Консервант для хранения нативных стандартных эритроцитов

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к композиции для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов, содержащей цитрат натрия, ортофосфат натрия, глюкозу, аденин и рибоксин, отличающейся тем, что композиция дополнительно содержит фетальную сыворотку, фосфолипиды и лизоцим, а также относится к набору для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов, состоящему из композиции и стандартных нативных эритроцитов, и также относится к применению набора для диагностики антител к антигенам эритроцитов. Группа изобретений обеспечивает расширение спектра недорогих и доступных консервантов и значительное удлинение сроков хранения полноценной эритроцитарной панели за счет защиты клеточной мембраны эритроцитов на поздних сроках хранения. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов для последующего применения в наборе для диагностики антител к антигенам. Заявленное изобретение может найти применение на станциях переливания крови, службе крови, клинических лабораториях, лабораториях судебной медицины и других медицинских учреждениях.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Для своевременной и правильной диагностики иммунологических причин посттрансфузионных осложнений, а также для обеспечения высокой степени иммунологической совместимости переливаемой крови службы крови, лаборатории и медицинские учреждения часто используют нативные (не обработанные протеазами, т.е. не энзимированные) эритроциты, стандартные по всем клинически наиболее значимым эритроцитарным изосерологическим системам ABO, Rh, MNSs, Lewis, Kell, Duffy, Kidd и др.

Использование длительно хранящейся консервированной эритроцитарной тест-панели освобождает лаборатории и учреждения от значительной части ежедневной рутинной работы по заготовке стандартных эритроцитов и их подготовке к использованию в серологических реакциях, позволяет более рационально расходовать редкие и дефицитные образцы эритроцитов.

На рынке известны коммерческие консервирующие растворы, специально разработанные для хранения стандартных эритроцитов при положительной (4-6°С) температуре, известных иммунологических компаний ДАДЕ и БИОТЕСТ, состав которых храниться в секрете и является трудновоспроизводимым. Указанные растворы являются дорогостоящими для постоянного применения и не показывают достаточной эффективности.

Существуют также коммерческие растворы для хранения донорской крови - различные гемоконсерванты - глюгицир, цитроглюкофосфат, циглюфад, эритронаф, эритропифеден. Однако все указанные выше растворы не способны сохранять эритроциты более 21-35 сут.

Из уровня техники известен раствор для консервации энзимированных эритроцитов, используемых в изосерологических реакциях экспресс-определения антител систем Rh, Lewis, который включает компонентов в смеси (г/л): аденин 1,35 - 2,70; инозин 4,00 - 8,00; лимонная кислота 14,5 - 15,0; глюкоза 55,0 - 60,0; Na3PO4 - 2,00 - 3,00; мертиолат натрия 0,10 - 0,15; NaOH 8,50 - 9,00, при выявлении изогемагглютининов α и β в пятнах крови раствор дополнительно содержит CaCl2 в количестве 0,03 - 0,04 г/л. (RU 2012331 C1, приоритет 27.06.1991). Указанный раствор позволяет сохранить агглютинирующую активность и специфичность реакции агглютинации тест-эритроцитов в течение 2-3 недель в обычных, нестерильных условиях. Недостатками выше приведенного раствора являются короткое время сохранения способности давать специфическую реакцию гемагглютинации, а также тот факт, что при обработке эритроцитов энзимами разрушаются некоторые антигены эритроцитов, например антигены системы Kell, что приводит к невозможности выявить антитела к этим антигенам.

Из уровня техники известно техническое решение по патенту РФ RU 2554764 C2, приоритет 10.09.2013, где описан набор для консервации нативных эритроцитов, применяющихся для выявления антител к антигенам эритроцитов, который состоит из двух растворов: водного раствора для кратковременного пребывания эритроцитов, содержащего 9,0-11,0 г/л глюкозы, 0,2-0,3 г/л цитрата натрия, 0,01-0,02 г/л лимонной кислоты и 0,95-1,05 г/л бычьего сывороточного альбумина, и водного раствора для хранения эритроцитов, включающего 0,2-0,4 г/л аденина, 25,0-35,0 г/л глюкозы, 6,0-8,0 г/л маннитола, 0,2-0,3 г/л цитрата натрия, 0,05-0,07 г/л лимонной кислоты и 0,95-1,05 г/л бычьего сывороточного альбумина. Также в раствор для хранения эритроцитов может быть включен бисептол как комбинированное антибактериальное средство для предотвращения бактериального роста и дифлюкан, в котором активным компонентом является флуконазол, как противокандидозное средство. Минусом данного изобретения является сложность и многоэтапность выполнения, а также длительность хранения эритроцитов, заготавливаемых на этом растворе, несмотря на разделение растворов на раствор для кратковременного пребывания эритроцитов и на раствор для хранения эритроцитов является недостаточной.

Следует отметить, что известны и криологические способы хранения (криоконсервация) крови и эритроцитов (при температуре 196°С), при которых эритроциты сохраняют свои антигенные свойства в течение ряда лет. Однако криологические способы хранения требуют наличия дорогостоящей (многомиллионной) специальной аппаратуры, сложной техники замораживания и оттаивания, что трудноосуществимо в подавляющем большинстве лабораторий и медицинских учреждений.

Ближайшим аналогом изобретения является техническое решение, представленное в патенте РФ RU 2049466 C1, приоритет 09.06.1992. В источнике описан состав для сохранения нативных стандартных эритроцитов на основе глюкозы, отличающийся тем, что дополнительно содержит аденин, инозин, лимонную кислоту, натрий фосфорнокислый трехзамещенный, едкий натрий, пенициллин, стрептомицин, при этом рН среды в интервале 7,0-7,1 и соотношении объемов консерванта и осадка эритроцитов 4 - 9,1 при следующем соотношении компонентов, г/л: аденин 1,34 - 1,36, инозин 3,00 - 5,00, лимонная кислота 14,0 - 16,0, глюкоза 50,0 - 70,0, натрий фосфорнокислый трехзамещенный 2,00 - 4,00, едкий натрий 8,00 - 8,50, пенициллин 5,00 - 10,00, стрептомицин 5,00 - 10,00, дистиллированная вода до 1 л. Согласно источнику указанный состав расширяет спектр сохраняемых эритроцитарных антигенов и удлиняет срок сохранности полноценной эритроцитарной панели. Нативные эритроциты помещаются в указанный консервирующий раствор после отмывки физиологическим раствором, то есть 0,9%-ным водным раствором хлористого натрия.

Однако у доноров в крови могут уже присутствовать антитела к пенициллину, что вызывает взаимодействие консервированных эритроцитов с сыворотками и приводит к ложноположительному результату при исследовании антител к эритроцитам. Стрептомицин имеет узкий спектр действия на бактерии и малоэффективен. Так же необходимо отметить, что при практических испытаниях эритроциты, обработанные консервантом указанного состава, не позволяют сохранить свои диагностические качества на длительный срок и могут подвергаться бактериальному загрязнению. Таким образом, указанный заявленный прототип является недостаточно эффективным.

Несмотря на разнообразие растворов, составов и различных консервирующих наборов для длительного хранения нативных стандартных эритроцитов, все еще остается значительная неудовлетворенная потребность в подходящих композициях и наборах для длительной консервации нативных стандартных эритроцитов для последующего применения для диагностики антител к антигенам эритроцитов. Такие композиции, наборы и их применение представлены в настоящем изобретении.

Представленное изобретение касается композиции для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов, содержащая цитрат натрия, ортофосфат натрия, глюкозу, аденин и рибоксин, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит фетальную сыворотку, фосфолипиды и лизоцим. Изобретение также касается набора, состоящего из описанной выше композиции и стандартных нативных эритроцитов, и применение указанного набора для диагностики антител к антигенам эритроцитов.

Неожиданно было обнаружено, что при дополнительном добавлении к раствору для консервации нативных стандартных эритроцитов, содержащему цитрат натрия, ортофосфат натрия, глюкозу, аденин и рибоксин - трех компонентов: фетальной сыворотки, фосфолипидов и лизоцима - обеспечивается длительная консервация (хранение) нативных стандартных эритроцитов при нестерильных условиях при сохранении морфологической целостности эритроцитов (предотвращения их гемолиза), агглютинационной активности эритроцитов и сохранении специфичности реакции агглютинации. Указанным композициям удалось преодолеть все недостатки применения композиций и составов известных из уровня техники. По сравнению с прототипом и композициями, известными из уровня техники, заявляемые композиции для длительной консервации и наборы позволяют расширить спектр недорогих и доступных консервантов и значительно удлинить сроки хранения полноценной эритроцитарной панели за счет защиты клеточной мембраны эритроцитов на поздних сроках хранения.

О применении подобных композиций для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов, содержащих фетальную сыворотку, фосфолипиды и лизоцим в дополнение к цитрату натрия, ортофосфату натрия, глюкозе, аденину и рибоксину до последнего времени не сообщалось.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к композиции для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов, содержащей цитрат натрия, ортофосфат натрия, глюкозу, аденин и рибоксин, отличающуюся тем, что композиция дополнительно содержит фетальную сыворотку, фосфолипиды и лизоцим, и обеспечивает длительную консервацию эритроцитов за счет неожиданного эффекта именно трех дополнительных компонентов указанной композиции: фетальной сыворотки, фосфолипидов и лизоцима.

Предпочтительно, изобретение включает композицию, содержащую цитрат натрия, ортофосфат натрия, глюкозу, аденин и рибоксин, отличающуюся тем, что композиция дополнительно содержит фетальную сыворотку, фосфолипиды и лизоцим.

Согласно рассматриваемому изобретению, включение глюкозы и ортофосфата натрия, в соответствующих количествах, создает необходимую стабильность осмотического давления, обеспечивает энергетические процессы в клетке, а включение аденина и рибоксина, в соответствующих количествах, создает чувствительность и специфичность реакции агглютинации, обеспечивает энергетические потребности эритроцитов, при этом, включение цитрата натрия, в соответствующих количествах, обеспечивает постоянство рН, необходимого для нормального функционирования энзиматических систем эритроцитов и их жизнеспособности in vitro, и это в совокупности обеспечивает жизнеспособность эритроцитов in vitro, предупреждает образование микросгустков эритроцитов, а также препятствует разрушению эритроцитов (гемолизу).

Добавление трех дополнительных компонентов - фетальной сыворотки, фосфолипидов и лизоцима - к рассматриваемой композиции позволяет продлить сроки консервации жизнеспособных эритроцитов до 120 дней, что позволяет на долгое время сохранять готовые к работе отмытые эритроциты, позволяет производить заготовку и хранение стандартных эритроцитов в обычных, нестерильных условиях работы серологической лаборатории, упрощает процедуру их приготовления, делает доступным приготовление и использование заявляемого раствора для любой практической лаборатории, не имеющей оборудования и специалистов для работы в условиях асептики.

Под «фетальной сывороткой», которая может быть использована в композиции, понимают сыворотку крови телячьих эмбрионов, полученную промышленным путем, содержащую сложный комплекс высоко- и низкомолекулярных веществ с различными физиологически сбалансированными стимулирующими и ингибирующими рост активностями. Здесь и далее под «фетальной сывороткой» подразумевается телячья эмбриональная сыворотка.

Примерами фосфолипидов, которые также могут быть использованы в композиции, не ограничиваются и распространяются на лецитины из различных источников: фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидная кислота и другие. В частности, но не ограничиваясь, в составе композиции могут быть использованы соевые фосфолипиды, L-α-лецитин, L-α-фосфатидилхолин.

Подразумевается, что фетальная сыворотка и фосфолипиды в составе композиции придают системе свойства нативной плазмы крови, снижают уровень стрессового состояния для клеток, находящихся вне кровотока, обеспечивают питание эритроцитов, поддерживают эластичность и стабильность реологического состояния мембраны, предотвращая риск увеличения ее проницаемости.

Включение в состав композиции низкой концентрации лизоцима предотвращает развитие патогенной микрофлоры в процессе хранения эритроцитов без влияния на агглютинационную активность эритроцитов.

В одном аспекте, композиция для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов включает приблизительно от 50 до приблизительно 70 г/л глюкозы.

В следующем аспекте, композиция для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов включает приблизительно от 0,20 до приблизительно 0,30 г/л лизоцима.

В другом аспекте, композиция для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов включает приблизительно от 18 до приблизительно 22 г/л цитрата натрия.

В следующем аспекте, композиция для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов включает приблизительно от 2 до приблизительно 4 г/л ортофосфат натрия.

В другом аспекте, композиция для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов включает приблизительно от 1,3 до приблизительно 1,7 г/л аденина.

В следующем аспекте, композиция для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов включает приблизительно от 4 до приблизительно 6 г/л рибоксина.

В другом аспекте, композиция для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов включает приблизительно от 0,45 до приблизительно 0,55 г/л фосфолипидов.

В следующем аспекте, композиция для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов, в которой объемная доля фетальной сыворотки составляет 0,1%.

В частном аспекте, композиция для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов, включает 60 г/л глюкозы, 0,25 г/л лизоцима, 20 г/л цитрата натрия, 3 г/л ортофосфат натрия, 1,5 г/л аденина, 5 г/л рибоксина, 0,5 г/л фосфолипидов, а объемная доля фетальной сыворотки составляет 0,1%.

Под термином «эритроциты» подразумеваются красные кровяные тельца человека. Композиция и набор для консервации предполагаются для использования для нативных (не обработанных протеазами, т.е. не энзимированных) эритроцитов, а также стандартных по всем клинически наиболее значимым эритроцитарным изосерологическим системам ABO, Rh, MNSs, Lewis, Ph, Kell, Duffy, Kidd и др.

Перед добавлением в набор, по указанному изобретению, свежие эритроциты необходимых фенотипов должны быть 2-3 раза отмыты. Сохранение стандартов в виде отмытых эритроцитов позволяет всегда, в любое время суток иметь готовую для работы панель стандартных эритроцитов и использовать ее для немедленной диагностики иммунологических причин трансфузионных осложнений.

При разработке предлагаемых композиций были проведены экспериментальные исследования влияния соотношения ингредиентов в композиционном средстве, последовательности и условий их смешивания и других параметров на эффективность консервации стандартных нативных эритроцитов, а именно возможность длительной консервации.

Заявляемое соотношение ингредиентов в композиции и предлагаемый способ ее получения обеспечивают наибольший эффект при осуществлении предлагаемого применения нативных стандартных эритроцитов для диагностики антител к антигенам эритроцитов.

Применение набора стандартных нативных эритроцитов, состоящего из композиции для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов, содержащей цитрат натрия, ортофосфат натрия, глюкозу, аденин и рибоксин, фетальную сыворотку, фосфолипиды и лизоцим, и свежих отмытых стандартных нативных эритроцитов для диагностики антител к антигенам эритроцитов предполагает использование полученной эритроцитарной тест-панели в лабораторной клинической практике для выявления причин и/или предупреждения пострансфузионных осложнений, при определении антител к антигенам эритроцитов человека с обеспечением достоверного результата и высокой степени иммунологической совместимости при переливании крови.

Следующие примеры предлагаются с тем, чтобы обеспечить специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как получать и применять изобретение, его композиции и наборы, но они не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели рассматривают в качестве своего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Пропись приготовления композиции для консервации стандартных нативных эритроцитов

1. В чистую простерилизованную емкость вносили 500 мл воды очищенной деионизованной, добавляли аденин 1,5 г и рибоксин 5 г при перемешивании, устанавливали кислый рН (ниже 3) раствора, растворяли компоненты, далее последовательно вносили и растворяли глюкозу 50 г, цитрат натрия 20 г, ортофосфат натрия (Na3PO4⋅12H2O) 5 г, лизоцим производства Panreac, Испания, в количестве 0,25 г, далее устанавливали рН раствора 7,1±0,1, доводили объем до 1000 мл и проводили стерилизующую фильтрацию полученного раствора.

2. Подготовка телячьей эмбриональной сыворотки FBS производства HyClone, США (далее - фетальная сыворотка) проводилась путем прогревания ее на водяной бане при 56°С в течение 30 минут.

3. Отдельно проводилось приготовление 5% раствора соевых фосфолипидов S40 производства Lipoid GmbH (далее - СФЛ) проводилось путем растворения навески 5 г сухих СФЛ в 100 мл воды очищенной деионизованной при перемешивании. Далее в полученный раствор при перемешивании вносилась прогретая фетальная сыворотка 1 мл и Proclin 300 производства Sigma Aldrich, США в количестве до 1 мл.

4. В стерильных условиях вносили 10 мл смеси из п. 3 в раствор из п. 1 при тщательном перемешивании. Полученную композицию консерванта разливали в чистую простерилизованную тару по 100 мл, плотно укупоривали стерильными резиновыми пробками и обжимали алюминиевыми колпачками, далее хранили при температуре +4 - 6°С до использования. Срок использования такой композиции без потери свойств в течение менее 12 месяцев.

Пример 2. Приготовление набора

Свежие, отмытые от плазмы, эритроциты нужного фенотипа, добавляли в композицию консерванта в соотношении 1:5, разливали по 6 мл в стеклянные флаконы номинальным объемом 12 мл, плотно укупоривали резиновыми пробками и обжимали алюминиевыми колпачками и хранили в таком виде при температуре +4 - 6°С до 120 дней.

Пример 3. Сравнительный анализ

Консервирующие свойства композиции для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов исследовали по количеству осмотически неустойчивых эритроцитов в ней. Для этого измеряли процент клеток, подверженных гемолизу, от общего количества клеток в различные сроки хранения при температуре +4 - 6°С во взвеси стандартных эритроцитов, приготовленных по примеру 2 в композиции консерванта, приготовленной по примеру 1 (раствор №7): после изготовления эритроцитов в композиции, через 15, 30, 45, 60, 75, 90 и 120 дней.

Раствор №1 готовили по прописи прототипа по патенту RU 2049466, а именно согласно примеру 1, где описывается в качестве раствора с предпочтительными весовыми соотношениями ингредиентов (в г/л дистиллированной воды) состав для стерильного сохранения стандартных эритроцитов в виде взвеси цельной крови в определенном количестве стерильного раствора: аденин 1,35, инозин (рибоксин) 4,00, лимонная кислота 15,0, глюкоза 60,0, натрий фосфорно-кислый трехзамещенный (Na3PO4⋅12H2O) 3,00, едкий натрий 8,50, бензил-пенициллин (натриевая соль) 5,00, стрептомицин (сульфат) 5,00, вода дистиллированная до 1000,0 (мл).

Одновременно провели исследование гемолиза эритроцитов в других композициях для консервации нативных стандартных эритроцитов:

- Раствор №1 приготовили по прописи прототипа (патент RU 2049466);

- Раствор №2 приготовили аналогично раствору №1, но вместо антибиотиков внесли лизоцим в количестве 0,25 г/л от общего объема раствора;

- Раствор №3 приготовили аналогично раствору №1 с добавлением в него соевых фосфолипидов в количестве 0,5 г/л;

- Раствор №4 приготовили аналогично раствору №2 с добавлением в него соевых фосфолипидов в количестве 0,5 г/л;

- Раствор №5 приготовили аналогично раствору №1 с добавлением в него фетальной сыворотки в концентрации 0,1% от общего объема;

- Раствор №6 приготовили аналогично раствору №2 с добавлением в него фетальной сыворотки в концентрации 0,1% от общего объема.

Результаты исследования приведены в таблице 1.

Результаты исследования показали непригодность раствора №1 (приготовлен по прописи прототипа по патенту РФ RU 2049466) для длительной консервации нативных стандартных эритроцитов. Через 75 дней показатель гемолиза клеток в данном растворе превысил 1% от общего количества клеток, и более 10% клеток подверглось гемолизу через 120 дней после начала изучения стабильности взвеси эритроцитов.

Внесение различных добавок в прототип консерванта оказало положительное влияние на сохранность эритроцитов. Например, при введении в прототип лизоцима вместо антибиотиков широкого спектра (раствор №2) количество клеток, подверженных гемолизу, не превышало 10% через 120 дней после начала изучения стабильности взвеси эритроцитов.

Добавление СФЛ (раствор №3) значительно улучшило состояние эритроцитов в течение 75 дней (гемолиз клеток составил менее 1%), дальнейшее хранение в растворе №3 было нерациональным (гемолиз клеток составил почти 5% через 90 дней, и 7% через 120 дней). Однако полученные результаты были лучше относительно результатов с использованием прототипа (гемолиз клеток через 120 дней хранения в растворе №2 не превышал 7%).

Введение в прототип консерванта фетальной сыворотки (раствор №5) также оказало положительное влияние на жизнеспособность и сохранность эритроцитов на срок не менее 75 дней (процент гемолиза составил на данном сроке хранения 0,99±0,12%). Дальнейшее хранение в растворе №5 было нерациональным (гемолиз клеток составил также как и в растворе №3 почти 5% через 90 дней, и 7% через 120 дней).

Сочетания СФЛ с лизоцимом (раствор №4) или фетальной сыворотки с лизоцимом (раствор №6) оказали положительное влияние на эритроциты в течение не менее 75 дней (гемолиз составил около 1% для разных сочетаний добавок в растворах). Однако результаты исследования подтвердили наибольшую эффективность применения композиции консерванта (раствор №7) для хранения стандартных эритроцитов при температуре +4 - 6°С. Доля подверженных гемолизу эритроцитов в растворе №7 снижалась незначительно во все сроки исследования по сравнению с прототипом и не превышала 1% в течение не менее 90 дней с момента приготовления взвеси эритроцитов в растворе. Через 120 дней количество осмотически неустойчивых клеток составило 1,45±0,15% от общего количества клеток, что в 5 раз ниже аналогичного показателя при хранении эритроцитов во всех остальных консервирующих растворах (растворы №№2-7) и в 10 раз меньше аналогичного показателя при хранении эритроцитов в прототипе композиции (раствор №1).

Заявленные композиция и набор обеспечивают возможность пребывания до 120 дней эритроцитов крови в консерванте при температуре от +4 +6°С без их гемолиза и падения их агглютинационной активности.

Пример 4. Проверка эритроцитов

Для проверки консервирующих свойств исследуемых растворов исследовали активность антигенов эритроцитов в реакции прямой агглютинации с сыворотками, содержащими антитела к антигенам, присутствующим в эритроцитах. Для этого поставили реакции агглютинации с различными эритроцитами системы АВО, например: для эритроцитов А, которые взаимодействовали с сыворотками, содержащими анти-А антитела, и не взаимодействовали с сыворотками, содержащими анти-В антитела; для эритроцитов В по факту их агглютинации с сыворотками, содержащими анти-В антитела, и отсутствия агглютинации с анти-А антителами, и так далее для всех групп эритроцитов системы АВО. Эритроциты были заготовлены по примеру 2, в композиции консерванта, приготовленному по примеру 1 (раствор №7), и исследовались в различные сроки хранения при температуре +4 - 6°С: после изготовления эритроцитов в консервирующем растворе, через 15, 30, 45, 60, 75, 90 и 120 дней. Одновременно провели аналогичное исследование активности антигенов эритроцитов, заготовленных в других консервирующих растворах, описание которых приведено в примере 3 (растворы №№1-6).

Результаты исследования активности эритроцитов системы АВО при взаимодействии с соответствующими сыворотками описаны ниже. Эритроциты давали реакцию агглютинации с соответствующими антителами в сыворотках сразу после их заготовки во всех вариантах растворов, а также при их хранении в растворах до 60 дней, однако через 75 дней отсутствовала реакции агглютинации эритроцитов А с антителами анти-А и эритроцитов В с антителами анти-В, заготовленных в растворе по прописи прототипа. Похожая ситуация наблюдалась и при внесении добавок в состав консервирующего раствора: через 75 дней не наблюдались агглютинации эритроцитов В с антителами анти-В в растворах, содержащих лизоцим (раствор №2), фетальную сыворотку (раствор №5) и их сочетания (раствор №6). При введении в консервирующий раствор соевых фосфолипидов и их сочетания с лизоцимом (растворы №№3, 4) или при использовании композиции консерванта со всеми добавками (раствор №7) наблюдались стабильные показатели агглютинации во все сроки исследования для всех типов эритроцитов с соответствующими им антителами. При этом отсутствовала агглютинация эритроцитов А с антителами анти-В и эритроцитов В и антителами анти-А.

Далее провели аналогичное исследование активности антигенов эритроцитов систем Rh, MNSs, Lewis, Kell, Duffy и Kidd. Эритроциты соответствующих фенотипов были заготовлены по примеру 2, в композиции консерванта, приготовленному по примеру 1 (раствор №7), и исследовались в различные сроки хранения при температуре +4 - 6°С: после изготовления эритроцитов в консервирующем растворе, через 15, 30, 45, 60, 75, 90 и 120 дней. Одновременно провели аналогичное исследование активности антигенов эритроцитов, заготовленных в других консервирующих растворах, описание которых приведено в примере 3 (растворы №№1-6). Результаты исследования активности эритроцитов при взаимодействии с соответствующими сыворотками описаны ниже. Эритроциты давали реакцию агглютинации с соответствующими антителами в сыворотках сразу после их заготовки во всех вариантах растворов, а также при их хранении в растворах до 60 дней. Далее результаты исследования подтвердили непригодность использования прототипа консервирующего раствора (раствор №1), поскольку через 75 дней типированные эритроциты не взаимодействовали с сыворотками, содержащими антитела к антигенам этих эритроцитов. Растворы №2-6 также не сохраняли антигены эритроцитов в надлежащем состоянии, поскольку не наблюдались необходимые реакции агглютинации в различные сроки после начала исследования (через 60-90 дней) после заготовки эритроцитов в данных растворах.

Однако композиция раствора, содержащего все добавки (раствор №7), доказала свою пригодность для длительного хранения эритроцитов систем Rh, MNSs, Lewis, Kell, Duffy и Kidd, поскольку во все сроки хранения наблюдалась однозначная реакция агглютинации типированных эритроцитов с сыворотками, содержащими соответствующие антитела к антигенам данных эритроцитов, а также отсутствовали ложноположительные реакции агглютинации.

Заявленные композиция и набор обеспечивают возможность пребывания до 120 дней эритроцитов крови в консерванте при температуре от +4 +6°С без их гемолиза и падения их агглютинационной активности, что делает эритроциты пригодными для использования в качестве тест-панели при определении антител к антигенам эритроцитов человека с обеспечением достоверного результата.

Пример 5. Сравнительный анализ фосфолипидов

Приготовили несколько вариантов консервирующих растворов по примеру 1, но взамен 5% раствора СФЛ вносили в них аналогичные количества 5% растворов L-α-лецитина или L-α-фосфатидилхолина производства Merck, США или растворов их комбинаций с лизоцимом в количестве 0,25 г/л от конечного объема раствора. Далее исследовали стабильность эритроцитов в консервирующих растворах, описанных в примере 1 и 5. Исследование проводили в условиях и методами, аналогичных примеру 3 и 4.

По результатам исследования был сделан вывод, о том, что все растворы одинаковы по своим характеристикам вне зависимости от вида фосфолипидов, а срок хранения эритроцитов от этого не менялся.

1. Композиция для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов, содержащая цитрат натрия, ортофосфат натрия, глюкозу, аденин и рибоксин, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит фетальную сыворотку, фосфолипиды и лизоцим.

2. Композиция по п. 1, где фосфолипиды выбраны из соевых фосфолипидов, L-α-лецитина, L-α-фосфатидилхолина или их комбинаций.

3. Композиция по п. 1, которая включает от 50 до 70 г/л глюкозы.

4. Композиция по п. 1, которая включает от 0,20 до 0,30 г/л лизоцима.

5. Композиция по п. 1, которая включает от 18 до 22 г/л цитрата натрия.

6. Композиция по п. 1, которая включает от 2 до 4 г/л ортофосфата натрия.

7. Композиция по п. 1, которая включает от 1,3 до 1,7 г/л аденина.

8. Композиция по п. 1, которая включает от 4 до 6 г/л рибоксина.

9. Композиция по п. 1, которая включает от 0,45 до 0,55 г/л фосфолипидов.

10. Композиция по п. 1, в которой объемная доля фетальной сыворотки составляет 0,1%.

11. Композиция по п. 2, которая включает 60 г/л глюкозы, 0,25 г/л лизоцима, 20 г/л цитрата натрия, 3 г/л ортофосфата натрия, 1,5 г/л аденина, 5 г/л рибоксина, 0,5 г/л фосфолипидов, а объемная доля фетальной сыворотки составляет 0,1%.

12. Набор для длительной консервации стандартных нативных эритроцитов, состоящий из композиции по любому из пп. 1-11 и стандартных нативных эритроцитов.

13. Применение набора по п. 12 для диагностики антител к антигенам эритроцитов.