Иммуноглобулины, связывающие аггрекан

Авторы патента:

ГЮРИНГ, Ханс (DE)

СТЕФФЕНСЕН, Сорен (BE)

БЕСТЕ, Геральд (BE)

ХЕРМАНС, Гай (BE)

ЛАДЕЛЬ, Кристоф (DE)

ТОЛАЙКИС, Ларс (DE)

C07K16/46 - гибридные иммуноглобулины (гибриды иммуноглобулина с пептидом, не являющимся иммуноглобулином C07K 19/00)

C07K16/40 - против ферментов

C07K16/18 - против материала из животных или человека

A61P19/02 - для лечения заболеваний суставов, например артритов, артрозов

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

Владельцы патента RU 2771818:

МЕРК ПАТЕНТ ГМБХ (DE)
АБЛИНКС НВ (BE)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым иммуноглобулинам и конструкциям на их основе, которые способны специфически связывать белок аггрекан. Фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента иммуноглобулины согласно настоящему изобретению, могут быть использованы в медицинской практике для профилактических, терапевтических или диагностических целей, в частности при лечении различных заболеваний суставов, например остеоартрита. 8 н. и 11 з.п. ф-лы, 15 табл., 11 пр., 4 ил.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к иммуноглобулинам, которые связывают аггрекан, а более конкретно к полипептидам, которые включают или по существу состоят из одного или нескольких таких иммуноглобулинов (также называемых в данном документе «иммуноглобулин(ы) по изобретению») и «полипептиды по изобретению», соответственно). Изобретение также относится к конструкциям, содержащим такие иммуноглобулины или полипептиды, а также к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие иммуноглобулины или полипептиды (также называемые в данном документе «нуклеиновая(ые) кислота(ы) по изобретению»), к способам получения таких иммуноглобулинов, полипептидов и конструкций; клеткам-хозяевам, экспрессирующим или способным экспрессировать такие иммуноглобулины или полипептиды, к композициям и, в частности, к фармацевтическим композициям, которые включают такие иммуноглобулины, полипептиды, конструкции, нуклеиновые кислоты и/или клетки-хозяева, и к применению иммуноглобулинов, полипептидов, конструкций, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев и/или композиций, в частности, для профилактических и/или терапевтических целей, таких как профилактические и/или терапевтические цели, упомянутые в данном документе. Другие аспекты, воплощения, преимущества и применения изобретения станут понятными из дальнейшего описания, приведенного в данном документе.

Предшествующий уровень техники

Остеоартрит является одной из наиболее распространенных причин инвалидности во всем мире. Он затрагивает 30 миллионов американцев и является наиболее распространенным заболеванием суставов. Предполагается, что в США он затронет более 20 процентов населения к 2025 году. Заболевание может возникнуть во всех суставах, чаще всего в коленях, бедрах, руках и позвоночнике. Остеоартрит (ОА) можно определить как разнообразную группу состояний, характеризующихся сочетанием симптомов суставов, признаков, обусловленных дефектами суставного хряща и изменениями в соседних тканях, включая кости, сухожилия и мышцы. ОА характеризуется прогрессирующей эрозией суставного хряща (хряща, который покрывает кости). В конце концов, болезнь приводит к полному разрушению суставного хряща, склерозу лежащей в основе кости, образованию остеофитов и т.д., что приводит к потере подвижности и к боли. Боль является наиболее заметным симптомом ОА, и именно по этой причине пациенты обращаются за медицинской помощью.

Аггрекан является основным протеогликаном в суставном хряще (Kiani et al., 2002 Cell Research 12:19-32). Эта молекула важна для правильного функционирования суставного хряща, потому что она обеспечивает гидратированную гелевую структуру, которая наделяет хрящ несущими свойствами. Аггрекан - это большая, многомодульная молекула (2317 аминокислот), экспрессируемая хондроцитами. Его основной белок состоит из трех глобулярных доменов (G1, G2 и G3) и большой протяженной области между G2 и G3 для прикрепления цепи гликозаминогликана. Эта протяженная область содержит два домена, один из которых замещен кератансульфатными цепями (домен KS), а другой - хондроитинсульфатными цепями (домен CS). Домен CS имеет 100-150 цепей гликозаминогликана (GAG), прикрепленных к нему. Аггрекан образует крупные комплексы с гиалуронаном, в которых 50-100 молекул аггрекана взаимодействуют через домен G1 и линкерный белок с одной молекулой гиалуронана. При поглощении воды (из-за содержания GAG) эти комплексы образуют обратимо деформируемый гель, который сопротивляется сжатию. Структура, удержание жидкости и функции суставного хряща связаны с содержанием в матрице аггрекана и количеством сульфата хондроитина, связанного с интактным белком сердцевины.

ОА характеризуется 1) деградацией аггрекана, постепенным высвобождением доменов G3 и G2 (что приводит к «дефляции» хряща) и, в конечном итоге, высвобождением домена G1 и 2) деградацией коллагена, необратимо разрушающей структуру хряща.

Хотя старение, ожирение и травмы суставов были определены как факторы риска, приводящие к остеоартриту, причина ОА неизвестна, и в настоящее время нет фармакологических методов лечения, которые бы останавливали прогрессирование заболевания или излечивали суставы. Для крупных суставов лекарственное средство может вводиться в сустав, чтобы помочь ограничить потенциальные побочные эффекты, такие как боль. Терапевтические стратегии в первую очередь направлены на уменьшение боли и улучшение функции суставов. Было показано, что Фасинумаб, неопиоидное обезболивающее лекарство против NGF, приводит к улучшению ключевого показателя боли во время испытаний фазы II/III. Дулоксетин был одобрен для лечения хронической боли в колене вследствие остеоартрита и был условно рекомендован Американским колледжем ревматологии. Было обнаружено, что ранелат стронция значительно снижает скорость уменьшения ширины суставного пространства, а также улучшает показатели боли по сравнению с плацебо в большом многоцентровом исследовании у пациентов с симптоматическим остеоартритом коленного сустава. Однако в тоже время биологические агенты, антагонисты рецептора интерлейкина-1 и антитела против фактора некроза опухоли, не продемонстрировали ни эффективности, ни изменения течения остеоартрита (Smelter Hochberg, 2013, Current Opin. Rheumatol. 25:310). Следовательно, многие такие методы лечения неэффективны и/или связаны с побочными эффектами. В конечном итоге пациенты будут проходить полную заместительную терапию коленного или тазобедренного сустава, если боль не поддастся контролю.

Фармакологическая терапия начинается с перорального введения парацетамола в сочетании с НПВП или ингибиторами COX-2 и слабым опиоидом. Основными недостатками перорального приема лекарств являются ограниченная биодоступность в интересующем месте и риск возникновения побочных эффектов, таких как повреждение печени, желудочно-кишечные (ЖК) язвы, желудочно-кишечные кровотечения и запоры.

Поскольку ОА имеет локализованный характер, внутрисуставное введение лекарств дает прекрасную возможность улучшить лечение. Тем не менее большинство вновь разработанных лекарств от остеоартрита, модифицирующих заболевание (DMOAD), имеют короткое время пребывания в суставе, даже при внутрисуставном введении (Edwards 2011 Vet. J. 190: 15-21; Larsen et al., 2008, J Pham Sci 97: 4622-4654). Внутрисуставная (IA) доставка терапевтических белков была ограничена их быстрым выведением из суставного пространства и отсутствием удержания в хряще. Синовиальное время удержания лекарственного средства в суставе часто составляет менее 24 часов. Из-за быстрого выведения большинства препаратов, вводимых IA, для поддержания эффективной концентрации потребуются частые инъекции (Owen et al., 1994, Br. J. Clin Pharmacol. 38:349-355). Тем не менее частые внутривенные инъекции нежелательны из-за боли и дискомфорта, которые могут привести к нарушению исполнительности пациента, а также из-за риска введения инфекции суставов.

Loffredo et al. проверили, будет ли целенаправленная доставка к хрящу путем слияния с гепарин-связывающим доменом достаточной для продления функции in vivo инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1). Гепарин присутствует в тучных клетках. Тем не менее естественная роль гепарина неизвестна, но он широко используется в качестве разжижителя крови (Loffredo et al., 2014. Arthritis Rheumatol. 66:1247-1255).

Остается потребность в дополнительных белках, заякоривающихся на хряще (CAP, cartilage anchoring proteins).

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения выдвинули гипотезу о том, что эффективность терапевтического лекарственного средства может быть значительно повышена путем соединения терапевтического лекарственного средства с компонентом, который «закрепляет» лекарственное средство в суставе и, следовательно, увеличивает удерживание лекарственного средства, но который не должен нарушать эффективность указанного терапевтического лекарственного средства (также обозначаемый в данном документе как «белок, заякоривающийся на хряще» или «CAP»). Эта концепция заякоривания будет не только повышать эффективность лекарственного средства, но также и функциональную специфичность для больного сустава за счет снижения токсичности и побочных эффектов, таким образом, увеличивая количество возможных полезных лекарств. Авторы настоящего изобретения также выдвинули гипотезу о том, что агенты, связывающие аггрекан, могут потенциально функционировать в качестве такого якоря, хотя аггрекан сильно гликозилирован и деградирует при различных нарушениях, влияющих на хрящ в суставах. Кроме того, ввиду затрат и обширных испытаний в различных моделях на животных, необходимых для того, чтобы лекарственное средство могло поступить в клинику, такие агенты, связывающие аггрекан, должны предпочтительно иметь широкую перекрестную реактивность, например, агенты, связывающие аггрекан, должны связываться с аггреканом различных видов.

Используя различные оригинальные способы иммунизации, скрининга и определения характеристик, авторы настоящего изобретения смогли идентифицировать ряд агентов, связывающих аггрекан, с превосходными свойствами селективности, стабильности и/или специфичности, которые обеспечили возможность длительного удержания и активности в суставе.

Соответственно, настоящее изобретение относится к иммуноглобулиновому одиночному вариабельному домену (ISV), который специфически связывается с аггреканом, предпочтительно указанный ISV специфически связывается с аггреканом человека (SEQ ID NO: 125), и/или где указанный ISV специфически связывается с аггреканом собаки (SEQ ID NO: 126), аггреканом коровы (SEQ ID NO: 127), аггреканом крысы (SEQ ID NO: 128), аггреканом свиньи (ядро) (SEQ ID NO: 129), аггреканом мыши (SEQ ID NO: 130), аггреканом кролика (SEQ ID NO: 131), аггреканом яванского макака (SEQ ID NO: 132) и/или аггреканом макака-резуса (SEQ ID NO: 133), еще более предпочтительно, где указанный ISV по существу не связывается с нейроканом (SEQ ID NO: 134) и/или бревиканом (SEQ ID NO: 135).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, где ISV имеет более чем 10-кратную, более чем 100-кратную, предпочтительно более чем 1000-кратную селективность связывания с аггреканом по отношению к нейрокану и/или бревикану, и/или указанный ISV предпочтительно связывается с хрящевой тканью, такой как хрящ и/или мениск, и/или указанный ISV обладает стабильностью, по меньшей мере, 7 дней, например, 14 дней, 21 день, 1 месяц, 2 месяца или даже 3 месяца в синовиальной жидкости (SF) при 37°C, и/или указанный ISV имеет удержание в хряще, по меньшей мере, 2, например, по меньшей мере, 3, 4, 5 или 6 RU в анализе удержания в хряще, и/или указанный ISV проникает в хрящ, по меньшей мере, на 5 мкм, например, по меньшей мере, 10 мкм, 20 мкм, 30 мкм, 40 мкм, 50 мкм или даже более, и/или указанный ISV по существу состоит из доменного антитела, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве доменного антитела, однодоменного антитела, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, dAb, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве dAb, нанотела, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена путем созревания аффинности.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, который по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4 соответственно) и 3 областей, определяющих комплементарность (CDR1-CDR3 соответственно), в которых: CDR1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 и 109; CDR2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 и 110; и CDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 и 111.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, где указанный ISV связывается с доменом G1 аггрекана, предпочтительно указанный ISV имеет pI более 8 и/или указанный ISV имеет K_off менее 2⋅10^-2с^-1, и/или указанный ISV имеет EC₅₀ менее 1⋅10^-6M.

i) CDR1 выбран из группы, состоящей из: a) SEQ ID NO: 24, 20 или 21; или b) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24, где в положении 2 S изменен на R, F, I или Т; в положении 3 Т изменен на I; в положении 5 I изменен на S; в положении 6 I изменен на S, T или M; в положении 7 N изменен на Y или R; в положении 8 V изменен на A, Y, T или G; в положении 9 V изменен на М; и/или в положении 10 R изменен на G, K или A; и/или

ii) CDR2 выбран из группы, состоящей из: c) SEQ ID NO: 42, 38 или 39; или d) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, где в положении 1 Т изменен на А или G; S или N вставляется между положением 3 и положением 4 (положение 2a, таблица 1.3B); в положении 3 S изменен на R, W, N или T; в положении 4 S изменен на T или G; в положении 5 G изменен на S; в положении 6 G изменен на S или R; в положении 7 N изменен на S, T или R; в положении 8 A изменен на T; и/или в положении 9 N изменен на D или Y; и/или

iii) CDR3 выбран из группы, состоящей из: e) SEQ ID NO: 60, 56 или 57; или f) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60, где в положении 1 P изменен на G, R, D, или E, или отсутствует; в положении 2 Т изменен на R, L, P или V или отсутствует; в положении 3 Т изменен на М, S или R или отсутствует; в положении 4 H изменен на D, Y, G или T; в положении 5 Y изменен на F, V, T или G; в положении 6 G изменен на L, D, S, Y или W; R, T, Y или V вставляются между положением 6 и положением 7 (положение 6a, Таблица 1.3C); в положении 7 G изменен на P или S; в положении 8 V изменен на G, T, H, R, L или Y; в положении 9 Y изменен на R, A, S, D или G; в положении 10 Y изменен на N, E, G, W или S; W вставлена между положением 10 и положением 11 (положение 10a, таблица 1.3C); в положении 11 G изменен на S, K или Y; в положении 12 P изменен на E, или D, или отсутствует; и/или в положении 13 Y изменен на L или отсутствует.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, в котором указанный ISV выбран из группы ISV, где: CDR1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 20, 21, 25, 27, 29, 31, 34, 35, 36, 37 и 109; CDR2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 38, 39, 43, 45, 47, 49, 50, 53, 54, 55 и 110; и CDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60, 56, 57, 61, 63, 65, 67, 71, 72, 73, 74 и 111.

В аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, в котором указанный ISV выбран из группы ISV, в которой:

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 24, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 42 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 60;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 20, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 38 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 56;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 21, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 39 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 57;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 25, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 43 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 61;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 27, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 45 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 63;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 29, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 47 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 65;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 49 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 67;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 34, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 50 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 71;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 35, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 53 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 72;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 36, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 54 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 73; и

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 55 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 74.

i) CDR1 выбран из группы, состоящей из: a) SEQ ID NO: 24 и 109; или b) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24, где в положении 7 N изменен на S; и/или в положении 9 V изменен на М; и/или

ii) CDR2 выбран из группы, состоящей из: c) SEQ ID NO: 42 и 110; или d) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, где в положении 1 Т изменен на А; в положении 3 S изменен на R; в положении 4 S изменен на T; в положении 8 A изменен на T; и/или в положении 9 N изменен на D; и/или

iii) CDR3 выбран из группы, состоящей из: e) SEQ ID NO: 60 и 111; или f) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60, где в положении 4 H изменен на R; и/или в положении 8 V изменен на D.

В аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, в котором указанный ISV выбран из группы ISV, где CDR1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24 и 109; CDR2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42 и 110; и CDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60 и 111.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, в котором указанный ISV принадлежит к эпитопной группе 1 или эпитопной группе 4, предпочтительно указанный ISV по существу состоит из 4 каркасных областей (от FR1 до FR4, соответственно) и 3 областей, определяющих комплементарность (CDR1-CDR3 соответственно), в котором:

i) CDR1 выбран из группы, состоящей из: a) SEQ ID NO: 36; и b) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36, где в положении 3 Т изменен на S; в положении 6 Т изменен на S; в положении 8 Т изменен на А; и/или в положении 9 М изменен на V; и/или

ii) CDR2 выбран из группы, состоящей из: c) SEQ ID NO: 54; и d) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 54, где в положении 1 A изменен на I; в положении 4 W изменен на R; в положении 7 G изменен на R; и/или в положении 8 Т изменен на S; и/или

iii) CDR3 выбран из группы, состоящей из: e) SEQ ID NO: 73; и f) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 73, где в положении 1 R изменен на G; в положении 2 P изменен на R или L; в положении 3 R изменен на L или S; в положении 5 Y изменен на R; в положении 6 Y изменен на S или A; в положении 7 Y изменен на T или отсутствует; в положении 8 S изменен на P; в положении 9 L изменен на H или R; в положении 10 Y изменен на P или A; в положении 11 S изменен на A или Y; в положении 12 Y изменен на D; в положении 13 D изменен на F; в положении 14 Y изменен на G или отсутствует; и/или после положения 14 вставляется S.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, где указанный ISV выбран из группы ISV, где: CDR1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 29 и 36; CDR2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 38, 47 и 54; и CDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 56, 65 и 73.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, доменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве доменного антитела, однодоменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, dAb, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве dAb, нанотелу, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена путем созревания аффинности и которая связывается с эпитопной группой 1 домена G1 аггрекана, и который конкурирует за связывание с доменом G1 аггрекана с ISV, описанным в данном документе.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, который, по существу, состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4 соответственно) и 3 областей, определяющих комплементарность (CDR1-CDR3 соответственно), в которых: i) выбран CDR1 из группы, состоящей из: а) SEQ ID NO: 24; и b) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24, где в положении 2 S изменен на I или F; в положении 5 I было изменено на S; в положении 6 I было изменено на S или M; в положении 7 N изменен на R или Y; в положении 8 V изменен на A или Y; в положении 9 V изменен на М; и/или в положении 10 R изменен на K; и/или ii) CDR2 выбран из группы, состоящей из: c) SEQ ID NO: 42; и d) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, где в положении 1 Т изменен на А или G; N вставляется между положением 2 и положением 3 (положение 2a, таблица 2.3B); в положении 7 N изменен на R; в положении 8 A изменен на T; и/или в положении 9 N изменен на D; и/или iii) CDR3 выбран из группы, состоящей из: e) SEQ ID NO: 60; и f) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60, где в положении 1 P отсутствует; в положении 2 Т изменен на R или отсутствует; в положении 3 Т изменен на М или отсутствует; в положении 4 H изменен на D или Y; в положении 5 Y изменен на F или V; в положении 6 G изменен на L или D; в положении 8 V изменен на G или T; в положении 9 Y изменен на R; в положении 10 Y изменен на N или E; в положении 11 G изменен на S или K; в положении 12 P изменен на E или отсутствует; и/или в положении 13 Y изменен на L или отсутствует; предпочтительно CDR1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 25 и 27; CDR2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 43 и 45; и CDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60, 61 и 63; еще более предпочтительно, где указанный ISV перекрестно блокирует связывание доменного антитела, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве доменного антитела, однодоменного антитела, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, dAb, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве dAb, нанотела, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена путем созревания аффинности к домену G1 аггрекана.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, к доменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве доменного антитела, к однодоменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, dAb, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве dAb, нанотела, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена путем созревания аффинности, которая связывается с эпитопной группой 4 домена G1 аггрекана и которая конкурирует за связывание с доменом G1 аггрекана с ISV, описанным в данном документе.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, в котором указанный ISV выбран из группы, состоящей из ISV с SEQ ID NO: 5, 1, 2, 6, 8, 10, 12, 16, 17, 18 и 19, и ISV, которые имеют более 80%, например, 90% или 95% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 5, 1, 2, 6, 8, 10, 12, 16, 17, 18, и 19.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, в котором указанный ISV связывается с доменом G1-IGD-G2 аггрекана, предпочтительно, в котором указанный ISV имеет pI более 8 и/или имеет K_off менее чем 2⋅10^-2с^-1 и/или имеет EC₅₀ менее 1⋅10^-6M.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, в котором: i) CDR1 выбран из группы, состоящей из: a) SEQ ID NO: 32, 30 и 23; и b) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32, где в положении 2 R изменен на L; в положении 6 S изменен на T; и/или в положении 8 Т изменен на А; и/или ii) CDR2 выбран из группы, состоящей из: c) SEQ ID NO: 50, 41, 48 и 51; и d) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 50, где в положении 7 G изменен на S или R; и/или в положении 8 R изменен на T; и/или iii) CDR3 выбран из группы, состоящей из: e) SEQ ID NO: 68, 59, 66 и 69; и f) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 68, где в положении 4 R изменен на V или P; в положении 6 A изменен на Y; в положении 7 S изменен на T; в положении 8 S отсутствует; в положении 9 N изменен на P; в положении 10 R изменен на T или L; в положении 11 G изменен на E; и/или в положении 12 L изменен на T или V, предпочтительно, где указанный ISV выбран из группы ISV, где: CDR1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32, 30 и 23; CDR2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, 41, 48 и 51; и CDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 68, 59, 66 и 69, еще более предпочтительно, где указанный ISV выбран из группы ISV, где: CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 50 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 68; CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 51 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 69; CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 30, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 48 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 66; и CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 23, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 41, и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 59.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, в котором указанный ISV выбран из группы, состоящей из ISV с SEQ ID NO: 13, 4, 11 и 14 и ISV, которые имеют более 80%, например, 90% или 95% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 13, 4, 11 и 14.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, где указанный ISV перекрестно блокирует связывание доменного антитела, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве доменного антитела, однодоменного антитела, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, dAb, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве dAb, нанотела, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена путем созревания аффинности к домену G1-IGD-G2 аггрекана. В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, доменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве доменного антитела, однодоменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, dAb, иммуноглобулин, который подходит для применения в качестве dAb, нанотела, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена путем созревания аффинности и которая связывается с доменом G1-IGD-G2 аггрекана и которая конкурирует за связывание с доменом G1-IGD-G2 аггрекана с ISV, описанным в данном документе.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, где указанный ISV связывается с доменом G2 аггрекана, предпочтительно, где указанный ISV имеет pI более 8 и/или имеет K_off менее 2⋅10^-2с^-1 и/или имеет EC₅₀ менее 1⋅10^-6M.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, в котором: i) CDR1 выбран из группы, состоящей из: a) SEQ ID NO: 28; и b) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 28, где в положении 1 G изменен на R; в положении 2 P изменен на S или R; в положении 3 Т изменен на I; в положении 5 S изменен на N; в положении 6 R изменен на N, M или S; в положении 7 Y изменен на R или отсутствует; в положении 8 A изменен на F или отсутствует; и/или в положении 10 G изменен на Y; и/или ii) CDR2 выбран из группы, состоящей из: c) SEQ ID NO: 46; и d) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46, где в положении 1 А изменен на S или Y; в положении 4 W изменен на L; в положении 5 S изменен на N; в положении 6 S отсутствует; в положении 7 G отсутствует; в положении 8 G изменен на A; в положении 9 R изменен на S, D или T; и/или в положении 11 Y изменен на N или R; и/или iii) CDR3 выбран из группы, состоящей из: e) SEQ ID NO: 64; и f) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 64, где в положении 1 А изменен на R или F; в положении 2 R изменен на I или L; в положении 3 I было изменено на H или Q; в положении 4 P изменен на G или N; в положении 5 V изменен на S; в положении 6 R изменен на G, N или F; в положении 7 Т изменен на R, W или Y; в положении 8 Y изменен на R или S или отсутствует; в положении 9 Т изменен на S или отсутствует; в положении 10 S изменен на E, K или отсутствует; в положении 11 E изменен на N, A или отсутствует; в положении 12 W изменен на D или отсутствует; в положении 13 N изменен на D или отсутствует; в положении 14 Y отсутствует; и/или D и/или N добавляются после положения 14 SEQ ID NO: 64; предпочтительно, когда указанный ISV выбран из группы ISV, где: CDR1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28, 22, 26 и 33; CDR2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 46, 40, 44 и 52; и CDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 64, 58, 62 и 70; еще более предпочтительно, где указанный ISV выбран из группы ISV, где: CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 28, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 46 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 64; CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 22, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 40 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 58; CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 26, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 44 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 62; и CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 33, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 52 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 70.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, где указанный ISV выбран из группы, состоящей из ISV с SEQ ID NO: 9, 3, 7 и 15 и ISV, которые имеют более 80%, например, 90% или 95% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 9, 3, 7 и 15.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, где указанный ISV перекрестно блокирует связывание доменного антитела, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве доменного антитела, однодоменного антитела, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, dAb, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве dAb, нанотела, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена путем созревания аффинности к домену G2 аггрекана. В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, доменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве доменного антитела, однодоменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, dAb, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве dAb, нанотелу, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена путем созревания аффинности и которая связывается с доменом G2 аггрекана и которая конкурирует за связывание с доменом G2 аггрекана с ISV, описанным в данном документе.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISV, описанному в данном документе, где указанный ISV выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-19 и 114-118 и ISV, которые имеют более 80%, например, 90% или 95% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 1-19 и 114-118.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему, по меньшей мере, один ISV, описанный в данном документе, предпочтительно указанное включает по меньшей мере два ISV, описанных в данном документе, где указанные по меньшей мере два ISV могут быть одинаковыми или разными. Предпочтительно указанные по меньшей мере два ISV независимо выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-19 и 114-118, более предпочтительно, где указанные по меньшей мере два ISV выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6, 8 и 114-117, или в которых указанные по меньшей мере два ISV выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13 и 118.

Предпочтительно в одном аспекте полипептид по изобретению содержит по меньшей мере один дополнительный ISV, например, терапевтический ISV. Предпочтительно, указанный по меньшей мере один дополнительный ISV связывается с представителем семейства сериновых протеаз, катепсинами, матриксными металлопротеиназами (MMP)/матриксинами или дезинтегрином и металлопротеиназой с мотивами тромбоспондина (ADAMTS), предпочтительно MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5 (аггреканазой-2), ADAMTS4 (аггреканазой-1) и/или ADAMTS11; причем указанный по меньшей мере один дополнительный ISV, например, терапевтический ISV, предпочтительно, сохраняет активность. Еще более предпочтительно, указанный по меньшей мере один дополнительный ISV, такой как терапевтический ISV, ингибирует активность представителя семейства сериновых протеаз, катепсинов, матриксных металлопротеиназ (ММР)/матриксинов или дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина (ADAMTS), предпочтительно MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5 (аггреканазы-2), ADAMTS4 (аггреканазы-1) и/или ADAMTS11.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в данном документе, где указанный полипептид имеет стабильность по меньшей мере 7 дней, например по меньшей мере 14 дней, 21 день, 1 месяц, 2 месяца или даже 3 месяца в синовиальной жидкости (SF) при 37°C и/или имеет удержание в хряще по меньшей мере 2, например по меньшей мере 3, 4, 5 или 6 RU в анализе удержания в хряще, и/или проникает в хрящ по меньшей мере на 5 мкм, например по меньшей мере 10 мкм, 20 мкм, 30 мкм, 40 мкм, 50 мкм или даже больше.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в данном документе, дополнительно включающему белок, связывающий сывороточный белок, или белок сыворотки, предпочтительно указанный фрагмент, связывающий сывороточный белок, связывает сывороточный альбумин; еще более предпочтительно указанный фрагмент, связывающий сывороточный белок, представляет собой ISV, связывающий сывороточный альбумин; еще более предпочтительно, указанный ISV, связывающий сывороточный альбумин, по существу, состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4, соответственно) и 3 областей, определяющих комплементарность (CDR1-CDR3 соответственно), в которых CDR1 представляет собой SFGMS, CDR2 представляет собой SISGSGSDTLYADSVKG и CDR3 представляет собой GGSLSR; еще более предпочтительно указанный ISV, связывающий сывороточный альбумин включает Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb135, Alb11, Alb11 (S112K) -A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG (см. также Таблицу C). В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в данном документе, дополнительно включающему связывающий белок сыворотки или сывороточный белок, где указанным связывающим белок сыворотки компонентом является полипептид, не основанный на антителах. В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в данном документе, дополнительно включающему PEG.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в данном документе, где указанные ISV непосредственно связаны друг с другом или связаны через линкер. В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в данном документе, где первый ISV и/или второй ISV, и/или, возможно, третий ISV, и/или, возможно, четвертый ISV, и/или, возможно, указанный ISV, связывающий сывороточный альбумин, связаны через линкер(ы); предпочтительно указанный линкер выбирают из группы, состоящей из линкеров 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS и 35GS (см. также Таблицу D).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в данном документе, где указанный полипептид выбран из группы полипептидов и/или конструкций, включающих ISV, связывающий мишень, как указано, и один или два ISV, связывающих аггрекан, как указано в таблице E- 1 и Таблице E-2, соответственно.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к конструкции, которая содержит или, по существу, состоит из ISV, описанного в данном документе, или полипептида, описанного в данном документе, и которая необязательно дополнительно включает одну или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, необязательно связанных через один или несколько пептидных линкеров; предпочтительно указанные одну или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих звеньев выбирают из группы, состоящей из молекулы полиэтиленгликоля, белков сыворотки или ее фрагментов, связывающих единиц, которые могут связываться с белками сыворотки, Fc-частью и небольшими белками или пептидами, которые могут связываться с сывороточными белками.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей ISV, описанный в данном документе, полипептиду, описанному в данном документе, или конструкции, описанной в данном документе.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину или хозяину, содержащему нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе, или экспрессирующий вектор, описанный в данном документе.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ISV, описанного в данном документе, или полипептиду, описанному в данном документе, причем указанный способ по меньшей мере включает стадии: а) экспрессии в подходящей клетке-хозяине или организме-хозяине или в другой подходящей системе экспрессии, нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе; необязательно с последующим: b) выделением и/или очисткой ISV, описанного в данном документе, или полипептида, описанного в данном документе.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере один ISV, описанный в данном документе, полипептид, описанный в данном документе, конструкцию, описанную в данном документе, или нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе; предпочтительно указанная композиция представляет собой фармацевтическую композицию, которая предпочтительно дополнительно включает по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель и/или адъювант и необязательно содержит один или несколько других фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, описанной в данном документе, ISV, описанному в данном документе, полипептиду, описанному в данном документе, или конструкции, описанной в данном документе, для применения в качестве лекарственного средства. Предпочтительно композиция, ISV, полипептид или конструкция, описанные в данном документе, предназначена для предотвращения или лечения артропатий и хондродистрофий, артритного заболевания, такого как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматический разрыв или отслоение, ахондроплазия, костохондрит, спондилоэпиметафизальная дисплазия, грыжа позвоночного диска, дегенеративные заболевания поясничного диска, дегенеративные заболевания суставов и рецидивирующий полихондрит.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения артропатий и хондродистрофий, артритного заболевания, такого как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматический разрыв или отслоение, ахондроплазия, костохондрит, спондилоэпиметафизарная дисплазия, грыжа позвоночника, дегенерация поясничного диска, дегенеративные заболевания суставов и рецидивирующий полихондрит, где указанный способ включает введение объекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества по меньшей мере композиции, ISV, полипептида или конструкции, описанной в данном документе, персоне, нуждающейся в этом.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу уменьшения и/или ингибирования оттока соединения, полипептида или конструкции из хрящевой ткани, где указанный способ включает введение фармацевтически активного количества по меньшей мере одного полипептида, описанного в данном документе, соединения или конструкции, описанных в данном документе, или композиции, описанной в данном документе, нуждающемуся в этом человеку.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования и/или блокирования активности ADAMTS5 и/или активности MMP13, где указанный способ включает введение фармацевтически активного количества по меньшей мере одного полипептида, описанного в данном документе, конструкции, описанной в данном документе, или композиции, описанной в данном документе нуждающемуся в этом человеку.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению ISV, как описано в данном документе, полипептида, как описано в данном документе, конструкции, как описано в данном документе, или композиции, как описано в данном документе, для приготовления фармацевтической композиции для лечения или профилактики артропатий и хондродистрофии, артритного заболевания, такого как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматический разрыв или отслоение, ахондроплазия, костохондрит, спондилоэпиметафизарная дисплазия, грыжа позвоночника, дегенерация поясничного диска, дегенеративные заболевания суставов и рецидивирующий полихондрит.

Другие аспекты, преимущества, применения и применения полипептидов и композиций станут ясны из дальнейшего раскрытия в данном документе. Несколько документов цитируется по всему тексту данного описания. Каждый из документов, процитированных в данном документе (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), будь то выше или ниже, настоящим полностью включен ссылкой. Ничто в данном документе не должно быть истолковано как признание того, что изобретение не имеет права предшествовать такому раскрытию в силу предшествующего изобретения.

Подписи к чертежам

Фигура 1: Примеры авторадиографических изображений срезов суставов крыс через 2 или 4 недели после введения ¹²⁵I-меченных конструкций ALB26-CAP. Для каждого из результатов через 2 недели после инъекции и через 4 недели после инъекции: левая панель: гистологический разрез; Правая панель: авторадиография.

Фигура 2: Репрезентативные изображения MARG. Специфическое окрашивание MARG отображается на изображениях в виде черных зерен и показано стрелками.

Фигура 3: Ингибирование деградации хряща нанотелами на крысиной модели ММТ с использованием нанотела против MMP13-CAP (C010100754) или нанотела против ADAMTS5-CAP (C010100954). Обработка началась через 3 дня после операции IA-введением. Гистопатология была выполнена на 42 день после операции. Была определена медиальная и общая фактическая ширина дегенерации хряща, а также процент снижения дегенерации хряща. На группу использовали по 20 животных.

Фигура 4: Концентрации в сыворотке (средняя концентрация в нг/мл) в зависимости от времени после первой дозы (h) полипептидов у крыс с остеоартритом и у здоровых крыс, получающих одну внутрисуставную инъекцию 400 мкг нанотела на сустав (правое колено). Точки представляют индивидуальные концентрации у здоровых животных; треугольники представляют индивидуальные концентрации у животных ОА; а линии представляют средние концентрации.

Подробное описание

Если не указано или не определено иначе, все используемые термины имеют свое обычное значение в данной области, что будет понятно специалисту. Источниками могут служить, например, стандартные справочники, такие как Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), F. Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987), Lewin (Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985), Old et al. (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2^nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981); Roitt et al. (Immunology (6^th Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001), Roitt et al. (Roitt's Essential Immunology (10^th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001) и Janeway et al. (Immunobiology (6^th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005), а также общий уровень техники, цитируемый в данном документе.

Если не указано иное, все способы, стадии, методики и манипуляции, которые в частности не описаны подробно, могут быть выполнены и были выполнены способом, известным по существу, как будет понятно специалисту в данной области. Например, опять может быть сделана отсылка к стандартным справочникам и общему уровню техники, упомянутым в данном документе, и к дополнительным источникам, цитируемым в них; и, например, к следующим обзорам Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006), Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2 (1): 49-57, 2006), Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001), Schmitz et al. (Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000), Gonzales et al. (Tumour Biol. 26 (1): 31-43, 2005), в которых описаны методы белковой инженерии, такие как созревание аффинности, и другие методы улучшения специфичности и других желательных свойств у белков, таких как иммуноглобулины.

Используемый в данном документе термин «последовательность» (например, в таких терминах, как «последовательность иммуноглобулина», «последовательность антитела», «последовательность вариабельного домена», «последовательность VHH» или «последовательность белка»), как правило, следует понимать как включающий как релевантную аминокислотную последовательность, так и нуклеиновые кислоты или нуклеотидные последовательности, кодирующие ее, если контекст не требует более ограниченной интерпретации.

Аминокислотные последовательности интерпретируются как означающие одну аминокислоту или неразветвленную последовательность из двух или более аминокислот, в зависимости от контекста. Нуклеотидные последовательности интерпретируются как означающие неразветвленную последовательность из 3 или более нуклеотидов.

Аминокислоты - это те L-аминокислоты, которые обычно встречаются в природных белках. Аминокислотные остатки будут указаны в соответствии со стандартным трехбуквенным или однобуквенным аминокислотным кодом. Источником может служить, например, таблица A-2 на стр. 48 WO 08/020079. Эти аминокислотные последовательности, содержащие D-аминокислоты, не предназначены для охвата этим определением. Любая аминокислотная последовательность, которая содержит посттрансляционно модифицированные аминокислоты, может быть описана как аминокислотная последовательность, которая первоначально транслируется с использованием символов, показанных в этой таблице A-2, с измененными положениями; например, гидроксилирования или гликозилирования, но эти модификации не должны быть явно показаны в аминокислотной последовательности. Любой пептид или белок, который может быть экспрессирован в виде последовательных модифицированных связей, поперечных связей и кэпов, непептидильных связей и т.д., охватывается этим определением.

Термины «белок», «пептид», «белок/пептид» и «полипептид» используются взаимозаменяемо по всему раскрытию, и каждый из них имеет одинаковое значение для целей настоящего раскрытия. Каждый термин относится к органическому соединению, состоящему из линейной цепи из двух или более аминокислот. Соединение может содержать десять или более аминокислот; двадцать пять или более аминокислот; пятьдесят или более аминокислот; сто или более аминокислот, двести или более аминокислот и даже триста или более аминокислот. Специалист в данной области поймет, что полипептиды обычно содержат меньше аминокислот, чем белков, хотя в данной области техники не существует общепризнанного предела числа аминокислот, которые отличают полипептид от белка; что полипептиды могут быть получены химическим синтезом или рекомбинантными способами; и что белки, как правило, получают in vitro или in vivo рекомбинантными способами, которые все известны в данной области.

Последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислоты считается «(в) (по существу) выделенной (в форме)» - например, по сравнению с реакционной средой или средой для культивирования, из которой она была получена, когда она была отделена по меньшей мере от одного другого компонента, с которым она обычно связана в указанном источнике или среде, такого как другая нуклеиновая кислота, другой белок/полипептид, другой биологический компонент или макромолекула или по меньшей мере один загрязнитель, примесь или минорный компонент. В частности, последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислоты считается «(по существу) выделенной», когда она очищена по меньшей мере в 2 раза, в частности по меньшей мере в 10 раз, более конкретно по меньшей мере в 100 раз и до 1000 раза или больше. Нуклеиновая кислота или аминокислота, которая находится «(по существу) в выделенной форме», предпочтительно является по существу гомогенной, что определяется с помощью подходящего метода, такого как подходящий хроматографический метод, такой как электрофорез в полиакриламидном геле.

Когда говорят, что нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность «включает» другую нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность соответственно или «по существу состоят из» другой нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности, это может означать, что последняя нуклеотидная последовательность или аминокислота последовательность была включена в первую упомянутую нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно, но чаще это обычно означает, что первая упомянутая нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность содержит в своей последовательности участок нуклеотидов или аминокислотных остатков, соответственно, который имеет ту же самую нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно, что и последняя последовательность, независимо от того, как фактически была создана или получена первая упомянутая последовательность (что может быть, например, любым подходящим способом, описанным в данном документе). Посредством неограничивающего примера, когда говорят, что полипептид по изобретению включает иммуноглобулиновый одиночный вариабельный домен («ISV»), это может означать, что указанная последовательность иммуноглобулинового одиночного вариабельного домена была включена в последовательность полипептида по изобретению, но чаще это обычно означает, что полипептид по изобретению содержит в своей последовательности последовательность ISV независимо от того, как указанный полипептид по изобретению был создан или получен. Кроме того, когда говорят, что нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность включает другую нуклеотидную последовательность, первая упомянутая нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность предпочтительно являются такими, что, когда они экспрессируются в продукт экспрессии (например, полипептид), аминокислотная последовательность, кодируемая последней нуклеотидной последовательности образует часть указанного продукта экспрессии (иными словами, последняя нуклеотидная последовательность находится в той же рамке считывания, что и первая упомянутая большая нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность). Кроме того, когда говорят, что конструкция по изобретению содержит полипептид или ISV, это может означать, что указанная конструкция по меньшей мере охватывает указанный полипептид или ISV, соответственно, но чаще это означает, что указанная конструкция включает группы, остатки (например, аминокислотные остатки), фрагменты и/или связывающие единицы в дополнение к указанному полипептиду или ISV, независимо от того, как указанный полипептид или ISV связан с указанными группами, остатками (например, аминокислотными остатками), фрагментами и/или связывающими единицами и независимо от того, как указанная конструкция была создана или получена.

«По существу состоит из» означает, что ISV, используемый в способе по изобретению, либо является точно таким же, как ISV по изобретению, либо соответствует ISV по изобретению, который имеет ограниченное количество аминокислотных остатков, например, 1-20 аминокислотных остатков, например, 1-10 аминокислотных остатков и предпочтительно 1-6 аминокислотных остатков, таких как 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков, добавленных на амино-конце, на карбокси-конце или как на амино-конце, так и на карбокси-конце ISV.

В целях сравнения двух или более нуклеотидных последовательностей процент «идентичности последовательности» между первой нуклеотидной последовательностью и второй нуклеотидной последовательностью можно рассчитать путем деления [числа нуклеотидов в первой нуклеотидной последовательности, которые идентичны нуклеотидам в соответствующие позиции во второй нуклеотидной последовательности] на [общее количество нуклеотидов в первой нуклеотидной последовательности] и умножения на [100%], при этом каждая делеция, вставка, замена или добавление нуклеотида во второй нуклеотидной последовательности (по сравнению с первой нуклеотидной последовательностью) рассматривается как различие в одном нуклеотиде (положении). Альтернативно, степень идентичности последовательностей между двумя или более нуклеотидными последовательностями может быть рассчитана с использованием известного компьютерного алгоритма для выравнивания последовательностей, такого как, например, NCBI Blast v2.0, используя стандартные настройки. Некоторые другие методы, компьютерные алгоритмы и настройки для определения степени идентичности последовательности, например, описаны в WO 04/037999, EP 0967284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 и GB 2357768. Обычно, с целью определения процента «идентичности последовательности» между двумя нуклеотидными последовательностями в соответствии со способом вычисления, описанным выше, нуклеотидная последовательность с наибольшим числом нуклеотидов будет принята за «первую» нуклеотидную последовательность, а другая нуклеотидная последовательность будет принята за «вторую» нуклеотидную последовательность.

В целях сравнения двух или более аминокислотных последовательностей процент «идентичности последовательности» между первой аминокислотной последовательностью и второй аминокислотной последовательностью (также называемой в данном документе «аминокислотной идентичностью») может быть рассчитан путем деления [числа аминокислотных остатков в первой аминокислотной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в соответствующих положениях во второй аминокислотной последовательности] на [общее количество аминокислотных остатков в первой аминокислотной последовательности] и умножения на [100%], при этом каждая делеция, вставка, замена или добавление аминокислотного остатка во второй аминокислотной последовательности - по сравнению с первой аминокислотной последовательностью - рассматривается как различие в одном аминокислотном остатке (положении), т.е. как «различие аминокислот», как определено в данном документе. Альтернативно, степень идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями может быть рассчитана с использованием известного компьютерного алгоритма, такого как упомянутые выше, для определения степени идентичности последовательности для нуклеотидных последовательностей, опять же с использованием стандартных настроек. Обычно, с целью определения процента «идентичности последовательности» между двумя аминокислотными последовательностями в соответствии с методом вычисления, описанным выше, аминокислотная последовательность с наибольшим количеством аминокислотных остатков будет принята за «первую» аминокислотную последовательность, а другая аминокислотная последовательность будет принята за «вторую» аминокислотную последовательность.

Кроме того, при определении степени идентичности последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями специалист в данной области может принять во внимание так называемые «консервативные» аминокислотные замены, которые обычно могут быть описаны как аминокислотные замены, в которых аминокислотный остаток изменен на другой аминокислотный остаток с аналогичной химической структурой, который мало или практически не влияет на функцию, активность или другие биологические свойства полипептида. Такие консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области, например, из WO 04/037999, GB 335768, WO 98/49185, WO 00/46383 и WO 01/09300; и (предпочтительные) типы и/или комбинации таких замен могут быть выбраны на основе соответствующих принципов, например, из WO 04/037999 или, например, WO 98/49185 и из приведенных там дополнительных источников.

Такие консервативные замены предпочтительно представляют собой замены, в которых одна аминокислота в следующих группах (а) - (е) замещена другим аминокислотным остатком в той же группе: (а) небольшие алифатические, неполярные или слегка полярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (b) полярные отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; (c) полярные положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (d) большие алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys; и (е) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются следующие: Ala в Gly или в Ser; Arg в Lys; Asn в Gln или в His; Asp в Glu; Cys в Ser; Gln в Asn; Glu в Asp; Gly в Ala или в Pro; His в Asn или в Gln; Ile в Leu или в Val; Leu в Ile или в Val; Lys в Arg, в Gln или в Glu; Met в Leu, в Tyr или в Ile; Phe в Met, в Leu или в Tyr; Ser в Thr; Thr в Ser; Trp в Tyr; Tyr в Trp; и/ или Phe в Val, в Ile или в Leu.

Любые аминокислотные замены, применяемые к полипептидам, описанным в данном документе, также могут быть основаны на анализе частот вариаций аминокислот между гомологичными белками различных видов, такими как, например, разработанный Schulz et al. («Principles of Protein Structure», Springer-Verlag, 1978), относительно анализов структурообразующих потенциалов, разработанных, например, Chou and Fasman (Biochemistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978), и на анализе паттернов гидрофобности в белках, разработанном, например, Eisenberg et al. (Proc. Natl. Акад. USA 81: 140-144, 1984), Kyte and Doolittle (J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981) или Goldman et al. (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986), все они включены в данный документ в полном объеме ссылкой. Информация о первичной, вторичной и третичной структуре нанотел дана в описании в данном документе и в общем уровне техники, указанном выше. Кроме того, для этой цели кристаллическая структура домена VHH из ламы, например, приведена Desmyter et al. (Nature Structural Biology, 3: 803, 1996), Spinelli et al. (Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996) или Decanniere et al. (Structure, 7 (4): 361, 1999). Дополнительную информацию о некоторых аминокислотных остатках, которые в обычных доменах VH образуют интерфейс VH/VL, и потенциальных верблюжьих заменах в этих положениях, можно найти в известном уровне техники, указанном выше.

Считается, что аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот являются «абсолютно одинаковыми», если они имеют 100% идентичность последовательностей (как определено в данном документе) по всей их длине.

При сравнении двух аминокислотных последовательностей термин «различие по аминокислоте(ам)» относится к вставке, делеции или замене одного аминокислотного остатка в положении первой последовательности по сравнению со второй последовательностью; следует понимать, что две аминокислотные последовательности могут содержать одно, два или более таких аминокислотных различий. Более конкретно, в аминокислотных последовательностях и/или полипептидах по настоящему изобретению термин «различие между аминокислотами» относится к вставке, делеции или замене одного аминокислотного остатка в положении последовательности CDR, указанной в b), d) или f) по сравнению с последовательностью CDR соответственно а), с) или е); следует понимать, что последовательность CDR b), d) и f) может содержать одно, два, три, четыре или максимум пять таких различий по аминокислотам по сравнению с последовательностью CDR соответственно а), с) или е).

«Различие(я) по аминокислоте(ам)» может представлять собой любую одну, две, три, четыре или максимум пять замен, делеций или вставок или любую их комбинацию, которые улучшают свойства агента, связывающего аггрекан по изобретению, такого как полипептид по изобретению, или которые по меньшей мере не слишком сильно умаляют желательные свойства или баланс или комбинацию желательных свойств агента, связывающего аггрекан по изобретению, такого как полипептид по изобретению. В этом отношении результирующий агент по изобретению, связывающий аггрекан, такой как полипептид по изобретению, должен по меньшей мере связывать аггрекан с такой же, примерно одинаковой или более высокой аффинностью по сравнению с полипептидом, содержащим одну или несколько последовательностей CDR без одной, двух, трех, четырех или максимум пять замен, делеций или вставок, где указанная аффинность измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

В этом отношении аминокислотная последовательность CDR в соответствии с b), d) и/или f) может представлять собой аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности в соответствии с a), c) и/или e), соответственно, посредством созревания аффинности с использованием одной или нескольких известных технологий созревания аффинности по существу.

Например, и в зависимости от организма-хозяина, используемого для экспрессии полипептида по изобретению, такие делеции и/или замены могут быть сконструированы таким образом, что один или несколько сайтов для посттрансляционной модификации (такие как один или несколько сайтов гликозилирования) удаляются, что будет в пределах компетенции специалиста в данной области.

«Семейство нанотел», «семейство VHH» или «семейство», используемое в настоящем описании, относится к группе последовательностей нанотел и/или VHH, которые имеют одинаковую длину (т.е. они имеют одинаковое количество аминокислот в своей последовательности), и из которых аминокислотная последовательность между положением 8 и положением 106 (согласно нумерации по Kabat) имеет идентичность аминокислотной последовательности 89% или более.

Термины «эпитоп» и «антигенная детерминанта», которые можно использовать взаимозаменяемо, относятся к части макромолекулы, такой как полипептид или белок, который распознается антигенсвязывающими молекулами, такими как иммуноглобулины, обычные антитела, ISV и/или или полипептиды по изобретению и, более конкретно, антигенсвязывающим сайтом указанных молекул. Эпитопы определяют минимальный сайт связывания иммуноглобулина и, таким образом, представляют собой мишень специфичности иммуноглобулина.

Часть антигенсвязывающей молекулы (такой как иммуноглобулин, обычное антитело, ISV и/или полипептид по изобретению), которая распознает эпитоп, называется «паратопом».

Аминокислотная последовательность (такая как ISV, антитело, полипептид по изобретению или, как правило, антигенсвязывающий белок или полипептид или их фрагмент), которая может «связываться» или «специфически связываться», которая «имеет аффинность к» и/или которая «обладает специфичностью» к определенному эпитопу, антигену или белку (или по меньшей мере к одной его части, фрагменту или эпитопу), называется «против» или «направлена против» указанного эпитопа, антигена или белка или является «связывающей» молекулой по отношению к такому эпитопу, антигену или белку, или, упоминается как «анти»-эпитоп, «анти»-антиген или «анти»-белок (например, «анти»-аггрекан).

Аффинность обозначает силу или стабильность молекулярного взаимодействия. Аффинность обычно задается как K_D, или константа диссоциации, которая имеет единицы моль/литр (или М). Аффинность также может быть выражена как константа ассоциации K_A, которая равна 1/K_D и имеет единицы (моль/литр)^-1 (или M^-1). В настоящем описании стабильность взаимодействия между двумя молекулами будет в основном выражаться через значение K_D их взаимодействия; специалисту в данной области техники ясно, что с учетом отношения K_A = 1/K_D, определение силы молекулярного взаимодействия по его значению K_D также может быть использовано для вычисления соответствующего значения K_A. Значение K_D характеризует силу молекулярного взаимодействия также в термодинамическом смысле, поскольку оно связано с изменением свободной энергии (DG) связывания с помощью хорошо известного соотношения DG=RT.ln(K_D) (эквивалентно DG=-RT.ln(K_A)), где R - газовая постоянная, T - абсолютная температура, а ln - натуральный логарифм.

K_D для биологических взаимодействий, которые считаются значимыми (например, специфическими), обычно находятся в диапазоне от 10^-12 М (0,001 нМ) до 10^-5 М (10000 нМ). Чем сильнее взаимодействие, тем ниже его K_D.

K_D также можно выразить как отношение константы скорости диссоциации комплекса, обозначенной как k_off, к скорости его ассоциации, обозначенной как k_on (так что K_D = k_off/k_on и K_A = k_on/k_off). Скорость диссоциации K_off имеет единицу измерения с^-1 (где с - это единица измерения СИ для секунды). Скорость ассоциации k_on есть единицы M^-1с^-1. Скорость ассоциации может варьировать от 10² M^-1с^-1 до примерно 10⁷ M^-1с^-1, приближаясь к диффузионно-ограниченной константе скорости ассоциации для бимолекулярных взаимодействий. Скорость диссоциации связана с периодом полувыведения данного молекулярного взаимодействия соотношением t_1/2 = ln (2)/k_off. Скорость дисооциации может варьировать от 10^-6с^-1 (около необратимого комплекса с t_1/2 нескольких дней) до 1 с^-1 (t_1/2 = 0,69 с).

Специфическое связывание антигенсвязывающего белка, такого как ISVD, с антигеном или антигенной детерминантой может быть определено любым подходящим способом, известным по существу, включая, например, анализы связывания с насыщением и/или анализы конкурентного связывания, такие как радиоиммуноанализы (RIA), иммуноферментные анализы (EIA) и сэндвич-конкурентные анализы и их различные варианты, известные по существу в данной области; и другие методы, упомянутые в данном документе.

Аффинность молекулярного взаимодействия между двумя молекулами может быть измерено различными способами, известными по существу, такими как хорошо известный биосенсорный метод поверхностного плазмонного резонанса (см. например, Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559), где одна молекула иммобилизована на чипе биосенсора, а другая молекула пропускается над иммобилизованной молекулой в условиях потока, что дает измерения k_on, K_off и, следовательно, значения K_D (или K_A). Это может быть выполнено, например, с использованием хорошо известных инструментов BIACORE® (Pharmacia Biosensor AB, Упсала, Швеция). Анализ кинетического исключения (KINEXA®) (Drake et al. 2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43) измеряет события связывания в растворе без мечения партнеров связывания и основывается на кинетическом исключении диссоциации комплекса. Анализ аффинности в растворе также можно проводить с использованием системы иммуноанализа GYROLAB®, которая обеспечивает платформу для автоматического биоанализа и быстрого анализа образцов (Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74) или ELISA.

Специалисту также будет понятно, что измеренный K_D может соответствовать кажущемуся K_D, если процесс измерения каким-либо образом влияет на внутреннюю аффинность связывания подразумеваемых молекул, например, из-за артефактов, связанных с покрытием на биосенсоре одной молекулы. Кроме того, кажущийся K_D может быть измерен, если одна молекула содержит более одного сайта узнавания для другой молекулы. В такой ситуации на измеренную аффинность может влиять авидность взаимодействия двух молекул. В частности, точное измерение KD может быть довольно трудоемким, и, как следствие, часто значения кажущегося KD определяются для оценки силы связывания двух молекул. Следует отметить, что до тех пор, пока все измерения выполняются согласованным образом (например, сохраняя неизменными условия анализа), измерения кажущегося KD можно использовать как приближение к истинному K_D, и, следовательно, в данном документе следует рассматривать KD и кажущееся KD с равной важностью или актуальностью.

Термин «специфичность» относится к числу различных типов антигенов или антигенных детерминант, с которыми может связываться конкретная антигенсвязывающая молекула или антигенсвязывающий белок (такой как ISVD или полипептид по изобретению). Специфичность антигенсвязывающего белка может быть определена на основе аффинности и/или авидности, например, как описано на страницах 53-56 WO 08/020079 (включена в настоящее описание ссылкой), которая также описывает некоторые предпочтительные методики для измерения связывания между антигенсвязывающей молекулой (такой как полипептид или ISVD по изобретению) и соответствующим антигеном. Как правило, антигенсвязывающие белки (такие как ISVD и/или полипептиды по изобретению) будут связываться со своим антигеном с константой диссоциации (K_D) от 10^-5 до 10^-12 моль/л или менее и предпочтительно 10^-7 до 10^-12 моль/литр или менее и более предпочтительно от 10^-8 до 10^-12 моль/литр (то есть с константой ассоциации (К_А) от 10⁵ до 10¹² л/моль или более, и предпочтительно от 10⁷ до 10¹² л/моль или более, а более предпочтительно от 10⁸ до 10¹² л/моль). Обычно считается, что любое значение K_D выше 10^-4 моль/литр (или любое значение K_A ниже 10⁴ л/моль) указывает на неспецифическое связывание. Предпочтительно, одновалентный ISVD по изобретению будет связываться с желаемым антигеном с аффинностью менее 500 нМ, предпочтительно менее 200 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, например, менее 500 пМ, например, от 10 до 5 пМ или меньше. Также отсылаем к пункту n) на страницах 53-56 в WO 08/020079.

Считается, что ISV и/или полипептид являются «специфичными» для (первой) мишени или антигена по сравнению с другой (второй) мишенью или антигеном, когда связывается с первым антигеном с аффинностью (как описано выше, и соответственно выражается как значение K_D, значение K_A, скорость K_off и/или скорость K_on), которая по меньшей мере в 10 раз, например по меньшей мере в 100 раз и предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз или более лучше, чем аффинность, с которой ISVD и/или полипептид связывается со второй мишенью или антигеном. Например, ISVD и/или полипептид может связываться с первой мишенью или антигеном со значением K_D, которое по меньшей мере в 10 раз меньше, например, по меньшей мере в 100 раз меньше, и предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз меньше или даже меньше, чем, чем K_D, с которым указанный ISV и/или полипептид связывается со второй мишенью или антигеном. Предпочтительно, когда ISV и/или полипептид является «специфичным для» первой мишени или антигена по сравнению со второй мишенью или антигеном, он направлен против (как определено в данном документе) указанной первой мишени или антигена, но не направлен против указанной второй мишени или антигена.

Специфическое связывание антигенсвязывающего белка с антигеном или антигенной детерминантой может быть определено любым подходящим способом, известным по существу , включая, например, анализы связывания с насыщением и/или анализы конкурентного связывания, такие как радиоиммуноанализ (RIA), иммуноферментный анализ (EIA) и различные его варианты, известные в данной области; и другие методы, упомянутые в данном документе.

Предпочтительным подходом, который можно использовать для оценки аффинности, является процедура двухстадийного ELISA (иммуноферментного анализа) Friguet et al. 1985 (J. Immunol. Methods 77: 305-19). Этот способ устанавливает измерение равновесного связывания фазы раствора и позволяет избежать возможных артефактов, связанных с адсорбцией одной из молекул на подложке, такой как пластик. Как будет понятно специалисту в данной области, константа диссоциации может быть фактической или кажущейся константой диссоциации. Способы определения константы диссоциации будут понятны специалисту в данной области и, например, включают методики, упомянутые на страницах 53-56 в WO 08/020079.

Наконец, следует отметить, что во многих ситуациях опытный ученый может посчитать удобным определить аффинность связывания относительно некоторой стандартной молекулы. Например, чтобы оценить силу связывания между молекулами А и В, можно, например, использовать стандартную молекулу C, которая, как известно, связывается с B и которая соответствующим образом помечена флуорофорной или хромофорной группой или другим химическим фрагментом, таким как биотин, для легкого обнаружения в ELISA или FACS (флуоресцентно-активируемая сортировка клеток) или в другом формате (флуорофор для определения флуоресценции, хромофор для определения поглощения света, биотин для стрептавидин-опосредованного определения ELISA). Как правило, стандартную молекулу C поддерживают при фиксированной концентрации, и концентрация A варьируется для данной концентрации или количестве B. В результате получается значение IC₅₀, соответствующее концентрации A, при которой измеряется сигнал для C в отсутствие А, уменьшается вдвое. При условии, что K_D ref, K_D стандартной молекулы, известен, а также общая концентрация Cref стандартной молекулы, кажущийся K_D для взаимодействия A-B можно получить из следующей формулы: K_D =IC₅₀/(1+c_ref/ K_Dref). Обратите внимание, что если c_ref << K_D _ref, K_D ≈ IC₅₀. При условии, что измерение IC₅₀ выполняется согласованным образом (например, сохранение cref фиксированным) для сравниваемых связующих, различие в силе или стабильности молекулярного взаимодействия может быть оценено путем сравнения IC₅₀, и это измерение оценивается как эквивалентное K_D или кажущемуся K_D по всему тексту.

Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC₅₀) также может быть мерой эффективности соединения в ингибировании биологической или биохимической функции, например, фармакологического эффекта. Эта количественная мера показывает, сколько полипептида или ISV (например, нанотела) необходимо для ингибирования данного биологического процесса (или компонента процесса, т.е. фермента, клетки, клеточного рецептора, хемотаксиса, анаплазии, метастазирования, инвазивности и т.д.) вдвое. Другими словами, это половина максимальной (50%) ингибирующей концентрации (IC) вещества (50% IC или IC₅₀). Значения IC₅₀ могут быть рассчитаны для данного антагониста, такого как полипептид или ISV (например, нанотела) по изобретению, путем определения концентрации, необходимой для ингибирования половины максимального биологического ответа агониста. K_D лекарственного средства может быть определено путем построения кривой доза-эффект и изучения влияния различных концентраций антагониста, такого как полипептид или ISV (например, нанотел) по настоящему изобретению, на изменение активности агониста.

Термин половинная максимальная эффективная концентрация (ЕС₅₀) относится к концентрации соединения, которая вызывает реакцию на полпути между исходным уровнем и максимумом после определенного времени воздействия. В настоящем контексте этот термин используется в качестве меры активности полипептида, ISV (например, нанотела). ЕС₅₀ кривой постепенного изменения дозы представляет собой концентрацию соединения, при которой наблюдается 50% его максимального эффекта. Концентрация предпочтительно выражается в молярных единицах.

В биологических системах небольшие изменения в концентрации лиганда обычно приводят к быстрым изменениям ответа, исходя из сигмоидальной функции. Точка перегиба, в которой увеличение реакции с увеличением концентрации лиганда начинает замедляться, - это EC₅₀. Она может быть определена математически путем выведения наиболее подходящей линии. Полагаться на график для оценки удобно в большинстве случаев. В случае если EC₅₀ указан в разделе примеров, эксперименты были разработаны так, чтобы максимально точно отразить K_D. Другими словами, значения EC₅₀ могут затем рассматриваться как значения K_D. Термин «средний K_D» относится к среднему значению K_D, полученному по меньшей мере в 1, но предпочтительно более чем в 1, например по меньшей мере в 2 экспериментах. Термин «средний» относится к математическому термину «средний» (суммы данных, деленные на количество элементов в данных).

Это также относится к IC₅₀, который является мерой ингибирования соединения (ингибирование 50%). Для анализов конкурентного связывания и анализов функциональных антагонистов IC₅₀ является наиболее распространенным суммарным показателем кривой доза-ответ. Для анализов агонистов/стимуляторов наиболее распространенной суммарной мерой является EC₅₀.

Константа ингибирования (Ki) является показателем того, насколько сильным является ингибитор; это концентрация, необходимая для получения половины максимального ингибирования. В отличие от IC₅₀, который может изменяться в зависимости от условий эксперимента, K_i является абсолютной величиной и часто упоминается как константа ингибирования лекарственного средства. Константу ингибирования K_i можно рассчитать с использованием уравнения Ченга-Прусоффа:

в котором [L] является фиксированной концентрацией лиганда.

Считается, что ISV и/или полипептид являются «специфичными» для (первой) мишени или антигена по сравнению с другой (второй) мишенью или антигеном, когда он связывается с первым антигеном с аффинностью (как описано выше, и соответственно выражается как значение K_D, значение K_A, скорость K_off и/или скорость K_on), которая по меньшей мере в 10 раз, например по меньшей мере в 100 раз и предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз или более лучше, чем аффинность, с которой ISV и/или полипептид связывается со второй мишенью или антигеном. Например, ISV и/или полипептид может связываться с первой мишенью или антигеном со значением K_D, которое по меньшей мере в 10 раз меньше, например, по меньшей мере в 100 раз меньше, и предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз меньше или даже меньше, чем, чем K_D, с которым указанный ISV и/или полипептид связывается со второй мишенью или антигеном. Предпочтительно, когда ISV и/или полипептид является «специфичным для» первой мишени или антигена по сравнению со второй мишенью или антигеном, он направлен против (как определено в данном документе) указанной первой мишени или антигена, но не направлен против указанной второй мишени или антигена.

Термины «(перекрестная) блокировка», «(перекрестно) блокированный», «(перекрестное) блокирование», «конкурентное связывание», «(перекрестно)-конкурировать», «(перекрестно)-конкурирующий» и «(перекрестная) конкуренция» используемые взаимозаменяемо в данном документе, означают способность иммуноглобулина, антитела, иммуноглобулинового одиночного вариабельного домена, полипептида или другого связывающего агента вмешиваться в связывание других иммуноглобулинов, антител, иммуноглобулиновых одиночных вариабельных доменов, полипептидов или связывающих агентов с заданной мишенью. Степень, в которой иммуноглобулин, антитело, ISV, полипептид или другой связывающий агент способны влиять на связывание другого с мишенью, и, следовательно, можно ли сказать, что он перекрестно блокируется в соответствии с изобретением, может определяться с помощью конкурентных анализов, которые общеизвестны в данной области. Особенно подходящие количественные анализы перекрестной блокировки включают ELISA и анализ связывания с активированной флуоресценцией (FACS) с аггреканом, экспрессированным на клетках. В настройках FACS степень (перекрестного) блокирования может быть измерена по (уменьшенной) флуоресценции канала.

Способы определения того, способен ли иммуноглобулин, антитело, ISV, полипептид или другой связывающий агент, направленный против мишеней (перекрестно)-блокировать, конкурентно связывается или является (перекрестно)-конкурирующим, как определено в данном документе, например, описаны в Xiao-Chi Jia et al. (Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004), Miller et al. (Journal of Immunological Methods 365: 118-125, 2011) и/или способах, описанных в данном документе (см., например, Пример 2.3).

Говорят, что аминокислотная последовательность является «перекрестно-реактивной» для двух разных антигенов или антигенных детерминант (таких как, например, аггрекан от различных видов млекопитающих, таких как, например, аггрекан человека, аггрекан собаки, аггрекан коровы, аггрекан крысы, аггрекан свиньи, аггрекан мыши, аггрекан кролика, аггрекан яванского макака и/или аггрекан макака-резуса), если он специфичен (как определено в данном документе) к этим различным антигенам или антигенным детерминантам.

В контексте настоящего изобретения «модулирование» или «модуляция» обычно означает снижение или ингибирование активности представителя семейства сериновых протеаз, катепсинов, матриксных металлопротеиназ (ММР)/матриксинов или дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивом тромбоспондина (ADAMTS), предпочтительно MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5 (аггреканазы-2), ADAMTS4 (аггреканазы-1), ADAMTS11 и/или провоспалительных цитокинов, такие как, например, интерлейкин-1α и -β, интерлейкина-6 и TNF-α с помощью ISV, полипептида или конструкции по изобретению, измеренное с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа, анализа ex vivo или in vivo (например, упомянутые в данном документе). В частности, «модулирование» или «модулировать» может означать либо уменьшение, либо ингибирование активности вышеупомянутых представителей, измеренную с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа, анализа ex vivo или in vivo (такого как упомянутые в данном документе) по меньшей мере на 1%, предпочтительно по меньшей мере 5%, например по меньшей мере 10% или по меньшей мере 25%, например по меньшей мере на 50% по меньшей мере на 60% по меньшей мере на 70% по меньшей мере на 80% или на 90% или более, по сравнению с активностью вышеупомянутых представителей в том же анализе в тех же условиях, но без присутствия иммуноглобулина или полипептида по изобретению.

В контексте настоящего изобретения «усиление» или «усилить» обычно означает увеличение, потенциирование или стимуляцию активности полипептидов или конструкций по изобретению, измеренное с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа, анализа ex vivo или in vivo (такого как упомянутые в данном документе). В частности, повышение или усиление активности полипептида или конструкции по изобретению, как измерено с использованием подходящего анализа in vitro, клеточного анализа, анализа ex vivo или in vivo (такого как упомянутые в данном документе) по меньшей мере на 5%, предпочтительно по меньшей мере 10%, минимум 15%, минимум 20%, минимум 25%, минимум 30%, минимум 35%, минимум 40%, минимум 45%, минимум 50%, минимум 55%, минимум 60% по меньшей мере 65% по меньшей мере 70% по меньшей мере 75% по меньшей мере 80% по меньшей мере 85% по меньшей мере 90% по меньшей мере 95% или более, например, 100%, по сравнению с активностью конструкции или полипептида в том же анализе в тех же условиях, но без присутствия агента, связывающего аггрекан, например, ISV, связывающего аггрекан, по изобретению.

«Синергетический эффект» двух соединений представляет собой эффект, при котором эффект комбинации двух агентов больше, чем сумма их индивидуальных эффектов, и предпочтительно статистически отличается от стандарта и отдельных лекарственных средств.

Используемый в данном документе термин «активность» ISV или полипептида по изобретению является функцией количества ISV или полипептида по изобретению, необходимого для его специфического эффекта, такого как, например, проникновение в хрящ, специфическое связывание с аггреканом и/или удержание в хряще. Ее можно измерить просто способами, известными специалисту в данной области, и, например, такими, которые используются в разделе Примеров.

Напротив, «эффективность» ISV или полипептида по изобретению измеряет максимальную силу самого эффекта при насыщении концентраций ISV или полипептида. Эффективность указывает на максимальный ответ, достижимый от ISV или полипептида по изобретению. Это относится к способности ISV или полипептида производить желаемый (терапевтический) эффект, такой как, например, связывание с аггреканом или удержание аггрекана и/или ингибирование активности представителя семейства ADAMTS или представителя семейства MMP.

«Период полувыведения» полипептида или конструкции по изобретению относится ко времени, которое требуется для снижения концентрации сыворотки конструкции или полипептида на 50% in vivo, например, из-за деградации конструкции или полипептида и/или клиренса или секвестрации конструкции или полипептида с помощью природных механизмов, см., например, абзац о) на стр. 57 в WO 08/020079. Период полувыведения in vivo конструкции или полипептида по изобретению может быть определен любым известным способом, таким как фармакокинетический анализ. Подходящие методики будут понятны специалисту в данной области техники и могут, например, в целом соответствовать описанному в абазце о) на странице 57 в WO 08/020079. Как также упомянуто в абзаце o) на странице 57 в WO 08/020079, период полувыведения может быть выражен с использованием таких параметров, как t1/2-альфа, t1/2-бета и площадь под кривой (AUC). Источниками могут служить, например, стандартные справочники, такие как Kenneth et al. (Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, John Wiley & Sons Inc, 1986) и M Gibaldi and D Perron ("Pharmacokinetics", Marcel Dekker, 2^nd Rev. Edition, 1982). Термины «увеличение периода полувыведения» или «увеличенный период полувыведения» относятся к увеличению t1/2-бета, либо с увеличением или без увеличения t1/2-альфа и/или AUC, либо с обоими, например, как описано в абзаце о) на стр. 57 в WO 08/020079.

Если не указано иное, термины «иммуноглобулин» и «последовательность иммуноглобулина» - вне зависимости, используются ли они в данном документе для обозначения антитела, состоящего только из тяжелых цепей, или обычного антитела с 4 цепями - используются в качестве общего термина для включения как полноразмерного антитела, так и его отдельных цепей, а также всех частей, доменов или их фрагментов (включая, без ограничения указанным, антигенсвязывающие домены или фрагменты, такие как домены VHH или домены VH/VL, соответственно).

Используемый в данном документе термин «домен» (полипептида или белка) относится к структуре свернутого белка, которая обладает способностью сохранять свою третичную структуру независимо от остальной части белка. Как правило, домены ответственны за дискретные функциональные свойства белков, и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без потери функции остальной части белка и/или домена.

Используемый в данном документе термин «иммуноглобулиновый домен» относится к глобулярной области цепи антитела (такой как, например, цепь обычного 4-цепочечного антитела или антитела тяжелой цепи) или к полипептиду, который по существу состоит из такой глобулярной области. Иммуноглобулиновые домены характеризуются тем, что они сохраняют иммуноглобулиновое сворачивание, характерное для молекул антител, которое представлено двухслойным сэндвича из около семи антипараллельных бета-нитей, расположенных в двух бета-листах, необязательно стабилизированных консервативной дисульфидной связью.

Используемый в данном документе термин «иммуноглобулиновый вариабельный домен» означает иммуноглобулиновый домен, по существу состоящий из четырех «каркасных областей», которые упоминаются в данной области и в данном документе ниже как «каркасная область 1» или «FR1»; как «каркасная область 2» или «FR2»; как «каркасная область 3» или «FR3»; и как «каркасная область 4» или «FR4», соответственно; при этом каркасные области прерываются тремя «определяющими комплементарность областями» или «CDR», которые упоминаются в данной области и ниже, как «область 1 определения комплементарности» или «CDR1»; как «область 2 определения комплементарности» или «CDR2»; и как «область 3 определения комплементарности» или «CDR3», соответственно. Таким образом, общая структура или последовательность вариабельного домена иммуноглобулина может быть указана следующим образом: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Он является вариабельным доменом (или доменами) иммуноглобулина, который придает специфичность антитела к антигену, поскольку заключает в себе антигенсвязывающий сайт.

Термин «иммуноглобулиновый одиночный вариабельный домен» («ISV» или «ISVD»), взаимозаменяемо используемый с «одиночным вариабельным доменом», определяет молекулы, в которых сайт связывания антигена присутствует и образован одиночным иммуноглобулиновым доменом. Это ставит ISV отдельно от «обычных» иммуноглобулинов или их фрагментов, в которых два иммуноглобулиновых домена, в частности два вариабельных домена, взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего сайта. Как правило, в обычных иммуноглобулинах вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) взаимодействуют с образованием сайта связывания антигена. В этом случае определяющие комплементарность области (CDR) как VH, так и VL, будут способствовать созданию сайта связывания антигена, т.е. в создании антигенсвязывающего сайта будет задействовано в общей сложности 6 CDR.

Ввиду вышеприведенного определения антигенсвязывающий домен обычного антитела из 4 цепей (такого как молекула IgG, IgM, IgA, IgD или IgE; известного в данной области) или фрагмента Fab, фрагмента F(ab')2, фрагмента Fv, такого как связанный с дисульфидом Fv или scFv-фрагмент, или диатела (все известные в данной области), полученный из такого обычного антитела из 4 цепей, обычно не считаются иммуноглобулиновым одиночным вариабельным доменом, поскольку, в этих случаях, связывание с соответствующим эпитопом антигена обычно осуществляется не одним (одиночным) иммуноглобулиновым доменом, а парой (ассоциированных) доменов иммуноглобулина, таких как вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, т.е. с помощью VH-VL-пары иммуноглобулиновых доменов, которые совместно связываются с эпитопом соответствующего антигена.

Напротив, ISV способны специфически связываться с эпитопом антигена без спаривания с дополнительным иммуноглобулиновым вариабельным доменом. Сайт связывания ISV образован одним доменом VH/VHH или VL. Следовательно, сайт связывания антигена ISV образуется не более чем тремя CDR.

Таким образом, одиночный вариабельный домен может представлять собой последовательность вариабельной области легкой цепи (например, VL- последовательность) или ее подходящий фрагмент; или последовательность вариабельной области тяжелой цепи (например, VH-последовательность или VHH-последовательность) или ее подходящий фрагмент; поскольку такой домен способен образовывать одиночную антигенсвязывающую единицу (т.е. функциональную антигенсвязывающую единицу, которая по существу состоит из одного вариабельного домена, так что одному антигенсвязывающему домену не требуется взаимодействовать с другим вариабельным доменом для образования функциональной антигенсвязывающей единицы).

В одном воплощении изобретения ISV представляют собой последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (например, VH-последовательность); более конкретно, иммуноглобулиновые одиночные вариабельные домены могут представлять собой последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, которые получены из обычного четырехцепочечного антитела, или последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, которые получены из антитела на основе только тяжелой цепи.

Например, иммуноглобулиновый одиночный вариабельный домен может быть антителом из (одиночного) домена (или аминокислотой, подходящей для применения в качестве антитела из (одиночного) домена), «dAb» или dAb (или аминокислотой, которая подходит для применения в качестве dAb) или нанотелом (как определено в данном документе и включая, без ограничения указанным, VHH); другими одиночными вариабельными доменами или любым подходящим фрагментом любого из них.

В частности, иммуноглобулиновый одиночный вариабельный домен может быть Нанотелом® (как определено в данном документе) или его подходящим фрагментом. [Примечание: Нанотело® и Нанотела® являются зарегистрированными товарными знаками Ablynx N.V.]. Для общего описания нанотел настоящим можно сослаться на последующее описание, а также на предшествующий уровень техники, упомянутый в данном документе, например, описанный в WO 08/020079 (стр. 16).

«VHH-домены», также известные как VHH, VHH-домены, антительные фрагменты VHH и VHH-антитела, первоначально были описаны как антигенсвязывающий иммуноглобулиновый (вариабельный) домен «антител, состоящих только из тяжелой цепи» (т.е. «антител, лишенных легких цепей», Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993). Термин «домен VHH» был выбран для того, чтобы отличать эти вариабельные домены от вариабельных доменов тяжелой цепи, которые присутствуют в обычных антителах из 4 цепей (которые упоминаются в данном документе как «V_H-домены» или «VH-домены») и от вариабельных доменов легкой цепи, которые присутствуют в обычных антителах из 4 цепей (которые называются в данном документе «V_L-доменами» или «VL-доменами»). Дальнейшее описание VHH и нанотел см. в обзорной статье Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001), а также в следующих патентных заявках, которые упоминаются в качестве предшествующего уровня техники: WO 94/04678, WO 95/04079 и WO 96/34103 от Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 и WO 02/48193 от Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 и WO 03/055527 от Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 от Algonomics N.V. и Ablynx N.V.; WO 01/90190 от Национального исследовательского совета Канады; WO 03/025020 (= EP 1433793) от Института антител; и WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 и WO 06/122825 от Ablynx N.V. и дальнейших опубликованных патентных заявках от Ablynx N.V. Также можно сделать отсылку на дополнительный предшествующий уровень техники, упомянутый в этих заявках и, в частности, на список литературы, упомянутый на страницах 41-43 Международной заявки WO 06/040153, перечень и источники которой включены в данный документ ссылкой. Как описано в этих источниках, ISV, нанотела (в частности, последовательности VHH и частично гуманизированные нанотела), в частности, могут быть охарактеризованы наличием одного или нескольких «характерных остатков» в одной или нескольких каркасных последовательностях. Дальнейшее описание ISV, нанотел, включая гуманизацию и/или оверблюживание нанотел, а также другие модификации, части или фрагменты, производные или «молекулы на основе слияния с нанотелами», мультивалентные конструкции (включая некоторые неограничивающие примеры линкерных последовательностей) и различные модификации для увеличения периода полувыведения ISV, нанотел и их составов с ними, можно найти, например, в WO 08/101985 и WO 08/142164. Для дальнейшего общего описания нанотел настоящим ссылаемся на предшествующий уровень техники, процитированный в данном документе, такой как, например, описанный в WO 08/020079 (стр. 16).

«Доменные антитела», также известные как «Dab», «Доменные Антитела» и «dAb» (термины «Доменные Антитела» и «dAb», используются в качестве товарных знаков группой GlaxoSmithKline) были описаны, например, в EP 0368684, Ward et al. (Nature 341: 544-546, 1989), Holt et al. (Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003) и WO 03/002609, а также, например, в WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 и других опубликованных патентных заявках Domantis Ltd. Доменные антитела, по существу, соответствуют VH или VL-доменам млекопитающих, отличных от верблюдовых, в частности, из человеческих антител с 4 цепями. Для связывания эпитопа в качестве одиночного антигенсвязывающего домена, т.е. без сопряжения с VL или VH-доменом, соответственно, требуется специфический отбор таких антигенсвязывающих свойств, например, с использованием библиотек последовательностей одиночных VH- или VL-доменов человека. Доменные антитела имеют, подобно VHH, молекулярную массу от около 13 до около 16 кДа и, если они получены из полностью человеческих последовательностей, не требуют гуманизации, например, для терапевтического применения у людей.

Следует также отметить, что отдельные вариабельные домены могут быть получены из некоторых видов акул (например, так называемые «домены IgNAR», см. например, WO 05/18629), хотя это менее предпочтительно в контексте настоящего изобретения, поскольку они происходят не из млекопитающих.

Таким образом, по смыслу настоящего изобретения термин «иммуноглобулиновый одиночный вариабельный домен» или «одиночный вариабельный домен» включает полипептиды, которые получены из источника, не являющегося человеком, предпочтительно верблюда, предпочтительно верблюжьего антитела на основе только тяжелой цепи. Они могут быть гуманизированы, как описано выше. Кроме того, этот термин включает полипептиды, полученные из источников, не являющихся верблюдовыми, например, мыши или человека, которые были «оверблюжены», как, например, описано в Davies and Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475-479, 1995; Prot. Eng. 9: 531-537, 1996) и Riechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999).

Аминокислотные остатки домена VHH пронумерованы в соответствии с общей нумерацией для доменов VH, приведенной в Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), применительно к доменам VHH верблюдовых, как показано, например, на фигуре 2 в Riechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999). Альтернативные способы нумерации аминокислотных остатков доменов VH, которые также могут быть применены аналогичным образом к доменам VHH, известны в данной области. Однако в настоящем описании, пунктах формулы и фигурах, будет соблюдаться нумерация согласно Kabat применимая к доменам VHH, как описано выше, если не указано иное.

Следует отметить, что - как хорошо известно в данной области для доменов VH и для доменов VHH - общее количество аминокислотных остатков в каждом из CDR может изменяться и может не соответствовать общему количеству аминокислотных остатков, указанному нумерацией Kabat (т.е. одно или несколько положений в соответствии с нумерацией Kabat могут быть не заняты в реальной последовательности, или фактическая последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем число, допустимое нумерацией Kabat). Это означает, что, как правило, нумерация по Kabat может соответствовать или не соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в фактической последовательности. Общее количество аминокислотных остатков в домене VH и домене VHH обычно будет находиться в диапазоне от 110 до 120, часто от 112 до 115. Следует, однако, отметить, что менее и более длинные последовательности также могут быть пригодны для целей, описанных в данном документе.

Определение областей CDR также может быть выполнено в соответствии с различными способами. В определении CDR согласно Kabat FR1 из VHH включает аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 из VHH включает аминокислотные остатки в положениях 31-35, FR2 из VHH включает аминокислоты в положениях 36- 49, CDR2 из VHH включает аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 из VHH включает аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 из VHH включает аминокислотные остатки в положениях 95-102 и FR4 из VHH включает аминокислотные остатки в положениях 103-113.

Однако в настоящей заявке последовательности CDR были определены в соответствии с Kontermann и (Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51, 2010). Согласно этому способу FR1 включает аминокислотные остатки в положениях 1-25, CDR1 включает аминокислотные остатки в положениях 26-35, FR2 включает аминокислоты в положениях 36-49, CDR2 включает аминокислотные остатки в положениях 50-58, FR3 включает аминокислотные остатки в положениях 59-94, CDR3 включает аминокислотные остатки в положениях 95-102, а FR4 включает аминокислотные остатки в положениях 103-113 (по нумерации Kabat).

ISV, такие как доменные антитела и нанотела (включая домены VHH), могут быть подвергнуты гуманизации. В частности, гуманизированные иммуноглобулиновые одиночные вариабельные домены, такие как нанотела (включая VHH-домены), могут быть иммуноглобулиновыми одиночными вариабельными доменами, которые, как правило, определены в предыдущих абзацах, но в которых присутствует по меньшей мере один аминокислотный остаток (и, в частности по меньшей мере один из остатков каркаса), который является и/или соответствует гуманизирующей замене (как определено в данном документе). Потенциально полезные гуманизирующие замены могут быть установлены путем сравнения последовательности каркасных областей встречающейся в природе последовательности VHH с соответствующей каркасной последовательностью одной или нескольких близко родственных человеческих последовательностей VH, после чего одна или несколько из потенциально полезных гуманизирующих замен (или их комбинации), определенные таким образом, могут быть введены в указанную последовательность VHH (любым способом, известным по существу, как дополнительно описано в данном документе), и полученные гуманизированные последовательности VHH можно проверить на аффинность к мишени, на стабильность, на легкость и уровень экспрессии и/или на другие искомые свойства. Таким образом, с помощью ограниченной степени проб и ошибок другие подходящие гуманизирующие замены (или их подходящие сочетания) могут быть определены специалистом в данной области на основании раскрытого в данном документе описания. Кроме того, на основании вышеизложенного (каркасные области) иммуноглобулинового одиночного вариабельного домена, такого как Нанотело (включая домены VHH), могут быть частично гуманизированы или полностью гуманизированы.

ISV, такие как доменные антитела и Нанотела (включая домены VHH и гуманизированные домены VHH), также могут быть подвергнуты созреванию аффинности путем введения одного или нескольких изменений в аминокислотной последовательности одного или нескольких CDR, причем эти изменения приводят к улучшению аффинности полученного в результате иммуноглобулинового одиночного вариабельного домена к его соответствующему антигену по сравнению с соответствующей исходной молекулой. Молекулы иммуноглобулинновых одиночных вариабельных доменов с созревшей аффинностью по изобретению могут быть получены способами, известными в данной области, например, как описано Marks et al. (Biotechnology 10: 779-783, 1992), Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994), Shier et al. (Gene 169: 147-155, 1995), Yelton et al. (Immunol. 155: 1994-2004, 1995), Jackson et al. (J. Immunol. 154: 3310-9, 1995), Hawkins et al. (J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992), Johnson and Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996).

Процесс конструирования/выбора и/или получения полипептида, начиная с ISV, такого как доменное антитело или нанотело, также называют в данном документе «форматированием» указанного ISV; и считается, что ISV, который является частью полипептида, «отформатирован» или находится «в формате» указанного полипептида. Примеры способов, в которых может быть отформатирован ISV, и примеры таких форматов будут понятны специалисту в данной области на основе раскрытия в данном документе; и такой форматированный ISV образует дополнительный аспект изобретения.

Например, и без ограничения указанным, один или несколько иммуноглобулиновых одиночных вариабельных доменов можно использовать в качестве «связывающей единицы», «связывающего домена» или «структурного элемента» (эти термины используются взаимозаменяемо) для получения полипептида, который может необязательно содержит один или несколько дополнительных ISV, которые могут служить связывающей единицей (т.е. против того же или другого эпитопа на аггрекане и/или против одного или нескольких других антигенов, белков или мишеней, отличных от аггрекана).

Настоящее изобретение предлагает агенты, связывающие аггрекан, такие как ISV (также называемые в данном документе «ISV по изобретению») и/или полипептиды (также называемые в данном документе «полипептиды по изобретению»), которые обладают специфичностью и/или связывают аггрекан.

Аггрекан также известен как аггрекан 1, ACAN, AGC1, AGCAN, CSPGCP, MSK16, SEDK, хрящ-специфический протеогликановый основной белок (CSPCP) или хондроитинсульфат протеогликан 1 (CSPG1). Аггрекан у людей кодируется геном ACAN, который находится в хромосоме Chr 15: q26.1.

Аггрекан - большая мультимодульная молекула (2317 аминокислот). Его основной белок состоит из трех глобулярных доменов (G1, G2 и G3) и большой протяженной области (CS) между G2 и G3, к которой присоединено множество N-связанных олигосахаридов и хондроитинсульфатных цепей и кератансульфатных цепей. Аггрекан является основным протеогликаном в суставном хряще. Он играет важную роль в правильном функционировании суставного хряща, обеспечивая гидратированную структуру геля за счет его взаимодействия с гиалуронаном и связывающими белками, что наделяет хрящ несущими свойствами. Домен G1 взаимодействует с гиалуроновой кислотой и связывает белки, образуя стабильные тройные комплексы во внеклеточном матриксе (ЕСМ). Домен G2 гомологичен тандемным повторам G1 и связывающим белкам и участвует в обработке продукта. G3 составляет карбоксильный конец основного белка и усиливает модификацию гликозаминогликана и секрецию продукта. Кроме того, домен G3 связывает агрегаты протеогликана с белками ЕСМ (фибулинами и тенасцинами). Деградация аггрекана, по-видимому, начинается на С-конце. Популяция молекул аггрекана без домена G3 увеличивается с возрастом. Аггрекан взаимодействует с ламинином, фибронектином, тенасцином и коллагеном, но он также является ферментативным субстратом различных дезинтегринов и металлопротеаз с мотивами тромбо-спондина (ADAMTS), таких как ADAMTS4, ADAMTS5 и ADAMTS11, и матриксных металло-протеиназ (MMP), таких как MMP8, MMP13, MMP19 и MMP20.

В одном аспекте изобретение относится к агентам, связывающим аггрекан, таким как ISV и полипептиды, которые специфически связывают аггрекан.

Агенты, связывающие аггрекан, по изобретению в конечном итоге предназначены для применения в качестве лекарственных средств у людей. Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к агентам, связывающим аггрекан, таким как ISV и полипептиды, которые специфически связывают аггрекан человека (SEQ ID NO: 125).

Авторы изобретения идентифицировали агенты, связывающие аггрекан, со значительноо улучшенной межвидовой перекрестной реактивностью и исключительными свойствами селективности.

Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к агенту, связывающему аггрекан, такому как ISV или полипептид, где указанный агент, связывающий аггрекан, специфически связывается с аггреканом человека (P16112; SEQ ID NO: 125), аггреканом собаки (Q28343; SEQ ID NO: 126), аггреканом коровы (P13608; SEQ ID NO: 127), аггреканом крысы (P07897; SEQ ID NO: 128), аггреканом свиньи (ядро; Q29011, SEQ ID NO: 129); аггреканом мыши (Q61282; SEQ ID NO: 130), аггреканом кролика (G1U677-1; SEQ ID NO: 131), аггреканом яванскгого макака (XP_005560513.1; SEQ ID NO: 132) и/или аггреканом макака-резуса (XP_002804990.1; SEQ ID NO: 133) (см. также Таблицу B).

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по изобретению, имеют благоприятные характеристики по сравнению с молекулами предшествующего уровня техники; они стабильны в суставах, они сохраняются в хряще в течение продолжительного времени и специфичны для хрящевой ткани, например, по существу не связываются с нейроканом (O14594, SEQ ID NO: 134) и/или бревиканом (Q96GW7, SEQ ID NO: 135) (см. также Таблицу B).

Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к агенту, связывающему аггрекан, такому как ISV или полипептид, который по существу не связывается с нейроканом (O14594, SEQ ID NO: 134) и/или бревиканом (Q96GW7, SEQ ID NO: 135), предпочтительно, где указанный аггрекан связывается с нейроканом и/или бревиканом со значением K_D, превышающим 10^-5 моль/литр, таким как 10^-4 моль/литр.

В одном аспекте изобретение относится к агенту, связывающему аггрекан, такому как ISV, где имеет более чем 10-кратную, более чем 100-кратную, предпочтительно более 1000-кратную селективность по сравнению с нейроканом и/или бревиканом при связывании с аггреканом.

Предпочтительные агенты по изобретению, связывающие аггрекан, включают иммуноглобулины (такие как антитела, состоящие только из тяжелой цепи, обычные 4-цепочечные антитела (такие как молекулы IgG, IgM, IgA, IgD или IgE), фрагменты Fab, фрагменты F (ab')2, фрагменты Fv, такие как дисульфид-связанные Fv или фрагменты scFv или диатела, полученные из такого обычного 4-цепочечного антитела, его отдельных цепей, а также всех их частей, доменов или фрагментов (включая, без ограничения указанным, антигенсвязывающие домены или фрагменты, такие как иммуноглобулиновые одиночные вариабельные домены), одновалентные полипептиды по изобретению или другие связывающие агенты).

Замечено, что агенты по изобретению, связывающие аггрекан, имели pI более 8, только с одним исключением (см. также Таблицу 2.2). Не ограничиваясь какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения выдвинули гипотезу о том, что высокий положительный заряд аггрекана может влиять на задержку и проникновение в хрящ всей группы, то есть даже в сочетании с другим структурным блоком, как в мультиспецифическом полипептиде. Соответственно, настоящее изобретение относится к агенту, связывающему аггрекан, такому как ISV, полипептид или конструкция по изобретению, предпочтительно ISV по изобретению, с pI более 8, таким как 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0 или даже больше, например, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8 или даже 9,8.

Связывание агентов по изобретению, связывающих аггрекан, таких как ISV и/или полипептиды по изобретению, с аггреканом можно измерить в различных анализах связывания, обычно известных в данной области. Типичные анализы включают (без ограничения) анализы связывания флуоресцентного лиганда, флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS), анализы связывания радиолиганда, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), плазмонно-волноводный резонанс (PWR), SPR-визуализацию для биосенсоров на основе аффинности, микрорезонатор с модами шепчущей галереи (WGM), резонансную волноводную решетку (RWG), биослойную интерферометрию, биосенсор (BIB), ядерно-магнитный резонанс (NMR), рентгеновскую кристаллографию, термическую денатурацию (TDA), изотермическую титрационную калориметрию (ITC), ELISA и т.д. анализы связывания клеточного лиганда, такие как биосенсор поверхностной акустической волны (SAW) и биосенсорный анализ RWG. Предпочтительным анализом для измерения связывания агентов по изобретению, связывающих аггрекан, таких как ISV и/или полипептиды по изобретению, с аггреканом является SPR, такой как, например, SPR, описанный в примерах, в котором определяли связывание агентов по изобретению, связывающих аггрекан, таких как ISV и/или полипептиды по изобретению, с аггреканом. Некоторые предпочтительные значения K_D для связывания агентов по изобретению, связывающих аггрекан, таких как ISV и/или полипептиды по изобретению, с аггреканом станут ясными из дальнейшего описания и примеров, приведенных в данном документе. Другим особенно предпочтительным анализом является ELISA, как подробно описано в примерах (см. также примеры 1.2 и 2.4).

Связывание агентов по изобретению, связывающих аггрекан, с аггреканом также можно измерить в анализах связывания, которые предпочтительно сохраняют конформацию аггрекановой мишени. Типичные анализы включают (без ограничения) анализы, в которых аггрекан экспонируется на клеточной поверхности (такой как, например, клетки СНО).

В воплощении изобретения агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по изобретению, имеют константу скорости (K_on) для связывания с указанным аггреканом, выбранным из группы, состоящей по меньшей мере из примерно 10² M^-1с^-1 по меньшей мере около 10³ M^-1с^-1 по меньшей мере около 10⁴ M^-1с^-1 по меньшей мере около 10⁵ M^-1с^-1 по меньшей мере около 10⁶ M^-1с^-1, 10⁷ M^-1с^-1 по меньшей мере около 10⁸ M^-1с^-1 по меньшей мере около 10⁹ M^-1с^-1 и по меньшей мере около 10¹⁰ M^-1с^-1, предпочтительно, в соответствии с измерением поверхностным плазмонным резонансом.

В воплощении изобретения агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по изобретению, имеют константу скорости выключения (K_off) для связывания с указанным аггреканом, выбранным из группы, состоящей максимум из 10^-3 с^-1, максимум около 10^-4 с^-1, максимум около 10^-5 с^-1, максимум около 10^-6 с^-1, максимум около 10^-7 с^-1, максимум около 10^-8 с^-1, самое большее примерно 10^-9 с^-1 и самое большее примерно 10^-10 с^-1, предпочтительно, как измерено поверхностным плазмонным резонансом.

В воплощении изобретения агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по изобретению, связываются с указанным аггреканом со средним значением KD от 100 нМ до 10 пМ, таким как при среднем значении KD 90 нМ или менее, еще более предпочтительно при среднем значении KD 80 нМ или менее, например, менее 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 нМ или даже менее, например, менее 4, 3, 2 или 1 нМ, например, менее 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 пМ или даже менее, например, менее 10 пМ. Предпочтительно, K_D определяется с помощью SPR, например, определяется с помощью Proteon.

Некоторые предпочтительные значения EC₅₀ для связывания иммуноглобулинов и/или полипептидов по изобретению с аггрекан станут ясными из дальнейшего описания и примеров, приведенных в данном документе.

В анализе связывания ELISA агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по настоящему изобретению, предпочтительно связывающие домен G1 и/или домен G1-IGD-G2, могут иметь значения EC₅₀ при связывании человеческого аггрекана, равного 10^-8 М или ниже, более предпочтительно, 10^-9 М или ниже, или даже 10^-10 М или ниже. Например, в таком анализе связывания ELISA иммуноглобулины и/или полипептиды по настоящему изобретению могут иметь значения EC₅₀ при связывании аггрекана человека между 10^-10 М и 10^-8 М, например, между 10^-9 М и 10^-8 М или между 10^-10 М и 10^-9 М.

В таком анализе связывания ELISA агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по настоящему изобретению, предпочтительно связывающие домен G1 и/или домен G1-IGD-G2, могут иметь значения EC₅₀ при связывании аггрекана яванского макака (cyno) 10^-7 М или ниже, предпочтительно 10^-8 М или ниже, более предпочтительно 10^-9 М или ниже, или даже 10^-10 М или ниже. Например, в таком анализе связывания ELISA полипептиды по настоящему изобретению могут иметь значения EC₅₀ при связывании аггрекана яванского макака от 10^-10 M до 10^-7 M, например, от 10^-10 M до 10^-8 M, от 10^-10 M до 10^-9 M.

В таком анализе связывания ELISA агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по настоящему изобретению, предпочтительно связывающие домен G1 и/или домен G1-IGD-G2, могут иметь значения EC₅₀ при связывании аггрекана крысы, равном 10^-6 М или ниже, предпочтительно 10^-7 М или ниже, предпочтительно 10^-8 М или ниже, более предпочтительно 10^-9 М или ниже, или даже 10^-10 М или ниже. Например, в таком анализе связывания ELISA полипептиды по настоящему изобретению могут иметь значения EC 50 при связывании аггрекана крысы от 10^-10 M до 10^-6 M, например, от 10^-10 M до 10^-7 M, от 10^-10 M до 10^-8 M, от 10^-10 M до 10^-9 M.

В таком анализе связывания ELISA агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по настоящему изобретению, предпочтительно связывающие домен G1 и/или домен G1-IGD-G2, могут иметь значение EC₅₀ при связывании аггрекана собаки, равное 10^-6 М или ниже, предпочтительно 10^-7 М или ниже, предпочтительно 10^-8 М или ниже, более предпочтительно 10^-9 М или ниже, или даже 10^-10 М или ниже. Например, в таком анализе связывания ELISA полипептиды по настоящему изобретению могут иметь значения EC₅₀ при связывании аггрекана собаки от 10^-10 M до 10^-6 M, например, от 10^-10 M до 10^-7 M, от 10^-10 M до 10^-8 M, от 10^-10 M до 10^-9 M.

В таком анализе связывания ELISA агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по настоящему изобретению, могут, предпочтительно, связывать домен G1 и/или домен G1-IGD-G2, иметь значения EC₅₀ при связывании коровьего аггрекан, равного 10^-6 М или ниже, предпочтительно 10^-7 М или ниже, предпочтительно 10^-8 М или ниже, более предпочтительно 10^-9 М или ниже, или даже 10^-10 М или ниже. Например, в таком анализе связывания ELISA полипептиды по настоящему изобретению могут иметь значения EC₅₀ при связывании аггрекана коровы от 10^-10 M до 10^-6M, например, от 10^-10M до 10^-7M, от 10^-10M до 10^-8M, от 10^-10M до 10^-9M.

Используемый в данном документе термин «хрящевая ткань» относится к хрящу, включая эластичный хрящ, гиалиновый хрящ и волокнистый хрящ, которые определяются отношением клеток (хондроцитов) к межклеточному пространству и относительными количествами коллагена и протеогликана. «Суставной хрящ» - это хрящ, найденный на суставной поверхности костей, и в основном это гиалиновый хрящ. Мениски сделаны полностью из фиброзно-хрящевой ткани. Аггрекан является основным протеогликаном во внеклеточном матриксе (ECM) и составляет около 50% от общего содержания белка (остальные ок. 50% составляют коллаген II и некоторые минорные белки, такие как, например, коллаген IX).

Агенты по изобретению, связывающие аггрекан, продемонстрировали предпочтительное связывание с хрящевыми тканями в суставе, такими как хрящ и мениск, по сравнению с не хрящевой тканью, такой как синовиальная мембрана, сухожилие и/или эпимизий. Соответственно, настоящее изобретение относится к агенту, связывающему аггрекан, такому как ISV или полипептид, где указанный агент, связывающий аггрекан, предпочтительно связывается с хрящевой тканью, такой как хрящ и/или мениск, предпочтительно по меньшей мере в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, 4 раза, 5 раза или даже больше по сравнению с нехрящевой тканью.

Следует принять во внимание, что суставы - это области, где встречаются две или более кости. Большинство суставов подвижны, что позволяет костям двигаться. Суставы состоят из: хряща, синовиальной оболочки, связок, сухожилий, бурсы и синовиальной жидкости. У некоторых суставов также есть мениск.

Как показано в примерах, агенты по изобретению, связывающие аггрекан, имеют различные характеристики удержания в хряще, что позволяет настраивать удерживание в суставах в соответствии с конкретными потребностями (см. также пример 2.2). Предпочтительно, агенты, связывающие аггрекан, обладают способностью удерживаться в хряще в течение более длительных периодов времени после относительно короткого воздействия агентов, связывающих аггрекан, на хрящ, чем можно ожидать при внутрисуставной инъекции. Удержание в хряще может быть измерено с помощью анализа удержания в хряще ex vivo, как изложено в разделе примеров. Степень удержания может быть измерена визуальным осмотром вестерн-блоттинга или с помощью денситометрического количественного анализа. Шкала, используемая для определения степени удержания, может быть определена специалистом в данной области, например, шкала от 0 до 6 RU (Единицы удержания), где 0 - отсутствие удержания, а 6 - полное удержание в этом анализе. Если необходимо, шкалу можно определить количественно с использованием агентов по изобретению, связывающих аггрекан, в которых каждому агенту, связующему аггрекан, присваивается балл, например, полное удержание и отсутствие удержания фиксируются. В альтернативном варианте шкала может быть построена с различными промежуточными баллами, которые назначаются с помощью агентов по изобретению, связывающих аггрекан, например, агент, связывающий аггрекан, содержащий два 114F08 = 6 RU и ложный агент, связывающий аггрекан, например, ALB26-ALB26 = 0 RU; или агент, связывающий аггрекан, содержащий два 114F08 = 6; агент, связывающий аггрекан, содержащий 608A05 = 5; агент, связывающий аггрекан, 604G01 = 4; агент, связывающий аггрекан, содержащий два 601D02 = 3; агент, связывающий аггрекан, содержащий два 606A07 = 2; агент, связывающий аггрекан, 112A01 = 1; и ложный агент, связывающий аггрекан, например, ALB26-ALB26 = 0 (см. также Таблицу 2.2). Соответственно, настоящее изобретение относится к агенту, связывающему аггрекан, такому как ISV и/или полипептид по изобретению, где указанный агент, связывающий аггрекан, имеет удержание в хряще по меньшей мере 2, например, по меньшей мере 3, 4, 5 или 6 RU в анализе удержания в хряще.

Агенты, по изобретению связывающие аггрекан, предпочтительно должны быть стабильными. В качестве первой предпосылки биофизические свойства агентов, связывающих аггрекан, были испытаны, как подробно описано в примере 3, в котором было продемонстрировано, что эти агенты, связывающие аггрекан, продемонстрировали благоприятные характеристики стабильности, о чем свидетельствуют высокие температуры плавления и отсутствие признаков агрегации и мультимеризации. Затем агенты, связывающие аггрекан, были проверены на их активность в суставах в течение длительных периодов путем инкубации в синовиальной жидкости при 37°С (см. также Пример 6). Деградации какой-либо из конструкций не было обнаружено, что указывает на то, что конструкции были стабильны в условиях, имитирующих ситуацию in vivo.

В одном аспекте изобретение относится к агентам, связывающим аггрекан, таким как ISV, которые имеют стабильность по меньшей мере 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, например, 14 дней, 21 день, 1 месяц, 2 месяца или даже 3 месяца в синовиальной жидкости (SF) при 37°C.

Настоящее изобретение обеспечивает участки аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 20-37 и 109, SEQ ID NO: 38-55 и 110 и SEQ ID NO: 56-74 и 111; Таблица A-2), которые особенно подходят для связывания с аггреканом. В частности, изобретение обеспечивает участки аминокислотных остатков, которые связываются с аггреканом человека, и в которых связывание указанных участков с указанным аггреканом сохраняет присутствие в хрящевой ткани (как описано выше). Эти участки аминокислотных остатков могут присутствовать и/или могут быть включены в конструкцию или полипептид по изобретению, в частности, таким образом, что они образуют (часть) антигенсвязывающего сайта полипептида по изобретению. Эти участки аминокислотных остатков были получены в виде последовательностей CDR антител тяжелой цепи или последовательностей VHH, которые были получены против аггрекана. Эти участки аминокислотных остатков также обозначаются в данном документе как «последовательность(и) CDR по изобретению» («последовательность(и) CDR1 по изобретению», «последовательность(и) CDR2 по изобретению» и «последовательность(и) CDR3 изобретения», соответственно).

Однако следует отметить, что изобретение в его самом широком смысле не ограничивается специфической структурной ролью или функцией, которую эти участки аминокислотных остатков могут иметь в полипептиде по изобретению, при условии, что эти участки аминокислотных остатков позволяют полипептиду изобретения связываться с аггреканом с желаемой аффинностью и эффективностью. Таким образом, как правило, изобретение в самом широком смысле обеспечивает полипептиды (также называемые в данном документе «полипептидом(ами) по изобретению»), которые способны связываться с аггреканом с определенной заданной аффинностью, авидностью, эффективностью и/или эффективной концентрацией, и которые содержат одну или несколько последовательностей CDR, описанный в данном документе, и, в частности, подходящую комбинацию двух или более таких последовательностей CDR, которые подходящим образом связаны друг с другом через одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, так что весь полипептид образует связывающий домен и/или блок связывания, способный связываться с аггреканом. Однако следует также отметить, что присутствие только одной такой последовательности CDR в полипептиде по изобретению само по себе уже может быть достаточным для того, чтобы обеспечить полипептиду по изобретению способность связываться с аггреканом; например, снова можно сделать отсылку на так называемые «содействующие фрагменты», описанные в WO 03/050531.

В частности, но не в ограничивающем аспекте, агент по изобретению, связывающий, аггрекан, такой как ISV и/или полипептид по изобретению, может, по существу, состоять или содержать по меньшей мере один фрагмент аминокислотных остатков, который выбран из группы, состоящей из:

i) последовательности CDR1:

a) SEQ ID NO: 24, 32, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37 и 109; и

b) аминокислотные последовательности, которые имеют различие в 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24;

и/или

ii) последовательности CDR2:

c) SEQ ID NO: 42, 50, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55 и 110; и

d) аминокислотные последовательности, которые имеют различие в 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42;

и/или

iii) последовательности CDR3:

e) SEQ ID NO: 60, 68, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 74 и 111; и

f) аминокислотные последовательности, которые имеют различие в 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60,

предпочтительно агент, связывающий аггрекан, такой как ISV и/или полипептид, содержит структуру FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, в которой FR1, FR2, FR3 и FR4 являются каркасными последовательностями.

В дополнительном аспекте предпочтительно агент по изобретению, связывающий аггрекан, такой как полипептид и/или ISV по изобретению, может содержать по меньшей мере один фрагмент аминокислотных остатков, который выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20-74 и 109-111.

В частности, предпочтительно агент по изобретению, связывающий аггрекан, такой как полипептид и/или ISV по изобретению, может представлять собой агент, связывающий аггрекан, который содержит один антигенсвязывающий сайт, где указанный антигенсвязывающий сайт содержит по меньшей мере один участок аминокислотных остатков, который выбран из группы, состоящей из последовательностей CDR1, последовательностей CDR2 и последовательностей CDR3, как описано выше (или любой подходящей их комбинации). Однако в предпочтительном аспекте предпочтительно агент по изобретению, связывающий аггрекан, такой как полипептид и/или ISV по изобретению, содержит более одного, например, два или более фрагментов аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из последовательностей CDR1 по изобретению, последовательности CDR2 по изобретению и/или последовательности CDR3 по изобретению. Предпочтительно агент по изобретению, связывающий аггрекан, такой как полипептид и/или ISV по изобретению, содержит три участка аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из последовательностей CDR1 по изобретению, последовательностей CDR2 по изобретению и CDR3 последовательности по изобретению, соответственно. Комбинации CDR, которые упомянуты в данном документе как предпочтительные для агента по изобретению, связывающего аггрекан, такого как полипептид и/или ISV по изобретению, перечислены в таблице A-2, т.е. предпочтительно комбинация CDR, показанная в одной строке в указанной таблице.

Репрезентативные полипептиды по настоящему изобретению, имеющие CDR, описанные выше, показаны в таблице A-1 (SEQ ID NO: 1-19 и 114-118).

В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к агенту по изобретению, связывающему аггрекан, такому как ISV и/или полипептид по изобретению, который содержит 3 определяющие комплементарность области (CDR1-CDR3 соответственно), где:

- CDR1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 32, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37 и 109;

- CDR2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 50, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55 и 110; и

- CDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60, 68, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 74 и 111

предпочтительно агент, связывающий аггрекан, такой как ISV и/или полипептид, включает структуру FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, в которой FR1, FR2, FR3 и FR4 являются каркасными последовательностями.

В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к агенту по изобретению, связывающему аггрекан, такому как ISV и/или полипептид по изобретению, которое содержит 3 определяющие комплементарность области (CDR1-CDR3 соответственно), где:

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 24, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 42 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 60;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 50 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 68;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 20, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 38 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 56;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 21, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 39 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 57;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 22, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 40 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 58;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 23, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 41 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 59;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 25, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 43 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 61;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 26, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 44 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 62;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 27, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 45 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 63;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 28, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 46 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 64;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 29, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 47 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 65;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 30, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 48 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 66;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 49 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 67;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 51 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 69;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 33, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 52 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 70;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 34, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 50 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 71;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 35, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 53 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 72;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 36, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 54 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 73;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 55 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 74; или

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 109, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 110, и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 111;

В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к агенту, связывающему аггрекан, такому как ISV, где указанный ISV был выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 117, 5, 118, 13, 114-116, 1-4, 6-12 и 14-19.

Кроме того, следует отметить, что изобретение не ограничено происхождением агента по изобретению, связывающего аггрекан, такого как ISV и/или полипептид по изобретению (или нуклеиновой кислоты по изобретению, используемой для его экспрессии), ни относительно того, каким образом создается или получается (или был создан или получен) предпочтительно агент по изобретению, связывающий аггрекан, такой как ISV и/или полипептид по изобретению, или нуклеиновая кислота по изобретению. Таким образом, предпочтительно агент по изобретению, связывающий аггрекан, такой как ISV и/или полипептид по изобретению, может быть встречающимся в природе ISV (из любых подходящих видов) или синтетическими или полусинтетическими ISV и/или полипептидами.

Кроме того, специалисту в данной области также будет понятно, что можно «привить» один или несколько CDR, упомянутых выше, на другие «каркасы», включая, без ограничения указанным, каркасы человека или неиммуноглобулиновые каркасы. Подходящие каркасы и методы для такой прививки CDR будут понятны специалисту и хорошо известны в данной области, см., например, US 7,180,370, WO 01/27160, EP 0605522, EP 0460167, US 7,054,297, Nicaise et al. (Protein Science 13: 1882-1891, 2004), Ewert et al. (Methods 34: 184-199, 2004), Kettleborough et al. (Protein Eng. 4: 773-783, 1991), O'Brien and Jones (Methods Mol. Biol. 207: 81-100, 2003), Skerra (J. Mol. Recognit. 13: 167-187, 2000) и Saerens et al. (J. Mol. Biol. 352: 597-607, 2005) и другие источники, цитируемые в них. Например, способы, известные по существу для прививки CDR мыши или крысы на человеческие каркасы и подложки, могут быть использованы аналогичным образом для получения химерных белков, включающих одну или несколько последовательностей CDR, определенных в данном документе, для моновалентных полипептидов по изобретению и одну или несколько человеческих каркасных областей или последовательностей. Подходящие каркасы для презентации аминокислотных последовательностей будут понятны специалисту в данной области и, например, включают связывающие каркасы, основанные или полученные из иммуноглобулинов (т.е. отличные от последовательностей иммуноглобулинов, уже описанных в данном документе), белковые каркасы, полученные из доменов протеина А (такие как Affibodies™), тендамистата, фибронектина, липокалина, CTLA-4, T-клеточных рецепторов, анкириновых повторов, авимеров и PDZ-доменов (Binz et al. Nat Biotech 23: 1257, 2005) и связывающие фрагменты на основе ДНК или РНК, включая, без ограничения указанным, аптамеры ДНК или РНК (Ulrich et al. Com Chem High Throughput Screen 9:619-32, 2006).

В агенте по изобретению, связывающем аггрекан, таком как ISV и/или полипептид по изобретению, CDR могут быть связаны с дополнительными аминокислотными последовательностями и/или могут быть связаны друг с другом через аминокислотные последовательности, в которых указанные аминокислотные последовательности предпочтительно представляют собой каркасные последовательности или представляют собой аминокислотные последовательности, которые действуют как каркасные последовательности, или вместе образуют каркас для презентации CDR.

Согласно предпочтительному воплощению, агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по изобретению, содержат по меньшей мере три последовательности CDR, связанные по меньшей мере с двумя каркасными последовательностями, в которых предпочтительно по меньшей мере одна из трех последовательностей CDR представляет собой последовательность CDR3, причем две другие последовательности CDR представляют собой последовательности CDR1 или CDR2 и предпочтительно представляют собой одну последовательность CDR1 и одну последовательность CDR2. Согласно одному особенно предпочтительному, но не ограничивающему воплощению, агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по изобретению, имеют структуру FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, в которой CDR1, CDR2 и CDR3 являются такими, как определено в данном документе для агентов, связывающих аггрекан, по изобретению, таких как ISV и/или полипептиды по изобретению, и FR1, FR2, FR3 и FR4 являются каркасными последовательностями. В таком агенте по изобретению, связывающем аггрекан, таком как ISV и/или полипептид по изобретению, каркасные последовательности могут представлять собой любую подходящую каркасную последовательность, и примеры подходящих каркасных последовательностей будут понятны специалисту, например, на основе стандартных справочников и дальнейшего раскрытия и предшествующего уровня техники, упомянутых в данном документе.

Соответственно, предпочтительно агент по изобретению, связывающий аггрекан, такой как ISV и/или полипептид по изобретению, содержит 3 определяющие комплементарность области (CDR1-CDR3 соответственно), в которых:

(i) CDR1 выбран из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO: 24, 32, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37 и 109; и

(b) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24 или с любой из SEQ ID NO: 20-23, 25-37 и 109; и/или

(ii) CDR2 выбран из группы, состоящей из:

(d) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42 или с любой из SEQ ID NO: 38-41, 43-55 и 110; и/или

(iii) CDR3 выбран из группы, состоящей из:

(e) SEQ ID NO: 60, 68, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 74 и 111; и

(f) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60 или с любой из SEQ ID NO: 56-59, 61-74 и 111

Агенты по изобретению, связывающие аггрекан, могут быть картированы в области G1, области G1-IGD-G2 или области G2 аггрекана.

Соответственно, настоящее изобретение относится к агентам по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептиды, которые связываются с доменом G2 аггрекана. Как указано в примерах, эти агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды, имеют различные предпочтительные характеристики. Предпочтительно агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды, имеют pI более 8 и/или имеют K_off менее 2⋅10^-2с^-1 и/или имеют EC₅₀ менее чем 1⋅10^-6M.

Сравнение CDR агентов по изобретению, связующих аггрекан, таких как ISV и/или полипептиды по изобретению, выявило ряд допустимых изменений аминокислот в CDR при сохранении связывания с доменом G2 аггрекана. Вариабельность последовательности в CDR всех клонов против CDR из 601D02, которые использовались в качестве стандарта, представлена в таблицах 1.5A, 1.5B и 1.5C.

В некотором варианте осуществления настоящее изобретение относится к агентам по изобретению, связывающим аггреканам, таким как ISV и/или полипептиды, в которых:

i) CDR1 выбран из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO: 28, 22, 26 и 33; и

b) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 28, где различие по аминокислотам определено следующим образом:

- в положении 1 G изменен на R;

- в положении 2 P изменен на S или R;

- в положении 3 Т изменен на I;

- в положении 5 S изменен на N;

- в положении 6 R изменен на N, M или S;

- в положении 7 Y изменен на R или отсутствует;

- в положении 8 A изменен на F или отсутствует; и/или

- в позиции 10 G изменен на Y;

и/или

ii) CDR2 выбран из группы, состоящей из:

c) SEQ ID NO: 46, 40, 44 и 52; и

d) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46, где различие по аминокислотам определено следующим образом:

- в положении 1 A изменен на S или Y;

- в положении 4 W изменен на L;

- в положении 5 S изменен на N;

- в положении 6 S отсутствует;

- в положении 7 G отсутствует;

- в положении 8 G изменен на A;

- в положении 9 R изменен на S, D или T; и/или

- в положении 11 Y изменен на N или R;

и/или

iii) CDR3 выбран из группы, состоящей из:

e) SEQ ID NO: 64, 58, 62 и 70; и

f) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 64, где различие по аминокислотам определено следующим образом:

- в положении 1 A изменен на R или F;

- в положении 2 R изменен на I или L;

- в положении 3 I было изменено на H или Q;

- в положении 4 P изменен на G или N;

- в положении 5 V изменен на S;

- в положении 6 R изменен на G, N или F;

- в положении 7 Т изменен на R, W или Y;

- в положении 8 Y изменен на R или S или отсутствует;

- в положении 9 Т изменен на S или отсутствует;

- в положении 10 S изменен на E, K или отсутствует;

- в положении 11 E изменен на N, A или отсутствует;

- в положении 12 W изменен на D или отсутствует;

- в положении 13 N изменен на D или отсутствует;

- в положении 14 Y отсутствует; и/или

- D и N добавляются после положения 14 в SEQ ID NO: 64;

- CDR1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28, 22, 26 и 33;

- CDR2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 46, 40, 44 и 52; и

- CDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 64, 58, 62 и 70;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 28, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 46 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 64;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 22, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 40 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 58;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 26, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 44 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 62; и

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 33, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 52 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 70;

В одном аспекте настоящее изобретение относится к агентам по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептиды, выбранные из группы агентов, связывающих аггрекан, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 3, 7 и 15, и агентам, связывающим аггрекан, которые имеют более 80%, например, 90% или 95% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 9, 3, 7 и 15.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к агентам по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептиды, которые перекрестно блокируют связывание доменного антитела, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве доменного антитела, однодоменного антитела, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, dAb, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве dAb, нанотела, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена созреванием аффинности к домену G2 аггрекана.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к доменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве доменного антитела, однодоменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, к dAb, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве dAb, нанотелу, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена путем созревания аффинности, которая связывается с доменом G2 аггрекана и которая конкурирует за связывание с доменом G2 аггрекана с агентами по изобретению, связывающими аггрекан, такими как ISV и/или полипептиды по изобретению, предпочтительно представленные в любой из SEQ ID NO: 9, 3, 7 и 15.

Настоящее изобретение также относится к агентам по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептиды, которые связываются с доменом G1-IGD-G2 аггрекана. Как указано в примерах, эти агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды, имеют различные предпочтительные характеристики. Предпочтительно агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды, имеют pI более 8 и/или имеют K_off менее 2⋅10^-2с^-1 и/или имеют EC₅₀ менее чем 1⋅10^-6М.

Сравнение CDR агентов по изобретению, связывающих аггрекан, таких как ISV и/или полипептиды по изобретению, выявило ряд допустимых изменений аминокислот в CDR при сохранении связывания с G1-IGD-G2 доменом аггрекана. Изменчивость последовательности в CDR всех клонов против CDR из 604F02, который использовался в качестве стандарта, представлена в таблицах 1.4A, 1.4B и 1.4C.

В аспекте настоящее изобретение также относится к агентам по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептиды, в которых:

i) CDR1 выбран из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO: 32, 30 и 23; и

b) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32, где различие по аминокислотам определено следующим образом:

- в положении 2 R изменен на L;

- в положении 6 S изменен на T; и/или

- в положении 8 Т изменен на А;

и/или

ii) CDR2 выбран из группы, состоящей из:

c) SEQ ID NO: 50, 41, 48 и 51; и

d) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36, где различие по аминокислотам определено следующим образом:

- в положении 7 G изменен на S или R; и/или

- в положении 8 R изменен на T;

и/или

iii) CDR3 выбран из группы, состоящей из:

e) SEQ ID NO: 68, 59, 66 и 69; и

f) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 68, где различие по аминокислотам определено следующим образом:

- в положении 4 R изменен на V или P;

- в положении 6 A изменен на Y;

- в положении 7 S изменен на T;

- в положении 8 S отсутствует;

- в положении 9 N изменен на P;

- в положении 10 R изменен на T или L;

- в положении 11 G изменен на E; и/или

- в положении 12 L изменен на T или V;

В одном аспекте настоящее изобретение относится к агентам по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептиды, где:

- CDR1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32, 30 и 23;

- CDR2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, 41, 48 и 51; и

- CDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 68, 59, 66 и 69;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 50 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 68;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 51 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 69;

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 30, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 48 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 66; и

- CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 23, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 41 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 59;

В одном аспекте настоящее изобретение относится к агентам по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептиды, выбранные из группы, состоящей из агентов, связывающих аггрекан, с SEQ ID NO: 118, 13, 4, 11 и 14, и агентов, связывающих аггрекан, которые имеют более 80%, например, 90% или 95% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 118, 13, 4, 11 и 14.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к агентам по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептиды, которые перекрестно блокируют связывание доменного антитела, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве доменного антитела, однодоменного антитела, иммуноглобулин, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, dAb, иммуноглобулина, который подходит для применения в качестве dAb, нанотела, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена созреванием аффинности к домену G1-IGD-G2 аггрекана.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к доменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве доменного антитела, однодоменному антителу, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве однодоменного антитела, к dAb, иммуноглобулину, который подходит для применения в качестве dAb, нанотелу, последовательности VHH, гуманизированной последовательности VHH, оверблюженной последовательности VH или последовательности VHH, которая была получена путем созревания аффинности, которая связывается с доменом G1-IGD-G2 аггрекана и которая конкурирует за связывание с доменом Gg-IGD-G2 аггрекана с агентом по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептид по изобретению, предпочтительно представленный в любой из SEQ ID NO: 118, 13, 4, 11 и 14.

В особенно предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к агентам по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептиды по изобретению, которые связываются с доменом G1 аггрекана. Как указано в примерах, эти агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды по изобретению, имеют различные предпочтительные характеристики. Предпочтительно агенты по изобретению, связывающие аггрекан, такие как ISV и/или полипептиды, имеют pI более 8 и/или имеют K_off менее 2⋅10^-2с^-1 и/или имеют EC₅₀ менее чем 1⋅10^-6М.

Сравнение CDR агентов по изобретению, связывающих аггрекан, таких как ISV и/или полипептиды по изобретению, выявило ряд допустимых изменений аминокислот в CDR при сохранении связывания с доменом G1 аггрекана. Изменчивость последовательности в CDR всех клонов против CDR из 114F08, который использовался в качестве стандарта, представлена в таблицах 1.3A, 1.3B и 1.3C.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к агентам по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептиды по изобретению, которые содержат 3 определяющие комплементарность области (CDR1-CDR3 соответственно), в которых:

i) CDR1 выбран из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO: 24, 20, 21, 25, 27, 29, 31, 34, 35, 36 и 37; и

b) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24, где различие по аминокислотам определено следующим образом:

- в положении 2 S изменен на R, F, I или T;

- в положении 3 Т изменен на I;

- в положении 5 I было изменено на S;

- в положении 6 I было изменено на S, T или M;

- в положении 7 N изменен на Y или R;

- в положении 8 V изменен на A, Y, T или G;

- в положении 9 V изменен на М; и/или

- в положении 10 R изменен на G, K или A;

и/или

ii) CDR2 выбран из группы, состоящей из:

c) SEQ ID NO: 42, 38, 39, 43, 45, 47, 49, 50, 53, 54 и 55; и

d) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, где различие по аминокислотам определено следующим образом:

- в положении 1 Т изменен на А или G;

- S или N вставляется между положением 3 и положением 4 (положение 2a, таблица 1.3B);

- в положении 3 S изменен на R, W, N или T;

- в положении 4 S изменен на T или G;

- в положении 5 G изменен на S;

- в положении 6 G изменен на S или R;

- в положении 7 N изменен на S, T или R;

- в положении 8 A изменен на T; и/или

- в положении 9 N изменен на D или Y;

и/или

iii) CDR3 выбран из группы, состоящей из:

e) SEQ ID NO: 60, 56, 57, 61, 63, 65, 67, 71, 72, 73 и 74; и

f) аминокислотных последовательностей, которые имеют различие в 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60, где различие по аминокислотам определено следующим образом:

- в положении 1 P изменен на G, R, D или E или отсутствует;

- в положении 2 Т изменен на R, L, P или V или отсутствует;

- в положении 3 Т изменен на М, S или R или отсутствует;

- в положении 4 H изменен на D, Y, G или T;

- в положении 5 Y изменен на F, V, T или G;

- в положении 6 G изменен на L, D, S, Y или W;

- R, T, Y или V вставляются между положением 6 и положением 7 (положение 6a, таблица 1.3C);

- в положении 7 G изменен на P или S;

- в положении 8 V изменен на G, T, H, R, L или Y;

- в положении 9 Y изменен на R, A, S, D или G;

- в положении 10 Y изменен на N, E, G, W или S;

- W вставлена между положением 10 и положением 11 (положение 10a, таблица 1.3C);

- в положении 11 G изменен на S, K или Y;

- в положении 12 P изменен на E, или D, или отсутствует; и/или

- в положении 13 Y изменен на L или отсутствует;

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к агентам по изобретению, связывающим аггрекан, таким как ISV и/или полипептиды, выбранные из группы агентов, связывающих аггрекан, где: CDR1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 20, 21, 25, 27, 29, 31, 34, 35, 36, 37 и 109; CDR2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 38, 39, 43, 45, 47, 49, 50, 53, 54, 55 и 110; и CDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60, 56, 57, 61, 63, 65, 67, 71, 72, 73, 74 и 111; предпочтительно агент, связывающий аггрекан, такой как ISV и/или полипептид, включает структуру FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, в которой FR1, FR2, FR3 и FR4 являются каркасными последовательностями.