Способ определения предрасположенности к нарушению функции вегетативной нервной системы у женщин, ассоциированной с избыточной контаминацией гексаном

Изобретение относится к области медицины, в частности к терапии и токсикологии. Предложен способ определения предрасположенности к нарушению функции вегетативной нервной системы у женщин, ассоциированной с избыточной контаминацией гексаном. У пациентки производят отбор пробы мочи и крови. Определяют в моче содержание гексана, а в крови - содержание иммуноглобулина G (IgG) к гексану и уровень сывороточного серотонина. Также отбирают пробу буккального эпителия. Проводят генотипирование полиморфизма гена GNB3 С825Т (rs5443). При одновременном выполнении следующих диагностических критериев: наличие генотипа С/С гена GNB3 С825Т (rs5443), превышение содержания гексана в моче более, чем в 10 раз по сравнению с фоновым уровнем, равным 0,01 мкг/см³, превышение по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к гексану более, чем в 2 раза и уровня содержания сывороточного серотонина выше 50-220 нг/мл, диагностируют у пациентки генетическую предрасположенность к нарушению функции вегетативной нервной системы, ассоциированной с избыточной контаминацией гексаном. Изобретение обеспечивает достоверность оценки влияния гексана на возникновение нарушений функции вегетативной нервной системы у женщин. 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к терапии и токсикологии, и может быть использовано для прогнозирования токсического действия гексана на нарушение функций вегетативной нервной системы у женщин. Изобретение предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия гексана на здоровье женщины, подвергающейся неблагоприятным внешним и производственным факторам.

Предлагаемое изобретение может быть использовано для постановки предварительного диагноза как в специализированных клиниках при обследовании пациенток, так и в обычных учреждениях здравоохранения. Результаты указанных обследования необходимы для разработки индивидуальных программ наблюдения и профилактики, в зависимости от степени проявлений признаков заболевания нервной системы у женщин, а, кроме того, могут быть использованы при формировании санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, в частности, гексана, обуславливающего риск формирование указанного заболевания.

Согласно Международной классификации болезней Десятого пересмотра, астено-вегетативный синдром (код по МКБ-10 F48.0) определяется как функциональное расстройство вегетативной нервной системы. Эта система регулирует работу всех внутренних органов, желез внутренней и внешней секреции, кровеносных и лимфатических сосудов. Также она играет главенствующую роль в поддержании постоянства внутренней среды организма (гомеостаза).

Наиболее часто астено-вегетативный синдром встречается среди представительниц прекрасной половины населения нашей планеты. Это непосредственно связано с лабильностью нервной системой женщин, которая менее устойчива к воздействию неблагоприятных внешних и производственных факторов.

Заболевания нервной системы, формирующиеся под воздействием средовых факторов, как правило, относятся к мультифакториальным, где экзо- и эндогенные факторы выступают как спусковой механизм для реализации генетической предрасположенности. К таким факторам можно отнести предельные углеводороды, выступающие как вредные факторы производства, воздействуя, например, на здоровье работниц флотофабрики по обогащению калийных солей.

Для задач оценки степени воздействия среды обитания на здоровье, ранней диагностики прогнозирования нарушений здоровья, а также для выбора эффективной профилактики и лечения, актуальным является выделение диагностических показателей конкретных заболеваний или их предвестников у человека под воздействием гексана, которые могут использовать в качестве индикаторов нарушения вегетативной нервной системы и в качестве дополнительных маркерных критериев санитарно-эпидемиологической обстановки.

Из патента РФ №2299003 известен способ дифференциальной диагностики синдрома вегетативной дистонии (СВД) от воздействия комплекса токсических веществ и синдрома вегетативной дистонии (СВД) нетоксической природы. Для этого проводят тест СМИЛ или определение содержания неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) и активности пероксидазы крови. Затем рассчитывают диагностический коэффициент по одной из следующих формул: F_смил,=6,11+0,1603⋅a₁-0,1193⋅а₂-0,08⋅а₃, F_пол=7,28+0,00248⋅a₄-0,02588⋅a₅, где a₁ - показатель 1 шкалы по СМИЛ, а₂ - показатель шкалы К по СМИЛ, а₃ - показатель шкалы L по СМИЛ, а₄ - содержание НЭЖК в крови, a₅ - активность пероксидазы крови, 6,11, 7,28 - константы. При значении F>константы диагностируют СВД токсической этиологии, а при значении F<константы - СВД нетоксического генеза. Проведение такой диагностики позволяет при использовании минимального числа исследований повысить точность дифференциальной диагностики.

Из патента РФ №2299004 тех же авторов известен способ диагностики синдрома вегетативной дистонии токсического генеза от воздействия комплекса химических веществ. При реализации способа проводят тесты СМИЛ и Силбергера-Ханина, или определяют содержание в крови адренокортикотропного гормона (АКТГ) и тироксина (Т4), или проводят энцефалографию. Затем рассчитывают диагностический коэффициент по одной из следующих формул: F_смил=20,38-0,2014⋅a₁+0,1714⋅a₂+0,1039⋅a₃, F_горм=0,32-0,0303⋅a₄+0,0138⋅а₅, F_ээг=0,2+0,327⋅а₆ -0,257⋅а₇-0,219⋅а₈+0,233⋅а₉, где а₁ - показатель 1 шкалы по СМИЛ, а₂ - уровень личностной тревожности по методике Спилбергера-Ханина, а₃ - показатель 3 шкалы по СМИЛ, а₄ - концентрация АКТГ, a₅ - концентрация Т₄, а₆ - мощность β₂ волн в отведении Fz на ЭЭГ, а₇ - мощность β₂ волн в отведении Cz на ЭЭГ, a₈ - мощность β₁ волн в отведении Pz на ЭЭГ, а₉ - мощность β₁ волн в отведении Fz на ЭЭГ; 20,38, 0,32 и 0,2 - константы. При значении F≥ константы диагностируют СВД токсической этиологии. Однако эти два способа недостаточно точны из-за использования субъективных показателей.

Из уровня техники известно, что в настоящее время наиболее прогрессивные способы диагностики проявления и предрасположенности к различным заболеваниям, ассоциированных с воздействием внешнесредовых токсикантов, основаны на использовании в качестве маркеров генетических критериев.

Из патента РФ №2687731 известен способ диагностики у детей астено-вегетативного синдрома в условиях экспозиции алюминием. Согласно известному способу в пробе мочи ребенка определяют содержание алюминия. Выделяют ДНК из пробы буккального эпителия. Затем на детектирующем амплификаторе с использованием ПЦР в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма генов ионотропного рецептора глутамата GRIA1 (rs545098) и гена глиального глутаматного транспортера SLC2A1 (rs841839). При одновременном выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена GRIA1 (rs545098) и гена SLC2A1 (rs841839), при условии одновременного обнаружения у пациента превышения содержания алюминия в моче более чем в 1,3 раза по сравнению с референтным диагностируют у ребенка наличие астено-вегетативного синдрома в условиях экспозиции алюминием. Однако указанный способ не применим для установления предрасположенности к нарушению функции вегетативной нервной системы у женщин, ассоциированной с избыточной контаминацией ароматических соединений, в частности, гексаном.

Из уровня техники известна диссертационная работа «Состояние эфферентного отдела нервной системы, психологического статуса и конституционально-генетические особенности у больных с вегетативными кризами (ВК)», автор: Закирова Д.Д., Казань, 2011 г. (Медицинские Диссертации http://medical-diss.com/medicina/sostoyanie-efferentnogo-otdela-nervnoy-sistemy-psihologicheskogo-statusa-i-konstitutsionalno-geneticheskie-osobennosti-u-#ixzz5BIkC5WjL), в которой указано, что при синдроме вегетативной дисфункции возникают сочетанные изменения в эфферентном звене анимальной нервной системы и психологическом статусе, проявляющиеся в ускорении процессов эфферентации и особом (демонстративном) типе акцентуации личности. Изучался полиморфизм генов: 1) G603A гена транспортера глутамата ЕААТ; 2) rs545098 G/A гена ионотропного рецептора глутамата GLUR 1 (GRIA1); 3) rs9307959 С/Т гена ионотропного рецептора глутамата GLUR 2 (GRIA2); 4) G49S гена бета-адренорецептора ADRB1. Была выявлена достоверная связь генотипов ADRB1 GG, Glur1 GG, Glur2 СТ, Glur2 СС, ЕААТ AG, ЕААТ АА, ADRB1 SG с нарушениями вегетативного гомеостаза, влияние генотипов Glur2 и ЕААТ на тяжесть, длительность заболевания и клинические проявления. В группе с гипервентиляционными вегетативными кризами прослежена связь «неблагоприятного» вегетативного гомеостаза с генотипом ADRB1 GG, GLUR2 СС. Полученные данные свидетельствуют о наличии предрасположенности к вегетативными кризам у лиц с определенным генотипом.

Недостатком указанного способа является то, что способ позволяет характеризовать исключительно предрасположенность к развитию вегетативных кризов, при этом не оценивается фактическое состояние вегетативной нервной системы по уровню экспрессии самих геноопосредованных белков, например, глутамата.

Также из уровня техники известны технические решения по диагностике, использующие в качестве генетических критериев такие гены, как: С825Т гена GNB3 (патент РФ №2376372), rs5443 гена GNB3 (патент РФ №2502474). Однако все эти известные способы применимы только генетической диагностики подверженности к сердечнососудистым заболеваниям и не связаны с токсическим воздействием на организм каких-либо химических веществ.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы диагностики предрасположенности к нарушению функции вегетативной нервной системы у женщин, ассоциированной с избыточной контаминацией гексаном, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении достоверности оценки влияния гексана на возможное возникновение нарушений функции вегетативной нервной системы у женщин, за счет использования в качестве информативного критерия совокупности маркеров, а именно: уровня контаминации гексаном и наличия генетического полиморфизма в отношении гена GNB3 С825Т (rs5443).

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом определения предрасположенности к нарушению функции вегетативной нервной системы у женщин, ассоциированной с избыточной контаминацией гексаном, характеризующийся тем, что у пациентки производят отбор пробы мочи и крови, определяют в моче содержание гексана, а в крови - содержание иммуноглобулина G (IgG) к гексану и уровень сывороточного серотонина, также у указанной пациентки отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма гена GNB3, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена GNB3 С825Т (rs5443), устанавливая при этом для указанного гена одно из следующих его состояний: дикое гомозиготное С/С, или вариантное гомозиготное Т/Т, или гетерозиготное С/Т, и при одновременном выполнении следующих диагностических критериев: наличие дикого гомозиготного генотипа С/С гена GNB3 С825Т (rs5443), при условии превышения содержания гексана в моче более, чем в 10 раз по сравнению с фоновым уровнем, равным 0,01 мкг/см³, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к гексану более, чем в 2 раза и уровня содержания сывороточного серотонина - маркера вегетативных нарушений - выше диапазона нормы, равной 50-220 нг/мл, диагностируют у пациентки генетическую предрасположенность к нарушению функции вегетативной нервной системы, ассоциированной с избыточной контаминацией гексаном.

Указанный технический результат обеспечивается за счет следующего. В механизме развития нарушений функции вегетативной нервной системы лежит нарушение транспорта импульсов от нервных рецепторов к клеткам тканей. Клиническая картина данного патологического состояния нервной системы определяется тем, какой орган или система органов подвергается большему негативному воздействию. В результате такого влияния, организм человека просто оказывается не в состоянии адекватно реагировать на возникающие стрессовые ситуации. Заболевания центральной нервной системы (далее - ЦНС), формирующиеся под воздействием средовых факторов, как правило, относятся к мультифакториальным, где экзо- и эндогенные факторы выступают как спусковой механизм для реализации генетической предрасположенности. К таким факторам можно отнести и предельные углеводороды, например, гексан, выступающие как вредные факторы производства, воздействуя на здоровье работников. Предельные углеводороды в качестве вредных производственных факторов оказывают негативное действие на ЦНС, что связанно с их высокой липофильностью и способностью оказывать наркотическое действие, приводя к тошноте, головной боли, головокружению, а хроническое действие приводит к полиневропатии с онемением конечностей, мышечной слабостью и помутнением рассудка [U.S. Department of Health and Human Services. Hazardous Substances Data Bank (HSDB, online database). National Toxicology Information Program, National Library of Medicine, Bethesda, MD. 1993]; [U.S. Environmental Protection Agency. Integrated Risk Information System (IRIS) on n-Hexane. National Center for Environmental Assessment, Office of Research and Development, Washington, DC. 1999].

Заболевания нервной системы относятся к одним из наиболее распространенных проявлений производственно обусловленной патологии, частота встречаемости которых варьирует в зависимости от стажа и вредности условий труда. Полиморфность генов кандидатов, также оказывает существенный вклад в их реализацию, являясь, в том числе, неотъемлемой частью диагностики оценки риска ранних нарушений со стороны вегетативной нервной системы.

При высоком содержании гексана в биосредах при генотипе С/С гена гуанин-нуклеотид связывающего белка GNB3, процесс активации нейронов посредством серотонинового рецептора в случае повышенного содержания сывороточного серотонина является чрезмерным и лабильность (подвижность) последующих вегетативных событий избыточна. В том случае, если ген гуанин-нуклеотид связывающего белка GNB3 полиморфно не изменен, высокие концентрации гексана потенцируют дополнительную активацию нейронов, вызванную экспрессией катехоламинов. Кроме того, дополнительно активируя внутриклеточные вторичные мессенджеры углеводороды стимулируют серотонинергическую передачу сигнала глубоко в нейрон и геном, формируя вегетативный дисбаланс.

При референтном содержании гексана в моче С/С генотип GNB3, имея более низкую передачу сигнала, связан с благоприятным ответом на действие катехоламинов, и вегетативные события не приводят к инициации сопутствующей патологии в виде вегетативной астении.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала проб буккального эпителия, крови и мочи, а также стандартных методик изучения иммунологических и генетических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Установление содержания химического контаминанта - гексана, именно в моче обусловлено тем, что моча является средой преимущественной элиминации из организма данного элемента, имеющего реферируемые уровни в данной биологической среде.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ГЩР) проведения генотипирования полиморфизма указанного гена GNB3 С825Т (rs5443). При этом устанавливается для гена одно из следующих его состояний: или дикое гомозиготное С/С, или вариантное гомозиготное Т/Т, или гетерозиготное С/Т. Таким образом, при оценке влияния гексана на риск нарушения состояния вегетативной нервной системы в предлагаемом способе рекомендуется использовать следующие критерии: наличие генотипа С/С гена GNB3 С825Т (rs5443), превышение концентрации гексана в моче выше фонового уровня более, чем в 10 раз, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к гексану более, чем в 2 раза.

Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с полиморфным вариантом гена GNB3 С825Т (rs5443), тропного к вегетативной нервной системе, и одновременно с количеством химического токсиканта - гексана в моче, при превышении IgG к гексану более, чем в 2 раза, и будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния гексана на риск возникновения нарушений функции вегетативной нервной системы у женщин.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. Выбирают производственное предприятие, характеризующееся наличием химического токсиканта - гексана. Исследования были проведены на женском контингенте флотофабрики по обогащению калийных удобрений на территории Пермского края, работающих в условиях содержания в воздухе рабочей зоны гексана на границе уровня ПДКр.з.

2. На указанной флотофабрике производят отбор работников-женщин одной этнической популяции. Затем производят отбор пробы крови в специальные пробирки для выделения сыворотки и определения содержания серотонина и IgG к гексану.

Содержание гексана в моче определяют методом анализа равновесной паровой фазы на газовом хроматографе «Кристалл-5000» согласно МУК 4.1.764-99. В качестве фонового значения содержания гексана в моче был принят показатель равный 0,01 мкг/см³.

Содержание серотонина в крови определяют по методике, изложенной в инструкции Serotonin FAST ELISA («ДРГ Техсистемс», Германия, EIA5061). В качестве физиологического диапазона содержания серотонина был принят диапазон, равный 50-220 нг/мл. (Н. Тиц, 2003).

3. Также у женщины отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки), причем забор осуществляют сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями без травматизации после предварительного полоскания полости рта водой. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Конец зонда отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразную цепную реакцию проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК гена GNB3 С825Т (rs5443).

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного человека готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранного гена GNB3 С825Т (rs5443) (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма гена GNB3 С825Т (rs5443) ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты, необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KC1, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена GNB3 в исследуемом участке ДНК С825Т (rs5443) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или дикое гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние гена GNB3 С825Т (rs5443).

4. И при одновременном выполнении следующих диагностических критериев:

- наличие дикого гомозиготного генотипа С/С гена GNB3 С825Т (rs5443),

- при превышении концентрации гексана в моче выше фонового уровня более, чем в 10 раз,

- а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к гексану более, чем в 2 раза,

- уровня содержания сывороточного серотонина - маркера вегетативных нарушений - выше диапазона нормы, равной 50-220 нг/мл, диагностируют у пациентки генетическую предрасположенность к нарушению функции вегетативной нервной системы, ассоциированной с избыточной контаминацией гексаном.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа выполнено обследование 111 работниц флотофабрики по обогащению калийных удобрений в возрасте 23-52 лет, подверженных воздействию предельных углеводородов (гексан), используемых на производстве калийных удобрений.

Группу наблюдения составили 54 женщины в возрасте 44,2±1,3 года, имеющие патологию нервной системы (расстройства вегетативной нервной системы, головная боль напряженного типа, невралгии).

Группа сравнения включала 57 женщин в возрасте 43,7±1,4 года, без заболеваний нервной системы.

Для оценки контаминации биосред гаптенами, было выполнено химико-аналитическое исследование, которое включало определение в моче предельных углеводородов (гексан) методом анализа равновесной паровой фазы на газовом хроматографе «Кристалл-5000» согласно МУК 4.1.764-99.

Определялся уровень медиаторных показателей: маркер нейрогуморальной регуляции - серотонин, методом иммуноферментного анализа согласно инструкции Serotonin FAST ELISA, производителя «DRG» Germany на приборе «BioTec Е1х808».

Полиморфизм гена диагностического маркера - гуанин-связывающего белка GNB3 С825Т (rs5443) у обследуемых женщин, определялся методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием комплекта реагентов компании ЗАО «Синтол» на приборе «BioRAD CFX96».

Статистическая обработка данных осуществлялась в программе Statistica 10.0, с определением:

- для иммунологических показателей: N-число, Х-среднее, SE-стандартная ошибка, t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна-Уитни, Н-Краскела-Уолиса, р-уровень значимости;

- для генетических показателей: мультипликативная и общая модели наследования с оценкой - HWE- равновесие Харди-Вайнберга, доминантная и рецессивная модели наследования, OR- оценка шансов, CI-95% доверительный интервал, р-уровень значимости.

При этом результаты считались суггестивными на уровне р<0,05 [Рубанович А.В. Пересмотр критического уровня значимости (0,005 вместо 0,05):Байесовский след//Радиационная биология. Радиоэкология, 2018, Т. 58, №5, с. 453-462] и достоверными (согласно манифесту RSS) на уровне р<0,005 [Benjamin D.J., Berger ОюЩюб Johannesson М., Nosek B.Redefine Statistical Significance//Nature Human Behavior, 2018, Vol. 2, pp 6-10].

Установлено что в 100% образцов мочи группы наблюдения выявлено присутствие предельных углеводородов (гексан), что в норме недопустимо. В группе сравнения наличие гексана в моче или не выявлено или результаты были равны или менее 0,01 мкг/мл.

В качестве маркера, доказывающего, что у пациентки возникло нарушение функции вегетативной нервной системы под влиянием гексана, использовали уровень серотонина в пробе крови.

Серотонин представляет собой 5-гидрокситриптамин, 5-НТ - один из основных нейромедиаторов. По химическому строению серотонин относится к биогенным аминам - катехоламинам, классу триптаминов. Серотонин является одним из основных медиаторов метасимпатической части вегетативной нервной системы. Серотонин - это нейромедиатор, который не столько приносит положительные эмоции, сколько снижает восприимчивость к отрицательным.

По результатам иммуноферментного анализа установлены различия между группами по содержанию сывороточного серотонина (р<0,05), избыточный уровень которого сопровождал нарушения вегетативной нервной системы в виде астено-вегетативного синдрома у женщин.

По результатам генетического исследования, установлена особенность распределения частот генотипов по локусам генов на р-суггестивном уровне (р<0,05): Достоверный уровень различий (р<0,005) выявлен по гену гуанин-нуклеотид связывающего белка GNB3 с участком С825Т (rs5443) с преобладанием С/С дикого генотипа в 1,8 раза в группе наблюдения, по сравнению с группой сравнения, при этом С аллель (OR - отношение шансов=2,96; CI (доверительный интервал): 1,59-5,40) и СС генотип (OR=3,33; CI:1,52-7,29) выступили как фактор, увеличивающий вероятность развития заболеваний нервной системы. При этом наследование С/С генотипа происходит по доминантному типу (р<0,005, OR=3,43; CI:1-57-7,49). Полученные данные приведены в таблице 1.

По результатам оценки распределения уровня сывороточного серотонина в зависимости от генотипа гена гуанин-связывающего белка GNB3, с использованием Н-теста Краскела-Уолиса, установлена обратная его зависимость от присутствия вариантного аллеля Т, при этом р не достигает суггестивного уровня.

На основании апостериорных сравнений (t-критерий) выявлено достоверное различие между распределением уровня серотонина по генотипам С/С и Т/Т при р<0,005.

У женщин работниц производства по обогащению калийных солей, имеющих патологию вегетативной нервной системы и избыточность контаминации предельными углеводородами (гексаном) (группа наблюдения), оказывающими негативное воздействие на вегетативную нервную систему, были выявлены значимые различия в уровне серотонина, а также особенности распределения частот генотипов и аллелей гена гуанин-связывающего белка GNB3 С825Т, которые достоверно отличались от аналогичного показателя группы женщин без патологии вегетативной нервной системы (группа сравнения). Установлено, что С аллель (OR=2,96, CI:1,57-5,40) и С/С дикий генотип (OR=3,33, CI:1,52-7,29), который наследуется по доминантному типу (р<0,005), выступили как факторы, увеличивающие вероятность развития патологии вегетативной нервной системы.

Большинство моноаминергических рецепторов (DRD, HTR2a) внутриклеточно связаны с G-белками, и при захвате рецептора, активируются внутриклеточные вторичные мессенджеры, для передачи информации глубоко в нейрон и геном. С/С генотип GNB3 (имеет более низкую передачу сигнала), был связан с благоприятным ответом на действие антидепрессантов и антипсихотиков, которые увеличивают серотонинергическую передачу [Muller D., De Luca V., Sicard Т., et al.

Suggestive association between the C825T polymorphism of the G-protein b3 subunit gene (ПТИЗ) and clinical improvement with antipsychotic in schizophrenia/ European Neuropsychopharmacology., Vol. 15(5)., 2005., pp. 525-531]

В исследовании Matsunaga Т. и соавторов, оценивалась роль полиморфизма GNB3 в вегетативной нервной системе на выборке здоровых молодых мужчин. Авторы предположили, что связь адренергического и мускаринового рецептора ацетилхолина с G-белком, может указывать на связь полиморфизма GNB3 с функцией вегетативной нервной системой, что было подтверждено через оценку индекса симпатической и парасимпатической системы при изменении положения тела пациентов с горизонтального в вертикальное, при этом носители Т/Т и С/Т генотипов имели более высокий индекс симпатической нервной системы, а носители Т/Т генотипа не имели хронологических изменений индексов симпатической и парасимпатической системы, при изменений положения тела [Matsunaga Т., Nagasumi Люб Yamamura Т et al. Association of C825T polymorphism of G protein beta3 submit with the autonomic nervous system in young healthy Japanese individuals/ Am О Hypertens., Vol. 18 (4 Ptl), 2005, pp. 523-529].

Верифицировано изменение уровня серотонина в зависимости от генотипа гена нуклеотид связывающего белка, когда С/С дикому генотипу соответствовал наибольший уровень сывороточного серотонина, с его обратно пропорциональным снижением при появлении аллеля Т в гетерозиготном и вариантном генотипе (t-критерий, р<0,005).

Локус гена GNB3 (С825Т rs5443) и его дикий генотип С/С рекомендуется использовать, как индикаторный для выявления наследственной предрасположенности к развитию патологии нервной системы, что в условиях избыточной контаминации предельными углеводородами (гексаном) может привести к запуску событий вегетативной дисфункции и формирования производственно-обусловленной патологии нервной системы работающих женщин (на примере условий флотофабрики калийного производства).

В таблице 2 приведены данные по результатам обследования женщин из указанных групп.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что при сочетании избыточного содержания гексана в моче, превышающего фоновый более, чем в 10 раз, (фоновый 0,01 мкг/мл), наличия С/С генотипа гена GNB3 (С825Т rs5443), наличия специфических антител к гексану (IgG) на уровне превышающем не менее, чем в 2 раза его норму (0,1 у.е), диагностируем наличие предрасположенности к развитию нарушений функции вегетативной нервной системы у женщин, ассоциированных с избыточной контаминацией гексаном.

При высоком содержании гексана в биосредах при генотипе С/С гена гуанин-нуклеотид связывающего белка, процесс активации нейронов посредством серотонинового рецептора в случае повышенного содержания сывороточного серотонина является чрезмерным и лабильность (подвижность) последующих вегетативных событий избыточна. В том случае если ген гуанин-нуклеотид связывающего белка полиморфно не изменен высокие концентрации гексана потенцируют дополнительную активацию нейронов вызванную экспрессией катехоламинов. Кроме того, дополнительно активируя внутриклеточные вторичные мессенджеры углеводороды стимулируют серотонинергическую передачу сигнала глубоко в нейрон и геном, за что отвечает уровень экспресии внутриклеточных медиаторов (гуанин-нуклеотид связывающий белок), формируя вегетативный дисбаланс.

При допустимом содержании гексана в моче С/С генотип GNB3, имея более низкую передачу сигнала связан с благоприятным ответом на действие катехоламинов и вегетативные события не приводят к инициации сопутствующей патологии в виде возможной вегетативной астении.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых диагностических критериев обеспечивается его назначение.

Пример 1. Пациентка, 38 лет, русская, патология вегетативной нервной системы (астено-вегетативный синдром). Установлено наличие дикого генотипа С/С гена GNB3 (С825Т rs5443), а также избыточный уровень содержания гексана в моче 0,117 мкг/мл (при норме <0,01). Содержание IgG к гексану в крови - маркера избыточного воздействия гексана выше нормальных значений - 0,35 у.е. (при норме <0,1). Уровень содержания сывороточного серотонина маркера вегетативных нарушений 357,9 нг/мл, т.е. выше диапазона нормы (50-220 нг/мл). Таким образом, установлены высокие значения уровня IgG к гексану в крови и избыточное содержание сывороточного серотонина, чрезмерный уровень которого сопровождает нарушения вегетативной нервной системы в виде астено-вегетативного синдрома, что на фоне дикого генотипа С/С гена GNB3 (С825Т rs5443), кодирующего экспрессию гуанин-нуклеотид связывающего белка, формируя избыточную серотонинергическую втутриклеточную передачу сигнала глубоко в нейрон и геном, вызывая вегетативную дисфукцию, в условиях дополнительной стимуляции предельными углеводородами (гексаном) у данной пациентки. Диагноз астено-невротического синдрома у пациентки был подтвержден проведенной электроэнцефалографией.

Это говорит о том, что, согласно предлагаемому способу, у данного пациента состояние оценивается, как реализация генетического риска развития у женщин нарушения функции вегетативной нервной системы, ассоциированной с избыточной контаминацией гексаном.

Пример 2. Пациентка, 40 лет, русская, патология вегетативной нервной системы отсутствует. Установлено наличие вариантного генотипа Т/Т гена GNB3 (С825Т rs5443), а также допустимый уровень содержания гексана в моче 0,023 мкг/мл (при норме <0,01). Содержание IgG к гексану в крови - маркера избыточного воздействия гексана - в диапазоне нормальных значений - 0,03 у.е. (при норме <0,1). Уровень содержания сывороточного серотонина - маркера вегетативных нарушений 117,9 нг/мл, т.е. в диапазоне нормы (50-220 нг/мл). Таким образом, на фоне вариантного генотипа Т/Т гена GNB3 (С825Т rs5443), установлены нормальные значения уровня IgG к гексану в крови и содержания сывороточного серотонина, что сопровождается отсутствием клинических проявлений в виде нарушения функции вегетативной нервной системы у данной пациентки.

Заявляемый способ позволяет с достаточной достоверностью установить предвестники нарушений функции вегетативной нервной системы у женщин, ассоциированные с влиянием гексана, по заявляемым генетическим критериям, содержанию гексана в моче и по уровню IgG к гексану, и начать заблаговременно профилактические мероприятия.

Способ определения предрасположенности к нарушению функции вегетативной нервной системы у женщин, ассоциированной с избыточной контаминацией гексаном, характеризующийся тем, что у пациентки производят отбор пробы мочи и крови, определяют в моче содержание гексана, а в крови - содержание иммуноглобулина G (IgG) к гексану и уровень сывороточного серотонина, также у указанной пациентки отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма гена GNB3, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена GNB3 С825Т (rs5443), устанавливая при этом для указанного гена одно из следующих его состояний: дикое гомозиготное С/С, или вариантное гомозиготное Т/Т, или гетерозиготное С/Т, и при одновременном выполнении следующих диагностических критериев: наличие дикого гомозиготного генотипа С/С гена GNB3 С825Т (rs5443), при условии превышения содержания гексана в моче более, чем в 10 раз по сравнению с фоновым уровнем, равным 0,01 мкг/см³, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к гексану более, чем в 2 раза и уровня содержания сывороточного серотонина - маркера вегетативных нарушений - выше диапазона нормы, равной 50-220 нг/мл, диагностируют у пациентки генетическую предрасположенность к нарушению функции вегетативной нервной системы, ассоциированной с избыточной контаминацией гексаном.