня экспрессии между ситуацией, подлежащей анализу, например, ситуацией, происходящей из образца пациента, и эталонной точкой, которая может представлять собой или нормальный контрольный уровень или злокачественный контрольный уровень, получаемый из любой подходящей стадии опухоли или злокачественной опухоли предстательной железы, известной специалисту в данной области. Уровни экспрессии полагают «увеличенными», когда экспрессия гена варианта PDE4D, например, в биологическом образце, подлежащем анализу, отличается, т.е. повышена, например, на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или больше чем 50% в сравнении с контрольным уровнем или по меньшей мере в 0,1 раза, по меньшей мере в 0,2 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз или больше в сравнении с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой или нормальный контрольный уровень или злокачественный контрольный уровень, как определено в настоящем описании выше. Если следует проводить сравнение со злокачественным контрольным уровнем, дополнительное сравнение с нормальным контрольным уровнем предпочтительно. Такое дополнительное сравнение делает возможным определение тенденции модификации, например, можно наблюдать величину увеличения уровня экспрессии и/или можно делать соответствующие заключения. Это может представлять собой сравнение с доброкачественной опухолью предстательной железы или со здоровой тканью или образцом, полученным у здорового индивидуума.

Термин «мониторинг злокачественной опухоли предстательной железы», как используют в настоящем описании, относится к сопровождению диагностированного или обнаруженного заболевания или нарушения злокачественной опухоли предстательной железы, например, в течение лечебной процедуры или в течение определенного периода времени, обычно в течение 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 6 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 5 лет, 10 лет или любого другого периода времени. Термин «сопровождение» обозначает, что состояния заболевания, как определено в настоящем описании выше, и, в частности, изменения этих состояний заболевания можно обнаруживать посредством сравнения уровня экспрессии маркерного варианта PDE4D в образце с нормальным контрольным уровнем, как определено в настоящем описании выше, в частности, с контрольным уровнем экспрессии, получаемым из контрольной прогрессирующей опухоли, контрольной не прогрессирующей опухоли или здорового контроля, или с уровнем экспрессии стабильной, например, независимой стабильной, клетки или клеточной линии злокачественной опухоли предстательной железы, или клеточной линии в периодическом временном сегменте любого типа, например, каждую неделю, каждые 2 недели, каждый месяц, каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев, каждые 1,5 года, каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет, в течение любого периода времени, например, в течение 2 недель, 3 недель, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 лет, соответственно. Стабильную, например, независимую стабильную, клетку или клеточную линию злокачественной опухоли предстательной железы, дающую начало дополнительному контрольному уровню, можно получать из образцов, соответствующих различным стадиям развития злокачественной опухоли, например, стадиям 0 и I-IV системы классификации TNM. В одном из вариантов осуществления термин относится к сопровождению диагностированной злокачественной опухоли предстательной железы, в частности, прогрессирующей или не прогрессирующей злокачественной опухоли предстательной железы. Мониторинг также может включать обнаружение экспрессии дополнительных генов или генетических элементов, например, эталонных генов.

Термин «прогнозирование злокачественной опухоли предстательной железы», как используют в настоящем описании, относится к предсказанию течения или исхода диагностированной или обнаруженной злокачественной опухоли предстательной железы, например, в течение определенного периода времени, в течение лечения или после лечения. Термин также относится к определению шанса на выживаемость или восстановление после заболевания, а также к предсказанию ожидаемого времени выживания субъекта. В частности, прогнозирование может включать установление вероятности выживаемости субъекта в течение определенного периода времени в будущем, такого как 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 5 лет, 10 лет или любой другой период времени.

Термины «диагностирование» и «прогнозирование» также предназначены для того, чтобы охватывать предсказания и вероятностные анализы. Варианты PDE4D в качестве маркеров, соответственно, можно использовать клинически при принятии решений в отношении модальностей лечения, включая терапевтическое вмешательство или диагностические критерии, такие как наблюдение заболевания. В соответствии с настоящим изобретением, можно предоставлять промежуточный результат для исследования состояния субъекта. Такой промежуточный результат можно комбинировать с дополнительной информацией, чтобы помогать врачу, медсестре или другому практику диагностировать, что субъект страдает заболеванием. Альтернативно, настоящее изобретение можно использовать для того, чтобы обнаруживать злокачественные клетки в ткани, полученной у субъекта, и предоставлять врачу полезную информацию для того, чтобы диагностировать, что субъект страдает заболеванием.

Термин «эталонный ген» или «контрольный ген», как используют в настоящем описании, относится к любому подходящему гену, например, к любому стабильно экспрессируемому и непрерывно поддающемуся обнаружению гену, продукту гена, продукту экспрессии, белку или варианту белка в предпочтительном организме. Термин также включает продукты генов, такие как экспрессируемые белки, пептиды, полипептиды, а также их модифицированные варианты. Термин эталонный ген, таким образом, также включает эталонные белки, происходящие из эталонного гена, если не указано иное. Также включены транскрипты всех типов, происходящие от эталонного гена, а также их модификации, или вторичные параметры, связанные с ними. Альтернативно или дополнительно, другие эталонные параметры также можно использовать для эталонных целей, например, метаболические концентрации, размеры клеток и т.д.

Экспрессию можно осуществлять в одном и том же образце, т.е. уровень варианта PDE4D и эталонного гена определяют в одном и том же образце. Если тестирование осуществляют в одном и том же образце, можно осуществлять подход с одним обнаружением или мультиплексным обнаружением, как раскрыто в настоящем описании. Для эффективности мультиплексного обнаружения можно модифицировать концентрацию праймеров и/или олигонуклеотидов зондов. Кроме того, концентрацию и присутствие дополнительных ингредиентов, таких как буферы, ионы и т.д., можно модифицировать, например, увеличивать или уменьшать в сравнении с указаниями производителей.

В конкретном варианте осуществления можно определять экспрессию больше чем одного эталонного гена или стабильно экспрессируемого гена. Например, можно определять экспрессию 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30 или больше эталонных генов. Результаты таких измерений можно или вычислять отдельно или можно комбинировать для того, чтобы получать усредненный коэффициент экспрессии. Кроме того, паттерн экспрессии эталонных генов можно определять и/или использовать в качестве основы для последующих стадий. Такой паттерн может быть основан на известном экспрессионном поведении генов в определенной злокачественной опухоли, в частности, на стадиях или в состояниях злокачественной опухоли предстательной железы.

Субъект, такой как пациент или индивидуум, подлежащий диагностированию, мониторингу или прогнозированию злокачественной опухоли предстательной железы или статуса прогрессирования злокачественной опухоли предстательной железы, представляет собой животное, такое как млекопитающее, например, человек.

Уровень варианта PDE4D можно определять на уровне нуклеиновой кислоты, уровне белка или уровне активности, как раскрыто в настоящем описании. Предпочтительным является определением количества транскрипта(ов) варианта PDE4D и/или белка. Вдобавок можно определять уровень эталонного гена в образце.

В одном из вариантов осуществления диагностирование, мониторинг, прогнозирование, стратификацию риска и предоставление рекомендации, как отмечено в настоящем описании, следует осуществлять на биологическом образце, полученном у индивидуума. Термин «биологический образец» или «образец, получаемый у индивидуума» относится к любому биологическому материалу, получаемому подходящими способами, известными специалисту в данной области, у индивидуума. Используемый биологический образец можно брать клинически приемлемым образом, например, таким образом, что сохраняют нуклеиновые кислоты (в частности, РНК) или белки.

Биологический образец(ы) может включать ткань и/или текучее вещество организма, такие как, но не ограничиваясь этим, кровь, пот и моча. Кроме того, биологический образец может содержать клеточный экстракт, полученный из или популяции клеток, включая эпителиальные клетки, такие как злокачественные эпителиальные клетки или эпителиальные клетки, происходящие из ткани, которую подозревают на злокачественность. Биологический образец может содержать популяцию клеток, происходящих из железистой ткани, например, образец может происходить из предстательной железы мужского индивидуума. Дополнительно, клетки можно очищать от полученных тканей и текучих веществ организма, в случае необходимости, и затем использовать в качестве биологического образца. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец ткани, образец мочи, образец осадка мочи, образец крови, образец слюны, образец семени, образец, содержащий циркулирующие опухолевые клетки, внеклеточные везикулы, образец, содержащий секретируемые предстательной железой экзосомы, или клеточные линии или линию клеток злокачественной опухоли.

В одном из вариантов осуществления можно получать и/или использовать биоптаты или резекционные образцы. Такие образцы могут включать клетки или клеточные лизаты.

В конкретном варианте осуществления содержимое биологического образца также можно подвергать стадии обогащения. Например, образец можно приводить в контакт с лигандами со специфичностью к клеточной мембране или органеллам определенного типа клеток, например, клеток предстательной железы, которые функционализированы, например, с использованием магнитных частиц. Материал, концентрированный посредством магнитных частиц, впоследствии можно использовать для стадий обнаружения и анализа, как раскрыто в настоящем описании выше или ниже.

Кроме того, клетки, например, опухолевые клетки, можно обогащать через процессы фильтрования образцов текучего вещества или жидкости, например, крови, мочи и т.д. Такие процессы фильтрования также можно комбинировать со стадиями обогащения на основе лиганд-специфических взаимодействий, как раскрыто в настоящем описании выше.

Ведение пациентов со злокачественной опухолью предстательной железы сильно зависит от профилирования риска. В National Comprehensive Cancer Network (NCCN) определены пять категорий риска (очень низкий риск, VLR; низкий риск, LR; благоприятный промежуточный риск, FIR; неблагоприятный промежуточный риск, UIR; и высокий риск, HR) на основе параметров до лечения, которые проиллюстрированы в таблицах 1 и 2.

Таблица 1: клиническая стратификация риска для пациентов со злокачественной опухолью предстательной железы, как определено в руководствах US NCCN

NCCN	Биопсия по Глисону	Клиническая стадия	PSA	% положительных фокусов биопсии	PSAD	№ положительных фокусов биопсии	% опухолей в биопсии
VLR	3+3	cT1c	<10	N/A	<0,15	<3	<50%
LR	3+3	cT1c	<10	N/A	N/A
cT2a
FIR	3+3	cT2b	<10
		cT2c
		cT1c	10-20
	cT2a
	3+4	cT1c	<10	< 50%	N/A
cT2a
UIR	3+3	cT2b	10-20	N/A
	cT2c
	3+4	cT2b	<10	N/A
		cT2c
		cT1c	10-20
		cT2a
		cT2b	10-20
	cT2c
4+3	≤cT2c	≤20	N/A
HR	≥4+4	≥cT3a	>20	N/A

Таблица 2: параметры для присвоения риска

	LR	IR	HR
Биопсия по Глисону	6	7	8-10
Клиническая стадия	cT1, cT2a	cT2b, cT2c	>cT3a
PSA	<10	10-20	>20

Для каждой группы риска в диапазоне очень низкого, низкого, промежуточного, высокого и очень высокого риска, в руководствах представлены несколько возможностей вмешательства. Несмотря на то, что эту оценку риска пациента легко осуществлять, и она основана на обычно доступных клинических данных, эта простота также вносит вклад в свой основной недостаток, который состоит в категоризации пациентов по непересекающимся группам вместо индивидуального риска для каждого пациента независимо от клинической группировки по рискам. Как следствие, рекомендованное лечение может быть идеальным для одного пациента, но может быть не подходящим для другого пациента в той же клинической группе риска. Таким образом, один аспект данного изобретения состоит в использовании молекулярныюх маркеров, таких как PDE4D7, чтобы добавлять ортогональную и независимую информацию к описанию клинического риска для более стратифицированного выбора терапии.

Со ссылкой на фиг. 1, проиллюстрирован способ стратификации риска для выбора терапии у пациента со злокачественной опухолью предстательной железы. Способ начинается в S100.

В S102 получают биологический образец у каждого из первого набора пациентов (индивидуумов), у которых диагностирована злокачественная опухоль предстательной железы и у которых проводили мониторинг злокачественной опухоли предстательной железы в течение периода времени, такого как по меньшей мере один год или по меньшей мере два года или приблизительно пять лет после получения биологического образца.

В S104 профиль экспрессии гена для по меньшей мере одного маркерного гена (например, PDE4D7) получают для каждого из биологических образцов, полученных у пациентов первого набора, например, посредством выполнения RT-qPCR (количественной ПЦР в реальном времени) на РНК, экстрагированной из каждого биологического образца. Образцовый профиль экспрессии включает уровень экспрессии (например, значение) для PDE4D7, которое можно нормализовать с использованием значения(й) для каждого из набора эталонных генов, такого как HPRT1, TUBA1B, PUM1 и/или TBP. В одном из вариантов осуществления единственным используемым маркерным геном является PDE4D7, а единственные используемые эталонные гены выбирают из группы, состоящей из HPRT1, TUBA1B, PUM1 и TBP, например, по меньшей мере один или по меньшей мере два или по меньшей мере три или все из этих эталонных генов.

В S106 определяют оценочную функцию для оценки прогностической оценки риска на основе профиля экспрессии гена для маркерного гена (PDE4D7), который получают для по меньшей мере некоторых биологических образцов, полученных для первого набора пациентов, и соответствующие результаты, получаемые при мониторинге.

В S108 у пациента (индивидуума) получают биологический образец. Пациент может быть новым пациентом или одним из первого набора.

В S110 получают профиль экспрессии гена для по меньшей мере одного маркерного гена (например, PDE4D7), например, посредством выполнения ПЦР на биологическом образце. Профиль экспрессии гена включает уровень экспрессии гена для варианта 7 фосфодиэстеразы 4D (PDE4D7) и для одного или нескольких эталонных генов. Подходящие эталонные гены включают HPRT1, TUBA1B, PUM1 и TBP. В одном из вариантов осуществления единственным используемым маркерным геном является PDE4D7, а единственные используемые эталонные гены выбирают из группы, состоящей из HPRT1, TUBA1B, PUM1 и TBP, например, по меньшей мере один или по меньшей мере два или по меньшей мере три или все из этих эталонных генов. Маркерные и эталонные гены являются теми же, которые используют в S104.

Другие эталонные гены, которые можно дополнительно или альтернативно использовать на стадиях S104 и S110, включают мРНК актина β Homo sapiens (ACTB); мРНК кислого 60S рибосомного фосфопротеина P0 Homo sapiens (RPLP0); полипептид A полимеразы (РНК) II (направленного на ДНК), 220 кДа (POLR2A); β-2-микроглобулин (B2M); и аминолевулинат-δ-синтазу (ALAS-1).

В S112 прогностическую оценку риска определяют для пациента на основе профиля экспрессии гена, используя полученную оценочную функцию.

В S114 пациента можно относить к одной из предварительно определяемого набора групп риска на основе прогностической оценки риска.

В S116 терапевтическую рекомендацию можно предоставлять, например, пациенту или его или ее опекуну, врачу или другому работнику здравоохранения, на основе группы риска пациента. Это может включать одно или несколько из a) предложения терапии для пациента на основе присваиваемой группы риска, причем по меньшей мере две из групп риска ассоциированы с различными терапиями, b) вычисления предсказания риска прогрессирования заболевания у пациента до или после хирургической операции на предстательной железе; и c) вычисления предсказания ответа на терапию у пациента до или после хирургической операции на предстательной железе. Примеры терапии включают по меньшей мере частичную простатэктомию, активную терапию, выбранную из лечения излучением, химиотерапии и их сочетания, и только наблюдения, т.е. без выполнения простатэктомии или активной терапии (т.е. активного наблюдения).

Способ заканчивается в S118.

Образцовая оценочная функция позволяет относить новых пациентов к соответствующей одной из набора групп риска, к которой отнесен первый набор пациентов, на основе результатов их мониторинга. Каждую из групп риска можно ассоциировать с соответствующей предлагаемой терапией, которая различается по ее агрессивности. Каждая предлагаемая терапия может быть основана на результатах пациентов из первого набора, которых относили к этой группе риска, и представляет собой ту, для которой предсказывают обеспечение наименее агрессивной терапии, которая не превышает пороговый клинический риск для развития злокачественной опухоли предстательной железы. В некоторых случаях это позволяет относить нового пациента к группе риска, ассоциированной с менее агрессивной предлагаемой терапией, чем было бы в случае других способов профилирования риска, например, с использованием индекса Глисона.

В одном из вариантов осуществления уровень экспрессии гена в S104, S110 определяют посредством обнаружения экспрессии мРНК с использованием одного или нескольких праймеров и/или зондов и/или одного или нескольких наборов из них.

В варианте способа, в S112 дополнительно определяют комбинированную прогностическую оценку риска для пациента на основе прогностической оценки риска и второго определения риска.

В S114 пациента можно относить к одной из предварительно определяемого набора групп риска на основе комбинированной прогностической оценки риска (а не на основе прогностической оценки риска).

Второе определение риска представляет собой определение риска, отличное от оценки риска PDE4D7 (прогностическая оценка риска), например, оно может быть основано на индексе Глисона. Предпочтительно второе определение риска представляет собой классификацию National Comprehensive Cancer Network (NCCN), такую как одно или несколько из очень низкого риска (VLR), низкого риска (LR), благоприятного промежуточного риска (FIR), неблагоприятного промежуточного риска (UIR) и высокого риска (HR). Комбинированную прогностическую оценку риска можно определять с использованием функции регрессии, получаемой у субъектов, у которых осуществляли мониторинг злокачественной опухоли предстательной железы. Дополнительный аспект относится к реализованному на компьютере способу диагностирования, мониторинга или прогнозирования злокачественной опухоли предстательной железы или стратификации риска прогрессирования злокачественной опухоли предстательной железы, который включает стадии способа, как описано на фиг. 1.

В контексте настоящей заявки выражение «реализованный на компьютере способ диагностирования, мониторинга или прогнозирования злокачественной опухоли предстательной железы или стратификации риска прогрессирования злокачественной опухоли предстательной железы» относится к способу, в котором алгоритмы программного обеспечения вычисляют оценку риска и на ее основе предоставляют прогноз для пациента, которого анализируют, где в этом способе используют исходные данные, получаемые при измерении уровня экспрессии гена для генов, упоминаемых в настоящем описании, и их преобразование в оценку риска с использованием уравнения, описанного далее.

Одну или несколько стадий способа, проиллюстрированного на фиг. 1, можно реализовать в компьютерном программном продукте, который можно исполнять на компьютере. Компьютерный программный продукт может содержать постоянную машиночитаемую среду для регистрации, в которой записывают (сохраняют) управляющую программу, такую как диск, жесткий диск или тому подобное. Обыкновенные формы постоянных машиночитаемых сред включают, например, гибкие диски, флоппи-диски, жесткие диски, магнитную ленту или любую другую магнитную запоминающую среду, CD-ROM, DVD или любую другую оптическую среду, RAM, PROM, EPROM, FLASH-EPROM или другой чип или картридж памяти или любую другую постоянную среду, которую компьютер может считывать и использовать.

Альтернативно, способ можно реализовать во временных средах, таких как передаваемая несущая волна, где управляющую программу реализуют в виде сигнала данных с использованием передающих сред, таких как акустические или световые волны, такие как те, которые генерируются в ходе радиоволновой и инфракрасной передачи данных, и т.п.

Образцовый способ можно реализовать в одном или нескольких компьютерах общего назначения, компьютера(ах) специального назначения, запрограммированном микропроцессоре или микроконтроллере и элементах периферических интегральных схем, ASIC или другой интегральной схеме, цифровом сигнальном процессоре, постоянной электронной или логической схеме, такой как схема на дискретных компонентах, программируемом логическом устройстве, таком как PLD, PLA, FPGA, CPU графической карты (GPU), или PAL, или тому подобное. В целом, проиллюстрировано любое устройство, способное реализовать машину конечных состояний, которая в свою очередь способна реализовать блок-схему, представленную на фиг. 1, можно использовать для реализации одной или нескольких стадий способа стратификации риска для выбора терапии для пациента со злокачественной опухолью предстательной железы. Следует принимать во внимание, что, хотя все стадии способа можно реализовать на компьютере, в некоторых вариантах осуществления одну или несколько стадий можно по меньшей мере частично выполнять вручную.

Компьютерные программные инструкции также можно загружать на компьютер, другой программируемый аппарат обработки данных или другие устройства, чтобы управлять серией рабочих стадий, подлежащих осуществлению, на компьютере, другом программируемом аппарате или других устройствах для получения реализованного на компьютере процессора так, что инструкции, которые исполняют на компьютере или другом программируемом аппарате, обеспечивают процессы для реализации функций/действий, точно определенных в настоящем описании.

Термины «определение уровня маркерного гена(ов) или GOI» или «определение уровня экспрессии гена» или «определение уровня экспрессии вариантов PDE4D» относится к определению присутствия или количества маркерного гена(ов) или GOI или продуктов экспрессии вариантов PDE4D. Термин «уровень маркерного гена(ов) или GOI», таким образом, обозначает присутствие или количество маркерного гена(ов) или продуктов экспрессии GOI, например, транскрипта(ов), и/или определение присутствия или количества маркерного гена(ов) или GOI. Определение присутствия или количества маркерного гена(ов) или продуктов экспрессии GOI можно выполнять с помощью любых средств, известных в данной области.

Определение присутствия или количества маркерного гена(ов) или продуктов экспрессии GOI можно выполнять посредством измерения нуклеиновой кислоты. Таким образом, уровень(ни) экспрессии можно определять с помощью способа, включающего обнаружение мРНК, кодируемой геном.

Например, измерение уровня нуклеиновой кислоты маркерного гена(ов) или экспрессии GOI можно оценивать посредством очистки молекул нуклеиновой кислоты (например, РНК или кДНК), получаемых из образца, после чего следует гибридизация со специфическими олигонуклеотидными зондами, как определено в настоящем описании выше. Сравнение уровней экспрессии можно выполнять визуально или с помощью подходящего устройства. Способы обнаружения мРНК или продуктов экспрессии известны специалисту в данной области.

Альтернативно, уровень нуклеиновой кислоты маркерного гена(ов) или экспрессии GOI можно обнаруживать в подходе с ДНК-чипом или микрочипом. Обычно нуклеиновые кислоты образца, получаемые у пациентов, подлежащих тестированию, обрабатывают и метят, например, флуоресцентной меткой. Впоследствии, такие молекулы нуклеиновой кислоты можно использовать в гибридизационном подходе с использованием иммобилизованных захватывающих зондов, соответствующих образцовым маркерным генам. Подходящие средства для осуществления микрочипового анализа известны специалисту в данной области.

В стандартной постановке, ДНК-чип или микрочип содержит иммобилизованные зонды высокой плотности для того, чтобы обнаруживать множество генов. Зонды на чипе комплементарны одной или нескольким частям последовательности маркерных генов. Обычно кДНК, продукты ПЦР и олигонуклеотиды можно использовать в качестве зондов.

Способ обнаружения на основе ДНК-чипа или микрочипа обычно включает следующие стадии: (1) выделение мРНК из образца и необязательное превращение мРНК в кДНК и впоследствии мечение этой РНК или кДНК. Способы выделения РНК, превращения ее в кДНК и мечения нуклеиновых кислот описаны в руководствах для микрочиповой технологии. (2) Гибридизация нуклеиновых кислот со стадии 1 с зондами для маркерных генов. Нуклеиновые кислоты из образца можно метить красителем, таким как флуоресцентные красители Cy3 (красный) или Cy5 (синий). Обычно контрольный образец метят другим красителем. (3) Обнаружение гибридизации нуклеиновых кислот из образца с зондами и определение, по меньшей мере качественное и более конкретно количественное, количеств мРНК в образце для исследуемых маркерных генов. Различие в уровне экспрессии между образцом и контролем можно оценивать на основе различия в интенсивности сигнала. Его можно измерять и анализировать посредством подходящего программного обеспечения, такого как, но не ограничиваясь этим, программное обеспечение, предоставляемое, например, Affymetrix.

Нет ограничений по числу зондов, соответствующих используемым маркерным генам, которые наносят на ДНК-чип. Также маркерный ген может быть представлен двумя или больше зондами, зонды гибридизуются с различными частями гена. Зонды разрабатывают для каждого выбранного маркерного гена. Такой зонд обычно представляет собой олигонуклеотид, содержащий 5-50 нуклеотидных остатков. Более длинную ДНК можно синтезировать с помощью ПЦР или химически. Способы синтеза таких олигонуклеотидов и их нанесения на подложку хорошо известны в области микрочипов. Гены, отличные от маркерных генов, также можно наносить на ДНК-чип. Например, зонд для гена, уровень экспрессии которого не значительно изменен, можно наносить на ДНК-чип для того, чтобы нормализовать результаты анализа или сравнивать результаты анализа для нескольких чипов или различных анализов.

В одном из вариантов осуществления уровень нуклеиновой кислоты маркерного гена(ов) или экспрессии GOI можно обнаруживать в подходе количественной RT-ПЦР, например, в подходе полимеразной цепной реакции (RT-qPCR) в реальном времени после обратной транскрипции транскриптов, представляющих интерес. Обычно, в качестве первой стадии, транскрипт подвергают обратной транскрипции в молекулу кДНК в соответствии с любым подходящим способом, известным специалисту в данной области. Подход количественной ПЦР или ПЦР в реальном времени впоследствии можно осуществлять на основе первой цепи ДНК, полученной, как описано выше.

В одном из вариантов осуществления зонды Taqman или с молекулярными маяками в качестве принципиальных зондов на основе FRET этого типа можно использовать для обнаружения в количественной ПЦР. В обоих случаях зонды служат в качестве внутренних зондов, которые используют в сочетании с парой противолежащих праймеров, которые фланкируют целевую область, представляющую интерес, например, набор олигонуклеотидов со специфичностью к маркерному гену(ам), как определено в настоящем описании выше. При амплификации целевого сегмента, зонд может избирательно связываться с продуктами в идентифицирующей последовательности между участками праймеров, тем самым вызывая увеличение FRET сигналов в связи с увеличением частоты мишеней.

Зонд Taqman, подлежащий использованию для подхода количественной ПЦР, может содержать специфический олигонуклеотид, как определено выше, приблизительно в 22-30 оснований, который метят на обоих концах FRET парой. Обычно, 5'-конец имеет флуорофор с меньшей длиной волны, такой как флуоресцеин (например, FAM), а 3'-конец обычно метят флуоресцентным гасителем с большей длиной волны (например, TAMRA) или соединением нефлуоресцентного гасителя (например, Black Hole Quencher). В одном из вариантов осуществления зонды, подлежащие использованию в количественной ПЦР, в частности, зонды, как определено в настоящем описании выше, не имеют гуанина (G) на 5'-конце смежно с репортерным красителем во избежание гашения флуоресценции репортера после разложения зонда.

В зонде с молекулярным маяком, подлежащим использованию в подходе количественной ПЦР, можно использовать FRET взаимодействия для того, чтобы обнаруживать и количественно определять продукт ПЦР, причем каждый зонд имеет 5'-конец с флуоресцентной меткой и 3’-конец, меченный гасителем. Эта конфигурация шпильки или стебель-петля в структуре зонда может содержат стебель с двумя короткими связывающими себя концами и петлю приблизительно в 20-30 оснований с длинной внутренней областью со специфичностью к мишени.

Альтернативные механизмы обнаружения, которые также можно использовать в контексте настоящего изобретения, относятся к зонду, изготовленному только из структуры петли и без короткой комплементарной области стебля. Альтернативный подход на основе FRET для количественной ПЦР, который также можно использовать, основан на использовании двух зондов для гибридизации, которые связываются со смежными участками на мишени, где первый зонд имеет метку флуоресцентного донора на 3'-конце и второй зонд имеет метку флуоресцентного акцептора на его 5'-конце.

В конкретном варианте осуществления уровень экспрессии гена определяют посредством способа на основе амплификации и/или микрочипового анализа и/или РНК секвенирования.

Образцовый профиль экспрессии гена представляет собой нормализованный профиль экспрессии гена, получаемый посредством нормализации уровня экспрессии по меньшей мере варианта PDE4D7 по экспрессии по меньшей мере одного эталонного гена.

Подробные описания эталонных генов, включая их ID транскриптов (NCBI RefSeq) и соответствующие аминокислотные последовательности для пары праймеров и зонда, приведены в таблице 3. Также в таблице 3 приведены, для каждого эталонного гена, смысловой праймер и антисмысловой праймер, а также последовательность зонда, который специфически связывается с ампликоном.

Таблица 3: образцовые последовательности нуклеиновой кислоты для праймеров и зондов

Название гена	Образцовая NCBI RefSeq	Номер доступа образцового белка	Смысловой праймер	Антисмысловой праймер	Последовательность зонда
PDE4D7	NM_001165899.1 (SEQ ID № 19)	NP_001159371.1 (SEQ ID № 20)	GAACATTCA ACGACCAAC CA (SEQ ID № 21)	TGCCATTGTC CACATCAAA A (SEQ ID № 22)	CTGCCGCTGA TTGCTATCAC TTCTGCA (SEQ ID № 23)
CGCTGATTGC TATCACTTCT GC (SEQ ID № 24)	GTCGTTGACT GTGGACAAA ATTTG (SEQ ID № 25)	TTCCCTTGGA TCCCATGACC AGCCCATAA GGGAA (SEQ ID № 26)
HPRT1	NM_000194.2 (SEQ ID № 34)	NP_000185.1 (SEQ ID № 35)	GAGGATTTG GAAAGGGTG TTTATT (SEQ ID № 36)	ACAGAGGGC TACAATGTG ATG (SEQ ID № 37)	ACGTCTTGCT CGAGATGTG ATGAAGG (SEQ ID № 38)
TUBA1B	NM_006082.2 (SEQ ID № 39)	NP_006073.2 (SEQ ID № 40)	TGACTCCTTC AACACCTTCT TC (SEQ ID № 41)	TGCCAGTGCGAACTTCAT (SEQ ID № 42)	CCGGGCTGT GTTTGTAGAC TTGGA (SEQ ID № 43)
PUM1	NM_001020658.1; (SEQ ID № 44) NM_014676.2 (SEQ ID № 45)	NP_001018494.1 (SEQ ID № 46); NP_055491.1 (SEQ ID № 47)	GCCAGCTTGT CTTCAATGA AAT (SEQ ID № 48)	CAAAGCCAG CTTCTGTTCA AG (SEQ ID № 49)	ATCCACCATG AGTTGGTAG GCAGC (SEQ ID № 50)
TBP	NM_003194.4 (SEQ ID № 51)	NP_003185.1 (SEQ ID № 52)	GCCAAGAAG AAAGTGAAC ATCAT (SEQ ID № 53)	ATAGGGATT CCGGGAGTC AT (SEQ ID № 54)	TCAGAACAA CAGCCTGCC ACCTTA (SEQ ID № 55)
ACTB	NM_001101.3 SEQ ID № 56)	NP_001092.1 (SEQ ID № 57)	CCAACCGCG AGAAGATGA (SEQ ID № 58)	CCAGAGGCG TACAGGGAT AG (SEQ ID № 59)	CCATGTACGT TGCTATCCAG GCT (SEQ ID № 60)
RPLP0	NM_001002.3 (SEQ ID № 61)	NP_444505.1/NP_000993.1 (SEQ ID № 62/63)	TAAACCCTG CGTGGCAAT (SEQ ID № 64)	ACATTTCGGA TAATCATCCA ATAGTTG (SEQ ID № 65)	AAGTAGTTG GACTTCCAG GTCGCC (SEQ ID № 66)
ALAS-1	NM_000688.5/NM_199166.2 (SEQ ID № 67/68)	NP_000679.1/NP_954635.1 (SEQ ID № 69/70)	AGCCACATC ATCCCTGT (SEQ ID № 71)	CGTAGATGTT ATGTCTGCTC AT (SEQ ID № 72)	TTTAGCAGCA TCTGCAACCC GC (SEQ ID № 73)

В конкретных вариантах осуществления прогностическая оценка риска основана на нормализованном профиле экспрессии гена, который содержит нормализованный уровень экспрессии по меньшей мере для PDE4D7. В некоторых вариантах осуществления ни один из вариантов PDE4D не используют в качестве эталонного гена. Другими словами, вариант(ы) PDE4D не используют в качестве эталонного гена для нормализации измеряемого уровня экспрессии. Результаты экспрессии можно нормализовать в соответствии с любым подходящим способом, известным специалисту в данной области. Обычно, такие тесты или соответствующую формулу, которые известны специалисту в данной области, следует использовать для того, чтобы стандартизовать данные об экспрессии, чтобы сделать возможной дифференцировку между реальными вариациями в уровнях экспрессии генов и вариациями, обусловленными процессами измерения. Для микрочипов можно использовать Robust Multi-array Average (RMA) в качестве подхода нормализации.

Нормализованные значения можно создавать посредством применения следующего:

N(Cq_{ген, представляющий интерес}) = Среднее(Cq_{эталонн. ген}) - (Cq_{ген, представляющий интерес}) (1)

где N(Cq_{ген, представляющий интерес}) представляет собой нормализованное значение экспрессии гена (цикл количественного определения, Cq) для выбранного гена, представляющего интерес;

Среднее(Cq_{эталонн. ген}) представляет собой арифметическое среднее для Cq значений ПЦР эталонного гена(в); и

Cq_{ген, представляющий интерес} представляет собой Cq значение ПЦР гена, представляющего интерес.

В конкретных вариантах осуществления уровень экспрессии вариантов PDE и эталонных генов определяли посредством ПЦР в реальном времени, как описано в R.H.D. «Human phosphodiesterase 4D7 (PDE4D7) expression is increased in TMPRSS2-ERG positive primary prostate cancer and independently adds to a reduced risk of post-surgical disease progression», Br J Cancer, 113, 1502-1511 (2015), включенном в настоящее описание (далее в настоящем описании « 2015»).

Со ссылкой на фиг. 2, в конкретных вариантах осуществления, когда уровни экспрессии PDE4D7 определены и нормализованы, прогностическую оценку риска можно определять посредством применения следующего:

Оценка риска PDE4D7 = (((PDE4D7_норм + A)*B)+1), (2)

Где «Оценка риска PDE4D7» представляет собой прогностическую оценку риска на основе профиля экспрессии гена в образце пациента, PDE4D7_норм представляет собой нормализованное значение экспрессии PDE4D7 (т.е., N(Cq_{ген, представляющий интерес})), а A и B представляют собой переменные.

В конкретных вариантах осуществления A может составлять приблизительно 6-8, например, 6,7167499999999, B может составлять 0,4-0,45, например, 0,420780231744713. Оценка риска PDE4D7, таким образом, может представлять собой значение между 1,0 и 5.0. Затем оценку риска PDE4D7 можно классифицировать или категоризировать по одной из по меньшей мере двух групп риска на основе оценки риска PDE4D7. Например, могут иметь место две группы риска, или три группы риска, или четыре группы риска, или больше чем четыре предварительно определяемых группы риска. Каждая группа риска охватывает соответствующий диапазон (непересекающихся) оценок риска PDE4D7. Например, группа риска может включать все оценки риска PDE4D7 от 1,0 до 2,0, другая группа риска от 2,0 до 3,0, другая группа риска от 3,0 до 4,0, другая группа риска от 4,0 до 5,0.

В некоторых вариантах осуществления предлагаемая терапия может быть основана на прогностической оценке риска и на втором определении риска. Например, второе определение риска может представлять собой индекс Глисона, определяемый посредством гистопатологии. См., например, Sperling, «Revisions of the Gleason grading system make it more accurate», Sperling Prostate Center, 2016. Второе определение риска также может представлять собой клинически определяемую стадию прогрессирования (значение cT), патологически определяемую стадию (значение pT), индекс Глисона биоптатов или группировку, патологический индекс Глисона или группировку, измерение специфического антигена простаты, измерение плотности специфического антигена простаты или их сочетание.

Второе определение риска может представлять собой комбинацию различных определений риска, отличных от оценки риска PDE4D7. Например, второе определение риска может представлять собой классификацию NCCN, например, одно из очень низкого риска (VLR), низкого риска (LR), благоприятного промежуточного риска (FIR), неблагоприятного промежуточного риска (UIR) и высокого риска (HR).

В конкретных вариантах осуществления предлагаемая терапия на основе присваиваемой группы риска PDE4D7 отличается от потенциальной предлагаемой терапии на основе только второго определения риска. То есть, предлагаемая терапия на основе присваиваемой группы риска PDE4D7 отличается от предлагаемой терапии на основе второго определения риска без группы риска PDE4D7.

В дополнительных вариантах осуществления определением группы риска PDE4D7 стратифицируют результаты и рекомендованные терапии на основе второго определения риска. Другими словами, оценка риска PDE4D7 может идентифицировать пациента как не требующего активного вмешательства (т.е. активного лечения), которого взамен можно помещать под активное наблюдение, тогда как отдельно второе определение риска будет указывать, что активное вмешательство необходимо. Альтернативно, оценка риска PDE4D7 позволяет идентифицировать пациента как требующего активного вмешательства вместо активного наблюдения, тогда как отдельно второе определение риска будет указывать, что активное вмешательство еще не было необходимым.

Дополнительный аспект относится к продукту, содержащему праймеры и/или зонды для определения уровня экспрессии по меньшей мере одного варианта фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), выбранного из группы, состоящей из PDE4D7, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 и PDE4D9, и дополнительно содержащему праймеры и/или зонды для определения уровня экспрессии гена для эталонного гена, выбранного из HPRT1, TUBA1B, PUM1, TBP и их сочетаний. В некоторых вариантах осуществления это обеспечивают с использованием композиции, содержащей набор молекул нуклеиновой кислоты, каждая содержит по меньшей мере одну последовательность олигонуклеотидного праймера и/или зонда для анализа экспрессии гена варианта(ов) PDE4D и по меньшей мере одну последовательность олигонуклеотидного праймера и/или зонда для анализа экспрессии гена для эталонных генов. В некоторых вариантах осуществления это обеспечивают с использованием чипа нуклеиновых кислот, содержащего один или несколько олигонуклеотидных зондов, комплементарных и гибридизуемых с кодирующей последовательностью варианта(ов) PDE4D, и один или несколько олигонуклеотидных зондов, комплементарных и гибридизуемых с эталонным геном(ами) для определения прогностической оценки риска, как определено в настоящем описании.

«Микрочип» представляет собой линейный или двухмерный массив дискретных областей, каждая имеет определенную площадь, образованную на поверхности обычно твердого носителя, такого как, но не ограничиваясь этим, стекло, пластмасса или синтетическая мембрана. Плотность дискретных областей не микрочипе определяют по общему числу иммобилизованных олигонуклеотидов, подлежащих обнаружению на поверхности одной твердофазной основы, например, по меньшей мере приблизительно 50/см², по меньшей мере приблизительно 100/см², по меньшей мере приблизительно 500/см², но меньше приблизительно 1000/см² в некоторых вариантах осуществления. Чипы могут содержать меньше чем приблизительно 500, приблизительно 1000, приблизительно 1500, приблизительно 2000, приблизительно 2500 или приблизительно 3000 иммобилизованных олигонуклеотидов в совокупности. Как используют в настоящем описании, ДНК микрочип представляет собой массив олигонуклеотидов или олигонуклеотидов, размещенных на чипе или других поверхностях, которые используют для гибридизации с амплифицированными или клонированными олигонуклеотидами из образца. Поскольку положение каждой конкретной группы олигонуклеотидов на чипе известно, отличительные черты олигонуклеотидов образца можно определять на основе их связывания с конкретным положением на микрочипе.

«Олигонуклеотид» представляет собой полимерную форму нуклеотидов, или рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Таким образом, этот термин включает двух- и одноцепочечную ДНК и РНК. Также он включает известные типы модификаций, в том числе метки, известные в данной области, метилирование, «кэпы», замены одного или нескольких встречаемых в природе нуклеотидов на аналог и межнуклеотидные модификации, такие как не заряженные связи (например, фосфотиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), а также немодифицированные формы олигонуклеотида.

Термин «амплифицировать» используют в широком смысле для обозначения, что создание продукта амплификации можно выполнять ферментативно с использованием ДНК или РНК полимераз. «Амплификация», как используют в настоящем описании, в целом относится к процессу получения нескольких копий желаемой последовательности, в частности, таковой из образца. «Несколько копий» обозначают по меньшей мере 2 копии. «Копия» не обязательно обозначает идеальную комплементарность или идентичность последовательностей относительно матричной последовательности. Возможно дополнительно использовать любой известный в данной области способ секвенирования для того, чтобы идентифицировать последовательности GOI.

Термин «соответствующий» может относиться, где это применимо, к молекуле нуклеиновой кислоты в качестве имеющей существенное количество идентичности последовательностей с другой молекулой нуклеиновой кислоты. Существенное количество обозначает по меньшей мере 95%, обычно по меньшей мере 98% и более обычно по меньшей мере 99%, и идентичность последовательностей определяют с использованием алгоритма BLAST, как описано в Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, (1990) (с использованием опубликованных настроек по умолчанию, т.е. параметров w=4, t=17). Способы амплификации мРНК в целом известны в данной области и включают ПЦР с обратной транскрипцией (RT-ПЦР) и то, что описано в U.S. 6,794,141, а также PCT/US 1/50340. Другой способ, который можно использовать, представляет собой количественную ПЦР (или Q-ПЦР). Альтернативно, РНК можно непосредственно метить как соответствующую кДНК известными в данной области способами.

Полагаясь на идентификацию генов (или экспрессированных последовательностей) с повышенной или пониженной экспрессией, один из вариантов осуществления включает определение экспрессии посредством гибридизации мРНК или ее амплифицированной или клонированной версии (такой как ДНК или кДНК) в клетке образца с олигонуклеотидом, который уникален для конкретной генной последовательности. Олигонуклеотиды этого типа могут содержать по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 22, по меньшей мере приблизительно 24, по меньшей мере приблизительно 26, по меньшей мере приблизительно 28, по меньшей мере приблизительно 30 или по меньшей мере приблизительно 32 последовательных пар оснований генной последовательности, которая не встречается в других генных последовательностях. Термин «приблизительно», как используют в предыдущем предложении, относится к увеличению или уменьшению на 1 относитлеьно заявленного числового значения. В других вариантах осуществления можно использовать олигонуклеотиды по меньшей мере или приблизительно 50, по меньшей мере или приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно или 150, по меньшей мере или приблизительно 200, по меньшей мере или приблизительно 250, по меньшей мере или приблизительно 300, по меньшей мере или приблизительно 350, или по меньшей мере или приблизительно 400 пар оснований генной последовательности, которая не встречается в других генных последовательностях. Термин «приблизительно», как используют в предшествующем предложении, относится к увеличению или уменьшению на 10% относительно заявленного числового значения. Такие олигонуклеотиды также можно обозначать как олигонуклеотидные зонды, которые способны к гибридизации с последовательностями генов или их уникальными частями, которые описаны в настоящем описании. Во многих случаях условия гибридизации представляют собой строгие условия приблизительно от 30% об./об. приблизительно до 50% формамида и приблизительно от 0,01 M приблизительно до 0,15 M соли для гибридизации и приблизительно от 0,01 M приблизительно до 0,15 M для условий промывания при приблизительно от 55 приблизительно до 65°C или выше, или условия, эквивалентные этому.

В других вариантах осуществления олигонуклеотидные зонды, которые можно использовать в настоящем описании, могут иметь приблизительно или 95%, приблизительно или 96%, приблизительно или 97%, приблизительно или 98%, или приблизительно или 99% идентичность с последовательностями маркерных генов, экспрессию которых следует определять. Идентичность определяют с использованием алгоритма BLAST, как описано выше. Эти зонды также можно описывать на основе способности к гибридизации с экспрессируемыми маркерными генами, используемыми в образцовом способе, при строгих условиях, как описано выше, или условиях, эквивалентных им.

Во многих случаях последовательностями являются таковые мРНК, кодируемые маркерными генами, соответствующие кДНК для таких мРНК и/или амплифицированные версии таких последовательностей. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотидные зонды иммобилизуют на чипе, других устройствах или в индивидуальных пятнах, которые локализуют зонды.

Подходящие метки, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают радиоизотопы, нуклеотидные хромофоры, ферменты, субстраты, флуоресцентные молекулы, хемилюминесцентные фрагменты, магнитные частицы, биолюминесцентные фрагменты и т.п. По существу, метка представляет собой любую композицию, поддающуюся обнаружению спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Термин «основа» относится к стандартным основам, таким как бусы, частицы, полоски, волокна, фильтры, мембраны и силановые или силикатные основы, такие как стеклянные пластины.

В некоторых вариантах осуществления продукт предоставляют в виде набора, используемого для того, чтобы определять оценку риска у субъекта с локализованной злокачественной опухолью предстательной железы, который содержит a) по меньшей мере один праймер и/или зонд для определения уровня экспрессии по меньшей мере одного варианта фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), где по меньшей мере один вариант PDE4D включает PDE4D7, b) по меньшей мере один праймер и/или зонд для определения уровня экспрессии гена у по меньшей мере одного эталонного гена, и c) инструкции для вычисления оценки риска на основе определяемых экспрессий, например, на бумаге или диске.

Диагностический набор может содержать одно или несколько средств, допускающих специфическое обнаружение маркерного гена(ов) или GOI, как определено в настоящем описании выше. Средства или ингредиенты диагностического набора могут содержаться в одном или нескольких контейнерах или отдельных объектах. Свойства средств определяют с помощью способа обнаружения, для которого предусмотрен набор.

Кроме того, набор может содержать определенное количество известной молекулы нуклеиновой кислоты, которую можно использовать для калибровки набора или в качестве внутреннего контроля. Обычно диагностический набор для обнаружения маркерного гена(ов) или продуктов экспрессии GOI может содержать вспомогательные ингредиенты, такие как ПЦР буферы, dNTP, полимераза, ионы, такие как двухвалентные катионы или одновалентные катионы, растворы для гибридизации и т.д. Такие ингредиенты известны специалисту в данной области и могут варьировать в зависимости от осуществляемого способа обнаружения. Дополнительно, набор может содержать листок с инструкциями и/или может предоставлять информацию о важности получаемых результатов.

Дополнительный аспект относится к системе, содержащей описанные выше продукты и/или наборы и описанные выше компьютерные программные продукты. В конкретных вариантах осуществления системы, описанные выше продукты и/или наборы, а также описанные выше компьютерные программные продукты можно использовать при лечении злокачественной опухоли предстательной железы.

Без намерения ограничивать объем образцового варианта осуществления, следующие примеры иллюстрируют аспекты способа.

ПРИМЕРЫ

Выбор генов и образцы когорты, используемые для построения оценки риска PDE4D7 для злокачественной опухоли предстательной железы

Для того чтобы выбирать гены-кандидаты для построения оценки риска PDE4D7, экспрессию PDE4D7 исследовали в когорте из более 500 пациентов и проводили сравнение с продольными клинически и биологически релевантными исходами пациентов после первичного лечения. Небольшой биоптат (приблизительно 1 миллиметр на 2 миллиметра) ткани брали из репрезентативной области опухоли из иссеченной предстательной железы у 550 пациентов, которых ранее оперировали между 2000 и 2004 годами. Эта когорта пациентов представляла смесь всех клинических групп риска в соответствии с определением, например, в руководствах американской NCCN по злокачественной опухоли предстательной железы. После удаления образцов, которые не отвечали предварительно определяемым критериям качества для количественного определения биомаркеров посредством qPCR и удаления пациента, который проходил адъювантную гормональную терапию после хирургической операции, к анализу допускали образцы всего 503 пациентов, как видно в таблице 4.

Таблица 4: демография исследуемой когорты пациентов

Хирургическая операция: 2000-2004 гг.	Параметр	Общая когорта (503)
Клинический диапазон (медиана; IQR)	Возраст	41,3-74,5 (62,6; 7,4)
	PSA до операции	0,18-73,16 (6,7; 5,5)
	Процент опухолей в биоптатах	0,2-79,7 (10,3; 16,0)
	Объем предстательной железы	9-148 (42; 22,5)
Плотность PSA	0,18-73,2 (6,7; 5,5)
Категория риска NCCN, число пациентов (процентная доля)	Очень низкий риск	67
	Низкий риск	144
	Благоприятный промежуточный риск	128
	Неблагоприятный промежуточный риск	120
Высокий риск	44
Патология до хирургической операции, число пациентов (процентная доля)	Биопсия по Глисону 3+3 (GG1)	316 (62,8%)
	Биопсия по Глисону 3+4 (GG2)	149 (29,6%)
	Биопсия по Глисону 4+3 (GG3)	25 (5,0%)
	Биопсия по Глисону ≥4+4 (≥GG4)	13 (2,6%)
	cT1	342 (68%)
	cT2	150 (29,8%)
cT3	11 (2,2%)
Патология после хирургической операции, число пациентов (процентная доля)	Патология по Глисону 3+3 (GG1)	201 (40%)
	Патология по Глисону 3+4 (GG2)	257 (51,1%)
	Патология по Глисону 4+3 (GG3)	41 (8,2%)
	Патология по Глисону >=4+4 (≥GG4)	4 (0,8%)
	pT1	0 (0%)
	pT2	331 (65,8%)
	pT ≥ 3	172 (34,2%)
	Положительные хирургические края	120 (23,9%)
	Положительная инвазия в семенные пузырьки	60 (11,9%)
Положительная инвазия в лимфатические узлы	5 (1%)
Наблюдение, месяцы	Среднее	110,4
IQR медиана	120,7
Исход, процентная доля	<5y BCR	20,6%
	<10y BCR	38,6%
	<5y CR	1,1%
<10y CR	4,3%
Спасительное лечение, процентная доля	<5y SRT	11,8%
	<10y SRT	25,9%
	<5y SADT	6,1%
<10y SADT	17,3%
Смертность, процентная доля	<5y PCSM	1,1%
	<10y PCSM	3,3%
	<5y OM	3,8%
<10y OM	11,5%

Представлены минимальные и максимальные значения в когорте для возраста пациента, PSA до операции, процентной доли опухолей в биоптатах, объема предстательной железы и плотности PSA, при этом медиана и IQR значения приведены в круглых скобках. Для категорий риска NCCN представлено число пациентов на группу риска. В случае дохирургической патологии указаны группы степени по Глисону для биоптатов, а также клинические стадии (по численной процентной доле пациентов). Патология после хирургической операции представлена группами степени по Глисону для патологии, стадиями патологии, состоянием хирургического края после простатэктомии, состоянием опухолевой инвазии в семенные пузырьки и тазовые лимфатические узлы (по численной процентной доле пациентов).

Наблюдение показывает средние и медианные периоды наблюдения в месяцах после хирургической операции для всех пациентов. Категория исхода иллюстрирует кумулятивный 5- и 10-летний биохимический рецидив (BCR) и клинический рецидив до метастазов (CR) после первичного лечения. В лечении перечислены 5- и 10-летний старт до спасительной лучевой терапии (SRT) или спасительной терапии с андрогенной депривацией (SADT) после хирургической операции. Смертность приведена в виде специфической смертности от злокачественной опухоли предстательной железы (PCSM), а также общей смертности (OM).

Лабораторные способы

Праймеры и зонды, используемые для количественной ПЦР в реальном времени для того, чтобы измерять гены, представляющие интерес, а также эталонные гены, представляют собой то, что описано в таблице 3. Все способы молекулярной биологии, используемые в настоящем описании, описаны ранее в 2015.

Анализ данных и статистика

Чтобы сделать возможным сравнение данных qPCR среди различных экспериментов, значение Cq для PDE4D7 нормализуют по среднему для значений Cq для эталонных генов, чтобы получать нормализованное значение экспрессии PDE4D7 в соответствии с ур. (1), где используют эталонные гены HPRT1, TUBA1B, PUM1 и TBP.

Для того чтобы определять корреляцию PDE4D7 с клиническими исходами, нормализованную экспрессию PDE4D7 преобразовывали в оценку риска PDE4D7 посредством линейного преобразования (ур. 2), как видно на фиг. 2.

Затем категории риска PDE4D7 определяли посредством слияния всех оценок риска PDE4D7 между 1 и 2, между 2 и 3, между 3 и 4 и между 4 и 5.

Затем категории риска PDE4D7 тестировали с различными доступными биологическими и связанными с лечением исходами. Для статистического анализа использовали пакет программного обеспечения MedCalc (MedCalc Software BVBA, Ostend, Belgium).

Результаты

Со ссылкой на таблицу 5, дифференциальную экспрессию для оценки риска PDE4D7 оценивали в подгруппе из когорты пациентов, охватывающей 446 и 347 пациентов с полным 5-летним и 10-летним наблюдением на предмет биохимического рецидива после хирургической операции, соответственно. Для сравнения две дополнительные прогностические оценки риска определяли на основе двух других транскриптов PDE4D, PDE4D5 и PDE4D9, которые, как известно, также экспрессируются в предстательной железе.

Таблица 5: результаты U-критерия Манна-Уитни, который выполняли для определения дифференциальной экспрессии PDE4D5, PDE4D7 и PDE4D9 в субкогорте пациентов с полным исходом и наблюдением в течение 5 лет (446 пациентов) или 10 лет после хирургической операции (347 пациентов)

U-критерий Манна-Уитни	Оценка PDE4D5 (p-значение)	Оценка PDE4D7 (p-значение)	Оценка PDE4D9 (p-значение)
5-летний BCR (446/92; 18,9%)	6,30 e-02	3,42 e-06	6,80 e-01
10-летний BCR (347/134; 38,6%)	5,50 e-01	2,34 e-06	9,80 e-01
-PSUPG (300) в сравнении с +PSUPG (146)	1,20 e-01	7,30 e-01	6,30 e-03

Как видно в таблице 5, между пациентами с или без 5- или 10-летнего биохимического рецидива оценка риска PDE4D7 выражена значительно различно; однако ни PDE4D5 ни PDE4D9 не позволяли проводить различия между этими двумя поднаборами когорты пациентов. Это демонстрирует уникальную способность оценки риска PDE4D7 проводить различия между клиническими исходами.

Со ссылкой на таблицу 6 и фиг. 3, одномерный и многомерный регрессионные анализы Кокса демонстрируют очень значимую корреляцию непрерывной оценки риска PDE4D7 и времени до биохимического рецидива (BCR) после хирургической операции (HR = 0,5; 95% CI = 0,4-0,7; p = 2,5E-07). Кроме того, при корректировке по известным прогностическим клиническим параметрам после хирургической операции, PDE4D7 продолжала вносить значимое независимое значение в регрессионную модель (HR = 0,5; 95% CI = 0,4-0,7; p = 9,7E-06). При использовании группы наименьшего риска PDE4D7 (т.е. PDE4D7 (1-2)) в качеств эталона, категории риска PDE4D7 с более высокими уровнями экспрессии PDE4D7 демонстрировали сильное снижение риска биохимического рецидива с течением времени в многопараметрическом анализе по сравнению с эталонной категорией риска PDE4D7 (PDE4D7 (4-5): HR = 0,1; 95% CI = 0,1-0,5; p = 1,4E-04; PDE4D7 (3-4): HR = 0,3; 95% CI = 0,1-0,8; p = 1,4E-02).

Таблица 6: одно- и многопараметрический регрессионный анализ Кокса для непрерывной и категоризированной оценки риска PDE4D7 в полной когорте пациентов (503 пациента), с клинической конечной точкой биохимического рецидива, где оценку риска PDE4D7 корректировали по клиническим параметрам после хирургической операции в многопараметрическом анализе

Клинические параметры после хирургической операции	Одномерный (вход)	Многомерный (вход)
BCR конечной точки (503/144; 28,6%)	p-значение	HR	95% CI при HR	p-значение	HR	95% CI при HR
Патологический индекс Глисона 3+3 N=201, эталон
Патологический индекс Глисона 3+4 (N=257)	1,10 e-03	1,96	1,31-2,93	4,16 e-01	1,20	0,77-1,87
Патологический индекс Глисона 4+3 (N=41)	<1,0 e-14	8,28	5,02-13,6	6,3 e-06	3,6	2,06-6,28
Патологический индекс Глисона ≥4+4 (N=4)	1,02 e-09	26,4	9,22-75,4	3,54 e-07	18,6	6,03-57,1
Стадия патологии pT2 (N=331); эталон
Стадия патологии pT3 (N=172)	<1,0 e-14	4,18	2,97-5,86	2,10 e-04	2,26	1,46-3,47
Состояние хирургического края (SMS)	2,92 e-08	2,59	1,84-3,62	1,42 e-04	1,98	1,39-2,82
Инвазия в семенные пузырьки (SVI)	<1,0 e-14	4,43	3,08-6,36	8,10 e-03	1,78	1,16-2,72
Оценка риска PDE4D7 (непрерывная)	2,46 e-07	0,52	0,41-0,67	9,68 e-06	0,55	0,42-0,72
Риск PDE4D7 (1-2) (N=11); эталон
Риск PDE4D7 (2-3) (N=117)	3,50 e-01	0,67	0,29-1,56	1,24 e-01	0,51	0,21-1,20
Риск PDE4D7 (3-4) (N=290)	1,63 e-02	0,36	0,16-0,83	1,40 e-02	0,35	0,15-0,80
Риск PDE4D7 (4-5) (N=85)	5,64 e-04	0,18	0,07-0,47	1,41 e-04	0,14	0,04-0,38

Это подтверждают с помощью анализа Каплана-Мейера, который выполняли на категориях риска PDE4D7 с использованием времени до рецидива PSA в качестве клинической конечной точки, как видно на фиг. 4. Категория наивысшего риска PDE4D7 включает мужчин с меньше чем 5% вероятностью 5-летнего BCR, тогда как шанс перенести рецидив PSA возрастает до больше чем 50% в группе пациентов с наименьшими уровнями оценки риска PDE4D7. Стоит отметить, что все события BCR в когорте пациентов с наименьшими оценками риска PDE4D7 происходят в пределах приблизительно 3,5 года после хирургической операции, при этом после этого периода времени дальнейшее событие отсутствует.

Со ссылкой на таблицу 7 и фиг. 5, определяли независимое значение оценки риска PDE4D7 в многомерном анализе, при такой же корректировке по известным прогностическим дохирургическим клиническим параметрам. Как можно видеть, в сравнении с многомерным анализом с дохирургическими клиническими данными для непрерывной оценки риска PDE4D7, наблюдали схожие результаты.

Таблица 7: одно- и многопараметрический регрессионный анализ Кокса непрерывной и категоризированной оценки риска PDE4D7 в полной когорте пациентов (503 пациента), с клинической конечной точкой биохимического рецидива, где оценку риска PDE4D7 корректировали по дохирургическим клиническим параметрам в многопараметрическом анализе

Дохирургические клинические параметры	Одномерный (вход)	Многомерный (вход)
BCR конечной точки (503/144; 28,6%)	p-значения	HR	95% CI при HR	p-значение	HR	95% CI при HR
Возраст при хирургической операции	8,01 e-1	1,00	0,97-1,03	N/A	N/A	N/A
PSA до операции	1,99 e-04	1,02	1,01-1,03	1,88 e-04	1,03	1,01-1,04
Индекс Глисона биоптатов 3+3 N=316, эталон
Индекс Глисона биоптатов 3+4 (N=149)	1,30 e-03	1,82	1,26-2,63	4,43 e-02	1,49	1,01-2,21
Индекс Глисона биоптатов 4+3 (N=25)	4,60 e-08	4,60	2,66-7,95	3,02 e-05	3,45	1,92-6,17
Индекс Глисона биоптатов ≥4+4 (N=13)	4,04 e-13	10,9	5,7-20,7	9,93 e-12	11,1	5,54-22,1
% положительных фокусов биопсии	1,25 e-06	4,51	2,45-8,3	5,48 e-02	2,41	0,98-5,92
% опухолей в биопсии	7,03 e-12	1,03	1,02-1,04	7,80 e-03	1,02	1,00-1,03
Клиническая стадия cT1c (N=342); эталон
Клиническая стадия cT2 и cT3 (N=161)	5,26 e-05	1,97	1,41-2,74	2,20 e-01	1,25	0,87-1,8
Оценка риска PDE4D7 (непрерывная)	2,46 e-07	0,52	0,41-0,67	5,40 e-08	0,49	0,37-0,63
Риск PDE4D7 (1-2) (N=11); эталон
Риск PDE4D7 (2-3) (N=117)	3,50 e-01	0,67	0,28-1,55	1,49 e-01	0,53	0,22-1,25
Риск PDE4D7 (3-4) (N=290)	1,63 e-02	0,36	0,15-0,82	5,80 e-03	0,30	0,13-0,70
Риск PDE4D7 (4-5) (N=85)	5,64 e-04	0,18	0,06-0,47	1,62 e-04	0,15	0,05-0,40

Со ссылкой на таблицу 8 и фиг. 6, показана корреляция непрерывной оценки риска PDE4D7 в одномерном анализе со временем до клинических конечных точек после хирургической операции, отличных от биохимического рецидива, причем конечные точки включают: старт до спасительной лучевой терапии (SRT); старт до спасительной терапии с андрогенной депривацией (SADT); клинический рецидив (CR); специфическую смертность от злокачественной опухоли предстательной железы (PCSM); и общую смертность (OM). Как можно видеть, PDE4D7 значительно отрицательно коррелирует с моментом времени всех конечных точек с отношением рисков между 0,2 и 0,5. Кроме того, вероятность перенести серьезную клиническую конечную точку, такую как метастазы (CR) или смерть из-за злокачественной опухоли предстательной железы (PCSM), возрастает, в частности, со снижением уровней PDE4D7. Кроме того, похоже, что оценка риска PDE4D7 имеет значимую корреляцию с общей выживаемостью.

Таблица 8: непрерывная оценка риска PDE4D7 в одномерном анализе со временем до клинических конечных точек после хирургической операции

Одномерный анализ	Одномерный (вход)
Многопараметрические конечные точки	p-значение	HR	95% CI при HR
PDE4D7 (BCR; 503/144; 28,6%)	2,46 e-07	0,52	0,41-0,67
PDE4D7 (SRT; 503/90; 17,9%)	1,10 e-04	0,55	0,40-0,74
PDE4D7 (ADT; 503/162; 12,3%)	2,40 e-03	0,56	0,38-0,81
PDE4D7 (CR; 503/22; 4,4%)	1,10 e-03	0,37	0,20-0,66
PDE4D7 (PCSS; 503/12; 2,4%)	3,94 e-05	0,20	0,09-0,43
PDE4D7 (OS; 503/52; 10,3%)	9,01 e-07	0,38	0,25-0,55

Таким образом, как можно видеть на фиг. 3, 5 и 6, не только экспрессия PDE4D7 в ткани опухоли имеет значимую отрицательную корреляцию с биологическими исходами, такими как BCR, показано, что эта отрицательная корреляция предоставляет независимое значение в многомерном моделировании при корректировке по диапазону известных прогностических клинических параметров до и после хирургической операции. Кроме того, уровни экспрессии PDE4D7 также позволяют предсказывать другие клинические конечные точки, такие как старт спасительного лечения, а также конечные точки, связанные с прогрессированием заболевания и специфической смертностью от злокачественной опухоли.

Стратификация - анализ оценки риска PDE4D7 в клинически определенных группах риска

Со ссылкой на фиг. 7-10, проиллюстрировано добавленное значение оценки риска PDE4D7 поверх клинически определяемых групп риска, как показано на примере определений групп риска из руководства NCCN по злокачественной опухоли предстательной железы. Четыре определенных группы риска PDE4D7 сравнивают с группами риска NCCN для: 5-летнего шанса перенести конечную точку биохимического рецидива (BCR) после хирургической операции (фиг. 7); 10-летнего шанса достигнуть конечной точки клинического рецидива (CR) (фиг. 8); 10-летнего шанса достигнуть конечной точки специфической смертности от злокачественной опухоли предстательной железы (CSM) (фиг. 9); и 10-летнего шанса достигнуть конечной точки общей смертности (OM) (фиг. 10). Включены группы риска NCCN: (1) группа очень низкого и низкого риска (VL и LR); (2) группа благоприятного промежуточного риска (FIR); (3) группа неблагоприятного промежуточного риска (UIR); и (4) группа высокого риска (HR). Эти группы риска NCCN сравнивали, соответственно, с четырьмя группами риска PDE4D7, включая: (1) PDE4D7 (4-5); (2) PDE4D7 (3-4); (3) PDE4D7 (2-3); и (4) PDE4D7 (1-2).

Как можно видеть на фиг. 7-10, хотя группа возрастающего риска вносит вклад в увеличенную вероятность достижения одной из исследуемых конечных точек, распределение рисков по схемам низких рисков отличается среди четырех категорий риска, соответственно. В частности, это показано на фиг. 9 и 10, где увеличение риска среди групп риска NCCN является очень линейным и увеличение наклона не является очень крутым. В отличие от этого, имеет место небольшой 10-летний риск смерти, связанной с метастазами или злокачественной опухолью предстательной железы, в двух категориях наивысшего риска PDE4D7 (3-4 и 4-5), тогда как увеличение наклона в группах с более низкими оценками риска PDE4D7 (2-3 и 1-2) значительно возрастает до достижения конечного уровня риска 25% в категории наименьшего риска PDE4D7 по сравнению с 10-15% в группе высокого риска NCCN.

Эти различия между группами риска NCCN и группами риска PDE4D7 могут помочь стратифицировать пациентов с диагнозом злокачественной опухоли предстательной железы, например, на пациентов, у которых можно отсрочить незамедлительное активное вмешательство и взамен лечить с активным наблюдением, и пациентов, которых не следует лечить с использованием активной интервенционной терапии. Другими словами, оценка риска PDE4D7 и группы риска могут помогать поставщикам медицинских услуг рекомендовать пациенту другие или альтернативные терапии на основе дополнительной информации, предоставляемой посредством оценки риска PDE4D7. То есть, оценка риска PDE4D7 может помогать поставщикам медицинских услуг рекомендовать пациенту перейти под активное наблюдение вместо того, чтобы проходить активную интервенционную терапию, поскольку, на основе PDE4D7, риск пациента перенести одну или несколько конкретных клинических конечных точек мал или ниже конкретного порога, даже когда пациента классифицируют в качестве имеющего более высокий риск в соответствии с другими клиническими метриками.

Со ссылкой на фиг. 11, проиллюстрирован шанс 5-летнего BCR среди всех комбинаций четырех групп риска NCCN в сравнении со всеми категориями риска PDE4D7. Как ожидают из предыдущего анализа, группы пациентов, представляющие категории наивысшего риска PDE4D7 (4-5), имеют меньший шанс перенести один из измеряемых продольных исходов по сравнению с клинической группой очень низкого и низкого риска NCCN, и наоборот для когорты пациентов с наименьшим риском PDE4D7 (1-2) по сравнению с группой клинически высокого риска NCCN. Стоит отметить, имеет место когорта мужчин, которую определяют по высоким уровням экспрессии PDE4D7 в их опухолях, которые имеют >50% меньший риск BCR в течение 5 лет после хирургической операции по сравнению с группой клинически очень низкого и низкого риска (4,2% в сравнении с 9,5%, соответственно). Это все еще является случаем, когда учитывают только группу клинически очень низкого риска (4,2% в сравнении с 6,6%, соответственно; не показано). Кроме того, эта когорта с высокой экспрессией PDE4D7 состоит из мужчин из всех групп клинического риска, включая группу неблагоприятного промежуточного и высокого риска.

Таким образом, как можно видеть на фиг. 11, оценку риска PDE4D7 можно использовать в комбинации со вторым определением риска, таким как группа риска NCCN, для того, чтобы определять рекомендованную или предлагаемую терапию или лечение. Кроме того, дополнительная информация об оценке риска PDE4D7 может помогать стратифицировать пациентов для того, чтобы предоставлять другие, альтернативные или более подходящие лечения. Например, как видно на фиг. 17, есть 148 пациентов, отнесенных к группам UIR (неблагоприятного промежуточного) и HR (высокого) риска NCCN. На основе только этого анализа, этих пациентов можно выбирать для незамедлительного активного вмешательства, поскольку имеет место 34,4% и 46,5% шанс 5-летнего BCR. Однако с учетом оценки риска PDE4D7 этих пациентов можно стратифицировать таким образом, который дифференцирует между их фактическим риском 5-летнего BCR. Как результат, 14 пациентов с 14,3% шансом 5-летнего BCR, 10 пациентов с 10% шансом 5-летнего BCR и даже 59 пациентов с 28.8% шансом 5-летнего BCR могут взамен выбирать активное наблюдение вместо активной интервенционной терапии, тем самым отсрочивая многие серьезные побочные эффекты активной интервенционной терапии и повышая качество жизни этих пациентов. Другими словами, поставщик медицинских услуг может рекомендовать этим 24 или 83 пациентам проходить активное наблюдение вместо активного вмешательства даже несмотря на то, что группа риска NCCN будет указывать на то, что они должны проходить некоторое активное интервенционное лечение.

Со ссылкой на фиг. 12-15, влияние индекса Глисона биоптатов в сравнении с категорией риска PDE4D7 в подгруппах клинического риска с очень низким и низким риском (VL и LR), благоприятным промежуточным риском (FIR) и неблагоприятным промежуточным риском и высоким риском (UI и HR) измеряли посредством анализа выживаемости Каплана-Мейера для времени до биохимического и клинического рецидива. В случае группы VL и L риска (не показано) отсутствовало значимое влияние категорий риска PDE4D7 на стратификацию субкогорты пациентов дополнительно в различные группы риска. Это может показывать, что общий риск в этой группе уже очень низок и, следовательно, трудно проводить дальнейшую субстратификацию этой когорты пациентов. Другими словами, группа клинически низкого риска (PSA < 10 нг/мл, биопсия по Глисону ≤ 3+3; cT ≤ T2) представляет собой отдельную группу с небольшими геномными изменениями, которые таят небольшой риск агрессивности будущего заболевания и которые отражены в <10% шансе 5-летнего биохимического рецидива, <1% шансе 10-летнего прогрессирования до метастазов и отсутствии риска специфической смертности от злокачественной опухоли предстательной железы в течение 10 лет после первичного лечения.

Однако, как видно на фиг. 12 и 13, при анализе группы благоприятного промежуточного риска очевидно, что биопсия по Глисону не дает дополнительной значительной стратификации рисков в этой группе (фиг. 12, p = 0,19), тогда как категории риска PDE4D7 четко определяют различные поднаборы пациентов с различными продольными профилями риска (фиг. 13, p = 0,01).

Аналогичным образом, как видно на фиг. 14, анализ пациентов с неблагоприятным промежуточным риском и высоким риском показывает, что, несмотря на то, что индекс Глисона биоптатов стратифицирует пациентов по различиям в исходах клинических рецидивов, этот параметр главным образом указывает на мужчин с высоким риском биохимического рецидива после хирургической операции. В частности, это верно для небольшой группы мужчин с индексом Глисона биоптатов 4+4.

В отличие от этого, со ссылкой на фиг. 15, категории риска PDE4D7 субстратифицируют пациентов на две группы риска с наивысшими оценками PDE4D7 (3-5) с очень небольшим риском клинического рецидива в течение 10 лет после хирургической операции (только 1 событие у 114 пациентов; 0,9%). С другой стороны, события в категории наименьшего риска PDE4D7 (2 из 6) наступают в пределах 20 месяцев после хирургической операции, что указывает не только на высокий риск рецидива в этой группе пациентов (33,3%), но также быстрый рецидив после хирургической операции, в случае возникновения рецидива.

Таким образом, количественное определение PDE4D7 при оценке риска для пациентов со злокачественной опухолью предстательной железы добавляет независимое и комплементарное значение в стратификацию риска популяций, определяемых по клиническим параметрам. В частности, высокие уровни экспрессии PDE4D7 могут быть способны предоставлять дополнительное подкрепление решения для того, чтобы выбирать пациентов с более низким риском, по сравнению с только клинической информацией среди всех клинических групп риска. Одновременно низкая экспрессия PDE4D7 может вносить вклад в повторную стратификацию пациентов с очень высоким риском быстрой декомпенсации в конечных точках, таких как рецидив PSA. Кроме того, оценка риска PDE4D7, которую определяют как раскрыто в настоящем описании, позволяет субстратифицировать пациентов по различными рискам выживаемости без прогрессирования, что невозможно с использованием других определений риска.

Комбинация оценки риска PDE4D7 со вторым определением риска

Данные, представленные в этом описании, показывают, что риск прогрессирования заболевания, предоставляемый с помощью оценки риска PDE4D7, дает новое понимание субпопуляций злокачественной опухоли предстательной железы и, таким образом, должен быть комплементарен рискам, предоставляемым с помощью критериев существующей клинической практики (второе определение риска). Следовательно, выдвинута гипотеза о том, что комбинация обеих оценок риска с помощью вычислительного моделирования позволит предсказывать долгосрочные исходя заболевания более эффективно по сравнению с использованием любой одной оценки отдельно. Для того чтобы оценивать эту гипотезу, выбирали субкогорту из 449 пациентов (92 события; 20,5%) с полным анамнезом 5-летних исходов и создавали логистическую регрессионную модель для того, чтобы предсказывать 5-летний риск биохимического рецидива после хирургической операции. Моделирование подтверждало независимое предсказательное значение оценки риска PDE4D7 (отношение шансов = 0,42; 95% CI = 0,28-0,63; p <1,0E-04; таблица 3). Для того чтобы предсказывать индивидуальный 5-летний риск прогрессирования (BCR) для всех 449 пациентов использовали логистическую функцию регрессионной модели, которая представляет собой:

logit(p) = A + (B*LR) + (C*FIR) +

+ (D* UIR) + (E*HR) + (F*PDE4D7_оценк.), (3)

где LR = низкий риск NCCN, FIR = благоприятный промежуточный риск NCCN, UIR = неблагоприятный промежуточный риск NCCN, HR = высокий риск NCCN, A, B, C, D, E и F представляют собой веса, а PDE4D7_оценк. представляет собой непрерывную оценку риска PDE4D7.

В конкретных вариантах осуществления A может составлять приблизительно (-0,5)-0,5, например, 0,16, B может составлять приблизительно 0,0-1,0, например, 0,59, C может составлять приблизительно 0,0-2,0, например, 1,07, D может составлять приблизительно 1,0-3,0, например, 2,03, E может составлять приблизительно 2,0-3,0, например, 2,52, и F может составлять приблизительно (-1,5)-(-0,5), например, -0,87. При вычислении регрессионной модели, значение 1 подставляли в логистическую функцию для категории риска NCCN, в которую попадает пациент, и значение 0 подставляли для других категорий риска NCCN. Например, если пациента относили к высокому риску NCCN, значение 1 подставляли в логистическую функцию для HR и значение 0 подставляли для каждого из LR, FIR и UIR.

Вероятность p для пациента перенести предсказанное событие составляет

p = 1 / (1 + e(-logit(p)). (4)

Вероятность p дает комбинированную прогностическую оценку риска, которая основана на оценке риска PDE4D7 и втором определении риска, здесь на классификации NCCN (в дальнейшем также NCCN и оценке риска PDE4D7). Комбинированную прогностическую оценку риска можно классифицировать или категоризировать в одну из по меньшей мере двух групп риска. Например, может быть две группы риска, или три группы риска, или четыре группы риска, или больше чем четыре предварительно определяемых группы риска. Каждая группа риска охватывает соответствующий диапазон (непересекающихся) вероятностей p. Например, группа риска может включать все вероятности p от 0,0 до <0,1, другая группа риска от 0,1 до <0,25, другая группа риска от 0,25 до <0,5 и другая группа риска от 0,5 до <1,0.

В таблице 9 представлены дополнительные подробности о логистической регрессионной модели. Как указано выше, в качестве входных переменных модели использовали оценку риска PDE4D7 в комбинации с клиническими категориями риска NCCN: очень низкий риск (VLR), низкий риск (LR), благоприятный промежуточный риск (FIR), неблагоприятный промежуточный риск (UIR) и высокий риск (HR) прогрессирования заболевания. Группу с очень низким клиническим риском определяли как эталонную группу, т.е. для пациента, который попадает в клиническую категорию риска VLR NCCN оценку риска NCCN и PDE4D7 вычисляют с использованием только веса A из уравнения (3) (т.е. коэффициента регрессии для «Постоянной» в таблице) и взвешенной непрерывной оценки риска PDE4D7 F*PDE4D7_оценк. из уравнения (3) (вес F является коэффициентом регрессии для «PDE4D7_оценк.» в таблице). Соответствующие параметры логистического регрессионного моделирования приведены в таблице. Даны коэффициенты регрессии (веса) для построения функции logit(p), а также отношения шансов, 95% доверительные области (95% CI) и p-значения. Кроме того, представлены стандартные ошибки и статистика Вальда.

Таблица 9: логистическая регрессионная модель для предсказания 5-летнего биохимического рецидива после хирургической операции (449 пациентов).

Коэффициенты и стандартные ошибки	Коэффициент регрессии	Стандартная ошибка	Вальд	p-значение	Отношение шансов	95% CI
Переменная
Очень низкий риск NCCN (эталон)	-	-	-	-	-	-
Низкий риск NCCN	0,59	0,60	0,99	3,19E-01	1,81	0,56-5,84
Благоприятный промежуточный риск NCCN	1,07	0,59	3,35	6,74E-02	2,92	0,93-9,12
Неблагоприятный промежуточный риск NCCN	2,03	0,56	12,88	3,00E-04	7,58	2,51-22,9
Высокий риск NCCN	2,52	0,61	16,93	<1,0E-04	12,37	3,73-41,0
Оценка PDE4D7	-0,87	0,20	18,27	<1,0E-04	0,42	0,28-0,65
Постоянная	0,16	0,82	0,04	8,44E-01	-	-

Тестирование регрессионной модели показало хорошую калибровку ожидаемых в сравнении с наблюдаемыми событиями как в группах событий, так и в группах без событий:

На фиг. 16 представлен калибровочный график логистической регрессионной модели с оценками NCCN и PDE4D7 для того, чтобы предсказывать 5-летний биохимический рецидив после хирургической операции на основе таблицы сопряженности после определения критерия Хосмера-Лемешоу (хи-квадрат 3,9; p=0,87) для когорты из 449 пациентов с полным 5-летним наблюдением. График показывает наблюдаемое в сравнении с ожидаемым (т.е. предсказанным логистической регрессионной моделью) числом пациентов, которые не имели рецидива PSA в течение 5 лет после первичного лечения в 10 децильных подгруппах общей когорты. Коэффициент детерминации составляет 0,9336, детали уравнения для нанесенной на график регрессионной линии y = отрезок на оси + наклон*x (прямая штриховая линия) представляет собой следующее: отрезок на оси = 0,7006 со стандартной ошибкой = 3,3621, 95% CI = -7,0525-8,4537, t = 0,2084 и p = 0,8401; наклон = 0,9804 со стандартной ошибкой = 0,09243, 95% CI = 0,7672-1,1935, t = 10,6072 и p <0,0001. Кривые штриховые линии показывают 95% доверительную область.

На фиг. 17 представлен калибровочный график логистической регрессионной модели с оценками NCCN и PDE4D7 для того, чтобы предсказывать 5-летний биохимический рецидив после хирургической операции на основе таблицы сопряженности после определения критерия Хосмера-Лемешоу (хи-квадрат 3,9; p = 0, 87) для когорты из 449 пациентов с полным 5-летним наблюдением. График показывает наблюдаемое в сравнении с ожидаемым (т.е. предсказанным логистической регрессионной моделью) числом пациентов, которые имели рецидив PSA в течение 5 лет после первичного лечения в 10 децильных подгруппах общей когорты. Коэффициент детерминации составляет 0,9291, детали уравнения для построенной на графике регрессионной линии y = отрезок на оси + наклон*x (прямая штриховая линия) представляют собой следующее: отрезок на осик = 0,2083 со стандартной ошибкой = 1,0895, 95% CI = -2,3041-2,7207, t = 0,1912 и p = 0,8532; наклон = 0,9774 со стандартной ошибкой = 0,09544, 95% CI = 0,7573-1,1975, t = 10,2405 и p <0,0001. Кривые штриховые линии показывают 95% доверительную область.

Затем осуществляли анализ ROC (рабочей характеристики приемника) для того, чтобы вычислять 2-, 5- и 10-летние AUC (площади под кривой ROC), равные 0,779, 0,749 и 0,748, соответственно:

На фиг. 18 представлен ROC анализ 2-летнего биохимического рецидива после хирургической операции (BCR) для логистической регрессионной модели с оценками NCCN и PDE4D7 в когорте из 449 пациентов с полным 5-летним наблюдением. График показывает кривую ROC на графике ложноположительных (чувствительность) в сравнении с ложноотрицательными (специфичность). Статистические детали ROC анализа представляют собой следующее: положительная группа = 47 (10,47%), отрицательная группа 402 (89,53%), распространенность заболевания = 10,5%, AUC = 0,779, стандартная ошибка = 0,0334, 95% CI = 0,738-0,817, z-статистика = 8,368, p (площадь=0,5) <0,0001.

На фиг. 19 представлен ROC анализ 5-летнего биохимического рецидива после хирургической операции (BCR) логистической регрессионной модели с оценками NCCN и PDE4D7 в когорте из 449 пациентов с полным 5-летним наблюдением. График показывает кривую ROC на графике ложноположительных (чувствительность) в сравнении с ложноотрицательными (специфичность). Статистические детали ROC анализа представляют собой следующее: положительная группа = 92 (20,49%), отрицательная группа 357 (79,51%), распространенность заболевания = неизвестна , AUC = 0,749, стандартная ошибка = 0,0284, 95% CI = 0,706-0,788, z-статистика = 8,739, p (площадь=0,5) <0,0001.

На фиг. 20 представлен ROC анализ 10-летнего биохимического рецидива после хирургической операции (BCR) для логистической регрессионной модели с оценками NCCN и PDE4D7 в когорте из 379 пациентов с полным 10-летним наблюдением. График показывает кривую ROC на графике ложноположительных (чувствительность) в сравнении с ложноотрицательными (специфичность). Статистические детали ROC анализа представляют собой следующее: положительная группа = 134 (35,36%), отрицательная группа 245 (64,64%), распространенность заболевания = неизвестна, AUC = 0,748, стандартная ошибка = 0,0259, 95% CI = 0,701-0,791, z-статистика = 9,549, p (площадь=0,5) <0,0001.

Как показано на фиг. 21, анализ предсказанного риска для каждой клинической категории риска NCCN в качестве функции оценки риска PDE4D7 обнаруживал гетерогенное распределение 5-летнего риска прогрессирования (BCR) даже в группах наименьшего клинического риска NCCN. На фиг. 5-летная предсказанная вероятность p нанесена на график в зависимости от оценок риска PDE4D7 для каждой индивидуальной категории риска NCCN.

На основе предсказанного риска по пациентам четыре группы риска определяли с низкой вероятностью 5-летнего (<10%) или 10-летнего (<15%) BCR после первичного лечения (группа риска от 0 до <0,1) на фиг. 22) или с очень существенным 5-летним риском после хирургической операции (>70%) рецидива PSA (группа риска (от 0,5 до 1,0) на фиг. 22) с медианным риском до события только 27,1 месяца. Медианный риск для группы риска (от 0,25 до <0,5) составлял 149,7 месяца, тогда как медианной выживаемости без прогрессирования не достигали для групп риска (от 0 до <0,1) и (от 0,1 до <0,25). При использовании группы риска (от 0 до <0,1) в качестве эталона в анализе Каплана-Мейера отношения рисков для группы риска (от 0,1 до <0,25), (от 0,25 до <0,5) и (от 0,5 до 1,0) составляли 2,2 (95% CI 1,7-3,5), 4,3 (95% CI 2,8-6,6) и 11,5 (95% CI 4,6-28,8), соответственно (фиг. 22; таблица 10).

Талица 10: таблица отношений рисков для логистической регрессионной модели с оценками NCCN и PDE4D7 в анализе выживаемости Каплана-Мейера для клинической конечной точки выживаемости без биохимического рецидива

Группа риска	HR/95% CI	Группа риска NCCN и PDE4D7 (1)	Группа риска NCCN и PDE4D7 (2)	Группа риска NCCN и PDE4D7 (3)	Группа риска NCCN и PDE4D7 (4)
Группа риска NCCN и PDE4D7 (1)	HR	-	2,4	4,3	11,5
95% CI	1,7-3,5	2,8-6,6	4,6-28,8
Группа риска NCCN и PDE4D7 (2)	HR	0,42	-	1,8	4,8
95% CI	0,29-0,6	1,6-2,7	1,9-11,9
Группа риска NCCN и PDE4D7 (3)	HR	0,23	0,56	-	2,7
95% CI	0,15-0,36	0,37-0,86	1,1-6,9
Группа риска NCCN и PDE4D7 (4)	HR	0,09	0,20	0,37	-
95% CI	0,03-0,21	0,08-0,52	0,14-0,95

Обсуждение

Для того чтобы оценивать индивидуальный риск на основе каждого пациента разрабатывали регрессионную модель на основе группы риска NCCN и оценки риска PDE4D7. Регрессионная модель показывала, что оценка риска PDE4D7 определяла широко перекрывающиеся распределения индивидуальных рисков в современных категориях риска NCCN. Независимо от группы риска NCCN, которую определяли для индивидуального пациента, более высокая оценка риска PDE4D7 определяла более низкий риск прогрессирования, тогда как более низкая оценка риска PDE4D7 показывала более высокий риск прогрессирующего заболевания для данного пациента.

В самое последнее время опубликованы долгосрочные результаты когорты активного наблюдения в гетеборгском рандомизированном скрининговом исследовании злокачественной опухоли предстательной железы. Они показывают, что мужчины с заболеванием с клинически низким риском могут иметь существенный риск перенести прогрессирующее заболевание при отложенной схеме лечения. Следовательно, авторы поставили вопрос о том, будут ли пригодны мужчины, отличные от тех, у которых заболевание с очень низким риском, для выжидательных стратегий наблюдения. Недавняя публикация 10-летних исходов из исследования ProtecT демонстрирует схожие заключения в группе активного мониторинга из этого исследования. Несмотря на то, что имеют место некоторые дискуссии о валидности этих результатов для современной практики, они могут подсказывать, что только пациентам с самым наименьшим риском не грозит какое-либо прогрессирование в ходе выжидательной тактики лечения. Хотя использование клинических критериев делает возможным выбор такой очень маленькой когорты пациентов с очень низким риском (например, 62 из 449 пациентов когорте авторов изобретения; 13,8%), авторы изобретения ожидают, что добавление молекулярных маркеров увеличит эту группу пациентов с очень низким риском (например, 122 из 449 в когорте авторов изобретения, когда оценку риска PDE4D7 объединяют с категорией риска NCC, что соответствует 27,2%).

Как используют в этом описании и в приложенной формуле изобретения, формы единственного числа также включают соответствующие формы множественного числа, пока контекст явно не диктует иное.

Термин «приблизительно» обозначает интервал точности, который специалист в данной области поймет как все еще обеспечивающий технический эффект рассматриваемого признака. Термин обычно указывает на отклонение от приведенного числового значения ±20%, или ±15%, или ±10%, или ±5%.

Следует понимать, что термин «содержит» не является ограничивающим. Для целей настоящего изобретения, термин «состоит из считают предпочтительным вариантом осуществления термина «содержит если далее в настоящем описании группу определяют как содержащую по меньшей мере определенное число вариантов осуществления, это также обозначает, что охвачена группа, которая состоит только из этих вариантов осуществления.

Кроме того, термины «первый», «второй», «третий» или «(a)», «(b)», «(c)», «(d)» и т.д. и т.п. в описании и в формуле изобретения используют, чтобы различать схожие элементы, и необязательно для описания последовательного или хронологического порядка. Следует понимать, что термины, используемые таким образом, взаимозаменяемы при подходящих условиях и что варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем описании, могут работать в других последовательностях, чем описано или проиллюстрировано в настоящем описании.

В случае, когда термины «первый», «второй», «третий» или «(a)», «(b)», «(c)», «(d)» и т.д. относятся к стадиям способа или использованию, между стадиями нет согласованности во времени или временном интервале, т.е. стадии можно осуществлять одновременно или могут иметь место временные интервалы в секунды, минуты, часы, дни, недели, месяцы или даже годы между такими стадиями, если не указано иное в заявке, как указано в настоящем описании выше или ниже. Следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными способами, протоколами, белками, бактериями, векторами, реактивами и т.д., описанными в настоящем описании, поскольку они могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, служит лишь цели описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для того, чтобы ограничивать объем настоящего изобретения, который ограничен только приложенной формулой изобретения. Пока не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют те же значения, как их обычно понимает специалист в данной области.

Приложенный список последовательностей, озаглавленный 2014PF01672_Sequence Listing_ST25, включен в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Koninklijke Philips N.V.

<120> ОЦЕНКИ РИСКА НА ОСНОВЕ ЭКСПРЕССИИ ВАРИАНТА 7 ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ

4D ЧЕЛОВЕКА

<130> 2016PF01363

<150> PCT/EP2016/061886

<151> 2016-05-26

<150> EP15169788.5

<151> 2015-05-29

<160> 73

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7801

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

gtggtggccg cgcacccggc cgcggctgat tcattcactt caagtgccgt gcagaaggct 60

cggcaggcgg ggcgggcgtg gggccgcggc tccgggttgg ggaccgagga gatccggctg 120

tggaccagac gctcctctgc ggggcgggca cccaagcgcg ctcgccaccc cctcgccatc 180

cgctagagcc gggctcctgg actgggactc gggcccgccg cacagttgaa aagtcgcata 240

gtggtttttc cgctcgcgtc gctgtgtgaa agttggctcg ccgctctttg cacgccctcc 300

ctggaggccg acccgagacg ccaagctgga gagaccgtgc ctccccgagg ccggccgccc 360

cgcgagcaca gcctccgccc ccgttgcact gccgggctgg gcaatatgaa ggagcagccc 420

tcatgtgccg gcaccgggca tccgagcatg gcggggtatg gcaggatggc cccctttgaa 480

ctcgctagcg gacccgtgaa gcgcttgaga actgagtccc cctttccctg tctcttcgca 540

gaggaggcct accagaaact ggccagcgag accctggagg agctggactg gtgtctggac 600

cagctagaga ccctacagac caggcactcc gtcagtgaga tggcctccaa caagtttaaa 660

aggatgctta atcgggagct cacccatctc tctgaaatga gtcggtctgg aaatcaagtg 720

tcagagttta tatcaaacac attcttagat aagcaacatg aagtggaaat tccttctcca 780

actcagaagg aaaaggagaa aaagaaaaga ccaatgtctc agatcagtgg agtcaagaaa 840

ttgatgcaca gctctagtct gactaattca agtatcccaa ggtttggagt taaaactgaa 900

caagaagatg tccttgccaa ggaactagaa gatgtgaaca aatggggtct tcatgttttc 960

agaatagcag agttgtctgg taaccggccc ttgactgtta tcatgcacac catttttcag 1020

gaacgggatt tattaaaaac atttaaaatt ccagtagata ctttaattac atatcttatg 1080

actctcgaag accattacca tgctgatgtg gcctatcaca acaatatcca tgctgcagat 1140

gttgtccagt ctactcatgt gctattatct acacctgctt tggaggctgt gtttacagat 1200

ttggagattc ttgcagcaat ttttgccagt gcaatacatg atgtagatca tcctggtgtg 1260

tccaatcaat ttctgatcaa tacaaactct gaacttgcct tgatgtacaa tgattcctca 1320

gtcttagaga accatcattt ggctgtgggc tttaaattgc ttcaggaaga aaactgtgac 1380

attttccaga atttgaccaa aaaacaaaga caatctttaa ggaaaatggt cattgacatc 1440

gtacttgcaa cagatatgtc aaaacacatg aatctactgg ctgatttgaa gactatggtt 1500

gaaactaaga aagtgacaag ctctggagtt cttcttcttg ataattattc cgataggatt 1560

caggttcttc agaatatggt gcactgtgca gatctgagca acccaacaaa gcctctccag 1620

ctgtaccgcc agtggacgga ccggataatg gaggagttct tccgccaagg agaccgagag 1680

agggaacgtg gcatggagat aagccccatg tgtgacaagc acaatgcttc cgtggaaaaa 1740

tcacaggtgg gcttcataga ctatattgtt catcccctct gggagacatg ggcagacctc 1800

gtccaccctg acgcccagga tattttggac actttggagg acaatcgtga atggtaccag 1860

agcacaatcc ctcagagccc ctctcctgca cctgatgacc cagaggaggg ccggcagggt 1920

caaactgaga aattccagtt tgaactaact ttagaggaag atggtgagtc agacacggaa 1980

aaggacagtg gcagtcaagt ggaagaagac actagctgca gtgactccaa gactctttgt 2040

actcaagact cagagtctac tgaaattccc cttgatgaac aggttgaaga ggaggcagta 2100

ggggaagaag aggaaagcca gcctgaagcc tgtgtcatag atgatcgttc tcctgacacg 2160

taacagtgca aaaactttca tgcctttttt ttttttaagt agaaaaattg tttccaaagt 2220

gcatgtcaca tgccacaacc acggtcacac ctcactgtca tctgccagga cgtttgttga 2280

acaaaactga ccttgactac tcagtccagc gctcaggaat atcgtaacca gttttttcac 2340

ctccatgtca tccgagcaag gtggacatct tcacgaacag cgtttttaac aagatttcag 2400

cttggtagag ctgacaaagc agataaaatc tactccaaat tattttcaag agagtgtgac 2460

tcatcaggca gcccaaaagt ttattggact tggggtttct attccttttt atttgtttgc 2520

aatattttca gaagaaaggc attgcacaga gtgaacttaa tggacgaagc aacaaatatg 2580

tcaagaacag gacatagcac gaatctgtta ccagtaggag gaggatgagc cacagaaatt 2640

gcataatttt ctaatttcaa gtcttcctga tacatgactg aatagtgtgg ttcagtgagc 2700

tgcactgacc tctacatttt gtatgatatg taaaacagat tttttgtaga gcttactttt 2760

attattaaat gtattgaggt attatattta aaaaaaacta tgttcagaac ttcatctgcc 2820

actggttatt tttttctaag gagtaacttg caagttttca gtacaaatct gtgctacact 2880

ggataaaaat ctaatttatg aattttactt gcaccttata gttcatagca attaactgat 2940

ttgtagtgat tcattgtttg ttttatatac caatgacttc catattttaa aagagaaaaa 3000

caactttatg ttgcaggaaa ccctttttgt aagtctttat tatttacttt gcattttgtt 3060

tcactctttc cagataagca gagttgctct tcaccagtgt ttttcttcat gtgcaaagtg 3120

actatttgtt ctataatact tttatgtgtg ttatatcaaa tgtgtcttaa gcttcatgca 3180

aactcagtca tcagttcgtg ttgtctgaag caagtgggag atatataaat acccagtagc 3240

taaaatggtc agtctttttt agatgttttc ctacttagta tctcctaata acgttttgct 3300

gtgtcactag atgttcattt cacaagtgca tgtctttcta ataatccaca catttcatgc 3360

tctaataatc cacacatttc atgctcattt ttattgtttt tacagccagt tatagtaaga 3420

aaaaggtttt tccccttgtg ctgctttata atttagcgtg tgtctgaacc ttatccatgt 3480

ttgctagatg aggtcttgtc aaatatatca ctaccattgt caccggtgaa aagaaacagg 3540

tagttaagtt agggttaaca ttcatttcaa ccacgaggtt gtatatcatg actagctttt 3600

actcttggtt tacagagaaa agttaaacag ccaactaggc agtttttaag aatattaaca 3660

atatattaac aaacaccaat acaactaatc ctatttggtt ttaatgattt caccatggga 3720

ttaagaacta tatcaggaac atccctgaga aacggtttta agtgtagcaa ctactcttcc 3780

ttaatggaca gccacataac gtgtaggaag tcctttatca cttatcctcg atccataagc 3840

atatcttgca gaggggaact acttctttaa acacatggag ggaaagaaga tgatgccact 3900

ggcaccagag ggttagtact gtgatgcatc ctaaaatatt tattatattg gtaaaaattc 3960

tggttaaata aaaaattaga gatcactctt ggctgatttc agcaccagga actgtattac 4020

agttttagag attaattcct agtgtttacc tgattatagc agttggcatc atggggcatt 4080

taattctgac tttatcccca cgtcagcctt aataaagtct tctttacctt ctctatgaag 4140

actttaaagc ccaaataatc atttttcaca ttgatattca agaattgaga tagatagaag 4200

ccaaagtggg tatctgacaa gtggaaaatc aaacgtttaa gaagaattac aactctgaaa 4260

agcatttata tgtggaactt ctcaaggagc ctcctgggga ctggaaagta agtcatcagc 4320

caggcaaatg actcatgctg aagagagtcc ccatttcagt cccctgagat ctagctgatg 4380

cttagatcct ttgaaataaa aattatgtct ttataactct gatcttttac ataaagcaga 4440

agaggaatca actagttaat tgcaaggttt ctactctgtt tcctctgtaa agatcagatg 4500

gtaatctttc aaataagaaa aaaataaaga cgtatgtttg accaagtagt ttcacaagaa 4560

tatttgggaa cttgtttctt ttaattttat ttgtccctga gtgaagtcta gaaagaaagg 4620

taaagagtct agagtttatt cctctttcca aaacattctc attcctctcc tccctacact 4680

tagtatttcc cccacagagt gcctagaatc ttaataatga ataaaataaa aagcagcaat 4740

atgtcattaa caaatccaga cctgaaaggg taaagggttt ataactgcac taataaagag 4800

aggctctttt tttttcttcc agtttgttgg tttttaatgg taccgtgttg taaagatacc 4860

cactaatgga caatcaaatt gcagaaaagg ctcaatatcc aagagacagg gactaatgca 4920

ctgtacaatc tgcttatcct tgcccttctc tcttgccaaa gtgtgcttca gaaatatata 4980

ctgctttaaa aaagaataaa agaatatcct tttacaagtg gctttacatt tcctaaaatg 5040

ccataagaaa atgcaatatc tgggtactgt atggggaaaa aaatgtccaa gtttgtgtaa 5100

aaccagtgca tttcagcttg caagttactg aacacaataa tgctgtttta attttgtttt 5160

atatcagtta aaattcacaa taatgtagat agaacaaatt acagacaagg aaagaaaaaa 5220

cttgaatgaa atggatttta cagaaagctt tatgataatt tttgaatgca ttatttattt 5280

tttgtgccat gcattttttt tctcaccaaa tgaccttacc tgtaatacag tcttgtttgt 5340

ctgtttacaa ccatgtattt attgcaatgt acatactgta atgttaattg taaattatct 5400

gttcttatta aaacatcatc ccatgatggg atggtgttga tatatttgga aactcttggt 5460

gagagaatga atggtgtgta tacatactct gtacattttt cttttctcct gtaatatagt 5520

cttgtcacct tagagcttgt ttatggaaga ttcaagaaaa ctataaaata cttaaagata 5580

tataaattta aaaaaacata gctgcaggtc tttggtccca gggctgtgcc ttaactttaa 5640

ccaatatttt cttctgtttt gctgcatttg aaaggtaaca gtggagctag ggctgggcat 5700

tttacatcca ggcttttaat tgattagaat tctgccaata ggtggatttt acaaaaccac 5760

agacaacctc tgaaagattc tgagaccctt ttgagacaga agctcttaag tacttcttgc 5820

cagggagcag cactgcatgt gtgatggttg tttgccatct gttgatcagg aactacttca 5880

gctacttgca tttgattatt tccttttttt ttttttttaa ctcggaaaca caactgggga 5940

aatatattct ttcccagtga ttataaacaa tctttttctt ttttttaagt ccttttggct 6000

tctagagctc ataggaaaat ggacttgatt tgaaattgga gccagagttt actcgtgttg 6060

gttatctatt catcagcttc ctgacatgtt aagagaatac attaaagaga aaatactgtt 6120

ttttaatcct aaaatttttc ttccactaag ataaaccaaa tgtccttaca tatatgtaaa 6180

cccatctatt taaacgcaaa ggtgggttga tgtcagttta catagcagaa agcattcact 6240

atcctctaag atttgtttct gcaaaacttt cattgcttta gaattttaaa atttcacctt 6300

gtacaatggc cagcccctaa agcaggaaac atttataatg gattatatgg aaacatcctc 6360

ccagtacttg cccagccctt gaatcatgtg gcttttcagt gaaaggaaag attctttttc 6420

taggaaaaat gagcctattt tattttattt tattttattt tttgacacaa actgtagatt 6480

ttagcagccc tggcccaaag gaatttgatt acttttgttt taaacagtac aaaggggaca 6540

ctataattac aaaaacatcc ttaactgatt tgagttgttt ttatttcttt ggatatattt 6600

tcagagtggt aaattgtgtg tgagaattac aaatgattat tcttttagtg gtttcttagc 6660

ctctcttaca gcccacgggg atagtactgt acatcaatac cttcatatga aatttttata 6720

tgcaatgaaa ataaaagcat gggttgattc tgcctattta tgactcaatc ttttacaaat 6780

aaaagattat tcattttaaa ttatagttca atcagcatgt ctcttaggat actgaacgtg 6840

gttgaaatga aaggatagtg acatcataag ttagtactga tattcataac caaataaagc 6900

caacttgagt aattttgcta cattaaaaat taccaaaatt acttagatgg cctataagat 6960

taagcatggt gttttctaag caagctttga aaggggcctt ccatacttac ttaattgaat 7020

attctgggat attgaaaatt attcagatac ttgacaatta tttttggtta cctactccgc 7080

aaactacaaa gttttaagga ctcaacaata agttaatgag acacagtgtt tgctttcatg 7140

gagcttacag tctggagggg acaaaggctt aaacaatact catataatta tatatgtgat 7200

cagtacaatg aaggagctca gtggggtaaa taagcaggaa cctgaacttg atctgttccg 7260

gagggccaca gaaggcttcc ttgaggcctt gagaaagtga tttgcatctg agttctgaag 7320

gattgtaaga ggtaactagg gaaaaagttg acaggaagag gaaggggatc cagacaagaa 7380

acatttgcaa agatcttgag gcataaatga gcttgagaca tctggagaaa ctgaggaaaa 7440

gtgagagagt aggcagggcc tggagccgca gagccattgc taaccatcct gtgtgagata 7500

tcccccattc tgtagcttta ttctcataac cctgctcaat tttctttata acacttctca 7560

cagatttata tacgtgtttg tttttgttat ctgtctctcc caccagacca cagctccatg 7620

agagcaaggt ctttgcttac caatatatca ctagcactta aaactatgcc tggtacacag 7680

taggttctta atatgtgttg aatatagcca tcaaattgat attggatata attcaatctg 7740

ataagatatt ttgagatatt aaagagtttt taacttgata ccataaaaaa aaaaaaaaaa 7800

a 7801

<210> 2

<211> 585

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Lys Glu Gln Pro Ser Cys Ala Gly Thr Gly His Pro Ser Met Ala

1 5 10 15

Gly Tyr Gly Arg Met Ala Pro Phe Glu Leu Ala Ser Gly Pro Val Lys

20 25 30

Arg Leu Arg Thr Glu Ser Pro Phe Pro Cys Leu Phe Ala Glu Glu Ala

35 40 45

Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu

50 55 60

Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr Arg His Ser Val Ser Glu Met Ala

65 70 75 80

Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser

85 90 95

Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Phe Ile Ser Asn Thr

100 105 110

Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys

115 120 125

Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser Gly Val Lys

130 135 140

Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro Arg Phe

145 150 155 160

Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp

165 170 175

Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu Ser Gly

180 185 190

Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp

195 200 205

Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu

210 215 220

Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn

225 230 235 240

Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr

245 250 255

Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile

260 265 270

Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln

275 280 285

Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser

290 295 300

Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln

305 310 315 320

Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln

325 330 335

Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser

340 345 350

Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys

355 360 365

Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg

370 375 380

Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro

385 390 395 400

Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu

405 410 415

Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile

420 425 430

Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val

435 440 445

Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp

450 455 460

Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn

465 470 475 480

Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Ala Pro

485 490 495

Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys Phe Gln Phe

500 505 510

Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu Lys Asp Ser

515 520 525

Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser Lys Thr Leu

530 535 540

Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp Glu Gln Val

545 550 555 560

Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro Glu Ala Cys

565 570 575

Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp Thr

580 585

<210> 3

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D1D2_прямой праймер

<400> 3

aatatgaagg agcagccctc a 21

<210> 4

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D1D2_обратный праймер

<400> 4

gtctcgctgg ccagtttc 18

<210> 5

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд PDE4D1D2

<400> 5

catccgagca tggcggga 18

<210> 6

<211> 7715

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 6

gtggtggccg cgcacccggc cgcggctgat tcattcactt caagtgccgt gcagaaggct 60

cggcaggcgg ggcgggcgtg gggccgcggc tccgggttgg ggaccgagga gatccggctg 120

tggaccagac gctcctctgc ggggcgggca cccaagcgcg ctcgccaccc cctcgccatc 180

cgctagagcc gggctcctgg actgggactc gggcccgccg cacagttgaa aagtcgcata 240

gtggtttttc cgctcgcgtc gctgtgtgaa agttggctcg ccgctctttg cacgccctcc 300

ctggaggccg acccgagacg ccaagctgga gagaccgtgc ctccccgagg ccggccgccc 360

cgcgagcaca gcctccgccc ccgttgcact gccgggctgg gcaatatgaa ggagcagccc 420

tcatgtgccg gcaccgggca tccgagcatg gcgggaggag gcctaccaga aactggccag 480

cgagaccctg gaggagctgg actggtgtct ggaccagcta gagaccctac agaccaggca 540

ctccgtcagt gagatggcct ccaacaagtt taaaaggatg cttaatcggg agctcaccca 600

tctctctgaa atgagtcggt ctggaaatca agtgtcagag tttatatcaa acacattctt 660

agataagcaa catgaagtgg aaattccttc tccaactcag aaggaaaagg agaaaaagaa 720

aagaccaatg tctcagatca gtggagtcaa gaaattgatg cacagctcta gtctgactaa 780

ttcaagtatc ccaaggtttg gagttaaaac tgaacaagaa gatgtccttg ccaaggaact 840

agaagatgtg aacaaatggg gtcttcatgt tttcagaata gcagagttgt ctggtaaccg 900

gcccttgact gttatcatgc acaccatttt tcaggaacgg gatttattaa aaacatttaa 960

aattccagta gatactttaa ttacatatct tatgactctc gaagaccatt accatgctga 1020

tgtggcctat cacaacaata tccatgctgc agatgttgtc cagtctactc atgtgctatt 1080

atctacacct gctttggagg ctgtgtttac agatttggag attcttgcag caatttttgc 1140

cagtgcaata catgatgtag atcatcctgg tgtgtccaat caatttctga tcaatacaaa 1200

ctctgaactt gccttgatgt acaatgattc ctcagtctta gagaaccatc atttggctgt 1260

gggctttaaa ttgcttcagg aagaaaactg tgacattttc cagaatttga ccaaaaaaca 1320

aagacaatct ttaaggaaaa tggtcattga catcgtactt gcaacagata tgtcaaaaca 1380

catgaatcta ctggctgatt tgaagactat ggttgaaact aagaaagtga caagctctgg 1440

agttcttctt cttgataatt attccgatag gattcaggtt cttcagaata tggtgcactg 1500

tgcagatctg agcaacccaa caaagcctct ccagctgtac cgccagtgga cggaccggat 1560

aatggaggag ttcttccgcc aaggagaccg agagagggaa cgtggcatgg agataagccc 1620

catgtgtgac aagcacaatg cttccgtgga aaaatcacag gtgggcttca tagactatat 1680

tgttcatccc ctctgggaga catgggcaga cctcgtccac cctgacgccc aggatatttt 1740

ggacactttg gaggacaatc gtgaatggta ccagagcaca atccctcaga gcccctctcc 1800

tgcacctgat gacccagagg agggccggca gggtcaaact gagaaattcc agtttgaact 1860

aactttagag gaagatggtg agtcagacac ggaaaaggac agtggcagtc aagtggaaga 1920

agacactagc tgcagtgact ccaagactct ttgtactcaa gactcagagt ctactgaaat 1980

tccccttgat gaacaggttg aagaggaggc agtaggggaa gaagaggaaa gccagcctga 2040

agcctgtgtc atagatgatc gttctcctga cacgtaacag tgcaaaaact ttcatgcctt 2100

tttttttttt aagtagaaaa attgtttcca aagtgcatgt cacatgccac aaccacggtc 2160

acacctcact gtcatctgcc aggacgtttg ttgaacaaaa ctgaccttga ctactcagtc 2220

cagcgctcag gaatatcgta accagttttt tcacctccat gtcatccgag caaggtggac 2280

atcttcacga acagcgtttt taacaagatt tcagcttggt agagctgaca aagcagataa 2340

aatctactcc aaattatttt caagagagtg tgactcatca ggcagcccaa aagtttattg 2400

gacttggggt ttctattcct ttttatttgt ttgcaatatt ttcagaagaa aggcattgca 2460

cagagtgaac ttaatggacg aagcaacaaa tatgtcaaga acaggacata gcacgaatct 2520

gttaccagta ggaggaggat gagccacaga aattgcataa ttttctaatt tcaagtcttc 2580

ctgatacatg actgaatagt gtggttcagt gagctgcact gacctctaca ttttgtatga 2640

tatgtaaaac agattttttg tagagcttac ttttattatt aaatgtattg aggtattata 2700

tttaaaaaaa actatgttca gaacttcatc tgccactggt tatttttttc taaggagtaa 2760

cttgcaagtt ttcagtacaa atctgtgcta cactggataa aaatctaatt tatgaatttt 2820

acttgcacct tatagttcat agcaattaac tgatttgtag tgattcattg tttgttttat 2880

ataccaatga cttccatatt ttaaaagaga aaaacaactt tatgttgcag gaaacccttt 2940

ttgtaagtct ttattattta ctttgcattt tgtttcactc tttccagata agcagagttg 3000

ctcttcacca gtgtttttct tcatgtgcaa agtgactatt tgttctataa tacttttatg 3060

tgtgttatat caaatgtgtc ttaagcttca tgcaaactca gtcatcagtt cgtgttgtct 3120

gaagcaagtg ggagatatat aaatacccag tagctaaaat ggtcagtctt ttttagatgt 3180

tttcctactt agtatctcct aataacgttt tgctgtgtca ctagatgttc atttcacaag 3240

tgcatgtctt tctaataatc cacacatttc atgctctaat aatccacaca tttcatgctc 3300

atttttattg tttttacagc cagttatagt aagaaaaagg tttttcccct tgtgctgctt 3360

tataatttag cgtgtgtctg aaccttatcc atgtttgcta gatgaggtct tgtcaaatat 3420

atcactacca ttgtcaccgg tgaaaagaaa caggtagtta agttagggtt aacattcatt 3480

tcaaccacga ggttgtatat catgactagc ttttactctt ggtttacaga gaaaagttaa 3540

acagccaact aggcagtttt taagaatatt aacaatatat taacaaacac caatacaact 3600

aatcctattt ggttttaatg atttcaccat gggattaaga actatatcag gaacatccct 3660

gagaaacggt tttaagtgta gcaactactc ttccttaatg gacagccaca taacgtgtag 3720

gaagtccttt atcacttatc ctcgatccat aagcatatct tgcagagggg aactacttct 3780

ttaaacacat ggagggaaag aagatgatgc cactggcacc agagggttag tactgtgatg 3840

catcctaaaa tatttattat attggtaaaa attctggtta aataaaaaat tagagatcac 3900

tcttggctga tttcagcacc aggaactgta ttacagtttt agagattaat tcctagtgtt 3960

tacctgatta tagcagttgg catcatgggg catttaattc tgactttatc cccacgtcag 4020

ccttaataaa gtcttcttta ccttctctat gaagacttta aagcccaaat aatcattttt 4080

cacattgata ttcaagaatt gagatagata gaagccaaag tgggtatctg acaagtggaa 4140

aatcaaacgt ttaagaagaa ttacaactct gaaaagcatt tatatgtgga acttctcaag 4200

gagcctcctg gggactggaa agtaagtcat cagccaggca aatgactcat gctgaagaga 4260

gtccccattt cagtcccctg agatctagct gatgcttaga tcctttgaaa taaaaattat 4320

gtctttataa ctctgatctt ttacataaag cagaagagga atcaactagt taattgcaag 4380

gtttctactc tgtttcctct gtaaagatca gatggtaatc tttcaaataa gaaaaaaata 4440

aagacgtatg tttgaccaag tagtttcaca agaatatttg ggaacttgtt tcttttaatt 4500

ttatttgtcc ctgagtgaag tctagaaaga aaggtaaaga gtctagagtt tattcctctt 4560

tccaaaacat tctcattcct ctcctcccta cacttagtat ttcccccaca gagtgcctag 4620

aatcttaata atgaataaaa taaaaagcag caatatgtca ttaacaaatc cagacctgaa 4680

agggtaaagg gtttataact gcactaataa agagaggctc tttttttttc ttccagtttg 4740

ttggttttta atggtaccgt gttgtaaaga tacccactaa tggacaatca aattgcagaa 4800

aaggctcaat atccaagaga cagggactaa tgcactgtac aatctgctta tccttgccct 4860

tctctcttgc caaagtgtgc ttcagaaata tatactgctt taaaaaagaa taaaagaata 4920

tccttttaca agtggcttta catttcctaa aatgccataa gaaaatgcaa tatctgggta 4980

ctgtatgggg aaaaaaatgt ccaagtttgt gtaaaaccag tgcatttcag cttgcaagtt 5040

actgaacaca ataatgctgt tttaattttg ttttatatca gttaaaattc acaataatgt 5100

agatagaaca aattacagac aaggaaagaa aaaacttgaa tgaaatggat tttacagaaa 5160

gctttatgat aatttttgaa tgcattattt attttttgtg ccatgcattt tttttctcac 5220

caaatgacct tacctgtaat acagtcttgt ttgtctgttt acaaccatgt atttattgca 5280

atgtacatac tgtaatgtta attgtaaatt atctgttctt attaaaacat catcccatga 5340

tgggatggtg ttgatatatt tggaaactct tggtgagaga atgaatggtg tgtatacata 5400

ctctgtacat ttttcttttc tcctgtaata tagtcttgtc accttagagc ttgtttatgg 5460

aagattcaag aaaactataa aatacttaaa gatatataaa tttaaaaaaa catagctgca 5520

ggtctttggt cccagggctg tgccttaact ttaaccaata ttttcttctg ttttgctgca 5580

tttgaaaggt aacagtggag ctagggctgg gcattttaca tccaggcttt taattgatta 5640

gaattctgcc aataggtgga ttttacaaaa ccacagacaa cctctgaaag attctgagac 5700

ccttttgaga cagaagctct taagtacttc ttgccaggga gcagcactgc atgtgtgatg 5760

gttgtttgcc atctgttgat caggaactac ttcagctact tgcatttgat tatttccttt 5820

tttttttttt ttaactcgga aacacaactg gggaaatata ttctttccca gtgattataa 5880

acaatctttt tctttttttt aagtcctttt ggcttctaga gctcatagga aaatggactt 5940

gatttgaaat tggagccaga gtttactcgt gttggttatc tattcatcag cttcctgaca 6000

tgttaagaga atacattaaa gagaaaatac tgttttttaa tcctaaaatt tttcttccac 6060

taagataaac caaatgtcct tacatatatg taaacccatc tatttaaacg caaaggtggg 6120

ttgatgtcag tttacatagc agaaagcatt cactatcctc taagatttgt ttctgcaaaa 6180

ctttcattgc tttagaattt taaaatttca ccttgtacaa tggccagccc ctaaagcagg 6240

aaacatttat aatggattat atggaaacat cctcccagta cttgcccagc ccttgaatca 6300

tgtggctttt cagtgaaagg aaagattctt tttctaggaa aaatgagcct attttatttt 6360

attttatttt attttttgac acaaactgta gattttagca gccctggccc aaaggaattt 6420

gattactttt gttttaaaca gtacaaaggg gacactataa ttacaaaaac atccttaact 6480

gatttgagtt gtttttattt ctttggatat attttcagag tggtaaattg tgtgtgagaa 6540

ttacaaatga ttattctttt agtggtttct tagcctctct tacagcccac ggggatagta 6600

ctgtacatca ataccttcat atgaaatttt tatatgcaat gaaaataaaa gcatgggttg 6660

attctgccta tttatgactc aatcttttac aaataaaaga ttattcattt taaattatag 6720

ttcaatcagc atgtctctta ggatactgaa cgtggttgaa atgaaaggat agtgacatca 6780

taagttagta ctgatattca taaccaaata aagccaactt gagtaatttt gctacattaa 6840

aaattaccaa aattacttag atggcctata agattaagca tggtgttttc taagcaagct 6900

ttgaaagggg ccttccatac ttacttaatt gaatattctg ggatattgaa aattattcag 6960

atacttgaca attatttttg gttacctact ccgcaaacta caaagtttta aggactcaac 7020

aataagttaa tgagacacag tgtttgcttt catggagctt acagtctgga ggggacaaag 7080

gcttaaacaa tactcatata attatatatg tgatcagtac aatgaaggag ctcagtgggg 7140

taaataagca ggaacctgaa cttgatctgt tccggagggc cacagaaggc ttccttgagg 7200

ccttgagaaa gtgatttgca tctgagttct gaaggattgt aagaggtaac tagggaaaaa 7260

gttgacagga agaggaaggg gatccagaca agaaacattt gcaaagatct tgaggcataa 7320

atgagcttga gacatctgga gaaactgagg aaaagtgaga gagtaggcag ggcctggagc 7380

cgcagagcca ttgctaacca tcctgtgtga gatatccccc attctgtagc tttattctca 7440

taaccctgct caattttctt tataacactt ctcacagatt tatatacgtg tttgtttttg 7500

ttatctgtct ctcccaccag accacagctc catgagagca aggtctttgc ttaccaatat 7560

atcactagca cttaaaacta tgcctggtac acagtaggtt cttaatatgt gttgaatata 7620

gccatcaaat tgatattgga tataattcaa tctgataaga tattttgaga tattaaagag 7680

tttttaactt gataccataa aaaaaaaaaa aaaaa 7715

<210> 7

<211> 507

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 7

Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr His

1 5 10 15

Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Phe Ile Ser

20 25 30

Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr

35 40 45

Gln Lys Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser Gly

50 55 60

Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro

65 70 75 80

Arg Phe Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu

85 90 95

Glu Asp Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu

100 105 110

Ser Gly Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln Glu

115 120 125

Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr

130 135 140

Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr His

145 150 155 160

Asn Asn Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu Leu

165 170 175

Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala

180 185 190

Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser

195 200 205

Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn

210 215 220

Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu

225 230 235 240

Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln

245 250 255

Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp

260 265 270

Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu

275 280 285

Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser

290 295 300

Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser

305 310 315 320

Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile

325 330 335

Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met

340 345 350

Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys Ser

355 360 365

Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp

370 375 380

Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu

385 390 395 400

Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro

405 410 415

Ala Pro Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys Phe

420 425 430

Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu Lys

435 440 445

Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser Lys

450 455 460

Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp Glu

465 470 475 480

Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro Glu

485 490 495

Ala Cys Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp Thr

500 505

<210> 8

<211> 7783

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 8

aatacttgtt gcaataattg cccacgatag ctgctcaaac aagagagttg gaattcatct 60

gtaaaaatca ctacatgtaa cgtaggagac aagaaaaata ttaatgacag aagatctgcg 120

aacatgatgc acgtgaataa ttttcccttt agaaggcatt cctggatatg ttttgatgtg 180

gacaatggca catctgcggg acggagtccc ttggatccca tgaccagccc aggatccggg 240

ctaattctcc aagcaaattt tgtccacagt caacgacggg agtccttcct gtatcgatcc 300

gacagcgatt atgacctctc tccaaagtct atgtcccgga actcctccat tgccagtgat 360

atacacggag atgacttgat tgtgactcca tttgctcagg tcttggccag tctgcgaact 420

gtacgaaaca actttgctgc attaactaat ttgcaagatc gagcacctag caaaagatca 480

cccatgtgca accaaccatc catcaacaaa gccaccataa cagaggaggc ctaccagaaa 540

ctggccagcg agaccctgga ggagctggac tggtgtctgg accagctaga gaccctacag 600

accaggcact ccgtcagtga gatggcctcc aacaagttta aaaggatgct taatcgggag 660

ctcacccatc tctctgaaat gagtcggtct ggaaatcaag tgtcagagtt tatatcaaac 720

acattcttag ataagcaaca tgaagtggaa attccttctc caactcagaa ggaaaaggag 780

aaaaagaaaa gaccaatgtc tcagatcagt ggagtcaaga aattgatgca cagctctagt 840

ctgactaatt caagtatccc aaggtttgga gttaaaactg aacaagaaga tgtccttgcc 900

aaggaactag aagatgtgaa caaatggggt cttcatgttt tcagaatagc agagttgtct 960

ggtaaccggc ccttgactgt tatcatgcac accatttttc aggaacggga tttattaaaa 1020

acatttaaaa ttccagtaga tactttaatt acatatctta tgactctcga agaccattac 1080

catgctgatg tggcctatca caacaatatc catgctgcag atgttgtcca gtctactcat 1140

gtgctattat ctacacctgc tttggaggct gtgtttacag atttggagat tcttgcagca 1200

atttttgcca gtgcaataca tgatgtagat catcctggtg tgtccaatca atttctgatc 1260

aatacaaact ctgaacttgc cttgatgtac aatgattcct cagtcttaga gaaccatcat 1320

ttggctgtgg gctttaaatt gcttcaggaa gaaaactgtg acattttcca gaatttgacc 1380

aaaaaacaaa gacaatcttt aaggaaaatg gtcattgaca tcgtacttgc aacagatatg 1440

tcaaaacaca tgaatctact ggctgatttg aagactatgg ttgaaactaa gaaagtgaca 1500

agctctggag ttcttcttct tgataattat tccgatagga ttcaggttct tcagaatatg 1560

gtgcactgtg cagatctgag caacccaaca aagcctctcc agctgtaccg ccagtggacg 1620

gaccggataa tggaggagtt cttccgccaa ggagaccgag agagggaacg tggcatggag 1680

ataagcccca tgtgtgacaa gcacaatgct tccgtggaaa aatcacaggt gggcttcata 1740

gactatattg ttcatcccct ctgggagaca tgggcagacc tcgtccaccc tgacgcccag 1800

gatattttgg acactttgga ggacaatcgt gaatggtacc agagcacaat ccctcagagc 1860

ccctctcctg cacctgatga cccagaggag ggccggcagg gtcaaactga gaaattccag 1920

tttgaactaa ctttagagga agatggtgag tcagacacgg aaaaggacag tggcagtcaa 1980

gtggaagaag acactagctg cagtgactcc aagactcttt gtactcaaga ctcagagtct 2040

actgaaattc cccttgatga acaggttgaa gaggaggcag taggggaaga agaggaaagc 2100

cagcctgaag cctgtgtcat agatgatcgt tctcctgaca cgtaacagtg caaaaacttt 2160

catgcctttt ttttttttaa gtagaaaaat tgtttccaaa gtgcatgtca catgccacaa 2220

ccacggtcac acctcactgt catctgccag gacgtttgtt gaacaaaact gaccttgact 2280

actcagtcca gcgctcagga atatcgtaac cagttttttc acctccatgt catccgagca 2340

aggtggacat cttcacgaac agcgttttta acaagatttc agcttggtag agctgacaaa 2400

gcagataaaa tctactccaa attattttca agagagtgtg actcatcagg cagcccaaaa 2460

gtttattgga cttggggttt ctattccttt ttatttgttt gcaatatttt cagaagaaag 2520

gcattgcaca gagtgaactt aatggacgaa gcaacaaata tgtcaagaac aggacatagc 2580

acgaatctgt taccagtagg aggaggatga gccacagaaa ttgcataatt ttctaatttc 2640

aagtcttcct gatacatgac tgaatagtgt ggttcagtga gctgcactga cctctacatt 2700

ttgtatgata tgtaaaacag attttttgta gagcttactt ttattattaa atgtattgag 2760

gtattatatt taaaaaaaac tatgttcaga acttcatctg ccactggtta tttttttcta 2820

aggagtaact tgcaagtttt cagtacaaat ctgtgctaca ctggataaaa atctaattta 2880

tgaattttac ttgcacctta tagttcatag caattaactg atttgtagtg attcattgtt 2940

tgttttatat accaatgact tccatatttt aaaagagaaa aacaacttta tgttgcagga 3000

aacccttttt gtaagtcttt attatttact ttgcattttg tttcactctt tccagataag 3060

cagagttgct cttcaccagt gtttttcttc atgtgcaaag tgactatttg ttctataata 3120

cttttatgtg tgttatatca aatgtgtctt aagcttcatg caaactcagt catcagttcg 3180

tgttgtctga agcaagtggg agatatataa atacccagta gctaaaatgg tcagtctttt 3240

ttagatgttt tcctacttag tatctcctaa taacgttttg ctgtgtcact agatgttcat 3300

ttcacaagtg catgtctttc taataatcca cacatttcat gctctaataa tccacacatt 3360

tcatgctcat ttttattgtt tttacagcca gttatagtaa gaaaaaggtt tttccccttg 3420

tgctgcttta taatttagcg tgtgtctgaa ccttatccat gtttgctaga tgaggtcttg 3480

tcaaatatat cactaccatt gtcaccggtg aaaagaaaca ggtagttaag ttagggttaa 3540

cattcatttc aaccacgagg ttgtatatca tgactagctt ttactcttgg tttacagaga 3600

aaagttaaac agccaactag gcagttttta agaatattaa caatatatta acaaacacca 3660

atacaactaa tcctatttgg ttttaatgat ttcaccatgg gattaagaac tatatcagga 3720

acatccctga gaaacggttt taagtgtagc aactactctt ccttaatgga cagccacata 3780

acgtgtagga agtcctttat cacttatcct cgatccataa gcatatcttg cagaggggaa 3840

ctacttcttt aaacacatgg agggaaagaa gatgatgcca ctggcaccag agggttagta 3900

ctgtgatgca tcctaaaata tttattatat tggtaaaaat tctggttaaa taaaaaatta 3960

gagatcactc ttggctgatt tcagcaccag gaactgtatt acagttttag agattaattc 4020

ctagtgttta cctgattata gcagttggca tcatggggca tttaattctg actttatccc 4080

cacgtcagcc ttaataaagt cttctttacc ttctctatga agactttaaa gcccaaataa 4140

tcatttttca cattgatatt caagaattga gatagataga agccaaagtg ggtatctgac 4200

aagtggaaaa tcaaacgttt aagaagaatt acaactctga aaagcattta tatgtggaac 4260

ttctcaagga gcctcctggg gactggaaag taagtcatca gccaggcaaa tgactcatgc 4320

tgaagagagt ccccatttca gtcccctgag atctagctga tgcttagatc ctttgaaata 4380

aaaattatgt ctttataact ctgatctttt acataaagca gaagaggaat caactagtta 4440

attgcaaggt ttctactctg tttcctctgt aaagatcaga tggtaatctt tcaaataaga 4500

aaaaaataaa gacgtatgtt tgaccaagta gtttcacaag aatatttggg aacttgtttc 4560

ttttaatttt atttgtccct gagtgaagtc tagaaagaaa ggtaaagagt ctagagttta 4620

ttcctctttc caaaacattc tcattcctct cctccctaca cttagtattt cccccacaga 4680

gtgcctagaa tcttaataat gaataaaata aaaagcagca atatgtcatt aacaaatcca 4740

gacctgaaag ggtaaagggt ttataactgc actaataaag agaggctctt tttttttctt 4800

ccagtttgtt ggtttttaat ggtaccgtgt tgtaaagata cccactaatg gacaatcaaa 4860

ttgcagaaaa ggctcaatat ccaagagaca gggactaatg cactgtacaa tctgcttatc 4920

cttgcccttc tctcttgcca aagtgtgctt cagaaatata tactgcttta aaaaagaata 4980

aaagaatatc cttttacaag tggctttaca tttcctaaaa tgccataaga aaatgcaata 5040

tctgggtact gtatggggaa aaaaatgtcc aagtttgtgt aaaaccagtg catttcagct 5100

tgcaagttac tgaacacaat aatgctgttt taattttgtt ttatatcagt taaaattcac 5160

aataatgtag atagaacaaa ttacagacaa ggaaagaaaa aacttgaatg aaatggattt 5220

tacagaaagc tttatgataa tttttgaatg cattatttat tttttgtgcc atgcattttt 5280

tttctcacca aatgacctta cctgtaatac agtcttgttt gtctgtttac aaccatgtat 5340

ttattgcaat gtacatactg taatgttaat tgtaaattat ctgttcttat taaaacatca 5400

tcccatgatg ggatggtgtt gatatatttg gaaactcttg gtgagagaat gaatggtgtg 5460

tatacatact ctgtacattt ttcttttctc ctgtaatata gtcttgtcac cttagagctt 5520

gtttatggaa gattcaagaa aactataaaa tacttaaaga tatataaatt taaaaaaaca 5580

tagctgcagg tctttggtcc cagggctgtg ccttaacttt aaccaatatt ttcttctgtt 5640

ttgctgcatt tgaaaggtaa cagtggagct agggctgggc attttacatc caggctttta 5700

attgattaga attctgccaa taggtggatt ttacaaaacc acagacaacc tctgaaagat 5760

tctgagaccc ttttgagaca gaagctctta agtacttctt gccagggagc agcactgcat 5820

gtgtgatggt tgtttgccat ctgttgatca ggaactactt cagctacttg catttgatta 5880

tttccttttt tttttttttt aactcggaaa cacaactggg gaaatatatt ctttcccagt 5940

gattataaac aatctttttc ttttttttaa gtccttttgg cttctagagc tcataggaaa 6000

atggacttga tttgaaattg gagccagagt ttactcgtgt tggttatcta ttcatcagct 6060

tcctgacatg ttaagagaat acattaaaga gaaaatactg ttttttaatc ctaaaatttt 6120

tcttccacta agataaacca aatgtcctta catatatgta aacccatcta tttaaacgca 6180

aaggtgggtt gatgtcagtt tacatagcag aaagcattca ctatcctcta agatttgttt 6240

ctgcaaaact ttcattgctt tagaatttta aaatttcacc ttgtacaatg gccagcccct 6300

aaagcaggaa acatttataa tggattatat ggaaacatcc tcccagtact tgcccagccc 6360

ttgaatcatg tggcttttca gtgaaaggaa agattctttt tctaggaaaa atgagcctat 6420

tttattttat tttattttat tttttgacac aaactgtaga ttttagcagc cctggcccaa 6480

aggaatttga ttacttttgt tttaaacagt acaaagggga cactataatt acaaaaacat 6540

ccttaactga tttgagttgt ttttatttct ttggatatat tttcagagtg gtaaattgtg 6600

tgtgagaatt acaaatgatt attcttttag tggtttctta gcctctctta cagcccacgg 6660

ggatagtact gtacatcaat accttcatat gaaattttta tatgcaatga aaataaaagc 6720

atgggttgat tctgcctatt tatgactcaa tcttttacaa ataaaagatt attcatttta 6780

aattatagtt caatcagcat gtctcttagg atactgaacg tggttgaaat gaaaggatag 6840

tgacatcata agttagtact gatattcata accaaataaa gccaacttga gtaattttgc 6900

tacattaaaa attaccaaaa ttacttagat ggcctataag attaagcatg gtgttttcta 6960

agcaagcttt gaaaggggcc ttccatactt acttaattga atattctggg atattgaaaa 7020

ttattcagat acttgacaat tatttttggt tacctactcc gcaaactaca aagttttaag 7080

gactcaacaa taagttaatg agacacagtg tttgctttca tggagcttac agtctggagg 7140

ggacaaaggc ttaaacaata ctcatataat tatatatgtg atcagtacaa tgaaggagct 7200

cagtggggta aataagcagg aacctgaact tgatctgttc cggagggcca cagaaggctt 7260

ccttgaggcc ttgagaaagt gatttgcatc tgagttctga aggattgtaa gaggtaacta 7320

gggaaaaagt tgacaggaag aggaagggga tccagacaag aaacatttgc aaagatcttg 7380

aggcataaat gagcttgaga catctggaga aactgaggaa aagtgagaga gtaggcaggg 7440

cctggagccg cagagccatt gctaaccatc ctgtgtgaga tatcccccat tctgtagctt 7500

tattctcata accctgctca attttcttta taacacttct cacagattta tatacgtgtt 7560

tgtttttgtt atctgtctct cccaccagac cacagctcca tgagagcaag gtctttgctt 7620

accaatatat cactagcact taaaactatg cctggtacac agtaggttct taatatgtgt 7680

tgaatatagc catcaaattg atattggata taattcaatc tgataagata ttttgagata 7740

ttaaagagtt tttaacttga taccataaaa aaaaaaaaaa aaa 7783

<210> 9

<211> 673

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 9

Met Met His Val Asn Asn Phe Pro Phe Arg Arg His Ser Trp Ile Cys

1 5 10 15

Phe Asp Val Asp Asn Gly Thr Ser Ala Gly Arg Ser Pro Leu Asp Pro

20 25 30

Met Thr Ser Pro Gly Ser Gly Leu Ile Leu Gln Ala Asn Phe Val His

35 40 45

Ser Gln Arg Arg Glu Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr Asp

50 55 60

Leu Ser Pro Lys Ser Met Ser Arg Asn Ser Ser Ile Ala Ser Asp Ile

65 70 75 80

His Gly Asp Asp Leu Ile Val Thr Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala Ser

85 90 95

Leu Arg Thr Val Arg Asn Asn Phe Ala Ala Leu Thr Asn Leu Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Pro Ser Lys Arg Ser Pro Met Cys Asn Gln Pro Ser Ile Asn

115 120 125

Lys Ala Thr Ile Thr Glu Glu Ala Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu Thr

130 135 140

Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr

145 150 155 160

Arg His Ser Val Ser Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu

165 170 175

Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln

180 185 190

Val Ser Glu Phe Ile Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val

195 200 205

Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro

210 215 220

Met Ser Gln Ile Ser Gly Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu

225 230 235 240

Thr Asn Ser Ser Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp

245 250 255

Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val

260 265 270

Phe Arg Ile Ala Glu Leu Ser Gly Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met

275 280 285

His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro

290 295 300

Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His

305 310 315 320

Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln

325 330 335

Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr

340 345 350

Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val

355 360 365

Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu

370 375 380

Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His Leu

385 390 395 400

Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln

405 410 415

Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp

420 425 430

Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp

435 440 445

Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu

450 455 460

Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val

465 470 475 480

His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg

485 490 495

Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg

500 505 510

Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn

515 520 525

Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His

530 535 540

Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp

545 550 555 560

Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile

565 570 575

Pro Gln Ser Pro Ser Pro Ala Pro Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln

580 585 590

Gly Gln Thr Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly

595 600 605

Glu Ser Asp Thr Glu Lys Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr

610 615 620

Ser Cys Ser Asp Ser Lys Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr

625 630 635 640

Glu Ile Pro Leu Asp Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu

645 650 655

Glu Glu Ser Gln Pro Glu Ala Cys Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp

660 665 670

Thr

<210> 10

<211> 8240

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 10

cccctctcgg tagccctgag gctctggcgc cttcaagtga gaagctaagc accagcctct 60

gctgggctgc agaagcggcg gcggcggcag cagcagcagc agcatcagga aggcgctcgg 120

gccagcgcgg tgaacccggg ctgggcagca ggtcgcggag ccgcgagcca ggatggaggc 180

agagggcagc agcgcgccgg cccgggcggg cagcggagag ggcagcgaca gcgccggcgg 240

ggccacgctc aaagccccca agcatctctg gaggcacgag cagcaccacc agtacccgct 300

ccggcagccc cagttccgcc tcctgcatcc ccatcaccac ctgcccccgc cgccgccacc 360

ctcgccccag ccccagcccc agtgtccgct acagccgccg ccgccgcccc ccctgccgcc 420

gcccccgccg ccgcccgggg ctgcccgcgg ccgctacgcc tcgagcgggg ccaccggccg 480

cgtccggcat cgcggctact cggacaccga gcgctacctg tactgtcgcg ccatggaccg 540

cacctcctac gcggtggaga ccggccaccg gcccggcctg aagaaatcca ggatgtcctg 600

gccctcctcg ttccagggac tcaggcgttt tgatgtggac aatggcacat ctgcgggacg 660

gagtcccttg gatcccatga ccagcccagg atccgggcta attctccaag caaattttgt 720

ccacagtcaa cgacgggagt ccttcctgta tcgatccgac agcgattatg acctctctcc 780

aaagtctatg tcccggaact cctccattgc cagtgatata cacggagatg acttgattgt 840

gactccattt gctcaggtct tggccagtct gcgaactgta cgaaacaact ttgctgcatt 900

aactaatttg caagatcgag cacctagcaa aagatcaccc atgtgcaacc aaccatccat 960

caacaaagcc accataacag aggaggccta ccagaaactg gccagcgaga ccctggagga 1020

gctggactgg tgtctggacc agctagagac cctacagacc aggcactccg tcagtgagat 1080

ggcctccaac aagtttaaaa ggatgcttaa tcgggagctc acccatctct ctgaaatgag 1140

tcggtctgga aatcaagtgt cagagtttat atcaaacaca ttcttagata agcaacatga 1200

agtggaaatt ccttctccaa ctcagaagga aaaggagaaa aagaaaagac caatgtctca 1260

gatcagtgga gtcaagaaat tgatgcacag ctctagtctg actaattcaa gtatcccaag 1320

gtttggagtt aaaactgaac aagaagatgt ccttgccaag gaactagaag atgtgaacaa 1380

atggggtctt catgttttca gaatagcaga gttgtctggt aaccggccct tgactgttat 1440

catgcacacc atttttcagg aacgggattt attaaaaaca tttaaaattc cagtagatac 1500

tttaattaca tatcttatga ctctcgaaga ccattaccat gctgatgtgg cctatcacaa 1560

caatatccat gctgcagatg ttgtccagtc tactcatgtg ctattatcta cacctgcttt 1620

ggaggctgtg tttacagatt tggagattct tgcagcaatt tttgccagtg caatacatga 1680

tgtagatcat cctggtgtgt ccaatcaatt tctgatcaat acaaactctg aacttgcctt 1740

gatgtacaat gattcctcag tcttagagaa ccatcatttg gctgtgggct ttaaattgct 1800

tcaggaagaa aactgtgaca ttttccagaa tttgaccaaa aaacaaagac aatctttaag 1860

gaaaatggtc attgacatcg tacttgcaac agatatgtca aaacacatga atctactggc 1920

tgatttgaag actatggttg aaactaagaa agtgacaagc tctggagttc ttcttcttga 1980

taattattcc gataggattc aggttcttca gaatatggtg cactgtgcag atctgagcaa 2040

cccaacaaag cctctccagc tgtaccgcca gtggacggac cggataatgg aggagttctt 2100

ccgccaagga gaccgagaga gggaacgtgg catggagata agccccatgt gtgacaagca 2160

caatgcttcc gtggaaaaat cacaggtggg cttcatagac tatattgttc atcccctctg 2220

ggagacatgg gcagacctcg tccaccctga cgcccaggat attttggaca ctttggagga 2280

caatcgtgaa tggtaccaga gcacaatccc tcagagcccc tctcctgcac ctgatgaccc 2340

agaggagggc cggcagggtc aaactgagaa attccagttt gaactaactt tagaggaaga 2400

tggtgagtca gacacggaaa aggacagtgg cagtcaagtg gaagaagaca ctagctgcag 2460

tgactccaag actctttgta ctcaagactc agagtctact gaaattcccc ttgatgaaca 2520

ggttgaagag gaggcagtag gggaagaaga ggaaagccag cctgaagcct gtgtcataga 2580

tgatcgttct cctgacacgt aacagtgcaa aaactttcat gccttttttt tttttaagta 2640

gaaaaattgt ttccaaagtg catgtcacat gccacaacca cggtcacacc tcactgtcat 2700

ctgccaggac gtttgttgaa caaaactgac cttgactact cagtccagcg ctcaggaata 2760

tcgtaaccag ttttttcacc tccatgtcat ccgagcaagg tggacatctt cacgaacagc 2820

gtttttaaca agatttcagc ttggtagagc tgacaaagca gataaaatct actccaaatt 2880

attttcaaga gagtgtgact catcaggcag cccaaaagtt tattggactt ggggtttcta 2940

ttccttttta tttgtttgca atattttcag aagaaaggca ttgcacagag tgaacttaat 3000

ggacgaagca acaaatatgt caagaacagg acatagcacg aatctgttac cagtaggagg 3060

aggatgagcc acagaaattg cataattttc taatttcaag tcttcctgat acatgactga 3120

atagtgtggt tcagtgagct gcactgacct ctacattttg tatgatatgt aaaacagatt 3180

ttttgtagag cttactttta ttattaaatg tattgaggta ttatatttaa aaaaaactat 3240

gttcagaact tcatctgcca ctggttattt ttttctaagg agtaacttgc aagttttcag 3300

tacaaatctg tgctacactg gataaaaatc taatttatga attttacttg caccttatag 3360

ttcatagcaa ttaactgatt tgtagtgatt cattgtttgt tttatatacc aatgacttcc 3420

atattttaaa agagaaaaac aactttatgt tgcaggaaac cctttttgta agtctttatt 3480

atttactttg cattttgttt cactctttcc agataagcag agttgctctt caccagtgtt 3540

tttcttcatg tgcaaagtga ctatttgttc tataatactt ttatgtgtgt tatatcaaat 3600

gtgtcttaag cttcatgcaa actcagtcat cagttcgtgt tgtctgaagc aagtgggaga 3660

tatataaata cccagtagct aaaatggtca gtctttttta gatgttttcc tacttagtat 3720

ctcctaataa cgttttgctg tgtcactaga tgttcatttc acaagtgcat gtctttctaa 3780

taatccacac atttcatgct ctaataatcc acacatttca tgctcatttt tattgttttt 3840

acagccagtt atagtaagaa aaaggttttt ccccttgtgc tgctttataa tttagcgtgt 3900

gtctgaacct tatccatgtt tgctagatga ggtcttgtca aatatatcac taccattgtc 3960

accggtgaaa agaaacaggt agttaagtta gggttaacat tcatttcaac cacgaggttg 4020

tatatcatga ctagctttta ctcttggttt acagagaaaa gttaaacagc caactaggca 4080

gtttttaaga atattaacaa tatattaaca aacaccaata caactaatcc tatttggttt 4140

taatgatttc accatgggat taagaactat atcaggaaca tccctgagaa acggttttaa 4200

gtgtagcaac tactcttcct taatggacag ccacataacg tgtaggaagt cctttatcac 4260

ttatcctcga tccataagca tatcttgcag aggggaacta cttctttaaa cacatggagg 4320

gaaagaagat gatgccactg gcaccagagg gttagtactg tgatgcatcc taaaatattt 4380

attatattgg taaaaattct ggttaaataa aaaattagag atcactcttg gctgatttca 4440

gcaccaggaa ctgtattaca gttttagaga ttaattccta gtgtttacct gattatagca 4500

gttggcatca tggggcattt aattctgact ttatccccac gtcagcctta ataaagtctt 4560

ctttaccttc tctatgaaga ctttaaagcc caaataatca tttttcacat tgatattcaa 4620

gaattgagat agatagaagc caaagtgggt atctgacaag tggaaaatca aacgtttaag 4680

aagaattaca actctgaaaa gcatttatat gtggaacttc tcaaggagcc tcctggggac 4740

tggaaagtaa gtcatcagcc aggcaaatga ctcatgctga agagagtccc catttcagtc 4800

ccctgagatc tagctgatgc ttagatcctt tgaaataaaa attatgtctt tataactctg 4860

atcttttaca taaagcagaa gaggaatcaa ctagttaatt gcaaggtttc tactctgttt 4920

cctctgtaaa gatcagatgg taatctttca aataagaaaa aaataaagac gtatgtttga 4980

ccaagtagtt tcacaagaat atttgggaac ttgtttcttt taattttatt tgtccctgag 5040

tgaagtctag aaagaaaggt aaagagtcta gagtttattc ctctttccaa aacattctca 5100

ttcctctcct ccctacactt agtatttccc ccacagagtg cctagaatct taataatgaa 5160

taaaataaaa agcagcaata tgtcattaac aaatccagac ctgaaagggt aaagggttta 5220

taactgcact aataaagaga ggctcttttt ttttcttcca gtttgttggt ttttaatggt 5280

accgtgttgt aaagataccc actaatggac aatcaaattg cagaaaaggc tcaatatcca 5340

agagacaggg actaatgcac tgtacaatct gcttatcctt gcccttctct cttgccaaag 5400

tgtgcttcag aaatatatac tgctttaaaa aagaataaaa gaatatcctt ttacaagtgg 5460

ctttacattt cctaaaatgc cataagaaaa tgcaatatct gggtactgta tggggaaaaa 5520

aatgtccaag tttgtgtaaa accagtgcat ttcagcttgc aagttactga acacaataat 5580

gctgttttaa ttttgtttta tatcagttaa aattcacaat aatgtagata gaacaaatta 5640

cagacaagga aagaaaaaac ttgaatgaaa tggattttac agaaagcttt atgataattt 5700

ttgaatgcat tatttatttt ttgtgccatg catttttttt ctcaccaaat gaccttacct 5760

gtaatacagt cttgtttgtc tgtttacaac catgtattta ttgcaatgta catactgtaa 5820

tgttaattgt aaattatctg ttcttattaa aacatcatcc catgatggga tggtgttgat 5880

atatttggaa actcttggtg agagaatgaa tggtgtgtat acatactctg tacatttttc 5940

ttttctcctg taatatagtc ttgtcacctt agagcttgtt tatggaagat tcaagaaaac 6000

tataaaatac ttaaagatat ataaatttaa aaaaacatag ctgcaggtct ttggtcccag 6060

ggctgtgcct taactttaac caatattttc ttctgttttg ctgcatttga aaggtaacag 6120

tggagctagg gctgggcatt ttacatccag gcttttaatt gattagaatt ctgccaatag 6180

gtggatttta caaaaccaca gacaacctct gaaagattct gagacccttt tgagacagaa 6240

gctcttaagt acttcttgcc agggagcagc actgcatgtg tgatggttgt ttgccatctg 6300

ttgatcagga actacttcag ctacttgcat ttgattattt cctttttttt tttttttaac 6360

tcggaaacac aactggggaa atatattctt tcccagtgat tataaacaat ctttttcttt 6420

tttttaagtc cttttggctt ctagagctca taggaaaatg gacttgattt gaaattggag 6480

ccagagttta ctcgtgttgg ttatctattc atcagcttcc tgacatgtta agagaataca 6540

ttaaagagaa aatactgttt tttaatccta aaatttttct tccactaaga taaaccaaat 6600

gtccttacat atatgtaaac ccatctattt aaacgcaaag gtgggttgat gtcagtttac 6660

atagcagaaa gcattcacta tcctctaaga tttgtttctg caaaactttc attgctttag 6720

aattttaaaa tttcaccttg tacaatggcc agcccctaaa gcaggaaaca tttataatgg 6780

attatatgga aacatcctcc cagtacttgc ccagcccttg aatcatgtgg cttttcagtg 6840

aaaggaaaga ttctttttct aggaaaaatg agcctatttt attttatttt attttatttt 6900

ttgacacaaa ctgtagattt tagcagccct ggcccaaagg aatttgatta cttttgtttt 6960

aaacagtaca aaggggacac tataattaca aaaacatcct taactgattt gagttgtttt 7020

tatttctttg gatatatttt cagagtggta aattgtgtgt gagaattaca aatgattatt 7080

cttttagtgg tttcttagcc tctcttacag cccacgggga tagtactgta catcaatacc 7140

ttcatatgaa atttttatat gcaatgaaaa taaaagcatg ggttgattct gcctatttat 7200

gactcaatct tttacaaata aaagattatt cattttaaat tatagttcaa tcagcatgtc 7260

tcttaggata ctgaacgtgg ttgaaatgaa aggatagtga catcataagt tagtactgat 7320

attcataacc aaataaagcc aacttgagta attttgctac attaaaaatt accaaaatta 7380

cttagatggc ctataagatt aagcatggtg ttttctaagc aagctttgaa aggggccttc 7440

catacttact taattgaata ttctgggata ttgaaaatta ttcagatact tgacaattat 7500

ttttggttac ctactccgca aactacaaag ttttaaggac tcaacaataa gttaatgaga 7560

cacagtgttt gctttcatgg agcttacagt ctggagggga caaaggctta aacaatactc 7620

atataattat atatgtgatc agtacaatga aggagctcag tggggtaaat aagcaggaac 7680

ctgaacttga tctgttccgg agggccacag aaggcttcct tgaggccttg agaaagtgat 7740

ttgcatctga gttctgaagg attgtaagag gtaactaggg aaaaagttga caggaagagg 7800

aaggggatcc agacaagaaa catttgcaaa gatcttgagg cataaatgag cttgagacat 7860

ctggagaaac tgaggaaaag tgagagagta ggcagggcct ggagccgcag agccattgct 7920

aaccatcctg tgtgagatat cccccattct gtagctttat tctcataacc ctgctcaatt 7980

ttctttataa cacttctcac agatttatat acgtgtttgt ttttgttatc tgtctctccc 8040

accagaccac agctccatga gagcaaggtc tttgcttacc aatatatcac tagcacttaa 8100

aactatgcct ggtacacagt aggttcttaa tatgtgttga atatagccat caaattgata 8160

ttggatataa ttcaatctga taagatattt tgagatatta aagagttttt aacttgatac 8220

cataaaaaaa aaaaaaaaaa 8240

<210> 11

<211> 809

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 11

Met Glu Ala Glu Gly Ser Ser Ala Pro Ala Arg Ala Gly Ser Gly Glu

1 5 10 15

Gly Ser Asp Ser Ala Gly Gly Ala Thr Leu Lys Ala Pro Lys His Leu

20 25 30

Trp Arg His Glu Gln His His Gln Tyr Pro Leu Arg Gln Pro Gln Phe

35 40 45

Arg Leu Leu His Pro His His His Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser

50 55 60

Pro Gln Pro Gln Pro Gln Cys Pro Leu Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro

65 70 75 80

Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ala Arg Gly Arg Tyr Ala

85 90 95

Ser Ser Gly Ala Thr Gly Arg Val Arg His Arg Gly Tyr Ser Asp Thr

100 105 110

Glu Arg Tyr Leu Tyr Cys Arg Ala Met Asp Arg Thr Ser Tyr Ala Val

115 120 125

Glu Thr Gly His Arg Pro Gly Leu Lys Lys Ser Arg Met Ser Trp Pro

130 135 140

Ser Ser Phe Gln Gly Leu Arg Arg Phe Asp Val Asp Asn Gly Thr Ser

145 150 155 160

Ala Gly Arg Ser Pro Leu Asp Pro Met Thr Ser Pro Gly Ser Gly Leu

165 170 175

Ile Leu Gln Ala Asn Phe Val His Ser Gln Arg Arg Glu Ser Phe Leu

180 185 190

Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Lys Ser Met Ser Arg

195 200 205

Asn Ser Ser Ile Ala Ser Asp Ile His Gly Asp Asp Leu Ile Val Thr

210 215 220

Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala Ser Leu Arg Thr Val Arg Asn Asn Phe

225 230 235 240

Ala Ala Leu Thr Asn Leu Gln Asp Arg Ala Pro Ser Lys Arg Ser Pro

245 250 255

Met Cys Asn Gln Pro Ser Ile Asn Lys Ala Thr Ile Thr Glu Glu Ala

260 265 270

Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu

275 280 285

Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr Arg His Ser Val Ser Glu Met Ala

290 295 300

Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser

305 310 315 320

Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Phe Ile Ser Asn Thr

325 330 335

Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys

340 345 350

Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser Gly Val Lys

355 360 365

Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro Arg Phe

370 375 380

Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp

385 390 395 400

Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu Ser Gly

405 410 415

Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp

420 425 430

Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu

435 440 445

Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn

450 455 460

Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr

465 470 475 480

Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile

485 490 495

Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln

500 505 510

Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser

515 520 525

Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln

530 535 540

Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln

545 550 555 560

Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser

565 570 575

Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys

580 585 590

Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg

595 600 605

Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro

610 615 620

Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu

625 630 635 640

Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile

645 650 655

Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val

660 665 670

Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp

675 680 685

Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn

690 695 700

Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Ala Pro

705 710 715 720

Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys Phe Gln Phe

725 730 735

Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu Lys Asp Ser

740 745 750

Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser Lys Thr Leu

755 760 765

Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp Glu Gln Val

770 775 780

Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro Glu Ala Cys

785 790 795 800

Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp Thr

805

<210> 12

<211> 7979

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 12

cagcagcagg ctcagacctg cttccctgga catttccggg accgtgagcg agggaaccac 60

gttgccctgg attcttgcca gctgtacaaa gttgaccagg aaaatggctc agcagacaag 120

cccggacact ttaacagtac ctgaagtgga taatccgcat tgtccaaacc cgtggctgaa 180

cgaagacctt gtgaaatcct tgcgagaaaa cctgttgcag catgagaagt ccaagacagc 240

gaggaaatcg gtttctccca agctctctcc agtgatctct ccgagaaatt cccccaggct 300

tctgcgcaga atgcttctca gcagcaacat ccccaaacag cggcgtttca cggtggcaca 360

tacatgtttt gatgtggaca atggcacatc tgcgggacgg agtcccttgg atcccatgac 420

cagcccagga tccgggctaa ttctccaagc aaattttgtc cacagtcaac gacgggagtc 480

cttcctgtat cgatccgaca gcgattatga cctctctcca aagtctatgt cccggaactc 540

ctccattgcc agtgatatac acggagatga cttgattgtg actccatttg ctcaggtctt 600

ggccagtctg cgaactgtac gaaacaactt tgctgcatta actaatttgc aagatcgagc 660

acctagcaaa agatcaccca tgtgcaacca accatccatc aacaaagcca ccataacaga 720

ggaggcctac cagaaactgg ccagcgagac cctggaggag ctggactggt gtctggacca 780

gctagagacc ctacagacca ggcactccgt cagtgagatg gcctccaaca agtttaaaag 840

gatgcttaat cgggagctca cccatctctc tgaaatgagt cggtctggaa atcaagtgtc 900

agagtttata tcaaacacat tcttagataa gcaacatgaa gtggaaattc cttctccaac 960

tcagaaggaa aaggagaaaa agaaaagacc aatgtctcag atcagtggag tcaagaaatt 1020

gatgcacagc tctagtctga ctaattcaag tatcccaagg tttggagtta aaactgaaca 1080

agaagatgtc cttgccaagg aactagaaga tgtgaacaaa tggggtcttc atgttttcag 1140

aatagcagag ttgtctggta accggccctt gactgttatc atgcacacca tttttcagga 1200

acgggattta ttaaaaacat ttaaaattcc agtagatact ttaattacat atcttatgac 1260

tctcgaagac cattaccatg ctgatgtggc ctatcacaac aatatccatg ctgcagatgt 1320

tgtccagtct actcatgtgc tattatctac acctgctttg gaggctgtgt ttacagattt 1380

ggagattctt gcagcaattt ttgccagtgc aatacatgat gtagatcatc ctggtgtgtc 1440

caatcaattt ctgatcaata caaactctga acttgccttg atgtacaatg attcctcagt 1500

cttagagaac catcatttgg ctgtgggctt taaattgctt caggaagaaa actgtgacat 1560

tttccagaat ttgaccaaaa aacaaagaca atctttaagg aaaatggtca ttgacatcgt 1620

acttgcaaca gatatgtcaa aacacatgaa tctactggct gatttgaaga ctatggttga 1680

aactaagaaa gtgacaagct ctggagttct tcttcttgat aattattccg ataggattca 1740

ggttcttcag aatatggtgc actgtgcaga tctgagcaac ccaacaaagc ctctccagct 1800

gtaccgccag tggacggacc ggataatgga ggagttcttc cgccaaggag accgagagag 1860

ggaacgtggc atggagataa gccccatgtg tgacaagcac aatgcttccg tggaaaaatc 1920

acaggtgggc ttcatagact atattgttca tcccctctgg gagacatggg cagacctcgt 1980

ccaccctgac gcccaggata ttttggacac tttggaggac aatcgtgaat ggtaccagag 2040

cacaatccct cagagcccct ctcctgcacc tgatgaccca gaggagggcc ggcagggtca 2100

aactgagaaa ttccagtttg aactaacttt agaggaagat ggtgagtcag acacggaaaa 2160

ggacagtggc agtcaagtgg aagaagacac tagctgcagt gactccaaga ctctttgtac 2220

tcaagactca gagtctactg aaattcccct tgatgaacag gttgaagagg aggcagtagg 2280

ggaagaagag gaaagccagc ctgaagcctg tgtcatagat gatcgttctc ctgacacgta 2340

acagtgcaaa aactttcatg cctttttttt ttttaagtag aaaaattgtt tccaaagtgc 2400

atgtcacatg ccacaaccac ggtcacacct cactgtcatc tgccaggacg tttgttgaac 2460

aaaactgacc ttgactactc agtccagcgc tcaggaatat cgtaaccagt tttttcacct 2520

ccatgtcatc cgagcaaggt ggacatcttc acgaacagcg tttttaacaa gatttcagct 2580

tggtagagct gacaaagcag ataaaatcta ctccaaatta ttttcaagag agtgtgactc 2640

atcaggcagc ccaaaagttt attggacttg gggtttctat tcctttttat ttgtttgcaa 2700

tattttcaga agaaaggcat tgcacagagt gaacttaatg gacgaagcaa caaatatgtc 2760

aagaacagga catagcacga atctgttacc agtaggagga ggatgagcca cagaaattgc 2820

ataattttct aatttcaagt cttcctgata catgactgaa tagtgtggtt cagtgagctg 2880

cactgacctc tacattttgt atgatatgta aaacagattt tttgtagagc ttacttttat 2940

tattaaatgt attgaggtat tatatttaaa aaaaactatg ttcagaactt catctgccac 3000

tggttatttt tttctaagga gtaacttgca agttttcagt acaaatctgt gctacactgg 3060

ataaaaatct aatttatgaa ttttacttgc accttatagt tcatagcaat taactgattt 3120

gtagtgattc attgtttgtt ttatatacca atgacttcca tattttaaaa gagaaaaaca 3180

actttatgtt gcaggaaacc ctttttgtaa gtctttatta tttactttgc attttgtttc 3240

actctttcca gataagcaga gttgctcttc accagtgttt ttcttcatgt gcaaagtgac 3300

tatttgttct ataatacttt tatgtgtgtt atatcaaatg tgtcttaagc ttcatgcaaa 3360

ctcagtcatc agttcgtgtt gtctgaagca agtgggagat atataaatac ccagtagcta 3420

aaatggtcag tcttttttag atgttttcct acttagtatc tcctaataac gttttgctgt 3480

gtcactagat gttcatttca caagtgcatg tctttctaat aatccacaca tttcatgctc 3540

taataatcca cacatttcat gctcattttt attgttttta cagccagtta tagtaagaaa 3600

aaggtttttc cccttgtgct gctttataat ttagcgtgtg tctgaacctt atccatgttt 3660

gctagatgag gtcttgtcaa atatatcact accattgtca ccggtgaaaa gaaacaggta 3720

gttaagttag ggttaacatt catttcaacc acgaggttgt atatcatgac tagcttttac 3780

tcttggttta cagagaaaag ttaaacagcc aactaggcag tttttaagaa tattaacaat 3840

atattaacaa acaccaatac aactaatcct atttggtttt aatgatttca ccatgggatt 3900

aagaactata tcaggaacat ccctgagaaa cggttttaag tgtagcaact actcttcctt 3960

aatggacagc cacataacgt gtaggaagtc ctttatcact tatcctcgat ccataagcat 4020

atcttgcaga ggggaactac ttctttaaac acatggaggg aaagaagatg atgccactgg 4080

caccagaggg ttagtactgt gatgcatcct aaaatattta ttatattggt aaaaattctg 4140

gttaaataaa aaattagaga tcactcttgg ctgatttcag caccaggaac tgtattacag 4200

ttttagagat taattcctag tgtttacctg attatagcag ttggcatcat ggggcattta 4260

attctgactt tatccccacg tcagccttaa taaagtcttc tttaccttct ctatgaagac 4320

tttaaagccc aaataatcat ttttcacatt gatattcaag aattgagata gatagaagcc 4380

aaagtgggta tctgacaagt ggaaaatcaa acgtttaaga agaattacaa ctctgaaaag 4440

catttatatg tggaacttct caaggagcct cctggggact ggaaagtaag tcatcagcca 4500

ggcaaatgac tcatgctgaa gagagtcccc atttcagtcc cctgagatct agctgatgct 4560

tagatccttt gaaataaaaa ttatgtcttt ataactctga tcttttacat aaagcagaag 4620

aggaatcaac tagttaattg caaggtttct actctgtttc ctctgtaaag atcagatggt 4680

aatctttcaa ataagaaaaa aataaagacg tatgtttgac caagtagttt cacaagaata 4740

tttgggaact tgtttctttt aattttattt gtccctgagt gaagtctaga aagaaaggta 4800

aagagtctag agtttattcc tctttccaaa acattctcat tcctctcctc cctacactta 4860

gtatttcccc cacagagtgc ctagaatctt aataatgaat aaaataaaaa gcagcaatat 4920

gtcattaaca aatccagacc tgaaagggta aagggtttat aactgcacta ataaagagag 4980

gctctttttt tttcttccag tttgttggtt tttaatggta ccgtgttgta aagataccca 5040

ctaatggaca atcaaattgc agaaaaggct caatatccaa gagacaggga ctaatgcact 5100

gtacaatctg cttatccttg cccttctctc ttgccaaagt gtgcttcaga aatatatact 5160

gctttaaaaa agaataaaag aatatccttt tacaagtggc tttacatttc ctaaaatgcc 5220

ataagaaaat gcaatatctg ggtactgtat ggggaaaaaa atgtccaagt ttgtgtaaaa 5280

ccagtgcatt tcagcttgca agttactgaa cacaataatg ctgttttaat tttgttttat 5340

atcagttaaa attcacaata atgtagatag aacaaattac agacaaggaa agaaaaaact 5400

tgaatgaaat ggattttaca gaaagcttta tgataatttt tgaatgcatt atttattttt 5460

tgtgccatgc attttttttc tcaccaaatg accttacctg taatacagtc ttgtttgtct 5520

gtttacaacc atgtatttat tgcaatgtac atactgtaat gttaattgta aattatctgt 5580

tcttattaaa acatcatccc atgatgggat ggtgttgata tatttggaaa ctcttggtga 5640

gagaatgaat ggtgtgtata catactctgt acatttttct tttctcctgt aatatagtct 5700

tgtcacctta gagcttgttt atggaagatt caagaaaact ataaaatact taaagatata 5760

taaatttaaa aaaacatagc tgcaggtctt tggtcccagg gctgtgcctt aactttaacc 5820

aatattttct tctgttttgc tgcatttgaa aggtaacagt ggagctaggg ctgggcattt 5880

tacatccagg cttttaattg attagaattc tgccaatagg tggattttac aaaaccacag 5940

acaacctctg aaagattctg agaccctttt gagacagaag ctcttaagta cttcttgcca 6000

gggagcagca ctgcatgtgt gatggttgtt tgccatctgt tgatcaggaa ctacttcagc 6060

tacttgcatt tgattatttc cttttttttt ttttttaact cggaaacaca actggggaaa 6120

tatattcttt cccagtgatt ataaacaatc tttttctttt ttttaagtcc ttttggcttc 6180

tagagctcat aggaaaatgg acttgatttg aaattggagc cagagtttac tcgtgttggt 6240

tatctattca tcagcttcct gacatgttaa gagaatacat taaagagaaa atactgtttt 6300

ttaatcctaa aatttttctt ccactaagat aaaccaaatg tccttacata tatgtaaacc 6360

catctattta aacgcaaagg tgggttgatg tcagtttaca tagcagaaag cattcactat 6420

cctctaagat ttgtttctgc aaaactttca ttgctttaga attttaaaat ttcaccttgt 6480

acaatggcca gcccctaaag caggaaacat ttataatgga ttatatggaa acatcctccc 6540

agtacttgcc cagcccttga atcatgtggc ttttcagtga aaggaaagat tctttttcta 6600

ggaaaaatga gcctatttta ttttatttta ttttattttt tgacacaaac tgtagatttt 6660

agcagccctg gcccaaagga atttgattac ttttgtttta aacagtacaa aggggacact 6720

ataattacaa aaacatcctt aactgatttg agttgttttt atttctttgg atatattttc 6780

agagtggtaa attgtgtgtg agaattacaa atgattattc ttttagtggt ttcttagcct 6840

ctcttacagc ccacggggat agtactgtac atcaatacct tcatatgaaa tttttatatg 6900

caatgaaaat aaaagcatgg gttgattctg cctatttatg actcaatctt ttacaaataa 6960

aagattattc attttaaatt atagttcaat cagcatgtct cttaggatac tgaacgtggt 7020

tgaaatgaaa ggatagtgac atcataagtt agtactgata ttcataacca aataaagcca 7080

acttgagtaa ttttgctaca ttaaaaatta ccaaaattac ttagatggcc tataagatta 7140

agcatggtgt tttctaagca agctttgaaa ggggccttcc atacttactt aattgaatat 7200

tctgggatat tgaaaattat tcagatactt gacaattatt tttggttacc tactccgcaa 7260

actacaaagt tttaaggact caacaataag ttaatgagac acagtgtttg ctttcatgga 7320

gcttacagtc tggaggggac aaaggcttaa acaatactca tataattata tatgtgatca 7380

gtacaatgaa ggagctcagt ggggtaaata agcaggaacc tgaacttgat ctgttccgga 7440

gggccacaga aggcttcctt gaggccttga gaaagtgatt tgcatctgag ttctgaagga 7500

ttgtaagagg taactaggga aaaagttgac aggaagagga aggggatcca gacaagaaac 7560

atttgcaaag atcttgaggc ataaatgagc ttgagacatc tggagaaact gaggaaaagt 7620

gagagagtag gcagggcctg gagccgcaga gccattgcta accatcctgt gtgagatatc 7680

ccccattctg tagctttatt ctcataaccc tgctcaattt tctttataac acttctcaca 7740

gatttatata cgtgtttgtt tttgttatct gtctctccca ccagaccaca gctccatgag 7800

agcaaggtct ttgcttacca atatatcact agcacttaaa actatgcctg gtacacagta 7860

ggttcttaat atgtgttgaa tatagccatc aaattgatat tggatataat tcaatctgat 7920

aagatatttt gagatattaa agagttttta acttgatacc ataaaaaaaa aaaaaaaaa 7979

<210> 13

<211> 745

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 13

Met Ala Gln Gln Thr Ser Pro Asp Thr Leu Thr Val Pro Glu Val Asp

1 5 10 15

Asn Pro His Cys Pro Asn Pro Trp Leu Asn Glu Asp Leu Val Lys Ser

20 25 30

Leu Arg Glu Asn Leu Leu Gln His Glu Lys Ser Lys Thr Ala Arg Lys

35 40 45

Ser Val Ser Pro Lys Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro Arg Asn Ser Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Arg Arg Met Leu Leu Ser Ser Asn Ile Pro Lys Gln Arg

65 70 75 80

Arg Phe Thr Val Ala His Thr Cys Phe Asp Val Asp Asn Gly Thr Ser

85 90 95

Ala Gly Arg Ser Pro Leu Asp Pro Met Thr Ser Pro Gly Ser Gly Leu

100 105 110

Ile Leu Gln Ala Asn Phe Val His Ser Gln Arg Arg Glu Ser Phe Leu

115 120 125

Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Lys Ser Met Ser Arg

130 135 140

Asn Ser Ser Ile Ala Ser Asp Ile His Gly Asp Asp Leu Ile Val Thr

145 150 155 160

Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala Ser Leu Arg Thr Val Arg Asn Asn Phe

165 170 175

Ala Ala Leu Thr Asn Leu Gln Asp Arg Ala Pro Ser Lys Arg Ser Pro

180 185 190

Met Cys Asn Gln Pro Ser Ile Asn Lys Ala Thr Ile Thr Glu Glu Ala

195 200 205

Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu

210 215 220

Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr Arg His Ser Val Ser Glu Met Ala

225 230 235 240

Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser

245 250 255

Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Phe Ile Ser Asn Thr

260 265 270

Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys

275 280 285

Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser Gly Val Lys

290 295 300

Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro Arg Phe

305 310 315 320

Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp

325 330 335

Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu Ser Gly

340 345 350

Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp

355 360 365

Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu

370 375 380

Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn

385 390 395 400

Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr

405 410 415

Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile

420 425 430

Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln

435 440 445

Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser

450 455 460

Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln

465 470 475 480

Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln

485 490 495

Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser

500 505 510

Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys

515 520 525

Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg

530 535 540

Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro

545 550 555 560

Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu

565 570 575

Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile

580 585 590

Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val

595 600 605

Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp

610 615 620

Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn

625 630 635 640

Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Ala Pro

645 650 655

Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys Phe Gln Phe

660 665 670

Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu Lys Asp Ser

675 680 685

Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser Lys Thr Leu

690 695 700

Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp Glu Gln Val

705 710 715 720

Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro Glu Ala Cys

725 730 735

Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp Thr

740 745

<210> 14

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D5_прямой праймер

<400> 14

gcttctcagc agcaacatc 19

<210> 15

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D5_обратный праймер

<400> 15

tgccattgtc cacatcaaaa 20

<210> 16

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд PDE4D5

<400> 16

acagcggcgt ttcacggtgg caca 24

<210> 17

<211> 7591

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 17

agttccttat ttggtagctt ttgacaggac tagcctttct tgcaactaag catcttgaca 60

tacattattc attaagccct ggagctcggg agagaaagat gcagaccctt agatctttag 120

atattccttt atcacgtgga ttttctttat tcagaatagt tgctgaattt tgtgccattc 180

tggagtctta caaatggcat gtattcgatg ggaagacggc tggatgggat ttaatgcgag 240

gctttcttat gtatacttaa ttaccaaaaa tctttaaaaa ctcatactct gcgtggcttg 300

tggaggttgt taaagtgtcg agattttgaa gctaaataca ttttagagct tactatatat 360

atacatatat atatatatac atataatcaa tcaaaaatgc ctgaagcaaa ctatttactg 420

tcagtgtctt ggggctacat aaagtttaaa aggatgctta atcgggagct cacccatctc 480

tctgaaatga gtcggtctgg aaatcaagtg tcagagttta tatcaaacac attcttagat 540

aagcaacatg aagtggaaat tccttctcca actcagaagg aaaaggagaa aaagaaaaga 600

ccaatgtctc agatcagtgg agtcaagaaa ttgatgcaca gctctagtct gactaattca 660

agtatcccaa ggtttggagt taaaactgaa caagaagatg tccttgccaa ggaactagaa 720

gatgtgaaca aatggggtct tcatgttttc agaatagcag agttgtctgg taaccggccc 780

ttgactgtta tcatgcacac catttttcag gaacgggatt tattaaaaac atttaaaatt 840

ccagtagata ctttaattac atatcttatg actctcgaag accattacca tgctgatgtg 900

gcctatcaca acaatatcca tgctgcagat gttgtccagt ctactcatgt gctattatct 960

acacctgctt tggaggctgt gtttacagat ttggagattc ttgcagcaat ttttgccagt 1020

gcaatacatg atgtagatca tcctggtgtg tccaatcaat ttctgatcaa tacaaactct 1080

gaacttgcct tgatgtacaa tgattcctca gtcttagaga accatcattt ggctgtgggc 1140

tttaaattgc ttcaggaaga aaactgtgac attttccaga atttgaccaa aaaacaaaga 1200

caatctttaa ggaaaatggt cattgacatc gtacttgcaa cagatatgtc aaaacacatg 1260

aatctactgg ctgatttgaa gactatggtt gaaactaaga aagtgacaag ctctggagtt 1320

cttcttcttg ataattattc cgataggatt caggttcttc agaatatggt gcactgtgca 1380

gatctgagca acccaacaaa gcctctccag ctgtaccgcc agtggacgga ccggataatg 1440

gaggagttct tccgccaagg agaccgagag agggaacgtg gcatggagat aagccccatg 1500

tgtgacaagc acaatgcttc cgtggaaaaa tcacaggtgg gcttcataga ctatattgtt 1560

catcccctct gggagacatg ggcagacctc gtccaccctg acgcccagga tattttggac 1620

actttggagg acaatcgtga atggtaccag agcacaatcc ctcagagccc ctctcctgca 1680

cctgatgacc cagaggaggg ccggcagggt caaactgaga aattccagtt tgaactaact 1740

ttagaggaag atggtgagtc agacacggaa aaggacagtg gcagtcaagt ggaagaagac 1800

actagctgca gtgactccaa gactctttgt actcaagact cagagtctac tgaaattccc 1860

cttgatgaac aggttgaaga ggaggcagta ggggaagaag aggaaagcca gcctgaagcc 1920

tgtgtcatag atgatcgttc tcctgacacg taacagtgca aaaactttca tgcctttttt 1980

ttttttaagt agaaaaattg tttccaaagt gcatgtcaca tgccacaacc acggtcacac 2040

ctcactgtca tctgccagga cgtttgttga acaaaactga ccttgactac tcagtccagc 2100

gctcaggaat atcgtaacca gttttttcac ctccatgtca tccgagcaag gtggacatct 2160

tcacgaacag cgtttttaac aagatttcag cttggtagag ctgacaaagc agataaaatc 2220

tactccaaat tattttcaag agagtgtgac tcatcaggca gcccaaaagt ttattggact 2280

tggggtttct attccttttt atttgtttgc aatattttca gaagaaaggc attgcacaga 2340

gtgaacttaa tggacgaagc aacaaatatg tcaagaacag gacatagcac gaatctgtta 2400

ccagtaggag gaggatgagc cacagaaatt gcataatttt ctaatttcaa gtcttcctga 2460

tacatgactg aatagtgtgg ttcagtgagc tgcactgacc tctacatttt gtatgatatg 2520

taaaacagat tttttgtaga gcttactttt attattaaat gtattgaggt attatattta 2580

aaaaaaacta tgttcagaac ttcatctgcc actggttatt tttttctaag gagtaacttg 2640

caagttttca gtacaaatct gtgctacact ggataaaaat ctaatttatg aattttactt 2700

gcaccttata gttcatagca attaactgat ttgtagtgat tcattgtttg ttttatatac 2760

caatgacttc catattttaa aagagaaaaa caactttatg ttgcaggaaa ccctttttgt 2820

aagtctttat tatttacttt gcattttgtt tcactctttc cagataagca gagttgctct 2880

tcaccagtgt ttttcttcat gtgcaaagtg actatttgtt ctataatact tttatgtgtg 2940

ttatatcaaa tgtgtcttaa gcttcatgca aactcagtca tcagttcgtg ttgtctgaag 3000

caagtgggag atatataaat acccagtagc taaaatggtc agtctttttt agatgttttc 3060

ctacttagta tctcctaata acgttttgct gtgtcactag atgttcattt cacaagtgca 3120

tgtctttcta ataatccaca catttcatgc tctaataatc cacacatttc atgctcattt 3180

ttattgtttt tacagccagt tatagtaaga aaaaggtttt tccccttgtg ctgctttata 3240

atttagcgtg tgtctgaacc ttatccatgt ttgctagatg aggtcttgtc aaatatatca 3300

ctaccattgt caccggtgaa aagaaacagg tagttaagtt agggttaaca ttcatttcaa 3360

ccacgaggtt gtatatcatg actagctttt actcttggtt tacagagaaa agttaaacag 3420

ccaactaggc agtttttaag aatattaaca atatattaac aaacaccaat acaactaatc 3480

ctatttggtt ttaatgattt caccatggga ttaagaacta tatcaggaac atccctgaga 3540

aacggtttta agtgtagcaa ctactcttcc ttaatggaca gccacataac gtgtaggaag 3600

tcctttatca cttatcctcg atccataagc atatcttgca gaggggaact acttctttaa 3660

acacatggag ggaaagaaga tgatgccact ggcaccagag ggttagtact gtgatgcatc 3720

ctaaaatatt tattatattg gtaaaaattc tggttaaata aaaaattaga gatcactctt 3780

ggctgatttc agcaccagga actgtattac agttttagag attaattcct agtgtttacc 3840

tgattatagc agttggcatc atggggcatt taattctgac tttatcccca cgtcagcctt 3900

aataaagtct tctttacctt ctctatgaag actttaaagc ccaaataatc atttttcaca 3960

ttgatattca agaattgaga tagatagaag ccaaagtggg tatctgacaa gtggaaaatc 4020

aaacgtttaa gaagaattac aactctgaaa agcatttata tgtggaactt ctcaaggagc 4080

ctcctgggga ctggaaagta agtcatcagc caggcaaatg actcatgctg aagagagtcc 4140

ccatttcagt cccctgagat ctagctgatg cttagatcct ttgaaataaa aattatgtct 4200

ttataactct gatcttttac ataaagcaga agaggaatca actagttaat tgcaaggttt 4260

ctactctgtt tcctctgtaa agatcagatg gtaatctttc aaataagaaa aaaataaaga 4320

cgtatgtttg accaagtagt ttcacaagaa tatttgggaa cttgtttctt ttaattttat 4380

ttgtccctga gtgaagtcta gaaagaaagg taaagagtct agagtttatt cctctttcca 4440

aaacattctc attcctctcc tccctacact tagtatttcc cccacagagt gcctagaatc 4500

ttaataatga ataaaataaa aagcagcaat atgtcattaa caaatccaga cctgaaaggg 4560

taaagggttt ataactgcac taataaagag aggctctttt tttttcttcc agtttgttgg 4620

tttttaatgg taccgtgttg taaagatacc cactaatgga caatcaaatt gcagaaaagg 4680

ctcaatatcc aagagacagg gactaatgca ctgtacaatc tgcttatcct tgcccttctc 4740

tcttgccaaa gtgtgcttca gaaatatata ctgctttaaa aaagaataaa agaatatcct 4800

tttacaagtg gctttacatt tcctaaaatg ccataagaaa atgcaatatc tgggtactgt 4860

atggggaaaa aaatgtccaa gtttgtgtaa aaccagtgca tttcagcttg caagttactg 4920

aacacaataa tgctgtttta attttgtttt atatcagtta aaattcacaa taatgtagat 4980

agaacaaatt acagacaagg aaagaaaaaa cttgaatgaa atggatttta cagaaagctt 5040

tatgataatt tttgaatgca ttatttattt tttgtgccat gcattttttt tctcaccaaa 5100

tgaccttacc tgtaatacag tcttgtttgt ctgtttacaa ccatgtattt attgcaatgt 5160

acatactgta atgttaattg taaattatct gttcttatta aaacatcatc ccatgatggg 5220

atggtgttga tatatttgga aactcttggt gagagaatga atggtgtgta tacatactct 5280

gtacattttt cttttctcct gtaatatagt cttgtcacct tagagcttgt ttatggaaga 5340

ttcaagaaaa ctataaaata cttaaagata tataaattta aaaaaacata gctgcaggtc 5400

tttggtccca gggctgtgcc ttaactttaa ccaatatttt cttctgtttt gctgcatttg 5460

aaaggtaaca gtggagctag ggctgggcat tttacatcca ggcttttaat tgattagaat 5520

tctgccaata ggtggatttt acaaaaccac agacaacctc tgaaagattc tgagaccctt 5580

ttgagacaga agctcttaag tacttcttgc cagggagcag cactgcatgt gtgatggttg 5640

tttgccatct gttgatcagg aactacttca gctacttgca tttgattatt tccttttttt 5700

ttttttttaa ctcggaaaca caactgggga aatatattct ttcccagtga ttataaacaa 5760

tctttttctt ttttttaagt ccttttggct tctagagctc ataggaaaat ggacttgatt 5820

tgaaattgga gccagagttt actcgtgttg gttatctatt catcagcttc ctgacatgtt 5880

aagagaatac attaaagaga aaatactgtt ttttaatcct aaaatttttc ttccactaag 5940

ataaaccaaa tgtccttaca tatatgtaaa cccatctatt taaacgcaaa ggtgggttga 6000

tgtcagttta catagcagaa agcattcact atcctctaag atttgtttct gcaaaacttt 6060

cattgcttta gaattttaaa atttcacctt gtacaatggc cagcccctaa agcaggaaac 6120

atttataatg gattatatgg aaacatcctc ccagtacttg cccagccctt gaatcatgtg 6180

gcttttcagt gaaaggaaag attctttttc taggaaaaat gagcctattt tattttattt 6240

tattttattt tttgacacaa actgtagatt ttagcagccc tggcccaaag gaatttgatt 6300

acttttgttt taaacagtac aaaggggaca ctataattac aaaaacatcc ttaactgatt 6360

tgagttgttt ttatttcttt ggatatattt tcagagtggt aaattgtgtg tgagaattac 6420

aaatgattat tcttttagtg gtttcttagc ctctcttaca gcccacgggg atagtactgt 6480

acatcaatac cttcatatga aatttttata tgcaatgaaa ataaaagcat gggttgattc 6540

tgcctattta tgactcaatc ttttacaaat aaaagattat tcattttaaa ttatagttca 6600

atcagcatgt ctcttaggat actgaacgtg gttgaaatga aaggatagtg acatcataag 6660

ttagtactga tattcataac caaataaagc caacttgagt aattttgcta cattaaaaat 6720

taccaaaatt acttagatgg cctataagat taagcatggt gttttctaag caagctttga 6780

aaggggcctt ccatacttac ttaattgaat attctgggat attgaaaatt attcagatac 6840

ttgacaatta tttttggtta cctactccgc aaactacaaa gttttaagga ctcaacaata 6900

agttaatgag acacagtgtt tgctttcatg gagcttacag tctggagggg acaaaggctt 6960

aaacaatact catataatta tatatgtgat cagtacaatg aaggagctca gtggggtaaa 7020

taagcaggaa cctgaacttg atctgttccg gagggccaca gaaggcttcc ttgaggcctt 7080

gagaaagtga tttgcatctg agttctgaag gattgtaaga ggtaactagg gaaaaagttg 7140

acaggaagag gaaggggatc cagacaagaa acatttgcaa agatcttgag gcataaatga 7200

gcttgagaca tctggagaaa ctgaggaaaa gtgagagagt aggcagggcc tggagccgca 7260

gagccattgc taaccatcct gtgtgagata tcccccattc tgtagcttta ttctcataac 7320

cctgctcaat tttctttata acacttctca cagatttata tacgtgtttg tttttgttat 7380

ctgtctctcc caccagacca cagctccatg agagcaaggt ctttgcttac caatatatca 7440

ctagcactta aaactatgcc tggtacacag taggttctta atatgtgttg aatatagcca 7500

tcaaattgat attggatata attcaatctg ataagatatt ttgagatatt aaagagtttt 7560

taacttgata ccataaaaaa aaaaaaaaaa a 7591

<210> 18

<211> 518

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 18

Met Pro Glu Ala Asn Tyr Leu Leu Ser Val Ser Trp Gly Tyr Ile Lys

1 5 10 15

Phe Lys Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser

20 25 30

Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Phe Ile Ser Asn Thr Phe Leu Asp

35 40 45

Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys Glu Lys Glu

50 55 60

Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser Gly Val Lys Lys Leu Met

65 70 75 80

His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys

85 90 95

Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Val Asn Lys

100 105 110

Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu Ser Gly Asn Arg Pro

115 120 125

Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys

130 135 140

Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu Met Thr Leu

145 150 155 160

Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn Ile His Ala

165 170 175

Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu

180 185 190

Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ser

195 200 205

Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile

210 215 220

Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser Ser Val Leu

225 230 235 240

Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu Asn

245 250 255

Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Ser Leu Arg

260 265 270

Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met

275 280 285

Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr

290 295 300

Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val

305 310 315 320

Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro

325 330 335

Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe

340 345 350

Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met

355 360 365

Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile

370 375 380

Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val His

385 390 395 400

Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Glu Trp

405 410 415

Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Ala Pro Asp Asp Pro

420 425 430

Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr

435 440 445

Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu Lys Asp Ser Gly Ser Gln

450 455 460

Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser Lys Thr Leu Cys Thr Gln

465 470 475 480

Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp Glu Gln Val Glu Glu Glu

485 490 495

Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro Glu Ala Cys Val Ile Asp

500 505 510

Asp Arg Ser Pro Asp Thr

515

<210> 19

<211> 8130

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 19

agattatagc ccagcgtacg agaagcacga gtcctatagt tggcgtaccc tgaggcctgc 60

cagttcctgc cttaatgcat atgtagtcgt aattgagttc tgacacggcc ttggatgttt 120

ctgtcctaaa tagctgacat tgcatcttca agactgtcat tccagttggc ttttgagtgg 180

atacgtgcag tgagatcatt gacactggaa acactagttc ccattttaat tacttaaaac 240

accacgatga aaagaaatac ctgtgatttg ctttctcgga gcaaaagtgc ctctgaggaa 300

acactacatt ccagtaatga agaggaagac cctttccgcg gaatggaacc ctatcttgtc 360

cggagacttt catgtcgcaa tattcagctt ccccctctcg ccttcagaca gttggaacaa 420

gctgacttga aaagtgaatc agagaacatt caacgaccaa ccagcctccc cctgaagatt 480

ctgccgctga ttgctatcac ttctgcagaa tccagtggtt ttgatgtgga caatggcaca 540

tctgcgggac ggagtccctt ggatcccatg accagcccag gatccgggct aattctccaa 600

gcaaattttg tccacagtca acgacgggag tccttcctgt atcgatccga cagcgattat 660

gacctctctc caaagtctat gtcccggaac tcctccattg ccagtgatat acacggagat 720

gacttgattg tgactccatt tgctcaggtc ttggccagtc tgcgaactgt acgaaacaac 780

tttgctgcat taactaattt gcaagatcga gcacctagca aaagatcacc catgtgcaac 840

caaccatcca tcaacaaagc caccataaca gaggaggcct accagaaact ggccagcgag 900

accctggagg agctggactg gtgtctggac cagctagaga ccctacagac caggcactcc 960

gtcagtgaga tggcctccaa caagtttaaa aggatgctta atcgggagct cacccatctc 1020

tctgaaatga gtcggtctgg aaatcaagtg tcagagttta tatcaaacac attcttagat 1080

aagcaacatg aagtggaaat tccttctcca actcagaagg aaaaggagaa aaagaaaaga 1140

ccaatgtctc agatcagtgg agtcaagaaa ttgatgcaca gctctagtct gactaattca 1200

agtatcccaa ggtttggagt taaaactgaa caagaagatg tccttgccaa ggaactagaa 1260

gatgtgaaca aatggggtct tcatgttttc agaatagcag agttgtctgg taaccggccc 1320

ttgactgtta tcatgcacac catttttcag gaacgggatt tattaaaaac atttaaaatt 1380

ccagtagata ctttaattac atatcttatg actctcgaag accattacca tgctgatgtg 1440

gcctatcaca acaatatcca tgctgcagat gttgtccagt ctactcatgt gctattatct 1500

acacctgctt tggaggctgt gtttacagat ttggagattc ttgcagcaat ttttgccagt 1560

gcaatacatg atgtagatca tcctggtgtg tccaatcaat ttctgatcaa tacaaactct 1620

gaacttgcct tgatgtacaa tgattcctca gtcttagaga accatcattt ggctgtgggc 1680

tttaaattgc ttcaggaaga aaactgtgac attttccaga atttgaccaa aaaacaaaga 1740

caatctttaa ggaaaatggt cattgacatc gtacttgcaa cagatatgtc aaaacacatg 1800

aatctactgg ctgatttgaa gactatggtt gaaactaaga aagtgacaag ctctggagtt 1860

cttcttcttg ataattattc cgataggatt caggttcttc agaatatggt gcactgtgca 1920

gatctgagca acccaacaaa gcctctccag ctgtaccgcc agtggacgga ccggataatg 1980

gaggagttct tccgccaagg agaccgagag agggaacgtg gcatggagat aagccccatg 2040

tgtgacaagc acaatgcttc cgtggaaaaa tcacaggtgg gcttcataga ctatattgtt 2100

catcccctct gggagacatg ggcagacctc gtccaccctg acgcccagga tattttggac 2160

actttggagg acaatcgtga atggtaccag agcacaatcc ctcagagccc ctctcctgca 2220

cctgatgacc cagaggaggg ccggcagggt caaactgaga aattccagtt tgaactaact 2280

ttagaggaag atggtgagtc agacacggaa aaggacagtg gcagtcaagt ggaagaagac 2340

actagctgca gtgactccaa gactctttgt actcaagact cagagtctac tgaaattccc 2400

cttgatgaac aggttgaaga ggaggcagta ggggaagaag aggaaagcca gcctgaagcc 2460

tgtgtcatag atgatcgttc tcctgacacg taacagtgca aaaactttca tgcctttttt 2520

ttttttaagt agaaaaattg tttccaaagt gcatgtcaca tgccacaacc acggtcacac 2580

ctcactgtca tctgccagga cgtttgttga acaaaactga ccttgactac tcagtccagc 2640

gctcaggaat atcgtaacca gttttttcac ctccatgtca tccgagcaag gtggacatct 2700

tcacgaacag cgtttttaac aagatttcag cttggtagag ctgacaaagc agataaaatc 2760

tactccaaat tattttcaag agagtgtgac tcatcaggca gcccaaaagt ttattggact 2820

tggggtttct attccttttt atttgtttgc aatattttca gaagaaaggc attgcacaga 2880

gtgaacttaa tggacgaagc aacaaatatg tcaagaacag gacatagcac gaatctgtta 2940

ccagtaggag gaggatgagc cacagaaatt gcataatttt ctaatttcaa gtcttcctga 3000

tacatgactg aatagtgtgg ttcagtgagc tgcactgacc tctacatttt gtatgatatg 3060

taaaacagat tttttgtaga gcttactttt attattaaat gtattgaggt attatattta 3120

aaaaaaacta tgttcagaac ttcatctgcc actggttatt tttttctaag gagtaacttg 3180

caagttttca gtacaaatct gtgctacact ggataaaaat ctaatttatg aattttactt 3240

gcaccttata gttcatagca attaactgat ttgtagtgat tcattgtttg ttttatatac 3300

caatgacttc catattttaa aagagaaaaa caactttatg ttgcaggaaa ccctttttgt 3360

aagtctttat tatttacttt gcattttgtt tcactctttc cagataagca gagttgctct 3420

tcaccagtgt ttttcttcat gtgcaaagtg actatttgtt ctataatact tttatgtgtg 3480

ttatatcaaa tgtgtcttaa gcttcatgca aactcagtca tcagttcgtg ttgtctgaag 3540

caagtgggag atatataaat acccagtagc taaaatggtc agtctttttt agatgttttc 3600

ctacttagta tctcctaata acgttttgct gtgtcactag atgttcattt cacaagtgca 3660

tgtctttcta ataatccaca catttcatgc tctaataatc cacacatttc atgctcattt 3720

ttattgtttt tacagccagt tatagtaaga aaaaggtttt tccccttgtg ctgctttata 3780

atttagcgtg tgtctgaacc ttatccatgt ttgctagatg aggtcttgtc aaatatatca 3840

ctaccattgt caccggtgaa aagaaacagg tagttaagtt agggttaaca ttcatttcaa 3900

ccacgaggtt gtatatcatg actagctttt actcttggtt tacagagaaa agttaaacag 3960

ccaactaggc agtttttaag aatattaaca atatattaac aaacaccaat acaactaatc 4020

ctatttggtt ttaatgattt caccatggga ttaagaacta tatcaggaac atccctgaga 4080

aacggtttta agtgtagcaa ctactcttcc ttaatggaca gccacataac gtgtaggaag 4140

tcctttatca cttatcctcg atccataagc atatcttgca gaggggaact acttctttaa 4200

acacatggag ggaaagaaga tgatgccact ggcaccagag ggttagtact gtgatgcatc 4260

ctaaaatatt tattatattg gtaaaaattc tggttaaata aaaaattaga gatcactctt 4320

ggctgatttc agcaccagga actgtattac agttttagag attaattcct agtgtttacc 4380

tgattatagc agttggcatc atggggcatt taattctgac tttatcccca cgtcagcctt 4440

aataaagtct tctttacctt ctctatgaag actttaaagc ccaaataatc atttttcaca 4500

ttgatattca agaattgaga tagatagaag ccaaagtggg tatctgacaa gtggaaaatc 4560

aaacgtttaa gaagaattac aactctgaaa agcatttata tgtggaactt ctcaaggagc 4620

ctcctgggga ctggaaagta agtcatcagc caggcaaatg actcatgctg aagagagtcc 4680

ccatttcagt cccctgagat ctagctgatg cttagatcct ttgaaataaa aattatgtct 4740

ttataactct gatcttttac ataaagcaga agaggaatca actagttaat tgcaaggttt 4800

ctactctgtt tcctctgtaa agatcagatg gtaatctttc aaataagaaa aaaataaaga 4860

cgtatgtttg accaagtagt ttcacaagaa tatttgggaa cttgtttctt ttaattttat 4920

ttgtccctga gtgaagtcta gaaagaaagg taaagagtct agagtttatt cctctttcca 4980

aaacattctc attcctctcc tccctacact tagtatttcc cccacagagt gcctagaatc 5040

ttaataatga ataaaataaa aagcagcaat atgtcattaa caaatccaga cctgaaaggg 5100

taaagggttt ataactgcac taataaagag aggctctttt tttttcttcc agtttgttgg 5160

tttttaatgg taccgtgttg taaagatacc cactaatgga caatcaaatt gcagaaaagg 5220

ctcaatatcc aagagacagg gactaatgca ctgtacaatc tgcttatcct tgcccttctc 5280

tcttgccaaa gtgtgcttca gaaatatata ctgctttaaa aaagaataaa agaatatcct 5340

tttacaagtg gctttacatt tcctaaaatg ccataagaaa atgcaatatc tgggtactgt 5400

atggggaaaa aaatgtccaa gtttgtgtaa aaccagtgca tttcagcttg caagttactg 5460

aacacaataa tgctgtttta attttgtttt atatcagtta aaattcacaa taatgtagat 5520

agaacaaatt acagacaagg aaagaaaaaa cttgaatgaa atggatttta cagaaagctt 5580

tatgataatt tttgaatgca ttatttattt tttgtgccat gcattttttt tctcaccaaa 5640

tgaccttacc tgtaatacag tcttgtttgt ctgtttacaa ccatgtattt attgcaatgt 5700

acatactgta atgttaattg taaattatct gttcttatta aaacatcatc ccatgatggg 5760

atggtgttga tatatttgga aactcttggt gagagaatga atggtgtgta tacatactct 5820

gtacattttt cttttctcct gtaatatagt cttgtcacct tagagcttgt ttatggaaga 5880

ttcaagaaaa ctataaaata cttaaagata tataaattta aaaaaacata gctgcaggtc 5940

tttggtccca gggctgtgcc ttaactttaa ccaatatttt cttctgtttt gctgcatttg 6000

aaaggtaaca gtggagctag ggctgggcat tttacatcca ggcttttaat tgattagaat 6060

tctgccaata ggtggatttt acaaaaccac agacaacctc tgaaagattc tgagaccctt 6120

ttgagacaga agctcttaag tacttcttgc cagggagcag cactgcatgt gtgatggttg 6180

tttgccatct gttgatcagg aactacttca gctacttgca tttgattatt tccttttttt 6240

ttttttttaa ctcggaaaca caactgggga aatatattct ttcccagtga ttataaacaa 6300

tctttttctt ttttttaagt ccttttggct tctagagctc ataggaaaat ggacttgatt 6360

tgaaattgga gccagagttt actcgtgttg gttatctatt catcagcttc ctgacatgtt 6420

aagagaatac attaaagaga aaatactgtt ttttaatcct aaaatttttc ttccactaag 6480

ataaaccaaa tgtccttaca tatatgtaaa cccatctatt taaacgcaaa ggtgggttga 6540

tgtcagttta catagcagaa agcattcact atcctctaag atttgtttct gcaaaacttt 6600

cattgcttta gaattttaaa atttcacctt gtacaatggc cagcccctaa agcaggaaac 6660

atttataatg gattatatgg aaacatcctc ccagtacttg cccagccctt gaatcatgtg 6720

gcttttcagt gaaaggaaag attctttttc taggaaaaat gagcctattt tattttattt 6780

tattttattt tttgacacaa actgtagatt ttagcagccc tggcccaaag gaatttgatt 6840

acttttgttt taaacagtac aaaggggaca ctataattac aaaaacatcc ttaactgatt 6900

tgagttgttt ttatttcttt ggatatattt tcagagtggt aaattgtgtg tgagaattac 6960

aaatgattat tcttttagtg gtttcttagc ctctcttaca gcccacgggg atagtactgt 7020

acatcaatac cttcatatga aatttttata tgcaatgaaa ataaaagcat gggttgattc 7080

tgcctattta tgactcaatc ttttacaaat aaaagattat tcattttaaa ttatagttca 7140

atcagcatgt ctcttaggat actgaacgtg gttgaaatga aaggatagtg acatcataag 7200

ttagtactga tattcataac caaataaagc caacttgagt aattttgcta cattaaaaat 7260

taccaaaatt acttagatgg cctataagat taagcatggt gttttctaag caagctttga 7320

aaggggcctt ccatacttac ttaattgaat attctgggat attgaaaatt attcagatac 7380

ttgacaatta tttttggtta cctactccgc aaactacaaa gttttaagga ctcaacaata 7440

agttaatgag acacagtgtt tgctttcatg gagcttacag tctggagggg acaaaggctt 7500

aaacaatact catataatta tatatgtgat cagtacaatg aaggagctca gtggggtaaa 7560

taagcaggaa cctgaacttg atctgttccg gagggccaca gaaggcttcc ttgaggcctt 7620

gagaaagtga tttgcatctg agttctgaag gattgtaaga ggtaactagg gaaaaagttg 7680

acaggaagag gaaggggatc cagacaagaa acatttgcaa agatcttgag gcataaatga 7740

gcttgagaca tctggagaaa ctgaggaaaa gtgagagagt aggcagggcc tggagccgca 7800

gagccattgc taaccatcct gtgtgagata tcccccattc tgtagcttta ttctcataac 7860

cctgctcaat tttctttata acacttctca cagatttata tacgtgtttg tttttgttat 7920

ctgtctctcc caccagacca cagctccatg agagcaaggt ctttgcttac caatatatca 7980

ctagcactta aaactatgcc tggtacacag taggttctta atatgtgttg aatatagcca 8040

tcaaattgat attggatata attcaatctg ataagatatt ttgagatatt aaagagtttt 8100

taacttgata ccataaaaaa aaaaaaaaaa 8130

<210> 20

<211> 748

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 20

Met Lys Arg Asn Thr Cys Asp Leu Leu Ser Arg Ser Lys Ser Ala Ser

1 5 10 15

Glu Glu Thr Leu His Ser Ser Asn Glu Glu Glu Asp Pro Phe Arg Gly

20 25 30

Met Glu Pro Tyr Leu Val Arg Arg Leu Ser Cys Arg Asn Ile Gln Leu

35 40 45

Pro Pro Leu Ala Phe Arg Gln Leu Glu Gln Ala Asp Leu Lys Ser Glu

50 55 60

Ser Glu Asn Ile Gln Arg Pro Thr Ser Leu Pro Leu Lys Ile Leu Pro

65 70 75 80

Leu Ile Ala Ile Thr Ser Ala Glu Ser Ser Gly Phe Asp Val Asp Asn

85 90 95

Gly Thr Ser Ala Gly Arg Ser Pro Leu Asp Pro Met Thr Ser Pro Gly

100 105 110

Ser Gly Leu Ile Leu Gln Ala Asn Phe Val His Ser Gln Arg Arg Glu

115 120 125

Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Lys Ser

130 135 140

Met Ser Arg Asn Ser Ser Ile Ala Ser Asp Ile His Gly Asp Asp Leu

145 150 155 160

Ile Val Thr Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala Ser Leu Arg Thr Val Arg

165 170 175

Asn Asn Phe Ala Ala Leu Thr Asn Leu Gln Asp Arg Ala Pro Ser Lys

180 185 190

Arg Ser Pro Met Cys Asn Gln Pro Ser Ile Asn Lys Ala Thr Ile Thr

195 200 205

Glu Glu Ala Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp

210 215 220

Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr Arg His Ser Val Ser

225 230 235 240

Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr

245 250 255

His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Phe Ile

260 265 270

Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro

275 280 285

Thr Gln Lys Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser

290 295 300

Gly Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Ser Ile

305 310 315 320

Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu

325 330 335

Leu Glu Asp Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu

340 345 350

Leu Ser Gly Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln

355 360 365

Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile

370 375 380

Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr

385 390 395 400

His Asn Asn Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu

405 410 415

Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu

420 425 430

Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val

435 440 445

Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr

450 455 460

Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys

465 470 475 480

Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys

485 490 495

Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr

500 505 510

Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val

515 520 525

Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr

530 535 540

Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu

545 550 555 560

Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg

565 570 575

Ile Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly

580 585 590

Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys

595 600 605

Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr

610 615 620

Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu

625 630 635 640

Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser

645 650 655

Pro Ala Pro Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys

660 665 670

Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu

675 680 685

Lys Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser

690 695 700

Lys Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp

705 710 715 720

Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro

725 730 735

Glu Ala Cys Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp Thr

740 745

<210> 21

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D7_прямой праймер

<400> 21

gaacattcaa cgaccaacca 20

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D7_обратный праймер

<400> 22

tgccattgtc cacatcaaaa 20

<210> 23

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D7 probe

<400> 23

ctgccgctga ttgctatcac ttctgca 27

<210> 24

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D7 прямой праймер 2

<400> 24

cgctgattgc tatcacttct gc 22

<210> 25

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D7 обратный праймер

<400> 25

gtcgttgact gtggacaaaa tttg 24

<210> 26

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D7 зонд 2

<400> 26

ttcccttgga tcccatgacc agcccataag ggaa 34

<210> 27

<211> 8130

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 27