Улучшенный способ синтеза линкер-лекарственного средства vc-seco-duba

Изобретение относится к соединению формулы (II), которое является промежуточным веществом в улучшенном способе синтеза линкер-лекарственного средства vc-seco-DUBA формулы (I). Изобретение относится также к способу получения соединения формулы (II), его применению для получения vc-seco-DUBA формулы (I), способу синтеза vc-seco-DUBA формулы (I) и способам синтеза конъюгатов антитело-лекарственное средство, включающим способ синтеза vc-seco-DUBA формулы (I). 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

(II)

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к улучшенному способу синтеза линкер-лекарственное средство vc-seco-DUBA и его промежуточных соединений, а также к применению указанного улучшенного способа в способе получения конъюгата антитело-лекарственное средство, содержащего vc-seco-DUBA линкер-лекарственное средство.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Дуокармицины являются членами семейства противоопухолевых антибиотиков, которые включают дуокармицин A, дуокармицин SA и CC-1065. Они известны своими мощными противоопухолевыми свойствами, но обычно не используются сами по себе из-за их чрезвычайно высокой токсичности. В настоящее время дуокармицины исследуют в качестве цитотоксических лекарственных средств в конъюгатах антитело-лекарственное средство (ADC).

ADC обладают потенциалом для решения большой неудовлетворенной потребности в эффективных новых методах лечения рака путем направления сильнодействующего цитотоксического лекарственного средства конкретно к раковым клеткам, тем самым повышая эффективность, одновременно снижая потенциальные системные токсические побочные эффекты низкомолекулярного лекарственного средства.

Одним из ключевых аспектов будущего коммерческого успеха ADC является способ синтеза цитотоксического лекарственного средства и соответствующей конструкции линкер-лекарственное средство, в которой линкерный фрагмент присоединяют к цитотоксическому лекарственному средству для облегчения конъюгации с антителом, который пригоден для получения в промышленных масштабах.

Линкер-лекарственное средство vc-seco-DUBA формулы (I)

,

впервые раскрытое в WO2011/133039 как соединение 18b на стр. 210, ll. 21-27, является примером сильнодействующего аналога CC-1065. ADC vc-seco-DUBA с анти-HER2-антителом трастузумаб, т.е. SYD985 или (vic-)трастузумаб дуокармазин, был успешно использован в нескольких доклинических исследованиях (M.M.C. van der Lee et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2015, 14(3), 692-703; J. Black et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2016, 15 (8), 1900-1909) и стадии I клинических испытаний (ClinicalTrials.gov NCT02277717). В настоящее время лечение SYD985 напрямую сравнивается с лечением по выбору врача на стадии III клинических испытаний у пациентов с HER2-положительным местнораспространенным или метастатическим раком молочной железы (TULIP; ClinicalTrials.gov NCT03262935).

Синтез линкер-лекарственного средства vc-seco-DUBA описан в WO 2011/133039 как четырехстадийный способ. Получение vc-seco-DUBA в результате этого способа в лабораторном масштабе 50-100 мг давало линкер-лекарственное средство с общим выходом только 21-25%. Последние две стадии, т.е. стадии 3 и 4, этого способа имеют решающее значение для общего выхода vc-seco-DUBA из всего процесса, показывая общий выход всего около 50%. В промышленном масштабе выход этого четырехстадийного способа будет еще ниже.

Следовательно, существует потребность в улучшенном способе получения vc-seco-DUBA. В частности, существует потребность в способе, который является эффективным с точки зрения выхода и химической чистоты, экономически эффективным с точки зрения реагентов и условий реакции и который пригоден для производства в промышленном масштабе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу синтеза линкер-лекарственного средства vc-seco-DUBA и его промежуточных соединений с условиями процесса, которые пригодны для получения в промышленном масштабе и которые дают желаемый vc-seco-DUBA продукт с улучшенным выходом.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (II)

Во втором аспекте изобретение относится к способу, включающему взаимодействие соединения формулы (III)

с хлористым водородом в 1,4-диоксане с образованием соединения формулы (II).

В третьем аспекте изобретение относится к применению соединения формулы (II) в способе получения vc-seco-DUBA формулы (I)

В четвертом аспекте изобретение относится к применению способа получения vc-seco-DUBA в способе получения vc-seco-DUBA-содержащего антитело-лекарственное средство конъюгата.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Дуокармицины представляют собой класс структурно родственных токсинов, впервые выделенных из бульонной культуры видов Streptomyces. Они являются членами семейства противоопухолевых антибиотиков, которые включают дуокармицин А, дуокармицин SA и CC-1065. Дуокармицины связываются с малой бороздкой ДНК и впоследствии вызывают необратимое алкилирование ДНК. Это нарушает структуру нуклеиновых кислот, что в конечном итоге приводит к гибели опухолевых клеток.

WO2011/133039, в частности, раскрывает сильнодействующее линкер-лекарственное средство vc-seco-DUBA формулы (I) (соединение 18b на стр. 210, ll. 21-27), которое содержит производное дуокармицина CC-1065

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу получения vc-seco-DUBA с удивительно высоким выходом, который может быть успешно применен в промышленном масштабе.

Химический синтез vc-seco-DUBA линкер-лекарственное средство в примере 10 WO 2011/133039 описан как четырехстадийный способ

,

в котором PNP-Cl представляет собой 4-нитрофенилхлорформиат, Et₃N представляет собой триэтиламин, Boc представляет собой трет-бутилоксикарбонил, TFA обозначает трифторуксусную кислоту, CHCl₃ обозначает хлороформ и DMF обозначает N,N-диметилформамид.

В лабораторном масштабе 50-100 мг этот четырехстадийный способ показывает общий выход только 21-25%. В промышленном масштабе этот выход будет значительно ниже.

Низкий общий выход этого четырехстадийного способа может быть в значительной степени обусловлен низким совокупным выходом, составляющим всего около 50% в лабораторном масштабе последних двух стадий, то есть стадий 3 и 4. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что модифицированная процедура, включающая замену кислотного реагента на стадии 3, дает новое промежуточное соединение, которое может быть выделено путем кристаллизации. Неожиданно было обнаружено, что эта модифицированная процедура стадии 3 и использование нового промежуточного соединения привели к значительному увеличению выхода vc-seco-DUBA.

Обычно стадия кристаллизации вводится в химический синтез, когда необходимо повысить чистоту продукта. Однако введение такой стадии обычно снижает выход указанного продукта, так как значительное количество продукта остается в маточном растворе. Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение стадии кристаллизации в синтез vc-seco-DUBA, как описано выше в настоящем описании, приводящей к новому промежуточному соединению формулы (II)

не только приводит к увеличению чистоты (с 94-96% до ≥99,0%), но также показало неожиданное, значительное увеличение выхода vc-seco-DUBA (с 53% до ~79%).

Следовательно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формулы (II).

Во втором варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы (II), включающему взаимодействие соединения формулы (III)

с хлористым водородом в 1,4-диоксане с образованием соединения формулы (II). Обычно соединение формулы (III) взаимодействует с 10-20% масс. хлористого водорода в 1,4-диоксане. Предпочтительно соединение формулы (III) подвергают взаимодействию с 12-18% хлористым водородом в 1,4-диоксане, более предпочтительно с 15% хлористым водородом в 1,4-диоксане. Обычно, массовое соотношение соединения формулы (III):HCl в 1,4-диоксане составляет от 1:0,5 до 1:25. Предпочтительно массовое соотношение соединения формулы (III):HCl в 1,4-диоксане составляет от 1:1 до 1:10. Более предпочтительно от 1:5 до 1:10.

В основном, количество хлористого водорода находится в молярном избытке от количества соединения формулы (III). Предпочтительно количество хлористого водорода составляет по меньшей мере 2 молярных эквивалента количества соединения формулы (III), более предпочтительно от 2 до 50 эквивалентов.

Предпочтительно, указанная реакция происходит в присутствии акцептора, такого как триизопропилсилан в воде и/или метаноле. Указанная вода и/или метанол могут присутствовать в количестве менее 25% масс. от общей массы растворителя, предпочтительно менее 15%, более предпочтительно менее 10%.

Соединение формулы (III) может быть получено, как описано, например, в R.C. Elgersma et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2015, 12(6), 1813-1835, путем взаимодействия соединения формулы (IV)

с 4-нитрофенилхлорформиатом с образованием соединения формулы (V)

с последующим взаимодействием соединения формулы (V) с соединением формулы (VI)

в присутствие 1-гидроксибензотриазол гидрата с образованием соединения формулы (III).

В основном, взаимодействие соединения формулы (IV) с 4-нитрофенилхлорформиатом осуществляют при температуре от 0 до 20°С. Предпочтительно температура составляет от 0 до 10°С, более предпочтительно от 0 до 6°С, еще более предпочтительно от 2 до 6°С, наиболее предпочтительно от 3 до 5°С.

Подходящими растворителями для использования при получении соединения формулы (V) являются, без ограничения, органические растворители, предпочтительно апротонные растворители, более предпочтительно полярные апротонные растворители. Предпочтительными растворителями являются эфирные растворители, амидные растворители или их смеси. Особенно предпочтительными растворителями являются тетрагидрофуран (THF), N,N-диметилацетамид (DMA) или их смеси. Наиболее предпочтительной является смесь THF и DMA.

Подходящими основаниями для использования при получении соединения формулы (V) являются органические основания, например третичные амины. Особенно подходящее основание представляет собой Et₃N.

Обычно взаимодействие соединения формулы (V) с соединением формулы (VI) осуществляют при температуре от 0 до 20°С. Предпочтительно температура составляет от 0 до 10°С, более предпочтительно от 4 до 10°С.

Подходящими растворителями для использования при получении соединения формулы (III) являются, без ограничения, органические растворители, предпочтительно апротонные растворители, полярные растворители или их смеси. Предпочтительные растворители представляют собой эфирные растворители, амидные растворители или их смеси. Особенно предпочтительные растворители представляют собой THF, DMA или их смеси. Наиболее предпочтительной является смесь THF и DMA.

Соединение формулы (IV) может быть получено любым подходящим способом, известным в предшествующем уровне техники, например способом, описанным в Примере 6а WO2015/185142, или аналогично ему.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (II) для получения vc-seco-DUBA.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения vc-seco-DUBA, в котором соединение формулы (II) взаимодействует с соединением формулы (VII)

Неожиданно выход vc-seco-DUBA еще больше увеличился, когда соединение формулы (II) подвергли взаимодействию с соединением формулы (VII) с использованием N,N-диизопропиламина (DIPEA) в качестве основания вместо триэтиламина (Et₃N), который использовали в Примере 10 WO 2011/133039. Обычно, молярное соотношение соединения формулы (II):DIPEA находится в диапазоне от 1:1 до 1:15. Предпочтительно, соотношение находится в диапазоне от 1:1 до 1:10, более предпочтительно от 1:2 до 1:7, еще более предпочтительно от 1:3 до 1:5, наиболее предпочтительно соотношение составляет приблизительно 1:4.

Как правило, реакцию соединения формулы (II) с соединением формулы (VII) проводят при температуре от 0 до 20°С. Предпочтительно температура составляет от 0 до 10°С, более предпочтительно от 0 до 5°C.

Подходящими растворителями для использования при взамодействии формулы (II) с соединением формулы (VII) с получением vc-seco-DUBA являются, без ограничения, органические растворители, предпочтительно апротонные растворители, более предпочтительно полярные апротонные растворители. Предпочтительные растворители представляют собой эфирные растворители, амидные растворители или их смеси. Особенно предпочтительными растворителями являются THF, DMA, N,N-диметилформамид (DMF) или их смеси. Наиболее предпочтительным является DMA.

В предпочтительном варианте осуществления процесс проводят в присутствии 1-гидроксибензотриазол гидрата. Как правило, молярное соотношение соединения формулы (II):1-гидроксибензотриазол гидрата находится в диапазоне от 1:1 до 1:10. Предпочтительно, соотношение находится в диапазоне от 1:1 до 1:7, более предпочтительно от 1:2 до 1:5, еще более предпочтительно, от 1:2 до 1:3, наиболее предпочтительно, соотношение составляет приблизительно 1:2,5.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения vc-seco-DUBA ADC формулы (VIII)

где соединение vc-seco-DUBA линкер-лекарственное средство получают способом по изобретению, как описано выше в настоящем описании.

m представляет собой среднее отношение лекарственное средство-антитело (DAR) от 1 до 8, предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4.

В контексте настоящего изобретения любое антитело, в частности, любое антитело, обладающее терапевтической активностью, или любое антитело, известное в области ADC, или любой его антигенсвязывающий фрагмент, например фрагмент F(ab')₂ или Fab', одноцепочечное (sc) антитело, scFv, однодоменное (sd) антитело, диатело или миниантитело, могут быть использованы для (дикого типа или сайта-специфической) конъюгации vc-seco-DUBA. Антитела могут быть любого изотипа, такие как антитела IgG, IgA или IgM. Предпочтительно антитело представляет собой антитело IgG, более предпочтительно антитело IgG₁ или IgG₂. Антитела могут быть химерными, гуманизированными или человеческими. Предпочтительно антитела являются гуманизированными. Еще более предпочтительно, антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело IgG, наиболее предпочтительно, гуманизированное или человеческое моноклональное антитело IgG₁ (mAb). Предпочтительно указанное антитело имеет κ (каппа) легкие цепи, т.е. гуманизированное или человеческое антитело IgG₁-κ.

В гуманизированных антителах антигенсвязывающие определяющие комплементарность области (CDR) в вариабельных областях тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC) получают из антител нечеловеческого происхождения, обычно мыши, крысы или кролика. Эти CDR нечеловеческого происхождения могут быть помещены в человеческий каркас (каркасная область (FR) FR1, FR2, FR3 и FR4) вариабельных областей HC и LC. Выбранные аминокислоты в FR человека могут быть заменены на соответствующие исходные аминокислоты нечеловеческого вида, например, для улучшения аффинности связывания при сохранении низкой иммуногенности. Альтернативно, каркасы, не относящиеся к человеку, сохраняются, и выбранные аминокислоты FR нечеловеческого вида могут быть заменены на их соответствующие аминокислоты человека для снижения иммуногенности при сохранении аффинности связывания антитела. Таким образом, гуманизированные вариабельные области объединяются с человеческими константными областями.

Эти антитела могут быть получены рекомбинантным, синтетическим или другими подходящими способами, известными в данной области.

Как правило, антитело представляет собой моноспецифичное (т.е. специфичное для одного антигена; такой антиген может быть общим для разных видов или иметь сходные аминокислотные последовательности между видами) или биспецифичное (т.е. специфичное для двух разных антигенов вида) антитело, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область HC и LC, связывающуюся с мишенью, выбранной из группы, состоящей из аннексина Al, B7H4, CA6, CA9, CA15-3, CA19-9, CA27-29, CA125, CA242 (раковый антиген 242), CCR2, CCR5, CD2, CD19, CD20, CD22, CD30 (фактор некроза опухоли 8), CD33, CD37, CD38 (циклическая АДФ рибозогидролаза), CD40, CD44, CD47 (белок, ассоциированный с интегрином), CD56 (молекула адгезии нервных клеток), CD70, CD74, CD79, CD115 (рецептор колониестимулирующего фактора 1), CD123 (рецептор интерлейкина-3), CD138 (синдекан 1), CD203c (ENPP3), CD303, CD333, CEA, CEACAM, CLCA-1 (лектиноподобная молекула-1 С-типа), CLL-1, c-MET (рецептор фактора роста гепатоцитов), Cripto, DLL3, EGFL, EGFR, EPCAM, EPh (например, EphA2 или EPhB3), ETBR (рецептор эндотелина типа B), FAP, FcRL5 (подобный Fc-рецептору белок 5, CD307), FGFR (например, FGFR3), FOLR1 (рецептор фолиевой кислоты альфа), GCC (гуанилилциклаза C), GPNMB, HER2, HMW-MAA (высокомолекулярный антиген, ассоциированный с меланомой), интегрин α (например, αvβ3 и αvβ5), IGF1R, TM4SF1 (или L6 антиген), антиген Lea-подобный углевод, антиген Lex, антиген Ley (CD174), LIV1, мезотелин (MSLN), MN (CA9), MUC1, MUC16, NaPi2b, Nectin-4, PD-1, PD-L1, PSMA, PTK7, SLC44A4, STEAP-1, 5T4 антиген (или TPBG, трофобластический гликопротеин), TF (тканевой фактор, тромбопластин, CD142), TF-Ag, Tag72, TNFR, TROP2 (опухолеассоциированный трансдуктор кальциевого сигнала 2), VEGFR и VLA.

Примеры подходящих антител включают блинатумомаб (CD19), эпратузумаб (CD22), иратумумаб и брентуксимаб (CD30), вадастуксимаб (CD33), тетулумаб (CD37), изатуксимаб (CD38), биватузумаб (CD44), лорвотузумаб (CD56), ворсетузумаб (CD70), милатузумаб (CD74), полатузумаб (CD79), ровалпитузумаб (DLL3), футуксимаб (EGFR), опортузумаб (EPCAM), фарлетузумаб (FOLR1), глембатумумаб (GPNMB), трастузумаб и пертузумаб (HER2), этарацизумаб (интегрин), анетумаб (мезотелин), панкомаб (MUC1), энфортумаб (нектин-4), и H8, A1 и A3 (5T4 антиген).

Конъюгирование vc-seco-DUBA линкер-лекарственного средства с антителом может быть осуществлено, как описано, например, в WO2011/133039, WO2015/177360 и WO2017/137628.

ADC дикого типа получают путем конъюгирования линкер-лекарственного средства с антителом через свободные тиолы боковых цепей цистеинов, полученные путем восстановления межцепочечных дисульфидных связей. Получение включает частичное восстановление подвергнутых воздействию растворителя межцепочечных дисульфидов с последующей модификацией полученных тиолов малеимидсодержащими линкер-лекарственными средствами. Стратегия связывания цистеина дает в результате максимум два лекарственных средства на восстановленный дисульфид. Большинство молекул IgG человека имеют четыре дисульфидные связи, подверженные воздействию растворителя, и поэтому возможен диапазон от нуля до восьми лекарственных средств на антитело. Точное количество лекарственных средств на антитело определяется степенью редукции дисульфида и количеством молярных эквивалентов линкер-лекарственное средство, использованных в последующей реакции конъюгации. Полное восстановление всех четырех дисульфидных связей дает гомогенную конструкцию с восемью лекарственными средствами на антитело, тогда как частичное восстановление обычно приводит к гетерогенной смеси с без, двумя, четырьмя, шестью или восемью лекарственными средствами на антитело.

Сайт-специфические ADC получают путем конъюгирования линкер-лекарственного средства с антителом через боковые цепи сконструированных остатков цистеина в подходящих положениях мутированного антитела. Сконструированные цистеины обычно завершаются другими тиолами, такими как цистеин или глутатион, с образованием дисульфидов. Эти закрытые остатки должны быть освобождены до того, как может произойти прикрепление лекарственного средства. Прикрепление лекарственного средства к сконструированным остаткам либо достигается путем уменьшения как нативных межцепочечных, так и мутантных дисульфидов, затем повторного окисления нативных межцепочечных цистеинов с использованием мягкого окислителя, такого как CuSO4 или дегидроаскорбиновая кислота, с последующим стандартным конъюгированием освобожденного сконструированного цистеина с линкер-лекарственным средством или с использованием мягких восстанавливающих агентов, которые восстанавливают мутантные дисульфиды с более высокой скоростью, чем межцепные дисульфидные связи, с последующим стандартным конъюгированием освобожденного сконструированного цистеина с линкер-лекарственным средством. При оптимальных условиях два лекарственных средства на антитело (т.е. отношение лекарственное средство-антитело, DAR, равно 2) будет прикреплено (если один цистеин встроен в тяжелую цепь или легкую цепь mAb).

В предпочтительном варианте осуществления антитело, используемое в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой анти-HER2 антитело, еще более предпочтительно, анти-HER2 антитело, трастузумаб.

В одном конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения ADC трастузумаб vc-seco-DUBA формулы (IX)

где соединение vc-seco-DUBA линкер-лекарственное средство получают способом по изобретению, как описано выше в настоящем описании. 2,6-2,9 представляет среднее отношение DAR от 2,6-2,9.

Примеры

Пример 1 - Получение метилCBI-азаиндол-бензамид-MOM-Boc-этилендиамин-D (4)

МетилCBI-азаиндол-бензамид-MOM (1) (1,0 г, 1,75 ммоль) подвергали взаимодействию с 4-нитрофенилхлорформиатом (PNP-Cl) (0,43 г, 2,12 ммоль) в смеси тетрагидрофурана (THF) (4,5 г) и N,N-диметилацетамида (DMA) (3,0 г) в присутствии триэтиламина (Et₃N) (0,55 г, 4,94 ммоль) в течение примерно 1,5 часов при температуре 0°C, давали нагреться до 6°C. Получали суспензию, содержащую метилCBI-азаиндол-бензамид-MOM-PNP (2).

На второй стадии трет-бутил (2-((2-(2-гидроксиэтокси)этил)амино)этил)(метил)карбамат (3) (0,58 г, 2,19 ммоль) растворяли в DMA (1,7 г) и добавляли 1-гидроксибензотриазол гидрат (HOBt) (0,35 г, 2,28 ммоль). Полученный раствор подвергали взаимодействию с суспензией в течение 1,5 часов при температуре 4°С, давали нагреться до 10°С.

После завершения реакции к реакционной смеси добавляли этилацетат (EtOAc) (8,8 г) и раствор промывали солевым раствором (11,3 г), насыщенным раствором бикарбоната натрия (3,8 г) и снова соляным раствором (3,8 г). Органический слой отделяли и очищали с помощью фильтрования через слой активированного угля. Растворитель выпаривали на ротационном вакуумном испарителе. Полученный метилCBI-азаиндол-бензамид-MOM-Boc-этилендиамин-D (4) растворяли в ацетоне (20 г) и, в конце концов, снова очищали с помощью фильтрования через слой активированного угля.

Сырой продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя его подвижной фазой - DCM:MeOH=97:3-94:6. Объединенные фракции продукта концентрировали и сушили в вакууме с получением метилCBI-азаиндол-бензамид-MOM-Boc-этилендиамин-D (4) (1,27 г, 1,48 ммоль; 84% выход, 93,82% чистота).

Пример 2 - Получение vc-seco-DUBA

Получение метилCBI-азаиндол-бензамид-этилендиамин-D гидрохлорида (5)

Метоксиметильную (MOM) и трет-бутилоксикарбонильную (Boc) группы метилCBI-азаиндол-бензамид-MOM-Boc-этилендиамин-D (4) (1,27 г, 1,48 ммоль) удаляли с помощью 15% хлористого водорода (HCl) в 1,4-диоксане (7,5 г) в присутствии акцептора (триизопропилсилан (0,63 г), вода (0,4 г) и метанол (0,3 г)). МетилCBI-азаиндол-бензамид-этилендиамин-D гидрохлорид (5) кристаллизуется из реакционного раствора в виде желтого твердого вещества.

Полученное желтое твердое вещество отфильтровывали, промывали ацетоном и сушили на фильтре с использованием азота и вакуума, получая чистый продукт (5) (1,0 г, 1,33 ммоль; 90% выход, ≥90% чистота).

Получение vc-seco-DUBA

МетилCBI-азаиндол-бензамид-этилендиамин-D гидрохлорид (5) (1,0 г, 1,33 ммоль) подвергали взаимодействию в течение 1,5 часов в темноте при температуре 0°C, которой давали нагреться до 5°C с малеимид-OEG₂-val-cit-PABA-PNP (6) (0,98 г, 1,29 ммоль) в DMA (17,8 г) в присутствии N,N-диизопропиламина (DIPEA) (0,65 г, 5,10 ммоль) и HOBt (0,47 г, 3,16 ммоль). Реакционную смесь по каплям добавляли в воду (201,1 г) при температуре от 23 до 25°С (50-60 мин) и получали осадок сырого продукта vc-seco-DUBA. Через 30 минут перемешивания, выпавший в осадок сырой продукт фильтровали на фильтре под давлением. Осадок на фильтре тщательно промывали водой и высушивали на фильтре под вакуумом и слабым потоком азота.

Сырой продукт vc-seco-DUBA сначала подвергали флеш-хроматографии низкого давления (неподвижная фаза - силикагель от 0,040 до 0,063 мм; подвижная фаза - дихлорметан:метанол=90:10). Соответствующие фракции (с чистотой UPLC-IN vc-seco-DUBA ≥90%) собирали в колбу, фильтровали и упаривали. Дальнейшую очистку осуществляли с помощью препаративной хроматографии (неподвижная фаза - силикагель от 0,015 до 0,040 мм; подвижная фаза - дихлорметан:метанол=90:10-85:15). Соответствующие фракции (с чистотой UPLC-IN vc-seco-DUBA ≥90%) собирали в колбу и растворитель меняли на DMA. Концентрирование осуществляли при максимальной температуре 25°C. Концентрированные растворы объединяли, фильтровали через фильтр 0,2 мкм и добавляли в воду для осаждения чистого vc-seco-DUBA в виде мелкодисперсного желтого порошка (выход: 35-45%; чистота: ≥99,0%).

Продукт отфильтровали, промыли водой и сушили на фильтре с использованием азота и вакуума при температуре максимум 25°С.

Сравнительный пример - Получение vc-seco-DUBA

Синтез vc-seco-DUBA осуществляли в соответствии со способом, описанным в Примере 10 WO2011/133039.

Стадия 1

МетилCBI-азаиндол-бензамид-MOM-Boc-этилендиамин-D (4) (0,1 ммоль) суспендировали в хлороформе (CHCl₃) (6 мл) и охлаждали на льду. Добавляли 2 мл кислоты (трифторуксусная кислота (TFA) или 15% HCl в 1,4-диоксане (7,5 г)) и смесь перемешивали в течение 3 часов. Затем смесь концентрировали в вакууме.

Стадия 2

Остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (DMF) (4 мл), раствор охлаждали на льду и добавляли малеимид-OEG₂-val-cit-PABA-PNP (6) (0,13 ммоль) и основание (1 ммоль, Et₃N или DIPEA). Смесь перемешивали в течение 2 часов, концентрировали в вакууме и остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (SiO₂, дихлорметан:метанол, 1:0-8:2).

Вышеуказанный способ осуществляли с использованием или HCl в 1,4-диоксане или известной кислоты TFA для удаления групп MOM и Boc метилCBI-азаиндол-бензамид-MOM-Boc-этилендиамин-D (4) на первой стадии и с использованием или DIPEA или известного основания Et₃N для облегчения реакции сочетания метилCBI-азаиндол-бензамид-этилендиамин-D гидрохлорида (5) и малеимид-OEG2-val-cit-PABA-PNP (6) на стадии 2, чтобы определить влияние выбора кислоты и основания на эффективность препарата vc-seco-DUBA.

В таблице ниже показан выход vc-seco-DUBA.

Кислота, используемая на стадии 1	Основание, используемое на стадии 2	Промежуточное соединение (5), выделенное	Выход (%)
TFA*	Et3N*	нет	52,96
TFA	DIPEA	нет	29,32
HCl в 1,4-диоксане	Et3N	да	78,76
HCl в 1,4-диоксане	DIPEA	да	82,80

^* Кислота и реагент, используемые в способе, известном из уровня техники (WO2011/133039)

Использование HCl в 1,4-диоксане вместо TFA на стадии 1 привело к увеличению общего выхода vc-seco-DUBA на 25,8%, как определено методом ВЭЖХ. Использование DIPEA вместо Et₃N на стадии 2 привело к снижению общего выхода vc-seco-DUBA на 23,6%, как определено ВЭЖХ. Однако использование HCl в 1,4-диоксане на стадии 1 и DIPEA на стадии 2 привело к увеличению общего выхода vc-seco-DUBA на 29,8%, как определено методом ВЭЖХ.

1. Соединение формулы (II)

(II).

2. Способ, включающий взаимодействие соединения формулы (III)

(III)

с хлористым водородом в 1,4-диоксане с образованием соединения формулы (II) по п. 1.

3. Применение соединения формулы (II) по п. 1 для получения vc-seco-DUBA формулы (I)

(I).

4. Способ синтеза vc-seco-DUBA формулы (I)

,

включающий взаимодействие соединения формулы (II) по п. 1 с соединением формулы (VII)

(VII)

с образованием соединения формулы (I).

5. Способ по п. 4, где взаимодействие соединения формулы (II) и соединения формулы (VII) осуществляют в присутствии N,N-диизопропиламина.

6. Способ по п. 4, где взаимодействие соединения формулы (II) и соединения формулы (VII) осуществляют в N,N-диметилацетамиде в присутствии N,N-диизопропиламина и 1-гидроксибензотриазол гидрата.

7. Способ по любому из пп. 4-6, где соединение формулы (II) получают взаимодействием соединения формулы (III)

(III)

с хлористым водородом в 1,4-диоксане с образованием соединения формулы (II).

8. Способ по п. 7, где соединение формулы (III) получают взаимодействием соединения формулы (IV)

(IV)

с 4-нитрофенилхлорформиатом с образованием соединения формулы (V)

(V),

с последующим взаимодействием соединения формулы (V) с соединением формулы (VI)

(VI)

в присутствии 1-гидроксибензотриазол гидрата с образованием соединения формулы (III).

9. Способ синтеза конъюгата антитело-лекарственное средство формулы (VIII)

включающий способ по любому из пп. 4-8 получения соединения формулы (I), с последующим конъюгированием соединения формулы (I) с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, где антитело представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и m представляет собой среднее отношение лекарственное средство-антитело от 1 до 8, предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4.

10. Способ по п. 9, где соединение формулы (I) конъюгировано с анти-HER2 антителом трастузумаб.

11. Способ синтеза конъюгата антитело-лекарственное средство формулы (IX)

включающий способ по любому из пп. 4-8 получения соединения формулы (I), с последующим конъюгированием соединения формулы (I) с анти-HER2 антителом трастузумаб, где 2,6-2,9 представляет среднее отношение лекарственное средство-антитело от 2,6 до 2,9.