Режим дозирования ингибитора wnt и молекулы антитела к pd-1 в комбинации

Авторы патента:

ДОБСОН, Джейсон Рассел (US)

МУДИ, Сьюзан (US)

МАКЛАФИН, Маргарет Элис (US)

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

A61K39/39541 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

A61K31/497 - содержащие дополнительно гетероциклические кольца

A61K2039/505 - Лекарства и медикаменты для терапевтических, стоматологических или гигиенических целей (изготовление специальных лекарственных форм A61J; химические аспекты или использование материалов для дезодорации воздуха, для дезинфекции или стерилизации или для бандажей, перевязочных средств, впитывающих прокладок или хирургических приспособлений A61L; соединения как таковые C01, C07,C08,C12N; мыла C11D; микроорганизмы как таковые C12N)

Владельцы патента RU 2767533:

НОВАРТИС АГ (CH)

Изобретение относится к области фармации и медицины, а именно к способу лечения рака, включающему введение фармацевтической комбинации, содержащей (i) 2–(2',3–диметил–[2,4'–бипиридин]–5–ил)–N–(5–(пиразин–2–ил)пиридин–2–ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль и (ii) молекулу антитела к PD–1, выбранную из ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, PDR–001 или их фармацевтически приемлемой соли; где (ii) вводится по меньшей мере один раз за цикл; где (i) вводится ежедневно в дни 1–15 или дни 1-16 каждого цикла на протяжении до 4 циклов или (i) вводится в течение дней 1–8 каждого цикла на протяжении до 4 циклов; где каждый цикл составляет 28 дней или 30 дней; где рак представляет собой трижды негативный рак молочной железы (TNBC), плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак желудочно–кишечного тракта, колоректальный рак, плоскоклеточный рак легкого, плоскоклеточный рак пищевода, плоскоклеточный рак шейки матки или меланому. Изобретение обеспечивает решение проблемы разработки новых видов комбинированной терапии рака, которые активируют иммунную систему или преодолевают стойкость к видам иммунотерапии. 12 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл., 5 пр.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области фармации, в частности к ингибитору Wnt и молекуле антитела к PD-1 для применения при лечении рака. В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической комбинации, содержащей ингибитор Wnt или его фармацевтически приемлемую соль и молекулу антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемую соль, для применения при лечении рака, к способу лечения рака, который предусматривает введение комбинации; и к применению комбинации для изготовления лекарственного препарата для лечения рака.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Семейство Wnt (Wingless) представляет собой группу высококонсервативных секретируемых белков, которые регулируют взаимодействия между клетками во время эмбриогенеза и участвуют в процессах канцерогенеза, старения и фиброзирования. Ген Wnt был идентифицирован в качестве онкогена в опухолях молочной железы мышей 30 лет назад, и во многих исследованиях было подтверждено, что он формирует ключевой онкогенный сигнальный путь. Семейство генов Wnt кодирует большой класс секретируемых белков, родственных протоонкогену Int1/Wnt1 и Wingless дрозофилы ("Wg"), являющемуся гомологом Wnt1 у дрозофил (Cadigan et al. Genes& Development 1997, 11, 3286).

Белок 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1) является ингибирующим членом обширного семейства CD28/CTLA4 регуляторов Т-клеток (Okazaki et al. Curr. Opin. Immunol. 2002, 14, 391779; Bennett et al. J. Immunol. 2003, 170, 711). Лиганды рецептора CD28 включают группу родственных молекул В7, также известных как "суперсемейство В7" (Coyle et al. Nature Immunol. 2001, 2(3), 203; Sharpe et al. Nature Rev. Immunol. 2002, 2, 116; Collins et al. Genome Biol. 2005, 6, 223.1; Korman et al. Adv. Immunol. 2007, 90, 297). Известно несколько членов суперсемейства В7, в том числе В7.1 (CD80), В7.2 (CD86), индуцируемый костимулирующий лиганд (ICOS-L), лиганд 1 белка запрограммированной гибели клеток (PD-L1; B7-H1), лиганд 2 белка запрограммированной гибели клеток (PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4 и B7-H6 (Collins et al. Genome Biol. 2005, 6, 223.1). Другие члены семейства CD28 включают CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. Предполагается, что PD-1 существует в виде мономера, не имеющего неспаренного цистеинового остатка, характерного для других членов семейства CD28. PD-1 экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и моноцитах.

PD-L1 является широко распространенным при различных формах рака человека (Dong et al. Nat. Med. 2002, 8, 787). PD-1 известен как иммуноингибирующий белок, который осуществляет отрицательную регуляцию передачи сигналов, опосредованной TCR (Ishida et al. EMBO J. 1992, 11, 3887; Blank et al. Immunol. Immunother. 2006, 56(5), 739). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 может выступать в качестве контрольной точки иммунного ответа, что может приводить, например, к уменьшению количества инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, уменьшению пролиферации, опосредованной Т-клеточными рецепторами, и/или ускользанию раковых клеток от иммунного надзора (Dong et al. J. Mol. Med. 2003, 81, 281; Blank et al. Cancer Immunol. Immunother. 2005, 54, 307; Konishi et al. Clin. Cancer Res. 2004, 10, 5094). Иммуносупрессию можно устранить путем ингибирования локального взаимодействия PD-1 с PD-L1 или PD-L2; данный эффект является аддитивным, если также блокируется взаимодействие PD-1 с PD-L2 (Iwai et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2002, 99:12293-7; Brown et al. J. Immunol. 2003, 170, 1257).

Несколько наборов данных позволяют предположить, что сигнальный путь Wnt может иметь важное значение при различных формах рака. Мутации компонентов канонического сигнального пути Wnt, таких как APC и β-катенин, могут играть важные роли в патогенезе некоторых злокачественных новообразований. Недавний молекулярный анализ образцов метастатической меланомы человека выявил корреляцию между активацией сигнального пути WNT/β-катенина и отсутствием сигнатуры экспрессии генов Т-клеток (Spranger et al. Nature 2015, 523, 231).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

С учетом важности сигнальных путей, являющихся контрольными точками иммунного ответа, в регуляции иммунного ответа при терапии рака существует потребность в разработке новых видов комбинированной терапии, которые активируют иммунную систему или преодолевают стойкость к видам иммунотерапии.

Настоящее изобретение решает эту потребность путем обеспечения фармацевтической комбинации, определенной в данном документе.

Первым аспектом настоящего изобретения является фармацевтическая комбинация, содержащая ингибитор Wnt формулы (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид [соединение формулы (I)] или его фармацевтически приемлемую соль,

и (ii) молекулу антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемую соль, для применения при лечении рака, где (i) вводится ежедневно в дни 1-15 каждого цикла на протяжении до 4 циклов, а (ii) вводится по меньшей мере один раз в цикл.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрено применение ингибитора Wnt формулы (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с молекулой антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемой солью для изготовления лекарственного препарата для лечения рака, где (i) и (ii) вводятся так, как указано в данном документе, где предпочтительно (i) вводится ежедневно в дни 1-15 каждого цикла на протяжении до 4 циклов, а (ii) вводится по меньшей мере один раз в цикл.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения рака, при этом указанный способ включает введение эффективного количества (i) и (ii) пациенту, нуждающемуся в этом, где (i) вводят ежедневно в дни 1-15 каждого цикла на протяжении до 4 циклов, а (ii) вводят по меньшей мере один раз в цикл.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фигуре 1 представлена измеренная с помощью NanoString экспрессия генов в образцах РНК, выделенных из биоптатов опухолей после 15-дневного воздействия.

На фигуре 2 показана экспрессия CD3 при скрининговых и заключительных визитах для 9 пар субъектов в этом анализе.

На фигуре 3 показана одна из сигнатур Т-клеток, выбранных для исследования.

На фигуре 4 показано модулирование сигнального пути Wnt после лечения.

На фигуре 5 показана сигнатура хемокинов, ассоциированная с привлечением CD103+ дендритных клеток.

На фигуре 6 показана сигнатура хемокинов, ассоциированная с привлечением CD8+ Т-клеток.

На фигурах 7А и 7В показана корреляция между сигнатурами Т-клеток и Wnt в Атласе ракового генома (TCGA) для различных типов раковых клеток.

На фигуре 8 проиллюстрирован план клинического исследования.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Недавно стало известно, что секретируемые гликопротеины R-спондины 1-4 (RSPO1-4) являются важными активаторами канонического сигнального пути Wnt. RSPO связываются с рецепторами, сопряженными с G-белком, содержащими повторы, богатые лейцином (LGR4-6), и трансмембранными убиквитинлигазами Е3 c RING-пальцами 43/цинковыми и RING-пальцами 3 (RNF43/ZNRF3) с образованием тройного комплекса (Chen et al. Genes Dev; 2013, 27, 1345). RNF43/ZNRF3 выступают в качестве антагонистов сигнального пути Wnt, стимулируя метаболизм Fz и LRP6 (Hao et al. Nature 2012, 485 (7397), 195-200; Koo et al. Nature, 2012, 488 (7413), 665). Связывание RSPO индуцирует эндоцитоз RNF43/ZNRF3 с увеличением таким образом уровней мембраносвязанных Fz и LRP6 и усилением передачи сигнала, опосредованной лигандами Wnt. Для активации передачи сигнала внутри клеток-мишеней Wnt белки должны надлежащим образом секретироваться и транспортироваться по внеклеточному пространству. Porcupine представляет собой мембраносвязанную О-ацилтрансферазу (MBOAT), которая добавляет пальмитоильные группы к белкам Wnt (Takada et al. Dev. Cell 2006, 11, 791). Мутации компонентов канонического сигнального пути Wnt, таких как APC и β-катенин, играют важные роли в патогенезе некоторых злокачественных новообразований, и эти генетические повреждения влияют на восходящую регуляцию сигнального пути Wnt. Недавно стало известно, что ингибирование сигнального пути Wnt ассоциировано с некоторыми недостатками, такими как побочные эффекты и формы дозолимитирующей токсичности. Такие недостатки ограничивали противоопухолевую эффективность ингибиторов Wnt. Помимо этого, была установлена связь активации сигнального пути Wnt с устойчивостью к иммунотерапии, и она является механизмом, с помощью которого опухоли могут ускользать от выявления иммунной системой и таким образом уменьшать клиническую пользу ингибиторов контрольных точек иммунного ответа (Spranger et al. Nature 2015, 523, 231). Например, был протестирован ингибитор Wnt согласно настоящему изобретению, а именно 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид, и были проанализированы уровни pLRP6 и AXIN2 с помощью qPCR в биоптатах кожи и опухолей. Наблюдалось ингибирование уровней pLRP6 и AXIN2 в биопсийных образцах кожи после лечения с помощью 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли, что указывало на ингибирование сигнального пути Wnt. К сожалению, в других исследованиях 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемая соль в отдельности в качестве монотерапии продемонстрировал повышенный уровень экспрессии цитотоксической генной сигнатуры и отсутствие противоопухолевой эффективности. В дополнение, исследования на животных показали уменьшение количества трабекул в исследованиях на крысах; формы токсичности в желудочно-кишечном (GI) тракте, костях и зубах в моделях на крысах и собаках; а также вторичные эффекты, которые влияют на костный мозг у крыс и почки у собак.

Было установлено, что лечение пациентов с помощью ингибитора Wnt (i) в отдельности приводило к изменениям иммунных сигнатур в опухолях, и что 8-15 дней лечения ингибитором Wnt (i) в качестве монотерапии были достаточными для того, чтобы привести к этим изменениям. Эти результаты дали возможность сделать выводы о том, что прерывистое дозирование ингибитора Wnt (i) с молекулой антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемой солью может повышать чувствительность дендритных клеток и Т-клеток и, таким образом, быть достаточным для усиления эффектов ингибирования PD-1 и смягчения в то же время некоторых форм токсичности, обусловленных длительным введением Wnt, в частности в отношении кости.

Сигнальный путь Wnt необходим для развития и выживания остеобластов (участвующих в формировании костной ткани) и отрицательно регулирует остеокласты (участвующие в резорбции костной ткани). С этим связано обнаружение того, что ингибиторы Wnt вызывают резорбцию костной ткани и истончение костной ткани. В клиническом исследовании ингибитора Wnt у некоторых пациентов наблюдались переломы костей, что может быть связано с эффектами ингибирования сигнального пути Wnt в отношении остеобластов и остеокластов. Таким образом, введение ингибитора Wnt (i), например, 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли, в течение более короткого периода, как, например, ежедневно только в дни 1-15 на протяжении до 4 циклов терапии, может снизить риск клинических значимых изменений кости, вызываемых ингибитором Wnt. В дополнение, краткосрочное прерывистое дозирование ингибитора Wnt было достаточным для того, чтобы привести к повышению экспрессии сигнатур активированных дендритных клеток. Это является значимым, поскольку данный подтип дендритных клеток является важным для привлечения и активации Т-клеток для противоопухолевого ответа. Ингибирование передачи сигнала, опосредованной Wnt, при лечении рака улучшает частоту ответа на ингибирование PD-1 посредством прекращения ингибирования активации дендритных клеток и Т-клеток. В целом комбинация ингибитора Wnt (i) и молекулы антитела к PD-1, где ингибитор Wnt вводится только в начале цикла лечения на протяжении, например, 8 или 15 дней, может демонстрировать взаимосогласованный эффект обоих соединений и обеспечивать лучшую эффективность и значительно облегченный профиль безопасности в сравнении с, например, применением ингибитора Wnt (i) в отдельности.

Согласно настоящему изобретению ингибитор Wnt является соединением, которое целенаправленно воздействует на передачу сигнала, опосредованную Wnt, в клетке, уменьшает или ингибирует ее активность. Например, ингибитор Wnt также может представлять собой ингибитор Porcupine. Ингибитор Wnt (i) представляет собой соединение, описанное в WO2010/101849. Ингибитор Wnt, подлежащий применению в комбинации с молекулой антитела к PD-1 или ее фармацевтической солью, представляет собой 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль формулы (I):

раскрытые в WO2010/101849 (соединение 86, пример 10).

Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая комбинация, содержащая (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль и (ii) молекулу антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемую соль, для применения при лечении рака, где соединение формулы (i), а именно 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемая соль, вводится ежедневно в дни 1-15 каждого цикла на протяжении до 4 циклов, а молекула антитела к PD-1 (ii), описанная в данном документе, вводится по меньшей мере один раз в цикл. Ингибитор Wnt можно вводить на протяжении 4 циклов.

В настоящем изобретении термин "фармацевтическая комбинация" относится к нефиксированной комбинации. Термин "нефиксированная комбинация" означает, что оба активных ингредиента, например, соединение формулы (i), а именно 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемая соль, и молекула антитела к PD-1 или ее форма фармацевтически приемлемой соли, вводятся пациенту в виде отдельных объектов одновременно либо последовательно без конкретных ограничений по времени, где такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме пациента.

Термины "комбинация" или "в комбинации с" не предназначены для обозначения того, что виды терапии или терапевтические средства должны вводиться в одно и то же время и/или быть составлены для совместной доставки, хотя эти способы доставки находятся в пределах объема, описанного в данном документе. Терапевтические средства в комбинации можно вводить одновременно с одним или несколькими дополнительными видами терапии или терапевтическими средствами, до них или после них. Терапевтические средства или протокол терапии можно применять в любом порядке. Как правило, каждое средство будет вводиться в дозе и/или по временному графику, которые определены для данного средства. Также следует понимать, что дополнительное терапевтическое средство, применяемое в данной комбинации, может вводиться совместно или в отдельности в другой композиции. В целом, ожидается, что дополнительные терапевтические средства, применяемые в комбинации, будут применяться при уровнях, которые не превышают уровни, при которых они применяются по отдельности. В некоторых вариантах осуществления уровни, используемые в комбинации, будут ниже уровней при использовании по отдельности.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемые соли, которые можно применять в комбинации с ингибиторами Wnt согласно настоящему изобретению, могут представлять собой любое антитело к PD-1, раскрытое в данном документе. Например, молекула антитела к PD-1 может содержать по меньшей мере одну антигенсвязывающую область, например, вариабельную область или ее антигенсвязывающий фрагмент, из антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона В или BAP049 клона Е; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей. Молекула антитела к PD-1 предпочтительно выбрана из ниволумаба (Opdivo), пембролизумаба (Keytruda), пидилизумаба, PDR-001 или их фармацевтической соли. Молекула антитела к PD-1 наиболее предпочтительно представляет собой PDR-001 или его фармацевтическую соль. Молекула антитела к PD-1, обозначенная как PDR-001, была описана в PCT/CN2016/099494. Более конкретно, ингибитор PDR-001 или его фармацевтически приемлемая соль содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность HCDR1, HCDR2 и HCDR3 BAP049 клона Е, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность LCDR1, LCDR2 и LCDR3 BAP049 клона Е, описанные в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну, две, три или четыре вариабельные области из антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну или две вариабельные области тяжелой цепи из антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну или две вариабельные области легкой цепи из антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, константную область тяжелой цепи IgG4, например, IgG4 человека. IgG4 человека содержит замену в положении 228 согласно нумерации EU (например, замену Ser на Pro). Молекула антитела к PD-1 содержит константную область тяжелой цепи IgG1, например, IgG1 человека. IgG1 человека содержит замену в положении 297 согласно нумерации EU (например, замену Asn на Ala). IgG1 человека также может содержать замену в положении 265 согласно нумерации EU, замену в положении 329 согласно нумерации EU или их обе (например, замену Asp на Ala в положении 265 и/или замену Pro на Ala в положении 329). IgG1 человека также содержит замену в положении 234 согласно нумерации EU, замену в положении 235 согласно нумерации EU или их обе (например, замену Leu на Ala в положении 234 и/или замену Leu на Ala в положении 235). Константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, приведенную в таблице 3, или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) ей.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, константную область легкой каппа-цепи, например, константную область легкой каппа-цепи человека. Константная область легкой каппа-цепи содержит аминокислотную последовательность, приведенную в таблице 3, или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) ей.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению также содержит, например, константную область тяжелой цепи IgG4, например, IgG4 человека, и константную область легкой каппа-цепи, например, константную область легкой каппа-цепи человека, например, константную область тяжелой и легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в таблице 3, или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) ей. IgG4 человека содержит замену в положении 228 согласно нумерации EU (например, замену Ser на Pro). Молекула антитела к PD-1 содержит константную область тяжелой цепи IgG1, например, IgG1 человека, и константную область легкой каппа-цепи, например, константную область легкой каппа-цепи человека, например, константную область тяжелой и легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в таблице 3, или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) ей. IgG1 человека также может содержать замену в положении 297 согласно нумерации EU (например, замену Asn на Ala). IgG1 человека содержит замену в положении 265 согласно нумерации EU, замену в положении 329 согласно нумерации EU или их обе (например, замену Asp на Ala в положении 265 и/или замену Pro на Ala в положении 329). IgG1 человека содержит замену в положении 234 согласно нумерации EU, замену в положении 235 согласно нумерации EU или их обе (например, замену Leu на Ala в положении 234 и/или замену Leu на Ala в положении 235).

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению также содержит, например, вариабельный домен и константную область тяжелой цепи, вариабельный домен и константную область легкой цепи или как то, так и другое, которые содержат аминокислотную последовательность BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанную в таблице 1, или кодируемую нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей. Молекула антитела к PD-1 необязательно содержит лидерную последовательность тяжелой цепи, легкой цепи или их обеих, как показано в таблице 4; или последовательность, в значительной степени идентичную ей.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну, две или три области, определяющие комплементарность (CDR), из вариабельной области тяжелой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну, две или три CDR (или в совокупности все CDR) из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1, или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1. Одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) имеют одно, два, три, четыре, пять, шесть или больше изменений, например, аминокислотных замен или делеций, по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в таблице 1 или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль содержит, например, по меньшей мере, одну, две или три CDR (или в совокупности все CDR) из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1, или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1. Одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) имеют одно, два, три, четыре, пять, шесть или больше изменений, например, аминокислотных замен или делеций, по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в таблице 1 или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль содержит, например, по меньшей мере одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль содержит, например, по меньшей мере, одну, две или три CDR (или в совокупности все CDR) из вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1, или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1. Одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) имеют одно, два, три, четыре, пять, шесть или больше изменений, например, аминокислотных замен или делеций, по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в таблице 1 или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль содержит замену в CDR легкой цепи, например, одну или несколько замен в CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи. Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль содержит замену в CDR3 легкой цепи в положении 102 вариабельной области легкой цепи, например, замену цистеина на тирозин или цистеина на сериновый остаток в положении 102 в вариабельной области легкой цепи согласно таблице 1 (например, SEQ ID NO: 54 или 70 в случае с модифицированной последовательностью).

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR (или в совокупности все CDR) из вариабельной области тяжелой и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1, или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1. В одном варианте осуществления одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) имеют одно, два, три, четыре, пять, шесть или больше изменений, например, аминокислотных замен или делеций, по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в таблице 1 или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, все шесть CDR из антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1, или близкородственные CDR, например, CDR, которые являются идентичными или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен). Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль также может содержать любую описанную в данном документе CDR. Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль содержит замену в CDR легкой цепи, например, одну или несколько замен в CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи. Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит замену в CDR3 легкой цепи в положении 102 вариабельной области легкой цепи, например, замену цистеина на тирозин или цистеина на сериновый остаток в положении 102 в вариабельной области легкой цепи согласно таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну, две или три CDR согласно Kabat et al. (например, по меньшей мере одну, две или три CDR согласно определению Kabat, указанные в таблице 1) из вариабельной области тяжелой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей; или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен) по сравнению с одной, двумя или тремя CDR согласно Kabat et al., показанными в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну, две или три CDR согласно Kabat et al. (например, по меньшей мере одну, две или три CDR согласно определению Kabat, указанные в таблице 1) из вариабельной области легкой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей; или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен) по сравнению с одной, двумя или тремя CDR согласно Kabat et al., показанными в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR согласно Kabat et al. (например, по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR согласно определению Kabat, указанных в таблице 1) из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей; или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен) по сравнению с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью CDR согласно Kabat et al., показанными в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит все шесть CDR согласно Kabat et al. (например, все шесть CDR согласно определению Kabat, указанных в таблице 1) из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей; или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен) по сравнению со всеми шестью CDR согласно Kabat et al., показанными в таблице 1. Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению может содержать любую CDR, описанную в данном документе.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну, две или три гипервариабельные петли согласно Chothia (например, по меньшей мере одну, две или три гипервариабельные петли согласно определению Chothia, указанные в таблице 1) из вариабельной области тяжелой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или по меньшей мере аминокислоты из тех гипервариабельных петель, которые контактируют с PD-1; или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен) по сравнению с одной, двумя или тремя гипервариабельными петлями согласно Chothia et al., показанными в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну, две или три гипервариабельные петли согласно Chothia (например, по меньшей мере одну, две или три гипервариабельные петли согласно определению Chothia, указанные в таблице 1) из вариабельной области легкой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или по меньшей мере аминокислоты из тех гипервариабельных петель, которые контактируют с PD-1; или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен) по сравнению с одной, двумя или тремя гипервариабельными петлями согласно Chothia et al., показанными в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть гипервариабельных петель (например, по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть гипервариабельных петель согласно определению Chothia, указанных в таблице 1) из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или описанные в таблице 1, или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или по меньшей мере аминокислоты из тех гипервариабельных петель, которые контактируют с PD-1; или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен) по сравнению с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью гипервариабельными петлями согласно Chothia et al., показанными в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, все шесть гипервариабельных петель согласно Chothia (например, все шесть гипервариабельных петель согласно определению Chothia, указанных в таблице 1) из антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E; или близкородственные гипервариабельные петли, например, гипервариабельные петли, которые являются идентичными или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен); или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен) по сравнению со всеми шестью гипервариабельными петлями согласно Chothia et al., показанными в таблице 1. Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению может содержать любую гипервариабельную петлю, описанную в данном документе.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну, две или три гипервариабельные петли, которые имеют такие же канонические структуры, как и соответствующая гипервариабельная петля антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E, например, такие же канонические структуры, как и по меньшей мере петля 1 и/или петля 2 вариабельных доменов тяжелой и/или легкой цепи антитела, описанного в данном документе. (См., например, Chothia et al. J. Mol. Biol. 1992, 227, 799; Tomlinson et al. J. Mol. Biol. 1992, 227:776-798 в отношении описаний канонических структур гипервариабельных петель). Эти структуры можно определить путем рассмотрения таблиц, описанных в данных литературных источниках.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению также может содержать, например, комбинацию CDR или гипервариабельных петель, определенных в соответствии с Kabat et al. и Chothia et al., описанных в данном документе в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит, например, по меньшей мере одну, две или три CDR или гипервариабельные петли из вариабельной области тяжелой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E, согласно определению Kabat и Chothia (например, по меньшей мере одну, две или три CDR или гипервариабельные петли согласно определению Kabat и Chothia, указанные в таблице 1); или кодируемые нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, в значительной степени идентичную (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичную) любой из вышеупомянутых последовательностей; или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен) по сравнению с одной, двумя или тремя CDR или гипервариабельными петлями согласно Kabat и/или Chothia, показанными в таблице 1.

Например, молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению может содержать CDR1 VH согласно Kabat et al. или гипервариабельную петлю 1 VH согласно Chothia et al. или их комбинацию, например, как показано в таблице 1. CDR1 VH согласно комбинации определений CDR по Kabat и Chothia содержит аминокислотную последовательность GYTFTTYWMH (SEQ ID NO: 224) или аминокислотную последовательность, в значительной степени идентичную ей (например, имеющую по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен). Молекула антитела к PD-1 может дополнительно содержать, например, CDR 2-3 VH согласно Kabat et al. и CDR 1-3 VL согласно Kabat et al., например, как показано в таблице 1. Соответственно, каркасные области (FW) определяются на основании комбинации CDR, определяемых согласно Kabat et al., и гипервариабельных петель, определяемых согласно Chothia et al. Например, молекула антитела к PD-1 может содержать FW1 VH, определенную на основании гипервариабельной петли 1 VH согласно Chothia et al., и FW2 VH, определенную на основании CDR 1-2 VH согласно Kabat et al., например, как показано в таблице 1. Молекула антитела к PD-1 может дополнительно содержать, например, FW 3-4 VH, определенные на основании CDR 2-3 VH согласно Kabat et al., и FW 1-4 VL, определенные на основании CDR 1-3 VL согласно Kabat et al.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи антитела, описанного в данном документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049 клона B или BAP049 клона E, согласно определениям Kabat и Chothia (например, по меньшей мере одну, две или три CDR согласно определениям Kabat и Chothia, указанные в таблице 1).

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 4, аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 5 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 3; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 13, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 14 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 33;

(b) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1, выбранную из SEQ ID NO: 1; аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 2 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 3; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 32;

(c) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 224, аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 5 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 3; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 13, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 14 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 33; или

(d) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 224, аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 2 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 3; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 32.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 224; аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 5 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 3; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 13, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 14 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению может содержать, например, вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 70.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению может содержать, например, тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 91, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 72.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 из BAP049 клона B или BAP049 клона E, описанные в таблице 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 из BAP049 клона B или BAP049 клона E, описанные в таблице 1.

Молекула антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемая соль согласно настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 из BAP049 клона E, описанные в таблице 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 из BAP049 клона E, описанные в таблице 1.

Следует понимать, что молекула антитела к PD-1, или молекула, представляющая собой антитело к PD-1, согласно настоящему изобретению может иметь дополнительные консервативные или несущественные аминокислотные замены, которые не производят значительный эффект в отношении их функций.

Термин "молекула антитела" относится к белку, например, цепи иммуноглобулина или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере одну последовательность вариабельного домена иммуноглобулина. Термин "молекула антитела" предусматривает, например, моноклональное антитело (в том числе полноразмерное антитело, имеющее Fc-область иммуноглобулина). Молекула антитела содержит полноразмерное антитело или полноразмерную цепь иммуноглобулина или антигенсвязывающий или функциональный фрагмент полноразмерного антитела или полноразмерной цепи иммуноглобулина. Молекула антитела также может являться молекулой полиспецифического антитела, например, она содержит множество последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулина, где первая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества обладает специфичностью связывания с первым эпитопом, а вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества обладает специфичностью связывания со вторым эпитопом.

Термин "фармацевтически приемлемые соли" может означать соли, образованные, например, в виде солей присоединения кислоты, предпочтительно с органическими или неорганическими кислотами. Подходящими неорганическими кислотами являются, например, галогенсодержащие кислоты, такие как хлористоводородная кислота. Подходящими органическими кислотами являются, например, карбоновые кислоты или сульфоновые кислоты, такие как фумаровая кислота или метансульфоновая кислота. Для целей выделения или очистки также можно использовать фармацевтически неприемлемые соли, например, пикраты или перхлораты. Для терапевтического применения используются только фармацевтически приемлемые соли или свободные соединения (при необходимости в форме фармацевтических препаратов), и они, таким образом, являются предпочтительными. Любая ссылка на свободное соединение в данном документе должна пониматься как ссылка также на соответствующую соль, если это необходимо и целесообразно. Соли ингибиторов, описанных в данном документе, предпочтительно представляют собой фармацевтически приемлемые соли; подходящие фармацевтически приемлемые соли, образующие противоионы, известны в данной области.

Термин "фармацевтически приемлемый" относится к тем соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые подходят для применения в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений в соответствии с разумным соотношением польза/риск.

Термин "ингибирование" или "ингибитор" предусматривает снижение определенного параметра, например, активности, указанной молекулы, например, ингибитора контрольной точки иммунного ответа, такого как молекула антитела к PD-1. Например, данный термин предусматривает ингибирование активности, например, активности PD-1 или PD-L1, на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или больше. Таким образом, ингибирование не обязательно должно составлять 100%.

Термин "рак" относится к заболеванию, характеризующемуся быстрым и неконтролируемым ростом аберрантной пролиферации клеток. Раковые клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части организма. Примерами различных форм рака являются, без ограничения, лейкоз, рак предстательной железы, рак почки, рак печени, рак головного мозга, лимфома, рак яичника, рак легкого, рак шейки матки, рак кожи, рак молочной железы, плоскоклеточная карцинома головы и шеи (HNSCC), рак поджелудочной железы, рак желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, трижды негативный рак молочной железы (TNBC), плоскоклеточный рак легкого, плоскоклеточный рак пищевода, плоскоклеточный рак шейки матки или меланома. Согласно настоящему изобретению особенно поддающимися лечению болезненными состояниями, подлежащими лечению с помощью вышеупомянутой комбинации, являются трижды негативный рак молочной железы (TNBC), рак поджелудочной железы, плоскоклеточный рак легкого, плоскоклеточный рак пищевода, плоскоклеточный рак шейки матки или меланома.

Термины "опухоль" и "рак" используются в данном документе взаимозаменяемо, например, оба термина охватывают солидные опухоли и опухоли жидких тканей, например, диффузные или циркулирующие опухоли. В одном варианте осуществления термин "рак" или "опухоль" предусматривает злокачественные формы рака и опухоли, а также запущенные формы рака и опухоли.

Термин "лечение" включает, например, терапевтическое введение комбинации ингибитора Wnt или его фармацевтически приемлемой соли и молекулы антитела к PD-1 или ее фармацевтически приемлемой соли, описанной в данном документе, теплокровному животному, в частности человеку, нуждающемуся в таком лечении, с целью излечения заболевания или произведения эффекта в отношении регрессии заболевания или в отношении задержки прогрессирования заболевания. Термины "лечить", "осуществление лечения" или "лечение" в отношении любого заболевания или нарушения относятся к уменьшению интенсивности проявлений заболевания или нарушения (например, замедлению, или остановке, или ослаблению развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов), к предупреждению или задержке начала проявления, или развития, или прогрессирования заболевания или нарушения.

Ингибитор Wnt (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить ежедневно в дни 1-15 каждого цикла или в дни 1-8 каждого цикла. Ингибитор Wnt (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид можно вводить на протяжении до 4 циклов. Ингибитор Wnt (i) можно вводить на протяжении 4 циклов. Его также можно вводить только в первом цикле. Ингибитор Wnt (i) предпочтительно вводят в течение дней 1-15 каждого цикла на протяжении до 4 циклов. Ингибитор Wnt (i) наиболее предпочтительно вводят ежедневно в дни 1-8 каждого цикла на протяжении до 4 циклов. В настоящем изобретении также предусмотрено введение (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли только в течение первого цикла. В настоящем изобретении также предусмотрено введение (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли только в течение четырех циклов. Ингибитор Wnt, раскрытый в данном документе, можно вводить один раз в день или два раза в день с 12-часовым промежутком между двумя последовательными дозами. Партнера по комбинации, (ii) молекулу антитела к PD-1, можно продолжать вводить на протяжении дополнительных циклов до тех пор, пока это имеет клиническое значение. В одном варианте осуществления (ii) молекулу антитела к PD-1 вводят на протяжении до 4 циклов или на протяжении 4 циклов.

Партнеров по комбинации, раскрытых в данном документе, вводят в один и тот же день или в разные дни цикла. Термин "цикл" относится к конкретному периоду времени, выраженному в днях или месяцах, который повторяется на регулярной основе. Цикл, как раскрывается в данном документе, более предпочтительно выражают в днях. Например, цикл может составлять без ограничения 28 дней, 30 дней, 60 дней, 90 дней. "Цикл", упоминаемый в настоящем изобретении, наиболее предпочтительно имеет продолжительность 28 дней. Такой цикл может повторяться несколько раз (например, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз и т. д.), причем каждый цикл имеет одну и ту же продолжительность и может повторяться до тех пор, пока это имеет клиническое значение, т. е. темпы роста опухоли по меньшей мере снижаются или контролируются или опухоль уменьшается, а нежелательные явления являются переносимыми. При том, что один из партнеров по комбинации, например, ингибитор Wnt, вводится на протяжении до 4 циклов, другого партнера по комбинации можно продолжать вводить на протяжении дополнительных циклов. Лечение путем введения (i) согласно настоящему изобретению наиболее предпочтительно повторяют на протяжении до 4 циклов, в частности 4 циклов. Несмотря на то, что ингибитор Wnt можно вводить на протяжении до 4 циклов, в данном документе предполагается, что по прошествии определенного периода времени, например, когда соединение было полностью выведено из организма, и ингибитор Wnt, который вводили на протяжении до 4 циклов, перестает давать какие-либо положительные эффекты в отдельности либо посредством усиления эффектов, вызываемых молекулой антитела к PD-1, ингибитор Wnt можно снова вводить в рамках другой серии на протяжении до 4 циклов. Период между первой серией продолжительностью до 4 циклов (включающей только 1 цикл или только 4 цикла) и второй или последующей серией продолжительностью до 4 циклов должен быть достаточно длинным для предупреждения какого-либо накопления эффектов, вызванных ингибированием сигнального пути Wnt, таких как снижение плотности костей.

Ингибитор Wnt (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить перорально или внутривенно, наиболее предпочтительно перорально, в ежедневной дозе 2,5 мг/день, 5 мг/день, 7,5 мг/день, 10 мг/день, 20 мг/день, 40 мг/день, 80 мг/день, 120 мг/день или 180 мг/день. Ежедневная доза предпочтительно составляет 2,5 мг/день, 5 мг/день или 10 мг/день. Ежедневная доза наиболее предпочтительно составляет 10 мг/день.

Согласно настоящему изобретению (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить перорально, например, в фармацевтической композиции вместе с инертным разбавителем или носителем.

Согласно настоящему изобретению молекулу антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемую соль, выбранную из ниволумаба (Opdivo), пембролизумаба (Keytruda), пидилизумаба, PDR-001 или их фармацевтически приемлемых солей, можно применять при лечении рака и вводить каждые две недели или каждые четыре недели в цикле. При лечении рака наиболее предпочтительно применяют молекулу антитела к PD-1 PDR-001 (ii) или ее фармацевтически приемлемую соль, описанную в данном документе. PDR-001 (ii) наиболее предпочтительно вводят каждые четыре недели. PDR-001 вводят путем инъекции (например, подкожной или внутривенной) в дозе 300-400 мг/день. Молекулу антитела к PD-1 PDR-001 или ее фармацевтически приемлемую соль предпочтительно вводят внутривенно в разовой дозе 300-400 мг/день. Молекулу антитела к PD-1 PDR-001 (ii) или ее фармацевтически приемлемую соль наиболее предпочтительно вводят в разовой дозе 400 мг/день. Молекулу антитела к PD-1 PDR-001 или ее фармацевтически приемлемую соль наиболее предпочтительно вводят в дозе 400 мг/день каждые четыре недели. Дозу можно вводить в виде однократной болюсной дозы или в виде нескольких дробных доз.

В частности, режим дозирования может варьироваться от 2,5 мг/день, 5 мг/день или 10 мг/день ингибитора Wnt формулы (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли (в дни 1-15 или в дни 1-8 только первого цикла, или только 4 циклов, или каждого цикла на протяжении до 4 циклов) и от 300 мг/день до 400 мг/день молекулы антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемой соли каждые две или четыре недели. Например, согласно настоящему изобретению 2,5 мг/день (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли вводят в дни 1-8 или в дни 1-15, и молекулу антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемую соль вводят один раз в 4 недели на протяжении 4 циклов или на протяжении до 4 циклов в дозе 400 мг/день. Другой пример согласно настоящему изобретению заключается в введении 5 мг/день (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли в дни 1-8 или в дни 1-15 и введении молекулы антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемой соли один раз в 4 недели на протяжении 4 циклов или на протяжении до 4 циклов в дозе 400 мг/день. Еще один пример согласно настоящему изобретению предусматривает введение 10 мг/день (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли в дни 1-8 или в дни 1-15, а молекулу антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемую соль вводят один раз в 4 недели на протяжении 4 циклов или на протяжении до 4 циклов в дозе 400 мг/день.

Другой пример согласно настоящему изобретению предусматривает введение 2,5 мг/день (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли только в течение цикла 1 и введение молекулы антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемой соли каждые 4 недели в дозе 400 мг/день. Другой пример согласно настоящему изобретению предусматривает введение 5 мг/день (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли только в течение цикла 1 и введение молекулы антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемой соли каждые 4 недели в дозе 400 мг/день. Еще один пример согласно настоящему изобретению предусматривает введение 10 мг/день (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли только в течение цикла 1 и введение молекулы антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемой соли каждые 4 недели в дозе 400 мг/день.

Молекулы антител можно вводить различными способами, известными из уровня техники, хотя для многих путей терапевтического применения предпочтительным путем/способом введения является внутривенная инъекция или инфузия. Например, молекулы антител можно вводить путем внутривенной инфузии со скоростью более 20 мг/мин, например, 20-40 мг/мин, и, как правило, превышающей или равной 40 мг/мин, чтобы достичь дозы приблизительно 300-400 мг/день. Для внутривенной инъекции или инфузии терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации антитела. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем введения активного соединения (т. е. антитела или части антитела) в необходимом количестве в подходящий растворитель с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов в соответствии с необходимостью с последующей стерилизующей фильтрацией. Обычно дисперсии получают путем введения активного соединения в стерильное инертное вещество, которое содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофилизация, которые дают в результате порошок из активного ингредиента и любого дополнительного желаемого ингредиента из их раствора, ранее стерилизованного фильтрацией. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, путем применения покрывающего средства, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может обеспечиваться включением в композицию средства, которое замедляет всасывание, например, моностеаратных солей и желатина.

Будет понятно, что путь и/или способ введения будут варьироваться в зависимости от желаемых результатов. Например, активное соединение может быть получено с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, как, например, в составе с контролируемым высвобождением, в том числе имплантатах, трансдермальных пластырях и микроинкапсулированных системах доставки. Можно применять биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких составов запатентованы или общеизвестны специалистам в данной области (например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).

Точно так же (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с молекулой антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемой солью можно применять для изготовления лекарственного препарата для лечения рака.

Аналогичным образом, в настоящем изобретении также предусмотрен способ лечения рака, включающий введение эффективного количества партнеров по комбинации (например, (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли и молекулы антитела к PD-1 (ii) или ее фармацевтически приемлемой соли) пациенту, нуждающемуся в этом.

Термин "пациент" или "субъект" относится к теплокровному животному. В наиболее предпочтительном варианте осуществления субъектом или пациентом является человек. Это может быть человек, которому поставили диагноз и который нуждается в лечении заболевания или нарушения, раскрытого в данном документе.

При применении для изготовления лекарственного препарата для лечения рака или в способе лечения рака у пациента, нуждающегося в этом, (i) и (ii) можно применять в дозах и при режимах дозирования, объясняемых выше.

Комбинация наиболее предпочтительно содержит ингибитор Wnt (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль и молекулу антитела к PD-1 PDR-001 (ii) или ее фармацевтически приемлемую соль. Обоих партнеров по комбинации (i) и (ii) можно вводить согласно режиму дозирования, описанному в данном документе. Например, (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить ежедневно в дни 1-15 или в дни 1-8 каждого цикла на протяжении до 4 циклов, например, на протяжении 4 циклов или только в течение первого цикла. PDR-001 (ii) или его фармацевтически приемлемую соль вводят по меньшей мере один раз в цикл. Например, (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемую соль вводят в этой конкретной комбинации в дозе 2,5 мг/день, 5 мг/день, 7,5 мг/день, 10 мг/день, 20 мг/день, 40 мг/день, 80 мг/день, 120 мг/день, 180 мг/день. Доза предпочтительно составляет 2,5 мг/день, 5 мг/день или 10 мг/день. Доза наиболее предпочтительно составляет 10 мг/день. Ингибитор PDR-001 (ii) или его фармацевтически приемлемую соль вводят в разовой дозе 300-400 мг/день, наиболее предпочтительно в дозе 400 мг/день.

Партнеры по комбинации (i) и (ii), описанные в данном документе, могут быть синергически активными, вызывая при этом меньше побочных эффектов, вызываемых ингибированием сигнального пути Wnt, таких как пониженная плотность костей.

Термин "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" партнеров по комбинации согласно настоящему изобретению относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество партнеров по комбинации может варьироваться в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и вес индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически благоприятные эффекты превосходят любые токсические или неблагоприятные эффекты комбинации, описанные в данном документе. "Терапевтически эффективная доза" предпочтительно ингибирует поддающийся измерению параметр, например, скорость роста опухоли, на по меньшей мере приблизительно 20%, более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 40%, еще более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 60% и еще более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 80% по сравнению с субъектами, не получающими лечение.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

NanoString измеряет экспрессию генов в выбранной панели размером до приблизительно 1000 генов. Это выполняется с использованием зондов с уникальным штрих-кодом, которые гибридизируются непосредственно с РНК-мишенями (рибонуклеиновыми кислотами). Затем гибриды РНК-зонд прогоняют в геле для линеаризации штрих-кодов. Эти штрих-коды затем подсчитывают и затем нормализуют с использованием системы конвейерной обработки данных собственной разработки.

Биопсии опухолей проводили при скрининге и между днями 8 и 28 в ходе лечения ингибитором Wnt формулы (I) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамидом. Опухоли фиксировали в формалине и заливали в парафин (FFPE) или непосредственно помещали в RNAlater. Эти образцы переносили в Genoptix, где РНК выделяли для анализов фармакодинамического маркера (PD) AXIN2 с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени. Оставшуюся РНК переносили в аналитическую исследовательскую лабораторию (ARL), где определяли профиль экспрессии генов с использованием общей панели иммунологического профилирования раковых опухолей NanoString (2016), а также специально разработанной панели генов, связанных с иммунным ответом. Экспрессию генов нормализовали с использованием способов, рекомендованных NanoString, за исключением того, что образцы нормализовали в пределах определенных показаний (например, образцы меланомы или раковой опухоли поджелудочной железы нормализовали отдельно), а гены "домашнего хозяйства" отбирали с использованием количественного показателя стабильности geNorm [PMID: 12184808]. Некоторые гены дублировались в обеих панелях, которые авторы настоящего изобретения использовали для оценки изменчивости и других параметров контроля качества. Количественные показатели QC, вводимые с помощью процедуры нормализации NanoString, и ручной осмотр окрашенных гематоксилином и эозином (H & E) образцов, полученных путем толстоигольной биопсии смежных тканей, сужали когорту до 11 пар образцов. Дополнительно удаляли два образца, поскольку было обнаружено, что они были выпадающими в анализах методом главных компонент, оставляя 9 пар образцов для анализируемой когорты. Счетные данные, описанные в данном документе, нормализовали в соответствии со способами, рекомендованными NanoString, с одним исключением, а именно, что образцы нормализовали в пределах определенных показаний, описанных в данном документе, и примерно 40 генов "домашнего хозяйства" (определенных на веб-сайте NanoString для их коммерчески доступной панели иммунопрофилирования раковых опухолей, 2016) использовали для нормализации биологических данных между образцами.

Ранее генные сигнатуры использовались для изучения данных в отношении фенотипических изменений в иммунном микроокружении опухоли. Ранее было показано, что у полученных методами генной инженерии мышей с активированной передачей сигнала, опосредованной WNT, дендритные клетки и Т-клетки в микроокружении опухоли ингибируются; однако не было показано, что этот эффект является обратимым. Поэтому целью авторов настоящего изобретения было использование анализов экспрессии генов в образцах от пациентов, получавших лечение с помощью ингибитора Wnt, для определения степени, в которой ингибирующие эффекты передачи сигнала, опосредованной WNT, в опухоли в отношении проксимальных иммунных клеток можно устранить путем фармакологического ингибирования сигнального пути WNT.

Чтобы понять, производит ли соединение формулы (I) эффекты в отношении иммунного микроокружения опухоли, авторы настоящего изобретения рассматривали зависимость между экспрессией генов, связанных с иммунным ответом, и PD-маркером AXIN2. Используя этот маркер, авторы настоящего изобретения могут понять степень ингибирования сигнального пути WNT в указанной опухоли. Вместо того, чтобы сосредоточить внимание на отдельных генах, авторы настоящего изобретения использовали среднегеометрическую величину экспрессии наборов генов (генных сигнатур), которые описывают определенный сигнальный путь или клеточную функцию. Одной генной сигнатурой является сигнатура хемокинов, ассоциированная с привлечением CD8+ Т-клеток [PMID: 19293190], а другая сигнатура ассоциирована с активированными CD103+ дендритными клетками [PMID: 25970248]. Не у каждого субъекта наблюдалось сильное ингибирование сигнального пути WNT, о чем свидетельствуют кратные изменения, наблюдаемые в отношении экспрессии AXIN2. Примечательно, что между ингибированием AXIN2 и повышенной экспрессией сигнатуры хемокинов, а также сигнатуры дендритных клеток, по-видимому, существует достаточно линейная зависимость (см. ниже). Авторы настоящего изобретения наблюдали, что фармакологическое ингибирование сигнального пути WNT приводит к сопутствующей стимуляции популяции окружающих дендритных клеток. Эти дендритные клетки при стимуляции выполняют функцию привлечения Т-клеток к опухоли. Важно отметить, что это наблюдение было сделано спустя 15 дней воздействия ингибитора Wnt, что подтверждает тот факт, что прерывистое дозирование соединения формулы (I) можно использовать в комбинации с введением ингибитора контрольной точки для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа в случае с опухолями, в которых ранее отсутствовал иммунный инфильтрат.

Генные сигнатуры позволили авторам настоящего изобретения наблюдать сильную корреляцию между многими образцами при указанном показании, а также биологическое родство даже при небольшом размере образцов. В образцах пациентов, получавших лечение ингибитором Wnt, экспрессировались сигнатуры Т-клеток, и это наблюдалось среди различных пациентов и условий лечения, таких как различные уровни дозы (фигура 2). На фигуре 2 показана сильная корреляция между экспрессией CD3 при скрининге и уровнями Т-клеток, присутствующими при заключительных визитах, для 9 пар субъектов в этом анализе.

Одной из генных сигнатур, используемых в исследовании авторов настоящего изобретения, была сигнатура Т-клеток, показанная на фигуре 3.

Рассматривали модулирование сигнального пути Wnt с помощью ингибитора Wnt формулы (i) наряду с механизмом влияния такого ингибитора Wnt, а именно (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида, на иммунное микроокружение опухоли (фигура 4). Изменения в экспрессии AXIN2, которые измеряли с использованием тех же самых образцов РНК, использовали в качестве меры того, как ингибитор Wnt (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид влиял на сигнальный путь WNT. Изменения в экспрессии AXIN2 аппроксимировали линейной моделью к изменениям иммунной сигнатуры.

На каждом графике на фигуре 4 изображено следующее: по оси Y показано изменение указанной иммунной сигнатуры после воздействия ингибитора Wnt (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида, а по оси X показано изменение в отношении AXIN2. Оба они представлены в log2-масштабе. Положительное значение указывает на увеличение средней экспрессии генов в данной сигнатуре или AXIN2. Во-первых, наблюдалась слабая зависимость между сигнатурой интерферона I типа и ингибированием AXIN2. Во-вторых, наблюдалась зависимость между интерфероном гамма (или интерфероном II типа) и ингибированием AXIN2. Интерферон гамма обычно экспрессируется CD8+ Т-клетками. Наконец, наблюдалась умеренная обратная зависимость между ингибированием AXIN2 и сигнатурами тучных клеток и регуляторных T-клеток (T-reg). Наблюдалось, что оба этих типа клеток являются иммуносупрессивными в иммунном микроокружении опухоли. Примечательно, что между ингибированием AXIN2 и повышенной экспрессией сигнатуры хемокинов (фигура 6), а также сигнатуры дендритных клеток (фигура 5), по-видимому, существует достаточно линейная зависимость. Это является первым наблюдением того, что фармакологическое ингибирование сигнального пути WNT приводит к сопутствующей стимуляции популяции окружающих дендритных клеток.

Затем некоторые специфические гены, модулирование которых было идентифицировано в CD103+ дендритных клетках в ответ на усиление передачи сигнала, опосредованной WNT (Spranger et al. Nature 2015, 523, 231), использовали для создания специфической отсортированной сигнатуры и ее моделирования в зависимости от ингибирования AXIN2 (фигура 5). На фигуре 5 каждая точка представляет пару образцов от одного пациента. По оси X на график нанесен log2 кратности изменения экспрессии AXIN2 в опухоли от скрининга до периода лечения. По оси Y на график нанесен log2 кратности изменения экспрессии сигнатуры дендритных клеток в опухоли от скрининга до периода лечения. Генами, включенными в сигнатуру дендритных клеток, являются BATF3, ITGAE, IRF8, CCR5, CCL3, CCL4, CXCL1. Линия тренда представляет собой линейную оценку, полученную путем регрессии точек данных с использованием надежной линейной модели. Числа рядом с каждой точкой представляют количество дней между началом лечения и биопсией в период лечения. Согласно Spranger et al (Nature 2015, 523, 231), генами, отвечающими на Wnt, являются BATF3, ITGAE, IRF8, CCR5, CCL3, CCL4, CXCL1. В данной работе, подобно некоторым другим сигнатурам, наблюдалась прямая зависимость между ингибированием AXIN2 и повышенной экспрессией генов, ассоциированных с активацией CD103+ дендритных клеток. Это является значимым, поскольку данный подтип дендритных клеток является важным для "лицензирования" и активации Т-клеток для противоопухолевого ответа.

Эти данные свидетельствуют о том, что ингибитор Wnt (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид или его фармацевтически приемлемая соль влияет на иммунное микроокружение опухоли путем увеличения объема инфильтратов иммунных клеток и ослабления ингибирования CD103+ дендритных клеток. Эти клетки важны для активации и привлечения цитотоксических Т-клеток, которые управляют противоопухолевым иммунным ответом. Это обосновывает добавление молекулы антитела к PD-1 (также называемой ингибитором PD-1), которая ослабляет ингибирование Т-клеток, для обеспечения синергизма с эффектом ингибитора Wnt в отношении дендритных клеток.

Также исследовали другую генную сигнатуру, которая, как обнаружилось, сильно коррелировала с привлечением CD8+ T-клеток в опухоль. Эта генная сигнатура состоит в основном из генов хемокинов и характеризуется некоторым перекрыванием с вышеупомянутой сигнатурой дендритных клеток согласно Spranger et al (Nature 2015, 523, 231). Было показано, что эти хемокины привлекают CD8+ T-клетки дозозависимым образом. Хемокинами, которые коррелируют с привлечением CD8+ Т-клеток, являются CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 и CXCL10. Когда авторы настоящего изобретения измерили в образцах от пациентов среднюю экспрессию генов в этой сигнатуре хемокинов и сравнили их с ингибированием AXIN2, то они снова наблюдали линейную зависимость между степенью ингибирования сигнального пути WNT и экспрессией этой генной сигнатуры (фигура 6). На фигуре 6 каждая точка представляет пару образцов от одного пациента. По оси X на график нанесен log2 кратности изменения экспрессии AXIN2 в опухоли от скрининга до периода лечения. По оси Y на график нанесен log2 кратности изменения экспрессии сигнатуры хемокинов в опухоли от скрининга до периода лечения. Генами, включенными в сигнатуру хемокинов, являются CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 и CXCL10. Линия тренда представляет собой линейную оценку, полученную путем регрессии точек данных с использованием надежной линейной модели. Числа рядом с каждой точкой представляют количество дней между началом лечения и биопсией в период лечения. Как показано на фигуре 6, дендритные клетки при стимуляции выполняют функцию привлечения Т-клеток к опухоли. Важно отметить, что это наблюдение было сделано спустя приблизительно 15 дней воздействия ингибитора WNT (i) 2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамида или его фармацевтически приемлемой соли, что позволяет предположить, что прерывистое дозирование ингибитора WNT (i) можно использовать в комбинации с введением ингибитора контрольной точки для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа в случае с опухолями, в которых ранее отсутствовал иммунный инфильтрат.

Было обнаружено, что обратная корреляция между сигнатурой T-клеток и Wnt/CTNNB1 в Атласе ракового генома (TCGA) была однородной среди форм плоскоклеточного рака, независимо от ткани происхождения раковой клетки (Sanger et al., 2015). Обратная корреляция также была сильной при формах базальноподобного рака молочной железы, который является подтипом, выделенным на основании экспрессии генов, наиболее тесно связанным с TNBC (Bertucci et al., 2008). На фигуре 7 проиллюстрирована корреляция в нескольких различных типах раковых клеток. Сигнатура Wnt1 состоит из шести мишеней CTNNB1: EFNB3, APC2, HNF1A, TCF12 и VEGFA.

Таблица 1.

Аминокислотные и нуклеотидные последовательности молекул гуманизированных антител. Молекулы антител включают в себя BAP049 клона B и BAP049 клона E. Показаны аминокислотные и нуклеотидные последовательности CDR тяжелых и легких цепей, вариабельные области тяжелых и легких цепей, а также тяжелые и легкие цепи.

HC BAP049 клона B
SEQ ID NO: 1 (Kabat)	HCDR1	TYWMH
SEQ ID NO: 2 (Kabat)	HCDR2	NIYPGTGGSNFDEKFKN
SEQ ID NO: 3 (Kabat)	HCDR3	WTTGTGAY
SEQ ID NO: 4 (Chothia)	HCDR1	GYTFTTY
SEQ ID NO: 5 (Chothia)	HCDR2	YPGTGG
SEQ ID NO: 3 (Chothia)	HCDR3	WTTGTGAY
SEQ ID NO: 38	VH	EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYTFTTYWMHWVRQATGQGLEWMGNIYPGTGGSNFDEKFKNRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRWTTGTGAYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 95	ДНК VH	Gaggtgcagctggtgcagtcaggcgccgaagtgaagaagcccggcgagtcactgagaattagctgtaaaggttcaggctacaccttcactacctactggatgcactgggtccgccaggctaccggtcaaggcctcgagtggatgggtaatatctaccccggcaccggcggctctaacttcgacgagaagtttaagaatagagtgactatcaccgccgataagtctactagcaccgcctatatggaactgtctagcctgagatcagaggacaccgccgtctactactgcactaggtggactaccggcacaggcgcctactggggtcaaggcactaccgtgaccgtgtctagc
SEQ ID NO: 91	HC	EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYTFTTYWMHWVRQATGQGLEWMGNIYPGTGGSNFDEKFKNRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRWTTGTGAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO: 96	ДНК HC	gaggtgcagctggtgcagtcaggcgccgaagtgaagaagcccggcgagtcactgagaattagctgtaaaggttcaggctacaccttcactacctactggatgcactgggtccgccaggctaccggtcaaggcctcgagtggatgggtaatatctaccccggcaccggcggctctaacttcgacgagaagtttaagaatagagtgactatcaccgccgataagtctactagcaccgcctatatggaactgtctagcctgagatcagaggacaccgccgtctactactgcactaggtggactaccggcacaggcgcctactggggtcaaggcactaccgtgaccgtgtctagcgctagcactaagggcccgtccgtgttccccctggcaccttgtagccggagcactagcgaatccaccgctgccctcggctgcctggtcaaggattacttcccggagcccgtgaccgtgtcctggaacagcggagccctgacctccggagtgcacaccttccccgctgtgctgcagagctccgggctgtactcgctgtcgtcggtggtcacggtgccttcatctagcctgggtaccaagacctacacttgcaacgtggaccacaagccttccaacactaaggtggacaagcgcgtcgaatcgaagtacggcccaccgtgcccgccttgtcccgcgccggagttcctcggcggtccctcggtctttctgttcccaccgaagcccaaggacactttgatgatttcccgcacccctgaagtgacatgcgtggtcgtggacgtgtcacaggaagatccggaggtgcagttcaattggtacgtggatggcgtcgaggtgcacaacgccaaaaccaagccgagggaggagcagttcaactccacttaccgcgtcgtgtccgtgctgacggtgctgcatcaggactggctgaacgggaaggagtacaagtgcaaagtgtccaacaagggacttcctagctcaatcgaaaagaccatctcgaaagccaagggacagccccgggaaccccaagtgtataccctgccaccgagccaggaagaaatgactaagaaccaagtctcattgacttgccttgtgaagggcttctacccatcggatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagccggaaaacaactacaagaccacccctccggtgctggactcagacggatccttcttcctctactcgcggctgaccgtggataagagcagatggcaggagggaaatgtgttcagctgttctgtgatgcatgaagccctgcacaaccactacactcagaagtccctgtccctctccctggga
LC BAP049 клона B
SEQ ID NO: 10 (Kabat)	LCDR1	KSSQSLLDSGNQKNFLT
SEQ ID NO: 11 (Kabat)	LCDR2	WASTRES
SEQ ID NO: 32 (Kabat)	LCDR3	QNDYSYPYT
SEQ ID NO: 13 (Chothia)	LCDR1	SQSLLDSGNQKNF
SEQ ID NO: 14 (Chothia)	LCDR2	WAS
SEQ ID NO: 33 (Chothia)	LCDR3	DYSYPY
SEQ ID NO: 54	VL	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSGNQKNFLTWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQNDYSYPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 97	ДНК VL	Gagatcgtcctgactcagtcacccgctaccctgagcctgagccctggcgagcgggctacactgagctgtaaatctagtcagtcactgctggatagcggtaatcagaagaacttcctgacctggtatcagcagaagcccggtaaagcccctaagctgctgatctactgggcctctactagagaatcaggcgtgccctctaggtttagcggtagcggtagtggcaccgacttcaccttcactatctctagcctgcagcccgaggatatcgctacctactactgtcagaacgactatagctacccctacaccttcggtcaaggcactaaggtcgagattaag
SEQ ID NO: 56	LC	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSGNQKNFLTWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQNDYSYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 98	ДНК LC	Gagatcgtcctgactcagtcacccgctaccctgagcctgagccctggcgagcgggctacactgagctgtaaatctagtcagtcactgctggatagcggtaatcagaagaacttcctgacctggtatcagcagaagcccggtaaagcccctaagctgctgatctactgggcctctactagagaatcaggcgtgccctctaggtttagcggtagcggtagtggcaccgacttcaccttcactatctctagcctgcagcccgaggatatcgctacctactactgtcagaacgactatagctacccctacaccttcggtcaaggcactaaggtcgagattaagcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagcggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctacccccgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtcaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcataaggtgtacgcctgcgaggtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgc
SEQ ID NO: 92	ДНК HC	GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGTCCCTGCGGATCTCCTGCAAGGGCTCTGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCTACCGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCAACATCTATCCTGGCACCGGCGGCTCCAACTTCGACGAGAAGTTCAAGAACAGAGTGACCATCACCGCCGACAAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGGTGGACAACCGGCACAGGCGCTTATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCCTCTGCTTCTACCAAGGGGCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTGCTCCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCACCCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTTTAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGTAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCAAGCAGCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCCAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGC
LC BAP049 клона E
SEQ ID NO: 10 (Kabat)	LCDR1	KSSQSLLDSGNQKNFLT
SEQ ID NO: 11 (Kabat)	LCDR2	WASTRES
SEQ ID NO: 32 (Kabat)	LCDR3	QNDYSYPYT
SEQ ID NO: 13 (Chothia)	LCDR1	SQSLLDSGNQKNF
SEQ ID NO: 14 (Chothia)	LCDR2	WAS
SEQ ID NO: 33 (Chothia)	LCDR3	DYSYPY
SEQ ID NO: 70	VL	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSGNQKNFLTWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCQNDYSYPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 106	ДНК VL	Gagatcgtcctgactcagtcacccgctaccctgagcctgagccctggcgagcgggctacactgagctgtaaatctagtcagtcactgctggatagcggtaatcagaagaacttcctgacctggtatcagcagaagcccggtcaagcccctagactgctgatctactgggcctctactagagaatcaggcgtgccctctaggtttagcggtagcggtagtggcaccgacttcaccttcactatctctagcctggaagccgaggacgccgctacctactactgtcagaacgactatagctacccctacaccttcggtcaaggcactaaggtcgagattaag
SEQ ID NO: 72	LC	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSGNQKNFLTWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCQNDYSYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 107	ДНК LC	Gagatcgtcctgactcagtcacccgctaccctgagcctgagccctggcgagcgggctacactgagctgtaaatctagtcagtcactgctggatagcggtaatcagaagaacttcctgacctggtatcagcagaagcccggtcaagcccctagactgctgatctactgggcctctactagagaatcaggcgtgccctctaggtttagcggtagcggtagtggcaccgacttcaccttcactatctctagcctggaagccgaggacgccgctacctactactgtcagaacgactatagctacccctacaccttcggtcaaggcactaaggtcgagattaagcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagcggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctacccccgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtcaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcataaggtgtacgcctgcgaggtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgc
HC BAP049 клона B
SEQ ID NO: 133 (Kabat)	HCDR1	ACCTACTGGATGCAC
SEQ ID NO: 134 (Kabat)	HCDR2	AATATCTACCCCGGCACCGGCGGCTCTAACTTCGACGAGAAGTTTAAGAAT
SEQ ID NO: 135 (Kabat)	HCDR3	TGGACTACCGGCACAGGCGCCTAC
SEQ ID NO: 136 (Chothia)	HCDR1	GGCTACACCTTCACTACCTAC
SEQ ID NO: 137 (Chothia)	HCDR2	TACCCCGGCACCGGCGGC
SEQ ID NO: 135 (Chothia)	HCDR3	TGGACTACCGGCACAGGCGCCTAC
LC BAP049 клона B
SEQ ID NO: 138 (Kabat)	LCDR1	AAATCTAGTCAGTCACTGCTGGATAGCGGTAATCAGAAGAACTTCCTGACC
SEQ ID NO: 139 (Kabat)	LCDR2	TGGGCCTCTACTAGAGAATCA
SEQ ID NO: 140 (Kabat)	LCDR3	CAGAACGACTATAGCTACCCCTACACC
SEQ ID NO: 141 (Chothia)	LCDR1	AGTCAGTCACTGCTGGATAGCGGTAATCAGAAGAACTTC
SEQ ID NO: 142 (Chothia)	LCDR2	TGGGCCTCT
SEQ ID NO: 143 (Chothia)	LCDR3	GACTATAGCTACCCCTAC
HC BAP049 клона E
SEQ ID NO: 133 (Kabat)	HCDR1	ACCTACTGGATGCAC
SEQ ID NO: 134 (Kabat)	HCDR2	AATATCTACCCCGGCACCGGCGGCTCTAACTTCGACGAGAAGTTTAAGAAT
SEQ ID NO: 135 (Kabat)	HCDR3	TGGACTACCGGCACAGGCGCCTAC
SEQ ID NO: 136 (Chothia)	HCDR1	GGCTACACCTTCACTACCTAC
SEQ ID NO: 137 (Chothia)	HCDR2	TACCCCGGCACCGGCGGC
SEQ ID NO: 135 (Chothia)	HCDR3	TGGACTACCGGCACAGGCGCCTAC
LC BAP049 клона E
SEQ ID NO: 138 (Kabat)	LCDR1	AAATCTAGTCAGTCACTGCTGGATAGCGGTAATCAGAAGAACTTCCTGACC
SEQ ID NO: 139 (Kabat)	LCDR2	TGGGCCTCTACTAGAGAATCA
SEQ ID NO: 140 (Kabat)	LCDR3	CAGAACGACTATAGCTACCCCTACACC
SEQ ID NO: 141 (Chothia)	LCDR1	AGTCAGTCACTGCTGGATAGCGGTAATCAGAAGAACTTC
SEQ ID NO: 142 (Chothia)	LCDR2	TGGGCCTCT
SEQ ID NO: 143 (Chothia)	LCDR3	GACTATAGCTACCCCTAC

Таблица 2.

Аминокислотные и нуклеотидные последовательности каркасных областей тяжелых и легких цепей гуманизированных mAb BAP049 клона B и BAP049 клона E

	Аминокислотная последовательность	Нуклеотидная последовательность
VHFW1 (тип a)	EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGS (SEQ ID NO: 147)	GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATCTCCTGTAAGGGTTCT (SEQ ID NO: 148) GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGTCCCTGCGGATCTCCTGCAAGGGCTCT (SEQ ID NO: 149) GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCGAGTCACTGAGAATTAGCTGTAAAGGTTCA (SEQ ID NO: 150)
VHFW1 (тип b)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 151)	CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCT (SEQ ID NO: 152)
VHFW2 (тип a)	WVRQATGQGLEWMG (SEQ ID NO: 153)	TGGGTGCGACAGGCCACTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGT (SEQ ID NO: 154) TGGGTGCGACAGGCTACCGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGC (SEQ ID NO: 155) tgggtccgccaggctaccggtcaaggcctcgagtggatgggt (SEQ ID NO: 156)
VHFW2 (тип b)	WIRQSPSRGLEWLG (SEQ ID NO: 157)	TGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGT (SEQ ID NO: 158) TGGATCCGGCAGTCCCCCTCTAGGGGCCTGGAATGGCTGGGC (SEQ ID NO: 159)
VHFW2 (тип c)	WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO: 160)	TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGT (SEQ ID NO: 161)
VHFW3 (тип a)	RVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 162)	AGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACAAGA (SEQ ID NO: 163) AGAGTGACCATCACCGCCGACAAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGG (SEQ ID NO: 164) AGAGTGACTATCACCGCCGATAAGTCTACTAGCACCGCCTATATGGAACTGTCTAGCCTGAGATCAGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCACTAGG (SEQ ID NO: 165)
VHFW3 (тип b)	RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 166)	AGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACAAGA (SEQ ID NO: 167) AGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTACCAGA (SEQ ID NO: 168)
VHFW4	WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 169)	TGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCC (SEQ ID NO: 170) TGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCCTCT (SEQ ID NO: 171) TGGGGTCAAGGCACTACCGTGACCGTGTCTAGC (SEQ ID NO: 172) TGGGGCCAGGGCACAACAGTGACCGTGTCCTCC (SEQ ID NO: 173)
VLFW1 (тип a)	EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITC (SEQ ID NO: 174)	GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAGAAAGTCACCATCACCTGC (SEQ ID NO: 175) GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTTCCAGTCCGTGACCCCCAAAGAAAAAGTGACCATCACATGC (SEQ ID NO: 176)
VLFW1 (тип b)	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 177)	GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC (SEQ ID NO: 178) GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCTACCCTGTCCTGC (SEQ ID NO: 179) Gagatcgtcctgactcagtcacccgctaccctgagcctgagccctggcgagcgggctacactgagctgt (SEQ ID NO: 180)
VLFW1 (тип c)	DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISC (SEQ ID NO: 181)	GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC (SEQ ID NO: 182)
VLFW1 (тип d)	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC (SEQ ID NO: 183)	GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGC (SEQ ID NO: 184)
VLFW1 (тип e)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 185)	GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC (SEQ ID NO: 186)
VLFW2 (тип a)	WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 187)	TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT (SEQ ID NO: 188) TGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCTAC (SEQ ID NO: 189) tggtatcagcagaagcccggtcaagcccctagactgctgatctac (SEQ ID NO: 190)
VLFW2 (тип b)	WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 191)	TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTAT (SEQ ID NO: 192) tggtatcagcagaagcccggtaaagcccctaagctgctgatctac (SEQ ID NO: 193)
VLFW2 (тип c)	WYLQKPGQSPQLLIY (SEQ ID NO: 194)	TGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTAT (SEQ ID NO: 195)
VLFW3 (тип a)	GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYC (SEQ ID NO: 196)	GGGGTCCCCTCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACCTTTACCATCAGTAGCCTGGAAGCTGAAGATGCTGCAACATATTACTGT (SEQ ID NO: 197) GGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCCGGCTCTGGCACCGACTTTACCTTCACCATCTCCAGCCTGGAAGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGC (SEQ ID NO: 198) GGCGTGCCCTCTAGGTTTAGCGGTAGCGGTAGTGGCACCGACTTCACCTTCACTATCTCTAGCCTGGAAGCCGAGGACGCCGCTACCTACTACTGT (SEQ ID NO: 199)
VLFW3 (тип b)	GIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFC (SEQ ID NO: 200)	GGGATCCCACCTCGATTCAGTGGCAGCGGGTATGGAACAGATTTTACCCTCACAATTAATAACATAGAATCTGAGGATGCTGCATATTACTTCTGT (SEQ ID NO: 201)
VLFW3 (тип c)	GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (SEQ ID NO: 202)	GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGT (SEQ ID NO: 203) GGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCCGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGC (SEQ ID NO: 204)
VLFW3 (тип d)	GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 205)	GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGT (SEQ ID NO: 206) ggcgtgccctctaggtttagcggtagcggtagtggcaccgacttcaccttcactatctctagcctgcagcccgaggatatcgctacctactactgt (seq id no: 207)
VLFW4	FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 208)	TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 209) TTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG (SEQ ID NO: 210) ttcggtcaaggcactaaggtcgagattaag (SEQ ID NO: 211)

Таблица 3.

Аминокислотные последовательности константной области тяжелой цепи IgG человека и легкой каппа-цепи человека

HC	Аминокислотная последовательность мутантной константной области IgG4 (S228P) (нумерация EU) ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK (SEQ ID NO: 212)
LC	Аминокислотная последовательность константной области каппа-цепи человека RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO: 213)
HC	Аминокислотная последовательность мутантной константной области IgG4 (S228P), в которой отсутствует C-концевой лизин (K) (нумерация EU) ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG (SEQ ID NO: 214)
HC	IgG1 дикого типа ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 215)
HC	Аминокислотная последовательность мутантной константной области IgG1 (N297A) (нумерация EU) ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYA STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 216)
HC	Аминокислотная последовательность мутантной константной области IgG1 (D265A, P329A) (нумерация EU) ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVAVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LAAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 217)
HC	Аминокислотная последовательность мутантной константной области IgG1 (L234A, L235A) (нумерация EU) ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 218)

Таблица 4.

Аминокислотные последовательности лидерных последовательностей тяжелых и легких цепей гуманизированных mAb BAP049 клона B и BAP049 клона E

BAP049 клона B	HC	MAWVWTLPFLMAAAQSVQA (SEQ ID NO: 221)
	LC	MSVLTQVLALLLLWLTGTRC (SEQ ID NO: 222)
BAP049 клона E	HC	MAWVWTLPFLMAAAQSVQA (SEQ ID NO: 221)
	LC	MSVLTQVLALLLLWLTGTRC (SEQ ID NO: 222)

Пример 2. Резюме клинического исследования

Следующее клиническое исследование будет использоваться для подтверждения обоснования, результатов и выводов из примера 1. Безопасность и эффективность, ожидаемые в примере 1, также будут дополнительно оценены.

Открытое исследование фазы I с повышением дозы перорального LGK974 и PDR001 у пациентов со злокачественными новообразованиями, зависимыми от лигандов Wnt
Задача и обоснование	Задачей данного исследования является оценка рекомендуемой дозы соединения формулы (I) в комбинации с PDR001, которую можно безопасно вводить пациентам с определенными солидными злокачественными новообразованиями, для которых не существует эффективного стандартного лечения.
Основная цель	Определить MTD и/или рекомендуемую дозу для соединения формулы (I) в комбинации с PDR001 при введении пациентам со злокачественными новообразованиями, зависимыми от лигандов Wnt, как указано в критериях включения.
Вторичные цели	Охарактеризовать безопасность и переносимость соединения формулы (I) в комбинации с PDR001. Оценить PK соединения формулы (I) в комбинации с PDR001 Дать оценку противоопухолевой активности соединения формулы (I) в комбинации с PDR001.
План исследования	Это многоцентровое, открытое исследование фазы 1. Начальная доза соединения формулы (I) и PDR001 в комбинации будет составлять соответственно 2,5 мг QD от дня 1 до дня 8 только в цикле 1 и 400 мг Q4W. Доза PDR001 в 400 мг Q4W является RP2D, определенной в клиническом исследовании CPDR001X2101. Введение соединения формулы (I) будет начинаться с 2,5 мг QD, -1 уровня дозы, с которого наблюдается ингибирование мишени, в монотерапевтической части исследования. Могут быть изучены другие режимы дозирования соединения формулы (I) (т. е. дозирование QD LGK974 от дня 1 до дня 8 каждого цикла на протяжении циклов 1-4; дозирование QD соединения формулы (I) в дни 1-15 только в цикле 1 или дозирование QD LGK974 в дни 1-15 каждого цикла на протяжении циклов 1-4) в зависимости от данных по безопасности, PK, PD и эффективности. Повышение дозы будет продолжаться до достижения MTD и/или RDE. В части с повышением дозы будет использоваться модель байесовской логистической регрессии (BLRM) с принципом контроля передозировки (EWOC) для выбора уровня дозы и определения MTD и/или RDE. Часть исследования, проводимая в расширенной популяции, будет начинаться с определения RDE и будет проводиться в одном режиме. Цель части, проводимой в расширенной популяции, заключается в том, чтобы лучше охарактеризовать безопасность и переносимость, взаимосвязь между PK и PD, а также исследовать противоопухолевую активность комбинации. Примерно 40 пациентов из 4 групп заболеваний будут получать лечение в части исследования, в которой ранее установленная максимальная переносимая доза применяется в расширенной популяции. Токсичность будет оцениваться в соответствии с CTCAE версии 4.03 для оценивания безопасности и переносимости соединения формулы (I) в качестве монотерапии и в комбинации с PDR001. Ответ заболевания будет оцениваться с использованием RECIST v1.1 в монотерапевтической части и RECIST v1.1 и irRC в комбинационной части. Пациенты будут получать лечение до тех пор, пока не будет наблюдаться прогрессирование заболевания или неприемлемая токсичность или до отзыва согласия, после чего все пациенты будут проходить последующее наблюдение для оценки безопасности при завершении оценивания в рамках исследования (SEC) для выявления нежелательных явлений (AE) и серьезных нежелательных явлений (SAE) в течение 30 дней после последней дозы соединения формулы (I) в монотерапевтической части и в течение 150 дней после последней дозы PDR001 или 30 дней после последней дозы соединения формулы (I), в зависимости от того, что произойдет позднее, в комбинационной части.
Популяция	Взрослые пациенты и пациенты-подростки с запущенным раком, у которых наблюдалось прогрессирование, несмотря на применение стандартной терапии, или для которых не существует эффективной стандартной терапии, имеющие гистологически подтвержденный диагноз: соединение формулы (I) в комбинации с PDR001: ▪ аденокарцинома поджелудочной железы ▪ трижды негативный рак молочной железы (TNBC) ▪ меланома ▪ плоскоклеточный рак головы и шеи ▪ плоскоклеточный рак легкого ▪ плоскоклеточный рак пищевода ▪ плоскоклеточный рак шейки матки
Критерии включения	Пациенты, подходящие для включения в это исследование, должны соответствовать всем следующим критериям: 1. Диагностированный местнораспространенный или метастатический рак, который прогрессировал, несмотря на применение стандартной терапии, или для которого не существует эффективной стандартной терапии, и гистологическое подтверждение одного из следующих заболеваний, указанных ниже: ▪ соединение формулы (I) с PDR001: повышение дозы: пациенты со следующими формами рака, которые ранее получали лечение с помощью терапии с использованием антител к PD-1 и лучшим ответом которых на эту терапию было прогрессирование заболевания (т. е. с первичной невосприимчивостью): меланома, SCC легкого, HNSCC. Пациенты с SCC пищевода, SCC шейки матки или TNBC независимо от предшествующей терапии с использованием антител к PD-1 также подходят. Однако у пациентов с SCC пищевода, SCC шейки матки или TNBC, которые ранее получали терапию с использованием антител к PD-1, лучшим ответом на эту терапию должно быть прогрессирование заболевания. ▪ Соединение формулы (I) с PDR001: применение ранее установленной максимальной переносимой дозы в расширенной популяции: пациенты с раком поджелудочной железы, или TNBC, или меланомой, или плоскоклеточным раком головы и шеи. 2. Возраст 18 лет или больше 3. Общее состояние 0-2 по шкале WHO 4. В ходе части исследования с повышением дозы пациенты должны иметь поддающееся оцениванию заболевание. В ходе части исследования, проводимой в расширенной популяции, пациенты должны иметь поддающееся измерению заболевание согласно определению RECIST v1.1 (по меньшей мере один очаг, имеющий по меньшей мере один размер ≥ 10 мм при оценке с помощью CT или MRI, или кожный очаг с четко определенными краями, по меньшей мере один размер которого имеет величину ≥ 10 мм) 6. Готовность и способность выполнять все процедуры в рамках исследования 7. Письменное информированное согласие, полученное до каких-либо скрининговых процедур 8. Пациент должен быть готов пройти новую биопсию опухоли при скрининге.
Исследуемое и эталонное средство терапии	Исследуемое лекарственное средство: LGK974 [2-(2',3-диметил-[2,4'-бипиридин]-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид] в капсулах по 2,5, 10 и 50 мг PDR001: 100 мг порошка для инфузий
Оценки эффективности	Соединение формулы (I) в комбинации с PDR001: ответ опухоли будет определяться интерпретацией местного исследователя в соответствии с двумя наборами критериев: 1. RECIST v1.1 2. irRC На исходном уровне все пациенты будут подвергаться CT груди, живота и таза с i.v. введением контрастного вещества. Если имеются клинические признаки заболевания головы или шеи, также будет проведена CT головы и/или шеи. MRI следует использовать только для оценивания пораженных участков, которые надлежащим образом не визуализируются с помощью CT. Если пациент не переносит контрастные вещества на основе йода, CT можно проводить без контрастного вещества; однако, можно использовать MRI для оценивания пораженных участков, где CT без i.v. введения контрастного вещества не подходит. Видимые кожные очаги и легко прощупываемые подкожные опухоли могут быть измерены при физикальном обследовании с помощью линейки или штангенциркуля. Не следует использовать ультразвуковое исследование для измерения пораженных участков. Последующие оценивания опухолей для пациентов, получавших лечение с помощью соединения формулы (I) в комбинации с PDR001, будут производиться во время лечения, начиная с дня 1 цикла 3, каждые 2 цикла до дня 1 цикла 11, а затем каждые 3 цикла до прогрессирования заболевания согласно irRC или выхода пациента из исследования и во время периода последующего наблюдения за прогрессированием каждые 8 недель в течение 40 недель, затем каждые 12 недель до прогрессирования заболевания согласно irRC или утраты контакта с пациентом для последующего наблюдения. Оценивание опухолей также будет проводиться при EOT в обеих частях исследования. Если последнее предыдущее оценивание опухоли было проведено в период до 28 дней перед EOT, то его не нужно повторять при EOT. Оценивания опухолей после оценки на исходном уровне будут включать оценивание всех пораженных участков, идентифицированных на исходном уровне, с использованием той же методики, которая использовалась на исходном уровне. Если в участке тела на исходном уровне не было признаков заболевания, этот участок не нужно визуализировать при последующих оценках, если только не существует клинической обеспокоенности в отношении появления нового очага в этом участке тела. Для соединения формулы (I) в комбинации с PDR001 будет использоваться оценка местного исследователя для анализа ответа согласно как RECIST 1.1, так и irRC, а также для принятия решения о лечении (прекращение исследования в связи с PD согласно irRC). Пациенты, у которых наблюдается прогрессирование заболевания согласно критериям RECIST v. 1.1, могут продолжать получать лечение в соответствии с методическими рекомендациями irRC, пока прогрессирование не будет документально подтверждено с использованием irRC. В ходе исследования спонсор исследования может принять решение о проведении централизованной проверки выполненных рентгенологических оценок. В таком случае персонал исследователя будет проинструктирован о том, как отправлять данные этих рентгенологических оценок в контрактную исследовательскую организацию (CRO) для централизованной проверки в случае необходимости.
Оценки безопасности	Безопасность будет контролироваться путем оценки изменений лабораторных показателей, показателей физикального обследования и показателей жизненно важных функций по сравнению с исходным уровнем, а также сбора информации о нежелательных явлениях при каждом визите. ▪ Оценивание всех AE и SAE, включая реакции гиперчувствительности в месте инъекции, показатели жизненно важных функций, оценки лабораторных показателей и частоту встречаемости инфекций ▪ Физикальное обследование ▪ Показатели жизненно важных функций ▪ Рост и вес ▪ Оценивание лабораторных показателей ▪ Общий анализ крови ▪ Клинико-биохимический анализ крови ▪ Оценки лабораторных показателей, связанных с костями ▪ Анализ мочи ▪ Беременность и оценки фертильности ▪ Панель функции щитовидной железы ▪ Цитокины ▪ Оценки сердечной деятельности ▪ Сканирование плотности костей ▪ Рентгенологическое исследование поясничного отдела ▪ Оценка фармакокинетических параметров и иммуногенности (IG)
Анализ данных	Данные будут обобщены с использованием описательной статистики (непрерывные данные) и/или таблиц сопряженности признаков (категориальные данные) для демографических и исходных характеристик, измерений эффективности, измерений безопасности и всех соответствующих фармакокинетических и фармакодинамических измерений. Первичный CSR будет основан на всех данных о пациентах из частей с повышением дозы и в расширенной популяции до момента, когда все пациенты завершили по меньшей мере четыре цикла лечения или прекратили участие в исследовании. Любые дополнительные данные о пациентах, продолжающих получать лечение в рамках исследования после даты прекращения сбора данных для первичного CSR, как это разрешено протоколом, будут сообщены после того, как все пациенты завершат визит последующего наблюдения при SEC. В рамках этого анализа когорты пациентов, получавших лечение с использованием одних и тех же дозы или комбинации, режима и состава, будут объединены в группы лечения. Кроме того, в комбинационной части исследования пациенты, получавшие лечение в ходе части с повышением дозы, будут объединены с пациентами, получающими тот же режим дозирования в ходе части, проводимой в расширенной популяции. Все списки, резюме, фигуры и анализы будут приведены по группам лечения, если не указано иное. В части, в которой ранее установленная максимальная переносимая доза применяется в расширенной популяции, в случае необходимости могут быть выполнены дополнительные описательные анализы по группам показаний и путям введения.

План клинического испытания показан на фигуре 8.

Пример 3. Подавление роста раковой опухоли поджелудочной железы в отдельности и в комбинации с иммунотерапией

Следующее экспериментальное исследование будет использоваться для подтверждения обоснования, результатов и выводов из примера 1. Эффективность, ожидаемая в примере 1, также будет дополнительно оценена.

В исследовании будет изучена способность соединения формулы (I), в отдельности или в комбинации с молекулой антитела к PD1, подавлять рост опухолевых клеток поджелудочной железы у мышей PDX-CRE KRAS^G12D P53^R172H/+.

Группы лечения:

A) Инертное вещество

B) Соединение формулы (I), 5 мг/кг BID, PO

C) Соединение формулы (I), 5 мг/кг BID, PO, и антитело к PD1 (два раза в неделю ip)

D) Соединение формулы (I), 5 мг/кг BID, PO, и изотипический контроль (два раза в неделю ip)

В каждой группе лечения будет примерно 10-15 мышей

Период лечения. Лечение начнется, когда мыши будут иметь прощупываемую опухолевую массу. Мыши будут отобраны для исследования при проявлении симптомов рака поджелудочной железы (медианный период 120 дней). Из когорт животных, получающих лечение, и контрольных животных после кратковременного лечения (менее 7 дней) будут отобраны особи для анализа иммунного и воспалительного инфильтрата опухолей.

Рост опухоли будет контролироваться с помощью ультразвукового исследования. Время до появления симптомов рака поджелудочной железы и метастазирования также будет контролироваться. Также будет контролироваться HC в отношении маркеров дифференцировки, апоптоза, пролиферации и старения.

Регистрируемые показания: IHC ядерного β-катенина, включение BrdU, CD4+, CD8+, CD3+ (T-лимфоциты), F4/8- (макрофаги) и NIMP (нейтрофилы). У животных из когорт после кратковременного вмешательства будут определены материал и данные в форме выделенной РНК для полнотранскриптомного анализа с помощью секвенирования РНК в комбинации с GSEA для иммунных и воспалительных сигнатур.

Пример 4. Подавление роста меланомы в отдельности и в комбинации с иммунотерапией

В исследовании будет изучена способность соединения формулы (I), в отдельности или в комбинации с молекулой антитела к PD1, подавлять рост опухолевых клеток меланомы у мышей TyrCreER BRaf^V600E/+Pten^fl/+и TyrCreER BRaf^V600E/+ Pten^fl/+ Catnb^lox(ex3)/+.

Группы лечения:

A) Инертное вещество

B) Соединение формулы (I), 5 мг/кг BID, PO

C) Соединение формулы (I), 5 мг/кг BID, PO, и антитело к PD1 (два раза в неделю ip)

D) Соединение формулы (I), 5 мг/кг BID, PO, и изотипический контроль (два раза в неделю ip)

В каждой группе лечения будет примерно 10-15 мышей

Период лечения. Лечение начнется после формирования меланомы (диаметр 5 мм) и будет продолжаться до тех пор, пока опухоли не достигнут конечной точки (диаметр 15 мм). Рост опухоли будет контролироваться путем измерения штангенциркулем.

Регистрируемые показания. Рост опухоли с помощью измерения штангенциркулем, насыщенность клетками опухоли с помощью патологического исследования, IHC для β-катенина и qPCR для генов-мишеней Wnt, маркеры стромальных клеток/инфильтрирующих иммунных клеток с помощью IHC.

Пример 5. Подавление роста меланомы в отдельности и в комбинации с иммунотерапией

В исследовании будет изучена способность соединения формулы (I), в отдельности или в комбинации с молекулой антитела к PD1, подавлять рост опухолевых клеток меланомы у "голых" мышей CD-1 или мышей C57BL/6, которым была трансплантирована меланома мышиного происхождения (мышей TyrCreER BRaf^V600E/+ Pten^fl/и TyrCreER BRaf^V600E/+ Pten^fl/+ Catnb^lox(ex3)/+).

Группы лечения:

A) Инертное вещество

B) Соединение формулы (I), 5 мг/кг BID, PO

C) Соединение формулы (I), 5 мг/кг BID, PO, и антитело к PD1 (два раза в неделю ip)

D) Соединение формулы (I), 5 мг/кг BID, PO, и изотипический контроль (два раза в неделю ip)

В каждой группе лечения будет примерно 10-15 мышей

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> NOVARTIS AG

<120> Режим дозирования ингибитора Wnt и молекулы антитела к PD-1

в комбинации

<130> PAT057618

<140> PCT/IB2018/050846

<141> 2018-02-12

<150> 62/458,640

<151> 2017-02-14

<150> 62/616,682

<151> 2017-01-12

<160> 224

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 1

Thr Tyr Trp Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

интетический пептид"

<400> 2

Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 3

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 3

Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 4

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 5

Tyr Pro Gly Thr Gly Gly

1 5

<210> 6

<400> 6

000

<210> 7

<400> 7

000

<210> 8

<400> 8

000

<210> 9

<400> 9

000

<210> 10

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 10

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 11

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 11

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 12

<400> 12

000

<210> 13

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 13

Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe

1 5 10

<210> 14

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 14

Trp Ala Ser

<210> 15

<400> 15

000

<210> 16

<400> 16

000

<210> 17

<400> 17

000

<210> 18

<400> 18

000

<210> 19

<400> 19

000

<210> 20

<400> 20

000

<210> 21

<400> 21

000

<210> 22

<400> 22

000

<210> 23

<400> 23

000

<210> 24

<400> 24

000

<210> 25

<400> 25

000

<210> 26

<400> 26

000

<210> 27

<400> 27

000

<210> 28

<400> 28

000

<210> 29

<400> 29

000

<210> 30

<400> 30

000

<210> 31

<400> 31

000

<210> 32

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 32

Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 33

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 33

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr

1 5

<210> 34

<400> 34

000

<210> 35

<400> 35

000

<210> 36

<400> 36

000

<210> 37

<400> 37

000

<210> 38

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 39

<400> 39

000

<210> 40

<400> 40

000

<210> 41

<400> 41

000

<210> 42

<400> 42

000

<210> 43

<400> 43

000

<210> 44

<400> 44

000

<210> 45

<400> 45

000

<210> 46

<400> 46

000

<210> 47

<400> 47

000

<210> 48

<400> 48

000

<210> 49

<400> 49

000

<210> 50

<400> 50

000

<210> 51

<400> 51

000

<210> 52

<400> 52

000

<210> 53

<400> 53

000

<210> 54

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 54

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 55

<400> 55

000

<210> 56

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 56

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 57

<400> 57

000

<210> 58

<400> 58

000

<210> 59

<400> 59

000

<210> 60

<400> 60

000

<210> 61

<400> 61

000

<210> 62

<400> 62

000

<210> 63

<400> 63

000

<210> 64

<400> 64

000

<210> 65

<400> 65

000

<210> 66

<400> 66

000

<210> 67

<400> 67

000

<210> 68

<400> 68

000

<210> 69

<400> 69

000

<210> 70

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 70

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 71

<400> 71

000

<210> 72

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 72

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 73

<400> 73

000

<210> 74

<400> 74

000

<210> 75

<400> 75

000

<210> 76

<400> 76

000

<210> 77

<400> 77

000

<210> 78

<400> 78

000

<210> 79

<400> 79

000

<210> 80

<400> 80

000

<210> 81

<400> 81

000

<210> 82

<400> 82

000

<210> 83

<400> 83

000

<210> 84

<400> 84

000

<210> 85

<400> 85

000

<210> 86

<400> 86

000

<210> 87

<400> 87

000

<210> 88

<400> 88

000

<210> 89

<400> 89

000

<210> 90

<400> 90

000

<210> 91

<211> 443

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 91

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 92

<211> 1329

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 92

gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ctggcgagtc cctgcggatc 60

tcctgcaagg gctctggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt gcgacaggct 120

accggccagg gcctggaatg gatgggcaac atctatcctg gcaccggcgg ctccaacttc 180

gacgagaagt tcaagaacag agtgaccatc accgccgaca agtccacctc caccgcctac 240

atggaactgt cctccctgag atccgaggac accgccgtgt actactgcac ccggtggaca 300

accggcacag gcgcttattg gggccagggc accacagtga ccgtgtcctc tgcttctacc 360

aaggggccca gcgtgttccc cctggccccc tgctccagaa gcaccagcga gagcacagcc 420

gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480

ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540

agcctgagca gcgtggtgac cgtgcccagc agcagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 600

aacgtggacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gggtggagag caagtacggc 660

ccaccctgcc ccccctgccc agcccccgag ttcctgggcg gacccagcgt gttcctgttc 720

ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac ctgtgtggtg 780

gtggacgtgt cccaggagga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 840

gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag gagcagttta acagcaccta ccgggtggtg 900

tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aagagtacaa gtgtaaggtc 960

tccaacaagg gcctgccaag cagcatcgaa aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct 1020

agagagcccc aggtctacac cctgccaccc agccaagagg agatgaccaa gaaccaggtg 1080

tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac ccaagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140

aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc acccccccag tgctggacag cgacggcagc 1200

ttcttcctgt acagcaggct gaccgtggac aagtccagat ggcaggaggg caacgtcttt 1260

agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagag cctgagcctg 1320

tccctgggc 1329

<210> 93

<400> 93

000

<210> 94

<400> 94

000

<210> 95

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 95

gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgagtc actgagaatt 60

agctgtaaag gttcaggcta caccttcact acctactgga tgcactgggt ccgccaggct 120

accggtcaag gcctcgagtg gatgggtaat atctaccccg gcaccggcgg ctctaacttc 180

gacgagaagt ttaagaatag agtgactatc accgccgata agtctactag caccgcctat 240

atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcac taggtggact 300

accggcacag gcgcctactg gggtcaaggc actaccgtga ccgtgtctag c 351

<210> 96

<211> 1329

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 96

gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgagtc actgagaatt 60

agctgtaaag gttcaggcta caccttcact acctactgga tgcactgggt ccgccaggct 120

accggtcaag gcctcgagtg gatgggtaat atctaccccg gcaccggcgg ctctaacttc 180

gacgagaagt ttaagaatag agtgactatc accgccgata agtctactag caccgcctat 240

atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcac taggtggact 300

accggcacag gcgcctactg gggtcaaggc actaccgtga ccgtgtctag cgctagcact 360

aagggcccgt ccgtgttccc cctggcacct tgtagccgga gcactagcga atccaccgct 420

gccctcggct gcctggtcaa ggattacttc ccggagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480

ggagccctga cctccggagt gcacaccttc cccgctgtgc tgcagagctc cgggctgtac 540

tcgctgtcgt cggtggtcac ggtgccttca tctagcctgg gtaccaagac ctacacttgc 600

aacgtggacc acaagccttc caacactaag gtggacaagc gcgtcgaatc gaagtacggc 660

ccaccgtgcc cgccttgtcc cgcgccggag ttcctcggcg gtccctcggt ctttctgttc 720

ccaccgaagc ccaaggacac tttgatgatt tcccgcaccc ctgaagtgac atgcgtggtc 780

gtggacgtgt cacaggaaga tccggaggtg cagttcaatt ggtacgtgga tggcgtcgag 840

gtgcacaacg ccaaaaccaa gccgagggag gagcagttca actccactta ccgcgtcgtg 900

tccgtgctga cggtgctgca tcaggactgg ctgaacggga aggagtacaa gtgcaaagtg 960

tccaacaagg gacttcctag ctcaatcgaa aagaccatct cgaaagccaa gggacagccc 1020

cgggaacccc aagtgtatac cctgccaccg agccaggaag aaatgactaa gaaccaagtc 1080

tcattgactt gccttgtgaa gggcttctac ccatcggata tcgccgtgga atgggagtcc 1140

aacggccagc cggaaaacaa ctacaagacc acccctccgg tgctggactc agacggatcc 1200

ttcttcctct actcgcggct gaccgtggat aagagcagat ggcaggaggg aaatgtgttc 1260

agctgttctg tgatgcatga agccctgcac aaccactaca ctcagaagtc cctgtccctc 1320

tccctggga 1329

<210> 97

<211> 339

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 97

gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60

ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120

tggtatcagc agaagcccgg taaagcccct aagctgctga tctactgggc ctctactaga 180

gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240

atctctagcc tgcagcccga ggatatcgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300

ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaag 339

<210> 98

<211> 660

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 98

gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60

ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120

tggtatcagc agaagcccgg taaagcccct aagctgctga tctactgggc ctctactaga 180

gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240

atctctagcc tgcagcccga ggatatcgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300

ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaagc gtacggtggc cgctcccagc 360

gtgttcatct tcccccccag cgacgagcag ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgc 420

ctgctgaaca acttctaccc ccgggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg 480

cagagcggca acagccagga gagcgtcacc gagcaggaca gcaaggactc cacctacagc 540

ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc gactacgaga agcataaggt gtacgcctgc 600

gaggtgaccc accagggcct gtccagcccc gtgaccaaga gcttcaacag gggcgagtgc 660

<210> 99

<400> 99

000

<210> 100

<400> 100

000

<210> 101

<400> 101

000

<210> 102

<400> 102

000

<210> 103

<400> 103

000

<210> 104

<400> 104

000

<210> 105

<400> 105

000

<210> 106

<211> 339

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 106

gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60

ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120

tggtatcagc agaagcccgg tcaagcccct agactgctga tctactgggc ctctactaga 180

gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240

atctctagcc tggaagccga ggacgccgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300

ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaag 339

<210> 107

<211> 660

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 107