Способ ускорения процесса постлучевого восстановления селезенки лабораторных животных
Владельцы патента RU 2774030:
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к разработке способов ускорения процесса постлучевого восстановления селезенки, и может быть использовано для восстановления организма после лучевой нагрузки при онкологических заболеваниях. Способ включает внутривенное введение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и стволовых кроветворных клеток (СКК) с интервалом введения 24 часа. Мезенхимальные стволовые клетки вводят в дозе 1⋅106 клеток/мышь в течение первого часа после облучения и стволовые кроветворные клетки - 0,3⋅106 миелокариоцитов/мышь. Дополнительно внутримышечно трёхкратно вводят Деринат в дозе 0,13 мг/г живого веса через 10-15 мин после облучения, на 3 и на 7 сутки. Изобретение позволяет улучшить результаты постлучевого восстановления селезенки лабораторных животных, укрепить иммунный статус облученных животных. 1 табл.
Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к разработке способов ускорения процесса постлучевого восстановления селезенки, и может быть использовано для восстановления организма после лучевой нагрузки при онкологических заболеваниях.
Современная терапия в онкологии с использованием ионизирующего излучения в высоких дозах может приводит к серьёзным морфофункциональным изменениям в селезенке, ведущим к угнетению гемопоэтической функции этого органа. Основным лечебным подходом для восстановления кроветворения до настоящего времени является и стволовых кроветворных клеток (СКК). Для ослабления цитостатического и иммунодепрессивного действия лучевой терапии на гемопоэз также используется ряд гемостимуляторов. В последние десятилетия рядом экспериментальных исследований показано стимулирующее действие чужеродной ДНК.
Известен способ восстановления селезенки после лучевой нагрузки (RU 2551937 C1, 10.06.2015г.), который осуществляется путем проведения лабораторным мышам через час после облучения внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных мезенхиальных стромальных клеток (ММСК) и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Последние получают из плаценты самок-мышей при сроке гестации 14 дней. При этом ММСК вводят в дозе 6,5 млн клеток/кг, а ГСК – в дозе 400 тыс. клеток/кг. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, способных обеспечить регенераторный потенциал тканей селезенки, а также повысить регенерацию основных морфометрических показателей селезенки после воздействия лучевой нагрузки. Однако, эффект при введении только мезенхимных и стволовых клеток не всегда воспроизводится, что и является недостатком данного способа.
Известен способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных (RU 2230559 С1, 20.06.2004 г.), осуществленный путем введения дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из молоки рыб. Препарат вводили до или после облучения ежедневно в дозе 40-60 мкг/мышь в течение 5-7 дней. При этом последнюю дозу препарата до облучения или первую дозу после облучения вводили за 1-2 часа соответственно до или после облучения. Способ обеспечивает повышение эффекта колониеобразования кроветворных клеток в селезенке при устранении побочного действия.
Недостатком этого способа является то, что он недостаточно эффективен для восстановления селезенки, т.к. введение только ДНК не сопряжено с направленной миграцией в наиболее поврежденные ткани.
Самым близким (прототипом) является работа «Совместная трансплантация мезенхимальных и гематопоэтических стволовых клеток для восстановления гемопоэза у мышей, нарушенного вследствие воздействия ионизирующей радиаци» (Павлова Л.Н., Жаворонков Л.П., Павлов В.В., Чибисова О.Ф., Иванов В.Л., Панфилова В.В. Совместная трансплантация мезенхимальных и гематопоэтических стволовых клеток для восстановления гемопоэза у мышей, нарушенного вследствие воздействия ионизирующей радиации // Евразийское научное объединение. 2018. № 3-2 (37). С. 102–105). В данной работе изучалась эффективность разных режимов котрансплантации и различных алгоритмов введения мезенхиальных стромальных клеток (МСК) и стволовых кроветворных клеток (СКК), их доза, сроки начала лечения, а так же наличие и длительность интервала между введениями, что позволило определить наиболее оптимальный при аплазии вариант их терапевтического сочетания: МСК→СКК с интервалом 24 часа и началом лечения (МСК) непосредственно после поражающего воздействия.
Однако, следует отметить, что в некоторых опытах эффект не воспроизводился, что, возможно, зависело от проявления инфекции на фоне иммуносупрессии, вызванной введенной порцией МСК, что свидетельствует о необходимости введения в схему котрансплантации ССК дополнительных медикаментозных средств для борьбы с осложняющими процесс восстановления кроветворения факторами.
Поэтому целью изобретения является усиления лечебного эффекта котрансплантации стволовых клеток мезенхимного и гемопоэтического происхождения.
Задачей данного изобретения является разработка нового эффективного способа восстановления гемопоэтической функции селезенки после лучевой нагрузки в высоких дозах.
Технический результат достигается тем, что также как и в известном способе в первые часы после лучевой нагрузки вводят внутривенно мезенхимальные стволовые клетки и стволовые кроветворные клетки с интервалом 24 часа.
Особенностью изобретения является то, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК) вводят в дозе 1⋅106 клеток/мышь в течение первого часа после облучения и внутривенно вводят стволовые кроветворные клетки (СКК) в дозе 0,3⋅106 миелокариоцитов/мышь, причем дополнительно трехкратно внутримышечно вводят Деринат в дозе 0,13 мг/г живого веса через 10-15 мин после облучения животных, на 3 и на 7 сутки.
Изобретение осуществляют следующим образом.
Оценка модулирующего эффекта препарата «Деринат» на ускорение процесса постлучевого восстановления селезенки произведена по результатам опыта на 50 мышах. Использовали самок линейных мышей F1(СВАxС57B6), массой 20-25 г. Животных содержали в стандартных пластиковых клетках по 10 особей в условиях климатического комфорта (tо~ 22°С, влажность воздуха 50%) на стандартном пищевом рационе, состоящем из распаренного зерна и брикетированного корма.
Облучение всего тела мышей осуществляли на гамма-установке «Агат» (Co-60; 9,5 Гр; 0,51 Гр/мин). Животные облучались по 5 или по 10 особей одновременно в пластиковых прозрачных контейнерах, разделенных на 5 или 10 индивидуальных ячеек. Введение МСК проводили в течение первого часа облучения. Введение СКК осуществляли через 24 часа после МСК. Деринат использовался в виде готового фармакопейного препарата – раствора для внутримышечного введения по 5 мл в стеклянных флаконах (15 мг/мл) (производитель – ООО «ФЗ Иммунолекс», Россия). Деринат в дозе 0,13 мг/г живого веса вводили внутримышечно трижды после облучения: через 15 минут, через 3 и 7 суток. Мезенхимные стволовые клетки получали из банка клеток лаборатории клеточной и экспериментальной лучевой терапии МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России и после облучения вводили внутривенно по 1 млн клеток на мышь в объеме 0,2 мл. Стволовые кроветворные клетки получали ex tempore из костного мозга бедра мыши той же линии из одной поставки животных и вводили внутривенно по 300 тыс. миелокариоцитов в объеме 0,1 мл стерильного физиологического раствора. Животным группы облученного контроля в день введения стволовых клеток или инъекций Дерината проводили аналогичные в/в вливания или в/м инъекции физиологического раствора в тех же объемах
Показателем стрессирующего влияния на организм физических воздействий может служить снижение клеточности лимфоидных органов, в частности показателя общей клеточности селезенки. Поэтому критериями эффективности результатов предлагаемой схемы лечения служили масса и общая клеточность селезенки, оцениваемые в период восстановления системы кроветворения (9 сутки) после радиационного воздействия (Таблица 1).
Для определения количественных показателей использовали общепринятую методику подсчета клеток в камере Горяева. Результаты по всем показателям обрабатывались статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Различия ρ≤0,01 считали статистически значимыми.
Таблица 1.
Сравнение показателей состояния селезенки мышей через 8-9 суток после тотального γ-облучения в предлагаемом способе и прототипе
| Показатель | Экспериментальные группы | |||||
| Предлагаемый способ | Прототип | |||||
| γ-облучение | γ-облучение МСК→СКК + Деринат | Биоконтроль | γ-облучение | γ-облучение МСК→СКК | Биоконтроль | |
| Количество животных | 12 | 13 | 13 | 13 | 13 | 13 |
| Масса, мг | 30,0+1,6 | 80,0+6,0 | 79,8+1,9 | 31,4+3,1 | 37,4+3,7 | 87,8+4,6 |
| Общая клеточность, х106 |
5,85±0,4 | 49,5±7,7 | 179,9±2,6 | 12,0+1,0 | 30,8+4,8 | 175,2+8,2 |
Для оценки эффективности апробируемого способа постлучевого восстановления селезенки была выбрана высокая доза облучения (9,5 Гр), приводящая к выраженному костномозговому синдрому – выживаемость мышей в облученном контроле составила 40-50 % к 14 суткам наблюдения. Тот же синдром наблюдался и в прототипе при тотальном облучении животных в дозе 8,2 Гр ускоренными электронами.
Результаты исследования представлены в таблице. Видно, что тотальное облучение животных в дозе 8,2 Гр ускоренными электронами (10 МэВ) и гамма-квантами (1,4 МэВ) в дозе 9,5 Гр приводят к одинаковому биологическому эффекту. Так, масса селезенки через 8-9 суток после облучения составляет 36-37 % от массы органа у группы биоконтроля (животных, не подвергавшихся облучению и не получавших инъекции стволовых клеток или препарата) в обоих случаях. Животные, получившее лечение с препаратом «Деринат» по предлагаемой схеме демонстрируют восстановление массы селезенки до 100% от контрольного уровня, в то время как у группы мышей, получавших только трансплантацию стволовых клеток без препарата «Деринат» (Прототип) восстановление произошло только до 43%. Восстановление общей клеточности селезенки у животных в условиях выраженной стимуляции костномозгового кроветворения иммуномодулятором Деринат с 3,3 % до 27,5%, а в группе лечения без препарата (Прототип) – с 6,8 % до 17,2 %.
Таким образом, при облучении в дозе 9,5 Гр у животных, леченных МСК+СКК с 24 часовым интервалом введения на фоне 3-х кратного постлучевого введения Дерината отмечается восстановление массы и клеточности селезёнки и выявлены значимые различия не только с облученными контролем, но и с показателями группы, пролеченной только стволовыми клетками. Эти данные свидетельствует об эффективности предлагаемой схемы в процессе постлучевого восстановления селезенки.
Использование данного изобретения позволяет улучшить результаты постлучевого восстановления селезенки лабораторных животных и укрепить иммунный статус облученных животных при лечении стволовыми клетками, а также улучшить методы борьбы с инфекцией при лечении стволовыми клетками.
Способ ускорения процесса постлучевого восстановления селезенки лабораторных животных, включающий внутривенное введение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и стволовых кроветворных клеток (СКК) с интервалом введения 24 часа, отличающийся тем, что мезенхимальные стволовые клетки вводят в дозе 1⋅106 клеток/мышь в течение первого часа после облучения и стволовые кроветворные клетки - 0,3⋅106 миелокариоцитов/мышь, причем дополнительно внутримышечно трёхкратно вводят Деринат в дозе 0,13 мг/г живого веса через 10-15 мин после облучения, на 3 и на 7 сутки.
