Способы увеличения уровня 2'-дезоксиуридина (durd) в плазме и ингибирования тимидилатсинтазы

Изобретение относится к медицине, а именно к способу повышения уровней 2’-дезоксиуридина (dUrd) в плазме субъекта человека. Способ увеличения концентрации 2’-дезоксиуридина (dUrd) в плазме субъекта человека, включающий: стадию (а) введения 400 мг/м² или 500 мг/м² 5-фторурацила (5-FU) внутривенно в виде болюсной инъекции субъекту-человеку; после стадии (а) стадию (b) внутривенного введения 30, 60, 120 или 240 мг/м² [6R]-5,10-метилентетрагидрофолата (6R-MTHF) внутривенно в виде двух болюсных инъекций указанному субъекту-человеку и (с) необязательное введение 2400 мг/м² 5-FU в виде непрерывной инфузии одновременно с стадией (b) или после нее. Вышеописанный способ позволяет значительно повысить dUrd в плазме крови при совместном введении с 5-FU эквимолярной дозы 6R-MTHF по сравнению с лекарственным средством. 10 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 2 пр.

 

По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/458868, поданной 14 февраля 2017 г., которая включена в настоящее описание во всей своей полноте в виде ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к лечению солидных опухолей у человека, таких как рак, которое включает введение [6R]-5,10-метилен-тетрагидрофолата (6R-МТГФ) в на фоне химиотерапии 5-фторурацилом (5-ФУ).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

5-Фторурацил (5-ФУ) был впервые введен в 1957 и остается основным средством лечения солидных опухолей, включая рак ободочной и прямой кишки (CRC). Цитотоксическая активность 5-ФУ обусловлена главным образом ингибированием тимидилатсинтазы (TS) и до некоторой степени также включением метаболитов в РНК. (Ford et al. (2002) Clinical Cancer Research 2002; 8(1):103-109). Общий показатель ответа только на 5-ФУ довольно ограничен (10-15%), и для повышения противоопухолевой активности 5-ФУ были разработаны стратегии модуляции (Johnston et al. Anticancer Drugs 2001, 12:639-646). Одна из наиболее широко используемых стратегий включает совместное введение фолата, 5-формил-тетрагидрофолата (фолиновой кислоты или лейковорина или ЛВ), с 5-ФУ (Romanini et al. (1991) Cancer Res., 51:789-793; Keyomarsi et al. (1988) J. Biol. Chem., 263:14402-14409). ЛВ стабилизирует тройной комплекс, который ингибирует тимидилатсинтазу (TS), фермент, необходимый для синтеза ДНК (Longley et al. (2003) Nat. Rev. Cancer, 3(5):330-8). При добавлении ЛВ к 5-ФУ общий уровень ответов увеличился до более чем 20% (Id.).

Восстановленный фолат, фотрексорин-кальций (CoFactor®) (кальциевая соль (dl)-5,10-метилен-птероил-моноглутамата или Ca соль [6R,S]-5,10-метилен-ТГФ), также известный в виде рацемической смеси метилен-ТГФ, был предложен в качестве альтернативы ЛВ, исходя из предположения, что прямое введение восстановленного фолата метилен-ТГФ вместо ЛВ может обеспечить существенные преимущества в отношении клинической активности. CoFactor® представляет собой 1:1 смесь двух диастереоизомеров (Odin, E., Carlsson, G., Frösing, R., Gustavsson, B., Spears, C.P., Larsson, P.A., 1998. Chemical stability and human plasma pharmacokinetics of reduced folates. Cancer Invest. 16, 447-455). Поскольку [6R]-изомер является непосредственно активным ко-субстратом для TS, ожидалось, что введение CoFactor® вместо лейковорина обеспечит преимущества за счет более низкой изменчивости клинической безопасности и эффективности, наблюдаемой как среди пациентов, так и одного у пациента.

Действительно, в клиническом исследовании фазы II с участием пациентов с метастатическим раком ободочной и прямой кишки, ранее не получавших лечение, частота ответа на CoFactor® оказалась равной 35% (Saif, M.W, Merritt, J, Robbins J, Stewart J., Schupp, J, 2006. Phase III Multicenter Randomized Clinical Trial to Evaluate the Safety and Efficacy of CoFactor®/5-Fluorouracil/Bevacizumab Versus Leucovorin/5-Fluorouracil/ Bevacizumab as Initial Treatment for Metastatic Colorectal Carcinoma Clinical Colorectal Cancer, Vol. 6, No. 3, 229-234, 2006), а в другом клиническом исследовании фазы I/II у 40% пациентов с раком поджелудочной железы введение CoFactor® в сочетании с 5-ФУ обеспечило положительный клинический эффект, определяемый как стабильное заболевание или ответ опухоли (Saif, M.W., Makrilia N., Syrigos K., 2010. CoFactor: Folate Requirement for Optimization of 5-Fluouracil Activity in Anticancer Chemotherapy. Journal of Oncology Vol. 1-5). Тем не менее, помимо ненужной нагрузки, связанной с детоксикацией печени, не встречающийся в природе (6S)-изомер отчасти является конкурентным ингибитором природного [6R]-изомера в отношении его действия в качестве ко-субстрата TS (Leary, R.P., Gaumont, Y., Kisliuk, R.L., 1974. Effects of the diastereoisomers of methylenetetrahydrofolate on the reaction catalyzed by thymidylate synthetase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 56, 484-488). Кроме того, в клиническом исследовании фазы IIb не было продемонстрировано, что CoFactor® является более эффективным при раке ободочной и прямой кишки, чем лейковорин, поскольку не было обнаружено никаких существенных различий в эффективности или безопасности между исследуемыми группами, и запланированное исследование фазы III в отношении рака ободочной и прямой кишки было прекращено до его завершения (Пресс-релиз: ADVENTRX Provides Update on Cofactor Program. Nov 2, 2007).

Имеется большая потребность в композициях и способах стабилизации тройного комплекса и усиления ингибирования TS. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что введение 6R-МТГФ повышает уровни 2'-дезоксиуридина (dUrd) в плазме по сравнению с введением эквимолярных концентраций ЛВ. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что введение 6R-МТГФ усиливает ингибирование TS по сравнению с введением эквимолярных концентраций ЛВ.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что при совместном введении с 5-ФУ эквимолярные дозы 6R-МТГФ приводят к значительно более высоким уровням dUrd в плазме крови по сравнению с ЛВ. Повышение уровня 2'-дезоксиуридина (dUrd) в плазме является маркером ингибирования TS (Ford et al. (2002) Clinical Cancer Research 2002; 8(1):103-109). Настоящее изобретение относится к способам повышения уровней dUrd в плазме, включающим введение 6R-МТГФ. Способы повышения уровня dUrd в плазме обеспечивают увеличение уровней по сравнению с эквимолярными концентрациями ЛВ. Настоящее изобретение также относится к способам усиления ингибирования TS, включающим введение 6R-МТГФ.

Повышение уровня dUrd в плазме в качестве суррогатного маркера ингибирования TS постепенно становится биомаркером выбора. Этот анализ также относительно прост в осуществлении, состоящему из забора крови и анализа ЖХ-МС/МС. Обработка ингибиторами TS, такими как 5-ФУ, приводит к увеличению внутриклеточных пулов dUMP субстрата TS, что отражается в увеличенных уровнях соответствующего нуклеозида dUrd, который по существу является внеклеточным и может быть измерен в плазме. Кроме того, было показано, что повышение уровня dUrd в плазме возникает после введения ингибиторов TS и, таким образом, является суррогатным маркером ингибирования TS (Ford et al (2002)).

Авторы изобретения понимают, что повышение уровней dUrd в плазме непосредственно отражает текущее общее состояние ингибирования TS опухоли в организме во время лечения 5-ФУ, выявляя все присутствующие участки опухоли, включая метастазы.

Вышесказанное полностью подтверждается данными о том, что базовая активность TS в опухолях намного выше, чем в слизистой оболочке, и что как связывание метаболита, 5-фтордезоксиуридинмонофосфата (FdUMP), с TS, так и TS-ингибирующий эффект во время терапии 5-ФУ существенно выше в опухолях, чем в слизистой оболочке и других клетках организма. Примечательным является то, что без добавления экзогенного фолата (МТГФ) в опухолях практически отсутствует связывание FdUMP (Peters et al. (1991) Eur J Cancer, 27 (3):263-267).

Таким образом, уровень dUrd в плазме в качестве суррогатного маркера ингибирования TS явно выделяется на фоне более старых анализов, основанных, например, на TS-связывании ³H-FdUMP, которые ограничиваются только in vitro исследованиями, например, биопсии опухолей или слизистой оболочки, или анализа выделенного TS-фермента. Эти анализы связывания на основе радиоактивной метки в настоящее время используются редко, если вообще используются, и тесно связаны с очень большой изменчивостью (Peters et al. (1991) Eur J Cancer, 27 (3):263-267), а также с трудностями, связанными с получением необходимых материалов для анализов.

Авторы изобретения полагают, что для перехода опухоли в состояние апоптоза, необходимое для инициации некроза опухоли, необходима степень ингибирования TS выше 90%. Кроме того, предполагается, что 6R-МТГФ обладает способностью стабилизировать вышеуказанный ингибирующий тройной комплекс до уровня, необходимого для обеспечения ингибирования TS на уровне 90% и выше.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1: Усиленное ингибирование TS после введения 5-ФУ с 30 и 60 мг/м² 6R-МТГФ (обозначенным как «6R») по сравнению с 30 мг/м² l-ЛВ («L-ЛВ») (обозначенным как «L-ЛВ 30») по сравнению с 60 мг/м² рацемической смеси (d,l-ЛВ или ЛВ).

Фиг. 2: Уровни dUrd в плазме по отношению к L-ЛВ 30 мг/м² (60 мг/м² d,l-ЛВ или ЛВ, или ЛВ 60) после введения 5-ФУ с 30 и 60 мг/м² 6R-МТГФ (обозначенным как «6R»).

Фиг. 3: Эквимолярное сравнение ЛВ и 6R-МТГФ, показанное в виде возрастающих уровней dUrd в плазме через 24 часа после болюсной инъекции 500 мг/м² 5-ФУ, введенной вместе с болюсной инъекцией 30 мг/м² l-ЛВ (обозначенным как «L-ЛВ30») (60 мг/м² d, l-ЛВ или ЛВ) или 30 мг/м² 6R-МТГФ (обозначенным как «М30»). Приращения рассчитывали как индивидуальные различия между концентрациями dUrd в плазме через 24 часа (t₂₄) за вычетом концентрации dUrd в плазме непосредственно перед инъекцией (t₀) для циклов L-ЛВ (n=48) и циклов 6R-МГТФ (n=18). L-ЛВ является активным природным изомером ЛВ, который представляет собой смесь 50:50 L-ЛВ и неприродного, не(значительно) активного d-ЛВ. Молекулярные массы 6R-МТГФ и L-ЛВ достаточно схожи в качестве основы для эквимолярного сравнения. Различие между группами проверяли с помощью U-критерия Манна-Уитни (р<0,05).

Фиг. 4: 6R-МГТФ дозозависимое увеличение возрастающих уровней dUrd в плазме через 24 часа после введения болюсной инъекции 500 мг/м² 5-ФУ вместе с болюсной инъекцией 30 мг/м² L-ЛВ (обозначенным как «L-ЛВ30») (60 мг/м² d,l-ЛВ или ЛВ) или 30 мг/м² 6R-МГТФ (обозначенным как «M30»), или 60 мг/м² 6R-МГТФ (обозначенным как «M60»). Приращения рассчитывали как индивидуальные различия между концентрациями dUrd в плазме через 24 часа (t₂₄) за вычетом концентрации dUrd в плазме непосредственно перед инъекцией (t₀) для циклов L-ЛВ (30 мг/м², n=48) и циклов 6R-МТГФ (30 мг/м², n=18; 60 мг/м², n=16). Различия между группами были значимыми согласно результатам двустороннего дисперсионного анализа Фридмана (р<0,05).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном из вариантов осуществления [6R]-5,10-метилен-тетрагидрофолиевую кислоту (6R-МТГФ) или ее фармацевтически приемлемую соль используют в виде твердой формы, которая растворима в воде, или в виде лиофилизата, необязательно стабилизированного одним или более подходящими наполнителями и/или антиоксидантами, такими как лимонная кислота или аскорбиновая кислота или их солевые формы. В одном из вариантов осуществления 6R-МТГФ вводят в виде одного или более болюсов для внутривенного введения, причем каждый болюс содержит 5-1000 мг/м² BSA (площади поверхности тела), например 5 мг/м² BSA, например 7 мг/м² BSA, например 10 мг/м² BSA, например 15 мг/м² BSA, например 30 мг/м² BSA, например 60 мг/м² BSA, например 120 мг/м² BSA, например 240 мг/м² BSA, например 480 мг/м² BSA, например, 720 мг/м² BSA или 960 мг/м² BSA. Используемый в настоящем описании термин «болюс» означает способ внутривенного введения, при котором разовая доза фармацевтической композиции вводится сразу, в отличие от внутривенной инфузии, когда разовая доза вводится при постоянной концентрации в течение определенного периода времени.

Дозировка зависит от формы терапии, формы применения препарата, а также от возраста, веса, питания и состояния пациента. Лечение может начинаться с меньшего количества, ниже оптимального, которое может быть увеличено для достижения оптимального эффекта. Предпочтительная доза, используемая в терапии, составляет от 10 до 3000 мг в сутки, в частности от 50 до 500 мг в сутки. Введение можно выполнять в виде разовой дозы или в виде многократных доз.

В одном из вариантов осуществления 6R-МТГФ может быть в форме свободной кислоты, в форме фармацевтически приемлемой соли, в частности кислой соли, а также соли щелочного или щелочноземельного металла.

В другом варианте осуществления МТГФ включает оба диастереомерных изомера, в частности диастереоизомерно чистый природный 6R-МТГФ. Используемый в настоящем описании термин «диастереоизомерно чистый» означает 6R-МТГФ или его соль в изомерном избытке по сравнению с другим изомером, более чем примерно 80%, предпочтительно более чем примерно 90%, предпочтительно более чем примерно 95%, более предпочтительно более чем примерно 97% и более предпочтительно более чем примерно 99%, более предпочтительно более чем примерно 99,5% или более, и наиболее предпочтительно до 100%, где остаток представляет собой другой изомер, 6S-МТГФ.

В другом варианте осуществления 6R-МТГФ является химически чистым. Используемый в настоящем описании термин «химически чистый» означает соединение с химической чистотой примерно 80%, предпочтительно с химической чистотой примерно 90%, более предпочтительно примерно 95%, более предпочтительно примерно 97%, более предпочтительно примерно 98% и наиболее предпочтительно 99% или выше 99%, например, с химической чистотой 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 или до 100%, согласно результатам определения методом ВЭЖХ. Химические примеси могут включать непрореагировавший исходный материал (включая растворители), продукты разложения 6R-МТГФ (такие как тетрагидрофолиевая кислота и ее продукты разложения) и т.д.

Необязательно, фармацевтическая композиция, содержащая, например 6R-МТГФ, может дополнительно содержать по меньшей мере одно противораковое соединение. Противораковое соединение может включать, без ограничения, один или более химиотерапевтических агентов, таких как, без ограничения: нуклеиновые кислоты, в частности фторированные нуклеиновые кислоты (например, 5-фторурацил (5-ФУ) или его аналог или пролекарство), антифолаты (например, пеметрексед, ралтитрексид, лометрексол), ингибиторы топоизомеразы (например, иринотекан, топотекан), антиметаболитные лекарственные средства (например, метотрексат, гемцитабин, тезацитабин), модуляторы 5-ФУ, алкилирующие агенты (например, циклофосфамид, кармустин), ингибиторы биосинтеза нуклеиновых кислот (митомицин, антрациклины (например, эпирубицин, доксорубицин)), производные платины (например, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин), препараты, разрушающие микротрубочки (например, паклитаксел, доцетаксел, винолребин, винкристин), препараты, блокирующие гормоны (например, ингибиторы тамоксифена) ингибиторы киназ, включая, без ограничения, рецепторные и нерецепторные тирозинкиназы (например, Iressa, Tarceva, SU5416, PTK787, Gleevec), ингибиторы протеосом (например, бортезомиб), иммуномодуляторы (например, левамисол), противовоспалительные лекарственные средства, ингибиторы васкуляризации, цитокины (например, интерлейкины, факторы некроза опухолей) и лекарственные средства, ингибирующие активность цитокинов, гормонов или рецепторов цитокинов или гормонов (например, анти-VEGF-антитело бевацизумаб или «Авастин»). Противораковые соединения также могут включать моноклональные антитела, такие как, без ограничения, моноклональные антитела, которые связывают цитокины, гормоны или рецепторы гормонов (например, антитела, которые блокируют активацию факторов роста EGF или VEGF, такие как авастин, эрбитукс, герцептин) и т.д. В одном из вариантов осуществления 6R-МТГФ вводят в комбинации с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного противоракового соединения. Когда 6R-МТГФ вводят в комбинации с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного противоракового соединения, специалист в данной области техники поймет, что по меньшей мере указанное одно противораковое соединение можно вводить до, после или одновременно с 6R-МТГФ.

ПРИМЕРЫ

Приведенные ниже примеры просто демонстрируют природу настоящего изобретения и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения или прилагаемую формулу изобретения.

Пример 1 - Лечение 5-ФУ и фолатами.

1. Структура исследования.

Безопасность и эффективность [6R]-5,10-метилентетрагидрофолата ([6R]-МТГФ) анализируют в открытом когортном исследовании фазы I/II на нескольких площадках (ISO-CC-005) у пациентов с раком ободочной и прямой кишки стадии IV (mCRC) для определения безопасной и переносимой в/в болюсной дозы 6R-МТГФ в комбинации со стандартными дозами 5-ФУ (500 мг/м²) отдельно или в комбинации с фиксированной дозой бевацизумаба, оксалиплатина или иринотекана. Среди групп пациентов (n≥3) возрастающие дозы 6R-МТГФ в пределах от 30-240 мг/м² BSA оценивают в присутствии различных комбинаций цитотоксических препаратов, только 5-ФУ или 5-ФУ плюс оксалиплатин, бевацизумаб или иринотекан, вводимых стандартными дозами. Ожидается, что исследование будет завершено к концу 2017 года. Краткое описание плана исследования и каждой группы исследования приведено ниже в таблице 1.

Таблица 1: Начальные дозы химиотерапевтических агентов (бевацизумаб, оксалиплатин, иринотекан и/или 5-ФУ) и исследуемого лекарственного средства (6R-МТГФ)

Группа лечения	Когорта*	Бевацизумаб	Оксалиплатин	Иринотекан#	5-ФУ *	6R-МТГФ	5-ФУ
Через примерно -180 минут (инфузия от 30 до 90 мин)	Через примерно -60 минут (инфузия от 15 до 120 мин)	Через примерно -60 минут (инфузия от 30 до 90 мин)	Через 0 минут (болюс)	Через примерно 30 минут (болюс)a	Через примерно 35 минут (46-часовая непрерывная инфузия)a
Группа 1	Когорта 1	N/A	N/A	N/A	500 мг/м2	30 мг/м2	N/A
	Когорта 2	N/A	N/A	N/A	500 мг/м2	60 мг/м2	N/A
	Когорта 8	N/A	N/A	N/A	500 мг/м2	120 мг/м2	N/A
Когорта 9	N/A	N/A	N/A	500 мг/м2	240 мг/м2	N/A
Группа 2	Когорта 4	N/A	85 мг/м2	N/A	500 мг/м2	30 мг/м2	N/A
Когорта 5	N/A	85 мг/м2	N/A	500 мг/м2	60 мг/м2	N/A
Группа 3	Когорта 6	N/A	N/A	180 мг/м2	500 мг/м2	30 мг/м2	N/A
Когорта 7	N/A	N/A	180 мг/м2	500 мг/м2	60 мг/м2	N/A
Группа 4	Когорта 12	N/A	85 мг/м2	N/A	400 мг/м2	60 мг/м2a	2400 мг/м2
	Когорта 13	N/A	85 мг/м2	N/A	400 мг/м2	120 мг/м2a	2400 мг/м2
Когорта 14	N/A	85 мг/м2	N/A	400 мг/м2	240 мг/м2a	2400 мг/м2
Группа 5	Когорта 15	5 мг/кг	85 мг/м2	N/A	400 мг/м2	SP2Da,b	2400 мг/м2

Сокращение: N/A: не применимо, SP2D: доза, выбранная для фазы 2.

Окно временных точек для введения оксалиплатина может быть расширено для обеспечения времени инфузии до 120 минут, при необходимости

# Окно временных точек для введения иринотекана может быть расширено для обеспечения времени инфузии до 90 минут, при необходимости.

Вводимая болюсная доза 5-ФУ не должна превышать максимальную рекомендуемую суточную дозу 1000 мг независимо от площади поверхности тела.

* Когорта № 3, Когорта № 10 и Когорта № 11, первоначально включенные в более ранние версии этого протокола клинического исследования, были исключены.

a В группе лечения № 4 (когорты № 12, № 13 и № 14) и группе № 5 (когорта № 15) общая доза 6R-МТГФ может быть разделена на две (2) в.в. болюсные инъекции, вводимые примерно через 30 и 60 минут после введения болюсной инъекции 5-ФУ (через 0 минут), соответственно. Непрерывная инфузия 5-ФУ может быть приостановлена для введения второй инъекции 6R-МТГФ.

b Уровень дозы 6R-МТГФ в группе лечения № 4 (MOFOX) оценивается как уровень дозы с наиболее благоприятным профилем для следующего исследования.

В Гетеборге в течение почти двух десятилетий собирают клинические данные о лечении и результатах по всем пациентам с CRC. Образцы плазмы и ткани хранятся в биобанке в соответствующих физических условиях для длительного хранения. База данных и биобанк работают согласно соответствующим этическим и нормативным требованиям. Пациентов, получавших стандартную дозу 5-ФУ, 500 мг/м², плюс в/в болюсная доза ЛВ, 60 мг/м² (эквивалентная 30 мг/м² L-ЛВ), отбирали случайным образом из банка данных.

Сохраненные образцы плазмы всех пациентов использовали для определения dUrd.

Настоящее исследование является историческим сравнительным исследованием групп. Все пациенты получали стандартную дозу 500 мг 5-ФУ, вводимую в виде болюсной инъекции, плюс соответствующий фолат 6R-МТГФ или ЛВ, также вводимый в виде болюсной инъекции.

2. Пациенты, получавшие 6R-МТГФ.

Все пациенты были протестированы в течение двух последовательных циклов лечения 5-ФУ. Значения dUrd измеряли непосредственно перед введением 5-ФУ (t₀) и через 24 часа (t₂₄). Средние значения и стандартные отклонения для различия между значениями, полученными для t₂₄ и t₀, наблюдаемой у пациентов, рассчитывали для каждого уровня дозы - 30 и 60 мг/м² 6R-МТГФ, соответственно. Некоторые значения для дозы 240 мг/m² 6R-МТГФ также были проанализированы и рассчитаны.

3. Пациенты, получавшие ЛВ.

Двадцать четыре пациента с метастатическим раком (mCRC) ободочной и прямой кишки, получавшие 5-ФУ плюс 60 мг/м² ЛВ, были отобраны случайным образом из базы данных, и для каждого пациента определяли уровни dUrd в t₀ и t₂₄ в двух циклах лечения, и таким же образом, как для пациентов с 6R-МТГФ, рассчитывали среднее значение и стандартные отклонения для различия между значениями, полученными в t₂₄ и t₀. Поскольку ЛВ представляет собой смесь 50:50 природных (1-формил-тетрагидрофолат) и не встречающихся в природе (d-формил-тетрагидрофолат) изомеров, активный изомер составляет половину от заданной дозы ЛВ. Молекулярные массы ЛВ и 6R-МТГФ очень похожи, и поэтому 60 мг ЛВ можно рассматривать в качестве эквимолярных 30 мг 6R-МТГФ.

4. Статистические методы.

Различия между всеми четырьмя группами проверяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа Фридмана, и после этого оценивали различие между двумя группами, получавшими эквимолярные дозы ЛВ 60 мг/м² и 6R-МТГФ 30 мг/м² с помощью U критерия Манна-Уитни. Значения P менее 0,05 считались значимыми.

3. Определение уровня dUrd в плазме.

Уровень dUrd в плазме определяли методом, включающим жидкостную хроматографию с последующей тандемной масс-спектрометрией, в общих чертах описанную ниже. Образцы плазмы, хранившиеся в морозильной камере при -80°С, извлекали и в плазму добавляли трихлоруксусную кислоту, затем образцы перемешивали и центрифугировали. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр с молекулярной массой 10 кДа и снова центрифугировали в течение 30 минут. Раствор, находящийся на дне пробирки был готов для анализа методом ЖХ-МС/МС. Образцы для калибровки готовили таким же образом, используя холостой образец плазмы и различные концентрации внутреннего стандарта. Вводимый объем в ЖХ-МС/МС составлял 40 мкл. Дезоксиуридин и хлор-дезоксиуридин ионизировали электрораспылением в негативном режиме. Параметры МС оптимизировали в отношении максимальной реакции всех фолатов. Использовали метод сбора данных МС/МС (мониторинг множественных реакций).

ПРИМЕР 2 - Ингибирование TS.

Различия между первыми тремя группами были значимыми (р=0,04), также были значимыми различия между двумя эквимолярными группами: 60 мг/м² ЛВ и 30 мг/м² [6R]-МГТФ (p=0,03). Эквимолярная доза [6R]-МГТФ вместе с 5-ФУ обеспечивает значительно более высокий уровень dUrd, чем ЛВ. Кроме того, по-видимому, между увеличением дозы [6R]-МТГФ и усилением ингибирования TS существует зависимость доза-ответ, что отражается в увеличении уровней dUrd в плазме (см. Таблицу 2 и фиг. 1).

Таблица 2. Увеличение уровня dUrd через 24 часа после болюсной инъекции 5-ФУ плюс L-ЛВ или 6R-МТГФ

Доза активного соединения, мг/м2 BSA	Вводимая доза, мг/м2 BSA	№ цикла	Среднее значение (t24-t0) dUrd в плазме, пмоль/мл	SD, пмоль/мл	p<
ЛВ относительно 6R	Все группы1
L-ЛВ 30	60 (d,l-ЛВ)	48	48,7	25,8	0,03	0,04
6R-МТГФ 30	30	18	74,7	52,7
6R-МТГФ 60 6R-МТГФ 240	60 240	16 4	91,8 99,9	67,6 ND

¹За исключением группы 240 мг/м².

Это исследование показало, что биомодуляция 5-ФУ с помощью 6R-МТГФ, а не ЛВ приводит к увеличению уровня dUrd в плазме и усилению ингибирования TS. Это наблюдение также подтверждается зависимым от дозы ингибированием TS после увеличения дозы 6R-МТГФ.

Болюсная доза 60 мг/м² ЛВ является стандартной дозой, используемой в так называемом режиме лечения северных стран, широко используемом в Скандинавии. Клинические результаты аналогичны результатам, полученным при других режимах, в которых ЛВ вводят в виде инфузии, часто в количестве 400 мг в течение двух часов (Gustavsson et al., (2015) Clinical Colorectal Cancer, 14:1-10). Интересным оказался тот факт, что после введения 6R-МТГФ наблюдается гораздо более сильное ингибирование TS (фиг. 2).

1. Способ увеличения концентрации 2’-дезоксиуридина (dUrd) в плазме субъекта-человека, включающий:

a) стадию введения 400 или 500 мг/м² 5-фторурацила (5-FU) внутривенно в виде болюсной инъекции субъекту-человеку;

b) после стадии а) стадию внутривенного введения 30, 60, 120 или 240 мг/м² [6R]-5,10-метилентетрагидрофолата (6R-MTHF) внутривенно в виде двух болюсных инъекций указанному субъекту-человеку и

c) необязательное введение 2400 мг/м² 5-FU в виде непрерывной инфузии одновременно с стадией b) или после нее.

2. Способ по п.1, в котором 6R-MTHF предоставляется в виде фармацевтически приемлемой соли.

3. Способ по п.2, в котором фармацевтически приемлемая соль представлена в виде лиофилизата.

4. Способ по п.1, в котором указанный способ обеспечивает повышенную концентрацию 2’-дезоксиуридина (dUrd) в плазме по сравнению с концентрацией dUrd в плазме у человека после введения эквимолярной дозы 5-формилтетрагидрофолата (LV).

5. Способ по п.1, в котором 6R-MTHF вводят внутривенно в виде болюсной инъекции указанному субъекту-человеку примерно через 30 минут после стадии а).

6. Способ по п.1, в котором 6R-MTHF вводят внутривенно в виде болюсной инъекции указанному субъекту-человеку примерно через 30 и 60 минут после стадии а).

7. Способ по п.1, в котором указанный субъект-человек страдает раком.

8. Способ по п.7, в котором указанный рак представляет собой рак прямой кишки.

9. Способ по п.1, в котором указанный способ дополнительно включает стадию введения терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного противоракового агента, выбранного из группы, состоящей из оксалиплатина, иринотекана и бевацизумаба.

10. Способ по п.1, в котором указанный способ вызывает повышенное ингибирование тимидилатсинтазы (TS) по сравнению с ингибированием TS у субъекта-человека после введения эквимолярной дозы LV.

11. Способ по п.1, в котором 6R-MTHF имеет химическую чистоту более 90% и имеет 95% изомерный избыток по сравнению с [6S]-5,10-метилентетрагидрофолатом (6S-MTHF).