Методы асимметричной пцр

Изобретение относится к биотехнологии, в частности описан способ асимметричной ПЦР-амплификации для репарации одноцепочечного продукта, а также соответствующие праймеры и наборы для его осуществления. 22 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 1 пр.

 

1. Область техники

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) широко применяют для амплификации участков ДНК, включая геномную ДНК, а также кДНК, обратно транскрибируемую с РНК, для диагностики и других целей. ПЦР представляет серию повторяющихся этапов денатурации или плавления цепей для создания одноцепочечных матриц, отжига праймеров и удлинения праймеров с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, например, ДНК-олимеразы Thermus aquaticus (Taq).

Типичный трехстадийный протокол ПЦР (см. «PCR PROTOCOLS, a Guide to Methods and Applications», под ред. Innis с соавт., изд-во Academic Press (Сан-Диего, Калифорния, США, 1990, глава 1) может включать денатурацию или плавление нитей, при 93-95° в течение более 5 сек, отжиг праймеров при 55-65° в течение 10-60 сек и удлинение праймера в течение 15-120 сек при температуре, обеспечивающей высокую активность полимеразы, например, 72° для Taq ДНК-полимеразы. Типичный протокол двухстадийной ПЦР может отличаться тем, что имеет ту же температуру для отжига праймера, что и для удлинения праймера, например, 60° или 72°. Для трехстадийной ПЦР или двухстадийной ПЦР амплификация включает многократное циклическое проведение реакционной смеси через вышеупомянутую серию стадий, обычно 25-40 раз. В ходе реакции время проведения и температура отдельных стадий реакции могут оставаться неизменными от цикла к циклу, или они могут изменяться в одной или нескольких точках в ходе реакции, чтобы обеспечить эффективность или повысить селективность.

В дополнение к паре праймеров и целевой нуклеиновой кислоты (мишени) реакционная смесь для ПЦР обычно содержит каждый из четырех дезоксирибонуклеотид-5'-трифосфатов (dNTP), обычно в эквимолярных концентрациях, термостабильную полимеразу, двухвалентный катион (обычно Mg²⁺) и буферный агент. Обратную транскриптазу обычно включают для РНК-мишеней, если только полимераза не обладает такой активностью. Объем таких реакций обычно составляет 25-100 мкл. Больше последовательностей-мишеней могут быть амплифицированы в одной и той же реакции. В случае амплификации кДНК реакции ПЦР предшествует отдельная реакция обратной транскрипции РНК в кДНК, если только полимераза, используемая в ПЦР, не обладает активностью обратной транскриптазы. Количество циклов для конкретной амплификации ПЦР зависит от нескольких факторов, включая: а) количество исходного материала, б) эффективность реакции и в) метод и чувствительность обнаружения или последующего анализа продукта. Условия циклического проведения ПЦР, концентрации реагентов, структура праймеров и соответствующие устройства для типичных реакций циклической амплификации хорошо известны в данной области (см., например, Ausubel, F. Current Protocols in Molecular Biology, 1988, глава 15, изд-во J. Wiley, Нью-Йорк, США).

В идеале, каждая цепь каждой молекулы ампликона гибридизируется (процесс называют «связыванием») с праймером на одном конце и служит матрицей для последующего цикла синтеза. Таким образом, скорость образования продуктов удлинения праймеров или ампликонов экспоненциальная, удваиваясь в течение каждого цикла. Ампликоны включают как плюсовые (+), так и минусовые (-) цепи, которые гибридизируются друг с другом, образуя двойные цепи.

Реакции ПЦР обычно рассчитаны на симметричность, то есть для получения двухцепочечных копий путем использования прямого праймера и обратного праймера, предусматривая, что их «температуры плавления» или «T_m» равны или находятся в пределах нескольких °С друг от друга. Обычно используемые компьютерные программы по разработке праймеров предупреждают пользователей о том, что следует избегать большой разницы в свойствах T_m, и автоматически сопоставляют показатели T_m.

Чтобы отличить типичную ПЦР от методов асимметричной ПЦР, описанных в настоящем изобретении, типичную ПЦР упоминают в настоящем описании под названием «симметричная ПЦР». Симметричная ПЦР, таким образом, приводит к экспоненциальному увеличению одной или нескольких двухцепочечных молекул ампликона, и обе цепи каждого ампликона накапливаются в равных количествах в каждом цикле репликации. Эффективность экспоненциальной амплификации в результате симметричной ПЦР со временем снижается, а скорость накопления ампликонов замедляется и останавливается. Кинетический анализ симметричной ПЦР показывает, что реакции состоят из: а) невыявляемой фазы амплификации (начальных циклов), в течение которой обе цепи последовательности-мишени экспоненциально количественно возрастают, но количество накопленного продукта ниже обнаруживаемого уровня для конкретного применяемого метода обнаружения; б) обнаруживаемой фазы амплификации (дополнительные циклы), во время которой обе цепи последовательности-мишени продолжают увеличиваться параллельно, и количество продукта можно обнаружить; в) фазы плато (терминальные циклы), во время которой синтез обеих нитей ампликона постепенно прекращается и количество продукта больше не возрастает. Симметричные реакции замедляются и прекращаются, потому что увеличивающиеся концентрации комплементарных цепей ампликона гибридизируются друг с другом (вторичный отжиг), и это превосходит способность отдельных праймеров гибридизироваться с соответствующими им цепями-мишенями. Обычно реакции протекают достаточно долго для того, чтобы гарантировать накопление определяемого количества продукта, без учета точного количества циклов, необходимых для достижения этой цели.

Метод, имеющий ограниченное применение для получения одноцепочечной ДНК непосредственно в реакции ПЦР, называют «асимметричная ПЦР». Gyllensten, Erlich, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 1988, 7652-7656; US 5066584. Традиционная асимметричная ПЦР отличается от симметричной ПЦР тем, что один из праймеров добавляют в ограниченном количестве, обычно от 1/100 до 1/5 от концентрации другого праймера. Двухцепочечный ампликон накапливается в течение ранних температурных циклов, как при симметричной ПЦР, но один праймер истощается, как правило, после 15-25 циклов ПЦР, в зависимости от количества исходных матриц. Линейная амплификация одной цепи происходит во время последующих циклов с использованием оставшегося праймера. Праймеры, используемые в асимметричных реакциях ПЦР, о которых сообщалось в литературе, часто представляют собой те же самые праймеры, которые используют в симметричной ПЦР. Poddar сравнивает симметричную и асимметричную ПЦР для амплификации субстрата аденовируса с помощью анализа конечной точки, который включает 40 термических циклов (Poddar, Mol. Cell Probes 14, 2000, 25-32). В этой публикации отмечено, что соотношение праймеров 50:1 оптимально и что методы асимметричной ПЦР имеют лучшую чувствительность, которая, однако, значительно снижается для разбавленных растворов субстрата, которые предположительно содержат меньшее количество молекул-мишеней.

Таким образом, существует потребность в улучшенных асимметричных методах амплификации ПЦР, которые способны обнаруживать молекулы-мишени, присутствующие в образце в низких количествах, например, в диагностике.

2. Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к улучшенным методам асимметричной ПЦР, а также к используемым в этих методах праймерам и наборам.

Методы асимметричной ПЦР по настоящему изобретению включают как экспоненциальную фазу, так и линейную фазу. Во время экспоненциальной фазы амплифицируются обе цепи нуклеиновой кислоты-мишени. Во время линейной фазы амплифицируется только одна из цепей, что приводит к избытку одной цепи нуклеиновой кислоты-мишени.

Методы асимметричной ПЦР позволяют получить избыток одной цепи, используя пары праймеров различной длины и температуры плавления, при этом более длинный праймер обозначают в настоящем изобретении как « удлиненный праймер», а более короткий праймер обозначают в настоящем изобретении как «неудлиненный праймер». Удлиненный праймер имеет более высокую температуру плавления, чем неудлиненный праймер, и его можно использовать для селективной амплификации одной нити целевой нуклеиновой кислоты с использованием циклов ПЦР, в которых стадию отжига проводят при температуре, превышающей температуру плавления неудлиненного праймера, но ниже, чем температура плавления удлиненного праймера. Селективная амплификация повышает смесь продуктов ПЦР, которая обогащена цепью-мишенью, предназначенной для последующего исследования.

удлиненные праймеры содержат в дополнение к последовательности, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени, 5'-удлинение, содержащее последовательность, которая комплементарна связывающей мишень части того же праймера. Не ограничиваясь какой-либо теорией, в настоящем изобретении полагают, что использование 5'-удлинения позволяет осуществлять внутри- или межмолекулярную гибридизацию молекул удлиненного праймера и предотвращает произвольное или неспецифическое связывание этих более длинных праймеров с молекулами ДНК, присутствующими в реакции ПЦР, в начале реакции ПЦР. Это, в свою очередь, предотвращает неспецифическую амплификацию ДНК и предотвращает «шум» в продукте ПЦР, который может быть проблематичным при амплификации мишени, присутствующей в небольших количествах в биологическом образце.

Другим объектом настоящего изобретения являются наборы реагентов для выполнения асимметричной ПЦР, приведенной в настоящем описании.

3. Краткое описание фигур

Фиг. 1. Показана пара праймеров, применимая для методов асимметричной ПЦР по настоящему изобретению, включающая неудлиненный праймер, который может быть традиционным праймером, используемым в процессах симметричной ПЦР, и удлиненным праймером, состоящим из области «А», которая комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени, области «В», которая включает прямой повтор или инвертированный повтор, по крайней мере, части области «А», и необязательной области «С», которая может включать спейсерную последовательность и/или часть всего сайта распознавания эндонуклеазы рестрикции.

Фиг. 2А-2В. Фиг. 2А иллюстрирует межмолекулярную гибридизацию удлиненных праймеров, которая происходит, когда область «В» содержит инвертированный повтор по крайней мере части области «А». Фиг. 2Б иллюстрирует внутримолекулярную гибридизацию удлиненных праймеров, которая происходит, когда область «В» содержит прямой повтор, по крайней мере, части области «А». Фиг. 2В иллюстрирует внутримолекулярную гибридизацию удлиненных праймеров, которая происходит, когда область «В» содержит инвертированный повтор по крайней мере части области «А». Предпочтительно, чтобы область комплементарности между областью «А» и областью «Б» находилась на 5'-конце области «А» или около него.

Фиг. 3. Показана стадия денатурации асимметричной ПЦР по настоящему изобретению. На стадии денатурации реакционная смесь ПЦР (обычно содержащая биологический образец, содержащий нуклеиновую кислоту-мишень или предположительно имеющий ее, асимметричную пару праймеров, термостабильную ДНК-полимеразу и реагенты для ПЦР) нагревают до температуры выше точки плавления нуклеиновой кислоты-мишени, что приводит к денатурации нуклеиновой кислоты-мишени (если она присутствует) и удлиненного праймера в асимметричной паре праймеров таким образом, что формируются одиночные цепи.

Фиг. 4. Стадия отжига экспоненциальной фазы асимметричных ПЦР по настоящему изобретению, которая происходит при температуре ниже температуры плавления неудлиненного праймера. Как неудлиненный праймер, так и удлиненный праймер в асимметричной паре праймеров гибридизируются с соответствующими комплементарными цепями. На рис. 4 показан отжиг (также называемый гибридизацией или связыванием) с целевой ДНК, как это происходит на начальных циклах ПЦР, но в последующих циклах, вероятно, будет происходить отжиг между праймерами и комплементарными последовательностями в продуктах ПЦР. Из-за участков «В» и необязательно «С» в удлиненном праймере продукты ПЦР могут иметь эти последовательности или комплементарные им последовательности, что показано на фиг. 5Б и фиг. 6.

Фиг. 5А и 5Б иллюстрируют стадию продления экспоненциальной фазы асимметричных ПЦР по настоящему изобретению, во время которой термостабильная ДНК-полимераза удлиняет ДНК праймера с использованием комплементарной ДНК в качестве матрицы. Область удлинения изображена пунктирными линиями. Матрица на фиг. 5 А представляет цепь целевой ДНК, а на фиг. 5Б - цепь продукта ПЦР, полученного с использованием асимметричной пары праймеров и целевой ДНК.

Фиг. 6. Одновременный отжиг и стадия удлинения линейной фазы асимметричных ПЦР по настоящему описанию, которые происходят при температуре, выше температуры плавления неудлиненного праймера и ниже температуры плавления удлиненного праймера, используя в качестве матрицы продукт ПЦР цепи 2. Это приводит к асимметричной амплификации продукта ПЦР цепи 2, что приводит к избытку молекул продукта ПЦР цепи 2 по сравнению с молекулами продукта ПЦР цепи 1 к концу реакции ПЦР.

Фиг. 7А. Последовательность 17S рибосомальной РНК Solarium lycopersicum с выделенной жирным шрифтом целевой областью из 160 оснований, которая амплифицирована с использованием пары асимметричных праймеров, показанных на фиг. 7Б. Фиг. 7Б. Пара асимметричных праймеров, применимых для амплификации области из 160 оснований, выделенной жирным шрифтом на фиг. 7А, с областью «А» удлиненного праймера, представленной обычным шрифтом, и выделенной жирным шрифтом областью «В» (которая является инвертированным повтором дважды подчеркнутой части области «А»). Этот удлиненный праймер не содержит необязательной области «С».

Фиг. 8. Результаты исследования по оптимизации числа экспоненциальных и линейных циклов в методах асимметричной ПЦР согласно описанию настоящего изобретения с использованием праймеров и зондов S. aureus. Интенсивность сигнала измеряют в условных единицах («у.е.»).

Фиг. 9. Результаты сравнения предела обнаружения мишеней с низким числом копий с помощью методов асимметричной ПЦР, описанных в настоящем изобретении, и традиционной (симметричной) ПЦР с использованием праймеров и зондов S. aureus. Интенсивность сигнала измеряют в условных единицах («у.е.»).

4. Подробное описание изобретения

4.1. Определения

Удлиненный праймер: праймер ПЦР, который содержит (а) область «А» на 3'-конце, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности с соответствующей области целевой цепи 1 или по меньшей мере на 75% комплементарна последовательности соответствующей области в целевой цепи 2; (б) область «В» на 5'-конце, которая содержит последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере к части области «А»; и (в) необязательную область «С», расположенную между областями «А» и «В».

Неудлиненный праймер: праймер ПЦР, который состоит по существу из нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична соответствующей области целевой цепи 2 или по меньшей мере на 75% комплементарна последовательности соответствующей области целевой цепи 1. Понятие «состоит по существу из» применительно к неудлиненному праймеру означает, что нуклеотидная последовательность может содержать не более 3 дополнительных нуклеотидов конца 5' к области, комплементарной (по меньшей мере на 75%) целевой последовательности.

Пара праймеров: пара прямого и обратного праймеров (каждый из которых может представлять собой смесь праймеров с вариациями последовательности для учета возможных вариаций целевой последовательности), способная гибридизироваться и инициировать реакцию полимеризации ДНК из разных цепей одной и той же молекулы нуклеиновой кислоты в области длиной менее 5000 пар оснований. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пара праймеров способна гибридизироваться с инициированием реакции полимеризации ДНК из разных цепей одной и той же молекулы нуклеиновой кислоты в области менее 2500 пар оснований или менее 1500 пар оснований.

Пара асимметричных праймеров: пара праймеров, состоящая неудлиненного праймера и неудлиненного праймера.

Температура плавления (T_m): температура, при которой половина дуплекса ДНК диссоциирует и становится одноцепочечной. T_m линейных праймеров, состоящих из дезоксирибонуклеотидов (ДНК), обычно рассчитывают методом «процент GC» («PCR PROTOCOLS, a Guide to Methods and Applications», под ред. Innis с соавт., 1990, изд-во Academic Press (Сан-Диего, Калифорния, США), или методом «2 (А+Т) плюс 4 (G+C)» (Wallace с соавт., Nucleic Acids Res. 6(11), 1979, 3543-3557), или методом «ближайшего соседа» (Santa Lucia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, 1460-1465; Allawi и Santa Lucia, Biochem. 36, 1997, 10581-10594). Для формулы настоящего изобретения рассчитывают T_m ДНК по методу «ближайшего соседа», неприродные основания (например, 2-дезоксиинозин) трактуют как аденины.

Праймер: олигонуклеотид ДНК, состоящий не менее чем из 12 нуклеотидов, который имеет свободную гидроксильную группу на 3'-конце. Праймеры могут включать встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе нуклеотиды (например, нуклеотиды, содержащие универсальные основания, такие как 3-нитропиррол, 5-нитроиндол или 2-дезоксиинозин, предпочтительным является 2-дезоксиинозин). Если в контексте настоящего изобретения не указано иное, понятие «праймер» также относится к смеси молекул праймеров, которая возникает, когда разнородные основания включены в конструкцию праймера, чтобы позволить им гибридизироваться с вариантами последовательностей в молекулах нуклеиновых кислот-мишеней. Варианты последовательностей-мишеней могут быть межвидовыми или внутривидовыми вариантами. Стандартная номенклатура разнородных оснований представлена в таблице 1.

Предпочтительно каждый праймер содержит не более трех разнородных оснований в области комплементарности к целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения праймер содержит ноль, одно, два или три разнородных основания в области комплементарности к целевой нуклеиновой кислоте.

Универсальный праймер: праймер, последовательность которого состоит, по существу, из области «В» удлиненного праймера. Предпочтительно методы асимметричной ДНК амплификации по настоящему изобретению осуществляют в отсутствие универсальных праймеров.

Прямой повтор: в контексте области «В» удлиненного праймера «прямой повтор» означает нуклеотидную последовательность, которая является прямой комплементарной частью к части области «А» (т.е. имеет комплементарную последовательность в том же порядке от 5' к 3').

Инвертированный повтор: в контексте области «В» удлиненного праймера «инвертированный повтор» означает нуклеотидную последовательность, которая является обратной комплементарной частью к части области «А» (т.е. имеет комплементарную последовательность в противоположном порядке от 5' к 3').

Реагенты ПЦР: если в контексте не указано иное, понятие «реагенты ПЦР» относится к компонентам реакции ПЦР, отличным от матричной нуклеиновой кислоты, термостабильной полимеразы и праймеров. Реагенты для ПЦР обычно включают dNTP (могут включать меченые, например, флуоресцентно меченые, dNTP в дополнение к немеченым dNTP), буферы и соли, содержащие двухвалентные катионы (например, MgCl₂).

Целевая цепь 1: Целевая цепь 1 относится к цепи в двухцепочечной целевой нуклеиновой кислоте, к которой комплементарен неудлиненный праймер в асимметричной паре праймеров.

Целевая цепь 2: Целевая цепь 2 относится к цепи в двухцепочечной целевой нуклеиновой кислоте, к которой комплементарен участок «А» в удлиненном праймере в асимметричной паре праймеров.

Цепь 1 продукта ПЦР: Цепь 1 продукта ПЦР относится к цепи в двухцепочечном продукте ПЦР, полученном из нуклеиновой кислоты-мишени и пары асимметричных праймеров, которая комплементарна к неудлиненному праймеру пары асимметричных праймеров.

Цепь 2 продукта ПЦР: Цепь 2 продукта ПЦР относится к цепи в двухцепочечном продукте ПЦР, полученном из нуклеиновой кислоты-мишени и пары асимметричных праймеров, которая комплементарна удлиненному праймеру пары асимметричных праймеров.

Соответствие: в отношении двух цепей нуклеиновых кислот разной длины, которые имеют идентичную или комплементарную последовательность, понятие «соответствие» относится к области перекрытия или комплементарности последовательностей, присутствующих в обеих цепях, в зависимости от контекста.

Примерно: применительно к целому числу понятие «примерно» расширяет целое число, чтобы включать дробные значения меньше, чем 0,50 и больше, чем 0,49. Например, температура «примерно 68°С» означает температуру 67,50 68,49°С, а идентичность последовательностей «примерно 95%» означает процент идентичности последовательностей 94,50-95,49%.

Приблизительно: при количественной оценке понятие «приблизительно» следует понимать так, что указанное значение может быть больше на величину до 10%, или меньше на 10%. Применительно к диапазону значений понятие «приблизительно» следует понимать так, что имеют в виду величины, которые до 10% выше верхнего предела указанного диапазона или до 10% ниже нижнего предела указанного диапазона.

Образец нуклеиновой кислоты: означает образец, который может быть источником целевой нуклеиновой кислоты, или фиктивный образец, используемый в качестве отрицательного контроля, содержащий нецелевую нуклеиновую кислоту или не содержащий нуклеиновую кислоту (например, для измерения или обнаружения загрязнения или неспецифической амплификации). Образец нуклеиновой кислоты не обязательно содержит целевую ДНК, например, в случае диагностируемого образца образец может быть биологическим образцом, предположительно содержащим целевую нуклеиновую кислоту, например, как описано в разделе 4.3.

4.2. Конструирование праймеров

4.2.1. Удлиненный праймер

Область «А» удлиненный праймера по меньшей мере на 75% идентична соответствующей области в целевой цепи 1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения область «А» праймера идентична соответствующей области в целевой цепи 1 по меньшей мере на 80% по меньшей мере на 85% по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%. В другом варианте осуществления настоящего изобретения последовательность области «А» праймера на 100% идентична соответствующей последовательности целевой цепи 1.

Иными словами, в различных вариантах осуществления настоящего изобретения область «А» удлиненного праймера идентична комплементарному участку соответствующей области в целевой цепи 2 по меньшей мере на 75% по меньшей мере на 80% по меньшей мере на 85% по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%, или на 100%. Обычно, чем больше каких-либо 5' несовпадений находится между последовательностью праймера и последовательностью-мишенью, тем более вероятно, что они будут устойчивы во время ПЦР. Специалист в данной области может легко сконструировать последовательности праймеров, которые имеют менее 100% идентичности последовательности с цепью-мишенью, но все же могут эффективно амплифицировать ДНК-мишень.

Последовательность в области «В», которая комплементарна по меньшей мере части последовательности области «А», может быть прямым повтором или инвертированным повтором. Если область «В» содержит прямой повтор части области «А», разные молекулы удлиненного праймера могут гибридизироваться друг с другом межмолекулярно, как показано на фиг. 2Б. Если область «В» содержит инвертированный повтор части области «А», молекулы удлиненного праймера могут гибридизироваться внутримолекулярно, как показано на фиг. 2 В, или друг с другом межмолекулярно, как показано на фиг. 2А.

Часть области «А», к которой комплементарна последовательность в области «В», предпочтительно находится на 5'-конце области «А» или рядом (например, в пределах 1, 2 или 3 нуклеотидов), т.е. в том месте или рядом с ним, где область «А» примыкает к области «В» (или области «С», если область «С» присутствует).

Область «В» удлиненного праймера предпочтительно имеет в длину от 6 до 12 нуклеотидов, т.е. предпочтительно имеет в длину 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения участок «В» удлиненного праймера имеет в длину от 8 до 10 нуклеотидов, то есть имеет в длину 8, 9 или 10 нуклеотидов.

Область «С», если она присутствует в удлиненном праймере, предпочтительно имеет длину от 1 до 6 нуклеотидов, т.е. предпочтительно имеет в длину 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов.

T_m удлиненного праймера предпочтительно (но не обязательно) составляет приблизительно от 68°С до приблизительно 80°С. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения T_m неудлиненного праймера составляет приблизительно от 72°С до приблизительно 78°С, например приблизительно 72°С, приблизительно 73°С, приблизительно 74°С, приблизительно 75°С, приблизительно 76°С, приблизительно 77°С, или приблизительно 78°С.

Необязательная область «С», расположенная между областями «А» и «В», может действовать в качестве спейсера между областями «А» и «В», чтобы позволить удлиненному праймеру образовать петлю шпильки и/или интродуцировать последовательность эндонуклеазы рестрикции (предпочтительно последовательность 6-cutter) в продукт ПЦР. Последовательность эндонуклеазы рестрикции может полностью находиться в пределах области «С» или образовываться из всей или части области «С» вместе с фланкирующими 5'- и/или 3'-последовательностями из областей «В» и «А», соответственно. Чтобы минимизировать вмешательство в гибридизацию с целевой нуклеиновой кислотой, область «С» предпочтительно не комплементарна целевой цепи 1 или целевой цепи 2.

T_m удлиненного праймера предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 6°С больше, чем T_m неудлиненного праймера. Предпочтительно, чтобы удлиненный праймер имел T_m, которая примерно на 15-30°С больше, чем T_m неудлиненного праймера.

T_m области «А» удлиненного праймера предпочтительно не более чем примерно на 3°С выше или ниже чем T_m части неудлиненного праймера, комплементарного (по меньшей мере на 75%), мишени (за исключением каких-либо удлинений 5'), т.е. T_m области в прямом праймере, который гибридизируется с мишенью, предпочтительно не более чем примерно на 3°С выше или ниже, чем T_m области в обратном праймере, который гибридизируется с мишенью, и наоборот.

Область «А» удлиненного праймера предпочтительно имеет в длину по меньшей мере 12 нуклеотидов, предпочтительно варьирует в длину от 12 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно - от 14 до 25 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения область «А» удлиненного праймера имеет в длину 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов.

4.2.2. Неудлиненный праймер

Неудлиненный праймер имеет нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 75% последовательности соответствующей области в цепи-мишени 2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, неудлиненный праймер имеет нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% по меньшей мере на 85% по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична последовательности соответствующей области в цепи-мишени 2. В других вариантах осуществления настоящего изобретения неудлиненный праймер имеет нуклеотидную последовательность со 100% идентичностью по отношению к последовательности с соответствующей областью цепи-мишени 2.

Иными словами, в различных вариантах осуществления настоящего изобретения неудлиненный праймер имеет нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75% по меньшей мере на 80% по меньшей мере на 85% по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% или 100% идентична комплементу соответствующей области 1 в целевой цепи 2. Обычно, чем больше каких-либо 5' несовпадений находится между последовательностью праймера и последовательностью-мишенью, тем более вероятно, что они будут устойчивы во время реакции ПЦР. Специалист в данной области может легко сконструировать последовательности праймеров, которые идентичны с цепью-мишенью менее чем на 100%, но все же могут эффективно амплифицировать ДНК-мишень.

Неудлиненный праймер может дополнительно иметь с 5'-конца хвост из 1, 2 или 3 нуклеотидов.

T_m неудлиненного праймера предпочтительно (но не обязательно) составляет приблизительно от 50°С до приблизительно 62°С. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения T_m неудлиненного праймера составляет приблизительно от 59°С до приблизительно 62°С, например приблизительно 59°С, приблизительно 60°С, приблизительно 61°С или приблизительно 62°С.

T_m неудлиненного праймера предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 6°С ниже, чем T_m удлиненного праймера. Предпочтительно T_m неудлиненного праймера примерно на 15-30°С ниже, чем T_m удлиненного праймера.

T_m области неудлиненного праймера, комплементарного (по меньшей мере, на 75%) мишени (исключая какие-либо удлинения 5'), предпочтительно не более чем примерно на 3°С выше или ниже, чем T_m области «А» удлиненного праймера, т.е. T_m области в прямом праймере, который гибридизируется с мишенью, предпочтительно не более чем примерно на 3°С выше или ниже, чем T_m области в обратном праймере, который гибридизируется с мишенью, и наоборот.

неудлиненный праймер предпочтительно имеет в длину по меньшей мере 12 нуклеотидов, предпочтительно варьирует в длину от 12 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно от 14 до 25 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения неудлиненный праймер имеет в длину 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов. 4.2.3. Универсальный праймер

В некоторых методах асимметричного ПЦР, например, описанных в патенте US 8735067 В2, в дополнение к паре прямого и обратного праймеров используют третий «универсальный» праймер, который имеет последовательность, близкую 5'-олигонуклеотидному хвосту, добавленному к одному из праймеров. Универсальный праймер предназначен для участия в реакции амплификации после начального цикла ПЦР, чтобы «сбалансировать» эффективность амплификации различных мишеней в реакции мультиплексной амплификации.

Не опираясь на теорию, авторы изобретения полагают, что включение универсального праймера, описанного в US 8735067, который в контексте настоящего изобретения будет иметь последовательность, состоящую по существу из последовательности области «В» удлиненного праймера (такие общие праймеры в настоящем изобретении называют «универсальными праймерами»), может снизить эффективность амплификации с использованием пар асимметричных праймеров по настоящему изобретению. Соответственно, методы асимметричной амплификации ДНК по настоящему изобретению предпочтительно выполнять в отсутствие универсальных праймеров.

В родственном варианте осуществления настоящего изобретения в методах асимметричной амплификации ДНК по настоящему изобретению используют одну пара асимметричных праймеров для каждой области-мишени, то есть они не включают каких-либо дополнительных праймеров, учитывая, что индивидуальный праймер может быть смесью молекул праймера с близкородственными последовательностями, полученными в результате включения разнородных оснований в определенных положениях праймера. Для ясности и во избежание сомнений, этот вариант осуществления настоящего изобретения не исключает такого использования множества пар асимметричных праймеров в реакции мультиплексной амплификации при условии, что для каждого ампликона используют одну пару асимметричных праймеров.

4.3. Последовательности-мишени и подготовка образцов

Методы ПЦР по настоящему изобретению можно использовать для амплификации нуклеиновых кислот из биологических источников или источников окружающей среды. Молекулы-мишени могут происходить из клеток и тканей организмов всех таксономических групп, в том числе из вирусов, бактерий и эукариот, прокариот, протист, растений, грибов, а также животных всех типов и классов. Животные могут быть позвоночными, млекопитающими, приматами и особенно, в том числе людьми. Кровь, сыворотка, плазма, ткань, клетки, слюна, мокрота, моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, молоко, слезы, стул, пот, сперма, цельные клетки, клеточные компоненты и мазки клеток являются подходящими источниками молекул-мишеней.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения молекулы нуклеиновых кислот-мишеней происходят от патогенов, например бактерий, вирусов или грибов, которые могут быть обнаружены в крови, моче или перитонеальной жидкости человека. К примерам таких патогенов относят, но ими перечень не ограничивают, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis, Staphylococcus aureus (включая метициллинчувствительные (MSSA) и метициллинрезистентные (MRSA) штаммы Staphylococcus aureus), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Nocardia sp., Actinomyces sp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumonia, виды Legionella, Pneumocystis jiroveci, вирус гриппа А, цитомегаловирус, риновирус, Enterococcus faecium, Acinetobacter baumannii, Corynebacterium amycolatum, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis CI 4413, Serratia marcescens, Streptococcus equi и Candida albicans.

Молекулы нуклеиновой кислоты-мишени предпочтительно являются молекулами ДНК, но также могут быть молекулами РНК. В случае матриц РНК, ПЦР может предшествовать реакция обратной транскрипции для получения молекул кДНК для использования в качестве молекул-мишеней в реакции ПЦР. Реакция обратной транскрипции может быть проведена в той же реакционной смеси, что и ПЦР, или в отдельной реакционной смеси. Способы обратной транскрипции хорошо известны в данной области.

Молекулы нуклеиновых кислот-мишеней могут быть подвергнуты обратной транскрипции (если они являются молекулами РНК), экстрагированы и/или очищены из биологических образцов или образцов окружающей среды перед включением в исходную смесь для ПЦР.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты-мишени экстрагируют с применением гранул для измельчения, описанных в патенте US 20170218356, сущность которого приведена в настоящем описании в виде ссылки.

4.4. Реакция ПЦР

4.4.1. Первоначальная реакционная смесь

Первоначальная смесь реакции ПЦР включает:

Образец нуклеиновой кислоты;

Пару асимметричных праймеров;

Термостабильную ДНК-полимеразу;

Реагенты ПЦР.

Образец нуклеиновой кислоты. Образец нуклеиновой кислоты может включать биологический образец или образец из окружающей среды, или образец, полученный из них, например, выделенную из них или очищенную ДНК. Биологический образец может представлять собой, например, кровь, сыворотку, плазму, ткань, клетки, слюну, мокроту, мочу, спинномозговую жидкость, плевральную жидкость, молоко, слезы, стул, пот, сперму, цельные клетки, клеточный компонент, клеточный мазок, или его экстракт или производное. Образец нуклеиновой кислоты также может быть образцом положительного или отрицательного контроля. Образец нуклеиновой кислоты отрицательного контроля может не содержать нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты, заведомо не содержащей последовательностей, с которыми гибридизируется пара асимметричных праймеров.

Пара асимметричных праймеров. Начальная концентрация каждого удлиненного праймера и неудлиненного праймера в реакции ПЦР может варьироваться от 200 нМ до 6 мкМ. удлиненный праймер и неудлиненный праймер могут быть включены в эквимолярных количествах в начальную реакцию ПЦР, например, в концентрациях от примерно 200 нМ до 1 мкМ каждый, например, в концентрациях 500 нМ каждый. В другом варианте, удлиненный праймер и неудлиненный праймер могут быть включены в неэквимолярных количествах в начальную реакцию ПЦР. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения начальная концентрация удлиненного праймера предпочтительно превышает концентрацию неудлиненного праймера, например, примерно от 2 до 30-кратного мольного избытка. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения концентрация удлиненного праймера находится в диапазоне от примерно 1 мкМ до 6 мкМ, а концентрация неудлиненного праймера находится в диапазоне примерно от 50 до 200 нМ.

Пара асимметричных праймеров может быть разработана для амплификации нуклеиновой кислоты из какого-либо источника, а для диагностических применений пара асимметричных праймеров может быть разработана для амплификации ДНК от патогенов, таких как те, которые указаны в разделе 4.3.

Пара асимметричных праймеров может быть разработана так, чтобы иметь возможность амплифицировать консервативные последовательности нуклеиновых кислот, присутствующие у многих видов одновременно, например высококонсервативную рибосомную последовательность 16S у бактерий.

Термостабильная ДНК-полимераза. Следующие термостабильные полимеразы могут быть применены в реакциях асимметричной ПЦР по настоящему изобретению, но ими перечень не ограничивается: Vent (Tli/Thermoccus Literalis), Vent exo-, Deep Vent, Deep Vent exo-, Taq (Thermus aquaticus), Hot Start Taq, Hot Start Ex Taq, Hot Start LA Taq, Dream Taq™, TopTaq, RedTaq, Taqurate, NovaTaq™, SuperTaq™, Stoffel Fragment, Discoverase™ dHPLC, 9° Nm, Phusion®, LongAmp Taq, LongAmp Hot Start Taq, OneTaq, Phusion® Hot Start Flex, Crimson Taq, Hemo KlenTaq, KlenTaq, Phire Hot Start II, DyNAzyme I, DyNAzyme II, M-MulV Reverse Transcript, PyroPhage®, Tth (Thermos termophilus HB-8), Tfl, Amlitherm™, ДНК Bacillus, DisplaceAce™, Pfu (Pyrococcus furiosus), Pfu Turbot, Pfunds, ReproFast, PyroBest™, VeraSeq, Mako, Manta, Pwo (Pyrococcus woesei), ExactRun, KOD (Thermococcus kodakkaraensis), Pfx, ReproHot, Sac (Sulfolobus acidocaldarius), Sso (Sulfolobus solfataricus), Tru (Thermus ruber, Pfx50™ (Thermococcus zilligi), AccuPrime™ GC-Rich (Pyrolobus fumarius), Pyrococcus species GB-D, Tfi (Thermus filiformis), Tfi exo-, ThermalAce™, Tac (Thermoplasma acidophilum), (Mth (M. ihermoautotrophicum), Pab (Pyrococcus abyssi), Pho (Pyrococcus horikosihi, В103 (Picovirinae бактериофаг B103), Bst (Bacillus stearothermophilus), Bst большой фрагмент, Bst 2.0, Bst 2.0 Warm Start, Bsu, Therminator™, Therminator™ II, Therminator™ III и Therminator™ Т. В предварительном варианте осуществления ДНК-полимеразой является полимераза Taq, например, Taq, Hot Start Taq, Hot Start Ex Taq, Hot Start LA Taq, DreamTaq™, TopTaq, RedTaq, Taqurate, NovaTaq™ или SuperTaq™.

Реагенты для ПЦР. Реагенты для ПЦР (dNTP, буферный агент, соль) хорошо известны специалистам в данной области. Их можно добавлять отдельно к исходной реакционной смеси для ПЦР или предварительно смешивать полностью или частично, например, в качестве части мастер-микс для ПЦР.

Удобно, что мастер-микс для ПЦР может быть приготовлен до начала реакции и сохраняться до использования. Мастер-микс ПЦР может включать ДНК-полимеразу, dNTP (включая необязательные флуоресцентно меченые dNTP при необходимости), буферный агент и/или соль и, необязательно, обратную транскриптазу, и различные добавки, такие как консервант. Праймеры и образец нуклеиновой кислоты обычно не включают в мастер-микс для ПЦР, а включают в реакционную смесь для начальной ПЦР незадолго до начала реакции ПЦР.

Методы по настоящему изобретению дополнительно включают необязательную стадию формирования начальной реакционной смеси перед началом термоциклирования путем объединения компонентов начальной реакционной смеси в сосуде для ПЦР, например, в пробирке для ПЦР.

4.4.2. Условия проведения ПЦР

В табл. 2 показан набор асимметричных циклов как иллюстрация для применения в методах асимметричной ПЦР.

Диапазоны количества циклов, показанные в табл. 2, можно использовать для какой-либо пары асимметричных праймеров, и оптимальное количество циклов зависит от количества копий ДНК-мишени в исходной смеси ПЦР: чем больше исходное количество копий, тем меньше циклов необходимо в экспоненциальной фазе для выработки достаточного количества продуктов ПЦР, которые являются матрицами для линейной фазы. Оптимизация числа циклов является обычной операцией, известной специалистам.

Температура, приведенная в табл. 2, в частности применима, если T_m удлиненного праймера выше 72°С (например, 75-80°С) и T_m неудлиненного праймера выше 58°С, но ниже 72°С (например, 60-62°С), и когда термоустойчивая ДНК-полимераза активна при 72°С.

Продолжительность цикла, особенно время удлинения, можно варьировать в зависимости от температуры плавления праймеров и длины продукта ПЦР, при этом более длинные продукты ПЦР требуют более длительного времени удлинения. Практическое правило состоит в том, что стадия удлинения должна составлять по меньшей мере 60 сек на 1000 оснований ампликона. Стадия удлинения может быть продлена в линейной фазе, чтобы обеспечить дополнительное время для отжига.

4.5. Выявление продуктов ПЦР

ПЦР-продукт цепи 2, которая представляет собой обогащенный одноцепочечный продукт ПЦР, полученный описанными в настоящем изобретении методами, может быть помечен флуоресцентными метками для его выявления.

Нанесение флуоресцентной метки может быть достигнуто включением флуоресцентно меченых нуклеотидов во время ПЦР и/или использованием меченых праймеров для ПЦР.

К примерам флуоресцентных фрагментов относят FITC, EDANS, техасский красный, 6-joe, TMR, Alexa 488, Alexa 532, "BODIPY FL/C3", "BODIPY R6G", "BODIPY FL", Alexa 532, "BODIPY FL/C6", "BODIPY TMR", 5-FAM, "BODIPY 493/503", "BODIPY 564", "BODIPY 581", СуЗ, Cy5, R110, TAMRA и х-родамин.

Флуоресцентные фрагменты могут быть присоединены к dNTP, особенно к тем, которые содержат цитозин в качестве основания (цитидиловая кислота, цитидин-5'-фосфат, цитидин-5'-дифосфат, цитидин-5'-трифосфат или их полимеры, или полимеры, содержащий цитидиловую кислоту).

Положение метки dNTP может быть у основания (аминогруппа), фосфатной группы (группа ОН) или дезоксирибозного фрагмента (2'- или 3'-ОН групп). Предпочтительным является положение у основания.

Подобно другим нуклеотидам, флуоресцентно меченные dNTP могут быть включены в обе цепи ампликона ПЦР в случайных сайтах, обычно сайтах dC, и удлинены с помощью ДНК-полимеразы.

Флуоресцентные dNTP коммерчески доступны в высокой концентрации и могут быть добавлены в реакционную смесь для ПЦР без корректировки концентрации каждого dNTP без метки. Для большинства амплификаций ПЦР типичное соотношение dNTP к флуоресцентным dNTP составляет от 100:1 до 1000:1. Таким образом, флуоресцентно меченые dNTP могут быть включены в состав реагентов для ПЦР в количестве от 0,1% до 1% (в молях) dNTP без метки.

Обнаружение флуоресцентно меченых продуктов ПЦР (например, одноцепочечного продукта цепи 2, который образуется в избытке при использовании методов по настоящему изобретению) может быть достигнуто посредством гибридизации с молекулами зондов, например, молекулами зондов, связанными с микрочипом. Подходящая система микрочипов использует преимущества трехмерного перекрестно сшитого полимера, например, описанного в US 9738926, сущность которого включена в настоящее изобретение в виде ссылки.

4.6. Наборы

В настоящем описании также предусматривают наборы, применимые для проведения описанных в настоящем изобретении методов асимметричной ПЦР. Наборы обычно включают, по крайней мере, асимметричную пару праймеров. Кроме того, наборы по настоящему изобретению могут включать молекулы зондов, ДНК-полимеразу, немеченые dNTP, меченые dNTP, буферы, солевые растворы или какую-либо их комбинацию. Некоторые из реагентов (например, ДНК-полимераза, dNTP, соль и/или буфер) могут быть предварительно объединены в виде мастер-микса.

5. Примеры

Начальную реакцию ПЦР осуществляют с помощью пары асимметричных праймеров, разработанной для амплификации области длиной 506 п. н. из гена 16S S. aureus (без учета последовательностей праймеров), с использованием удлиненного праймера для прямого праймера и неудлиненного праймера для обратного праймера. Образец нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК человека с известным числом копий геномной ДНК S. aureus (целевой ДНК для этих исследований). Прямой праймер (с расчетной T_m 68,1°С) характеризуется меткой Су5 на первичном 5-конце, содержит область «А» (с расчетной T_m 64,09°С), область «В», комплементарную 5'-концу области «А», и не содержит области «С» в качестве спейсера между областями «А» и «В». Обратный праймер включает инозин, который может образовывать пару оснований с каким-либо другим основанием в последовательности-мишени. В зависимости от дополнительного целевого основания T_m обратного праймера варьирует в диапазоне 60-61,9°С. Начальную реакцию ПЦР проводят с применением следующих циклов ПЦР:

• период начальной денатурации длительностью 2 мин при 95°С,

• экспоненциальные циклы, каждый из которых состоит из денатурации в течение 20 сек при 95°С, отжига в течение 15 сек при 58°С и удлинения в течение 40 сек при 72°С,

• линейные циклы, каждый из которых состоит из денатурации в течение 20 сек при 95°С и затем одновременного отжига/удлинения при 72°С, и

• в конце, период продленного удлинения длительностью 2 мин при 72°С.

В эксперименте 1 количество молекул-мишеней ДНК и экспоненциальных и линейных циклов варьируют, чтобы оптимизировать количество экспоненциальных и линейных циклов для числа копий нуклеиновой кислоты-мишени. Количество включенного обратного (неудлиненного праймера) определяют таким образом, чтобы неудлиненный праймер был исчерпан или почти исчерпан к концу экспоненциальной фазы, и очень небольшое количество молекул неудлиненного праймера оставалось бы в линейной фазе асимметричной ПЦР. Результаты этих рассчетов показаны в табл. 3.

Количество продукта ПЦР, полученного в эксперименте 1, определяют путем гибридизации с микрочипом. Результаты показаны на фиг. 8.

В эксперименте 2 сравнивают количество продукта ПЦР, полученного от разных концентраций матрицы с применением асимметричной ПЦР и симметричной ПЦР с использованием 500 нМ каждого из прямого и обратного зондов в реакции ПЦР. Для асимметричной реакции количество используемых экспоненциальных и линейных циклов составляет 35 и 20, соответственно. В симметричной реакции линейные циклы не используют.

Количество продукта ПЦР определяют путем гибридизации с микрочипом. Результаты показаны на фиг. 9. Величина R, превышающая 0,95, означает, что в каждом случае линия регрессии является действительной для данных.

6. Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения

Настоящее изобретение иллюстрируют конкретные варианты его осуществления, приведенные ниже.

1. Способ получения одноцепочечных ампликонов ДНК с помощью асимметричной полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий стадии:

(а) воздействия на исходную смесь на первой стадии циклического температурного воздействия (термоциклирования) в условиях амплификации ПЦР, причем указанная исходная смесь содержит:

(i) образец нуклеиновой кислоты;

(ii) пару асимметричных праймеров,

(iii) термостабильную ДНК-полимеразу, и

(iv) реагенты ПЦР,

где первая стадия термоциклирования включает чередование по меньшей мере трех температур, а именно: (1) первой температуры выше T_m нуклеиновой кислоты-мишени, предназначенной для денатурации, (2) второй температуры ниже T_m неудлиненного праймера для отжига праймера, и (3) третьей температуры, подходящей для удлинения с помощью термостабильной ДНК-полимеразы,

тем самым формируя промежуточную смесь, которая включает ампликоны ДНК, удлиненные как от неудлиненного праймера, так и от удлиненного праймера, если целевая нуклеиновая кислота (нуклеиновая кислота-мишень) присутствует в образце;

(б) воздействия на промежуточную смесь на второй фазе термоциклирования, причем указанная вторая фаза включает чередование: (1) четвертой температуры выше T_m ампликонов ДНК для денатурации, (2) пятой температуры, которая (i) ниже T_m удлиненного праймера, (ii) выше T_m неудлиненного праймера и (iii) применима для удлинения с помощью термостабильной ДНК-полимеразы,

таким образом получают итоговую смесь, включающую ампликоны одноцепочечной ДНК, если в образце присутствует нуклеиновая кислота-мишень.

2. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 1, в котором стадии (а) предшествует период начальной денатурации.

3. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 2, в котором начальную денатурацию осуществляют при первой температуре.

4. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-3, в котором стадия (б) сопровождается дополнительным периодом удлинения.

5. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 4, в котором дополнительное удлинение осуществляют при пятой температуре.

6. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-5, в которых первая и четвертая температуры одинаковые.

7. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-6, в котором третья и пятая температуры одинаковые.

8. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-7, в котором область «В» удлиненного праймера является дополнением инвертированного повтора по меньшей мере части области «А».

9. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 0, в котором область «В» содержит по меньшей мере 4 нуклеотида в длину.

10. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 0 или 9, в которых область «В» короче на 3 нуклеотида по сравнению с областью «А».

11. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-7, в которых область «В» удлиненного праймера является дополнением прямого повтора по меньшей мере части области «А».

12. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 11, в котором область «В» удлиненного праймера содержит по меньшей мере 4 нуклеотида в длину.

13. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 11 или 12, в которых область «В» удлиненного праймера короче на 3 нуклеотида по сравнению с областью «А».

14. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-11, в которых область «В» удлиненного праймера содержит от 7 до 15 нуклеотидов в длину.

15. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 14, в котором область «В» удлиненного праймера содержит от 6 до 12 нуклеотидов в длину.

16. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 15, в котором область «В» удлиненного праймера содержит от 8 до 10 нуклеотидов в длину.

17. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 15, в котором область «В» удлиненного праймера содержит 6 нуклеотидов в длину.

18. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 15, в котором область «В» удлиненного праймера содержит 7 нуклеотидов в длину.

19. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 15, в котором область «В» удлиненного праймера содержит 8 нуклеотидов в длину.

20. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 15, в котором область «В» удлиненного праймера содержит 9 нуклеотидов в длину.

21. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 15, в котором область «В» удлиненного праймера содержит 10 нуклеотидов в длину.

22. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 15, в котором область «В» удлиненного праймера содержит 11 нуклеотидов в длину.

23. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 15, в котором область «В» удлиненного праймера содержит 12 нуклеотидов в длину.

24. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-23, в котором неудлиненный праймер не имеет удлинение с 5'-конца.

25. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-23, в котором неудлиненный праймер имеет удлинение с 5'-конца из 3 нуклеотидов или менее.

26. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-25, в котором неудлиненный праймер содержит 12-35 нуклеотидов в длину.

27. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 26, в котором неудлиненный праймер содержит 15-25 нуклеотидов в длину.

28. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 26, в котором неудлиненный праймер содержит 18-20 нуклеотидов в длину.

29. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-28, в котором область «А» удлиненного праймера содержит 12-35 нуклеотидов в длину.

30. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 29, в котором область «А» удлиненного праймера содержит 15-25 нуклеотидов в длину.

31. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 29, в котором область «А» удлиненного праймера содержит 18-20 нуклеотидов в длину.

32. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-31, в котором удлиненный праймер содержит область «С».

33. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 32, в котором область «С» содержит 1-8 нуклеотидов в длину.

34. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 32 или 33, в котором область «С», одна или в комбинации с нуклеотидами фланкирующей области «А» и/или «В», образует сайт распознавания для эндонуклеазы рестрикции.

35. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 34, в котором эндонуклеазой рестрикции является рестриктаза 6-cutter.

36. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-35, в котором T_m удлиненного праймера больше, чем T_m неудлиненного праймера по меньшей мере на 8°С.

37. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 36, в котором T_m удлиненного праймера больше, чем T_m неудлиненного праймера, на 10°С - 30°С.

38. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 37, в котором T_m удлиненного праймера больше, чем T_m неудлиненного праймера, на 15°С - 30°С

39. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 38, в котором T_m удлиненного праймера больше, чем T_m неудлиненного праймера, на 12°С - 20°С.

40. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 39, в котором T_m удлиненного праймера больше, чем T_m неудлиненного праймера, на 13°С - 17°С.

41. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-40, в котором T_m удлиненного праймера находится в диапазоне 68°С - 80°С.

42. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 41, в котором T_m удлиненного праймера находится в диапазоне 73°С - 77°С.

43. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 42, в котором T_m удлиненного праймера равна 75°С.

44. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-43, в котором T_m неудлиненного праймера находится в диапазоне 50°С - 62°С.

45. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 44, в котором T_m неудлиненного праймера находится в диапазоне 58°С - 62°С.

46. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 45, в котором T_m неудлиненного праймера равна 60°С.

47. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-46, в котором T_m области «А» удлиненного праймера находится в диапазоне 50°С - 62°С.

48. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 47, в котором T_m области «А» удлиненного праймера находится в диапазоне 5 8°С -62°С.

49. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 48, в котором T_m области «А» удлиненного праймера равна 60°С.

50. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-49, в котором T_m области «А» удлиненного праймера и T_m неудлиненного праймера варьирует не более чем на 3°С.

51. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-50, в котором первая температура равна 95°С.

52. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-51, в котором вторая температура равна 58°С.

53. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-52, в котором третья температура равна 72°С.

54. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-53, в котором четвертая температура равна 95°С.

55. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-54, в котором пятая температура равна 72°С.

56. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-55, в котором ампликоны ДНК, удлиненные как от неудлиненного праймера, так и от удлиненного праймера в промежуточной смеси, гибридизируются друг с другом с образованием двухцепочечных ампликонов ДНК.

57. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-56, в котором ампликоны ДНК, полученные методом ПЦР, варьируют в длину от 100 до 2500 нуклеотидов.

58. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 57, в котором ампликоны ДНК, полученные методом ПЦР, варьируют в длину от 100 до 2000 нуклеотидов.

59. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 57, в котором ампликоны ДНК, полученные методом ПЦР, варьируют в длину от 250 до 1500 нуклеотидов.

60. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 57, в котором ампликоны ДНК, полученные методом ПЦР, варьируют в длину от 300 до 1000 нуклеотидов.

61. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-60, в котором образец нуклеиновой кислоты является образцом исследуемой нуклеиновой кислоты.

62. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 61, в котором образец исследуемый нуклеиновой кислоты содержит, или есть риск что содержит, или предположительно содержит молекулы нуклеиновой кислоты-мишени.

63. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-60, в котором образец нуклеиновой кислоты является образцом контрольной нуклеиновой кислоты.

64. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 63, в котором образец контрольной нуклеиновой кислоты является положительным контрольным образцом, о котором известно, что он содержит молекулу (молекулы) нуклеиновой кислоты-мишени.

65. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 63, в котором образец контрольной нуклеиновой кислоты является положительным контрольным образцом, о котором известно, что он содержит молекулы нуклеиновой кислоты-мишени.

66. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-65, в котором реакция является множественной ПЦР.

67. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 66, в котором исходная смесь содержит по меньшей мере две пары асимметричных праймеров.

68. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 67, в котором исходная смесь содержит по меньшей мере две, три или четыре пары асимметричных праймеров.

69. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 61-68, в котором исходная смесь дополнительно содержит контрольные праймеры.

70. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 69, в котором контрольные праймеры комплементарны последовательности-мишени, которая отличается от целевой последовательности (последовательностей), по отношению к которой пара (пары) асимметричных праймеров комплементарна.

71. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 69 или 70, в котором контрольные праймеры являются стандартными праймерами.

72. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 69 или 70, в котором контрольные праймеры являются парой асимметричных праймеров.

73. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-0, в котором ПЦР осуществляют в отсутствие универсального праймера.

74. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-73, в котором первая стадия включает 20-40 термоциклов.

75. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 74, в котором вторая стадия включает 30-37 термоциклов.

76. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-75, в котором первая стадия приводит к экспоненциальной амплификации обеих цепей нуклеиновой кислоты-мишени.

77. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-76, в котором вторая стадия включает 15-25 термоциклов.

78. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-77, в котором вторая стадия приводит к линейной амплификации одной цепи нуклеиновой кислоты-мишени.

79. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-78, в котором концентрация каждого удлиненного праймера и неудлиненного праймера в исходной смеси варьирует от 200 нМ до 6 мкМ.

80. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-79, в котором концентрации каждого удлиненного праймера и неудлиненного праймера в исходной смеси одинаковы.

81. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 80, в котором концентрация каждого удлиненного праймера и неудлиненного праймера в исходной смеси варьирует от 100 нМ до 1000 нМ.

82. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 81, в котором концентрация каждого удлиненного праймера и неудлиненного праймера в исходной смеси варьирует от 250 нМ до 750 нМ.

83. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 82, в котором концентрация каждого удлиненного праймера и неудлиненного праймера в исходной смеси составляет примерно 500 нМ.

84. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-79, в котором концентрации удлиненного праймера и неудлиненного праймера в исходной смеси различны.

85. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 84, в котором концентрация удлиненного праймера в исходной смеси варьирует от 1 мкМ до 6 мкМ.

86. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 84 или 85, в котором концентрация неудлиненного праймера в исходной смеси варьирует от 50 нМ до 200 нМ.

87. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-86, в котором удлиненный праймер имеет метку.

88. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 87, в котором удлиненный праймер имеет метку с 5'-конца.

89. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 87 или 88, в котором меткой является флуорофор.

90. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-89, в котором пара асимметричных праймеров включает последовательности, комплементарные бактериальным последовательностям.

91. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 90, в котором бактериальные последовательности являются последовательностями 16S ДНК.

92. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 90, в котором бактериальные последовательности являются внутренними транскрибируемыми областями последовательностей бактериальной ДНК.

93. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-89, в котором пара асимметричных праймеров содержит последовательности, комплементарные последовательностям грибной ДНК.

94. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-93, в котором образец является биологическим образцом.

95. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 94, в котором биологический образец является кровью или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее.

96. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 94, в котором биологический образец является перитонеальной диализированной жидкостью или ее образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее.

97. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 94, в котором биологический образец является мочой или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее.

98. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 94, в котором биологический образец является мокротой или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее.

99. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 94, в котором биологический образец является отделяемым из раны или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из этого материала.

100. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-93, в котором образец является образцом из окружающей среды.

101. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 1-100, который дополнительно включает обнаружение одноцепочечного ампликона ПЦР.

102. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 101, который включает гибридизацию одноцепочечного ампликона ПЦР с молекулой зонда и обнаружение гибридизации ампликона с молекулой зонда.

103. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 102, в котором молекула зонда имеет метку.

104. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 103, в котором молекула зонда имеет метку флуорофор.

105. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 102-104, в котором молекула зонда комплементарна по меньшей мере части удлиненного праймера.

106. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 105, в котором молекула зонда имеет в длину по меньшей мере 15 нуклеотидов.

107. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 105 или 106, в котором молекула зонда содержит область, комплементарную по меньшей мере 8 нуклеотидам области «А» удлиненного праймера.

108. Способ по какому-либо варианту осуществления настоящего изобретения 102-104, в котором молекула зонда комплементарна по меньшей мере части неудлиненного праймера.

109. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 108, в котором молекула зонда имеет в длину по меньшей мере 15 нуклеотидов.

110. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 108 или 109, в котором молекула зонда содержит область, комплементарную по меньшей мере 8 нуклеотидам области «А» удлиненного праймера.

Хотя были проиллюстрированы и описаны различные конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, следует принять во внимание, что различные изменения могут быть внесены без отклонения от сущности настоящего изобретения и области его охвата.

7. Цитирование источников

Все публикации, патенты, патентные заявки и другие документы, процитированные в настоящем описании, включены в него в виде ссылок на их сущность. При несоответствии сущностей, изложенных в одной или нескольких ссылках, включенных в описание настоящего изобретения, приоритет имеют сущности, изложенные в настоящем изобретении.

1. Способ получения одноцепочечных ампликонов ДНК нуклеиновой кислоты-мишени, имеющей первую цепь и вторую цепь, с помощью асимметричной полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий стадии:

(а) воздействия на исходную смесь на первой стадии термоциклирования в условиях амплификации ПЦР, причем указанная исходная смесь содержит:

(i) образец нуклеиновой кислоты;

(ii) пару асимметричных праймеров, состоящую из удлиненного праймера и неудлиненного праймера,

(iii) термостабильную ДНК-полимеразу и

(iv) реагенты ПЦР,

где первая стадия термоциклирования включает чередование по меньшей мере трех температур, а именно:

(1) первой температуры выше T_m целевой нуклеиновой кислоты, предназначенной для денатурации,

(2) второй температуры ниже T_m неудлиненного праймера для отжига праймера и

(3) третьей температуры, подходящей для удлинения с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, тем самым формируя промежуточную смесь, которая включает ампликоны двухцепочечной ДНК, удлиненные как от неудлиненного праймера, так и от удлиненного праймера, если нуклеиновая кислота-мишень присутствует в образце;

(б) воздействия на промежуточную смесь на второй стадии термоциклирования, причем указанная вторая стадия термоциклирования включает чередование:

(1) четвертой температуры выше T_m двухцепочечных ампликонов ДНК для денатурации,

(2) пятой температуры, которая

(i) ниже T_m удлиненного праймера,

(ii) выше T_m неудлиненного праймера и

(iii) применима для удлинения с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, таким образом получают итоговую смесь, включающую одноцепочечные ампликоны ДНК, если в образце присутствует нуклеиновая кислота-мишень, в которой:

(1) неудлиненный праймер состоит по существу из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере на 75% комплементарной последовательности соответствующей области в первой цепи; и

(2) удлиненный праймер содержит (а) на своем 3'-конце область «А», которая по меньшей мере на 75% комплементарна последовательности соответствующей области второй цепи; (b) на ее 5'-конце область «B», которая содержит последовательность, комплементарную по меньшей мере части области «A»; и (c) необязательную область «C», расположенную между областями «A» и «B».

2. Способ по п. 1, в котором стадии (а) предшествует период начальной денатурации, при котором необязательно начальную денатурацию осуществляют при первой температуре.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором за стадией (б) следует период дополнительного удлинения, при котором необязательно дополнительное удлинение осуществляют при пятой температуре.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором первая и четвертая температуры равны и/или третья и пятая температуры равны.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором область «В» удлиненного праймера является комплементом инвертированного повтора по меньшей мере части области «А» или комплементом прямого повтора по меньшей мере части области «А».

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором неудлиненный праймер не имеет удлинения с 5′-конца или имеет удлинение с 5′-конца из 3 нуклеотидов или менее.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором удлиненный праймер содержит область «С», которая необязательно одна или в комбинации с нуклеотидами фланкирующей области «A» и/или «B», образует сайт распознавания для эндонуклеазы рестрикции.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором T_m удлиненного праймера больше, чем T_m неудлиненного праймера по меньшей мере на 8°C.

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором T_m области «А» удлиненного праймера и T_m неудлиненного праймера варьируют не более чем на 3°C.

10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором

(а) первая температура равна 95°C;

(б) вторая температура равна 58°C;

(в) третья температура равна 72°C;

(г) четвертая температура равна 95°C;

(д) пятая температура равна 72°C или

(е) какая-либо комбинация (а)-(д).

11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором ампликоны ДНК, удлиненные как от неудлиненного праймера, так и от удлиненного праймера в промежуточной смеси, гибридизируются друг с другом с образованием двухцепочечных ампликонов ДНК.

12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором образец нуклеиновой кислоты является образцом исследуемой нуклеиновой кислоты.

13. Способ по любому из пп. 1-11, в котором образец нуклеиновой кислоты является образцом контрольной нуклеиновой кислоты.

14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором реакция является множественной ПЦР.

15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором ПЦР осуществляют в отсутствие универсального праймера.

16. Способ по любому из пп.1-15, в котором часть области «A», которая комплементарна последовательности области «B», находится в пределах 1, 2 или 3 нуклеотидов от 5'-конца области «A».

17. Способ по любому из пп.1-16, в котором часть области «В» удлиненного праймера имеет длину от 6 до 12 нуклеотидов.

18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором часть области «C», когда она присутствует в удлиненном праймере, имеет длину от 1 до 6 нуклеотидов.

19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором первая стадия приводит к экспоненциальной амплификации обеих цепей нуклеиновой кислоты-мишени и/или вторая стадия приводит к линейной амплификации одной цепи нуклеиновой кислоты-мишени.

20. Способ по любому из пп. 1-19, в котором пара асимметричных праймеров включает последовательности, комплементарные бактериальным последовательностям или грибным последовательностям ДНК.

21. Способ по любому из пп. 1-20, в котором образец является биологическим образцом, который необязательно является:

(а) кровью или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее;

(б) перитонеальной диализированной жидкостью или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее;

(в) мочой или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее;

(г) мокротой или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее;

(д) отделяемым из раны или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из этого материала.

22. Способ по любому из пп. 1-20, в котором образец является образцом из окружающей среды.

23. Способ по любому из пп. 1-22, который дополнительно включает обнаружение одноцепочечного ампликона ПЦР.