Способ получения пептида ac-his-ala-glu-glu-nh2

Изобретение относится к способу получения тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂ (Ac-HAEE-NH₂) в растворе, который может найти применение в медицине в качестве препарата для лечения болезни Альцгеймера. Тетрапептид получают исходя из амида гамма-бензилового эфира глутаминовой кислоты с помощью метода активированных эфиров и карбодиимидного метода, используя трет-бутилкарбонильные и тритил-защищённые аминокислоты, деблокирование защитных групп проводят растворами хлористого водорода в диоксане, трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, 90%-ной уксусной кислотой, окончательное деблокирование проводят гидрированием на палладиевом катализаторе с получением тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂ высокой чистоты. 1 пр.

 

Изобретение относится к фармакологии, точнее, к способам получения биологически активных веществ, а именно к области химического синтеза пептидов и конкретно касается способа получения тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂ (далее Ac-HAEE-NH₂) в растворе. Заявляемый способ может использоваться в фармацевтическом производстве и в экспериментальных исследованиях с целью получения препарата для лечения болезни Альцгеймера (далее БА).

Болезнь Альцгеймера представляет собой тяжелое нейродегенеративное заболевание, приводящее к потере памяти, психическим расстройствам и неизбежной смерти. Болезнь Альцгеймера имеет большое социальное значение, так как в основе ее клинической картины лежит снижение когнитивных функций пациентов до уровня деменции, одним из ключевых проявлений которой является неспособность пациента к повседневной деятельности и самообслуживанию. Вследствие высокой распространённости и особой тяжести болезнь Альцгеймера становится важной медицинской и социально-экономической проблемой современного мира, и ее значение будет неуклонно возрастать по мере старения населения. Согласно отчету «Alzheimer’s Disease International World Alzheimer Report 2018», в 2018 г. в мире насчитывалось 50 млн человек с БА, причём ожидается, что к 2030 году это количество увеличится до 82 млн, а к 2050 году - до 150 млн человек. Общая оценочная мировая стоимость деменции в 2018 году составляла 1 триллион долларов. Эта цифра вырастет до 2 триллионов долларов к 2030 году.

В настоящее время известен ряд пептидов, предлагаемых в качестве средств для лечения болезни Альцгеймера.

В частности, пептид формулы HD[pS]GYEVHH, где остаток серина является фосфорилированным (RU 2679080, опубл. 05.02.2019). Данный пептид способен образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с металлсвязывающим доменом человеческого бета-амилоида и используется для лечения болезни Альцгеймера.

Следует отметить пептиды, предлагаемые для лечения БА и состоящие из последовательности аминокислот Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr-Glu-Cys-Cys-Lys-Glu [RU 2372355, 2009] Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala [RU 2558242, 27.07.2015].

В патенте RU 2677296, опубл. 16.01.2019, предложен пептид формулы Ac-Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala-NH₂, обладающий более длительным терапевтическим действием против болезни Альцгеймера.

Предложено применение пептида общей формулы ацетил-D-Lys-Lys-Arg-Arg-амид, использование которого позволяет достичь устойчивого ноотропного эффекта на скополамин-индуцированной модели болезни Альцгеймера (RU 2678987, опубл. 05.02.2019).

Вышеперечисленные пептиды получают твердофазным синтезом пептидов, предложенным Р. Б. Меррифилдом из университета Рокфеллера (Нобелевская премия 1984 г.). Этот метод основан на сборке пептида на нерастворимой полимерной подложке последовательным присоединением остатков аминокислот с защищенными α-амино- и боковыми группами. В качестве подложки (носителя) обычно используют хлорметилированный (-СH₂Cl) или гидроксиметилированный (-CH₂OH) полистирол, в котором содержание групп СH₂Cl или CH₂OH не превышает 1-2%. Использование твердофазного синтеза позволяет исключить стадию активации карбоксильной группы.

В настоящее время известен ряд синтезов пептидов, предлагаемых в качестве средств для лечения болезни Альцгеймера, которые проводят в растворе.

Метод синтеза пептидов в растворе - это построение пептидной цепи путем соединения аминокислот с помощью химических методов, он более удобен для синтеза пептидов до 10 остатков, так как позволяет получать их в больших количествах и большей степени чистоты (Синтез пептидов. Реагенты и методы. А. А Гершкович, В.К. Киберев. - Киев, Наукова думка, 1987). В случае коротких пептидов, которые необходимо получать в больших количествах, классический метод синтеза в растворе является более эффективным и экономичным.

Особенности синтеза пептидов определенного строения являются следствием бифункциональности исходных аминокислот и, следовательно, возможности образования пептидных связей, как между различными, так и между одинаковыми молекулами аминокислот. Для предотвращения разнообразных осложнений при синтезе пептидов необходимо защищать амино- или карбоксильную группу. Защитная группа должна устанавливаться селективно именно по защищаемой группе и удаляться в таких условиях, в которых не будут затрагиваться остальные функциональные группы в составе молекулы пептида. Кроме того, желательно, чтобы защита ставилась и снималась с высоким выходом и селективностью. Например, один из наиболее распространенных защитных групп аминогруппы являются защитные группы уретанового типа, например бензоксикарбонильная или трет-бутоксикарбонильная группа (Химический синтез пептидов. А. А Гершкович, В.К. Киберев. - г. Киев, Наук. думка, 1992).

В пептидной химии широко используют ступенчатый способ получения пептидов путем наращивания цепи с C-конца исходной аминокислоты с применением активированных производных аминокислот, например пентафторфениловых эфиров (Боданский М., Клаузнер Я.С. Активированные эфиры и стратегия пептидного синтеза. - Химия полипептидов. Под ред. П. Катосояниса. М., «Мир», 1977, с.30-51) или карбодиимидным методом.

В патенте РФ № 2119496 (опубл. 27.09.1998) описан способ получения пептидов формулы 1

методом смешанных ангидридов или карбодиимидным методом. Реакцию конденсации, осуществляемую по методу смешанных ангидридов, предпочтительно проводят с соблюдением "Андерсоновских" условий (G. W. Anderson et al. J. Am. Chem. Soc, 89, 50-12-5017. 1967). Карбоксильную составляющую для образования смешанного ангидрида N-ацилпролина предпочтительно активируют изобутилхлорформиатом. Могут быть использованы также этилхлороформиат и метилхлороформиат.

Лучшими растворителями являются смесь этилацетата с диметилформамидом, чистый диметилформамид и хлороформ. Лучшими третичными основаниями являются N-метилморфолин, N-этилморфолин и триэтиламин.

Реакцию конденсации, осуществляемую карбодиимидным методом, предпочтительно проводят в присутствии оксибензотриазола (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 788-789. 1979). Конденсация по карбодиимидному методу может быть также проведена в присутствии других добавок, таких как паранитрофенол, пентахлорфенол или N-оксисукцинимид.

Аминогруппу обычно эффективно защищают кислотными группами, например остатками алифатических, ароматических, гетероциклических карбоновых кислот, такими как ацетил, бензоил, пиридинкарбоксил; кислотными группами, производными от угольной кислоты, такими как этоксикарбонил, бензилоксикарбонил, третбутилоксикарбонил; или кислотными группами, производными от сульфокислоты, такой как пара-толуосульфониловая.

Полученные в результате пептиды обладают антиамнестическим, антигипоксическим и анорексигенным действием, проявляют низкую токсичность, способствуют улучшению способности к обучению и памяти.

В патенте RU 2557003 описано изобретение, относящееся к гексапептиду формулы Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂, обладающему нейропротекторной и ноотропной активностью, который получают с помощью классического синтеза, затем очищают и выделяют в гомогенном состоянии.

В патенте RU 2254139 синтез заявляемого средства проводили классическими методами пептидной химии. Для блокирования боковой цепи лизина применяли карбобензилокси (Z) группу, цистеина - тетрагидропиранильную (Thp), a для временной защиты α-N-функций трет-бутилоксикарбонильную (Воc) группы. Однако это изобретение решает задачу получения пептидов, обладающих противоопухолевым действием.

В патенте RU № 2141483 предложен синтез дипептидов и псевдодипептидов, содержащих N-аминоацильный заместитель, который осуществляют классическими методами пептидной химии с применением предпочтительно активированных, например, N- оксисукцинимидных эфиров. Наилучший вариант заключается в применении пентафторфениловых эфиров, как наиболее активных из известных. В качестве активированных производных дикарбоновых кислот применяют, как правило, их циклические внутренние ангидриды.

α-Аминогруппу карбоксильного компонента защищают различными обычно применяемыми группами, предпочтительно трет-бутилоксикарбонильной (Boc-) или бензилоксикарбонильной (Z-) защитами.

α-Карбоксильную функцию глутаминовой кислоты защищают предпочтительно бензильной (Bzl-) группой.

Карбоксильная группа аминокомпонента - гистидина в соединениях общей формулы (I) находится в виде метилового эфира или остается незамещенной.

Однако полученные соединения обладают свойствами модуляторов системы цитохрома Р-420, метаболизма арахидоновой кислоты, гормонов коры надпочечников, активности макрофагов, а также антиоксидантным, противоастматическим, антигипоксическим, противовирусным, липидрегулирующим, антиметастатическим, сахаропонижающим, адаптогенным и другими видами терапевтического действия.

Еще один способ получения пептидов общей формулы: X-Pro-Gly-Pro, где X=Phe-, Arg-, Lys-Pro-Arg-, Glu-His-Phe-, обладающих антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромботической активностью описан в патенте RU № 2286166. Синтез указанных пептидов осуществляли методами классической пептидной химии в растворе.

Из патента RU № 2588143, опубл. 27.06.2016, известно изобретение, которое относится к пептидному соединению Ra-R1-R2-R3-R4-Rb (I) или Ra-R4-R3-R2-R1-Rb (II), где Ra представляет собой N-концевую первичную аминную группу аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную аминозащитной группой, Rb представляет собой гидроксильную группу C-концевой карбоксильной группы аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную гидроксизащитной группой, и R1-R2-R3-R4 или R4-R3-R2-R1 представляют собой HADD, KADD, DDAK, RADD, DDAR, KAED, DEAK, RAED, DEAR, HADE, EDAH, KADE, EDAK, RADE, EDAR, HAEE, EEAH, KAEE, EEAK, RAEE и EEAR. Данные пептидные соединения применяются для связывания с β-амилоидными пептидами и ингибирования полимеризации их в виде амилоидных бляшек, а также в качестве лекарственного средства или для подготовки или определения препаратов с целью лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера. Причем, предпочтительно пептидное соединение, соответственно данному изобретению, выбрано из соединений с формулой (I) или (II), где R1-R2-R3-R4 или R4-R3-R2-R1, представлено одним из двух тетрапептидов HAEE и RADD. Наиболее предпочтительные пептидные соединения соответствуют формулам Ac-RADD-NH₂ и Ac-HAEE-NH₂, последний иначе обозначаемый также как Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂.

В настоящее время пептид HAEE является одним из самых эффективных антиамилодных препаратов в мире (Goyal D., Shuaib S., Mann S., and Goyal B. Rationally Designed Peptides and Peptidomimetics as Inhibitors of Amyloid-β (Aβ) Aggregation: Potential Therapeutics of Alzheimer’s Disease. ACS Combinatorial Science. 2017, 19, 55-80.). Молекулярный механизм антиамилоидного действия тетрапептида HAEE хорошо установлен (Козин С.А., Барыкин Е.П., Митькевич В.А., Макаров А.А. Антиамилоидная терапия болезни Альцгеймера: современное состояние и перспективы. Биохимия. 2018, 83, 1331-1342). Было найдено, что синтетический пептид HAEE специфически связывается с металл-связывающим доменом 1-16 Aβ по участку 11-14, блокирует цинк-индуцированную димеризацию домена и замедляет агрегацию полноразмерного Aβ in vitro (Tsvetkov P.O., Cheglakov I.B., Ovsepyan A.A., Mediannikov O.Y., Morozov A.O., Telegin G.B., and Kozin S.A. Peripherally Applied Synthetic Tetrapeptides HAEE and RADD Slow Down the Development of Cerebral beta-Amyloidosis in AbetaPP/PS1 Transgenic Mice. J Alzheimers Dis. 2015, 46, 849-853). Результаты другого исследования позволяют предположить что тетрапептид Ac-HAEE-NH₂ является потенциальным терапевтическим средством для лечения α4β2 nAChR-зависимой холинергической дисфункции при болезни Альцгеймера (Barykin E. P., Garifulina A. I., Tolstova A. P. et al. Tetrapeptide Ac-HAEE-NH2 Protects α4β2 nAChRfrom Inhibition by Aβ. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 6272).

В патенте RU 2709539, опубл. 18.12.2019, заявлена фармацевтическая композиция, обеспечивающая эффективную доставку тетрапептида Ac-HAEE-NH₂ используемого в качестве лекарственной субстанции, через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) для лечения нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера. Авторами изобретения показано, что указанная композиция позволяет значительно улучшить фармакокинетические характеристики и увеличить биодоступность лекарственной субстанции HAEE, что может значительно усилить терапевтический эффект от ее применения за счёт предупреждения образования амилоидных бляшек путем полимеризации или агрегации β-амилоидных пептидов.

Однако способ получения тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂ в научно-технической и патентной литературе не описан.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂, пригодного для дальнейшего использования в фармацевтическом производстве.

Технический результат - реализация поставленной задачи и получение тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂ высокой чистоты за счет использования предложенного способа.

Задача решается путем синтеза тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂ методом пептидного синтеза в растворе последовательным наращиванием цепи с С-конца молекулы с использованием стратегии максимальной защиты функциональных групп.

Тетрапептид Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂ получают, исходя из амида гамма-бензилового эфира глутаминовой кислоты с помощью метода активированных эфиров и карбодиимидного метода, используя трет-бутилоксикарбонил- и тритилзащищённые аминокислоты, деблокирование защитных групп проводят растворами хлористого водорода в диоксане, трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, 90%-ной уксусной кислотой, окончательное деблокирование - гидрированием на палладиевом катализаторе.

Сущность изобретения заключается в том, что тетрапептид Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂ получают в результате 10-стадийного синтеза в растворе, включающем следующие последовательные стадии многоступенчатого синтеза пептида:

1) получение Boc-Glu(OBzl)-OPfp из Boc-Glu(OBzl)-OH с использованием дициклогексилкарбодиимида в качестве конденсирующего агента;

2) амминолиз водным раствором аммиака с получением Boc-Glu(OBzl)-NH₂;

3) удаление третбутилкарбоксильной группы хлористым водородом в диоксане;

4) получение дипептида Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ конденсацией H-Glu(OBzl)NH₂ • HCl с Boc-Glu(OBzl)-OH с использованием дициклогексилкарбодиимида;

5) удаление третбутилкарбоксильной группы раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене;

6) получение Boc-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ конденсацией с Boc-Ala-OH с использованием дициклогексилкарбодиимида;

7) удаление третбутилкарбоксильной группы хлористым водородом в диоксане;

8) получение Ac-His(Trt)-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ конденсацией с Ac-His(Trt)-OH, с использованием дициклогексилкарбодиимида;

9) удаление тритильной защиты гистидина 90%-ным водным раствором уксусной кислоты, с последующей очисткой полученного продукта реакции с помощью препаративной высокоэффективной хроматографии;

10) удаление бензильной защиты с карбоксильных групп глутаминовых кислот гидрированием на палладиевом катализаторе, приводящее к целевому тетрапептиду Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂.

Структуру и чистоту полупродуктов и целевого продукта подтверждают данными ЯМР 1H спектроскопии, масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Используемые в описании изобретения сокращения обозначают:

Ala - аланин;

Glu - глутаминовая кислота;

His - гистамин;

AcOH - уксусная кислота;

Ac - ацетил;

Trt - тритил;

Вос - трет-бутилоксикарбонильная группа;

Bzl - бензил;

HOBt - 1-N-гидроксибензотриазол;

DCC, - N,N′-дициклогексилкарбодиимид;

NMM - N-метилморфолин;

PfpOH - пентафторфенол;

TFA - трифторуксусная кислота;

DMF - диметилформамид.

Химическая схема получения Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂

Пример синтеза тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂

Стадия 1. Получение Boc-Glu(OBzl)-OPfp (соединение 2) из Boc-Glu(OBzl)-OH (соединение 1) с использованием дициклогексилкарбодиимида в качестве конденсирующего агента.

Растворяют 87.7 г (0.26 моль) Boc-Glu(OBzl)-OH (соединение 1) и 51.5 г пентафторфенола (0.28 моль) в 750 мл этилацетата при комнатной температуре. Полученный раствор охлаждают до 5°C и при этой температуре прикапывают раствор 57.7 г дициклогексилкарбодиимида (0.28 моль) в 150 мл этилацетата. Реакционную массу отогревают до комнатной температуры и перемешивают 3 ч до окончания реакции. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, а этилацетат отгоняют в вакууме на роторном испарителе досуха при 40°C и давлении 10-12 мм рт.ст. Остаток затирают с 300 мл гексана, фильтруют и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 124.2 г (94.9%) белого мелкокристаллического соединения 2. Содержание основного вещества 97.2% (ВЭЖХ). ESMS, m/z (I%): 526.13 [M+Na]+ (100), 1029.26 [2M+Na]+ (7.3).

Стадия 2. Амминолиз водным раствором аммиака с получением Boc-Glu(OBzl)-NH₂ (соединение 3).

Растворяют 100.7 г (0.20 моль) Boc-Glu(OBzl)-OPfp (соединение 2, полученное на стадии 1) в 750 мл диоксана при комнатной температуре. Полученный раствор охлаждают до 10°C и при этой температуре приливают 30 мл водного 25% раствора аммиака. Реакционную массу перемешивают 2 ч при комнатной температуре до окончания реакции. Диоксан отгоняют в вакууме на роторном испарителе при 40°C, и давлении10-12 мм рт.ст. К остатку добавляют 1 л диэтилового эфира и полученный раствор последовательно промывают: 2×125 мл 5% раствором бикарбоната натрия, 2×125 мл воды и 2×125 мл насыщенным водным раствором хлористого натрия. Органическую фазу сушат сульфатом натрия, после чего упаривают в вакууме досуха при 40°C и давлении 10-12 мм рт.ст. Получают 61.6 г (91.5%) белого кристаллического соединения 3. Содержание основного вещества Boc-Glu(OBzl)-NH2 93.1% (ВЭЖХ). Вещество содержит примерно 5-7% пентафторфенола, который отделяется на следующей стадии. ESMS, m/z (I%): 359.16 [M+Na]+ (26.7), 695.33 [2M+Na]+ (100).

Стадия 3. Удаление трет-бутилкарбонильной группы хлористым водородом в диоксане с получением H-Glu(OBzl)-NH₂ • HCl (соединение 4).

Растворяют 60.0 г (0.18 моль) Boc-Glu(OBzl)-NH₂ (соединение 3, полученное на стадии 2) в 150 мл диоксана при комнатной температуре. К полученному раствору приливают 300 мл 20% раствора хлористого водорода в диоксане. Перемешивают реакционную массу в течение 3 часов. Добавляют 500 мл диэтилового эфира для более полного выпадения продукта реакции. Выпавшее соединение 4 отфильтровывают, промывают на фильтре 150 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 40.7 г (82.9%) белого кристаллического соединения 4. Содержание основного вещества H-Glu(OBzl)-NH₂⋅HCl 98.1% (ВЭЖХ). ESMS, m/z (I%): 237.12 [M+H]+ (20.2), 259.11 [M+Na]+ (28.5), 473.24 [2M+H]+ (81.9), 495.22 [2M+Na]+ (100). Спектр ЯМР 1H (d6-DMSO, δ, м.д.): 2.00-2.10 (m, 2H), 2.51-2.56 (m, 2H), 3.79 (t, J=6.14 Hz, 2H), 5.10 (s, 1H), 7.29-7.42 (m, 5H).

Стадия 4. Получение Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ (соединение 5) конденсацией H-Glu(OBzl)NH₂⋅HCl (сооединение 4) с Boc-Glu(OBzl)-OH (соединение 1) с использованием дициклогексилкарбодиимида.

Растворяют 14.30 г (42.4 ммоль) Boc-Glu(OBzl)-OH (соединение 1), 10.91 г (40 ммоль) H-Glu(OBzl)NH₂⋅HCl (сооединение 4), 6.13 г (40 ммоль) моногидрата 1-N-гидроксибензтриазола и 4.45 г (44 ммоль) N-метилморфолина в 100 мл диметилформамида при комнатной температуре. Реакционную массу охлаждают до 5°C и при этой температуре прикапывают раствор 9.08 г дициклогексилкарбодиимида (44 ммоль) в 20 мл диметилформамида. Реакционную массу перемешивают 12 часов при комнатной температуре до окончания реакции (контроль по ВЭЖХ). Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, а фильтрат разбавляют 500 мл этилацетата и последовательно промывают: 2×100 мл 5%-ным раствором лимонной кислоты, 2×50 мл воды, 2×50 мл 5%-ным раствором бикарбоната натрия, 50 мл воды и 50 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия. Органическую фазу упаривают в вакууме досуха при 40°C, и давлении 10-12 мм рт.ст. Получают 21.27 г (97.2%) белого порошка соединения 5. Содержание основного вещества Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH2 97.6% (ВЭЖХ). ESMS, m/z (I%): 556.27 [M+H]+ (100), 578.25 [M+Na]+ (4.3), 1133.51 [2M+Na]+ (3.9). Спектр ЯМР 1H (CDCl3, δ, м.д.): 1.43 (s, 9H), 1.89-2.04 (m, 2H), 2.08-2.26 (m, 2H), 2.40-2.61 (m, 4H), 4.06-4.17 (m, 1H), 4.48 (td, J1=8.13 Hz, J2=5.15 Hz, 1H), 5.12 (s, 4H), 5.43 (br d, J=7.13 Hz, 1H), 5.51-5.75 (m, 1H), 6.60 (br s, 1H), 7.23 (br d, J=7.93 Hz, 1H), 7.28-7.43 (m, 10H).

Стадия 5. Удаление трет-бутилкарбонильной группы раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене с получением H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂⋅TFA (соединение 6).

Суспендируют 20.0 г (36.0 ммоль) Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ (соединение 5 полученное на стадии 4) в 75 мл хлористого метилена. К полученной суспензии приливают 45 мл трифторуксусной кислоты и перемешивают реакционную массу 1 час при комнатной температуре до окончания реакции (контроль по ВЭЖХ). Растворители удаляют в вакууме при 40°C и 10-12 мм рт.ст, а маслообразный остаток растирают с диэтиловым эфиром: 3×100 мл и сушат в вакууме. Получают 19.62 г (95.7%) маслообразного соединения 6. Содержание основного вещества 96.2% (ВЭЖХ). ESMS, m/z (I%): 456.21 [M+H]+ (100).

Стадия 6. Получение Boc-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ (соединение 8) конденсацией H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂⋅TFA (соединение 6) с Boc-Ala-OH (соединение 7) с использованием дициклогексилкарбодиимида.

Растворяют 11.00 г (19.3 ммоль) H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂⋅TFA (соединение 6, полученное на стадии 5) 4.75 г (25.1 ммоль) Boc-Ala-OH (соединение 7), 3.25 г (21.2 ммоль) моногидрата N-гидроксибензтриазола и 2.33 г (23 ммоль) N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида при комнатной температуре. Реакционную массу охлаждают до 0°C и при этой температуре прикапывают раствор 4.97 г (24.1 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 10 мл диметилформамида. Отогревают до комнатной температуры и перемешивают 12 часов до окончания реакции (контроль по ВЭЖХ). Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, фильтрат разбавляют 200 мл этилацетата и последовательно промывают: 2×50 мл 5%-ным раствором лимонной кислоты, 2×25 мл воды, 2×25 мл 5%-ным раствором бикарбоната натрия, 25 мл воды и 25 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия. Органическую фазу упаривают в вакууме досуха при 40°C и давлении 10-12 мм рт.ст. Остаток затирают в 50 мл серного эфира, фильтруют и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 9.13 г (75.5%) белого порошка вещества 8. Содержание основного вещества 96.8% (ВЭЖХ). ESMS, m/z (I%): 627.30 [M+H]+ (100). Спектр ЯМР 1H (CDCl₃, δ, м.д.): 1.28 (d, J=7.13 Hz, 3H), 1.40 (s, 9H), 1.99-2.08 (m, 2H), 2.13-2.20 (m, 1H), 2.26-2.35 (m, 1H), 2.43-2.57 (m, 4H), 4.04-4.13 (m, 1H), 4.33-4.42 (m, 1H), 4.51 (td, J1=8.42 Hz, J2=4.95 Hz, 1H), 5.07-5.14 (m, 4H), 5.19 (br d, J=4.76 Hz, 1H), 5.66 (br s, 1H), 6.88 (br s, 1H), 7.30-7.36 (m, 10H), 7.52 (br d, J=8.32 Hz, 1H), 7.75 (br s, 1H).

Стадия 7. Удаление трет-бутилкарбонильной группы хлористым водородом в диоксане с получением H-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂⋅HCl (соединение 9).

Суспендируют 11.0 г (17.55 ммоль) Boc-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ (соединение 8, полученное на стадии 6) в 20 мл диоксана при комнатной температуре. При перемешивании нагревают полученную суспензию до 50°C и после полного растворения соединения 8 раствор охлаждают до комнатной температуры. К полученному раствору приливают 30 мл 20%-ного раствора хлористого водорода в диоксане. Перемешивают реакционную массу 2 ч до окончания реакции (контроль по ВЭЖХ), после чего приливают 30 мл серного эфира. Декантируют жидкую фазу с выпавшего масла и последовательно затирают его с 30 мл серного эфира, 30 мл этилацетата и затем с 30 мл серного эфира. Полученные кристаллы отфильтровывают, промывают на фильтре 20 мл серного эфира и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 9.50 г (96.1%) белого порошка соединения 9. Содержание основного вещества 94.2% (ВЭЖХ). ESMS, m/z (I%): 527.25 [M+H]+ (100), 549.23 [M+Na]+ (1.8), 1053.49 [2M+H]+ (6.9). Спектр ЯМР 1H (d6-DMSO, δ, м.д.): 1.37 (d, J=6.89 Hz, 3H), 1.79-1.93 (m, 2H), 1.97-2.08 (m, 2H), 2.38 (br t, J=7.88 Hz, 2H), 2.41-2.49 (m, 2H), 3.91 (q, J=6.56 Hz, 1H), 4.21-4.28 (m, 1H), 4.31-4.39 (m, 1H), 5.08 (s, 2H), 5.09 (s, 2H), 6.99 (br s, 1H), 7.29-7.38 (m, 10H), 8.04 (br d, J=7.55 Hz, 1H), 8.11-8.54 (m, 2H), 8.70 (br d, J=7.55 Hz, 1H).

Стадия 8. Получение Ac-His(Trt)-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ (соединение 12) конденсацией соединения 9 с Ac-His(Trt)-OH (соединение 11) с использованием дициклогексилкарбодиимида включает две стадии:

а) получение Ac-His(Trt)-OH (соединение 11).

Суспендируют 19.72 г (0.10 моль) Ac-His-OH (соединение 10) в 75 мл диметилформамида. Полученную суспензию охлаждают до 5°C и при этой температуре прикапывают 16.58 г (0.11 моль) триэтилхлорсилана. Реакционную массу отогревают до комнатной температуры и перемешивают до полного растворения в течение 30-40 мин. К полученному раствору присыпают 30.67 г (0.11 моль) тритилхлорида и при перемешивании прикапывают 11.13 г (0.11 моль) N-метилморфолина, поддерживая температуру не выше 45°C. Перемешивают реакционную массу 12 часов до окончания реакции (контроль по ВЭЖХ) и выливают её в 300 мл 5%-ного водного раствора лимонной кислоты. Выпавшие кристаллы последовательно промывают на фильтре: 2×100 мл гексана, 2×200 мл воды, 2×100 мл смеси гексан/диэтиловый эфир в соотношении 1:1 и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 40.60 г (92.3%) белого кристаллического вещества соединения 11. Содержание основного вещества 95.4% (ВЭЖХ). Полученый продукт содержит ~ 4-5% трифенилкарбинола, который не мешает дальнейшим реакциям и отделяется на следующей стадии. ESMS, m/z (I%): 440.20 [M+H]+ (100).

б) Конденсация Ac-His(Trt)-OH (соединение 11) с H-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂⋅HCl (соединение 9)

Растворяют 6.07 г (13.8 ммоль) Ac-His(Trt)-OH (соединение 11, полученное на стадии 8 а), 6.76 г (12.0 ммоль) H-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂⋅HCl (соединение 9, полученное на стадии 7), 2.39 г (15.6 ммоль) моногидрата N-гидроксибензтриазола и 1.49 г (14.8 ммоль) N-метилморфолина в 280 мл диметилформамида при комнатной температуре. Реакционную массу охлаждают до 0°C и прикапывают раствор 2.97 г (14.4 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 20 мл диметилформамида. После окончания прибавления перемешивают реакционную массу 1 час при 0°C, отогревают до комнатной температуры, перемешивают ещё 12 часов до окончания реакции (контроль по ВЭЖХ) и выливают в 800 мл 5%-ного раствора бикарбоната натрия. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, последовательно промывают на фильтре: 80 мл воды, 80 мл 5%-ного раствора лимонной кислоты, 80 мл воды и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 10.42 г (91.6%) белого кристаллического вещества 12. Содержание основного вещества 95.0% (ВЭЖХ). ESMS, m/z (I%): 948.50 [M+H]+ (100).

Стадия 9. Удаление тритильной защиты гистидина 90%-ным водным раствором уксусной кислоты с получением Ac-His-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ (соединение 13).

Растворяют 10.0 г (10.5 ммоль) Ac-His(Trt)-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ (соединение 12) в смеси 40 мл уксусной кислоты и 4 мл воды при комнатной температуре. Полученный раствор нагревают до 60°C и перемешивают при этой температуре 3 часа до окончания реакции (контроль по ВЭЖХ). Реакционную массу охлаждают до комнатной температуры, после чего фильтруют от остатков дициклогексилмочевины. К фильтрату добавляют 400 мл диэтилового эфира и декантируют органическую фазу с осадка. Осадок растирают 2 раза с 40 мл диэтилового эфира, фильтруют и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 6.96 г (93.9%) белого порошка 13. Содержание основного вещества 82.7% (ВЭЖХ).

Полученное вещество очищают с использованием обращённо-фазной препаративной ВЭЖХ. Окончательно получают 3.84 г (51.8%) чистого 13. Содержание основного вещества 99.5% (ВЭЖХ). ESMS, m/z (I%): 706.32 [M+H]+ (100). Спектр ЯМР 1H (d6-DMSO, δ, м.д.): 1.23 (d, J=7.13 Hz, 3H), 1.75-1.90 (m, 5H), 1.94-2.06 (m, 2H), 2.32-2.45 (m, 4H), 2.88-2.96 (m, 1H), 3.04 (dd, J1=15.26 Hz, J2=5.75 Hz, 1H), 4.19-4.32 (m, 3H), 4.53-4.62 (m, 1H), 5.08 (s, 2H), 5.08-5.10 (m, 2H), 7.03 (br s, 1H), 7.25-7.42 (m, 11H), 7.76 (d, J=7.93 Hz, 1H), 8.05 (d, J=8.32 Hz, 1H), 8.10 (d, J=6.34 Hz, 1H), 8.12-8.17 (m, 1H), 8.89 (d, J=1.19 Hz, 1H).

Стадия 10. Удаление бензильной защиты с карбоксильных групп глутаминовых кислот с получением тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂ (соединение 14).

Растворяют 2.50 г (3.54 ммоль) Ac-His-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ (соединение 13) в 12 мл уксусной кислоты. К полученному раствору добавляют 0.70 г 20%-ной влажной гидроокиси палладия в качестве катализатора и реакционную массу гидрируют, пропуская ток водорода в течение 12 ч при комнатной температуре до окончания реакции (контроль с помощью ВЭЖХ). Отделяют катализатор фильтрованием. Фильтрат выливают в 100 мл диэтилового эфира, выпавшее вещество отфильтровывают, промывают 2 раза по 50 мл диэтиловым эфиром и сушат на воздухе до постоянного веса. Полученный порошок растворяют в 80 мл воды и лиофилизируют. Получают 1.58 г (84.9%) тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 (соединение 14) в виде белого порошка. Содержание основного вещества 99.4% (ВЭЖХ). ESMS, m/z (I%): 526.23 [M+H]+ (100), 1051.44 [2M+H]+ (5.6). Спектр ЯМР 1H (D2O, δ, м.д.): 1.45 (d, J=7.09 Hz, 3H), 2.01-2.13 (m, 5H), 2.16-2.27 (m, 2H), 2.48-2.59 (m, 3H), 3.17-3.25 (m, 1H), 3.30-3.38 (m, 1H), 4.36-4.48 (m, 4H), 7.38 (s, 1H), 8.69 (s, 1H).

Таким образом, технический результат - разработанный оптимальный способ синтеза тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂ высокой чистоты, который может быть масштабирован для фармацевтического производства, достигнут.

Структура и чистота полупродуктов и целевого продукта подтверждены данными ЯМР 1H спектроскопии, масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Способ получения тетрапептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂, заключающийся в 10-стадийном методе пептидного синтеза в растворе с максимальной защитой функциональных групп, включающий следующие последовательные стадии:

1) получение Boc-Glu(OBzl)-OPfp из Boc-Glu(OBzl)-OH с использованием дициклогексилкарбодиимида в качестве конденсирующего агента;

2) амминолиз водным раствором аммиака с получением Boc-Glu(OBzl)-NH₂;

3) удаление трет-бутилкарбонильной группы хлористым водородом в диоксане;

4) получение дипептида Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ конденсацией с Boc-Glu(OBzl)-OH;

5) удаление трет-бутилкарбонильной группы раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене;

6) получение Boc-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ конденсацией с Boc-Ala-OH;

7) удаление третбутилкарбонильной группы хлористым водородом в диоксане;

8) получение Ac-His(Trt)-Ala-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-NH₂ конденсацией с Ac-His(Trt)-OH с использованием дициклогексилкарбодиимида;

9) удаление тритильной защиты гистидина 90%-ным водным раствором уксусной кислоты;

10) удаление бензильной защиты с карбоксильных групп глутаминовых кислот гидрированием на палладиевом катализаторе, приводящее к целевому тетрапептиду Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH₂.