Способ диагностики меланомы с помощью экзосомальных микрорнк

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения стадии меланомы. Способ определения стадии меланомы по изменению профиля экспрессии микроРНК в экзосомах включает забор венозной крови в пробирку с антикоагулянтом, центрифугирование, отбор плазмы и приготовление нескольких аликвот с последующим замораживанием, выделением экзосом методом ультрацентрифугирования и выделением экзосомальных микроРНК, постановка реакции ПЦР в реальном времени с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием меланомы: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроРНК-let7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, MHKpoPHK-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а, при определенных условиях, далее проводят расчет коэффициента, диагностирующего развитие меланомы (R) по эмпирической формуле и при значении R: в диапазоне от 0 до 0,99 – здоровые пациенты, в диапазоне от 1 до 1,99 - 1-2 стадия меланомы, выше 2 - 3-4 стадия меланомы. Вышеописанный способ позволяет определить стадии меланомы по изменению профиля экспрессии определенных микроРНК в экзосомах, выделенных из плазмы крови. 3 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к диагностическим методам, позволяющим диагностировать развитие меланомы.

Меланома - опухолевое заболевание, вызванное злокачественной трансформацией меланоцитов, - клеток, ответственных за производство меланина. Меланома является шестым наиболее распространенным злокачественным новообразованием в Соединенных Штатах, причем рост заболеваемости наблюдается во всем мире. Согласно данным американского онкологического сообщества, 91% меланом являются кожные, 5,3% увеальными, 1,3% являются меланомами слизистых оболочек, и 2,2% являются меланомами неизвестного первичного происхождения.

По статистике Всемирной организации здравоохранения в 2000 г было диагностировано более 200 тысяч случаев меланомы, при этом зафиксировано более 65 тысяч летальных исходов, связанных с меланомой. Рост заболевания меланомой отмечается с 1998 г., так к 2008 г. отмечается существенный рост количества случаев меланомы почти что во всех странах мира, в том числе и в Российской Федерации (например, в Санкт-Петербурге: мужчины - 3,5; женщины - 4). Летальность при меланоме тоже высокая, особенно среди белого населения Австралии (мужчины - 5, женщины - 5) и Новой Зеландии (мужчины - 3, женщины - 3), где повышенный уровень ультрафиолетового излучения. При анализе пятилетней выживаемости наблюдается различная картина в разных странах мира - так, высокий процент пятилетней выживаемости наблюдается в Соединенных Штатах Америки, где она составляет 88 процентов. Немного нижи цифры пятилетней выживаемости в Австралии и Новой Зеландии - около 85 процентов. В Европейских странах цифра варьирует, и в среднем составляет 70 - 75 процентов. Что касается развивающихся стран, тут пятилетняя выживаемость около 50 процентов.

МикроРНК, в качестве важнейших пост-транскрипционных регуляторов экспрессии генов, являются важными компонентами в биологии меланомы. Нарушение регулирования МикроРНК связывают с развитием злокачественных свойств и метастазирования злокачественной меланомы. Росту рака способствует потере определенных микроРНК, в то время как прогрессии рака способствует избыточная экспрессия других микроРНК.

МикроРНК можно определять практически во всех биологических жидкостях: в моче, слюне, соскобе со щеки, плазме или сыворотке крови, цереброспинальной жидкости и др. МикроРНК в жидкостях могут присутствовать в различном виде, так, в плазме крови они могут быть свободно циркулирующими молекулами, в комплексах с белками, в циркулирующих клетках и во внеклеточных везикулах, в частности в экзосомах - которые являются небольшими 20-140 нм, структурами, участвующими в межклеточной коммуникации. При проведении исследований выделение отдельных фракций микроРНК, особенно экзосомальных могут представлять наибольший интерес в связи с их ключевым воздействием при межклеточной коммуникации. Во многих исследованиях обнаруживалась способность таргетной доставки микроРНК посредством экзосом, воздействуют таким образом на молекулярно-генетические процессы в реципиентных клетках. Гены-мишени микроРНК при меланоме, как и в случаях с большинством других онкологических заболеваний, связаны с влиянием на клеточный цикл, пролиферацию клеток, адгезию и васкуляризацию. Так, обнаружено, что при меланоме наблюдается гиперрегулация порядка 519 генов в клеточных линиях полученных из метастазов меланомы и клеточных культурах меланомы человека. Существенно (примерно в 5 раз) повышается экспрессия гена ANPEP, а генов CFL1 и МТА2 напротив, слегка снижается (до 0,8 раз). Гены CFL1 и МТА2 определяют морфологию клеток, а также их метастатический потенциал. Ассоциированные с рядом микроРНК В сети взаимодействующих генов, являющихся таргетными для микроРНК, экспрессия которых значительно понижена или повышена при меланоме, отмечают основные гены участвующие во взаимодействии и являющиеся мишенями микроРНК: АРР, AGO2, АКТ1, KRAS, AHR, STAT1, ВАК1 и PARP1. Отмечается что ген АКТ1, а также ген PARP1 и ген KRAS ко-регулируются следующими микроРНК: микро-РНК-34а-5р, -148а-3р, -129-5р, -363-3р и -374b-5р.

Уровень экспрессии основных представителей семейства микроРНК34 (-34а, -34b и -34 с) при меланоме понижается. В то же время уровень экспрессии этих микроРНК определяется геном р53. Для микроРНК-34а, характерно участие в апаптозе, инициированным белком р53, она учувствует в подавлении антиапоптотического белка сиртулина 1 (SIRT1). Иной механизм задействует микроРНК34с. Она способствует подавлению опухолевого роста путем влияния на мРНК и изменению экспрессии ряда генов, таких как гены антиапоптотических белков (например BCL-2), циклинзависимая киназа 4 (CDK4) и циклинзависимая киназа 6 CDK6, а также генов, белки которых связаны с метастазированием (MYC, МЕТ, Notch, и AXL). Появляется все больше данных о ассоциации экспрессии микроРНК34а с рецепторами программированной клеточной смерти 1 (PDL1). Повышенный уровень экспрессии рецептора PDL1 на поверхности иммунокомпетентных клеток пациентов со злокачественными новообразованиями рассматривается как негативный прогностический фактор. Здесь мы наблюдаем обратную зависимость: при высоких уровнях микроРНК-34а отмечается низкий уровень экспрессии рецептора PDL1 и наоборот. Уровень микроРНК 10b повышается при также при раке молочной железы и глиоме и также при меланоме. Повышенный уровень данной микроРНК объясняется ее взаимодействием с промоторным участком гена TWIST, который вовлечен в формирование фенотипа клеток, кроме этого МикроРНК 10b учувствует в угнетении экспрессию гена HOXD10, за свет чего увеличивается метастатическая активность клеток. При меланоме понижаются уровни микроРНК-15 и МикроРНК-16, генами-мишенями которых являются: ген CDK1, ген ETS1, ген BCL-2 и ген JUN, активные участники опухолевого прогрессирования. На линии мышей было показано, что делеция участка 13q14.3, который содержит микроРНК-15 и микроРНК-16, вызывает развитие автономных лимфопролиферативных заболеваний. Так же и у человека течение хронической лимфоцитарной лейкемии часто сопровождается частичной делецией данного локуса.

МикроРНК, определяемые в плазме крови пациентов с меланомой на различных стадиях и представляющие собой прогностическую ценность при меланоме.

В процессе прогрессии опухоли наряду с соматическими мутациями BRAF, V600K, K601E, NRAS, CDKN2A, PTEN и ТР53 и проч. происходят нарушения не только на структурном уровне ДНК, но и на эпигенетическом: наряду с изменением уровня метилирования происходят изменения уровней экспрессии микроРНК. Данные изменения, в свою очередь, приводят к изменению уровней экспрессии различных мРНК, что непосредственно приводит к изменению интенсивности синтеза различных белков и соответственно к изменению функционального состояния клетки, например, к повреждению апоптотических механизмов и проч.

Изменение уровня экспрессии микроРНК может быть как в сторону повышения уровня экспрессии, так и в сторону снижению уровня экспрессии микроРНК. Отчасти динамика изменений зависит от таргетных для конкретной микроРНК генов: микроРНК-4731, уровень экспрессии которой снижен, ингибирует белок SSX4, блокирование функции которого привело к уменьшению размеров 2D колоний трех различных клеточных линий меланомы, также функцию этого белка связывают с подавлением клеточного и иммунного ответа организма на опухолевые клетки.

Снижение уровня экспрессии микроРНК-200b наблюдается не только при меланоме, но и, например, при раке легких, при этом отмечается ингибирующий эффект действия данной микроРНК на пролиферацию злокачественных клеток и рост метастазов.

Уровень экспрессии микроРНК-211 также имеет тенденцию к снижению при развитии меланомы, что связано с гиперметилированием определенных участков ДНК и ассоциировано со снижением чувствительности клеток к химиотерапии, в том числе цисплатином.

Повышение уровня экспрессии микроРНК198 при развитии меланомы связано с нарушением механизмов иммунной защиты, в частности, наблюдается при дисфункции CD8 позитивных клеток. Одной из микроРНК, играющих ключевую роль в развитии меланомы, является микроРНК21, повышение уровня экспрессии которой наблюдается на всех этапах развития злокачественного процесса и при меланоме превышает в 8,6 раз уровень экспрессии микроРНК21, характерный для доброкачественных меланоцитов.

Из уровня техники известен способ определения риска развития меланомы, описанный в патенте «Паттерны микроРНК для диагностики, прогноза и лечения меланомы» [US 8980549 B2, 01.08.2010]. Данный способ включает в себя получение образца опухолевой ткани от пациента с меланомой, выделение и определение уровней экспрессии микроРНК и методику применения микроРНК в качестве прогностического маркера развития меланомы.

Недостатком данного метода является, использование в качестве аналита для исследования только опухолевой ткани, а также отсутствие этапа предварительного выделения экзосом, для получения более специфичных данных по микроРНК.

Помимо этого, известен способ диагностики меланомы на основе панели нескольких микроРНК «Способ диагностики, стадии и мониторинга меланомы с использованием экспрессии гена микроРНК» [WO 2019068139 A1, 25.07.2007]. Метод включает в себя забор биологического материала от пациента, выделение микроРНК и определение профиля экспрессии в плазме микроРНК с оценкой по суммарным микроРНК развития меланомы. Основным недостатком метода является применение уровней экспрессии свободных микроРНК, воспроизводимость и специфичность которых ниже воспроизводимости экзосомальных микроРНК.

Формула 1 «Расчет коэффициента развития меланомы», описывающей способ расчета коэффициента, в соответствии с которым возможно диагностировать развитие меланомы.

Табл. 1 «Значения поправочных коэффициентов микроРНК», содержащая в себе значение поправочных коэффициентов для каждой микроРНК.

Табл. 2 «Уровни экспрессии экзосомальных микроРНК в плазме крови в различных группах пациентов», содержащая в себе значения уровней экспрессии экзосомальных микроРНК в плазме крови здоровых доноров, пациентов с 1-2 стадией меланомы и пациентов с 3-4 стадией меланомы.

Табл. 3 «Коэффициенты развития меланомы, полученные по значениям уровней экспрессии микроРНК из плазмы крови для пациентов различных групп», содержащая в себе числовые коэффициенты развития меланомы у здоровых доноров, пациентов с 1-2 стадией меланомы и пациентов с 3-4 стадией меланомы.

Техническим результатом заявленного способа является возможность определения стадии меланомы по изменению профиля экспрессии следующих микроРНК в экзосомах, выделенных из плазмы крови: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроРНК-1et7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, микроPHK-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а.

Вышеприведенный технический результат достигается благодаря тому, что заявленный способ включает следующие стадии: забор периферической венозной крови (не менее 1 мл) в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА; центрифугировании не позднее чем через 45 минут после взятия крови при 3000 g 15 минут, при комнатной температуре, заморозки при -80°С или использование сразу после центрифугирования; выделение экзосом методом ультрацентрифугирования, выделения экзосомальных микроРНК; постановка реакции ПНР в реальном времени с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием меланомы: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроPHK-let7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, микроРНК-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а.; расчета коэффициента, диагностирующего развитие меланомы по формуле (1) «Расчет коэффициента характеризующего стадию меланомы у пациента в соответствии с полученными числовыми значениями».

Перерасчет концентраций микроРНК, включаемый в расчет, осуществляется в соответствии с поправочными коэффициентами (см. таблицу 1).

Диагностика стадии меланомы осуществляется по цифровому показателю коэффициента R, когда R в диапазоне от 0 до 0,99 - здоровые доноры, если показатель находится в интервале от 1 до 1,99 - 1-2 стадия меланомы, если показатель выше 2-3-4 стадия меданомы.

Заявляемый способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.

Пример 1. Определение уровней экспрессии микроРНК в плазме крови различных групп пациентов и у здоровых доноров

У 10 здоровых доноров (возраст 38-65 лет, 5 мужчин, 5 женщин) в амбулаторных условиях производят забор 1 мл крови в пробирку ЭДТА К2 (забор возможен в любую пробирку, где в качестве антикоагулянта используется ЭДТА). Кровь в течение 45 часов после забора центрифугирует в течение 15 минут на 3000 g, отбирают в чистую пробирку плазму, готовят несколько аликвот по 250 мкл и замораживают при -80°С. Аналогичным образом производят забор материала у 10 пациентов (6 мужчин, 4 женщин, возраст 38-55 лет) с 1-2 стадией меланомы и у 10 пациентов с 3-4 стадией меланомы (5 мужчин, 5 женщин, возраст 42-59 лет).

Затем следует этап выделения экзосомальной фракции микроРНК, для чего необходимы следующие действия: 1) проведение центрифугирования в режиме 14000 g в течение 10 минут при комнатной температуре и отбирают супернатант; 3) проведение ультрацентрифугирования на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 1,5 часов при +4С. Супернатант быдрасывают, а полученный на осадок разводят в 200 мкл безнуклеазной воды. К полученному раствору добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 часа, далее проводят выделение миркоРНК на наборах "miRNeasy seram/plasma advanced kit" (Qiagen Q-217004) по стандартному протоколу: наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды и колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, затем проводят центрифугирование при 3000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи набора для обратной транскрипции "miRCURY LNA RT Kit" (Qiagen-339340) по стандартному протоколу.

Далее с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в режиме реального времени с использованием наборов "meRCURY LNA SYBR Green PCR kit" (Qiagen-339347) на приборе 7500 Applied Biosystems с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием меланомы: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроPHK-let7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, микроРНК-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а.

Затем при помощи программного обеспечения, поставляемого производителем оборудования (GenEx 6.1 - qPCR Data Analysis Software, bioMCC, 29.02.2016), вычисляют количество каждой из исследуемых микроРНК, выделенной из каждой фракции, полученные данные приводятся в формате таблицы.

Затем проводят расчет поправочных коэфициентов для каждой микроРНК. Значения поправочных коэффициентов отображены в табл. №1.

Расчет коэффициента, отражающего развитие меланомы происходит по формуле 1, приведенной выше.

Значения уровней экспрессии экзосомальных микроРНК отражены в табл. №2.

Полученные коэффициенты отражены в табл. №3

Способ определения стадии меланомы по изменению профиля экспрессии следующих микроРНК в экзосомах, включающий следующие стадии: забор периферической венозной крови не менее 1 мл в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА; центрифугирование не позднее чем через 45 минут после взятия крови при 3000 g 15 минут, при комнатной температуре, далее отбирают плазму и готовят несколько аликвот по 250 мкл и замораживают при -80°С, выделение экзосом методом ультрацентрифугирования, выделение экзосомальных микроРНК; постановка реакции ПЦР в реальном времени с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием меланомы: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроРНК-let7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, MHKpoPHK-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а, расчет коэффициента диагностирующего развитие меланомы проводят по формуле:

где R – коэффициент развития меланомы,

С – значение уровня экспрессии микроРНК, ассоциированное с развитием меланомы, в квадратных скобках указаны номера, соответствующие микроРНК, и если R находится в диапазоне от 0 до 0,99 - здоровые, если показатель R находится в интервале от 1 до 1,99 - 1-2 стадия меланомы, если показатель R выше 2 - 3-4 стадия меланомы.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для диагностики ДВС-синдрома у больных гемобластозами с сопутствующей тромбоцитопенией. Для диагностики явного ДВС-синдрома, кроме наличия 5 и более баллов по шкале DIC (ISTH), оценивается уровень синдекана-1 в сыворотке крови, повышение которого более 5,5 нг/мл подтверждает диагноз и требует назначения патогенетической терапии.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: антитело или его функциональный фрагмент, которое специфически связывается с ECL-2 клаудина 3, а также его применения для получения агента для детекции клаудина 3, а также для предупреждения и лечения рака и для получения средства для диагностики, визуализации, лечения рака и для доставки лекарственного средства, специфичного к раковым клеткам, где рак представляет собой рак, экспрессирующий клаудин 3, полинуклеотиды, вектора экспрессии, клетки, способ получения антитела или его функционального фрагмента, способы специфической детекции клаудина 3, композиция для детекции клаудина 3, конъюгат антитело-лекарственное средство и его применение для получения средства для предотвращения и лечения рака, композиция для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, композиция для предотвращения и лечения рака, содержащая антитело или его функциональный фрагмент, белок CAR, способы диагностики и визуализации рака, способы предупреждения и лечения рака, способ специфичной доставки лекарственного средства в раковые клетки.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии и онкологии. Для прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) после лимфаденэктомии проводят иммуногистохимический анализ на срезах лимоузлов с антителами к pSTAT3 и pAKT1.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии. Предложен малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии. Предложен малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогноза эффективности иммунотерапии меланомы ниволумабом. Производят забор опухолевой ткани пациента методом кор-биопсии.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и клинической биохимии, и может быть использовано для уточняющей лабораторной диагностики почечно-клеточного рака (ПКР) для случаев наличия дополнительной ткани в почке по результатам лучевых методов диагностики. Осуществляют определение KIM-1 следующим образом: в средней порции утренней мочи обследуемых определяют соотношение KIM-1 и креатинина.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования статуса рецептора эпидермального фактора роста Her2/neu в первичной опухоли у больных раком молочной железы. На этапе диагностики после забора биопсийного материала проводят морфологическое и иммуногистохимическое исследование с определением гистологического типа рака молочной железы и его молекулярных характеристик.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования статуса рецептора эпидермального фактора роста Her2/neu в первичной опухоли у больных раком молочной железы. На этапе диагностики после забора биопсийного материала проводят морфологическое и иммуногистохимическое исследование с определением гистологического типа рака молочной железы и его молекулярных характеристик.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу, которое специфически связывается с белком FZD10. Также раскрыты полинуклеотид, кодирующий указанное антитело.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и касается способа прогнозирования в остром периоде ишемического инсульта неблагоприятного исхода. Способ прогноза неблагоприятного исхода у пациентов с ишемическим инсультом включает оценку тяжести инсульта у пациента по шкале NIHSS, взятие периферической крови у пациента в острый период инсульта, выделение из периферической крови мононуклеарных клеток, мечение мононуклеарных клеток моноклональными антителами к поверхностным антигенам, присутствующим на моноцитарных миелоидных супрессорных клетках, причем взятие периферической крови у пациента проводят в первые 24-48 часов после инсульта, определяют процентное содержание моноцитарных миелоидных супрессорных клеток среди мононуклеарных клеток, рассчитывают показатель прогностической модели неблагоприятного исхода ишемического инсульта по формуле:Y=е(-3.42+0.23×Х1-0.16×Х2)/(1+е-3.42+0.23×Х1-0.16×Х2)где Y - показатель прогностической модели неблагоприятного исхода ишемического инсульта, Х1 - тяжесть инсульта у пациента по шкале NIHSS в первые 24-48 часов, Х2 - процентное содержание моноцитарных миелоидных супрессорных клеток в периферической крови в первые 24-48 часов у пациента, и при значении Y≥0,24 прогнозируют неблагоприятный исход ишемического инсульта.
Наверх