Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение



Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение
Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение

Владельцы патента RU 2778410:

РЕГЕНЕРОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированной мыши, геном зародышевой линии которой содержит первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий один или более сегменты гена Vλ человека, один или более сегменты гена Jλ человека, один ген Сλ мыши и одну или более регуляторные последовательности. Изобретение эффективно для получения антитела. 15 з.п. ф-лы, 24 ил., 2 табл., 7 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США №62/594,944, поданной 5 декабря 2017 г.; предварительной заявке США №62/594,946, поданной 5 декабря 2017 г.; предварительной заявке США №62/609,241, поданной 21 декабря 2017 г.; и предварительной заявке США №62/609,251, поданной 21 декабря 2017 г.; каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[002] Данная заявка содержит перечень последовательностей, поданный в электронном виде в формате ASCII и включенный в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 3 декабря 2018 г., называется 2010794-1440_SL.txt и имеет размер 30059 байт.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[003] Человеческие антитела являются наиболее быстро растущим классом терапевтических средств. Из технологий, которые в настоящее время используются для их производства, разработка генетически сконструированных животных (например, грызунов), созданных с использованием генетического материала, кодирующего полностью или частично антитела человека, произвела революцию в области терапевтических моноклональных антител человека для лечения различных заболевания. Тем не менее, необходима разработка улучшенных систем in vivo для выработки человеческих моноклональных антител, которые максимизируют спектр человеческих антител у, генетически модифицированных животных-хозяев.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[004] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает грызуна, геном зародышевой линии которого включает:

сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, включающий:

(a) один или более сегментов гена Vλ человека,

(b) один или более сегментов гена Jλ, человека и

(с) один или более генов Сλ,

причем один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ, человека функционально связаны с одним или более генами Сλ, и при этом у грызуна отсутствует ген Сκ грызуна в сконструированном эндогенном локусе κ иммуноглобулина.

[005] В некоторых вариантах один или более генов Сλ представляют собой гены Сλ. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ представляет собой или включает ген Сλ грызуна. В некоторых вариантах ген Сλ грызуна имеет последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична мышиному гену Сλ1, мышиному гену Сλ2 или мышиному гену Сλ3. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ грызуна представляет собой или включает ген Сλ1 мыши. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ грызуна представляет собой или включает ген Сλ крысы. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ крысы имеет последовательность, которая, по меньшей мере, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична крысиному гену Сλ1, крысиному гену Сλ2, крысиному гену Сλ3 или крысиному гену Сλ4.

[006] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека расположены на месте одного или более сегментов гена Vκ грызуна, одного или более сегментов гена Jκ грызуна или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека заменяют один или более сегментов гена Vκ грызуна, один или более сегментов гена Jκ грызуна или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека заменяет все функциональные генные сегменты Vκ грызуна и/или все генные сегменте Jκ грызуна.

[007] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека включают Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, , Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Уλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека включают Vλ4-69, Vλ-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ,2-8, Vλ,4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека включают Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 и Vλ3-1.

[008] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Jλ человека включают Jλ,1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Jλ человека включают Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 и Jλ7.

[009] В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Vλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Vλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека. Например, со ссылкой на фиг. 20, первая примерная эндогенная некодирующая последовательность Vλ естественным образом расположена рядом (около 3'-конца) с сегментом гена Vλ3-12 в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека. Сконструированный эндогенный локус κ легкой цепи иммуноглобулина, включающий первую примерную эндогенную некодирующую последовательность Vλ человека, может включать такую некодирующую последовательность в положении, которое расположено рядом (и предпочтительно у 3'-конца) с сегментом гена Vλ3-12 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина. Сконструированный эндогенный локус κ легкой цепи иммуноглобулина, включающий первую примерную эндогенную некодирующую последовательность Vλ человека, также может включать такую некодирующую последовательность в положении, которое расположено рядом (и предпочтительно у 5'-конца) с сегментом гена Vλ2-11 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина. В некоторых случаях сконструированный эндогенный локус κ легкой цепи иммуноглобулина, включающий первую примерную эндогенную некодирующую последовательность Vλ человека, также может включать такую некодирующую последовательность в положении, которое расположено рядом (и предпочтительно у 3'-конца) с сегментом гена Vλ3-12 и расположено рядом (и предпочтительно у 5'-конца) с сегментом гена Vλ2-11 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека представляет собой или включает интрон.

[0010] В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Jλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Jλ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Jλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ человека представляет собой или включает интрон. В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Jλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Jκ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Jκ человека в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека. Например, со ссылкой на фиг. 21, первая примерная эндогенная некодирующая последовательность Jκ естественным образом расположена в эндогенном локусе κ легкой цепи κ иммуноглобулина человека. Сконструированный эндогенный локус κ легкой цепи иммуноглобулина, включающий первую примерную некодирующую последовательность эндогенного Jκ человека, может представлять собой такую некодирующую последовательность в положении, которое расположено рядом с сегментом гена Jλ (например, Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7) в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ человека представляет собой или включает интрон.

[0011] В некоторых вариантах осуществления сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-51, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ1-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, VX4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ естественным образом расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

[0012] В некоторых вариантах осуществления сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает некодирующую последовательность легкой цепи κ между одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ человека. В некоторых вариантах осуществления некодирующая последовательность легкой цепи κ представляет собой некодирующую последовательность легкой цепи κ человека. В некоторых вариантах осуществления некодирующая последовательность легкой цепи κ человека имеет последовательность, которая естественным образом расположена между сегментом гена Vκ4-1 человека и сегментом гена Jκ1 человека в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

[0013] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, гомозиготен по сконструированному эндогенному локусу легкой цепи κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, гетерозиготен по сконструированному эндогенному локусу легкой цепи κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления геном зародышевой линии грызуна включает второй сконструированный локус легкой цепи κ эндогенного иммуноглобулина, который включает:

(a) один или более сегментов гена Vκ человека, и

(b) один или более сегментов гена Jκ человека,

где один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ человека функционально связаны с геном Сκ.

[0014] В некоторых вариантах осуществления геном грызуна дополнительно включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции. В некоторых вариантах осуществления элемент контроля транскрипции включает элемент контроля транскрипции RAG1, элемент контроля транскрипции RAG2, элемент контроля транскрипции тяжелой цепи иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи κ иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи λ иммуноглобулина или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая экзогенный TdT, расположена в локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, локусе легкой цепи λ иммуноглобулина, локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, локусе RAG1 или локусе RAG2. В некоторых вариантах осуществления TdT представляет собой TdT человека. В некоторых вариантах осуществления TdT представляет собой короткую изоформу TdT (TdTS).

[0015] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в настоящем документе, содержит в геноме зародышевой линии последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции, и демонстрирует легкие цепи (например, экспрессирует вариабельные домены легкой цепи, включая), показывающие по меньшей мере 1,2-кратное, по меньшей мере 1,5-кратное, по меньшей мере 1,75-кратное, по меньшей мере 2-кратное, по меньшей мере 3-кратное, по меньшей мере 4-кратное или по меньшей мере 5-кратное увеличение множественности J-сегментов по сравнению со сравнимой мышью (например, мышью из того же помета), которая не содержит в геноме зародышевой линии экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции. В некоторых вариантах осуществления множественность J-сегментов измеряется числом уникальных CDR3/10000 чтений.

[0016] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в настоящем документе, содержит в геноме зародышевой линии последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции, и по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65% легких цепей (например, легких цепей лямбда и/или каппа), выработанных грызунами, показывают наличие нешаблонных добавлений.

[0017] В некоторых вариантах осуществления геном зародышевой линии грызуна, описанный в данном документе, включает:

сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, включающий:

(a) один или более сегментов гена VH человека,

(b) один или более сегментов гена DH человека, и

(c) один или более сегментов гена JH человека,

где один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека функционально связаны с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0018] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека находятся на месте одного или более сегментов гена VH грызуна, одного или более сегментов гена DH грызуна, одного или более сегментов гена JH грызуна или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека заменяют один или более сегментов гена VH грызуна, один или более сегментов гена DH грызуна, один или более сегментов гена JH грызуна или любую их комбинацию.

[0019] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена VH человека включают VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена VH человека включают VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH 3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46/, VH1-45, VH3-46, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-l, VH4-4, VH1-3, VH1-2 и VH6-1.

[0020] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена DH включают DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена DH включают DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 и DH7-27.

[0021] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена JH человека включают JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена JH человека включает JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 и JH6.

[0022] В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей VH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена VH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей VH естественным образом расположена рядом с сегментом гена VH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей VH человека представляет собой или включает интрон. В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей DH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена DH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей DH естественным образом расположена рядом с сегментом гена DH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей DH человека представляет собой или включает интрон. В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей JH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена JH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей JH естественным образом расположена рядом с сегментом гена JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей JH человека представляет собой или включает интрон.

[0023] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, гомозиготен по сконструированному эндогенному локусу тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0024] В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна представляет собой константную область тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна.

[0025] В некоторых вариантах эндогенные сегменты гена Vλ, эндогенные сегменты гена Jλ и эндогенные гены Сλ удаляются полностью или частично. В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, не экспрессирует на заметных уровнях эндогенные вариабельные домены легкой цепи λ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, не экспрессирует на заметных уровнях эндогенные вариабельные домены легкой цепи κ иммуноглобулина.

[0026] В некоторых вариантах осуществления в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызунов. В некоторых вариантах осуществления геном зародышевой линии грызуна включает одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления экспрессируются один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов (например, в клетке мужской репродуктивной системы, например в клетке яичек).

[0027] В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, включены в ту же хромосому, что и сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, включены в сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, находятся между первым сегментом гена VH человека и вторым сегментом гена VH человека. В некоторых вариантах осуществления первый сегмент гена VH человека представляет собой VH1-2, и второй сегмент гена VH человека представляет собой VH6-1. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, расположены на месте псевдогена Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, заменяют псевдоген Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, находятся между сегментом гена VH человека и сегментом гена DH человека.

[0028] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, включает популяцию В-клеток, которые экспрессируют антитела, включая легкие цепи λ иммуноглобулина, каждая из которых включает вариабельный домен легкой цепи λ человеческого иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен легкой цепи λ иммуноглобулина человека кодируется перестроенной последовательностью вариабельной области легкой цепи λ иммуноглобулина человека, включающей (i) один из одного или более сегментов гена Vλ человека или их соматически гипермутированный вариант и (ii) один из одного или более сегментов гена Jλ человека или их соматически гипермутированный вариант.

[0029] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, включает популяцию В-клеток, которые экспрессируют антитела, включая тяжелые цепи иммуноглобулина, каждая из которых включает вариабельный домен тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека кодируется перестроенной последовательностью вариабельной области легкой цепи λ иммуноглобулина человека, включающей (i) один из одного или более сегментов гена VH человека или их соматически гипермутированный вариант, (ii) один из одного или более сегментов гена DH человека или их соматически гипермутированный вариант и (ii) один из одного или более сегментов гена JH человека или их соматически гипермутированный вариант.

[0030] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, вырабатывает популяцию В-клеток в ответ на иммунизацию антигеном, который включает один или более эпитопов. В некоторых вариантах осуществления грызун вырабатывает популяцию В-клеток, которые экспрессируют антитела, которые связываются (например, специфически связываются) с одним или более эпитопами интересующего антигена. В некоторых вариантах осуществления антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток, вырабатываемых в ответ на антиген, включают тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, и/или легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток, вырабатываемых в ответ на антиген, включают тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, и/или легкую цепь каппа, имеющую вариабельный домен легкой цепи каппа человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи каппа человека в соответствии с описанием в данном документе.

[0031] В некоторых вариантах осуществления грызун вырабатывает популяцию В-клеток, которые экспрессируют антитела, которые связываются с одним или более эпитопами представляющего интерес антигена, где антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток, продуцируемых в ответ на антиген, включают: (i) тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, (ii) легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе (iii) легкую цепь каппа, имеющую вариабельный домен легкой цепи каппа человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи каппа человека в соответствии с описанием в данном документе, или (iv) любую их комбинацию.

[0032] В некоторых вариантах осуществления последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ человека в соответствии с описанием в данном документе, является соматически гипермутированной. В некоторых вариантах по меньшей мере около 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% В-клеток в популяции В-клеток, вырабатываемых в ответ на антиген, включают последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ, которые соматически гипермутированы.

[0033] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, представляет собой мышь или крысу.

[0034] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе клетки и/или ткани получены (например, выделенные клетки и/или ткани) от грызуна. В некоторых вариантах осуществления полученные клетки и ткани включают, например, лимфоидную ткань, спленоциты, В-клетки, стволовые клетки и/или половые клетки. В некоторых вариантах осуществления полученная клетка является выделенной. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная клетка представляет собой или включает про-В-клетку, пре-В-клетку, незрелую В-клетку, зрелую наивную В-клетку, активированную В-клетку, В-клетку памяти, лимфоцит В-линии и/или плазматическую клетку. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка включает стволовую клетку (например, эмбриональную стволовую клетку) и/или зародышевую клетку (например, сперматозоид, ооцит).

[0035] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает выделенную клетку грызуна, геном зародышевой линии которой включает:

сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, включающий:

(a) один или более сегментов гена Vλ человека,

(b) один или более сегментов гена Jλ человека и

(c) ген Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с геном Сλ.

[0036] В некоторых вариантах осуществления у выделенной клетки грызуна, описанной в данном документе, отсутствует ген Сκ грызуна в сконструированном эндогенном локусе к иммуноглобулина.

[0037] В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе выделенная клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна.

[0038] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предоставляет эмбрион грызуна, полученный из клетки ES грызуна, описанной в данном документе.

[0039] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предоставляет иммортализованную клетку, полученную из выделенной клетки грызунов, описанной в данном документе.

[0040] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает способ получения грызуна, чей геном зародышевой линии включает сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, при этом способ включает этапы:

(a) введения одного или более фрагментов ДНК в геном зародышевой линии клетки ES грызуна, где один или более фрагментов ДНК содержат:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека,

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека и

(iii) один или более генов Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека, и один или более генов Сλ вводятся в геном зародышевой линии клетки ES грызуна в эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина и где один или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека, и один или более генов Сλ функционально связаны; и

(b) создание грызуна с использованием клетки ES грызуна, полученной в (а).

[0041] В некоторых вариантах осуществления способ получения грызуна, геном зародышевой линии которого включает сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, включает этап введения некодирующей последовательности легкой цепи κ в геном зародышевой линии клетки ES грызуна, так что некодирующая последовательность легкой цепи κ находится между одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ человека в геноме зародышевой линии клетки ES грызуна.

[0042] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает способ получения грызуна, чей геном зародышевой линии включает сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, способ включает этапы:

конструирования эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина в геноме зародышевой линии, чтобы включить:

(a) один или более сегментов гена Vλ человека,

(b) один или более сегментов гена Jλκ человека, и

(c) один или более генов Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с одним или более генами Сλ, и

где один или более генов Сλ вставляются на место гена Сκ грызуна в эндогенном локусе к иммуноглобулина.

[0043] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ заменяет ген Сκ грызуна в эндогенном локусе к иммуноглобулина.

[0044] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека включают Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека включают Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 и Vλ3-1. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека включают Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Ук2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 и Vλ3-1.

[0045] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Jλ человека включают Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Jλ человека включают Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 и Jλ7.

[0046] В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Vλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Vλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека представляет собой или включает интрон. В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Jλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Jλ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Jλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ человека представляет собой или включает интрон. В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Jλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Jκ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Jκ человека в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ человека представляет собой или включает интрон.

[0047] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ представляет собой или включает ген Сλ грызуна. В некоторых вариантах ген Сλ грызуна имеет последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична мышиному гену Сλ1, мышиному гену Сλ2 или мышиному гену Сλ3. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ грызуна представляет собой или включает ген Сλ1 мыши. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ грызуна представляет собой или включает ген Сλ крысы. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ крысы имеет последовательность, которая, по меньшей мере, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична крысиному гену Сλ1, крысиному гену Сλ2, крысиному гену Сλ3 или крысиному гену Сλ4.

[0048] В некоторых вариантах осуществления один или более фрагментов ДНК включают по меньшей мере один маркер отбора. В некоторых вариантах осуществления один или более фрагментов ДНК включают по меньшей мере один сайт-специфичный сайт рекомбинации.

[0049] В некоторых вариантах осуществления геном зародышевой линии грызуна включает:

сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, включающий:

(a) один или более сегментов гена VH человека,

(b) один или более сегментов гена DH человека, и

(c) один или более сегментов гена JH человека,

где один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека функционально связаны с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна,

[0050] В некоторых вариантах осуществления стадия конструирования эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина в геноме зародышевой линии осуществляется в ES-клетке грызунов, чей геном зародышевой линии включает сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, включающий один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека, функционально связанных с константным регионом тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна.

[0051] В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей VH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена VH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей VH человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена VH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей VH человека представляет собой или включает интрон. В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей DH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена DH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей DH естественным образом расположена рядом с сегментом гена DH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей DH человека представляет собой или включает интрон. В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей JH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена JH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей JH естественным образом расположена рядом с сегментом гена JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или более некодирующих последовательностей JH человека представляет собой или включает интрон.

[0052] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к способу получения антитела у грызуна, причем способ включает этапы:

(i) иммунизации грызуна представляющим интерес антигеном,

где грызун имеет геном зародышевой линии, включающий:

сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, включающий:

(a) один или более сегментов гена Vλ человека,

(b) один или более сегментов гена Jλ человека и

(c) один или более генов Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с геном Сλ, и

где один или более генов Сλ расположены на месте гена Сλ грызуна в эндогенном локусе иммуноглобулина κ;

содержания грызуна в условиях, достаточных для вызова у грызуна иммунного ответа на представляющий интерес антиген; и

извлечение антитела, которое связывает представляющий интерес антиген из грызуна, клетки грызуна или клетки, полученной из клетки грызуна.

[0053] В некоторых вариантах осуществления в ответ на этап иммунизации грызун вырабатывает В-клетку, которая экспрессирует антитело, которое связывает представляющий интерес антиген. В некоторых вариантах осуществления антитело, экспрессируемое В-клеткой, включает тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, и/или легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антитело, экспрессируемое В-клеткой, включает (i) тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, (ii) легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе (iii) легкую цепь каппа, имеющую вариабельный домен легкой цепи каппа человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи каппа человека в соответствии с описанием в данном документе, или (iv) любую их комбинацию.

[0054] В некоторых вариантах осуществления в ответ на этап иммунизации грызун вырабатывает популяцию В-клеток, которая экспрессирует антитела, которые связывают представляющий интерес антиген. В некоторых вариантах осуществления антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток, вырабатываемых в ответ на антиген, включают тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, и/или легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток в ответ на антиген, включают (i) тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, (ii) легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе (iii) легкую цепь каппа, имеющую вариабельный домен легкой цепи каппа человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи каппа человека в соответствии с описанием в данном документе, или (iv) любую их комбинацию.

[0055] В некоторых вариантах осуществления в ответ на этап иммунизации грызун вырабатывает популяцию В-клеток, которые экспрессируют антитела, которые связываются с одним или более эпитопами представляющего интерес антигена, где антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток, продуцируемых в ответ на антиген, включают: (i) тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, (ii) легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе (iii) легкую цепь каппа, имеющую вариабельный домен легкой цепи каппа человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи каппа человека в соответствии с описанием в данном документе, или (iv) любую их комбинацию.

[0056] В некоторых вариантах осуществления последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ человека в соответствии с описанием в данном документе, является соматически гипермутированной. В некоторых вариантах по меньшей мере около 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% В-клеток в популяции В-клеток, вырабатываемых в ответ на антиген, включают последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ, которые соматически гипермутированы.

[0057] В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает исследуемый антиген, выделяют, выделяют или идентифицируют из В-клетки грызуна. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает исследуемый антиген, выделяют, восстанавливают или идентифицируют из гибридомы, созданной с помощью В-клетки грызуна.

[0058] В некоторых вариантах осуществления антиген включает один или более эпитопов, а антитело, которое связывает исследуемый антиген, связывается с эпитопом одного или более эпитопов.

[0059] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ представляет собой или включает ген Сλ грызуна. В некоторых вариантах ген Сλ грызуна имеет последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична мышиному гену Сλ1, мышиному гену Сλ2 или мышиному гену Сλ3. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ грызуна представляет собой или включает ген Сλ1 мыши. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ грызуна представляет собой или включает ген Сλ крысы. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ крысы имеет последовательность, которая, по меньшей мере, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична крысиному гену Сλ1, крысиному гену Сλ2, крысиному гену Сλ3 или крысиному гену Сλ4.

[0060] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ1-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 и Vλ3-1. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 и Vλ3-1.

[0061] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλl, Jλ,2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Jλ человека включают Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 и Jλ7.

[0062] В некоторых вариантах осуществления сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ естественным образом расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ-l, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

[0063] В некоторых вариантах осуществления грызун имеет геном зародышевой линии, включающий сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, включающий:

(a) один или более сегментов гена VH человека,

(b) один или более сегментов гена DH человека, и

(c) один или более сегментов гена JH человека,

где один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека функционально связаны с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна,

[0064] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена VH человека содержат VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-l, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена VH человека содержат VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-l, VH4-4, VH1-3, VH1-2 и VH6-1.

[0065] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена DH человека содержат DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена DH человека содержат DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 и DH7-27.

[0066] В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена JH человека содержат JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена JH человека содержат JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 и JH6.

[0067] В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус легкой цепи иммуноглобулина включает в себя одну или более некодирующих последовательностей VH, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей VH человека расположена рядом с VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 или VH6-1 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей VH человека естественным образом расположена рядом с VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 или VH6-1 эндогенного локуса легкой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина включает одну или более некодирующих последовательностей DH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей DH человека расположена рядом с DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 или DH7-27 в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей DH человека естественным образом расположена рядом с DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 или DH7-27 эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина включает одну или более некодирующих последовательностей JH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей JH человека является смежной с JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 или JH6 в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей JH человека естественным образом расположена рядом с JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 или JH6 эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления извлеченная клетка грызуна представляет собой В-клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка, происходящая из клетки грызуна, представляет собой гибридому.

[0068] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидную последовательность, которая кодирует последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи лямбда человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи каппа человека, получают из В-клетки.

[0069] В некоторых вариантах осуществления в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызунов. В некоторых вариантах осуществления геном зародышевой линии грызуна включает одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления экспрессируются один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов (например, в клетке мужской репродуктивной системы, например в клетке яичек).

[0070] В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, включены в ту же хромосому, что и сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, включены в сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, находятся между первым сегментом гена VH человека и вторым сегментом гена VH человека. В некоторых вариантах осуществления первый сегмент гена VH человека представляет собой VH1-2, и второй сегмент гена VH человека представляет собой VH6-1. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, расположены на месте псевдогена Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, заменяют псевдоген Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, находятся между сегментом гена VH человека и сегментом гена DH человека.

[0071] В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь или крысу.

[0072] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает грызуна, геном зародышевой линии которого включает гомозиготный сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, включающий:

(i) один или более сегментов гена Vλ, где один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию.

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека, где один или более сегментов гена Jλ, человека содержат Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию, и

(iii) ген Сλ грызуна;

где один или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ, человека и ген Сλ грызуна функционально связаны друг с другом,

где ген Сλ. грызуна расположен на месте гена Сλ грызуна эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина,

где сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает:

(а) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека, и

(b) одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека, и где локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает некодирующую последовательность легкой цепи κ человека между одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ человека, которые имеют последовательность, которая естественным образом расположена между сегментом гена Vκ4-1 человека и сегментом гена Jκ1 человека в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

[0073] В некоторых вариантах ген Сλ грызуна представляет собой ген Сλ1 мыши.

[0074] В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает энхансеры Еκi и Еκ3' легкой цепи κ иммуноглобулина грызунов.

[0075] В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает делецию одного или более сегментов гена Vκ грызунов и/или один или более сегментов гена Jκ. В некоторых вариантах сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает делецию всех функциональных сегментов гена Vκ и/или Jκ грызунов.

[0076] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает грызуна, геном зародышевой линии которого включает:

(a) гомозиготный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, включающий один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека, функционально связанных с одним или более генами константных областей тяжелой цепи эндогенного иммуноглобулина таким образом, что грызун экспрессирует тяжелые цепи иммуноглобулина, каждая из которых содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи человека и последовательность константного домена тяжелой цепи грызуна,

(b) первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, включающий один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ, функционально связанных с эндогенной областью гена Сκ грызуна, таким образом, что грызун экспрессирует легкие цепи иммуноглобулина, каждая из которых включает вариабельный домен легкой цепи κ человека и последовательность константного домена легкой цепи κ грызуна, и

(с) второй сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, включающий:

(i) один или более сегментов гена Vλ, где один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию.

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека, где один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию, и

(iii) ген Сλ грызуна;

где один или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека и ген Сλ грызуна функционально связаны друг с другом,

где ген Сλ грызуна расположен на месте гена Сκ грызуна эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина,

где сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает:

(a) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека, и

(b) одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека, и где локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает некодирующую последовательность легкой цепи κ человека между одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ, человека, которые имеют последовательность, которая естественным образом расположена между сегментом гена Vκ4-1 человека и сегментом гена Jκ1 человека в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека;

так что грызун экспрессирует легкие цепи иммуноглобулина, каждая из которых включает вариабельный домен легкой цепи λ человека и последовательность константного домена легкой цепи λ грызуна.

[0077] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, включает инактивированный эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, гетерозиготен по инактивированному эндогенному локусу легкой цепи λ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, гомозиготен по инактивированному эндогенному локусу легкой цепи λ иммуноглобулина.

[0078] В некоторых вариантах осуществления геном грызуна дополнительно включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции. В некоторых вариантах осуществления элемент контроля транскрипции включает элемент контроля транскрипции RAG1, элемент контроля транскрипции RAG2, элемент контроля транскрипции тяжелой цепи иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи κ иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи λ иммуноглобулина или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая экзогенный TdT, расположена в локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, локусе легкой цепи λ иммуноглобулина, локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, локусе RAG1 или локусе RAG2. В некоторых вариантах осуществления TdT представляет собой TdT человека. В некоторых вариантах осуществления TdT представляет собой короткую изоформу TdT (TdTS).

[0079] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в настоящем документе, содержит в геноме зародышевой линии последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции, и демонстрирует легкие цепи (например, экспрессирует вариабельные домены легкой цепи, включая), показывающие по меньшей мере 1,2-кратное, по меньшей мере 1,5-кратное, по меньшей мере 1,75-кратное, по меньшей мере 2-кратное, по меньшей мере 3-кратное, по меньшей мере 4-кратное или по меньшей мере 5-кратное увеличение множественности J-сегментов по сравнению со сравнимой мышью (например, мышью из того же помета), которая не содержит в геноме зародышевой линии экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции. В некоторых вариантах осуществления множественность J-сегментов измеряется числом уникальных CDR3/10000 чтений. В некоторых вариантах осуществления множественность J-сегментов измеряется числом уникальных CDR3/10000 чтений.

[0080] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в настоящем документе, содержит в геноме зародышевой линии последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции, и по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65% легких цепей (например, легких цепей лямбда и/или каппа), выработанных грызунами, показывают наличие нешаблонных добавлений.

[0081] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, представляет собой крысу или мышь.

[0082] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к антителу, полученному способом, включающим этапы:

(a) предоставление описанного в данном документе грызуна;

(b) иммунизации грызуна исследуемым антигеном;

(c) содержания грызуна в условиях, достаточных для вызова у грызуна иммунного ответа на исследуемый антиген; и

(d) извлечение антитела, которое связывает исследуемый антиген из грызуна или клетки грызуна или клетки, полученной из клетки грызуна,

где антитело (d) включает вариабельные домены тяжелой цепи человека и вариабельные домены легкой цепи λ человека.

[0083] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к антителу, полученному способом, включающим этапы:

(a) иммунизации описанного в данном документе грызуна исследуемым антигеном,

(b) содержания грызуна в условиях, достаточных для вызова у грызуна иммунного ответа на исследуемый антиген; и

(c) извлечение антитела, которое связывает исследуемый антиген из грызуна или клетки грызуна или клетки, полученной из клетки грызуна,

где антитело (с) включает вариабельные домены тяжелой цепи человека и вариабельные домены легкой цепи λ человека.

[0084] В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует на заметных уровнях эндогенные вариабельные домены легкой цепи κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует на заметных уровнях эндогенные вариабельные домены легкой цепи λ иммуноглобулина.

[0085] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, вырабатывает популяцию В-клеток в ответ на иммунизацию антигеном, который включает один или более эпитопов. В некоторых вариантах осуществления грызун вырабатывает популяцию В-клеток, которые экспрессируют антитела, которые связываются (например, специфически связываются) с одним или более эпитопами интересующего антигена. В некоторых вариантах осуществления антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток, вырабатываемых в ответ на антиген, включают тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, и/или легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток в ответ на антиген, включают (i) тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, (ii) легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе (iii) легкую цепь каппа, имеющую вариабельный домен легкой цепи каппа человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи каппа человека в соответствии с описанием в данном документе, или (iv) любую их комбинацию.

[0086] В некоторых вариантах осуществления грызун вырабатывает популяцию В-клеток, которые экспрессируют антитела, которые связываются с одним или более эпитопами представляющего интерес антигена, где антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток, продуцируемых в ответ на антиген, включают: (i) тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, (ii) легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе и/или (iii) легкую цепь каппа, имеющую вариабельный домен легкой цепи каппа человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи каппа человека в соответствии с описанием в данном документе.

[0087] В некоторых вариантах осуществления последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ человека в соответствии с описанием в данном документе, является соматически гипермутированной. В некоторых вариантах по меньшей мере около 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% В-клеток в популяции В-клеток, вырабатываемых в ответ на антиген, включают последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ, которые соматически гипермутированы.

[0088] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предоставляет способ получения антитела, включающий:

(i) экспрессию первой нуклеотидной последовательности, которая кодирует тяжелую цепь иммуноглобулина в клетке-хозяине, где первая нуклеотидная последовательность включает последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека;

(ii) экспрессию второй нуклеотидной последовательности, которая кодирует легкую цепь иммуноглобулина X в клетке-хозяине, где вторая нуклеотидная последовательность включает последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека, которая была идентифицирована (например, экспрессирована и/или изолирована) у грызуна, геном зародышевой линии которого включает:

сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, включающий:

(a) один или более сегментов гена Vλ человека,

(b) один или более сегментов гена Jλ человека, и

(c) один или более генов Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с одним или более генами Сλ, и

где у грызуна отсутствует ген Сλ грызуна в сконструированном локусе к эндогенного иммуноглобулина;

(iii) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы легкие цепи иммуноглобулина и тяжелые цепи иммуноглобулина экспрессировались и образовывали антитело; и

(iv) получение антитела из клетки-хозяина и/или культуры клетки-хозяина.

[0089] В некоторых вариантах осуществления первая нуклеотидная последовательность включает константную область тяжелой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой полностью антитело человека.

[0090] В некоторых вариантах осуществления второй нуклеотид включает последовательность константной области легкой цепи λ человека.

[0091] В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело, обратное химерному. В некоторых вариантах осуществления первая нуклеотидная последовательность включает константную область тяжелой цепи грызуна. В некоторых вариантах осуществления вторая нуклеотидная последовательность включает последовательность константной области легкой цепи λ грызуна.

[0092] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает грызуна, геном зародышевой линии которого включает:

(a) первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека,

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека и

(iii) ген Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с геном Сλ, и

где у грызуна отсутствует ген Сκ грызуна в первом сконструированном локусе к эндогенного иммуноглобулина;

(b) второй сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, далее включающий:

(i) один или более сегментов гена Vκ человека, и

(ii) один или более сегментов гена Jκ человека,

где один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ человека функционально связаны с геном Сκ.

[0093] В некоторых вариантах осуществления ген Сκ представляет собой эндогенный ген Сκ грызуна.

[0094] В некоторых вариантах осуществления геном грызуна дополнительно включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции. В некоторых вариантах осуществления элемент контроля транскрипции включает элемент контроля транскрипции RAG1, элемент контроля транскрипции RAG2, элемент контроля транскрипции тяжелой цепи иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи κ иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи λ иммуноглобулина или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая экзогенный TdT, расположена в локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, локусе легкой цепи λ иммуноглобулина, локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, локусе RAG1 или локусе RAG2. В некоторых вариантах осуществления TdT представляет собой TdT человека. В некоторых вариантах осуществления TdT представляет собой короткую изоформу TdT (TdTS).

[0095] В некоторых вариантах осуществления геном грызуна дополнительно включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции. В некоторых вариантах осуществления элемент контроля транскрипции включает элемент контроля транскрипции RAG1, элемент контроля транскрипции RAG2, элемент контроля транскрипции тяжелой цепи иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи κ иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи λ иммуноглобулина или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая экзогенный TdT, расположена в локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, локусе легкой цепи λ иммуноглобулина, локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, локусе RAG1 или локусе RAG2. В некоторых вариантах осуществления TdT представляет собой TdT человека. В некоторых вариантах осуществления TdT представляет собой короткую изоформу TdT (TdTS).

[0096] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в настоящем документе, содержит в геноме зародышевой линии последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции, и демонстрирует легкие цепи (например, экспрессирует вариабельные домены легкой цепи, включая), показывающие по меньшей мере 1,2-кратное, по меньшей мере 1,5-кратное, по меньшей мере 1,75-кратное, по меньшей мере 2-кратное, по меньшей мере 3-кратное, по меньшей мере 4-кратное или по меньшей мере 5-кратное увеличение множественности J-сегментов по сравнению со сравнимой мышью (например, мышью из того же помета), которая не содержит в геноме зародышевой линии экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции. В некоторых вариантах осуществления множественность J-сегментов измеряется числом уникальных CDR3/10000 чтений. В некоторых вариантах осуществления множественность J-сегментов измеряется числом уникальных CDR3/10000 чтений.

[0097] В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в настоящем документе, содержит в геноме зародышевой линии последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции, и по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65% легких цепей (например, легких цепей лямбда и/или каппа), выработанных грызунами, показывают наличие нешаблонных добавлений.

[0098] В различных вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, клетка, не являющаяся человеческой клеткой, или ткань, не являющаяся человеческой тканью, в соответствии с описанием в настоящем документе, представляет собой грызуна, клетку грызуна или ткань грызуна; в некоторых вариантах осуществления мышь, клетку мыши или ткань мыши; в некоторых вариантах осуществления крысу, клетку крысы или ткань крысы. В некоторых вариантах осуществления мышь, клетка мыши или ткань мыши в соответствии с описанным в данном документе, содержит генетический фон, который включает линию 129, линию BALB/c, линию C57BL/6, смешанную линию 129×C57BL/6 или их комбинации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0099] Чертежи, включенные в данный документ, которые состоят из следующих фигур, предназначены исключительно для иллюстрации, а не для ограничения.

[00100] На фиг. 1А и 1В показаны иллюстрации примерного варианта осуществления (без масштабирования) стратегии построения нацеленного вектора (описанного в примере 1.1), используемого при создании варианта осуществления грызуна в соответствии с настоящим раскрытием.

[00101] На фиг. 2А показана иллюстрация примерного варианта осуществления (без масштабирования) введения нацеленного вектора (описанного в примере 1.1) в сконструированный локус легкой цепи κ Ig клона эмбриональных стволовых (ES) клеток грызунов, при этом данный клон клеток ES был использован при создании варианта осуществления согласно настоящему раскрытию.

[00102] На фиг. 2В показана иллюстрация примерного варианта осуществления (без масштабирования) опосредованного рекомбиназой удаления селекционных кассет в сконструированном локусе легкой цепи κ Ig, полученного в результате введения нацеленного вектора (описанного в примере 1.1), используемого при создании варианта осуществления, грызуну согласно настоящему раскрытию.

[00103] На фиг. 3 показана иллюстрация примерного варианта осуществления в масштабе стратегии построения нацеленного вектора (описанного в примере 1.2), используемого при создании варианта осуществления грызуна согласно настоящему раскрытию.

[00104] На фиг. 4А показана иллюстрация (без масштабирования) введения нацеленного вектора (описанного в примере 1.2) в сконструированный локус легкой цепи κ Ig клона эмбриональных стволовых (ES) клеток грызунов, при этом данный клон клеток ES был использован при создании варианта осуществления грызуна согласно настоящему раскрытию.

[00105] На фиг. 4 В показана иллюстрация примерного варианта осуществления (без масштабирования) опосредованного рекомбиназой удаления селекционных кассет в сконструированном локусе легкой цепи κ Ig, полученного в результате введения нацеленного вектора (описанного в примере 1.2), используемого при создании варианта осуществления, грызуну по настоящему раскрытию.

[00106] На фиг. 5 показаны результаты, полученные в репрезентативном варианте осуществления согласно настоящему раскрытию, показывающие спленоциты с гейтированием по одной клетке, собранные у мышей дикого типа (WT) и мышей линии 6558 НО (LiK, гомозиготных), верхний ряд иллюстрирует экспрессию CD 19 (ось у) и CD3 (ось х), а нижний ряд иллюстрирует спленоциты, гейтированные по CD19+, экспрессирующие иммуноглобулин D (IgD, ось у) и иммуноглобулин М (IgM, ось х).

[00107] На фиг. 6 показаны результаты, полученные в репрезентативном варианте осуществления согласно настоящему раскрытию, показывающие спленоциты с гейтированием по одной клетке, собранные у мышей дикого типа (WT) и мышей линии 6558 НО (LiK, гомозиготных), верхний ряд иллюстрирует экспрессию CD 19 (ось у) и CD3 (ось х), а нижний ряд иллюстрирует экспрессию иммуноглобулина М (IgD, ось у) и В220 (ось х).

[00108] На фиг. 7 показаны результаты, полученные в репрезентативном варианте осуществления согласно настоящему раскрытию, включая репрезентативные спленоциты, гейтированные по CD19+, собранные у мышей дикого типа (WT) и мышей линии 6558НО (LiK, гомозиготные), иллюстрирующие экспрессию легких цепей иммуноглобулина, содержащих константные области мышиного Ig λ (ось Y) или мышиного Ig κ (ось X).

[00109] На фиг. 8 показаны результаты, полученные в репрезентативном варианте осуществления в соответствии с настоящим раскрытием, включая репрезентативные спленоциты с гейтированием по одной клетке, собранные у различных указанных гуманизированных мышей, иллюстрирующие экспрессию CD 19 (ось у) и CD3 (ось х). Мыши НОН/LIK/λ-/- - мыши, гомозиготные по тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина (см., например, патенты США №8642835 и 8697940), гомозиготные по локусу LiK и гомозиготные по инактивированному эндогенному локусу легкой цепи λ иммуноглобулина; мыши HOH/KoK/LiK/λ-/- - мыши, гомозиготные по тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина (см., например, патенты США №8642835 и 8697940), гемизиготные по одному локусу каппа, содержащему локус LiK, и второму локусу каппа, содержащему локус легкой цепи каппа гуманизированного иммуноглобулина, и гомозиготные по инактивированному эндогенному локусу легкой цепи λ иммуноглобулина; мыши НОН/KoK - контрольные мыши, гомозиготные по тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина и гомозиготные по легкой цепи каппа гуманизированного иммуноглобулина.

[00110] На фиг. 9 показаны результаты, полученные в репрезентативном варианте осуществления согласно настоящему раскрытию, включая репрезентативные спленоциты, гейтированные по CD 19+, собранные у различных указанных гуманизированных мышей, иллюстрирующие экспрессию содержащих константные области легких цепей иммуноглобулина мышиного Igλ. (ось Y) или мышиного Igκ (ось X).

[00111] На фиг. 10 показаны результаты, полученные в репрезентативном варианте осуществления в соответствии с настоящим раскрытием, включая репрезентативные клетки костного мозга с гейтированием по одной клетке, собранные у различных указанных гуманизированных мышей, иллюстрирующие экспрессию иммуноглобулина М (IgD, ось у) и В220 (ось х).

[00112] На фиг. 11 показаны результаты, полученные в репрезентативном варианте осуществления согласно настоящему раскрытию, включая репрезентативные клетки костного мозга с гейтированием по одной клетке, собранные у различных указанных гуманизированных мышей, иллюстрирующие экспрессию легких цепей иммуноглобулина, содержащих константные области мышиного Igλ (ось Y) или мышиного Ig κ (ось X) в незрелых (верхний ряд) и зрелых (нижний ряд) В-клетках.

[00113] На фиг. 12 показана схематическая иллюстрация примерного варианта осуществления настоящего изобретения (без масштабирования) сконструированного локуса легкой цепи киммуноглобулина в соответствии с описанным в данном документе, и перегруппировка локуса с образованием молекулы мРНК.

[00114] На фиг. 13 показаны результаты, полученные в репрезентативном варианте осуществления в соответствии с настоящим раскрытием, включая репрезентативные белковые иммуноблоты (вестерн-блоттинг) SDS-PAGE с использованием сыворотки, выделенной из мышей дикого типа (WT) и гомозиготных мышей линии 6558 (LiK НО) в соответствии с описанным в примере 3.3.

[00115] На фигуре 14 показаны результаты тестирования варианта осуществления согласно настоящему раскрытию, показывающие репрезентативные спленоциты с гейтированием по одной клетке, собранные у гуманизированных мышей, иллюстрирующие экспрессию CD19 (ось у) и CD3 (ось х). Мыши HOH/LiK/λ-/-/TdT - мыши, гомозиготные по тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина (см., например, патенты США №8642835 и 8697940), гомозиготные по локусу LiK и гомозиготные по инактивированному эндогенному локусу легкой цепи λ иммуноглобулина, который включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT); и мыши HOH/KoK/LiK/A," VTdT - мыши, гомозиготные по тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина (см., например, патенты США №8642835 и 8697940), гемизиготные по одному локусу каппа, содержащему локус LiK, и второму локусу каппа, содержащему локус легкой цепи каппа гуманизированного иммуноглобулина, и гомозиготные по инактивированному эндогенному локусу легкой цепи λ иммуноглобулина, который включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT).

[00116] На фиг. 15 показаны результаты тестирования варианта осуществления согласно настоящему раскрытию, показывающие репрезентативные спленоциты, гейтированные по CD 19+, собранные у различных указанных гуманизированных мышей, иллюстрирующие экспрессию содержащих константные области легких цепей иммуноглобулина мышиного Igλ. (ось Y) или мышиного Igκ (ось X).

[00117] На фиг. 16 показаны результаты тестирования варианта осуществления согласно настоящему раскрытию, показывающие репрезентативные клетки костного мозга с гейтированием по одной клетке, собранные у различных указанных гуманизированных мышей, иллюстрирующие экспрессию иммуноглобулина М (IgM, ось у) и В220 (ось х).

[00118] На фиг. 17 показаны результаты тестирования варианта осуществления согласно настоящему раскрытию, показывающие репрезентативные клетки костного мозга с гейтированием по одной клетке, собранные у различных указанных гуманизированных мышей, иллюстрирующие экспрессию легких цепей иммуноглобулина, содержащих константные области мышиного Igλ. (ось Y) или мышиного Igκ (ось X) в незрелых (верхний ряд) и зрелых (нижний ряд) В-клетках.

[00119] На фиг. 18 показаны результаты тестирования варианта осуществления согласно настоящему раскрытию в виде графика сравнения иммунных ответов у мышей LiK/VI-3, LiK/VI-3/TdT и VI-3/TdT после иммунизации белковым иммуногеном.

[00120] На фиг. 19 показаны результаты тестирования варианта осуществления согласно настоящему раскрытию в виде графика сравнения иммунных ответов в отношении His-метки у мышей LiK/VI-3, LiK/VI-3/TdTT и VI-3/TdT после иммунизации с конденсацией нерелевантного белкового антигена с HIS-меткой.

[00121] На фиг. 20 показана иллюстрация (без масштабирования) части эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека. Фигура 20 включает в себя первую стрелку, указывающую на представление первой примерной эндогенной некодирующей последовательности Vλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека. Как показано, первая иллюстративная эндогенная некодирующая последовательность Vλ человека (представлена линией) в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Vλ3-12 человека (представлен темно-серым квадратом) и сегментом гена Vλ2-11 человека (представлен темно-серым квадратом) в эндогенном локусе легкой цепи λиммуноглобулина Ig человека. Фигура 20 также включает в себя вторую стрелку, указывающую на изображение второй иллюстративной эндогенной некодирующей последовательности Vλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека. Как показано, вторая иллюстративная эндогенная некодирующая последовательность Vλ, человека (представлена линией) в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Vλ2-11 человека (представлен темно-серым квадратом) и сегментом гена Vλ3-10 человека (представлен темно-серым квадратом) в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека.

[00122] На фиг. 21 показана иллюстрация (без масштабирования) части эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека. Фигура 21 включает в себя первую стрелку, указывающую на представление первой примерной эндогенной некодирующей последовательности Jκ человека в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека. Как показано, первая иллюстративная эндогенная некодирующая последовательность Jκ человека (представлена линией) в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Jκ1 человека (представлен темно-серым квадратом) и сегментом гена Jκ2 человека (представлен темно-серым квадратом) в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека. Фигура 21 также включает в себя вторую стрелку, указывающую на изображение второй иллюстративной эндогенной некодирующей последовательности Jκ человека в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека. Как показано, вторая иллюстративная эндогенная некодирующая последовательность Jκ человека (представлена линией) в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Jκ2 человека (представлен темно-серым квадратом) и сегментом гена Jκ3 человека (представлен темно-серым квадратом) в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ВЫБРАННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В СПИСКЕ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[00123] Ниже приведены типичные последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот различных константных областей иммуноглобулина генов лямбда мыши, крысы или человека. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот генов и полипептидов иммуноглобулинов доступны на сайте Международной информационной системы иммуногенетики, www.imgt.org.

[00124] ДНК Сλ1 мыши (SEQ ID NO: 1):

[00125] Аминокислота Cλ1 мыши (SEQ ID NO: 2):

[00126] ДНК Cλ2 мыши (SEQ ID NO: 3):

[00127] Аминокислота Cλ2 мыши (SEQ ID NO: 4):

[00128] ДНК Сλ3 мыши (SEQ ID NO: 5):

[00129] Аминокислота Сλ3 мыши (SEQ ID NO: 6):

[00130] ДНК Cλ1 крысы (SEQ ID NO: 7):

[00131] Аминокислота Cλ1 крысы (SEQ ID NO: 8):

[00132] ДНК Сλ2 крысы (SEQ ID NO:9):

[00133] Аминокислота Cλ2 крысы (SEQ ID NO: 10):

[00134] ДНК Сλ3 крысы (SEQ ID NO: 11):

[00135] Аминокислота Cλ3 крысы (SEQ ID NO: 12):

[00136] ДНК Cλ4 крысы (SEQ ID NO: 13):

[00137] Аминокислота Сλ4 крысы (SEQ ID NO: 14):

[00138] ДНК человека Cλ1 (SEQ ID NO: 15):

[00139] Аминокислота Сλ1 человека (SEQ ID NO: 16):

[00140] ДНК человека Cλ2 (SEQ ID NO: 17):

[00141] Аминокислота Cλ2 человека (SEQ ID NO: 18):

[00142] ДНК человека Сλ3 (SEQ ID NO: 19):

[00143] Аминокислота Сλ3 человека (SEQ ID NO: 20):

[00144] ДНК человека Cλ6 (SEQ ID NO: 21):

[00145] Аминокислота CλA6 человека (SEQ ID NO: 22):

[00146] ДНК человека Сλ7 (SEQ ID NO: 23):

[00147] Аминокислота Cλ7 человека (SEQ ID NO: 24):

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[00148] Объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и не ограничивается некоторыми вариантами осуществления, описанными в данном документе. Специалистам в данной области техники, читающим настоящее описание, будут известны различные модификации, которые могут быть эквивалентны таким описанным вариантам осуществления или иным образом пребывать пределах объема формулы изобретения. В общем, используемые в данном документе термины соответствуют их понимаемому значению в данной области техники, если не указано иное. Явные определения некоторых терминов приведены ниже; значения этих и других терминов в конкретных случаях в данном описании будут понятны специалистам в данной области из контекста. Дополнительные определения для следующих и других терминов изложены в описании. Ссылки на патентную и непатентную литературу, процитированные в данном описании, или их соответствующие части включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.

[00149] Использование в формуле изобретения порядковых терминов, таких как «первый», «второй», «третий» и т.д., для модификации элемента пункта формулы изобретения само по себе не подразумевает какого-либо приоритета, первоочередности или порядка одного элемента формулы изобретения относительно другого или временного порядка, в котором проводятся действия для осуществления способа, но они используются исключительно как метки для отличия одного элемента формулы изобретения, имеющего определенное название, от другого элемента, имеющего такое же название (за исключением использования порядкового термина), для отличия элементов формулы изобретения.

[00150] При использовании в данной заявке термины «около» и «приблизительно» используются в качестве эквивалентов. Любые цифры, используемые в данной заявке с или без дополнения «примерно/приблизительно», предназначены для охвата любых нормальных вариаций оцененных специалистом в соответствующей области техники.

[00151] Под упоминаниями единственного числа в описании и формуле изобретения, если явно не указано иное, следует понимать также ссылки на множественное число. Пункты формулы изобретения или описания, которые включают «или» между одним или более членами группы, считаются удовлетворенными, если один, более одного или все члены группы присутствуют, применяются или имеют отношение к определенному продукту или способу, если не указано иное или это иным образом не очевидно из контекста. Изобретение включает в себя варианты осуществления изобретения, в которых ровно один член группы присутствует в, применяется в или иным образом относится к данному продукту или способу. Изобретение также включает в себя варианты осуществления изобретения, в которых вся группа членов присутствует в, применяется в или иным образом относится к данному продукту или способу. Кроме того, следует понимать, что изобретение охватывает все варианты, комбинации и перестановки, в которых одно или более ограничений, элементов, положений, описательных терминов и т.д. одного или более из перечисленных пунктов формулы изобретения вводятся в другой пункт формулы изобретения, зависимый от того же независимого пункта (или, если применимо, любого другого пункта), если не указано иное, или если специалисту в данной области техники не будет очевидно потенциальное противоречие или несоответствие. Когда элементы представлены в виде списков (например, в формате группы Маркуша или схожих форматах), следует понимать, что каждая подгруппа элементов также раскрывается, и любой элемент (элементы) можно удалить из группы. Следует понимать, что, в общем, когда изобретение или аспекты изобретения упоминаются как содержащие конкретные элементы, признаки и т.д. некоторые варианты осуществления изобретения или аспекты изобретения состоят или состоят по существу из таких элементов, признаков и т.д. В целях упрощения такие варианты осуществления не во всех случаях конкретно изложены здесь в таком количестве слов. Следует также понимать, что любой вариант осуществления или аспект изобретения могут быть явно исключены из формулы изобретения, независимо от того, указано ли конкретное исключение в описании.

[00152] Термин введение при использовании в данном документе включает введение композиции субъекту или системе (например, клетке, органу, ткани, организму или соответствующему компоненту или набору их компонентов). Специалист в данной области поймет, что способ введения может варьироваться в зависимости, например, от субъекта или системы, которой вводят композицию, природы композиции, цели введения и т.д. Например, в некоторых вариантах осуществления введение животному (например, человеку или грызуну) может быть бронхиальным (в том числе путем бронхиальной инсталляции), буккальным, энтеральным, интердермальным, внутриартериальным, внутрикожным, внутрижелудочным, интрамедуллярным, внутримышечным, интраназальным, внутрибрюшинным, интратекальным, внутривенным, внутрижелудочковым, мукозальным, назальным, пероральным, ректальным, подкожным, сублингвальным, местным, трахеальным (в том числе путем интратрахеальной инсталляции), трансдермальным, вагинальным и/или витреальным. В некоторых вариантах осуществления введение может включать прерывистое дозирование. В некоторых вариантах осуществления введение может включать непрерывное дозирование (например, перфузию) в течение по меньшей мере выбранного периода времени.

[00153] Термин улучшение при использовании в данном документе включает предотвращение, уменьшение или смягчение состояния или улучшение состояния субъекта. Улучшение включает, но не требует их, полное выздоровление или полную профилактику заболевания, расстройства или состояния.

[00154] Термин приблизительно или около при применении к одному или более из представляющих интерес значений, относится к значению, аналогичному установленному эталонному значению. В некоторых вариантах осуществления термин «приблизительно» или «около» относится к диапазону значений, которые попадают в предел ± 10% или менее в любую сторону (больше или меньше) от установленного эталонного значения, если не указано иное или иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, когда такое число превышало бы 100% от возможного значения).

[00155] Термин биологически активный при использовании в данном документе относится к характеристике любого агента, который обладает активностью в биологической системе, in vitro или in vivo (например, в организме). Например, агент, который, присутствуя в организме, оказывает биологическое действие в этом организме, считается биологически активным. В конкретных вариантах осуществления, в которых белок или полипептид является биологически активным, часть этого белка или полипептида, которая разделяет по меньшей мере одну биологическую активность белка или полипептида, обычно называют «биологически активной» частью.

[00156] Термин сопоставимый при использовании в данном документе относится к двум или более агентам, объектам, ситуациям, наборам условий и т.д., которые могут не быть идентичными друг другу, но которые достаточно похожи, чтобы позволить сравнение их друг с другом с возможностью выведения обоснованных выводов на основе наблюдаются различия или сходства. Специалисты в данной области техники поймут в контексте, какая степень идентичности требуется в любом данном случае, чтобы два или более таких агентов, объектов, ситуаций, наборов условий и т.д. считались сопоставимыми.

[00157] Термин консервативный при использовании в данном документе относится к случаям описывающим консервативное аминокислотное замещение, включая замещение аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим R-группу боковой цепи со сходными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). В целом, консервативная аминокислотная замена не будет существенно изменять функциональные свойства интересующего белка, например, способность рецептора связываться с лигандом. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают: алифатические боковые цепи, такие как глицин (Gly, G), аланин (Ala, А), валин (Val, V), лейцин (Leu, L) и изолейцин (Ile, I); алифатически-гидроксильные боковые цепи, такие как серии (Ser, S) и треонин (Thr, Т); амидсодержащие боковые цепи, такие как аспарагин (Asn, N) и глутамин (Gln, Q); ароматические боковые цепи, такие как фенилаланин (Phe, F), тирозин (Туг, Y) и триптофан (Tip, W); основные боковые цепи, такие как лизин (Lys, К), аргинин (Arg, R) и гистидин (His, Ile); кислотные боковые цепи, такие как аспарагиновая кислота (Asp, D) и глутаминовая кислота (Glu, Е); и серосодержащие боковые цепи, такие как цистеин (Cys, С) и метионин (Met, М). Группы замены консервативных аминокислот включают, например, валин/лейцин/изолейцин (Val/Leu/Ile, V/L/I), фенилаланин/тирозин (Phe/Tyr, F/Y), лизин/аргинин (Lys/Arg, K/R), аланин/валин (Ala/Val, A/V), глутамат/аспартат (Glu/Asp, E/D) и аспарагин/глутамин (Asn/Gln, N/Q). В некоторых вариантах осуществления консервативная аминокислотная замена может представлять собой замену любого нативного остатка в белке аланином, как это используется, например, в аланин-сканирующем мутагенезе. В некоторых вариантах осуществления выполняется консервативная замена, которая имеет положительное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet, GH et al., 1992, Science 256:1443-1445, которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой умеренно консервативную замену, где замена имеет неотрицательное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.

[00158] Термин контроль или контрольный при использовании в данном документе относится к понимаемому в данной области техники значению «контроль», являющемуся стандартом, с которым сравниваются результаты. Как правило, контроли используются для повышения целостности в экспериментах путем выделения переменных с целью выведения заключений о данных переменных. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой реакцию или анализ, который проводится одновременно с тестовой реакцией или анализом для получения компаратора. Термин «контроль» или «контрольный» также включает в себя «контрольное животное». «Контрольное животное» может иметь модификацию в соответствии с описанием в данном документе, модификацию, которая отличается от описанной в данном документе, или быть не модифицированным (т.е. животное дикого типа). В одном эксперименте применяется «тест» (т.е. проверяемая переменная). Во втором эксперименте, «контрольном», проверяемая переменная не применяется. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой исторический контроль (т.е. тест или анализ, выполненные ранее, или количества или результат, которые ранее известны). В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой или содержит напечатанную или иным образом сохраненную запись. Контроль может быть положительным контролем или отрицательным контролем.

[00159] Термин нарушение при использовании в данном документе относится к результату события гомологичной рекомбинации с молекулой ДНК (например, с эндогенной гомологичной последовательностью, такой как ген или локус гена). В некоторых вариантах осуществления нарушение может приводить к или представлять собой вставку, делецию, замещение, замену, ошибочную мутацию или сдвиг рамки последовательностей ДНК или любую их комбинацию. Вставки могут включать вставку целых генов или фрагментов генов, например экзонов, которые могут иметь происхождение, отличное от эндогенной последовательности (например, гетерологичной последовательности). В некоторых вариантах осуществления нарушение может увеличивать экспрессию и/или активность гена или генного продукта (например, полипептида, кодируемого геном). В некоторых вариантах осуществления нарушение может снижать экспрессию и/или активность гена или генного продукта. В некоторых вариантах осуществления нарушение может изменить последовательность гена или кодированного генного продукта (например, кодированного полипептида). В некоторых вариантах осуществления нарушение может усекать или фрагментировать ген или кодированный генный продукт (например, кодированный полипептид). В некоторых вариантах осуществления нарушение может продлевать ген или кодируемый генный продукт. В некоторых таких вариантах осуществления нарушение может привести к появлению гибридного полипептида. В некоторых вариантах осуществления нарушение может влиять на уровень, но не на активность гена или генного продукта. В некоторых вариантах осуществления нарушение может влиять на активность, но не на уровень гена или генного продукта. В некоторых вариантах осуществления нарушение может не оказывать существенного влияния на уровень гена или генного продукта. В некоторых вариантах осуществления нарушение может не оказывать существенного влияния на активность гена или генного продукта. В некоторых вариантах осуществления нарушение может не оказывать существенного влияния ни на уровень, ни на активность гена или генного продукта.

[00160] Термины определение, измерение, оценка, оценка, анализ и анализирование используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения любой формы измерения и включают в себя определение того, присутствует элемент или нет. Такие термины включают оба из количественного и/или качественного определений. Оценка может быть относительной или абсолютной. Термин «анализ наличия» может обозначать определение количества присутствующего вещества и/или определение того, присутствует оно или отсутствует.

[00161] Термин эндогенный промотор при использовании в данном документе относится к промотору, который естественным образом связан, например, в организме дикого типа, с эндогенным геном.

[00162] Термин сконструированный при использовании в данном документе относится, в общем, к аспекту манипуляций со стороны человека. Например, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может считаться «сконструированным», когда две или более последовательностей, которые не связаны друг с другом в таком порядке в природе, подверглись манипуляциям со стороны человека для непосредственного связывания друг с другом в сконструированном полинуклеотиде. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полинуклеотид может содержать регуляторную последовательность, которая встречается в природе, в функциональной связи с первой кодирующей последовательностью, но не в функциональной связи со второй кодирующей последовательностью, и которая вследствие обеспечения связи со стороны человека становится функционально связанной со второй кодирующей последовательностью. Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты, каждая из которых кодирует полипептидные элементы или домены, которые в природе не связаны друг с другом, могут быть связаны друг с другом в одном сконструированном полинуклеотиде. Аналогично, в некоторых вариантах осуществления клетка или организм могут считаться «сконструированными», если ими манипулировали таким образом, чтобы их генетическая информация была изменена (например, был введен новый генетический материал, ранее не присутствовавший, или был изменен или удален ранее присутствующий генетический материал). Как обычно применяется на практике и понятно специалистам в данной области техники, потомство сконструированного полинуклеотида или клетки обычно все еще называют «сконструированным», даже если фактическое вмешательство выполняли на предшествующем объекте. Кроме того, как будет понятно специалистам в данной области техники, доступно множество методологий, посредством которых может быть достигнуто «конструирование» в соответствии с описанным в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления «конструирование» может включать отбор или проектирование (например, последовательностей нуклеиновых кислот, полипептидных последовательностей, клеток, тканей и/или организмов) посредством использования компьютерных систем, запрограммированных для выполнения анализа или сравнения, или иным образом для анализа, рекомендации и/или выбора последовательности, изменения и т.д.). Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления «конструирование» может включать использование методологий химического синтеза in vitro и/или технологий рекомбинантных нуклеиновых кислот, таких как, например, амплификация нуклеиновых кислот (например, посредством полимеразной цепной реакции), гибридизация, мутация, трансформация, трансфекция и т.д. и/или любая из множества методологий контролируемого спаривания. Специалистам в данной области будет понятно, что в данной области хорошо известны и описаны различные установленные методы (например, для рекомбинантной ДНК, синтеза олигонуклеотидов и культуры ткани) и трансформации (например, электропорация, липофекция и т.д.). в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитируются и/или обсуждаются в настоящем описании. См., например, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 and Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5th Ed., ed. By Old, R.W. and S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994, полностью включенное в настоящее описание посредством ссылки.

[00163] Термин функциональный при использовании в данном документе относится к форме или фрагменту объекта (например, гена или сегмента гена), который проявляет конкретное свойство (например, является частью кодирующей последовательности) и/или активности. Например, в контексте иммуноглобулинов вариабельные области кодируются уникальными генными сегментами (то есть, V, D и/или J), которые соединяют (или рекомбинируют) для образования функциональных кодирующих последовательностей. При наличии в геноме сегменты гена организованы в кластеры, хотя существуют отличия. «Функциональный» сегмент гена представляет собой сегмент гена, представленный в экспрессированной последовательности (то есть вариабельной области), для которой была выделена (т.е. клонирована) и идентифицирована по последовательности соответствующая геномная ДНК. Некоторые последовательности сегмента гена иммуноглобулина содержат открытые рамки считывания и считаются функциональными, хотя и не представлены в экспрессированном спектре, тогда как другие последовательности сегмента гена иммуноглобулина содержат мутации (например, точечные мутации, вставки, делеции и т.д.), приводящие к стоп-кодону и/или усеченной последовательности, которая впоследствии приводит к тому, что такие последовательности сегмента гена не способны обеспечивать свойства и/или выполнять активности, ассоциируемые с немутировавшими последовательностями. Такие последовательности не представлены в экспрессированных последовательностях и, следовательно, классифицируются как псевдогены.

[00164] Термин ген при использовании в данном документе относится к кодирующей продукт (например, продукт РНК и/или продукт полипептида) последовательности ДНК в хромосоме. В некоторых вариантах осуществления ген включает кодирующую последовательность (то есть последовательность, которая кодирует конкретный продукт). В некоторых вариантах ген включает некодирующую последовательность. В некоторых конкретных вариантах осуществления ген может включать как кодирующую (например, экзонную), так и некодирующую (например, интронную) последовательность. В некоторых вариантах ген может включать одну или более регуляторных последовательностей (например, промоторов, энхансеров и т.д.) и/или интронных последовательностей, которые, например, могут контролировать или влиять на один или более аспектов экспрессии генов (например, экспрессия, специфичная для клеточного типа, индуцибельная экспрессия и т.д.). Для ясности отметим, что используемый в настоящем описании термин «ген» обычно относится к части нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид или его фрагмент; термин может необязательно включать регуляторные последовательности, что будет понятно из контекста специалистам в данной области техники. Это определение не предназначено для исключения применения термина «ген» к не кодирующим белок единицам экспрессии, а скорее для пояснения того, что в большинстве случаев термин, используемый в данном этом документе, относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид.

[00165] Термин гетерологичный при использовании в данном документе относится к агенту или объекту из другого источника. Например, при использовании в отношении полипептида, гена или генного продукта, присутствующего в конкретной клетке или организме, термин поясняет, что соответствующий полипептид, ген или генный продукт: 1) был спроектирован рукой человека; 2) был введена в клетку или организм (или их предшественник) руками человека (например, с помощью генной инженерии); и/или 3) естественным образом не вырабатывается или не присутствует в соответствующей клетке или организме (например, соответствующем типе клетки или организма). Термин «гетерологичный» также включает полипептид, ген или генный продукт, который обычно присутствует в конкретной нативной клетке или организме, но был изменен или модифицирован, например, путем мутации или помещения под контроль не природных и, в некоторых вариантах осуществления, неэндогенных регуляторных элементов (например, промоторов).

[00166] Термин клетка-хозяин при использовании в данном документе относится к клетке, в которую была введена нуклеиновая кислота или белок. Специалисты в данной области поймут, что такие термины относятся не только к конкретной клетке субъекта, но также используются для обозначения потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут происходить определенные модификации, обусловленные либо мутацией, либо влиянием окружающей среды, такое потомство может фактически не быть идентичным родительской клетке, но оно все же включено в объем термина «клетка-хозяин». В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой или содержит прокариотическую или эукариотическую клетку. Как правило, клеткой-хозяином является любая клетка, которая подходит для получения и/или продуцирования гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка, независимо от биологического царства, к которому принадлежит клетка. Типичные клетки включают клетки прокариот и эукариот (одноклеточных или многоклеточных), бактериальные клетки (например, штаммы Escherichia coli, Bacillus spp., Streptomyces spp.и т.д.), микобактериальные клетки, грибковые клетки, дрожжевые клетки (например,, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomycespombe, Pichiapastoris, Pichia methanolica и т.д.), растительные клетки, клетки насекомых (например, SF-9, SF-21, инфицированные бакуловирусом клетки насекомых, Trichoplusia ni и др.), клетки животного, не являющегося человеком, клетки человека или клеточные слияния, такие как, например, гибридомы или квадромы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека, обезьяны, человекообразной обезьяны, хомяка, крысы или мыши. В некоторых вариантах осуществления клетка является эукариотической и выбрана из следующих клеток: СНО (например, СНО K1 DXB-11 СНО, Veggie-CHO), COS (например, COS-7), клетка сетчатки, Vero, CV1, клетка почки (например, НЕК293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, ВНК), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, НВ 8065, HL-60 (например, ВНК21), Jurkat, Daudi, А431 (эпидермальный), CV-1, U937, 3Т3, L-клетка, клетка С127, SP2/0, NS-0, ММТ 060562, клетка Сертоли, клетка BRL 3А, клетка НТ1080, клетка миеломы, опухолевая клетка и клеточная линия, полученная из вышеупомянутой клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит один или более вирусных генов, например клетка сетчатки, которая экспрессирует вирусный ген (например, клетка PER.C6®). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой или содержит выделенную клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин является частью ткани. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин является частью организма.

[00167] Термин идентичность при использовании в данном документе в отношении сравнения последовательностей относится к идентичности, определенной в соответствии с рядом различных алгоритмов, известных в данной области, которые могут использоваться для измерения идентичности нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления идентификаторы в соответствии с описанием в данном документе определяются с использованием выравнивания ClustalW v. 1.83 (медленное) с использованием штрафа за открытие гэпа 10,0, штрафа за увеличение гэпа 0,1 и с использованием матрицы сходства Gonnet (MACVECTOR ™ 10.0.2, Mac Vector Inc., 2008).

[00168] Термин на месте при использовании в данном документе относится к позиционному замещению, в котором первая последовательность нуклеиновой кислоты расположена в положении второй последовательности нуклеиновой кислоты в хромосоме (например, где вторая последовательность нуклеиновой кислоты была ранее (например, первоначально) расположена в хромосоме, например, в эндогенном локусе второй последовательности нуклеиновой кислоты). Термин «на месте» не требует удаления второй последовательности нуклеиновой кислоты, например, из локуса или хромосомы. В некоторых вариантах осуществления вторая последовательность нуклеиновой кислоты и первая последовательность нуклеиновой кислоты сравнимы друг с другом в том, что, например, первая и вторая последовательности гомологичны друг другу, содержат соответствующие элементы (например, белковые кодирующие элементы, регуляторные элементы и т.д.) и/или имеют похожие или идентичные последовательности. В некоторых вариантах осуществления первая и/или вторая последовательность нуклеиновой кислоты включает один или более из промотора, энхансера, сайта донора сплайсинга, сайт а акцептора сплайсинга, интрона, экзона, нетранслируемой области (UTR); в некоторых вариантах осуществления первая и/или вторая последовательность нуклеиновой кислоты включает одну или более кодирующих последовательностей. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой гомолог или вариант (например, мутант) второй последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой ортолог или гомолог второй последовательности. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность нуклеиновой кислоты человека. В некоторых вариантах осуществления, в том числе, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность нуклеиновой кислоты человека, вторая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность грызуна (например, последовательность мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления, в том числе, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность нуклеиновой кислоты человека, вторая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность человека. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой вариант или мутант (то есть последовательность, которая содержит одно или более отличий в последовательности, например, замен, по сравнению со второй последовательностью) второй последовательности. Расположенная таким образом последовательность нуклеиновой кислоты может включать одну или более регуляторных последовательностей, которые являются частью исходной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой для получения расположенной таким образом последовательности (например, промоторы, энхансеры, 5'- или 3'-нетранслируемые области и т.д.). Например, в различных вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой замену эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью, которая приводит к получению генного продукта из последовательности нуклеиновой кислоты, расположенной таким образом (содержащей гетерологичную последовательность), но не экспрессии эндогенной последовательности; первая последовательность нуклеиновой кислоты имеет эндогенную геномную последовательность с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, выполняющий функцию, аналогичную полипептиду, кодируемому эндогенной последовательностью (например, эндогенная геномная последовательность кодирует полипептид вариабельной области, не принадлежащий человеку, полностью или частично, и фрагмент ДНК кодирует один или более полипептидов вариабельной области человека, полностью или частично). В различных вариантах осуществления сегмент гена иммуноглобулина человека или его фрагмент находится на месте эндосегмента гена или фрагмента гена иммуноглобулина, не принадлежащего человеку.

[00169] Термин «In vitro» в контексте данного документе относится к событиям, которые происходят в искусственной среде, например в пробирке или реакционном сосуде, в культуре клеток и т.д., а не в многоклеточном организме.

[00170] Термин «in vivo» в контексте данного документе относится к событиям, которые происходят в многоклеточном организме, таком как человек и животное, отличное от человека. В контексте систем на основе клеток данный термин может использоваться для обозначения событий, которые происходят внутри живой клетки (в отличие, например, от систем in vitro).

[00171] Термин выделенный при использовании в данном документе относится к веществу и/или объекту, который (1) отделен по меньшей мере от некоторых компонентов, с которыми он был связан при первоначальной выработке (природе и/или в экспериментальных условиях), и/или (2) разработан, приготовлен, подготовлен и/или изготовлен вручную. Выделенные вещества и/или объекты могут быть отделены от примерно 10%, примерно 20%, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или более чем примерно 99% других компонентов, с которыми они были первоначально связаны. В некоторых вариантах осуществления выделенные агенты отделяли от 10-100%, 15-100%, 20-100%, 25-100%, 30-100%, 35-100%, 40-100%, 45-100%, 50-100%, 55-100%, 60-100%, 65-100%, 70-100%, 75-100%, 80-100%, 85 -100%, 90-100%, 95-100%, 96-100%, 97-100%, 98-100% или 99-100% других компонентов, с которыми они были изначально связаны. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенные агенты отделяли от 10-100%, 10-99%, 10-98%, 10-97%, 10-96%, 10-95%, 10-90%, 10-85%, 10-80%, 10-75%, 10-70%, 10-65%, 10-60%, 10-55%, 10-50%, 10-45%, 10-40%, 10-35%, 10-30%, 10-25%, 10-20% или 10-15% других компонентов, с которыми они были первоначально связано. В некоторых вариантах осуществления выделенные агенты отделяли от 11-99%, 12-98%, 13-97%, 14%-96%, 15-95%, 20-90%, 25-85%, 30-80%, 35-75%, 40-70%, 45-65%, 50-60% или 55-60% других компонентов, с которыми они изначально были связаны. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенные агенты имеют чистоту около 80%, около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или более чем около 99%. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенные агенты имеют чистоту 80-99%, 85-99%, 90-99%, 95-99%, 96-99%, 97-99% или 98-99%. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенные агенты имеют чистоту 80-99%, 80-98%, 80-97%, 80-96%, 80-95%, 80-90% или 80-85%. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенные агенты имеют чистоту 85-98%, 90-97% или 95-96%. При использовании в данном документе вещество называется «чистым», если оно по существу не содержит других компонентов. В некоторых вариантах осуществления, как будет понятно специалистам в данной области техники, вещество может все еще считаться «выделенным» или даже «чистым» после объединения с некоторыми другими компонентами, такими как, например, один или более носителей или наполнителей (например, буфер, растворитель, вода и т.д.); в таких вариантах осуществления процент выделения или чистоты вещества рассчитывают без учета таких носителей или наполнителей. Например, в некоторых вариантах осуществления биологический полимер, такой как полипептид или полинуклеотид, который встречается в природе, считается «выделенным», когда: а) в силу своего происхождения или источника деривации не связан с некоторыми или всеми из компонентов, которые сопровождают его в его естественном состоянии в природе; б) он по существу не содержит других полипептидов или нуклеиновых кислот того же вида из видов, которые его вырабатывают в природе; или с) экспрессируется или иным образом ассоциируется с компонентами клетки или другой системы экспрессии, которая не относится к виду, производящему его в природе. Так, например, в некоторых вариантах осуществления полипептид, который синтезируется химически или синтезируется в клеточной системе, отличной от той, которая вырабатывает его в природе, считается «выделенным» полипептидом. Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления полипептид, который был подвергнут одному или более из способов очистки, может рассматриваться как «выделенный» полипептид в той степени, в которой он был отделен от других компонентов: а) с которыми он связан в природе; и/или b) с которым он был связан при первоначальной выработке.

[00172] Термин локус при использовании в данном документе, относится к местоположению гена (или значимой последовательности), последовательности ДНК, последовательности, кодирующей полипептид, или положению в хромосоме генома организма. Например, «локус иммуноглобулина» может относиться к расположению сегмента гена иммуноглобулина (например, V, D, J или С), последовательности ДНК сегмента гена иммуноглобулина, последовательности, кодирующей сегмент гена иммуноглобулина, или позиции сегмента гена иммуноглобулина в хромосоме генома организма, которая была идентифицирована относительно того, где находится такая последовательность. «Локус иммуноглобулина» может содержать регуляторный элемент сегмента гена иммуноглобулина, включая, но не ограничиваясь этим, энхансер, промотор, 5'- и/или 3'-регуляторную последовательность или область или их комбинацию. «Локус иммуноглобулина» может содержать межгенную ДНК, например, ДНК, которая обычно находится или появляется между сегментами гена в локусе дикого типа. Специалисты в данной области поймут, что в некоторых вариантах осуществления хромосомы могут содержать сотни или даже тысячи генов и демонстрировать физическую совместную локализацию сходных генетических локусов при сравнении разных видов. Такие генетические локусы могут быть описаны как имеющие общую синтению.

[00173] Термин естественным образом находится или естественным образом расположена при использовании в данном документе в отношении биологического элемента (например, последовательности нуклеиновой кислоты) означает, что биологический элемент может быть найден в определенном контексте и/или месте без использования способов конструирования (например, генной инженерии), в клетке или организме (например, животном). Другими словами, последовательность, которая естественным образом расположена в указанном контексте и/или местоположении, не находится в указанном контексте и/или местоположении в результате процесса конструирования (например, генной инженерии). Например, последовательность, которая естественным образом расположена рядом с сегментом гена Jκ1 человека в эндогенном локусе легкой цепи каппа иммуноглобулина человека представляет собой последовательность, которая может быть обнаружена у человека рядом с сегментом гена JκI человека в эндогенном локусе легкой цепи каппа иммуноглобулина человека при отсутствии генной инженерии. В некоторых вариантах осуществления последовательность может происходить, быть получена и/или выделена из того места, где она естественным образом расположена в клетке или организме. В некоторых вариантах осуществления клетка или организм не является прямым источником последовательности, которая естественным образом расположена в клетке или организме. Например, соответствующая последовательность в клетке или организме может быть идентифицирована, а затем произведена или реплицирована с помощью механизмов, известных в данной области.

[00174] Термин животное, не являющееся человеком при использовании в данном документе относится к любому позвоночному организму, который не является человеком. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой циклостому, костистую рыбу, хрящевую рыбу (например, акулу или ската), амфибию, рептилию, млекопитающее и птицу. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее, не являющееся человеком, представляет собой примата, козу, овцу, свинью, собаку, корову или грызуна. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой грызуна, такого как крыса или мышь.

[00175] Термин нуклеиновая кислота при использовании в данном документе относится к любому соединению и/или веществу, которое включено или может быть включено в олигонуклеотидную цепь. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой соединение и/или вещество, которое входит или может быть включено в олигонуклеотидную цепь посредством фосфодиэфирной связи. Как будет понятно из контекста, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» относится к отдельным остаткам нуклеиновой кислоты (например, нуклеотидам и/или нуклеозидам); в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» относится к олигонуклеотидной цепи, содержащей отдельные остатки нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит РНК; в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит ДНК. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой, содержит или состоит из одного или более естественных остатков нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой, содержит или состоит из одного или более аналогов нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления аналог нуклеиновой кислоты отличается от «нуклеиновой кислоты» тем, что он не использует фосфодиэфирный каркас. Например, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой, содержит или состоит из одной или более «пептидных нуклеиновых кислот», которые известны в данной области техники и каркас которых содержит пептидные связи вместо фосфодиэфирных связей. Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет одну или более фосфоротиоатных и/или 5'-N-фосфорамидитных связей, а не фосфодиэфирных связей. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой, содержит или состоит из одного или более природных нуклеозидов (например, аденозина, тимидина, гуанозина, цитидина, уридина, дезоксиаденозина, дезокситимидина, дезоксигуанозина и дезоксицитидина). В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой, содержит или состоит из одного или более нуклеозидных аналогов (например, 2-аминоаденозина, 2-тиотимидина, инозина, пирролопиримидина, 3-метиладенозина, 5-метилцитидина, С-5 пропинилцитидина, С-5 пропинил-уридина, 2-аминоаденозина, С5-бромуридина, С5-фторуридина, С5-йодуридина, С5-пропинил-уридина, С5-пропинил-цитидина, С5-метилцитидина, 2-аминоаденозина, 7-аминозадина, 7-деазагуанозина, 8-оксоаденозина, 8-оксогуанозина, O(6)-метилгуанина, 2-тиоцитидина, метилированных оснований, интеркалированных оснований и их комбинации). В некоторых вариантах осуществления изобретения «нуклеиновая кислота» включает один или более модифицированных сахаров (например, 2'-фторибозу, рибозу, 2'-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу) по сравнению с таковыми в природных нуклеиновых кислотах. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет нуклеотидную последовательность, которая кодирует функциональный генный продукт, такой как РНК или полипептид. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» включает один или более интронов. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» включает один или более экзонов. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновую кислоту» получают путем одного или более выделений из природного источника, ферментативного синтеза путем полимеризации на основе комплементарной матрицы (in vivo или in vitro), размножения в рекомбинантной клетке или системе и химического синтеза., В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет длину, без ограничения, по меньшей мере, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» является одноцепочечной; в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» является двухцепочечной. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере один элемент, который кодирует полипептид, или являющуюся комплементарной последовательности, которая кодирует полипептид. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» обладает ферментативной активностью.

[00176] Термин «функционально связанный» при использовании в данном документе относится к взаимному расположению, в котором описываемые таким образом компоненты находятся во взаимосвязи, обеспечивающей их функционирование предполагаемым для них образом. Контрольная последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигируется таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с контрольными последовательностями. «Функционально связанные» последовательности включают в себя как регулирующие экспрессию последовательности, которые примыкают к представляющему интерес гену, так и последовательности, контролирующие экспрессию, которые действуют в транс-положении или на расстоянии, контролируя представляющий интерес ген (или представляющую интерес последовательность). Термин «регулирующие экспрессию последовательности» включает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и обработку кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Регулирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации, терминации, промотора и энхансера транскрипции; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е., консенсусная последовательность Козак); последовательности, которые повышают стабильность полипептида; и, при необходимости, последовательности, которые усиливают секрецию полипептида. Природа такой регулирующей последовательности различна в зависимости от организма-хозяина. Например, у прокариот такие регулирующие последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции, тогда как у эукариот обычно такие регулирующие последовательности включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин «регулирующие последовательности» предназначен для включения компонентов, присутствие которых является существенным для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, присутствие которых является преимущественным, например, лидерные последовательности и последовательности партнеров слияния.

[00177] Термин физиологические условия при использовании в данном документе относится к понимаемому в данной области техники значению, относящемуся к условиям, при которых клетки или организмы живут и/или размножаются. В некоторых вариантах осуществления этот термин включает условия внешней или внутренней среды, которые могут возникать в природе для организма или клеточной системы. В некоторых вариантах осуществления физиологическими условиями являются условия, которые присутствуют в теле человека или животного, не являющегося человеком, особенно те условия, которые присутствуют в и/или в пределах хирургического участка. Физиологические условия обычно включают, например, диапазон температур 20-40°С, атмосферное давление 1, рН 6-8, концентрацию глюкозы 1-20 мМ, концентрацию кислорода на атмосферных уровнях и гравитацию в том виде, в каком она встречается на Земле. В некоторых вариантах осуществления условиями в лаборатории манипулируют и/или поддерживают в физиологических условиях. В некоторых вариантах осуществления физиологические условия встречаются в организме.

[00178] Термин полипептид при использовании в данном документе относится к любой полимерной цепи аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая не встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая содержит части, которые встречаются в природе отдельно друг от друга (то есть от двух или более различных организмов, например части человека и не человека). В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая сконструирована таким образом, что она сконструирована и/или продуцирована посредством действий человека. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью, которая не встречается в природе (например, последовательность, которая сконструирована таким образом, что она сконструирована и/или получена посредством действий человека для кодирования указанного полипептида),

[00179] Термин рекомбинантный при использовании в данном документе относится к полипептидам, которые разработаны, сконструированы, получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, например, полипептидам, экспрессированным с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина, полипептидам, выделенным из библиотеки рекомбинантных комбинаторных полипептидов человека (Hoogenboom, HR, 1997, TIB Tech. 15:62-70; Azzazy, Н. and W.E. Highsmith, 2002, Clin. Biochem. 35:425-45; Gavilondo, J. V. and J.W. Larrick, 2002, BioTechniques 29:128-45; Hoogenboom H., and P. Chames, 2000, Immunol. Today 21:371-8, включенный в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте), антителам, выделенным из животного (например, мыши), которое было генетически модифицировано для включения генов иммуноглобулина человека (см., например, Taylor, LDet al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-95; Kellermann, S-A. and L.L. Green, 2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13:593-7; Little, M. et al., 2000, Immunol. Today 21:364-70; Osborn, M.J. et al., 2013, J. Immunol. 190:1481-90; Lee, E-C. et al., 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63; Macdonald, L.E. et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5147-52; Murphy, A.J. et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме) или полипептидам, полученным, экспрессированным, созданным или выделенным любым другим способом, который включает сплайсинг выбранных элементов последовательности друг с другом. В некоторых вариантах осуществления один или более таких выбранных элементов последовательности встречаются в природе. В некоторых вариантах осуществления один или более таких выбранных элементов последовательности сконструированы in silico. В некоторых вариантах осуществления один или более таких выбранных элементов последовательности являются результатом мутагенеза (например, in vivo или in vitro) известного элемента последовательности, например, из природного или синтетического (например, созданного человеком) источника. Например, в некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид состоит из последовательностей, обнаруженных в геноме интересующего организма-источника (например, человека, мыши и т.д.). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая является результатом мутагенеза (например, in vitro или in vivo, например, у животного, не являющегося человеком), так что аминокислотные последовательности рекомбинантных полипептидов представляют собой последовательности, которые, хотя и происходят из полипептидных последовательностей и являются связанными с ними, в естественных условиях могут не существовать в геноме животного, не являющегося человеком, in vivo.

[00180] Термин эталонный или эталон при использовании в данном документе относится к стандартному или контрольному агенту, животному, когорте, индивидууму, популяции, образцу, последовательности или значению, с которым сравнивается агент, животное, когорта, индивидуум, популяция, образец, последовательность или значение, представляющие интерес. В некоторых вариантах осуществления эталонный агент, животное, когорта, индивидуум, популяция, образец, последовательность или значение тестируются и/или определяются по существу одновременно с тестированием или определением агента, животного, когорты, индивидуума, популяции, образца, последовательности или значения, представляющих интерес. В некоторых вариантах осуществления эталонный агент, животное, когорта, индивидуум, популяция, образец, последовательность или значение представляют собой историческую ссылку, необязательно воплощенную в материальной среде. В некоторых вариантах осуществления эталон может относиться к контролю. «Эталон» также включает в себя «эталонное животное». «Эталонное животное» может иметь модификацию в соответствии с описанием в данном документе, модификацию, которая отличается от описанной в данном документе, или не иметь модификаций (то есть, представлять собой животное дикого типа). Как обычно понимают специалисты в данной области, эталонный агент, животное, когорта, индивидуум, популяция, образец, последовательность или значение определяют или характеризуют в условиях, сопоставимых с теми, которые используются для определения или характеристики агента, животного (например, млекопитающего), когорты, индивидуума, популяции, образца, последовательности или значения, представляющего интерес.

[00181] Термин замена при использовании в данном документе относится к процессу, посредством которого «замененная» последовательность нуклеиновой кислоты (например, ген), обнаруженная в локусе хозяина (например, в геноме), удаляется из этого локуса, и другая «заменяющая» нуклеиновая кислота вводится на ее место. В некоторых вариантах осуществления замененная последовательность нуклеиновой кислоты и заменяющие последовательности нуклеиновой кислоты сравнимы друг с другом в том, что, например, они гомологичны друг другу, содержат соответствующие элементы (например, белковые кодирующие элементы, регуляторные элементы и т.д.) и/или имеют похожие или идентичные последовательности. В некоторых вариантах осуществления замененная последовательность нуклеиновой кислоты включает один или более из промотора, энхансера, сайта донора сплайсинга, сайт а акцептора сплайсинга, интрона, экзона, нетранслируемой области (UTR); в некоторых вариантах осуществления заменяющая последовательность нуклеиновой кислоты включает одну или более кодирующих последовательностей. В некоторых вариантах осуществления заменяющая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой гомолог или вариант (например, мутант) замененной последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления заменяющая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой ортолог или гомолог замененной последовательности. В некоторых вариантах осуществления заменяющая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность нуклеиновой кислоты человека. В некоторых вариантах осуществления, в том числе, когда заменяющая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность нуклеиновой кислоты человека, замененная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность грызуна (например, последовательность мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления, в том числе, когда заменяющая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность нуклеиновой кислоты человека, замененная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность человека. В некоторых вариантах осуществления заменяющая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой вариант или мутант (то есть последовательность, которая содержит одно или более различий в последовательностях, например, замен по сравнению с замененной последовательностью) замененной последовательности. Расположенная таким образом последовательность нуклеиновой кислоты может включать одну или более регуляторных последовательностей, которые являются частью исходной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой для получения расположенной таким образом последовательности (например, промоторы, энхансеры, 5' - или 3'-нетранслируемые области и т.д.). Например, в различных вариантах осуществления заменяющая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой замену эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью, которая приводит к получению генного продукта из последовательности нуклеиновой кислоты, расположенной таким образом (содержащей гетерологичную последовательность), но не экспрессии эндогенной последовательности; заменяющая последовательность нуклеиновой кислоты имеет эндогенную геномную последовательность с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, выполняющий функцию, аналогичную полипептиду, кодируемому эндогенной последовательностью (например, эндогенная геномная последовательность кодирует полипептид вариабельной области, не принадлежащий человеку, полностью или частично, и фрагмент ДНК кодирует один или более полипептидов вариабельной области человека, полностью или частично). В различных вариантах осуществления сегмент гена эндогенного иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, или его фрагмент заменен сегментом гена иммуноглобулина человека или его фрагментом.

[00182] Термин по существу при использовании в данном документе относится к качественному состоянию, демонстрирующему общую или почти полную степень, или степень представляющей интерес характеристики или свойства. Средний специалист в области биологических наук поймет, что биологические и химические явления редко, если вообще когда-либо, доходят до завершения и/или переходят к завершению, достигают или исключают абсолютный результат. Таким образом, термин «по существу» используется в данном документе для обозначения потенциального недостатка полноты, присущей многим биологическим и химическим явлениям.

[00183] Термин существенное сходство при использовании в данном документе относится к сравнению между аминокислотными или нуклеиновыми кислотными последовательностями. Как будет понятно специалистам в данной области, две последовательности, как правило, считаются «по существу сходными», если они содержат сходные остатки (например, аминокислоты или нуклеотиды) в соответствующих положениях. Как понятно в данной области техники, хотя сходные остатки могут быть идентичными остатками (см. также «существенная идентичность» ниже), сходные остатки также могут быть неидентичными остатками с соответствующим образом сопоставимыми структурными и/или функциональными характеристиками. Например, как известно специалистам в данной области техники, некоторые аминокислоты обычно классифицируют как «гидрофобные» или «гидрофильные» аминокислоты и/или как имеющие «полярные» или «неполярные» боковые цепи. Замена одной аминокислоты на другую того же типа часто может рассматриваться как «консервативная» замена. Типичные классификации аминокислот приведены в таблице ниже.

[00184] Как хорошо известно в данной области техники, последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот можно сравнивать с использованием любого из множества алгоритмов, в том числе доступных в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, gappedBLAST и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Примерные такие программы описаны в Altschul, SF et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. and B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol.132, Humana Press, 1998, полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки. В дополнение к идентификации сходных последовательностей упомянутые выше программы обычно предоставляют указание степени сходства. В некоторых вариантах осуществления две последовательности считаются по существу сходными, если по меньшей мере например, без ограничения, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков являются сходными (например, идентичными или включающими консервативную замену) по соответствующему участку остатков. В некоторых вариантах осуществления соответствующий участок представляет собой полную последовательность (например, последовательность гена, сегмент гена, последовательность, кодирующую домен, полипептид или домен). В некоторых вариантах осуществления соответствующий участок составляет по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления соответствующий участок составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления соответствующий участок включает смежные остатки вдоль полной последовательности. В некоторых вариантах осуществления соответствующий участок включает в себя прерывистые остатки вдоль полной последовательности, например, несмежные остатки, объединенные посредством свернутой конформации полипептида или его части.

[00185] Термин существенная идентичность при использовании в данном документе относится к сравнению между аминокислотными или нуклеиновыми кислотными последовательностями. Как будет понятно специалистам в данной области техники, две последовательности, как правило, считаются «по существу идентичными», если они содержат идентичные остатки (например, аминокислоты или нуклеотиды) в соответствующих положениях. Как хорошо известно в данной области техники, последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот можно сравнивать с использованием любого из множества алгоритмов, в том числе доступных в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, gappedBLAST и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Примерные такие программы описаны в Altschul, SF et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. and B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998, каждая из которых полностью включена в настоящее описание посредством ссылки. В дополнение к идентификации идентичных последовательностей программы, упомянутые выше, обычно предоставляют указание степени идентичности. В некоторых вариантах осуществления две последовательности считаются по существу идентичными, если по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков идентичны на соответствующем участке остатков. В некоторых вариантах осуществления соответствующий участок остатков представляет собой полную последовательность. В некоторых вариантах осуществления соответствующий участок остатков представляет собой, например, без ограничений, по меньшей мере, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков.

[00186] Термин нацеленная конструкция или нацеленный вектор при использовании в данном документе относится к полинуклеотидной молекуле, которая содержит область нацеливания. Область нацеливания содержит последовательность, которая идентична или по существу идентична последовательности в клетке-мишени, ткани или животном и обеспечивает интеграцию конструкции-мишени в положение в геноме клетки, ткани или животного посредством гомологичной рекомбинации. Области нацеливания, которые нацелены с использованием сайтов распознания сайт-специфической рекомбиназы (например, сайтов loxP или Frt), также включены и описаны в данном документе. В некоторых вариантах осуществления нацеленная конструкция в соответствии с описанием в настоящем документе дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты или ген, представляющий особый интерес, селективный маркер, контрольные и/или регуляторные последовательности и другие последовательности нуклеиновой кислоты, которые обеспечивают рекомбинацию, опосредованную посредством экзогенного добавления белков, которые способствуют или облегчают рекомбинацию с участием таких последовательностей. В некоторых вариантах осуществления нацеленная конструкция в соответствии с описанием в настоящем документе дополнительно содержит представляющий интерес ген полностью или частично, где представляющий интерес ген представляет собой гетерологичный ген, который полностью или частично кодирует полипептид, который выполняет функцию, аналогичную белку, кодируемому эндогенной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления нацеленная конструкция в соответствии с описанием в настоящем документе дополнительно содержит интересующий гуманизированный ген полностью или частично, где представляющий интерес гуманизированный ген кодирует полипептид, полностью или частично, который выполняет функцию, аналогичную функции полипептида, кодируемого эндогенной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления нацеленная конструкция (или нацеленный вектор) может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая подверглась манипуляциям со стороны человека. Например, в некоторых вариантах осуществления нацеленная конструкция (или нацеленный вектор) может быть сконструирована так, чтобы содержать сконструированный или рекомбинантный полинуклеотид, который содержит две или более последовательности, которые не связаны друг с другом в таком порядке в природе, но подверглись манипуляциям со стороны человека с целью образования непосредственной связи между ними в сконструированном или рекомбинантном полинуклеотиде.

[00187] Термин трансген или трансгенная конструкция при использовании в данном документе относится к последовательности нуклеиновой кислоты (кодирующей, например, представляющий интерес полипептид, полностью или частично), которая была введена в клетку в процессе манипуляций человека, например способами, описанными в данном документе. Трансген может быть частично или полностью гетерологичным, то есть чужеродным, для генетически модифицированного животного или клетки, в которую он введен. Трансген может включать одну или более регуляторных последовательностей транскрипции и любую другую нуклеиновую кислоту, такую как интроны или промоторы, которые могут быть необходимы для экспрессии выбранной последовательности нуклеиновой кислоты.

[00188] Термины генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, или генетически сконструированное животное, не являющееся человеком в данном документе используются взаимозаменяемо и относятся к любому не встречающемуся в природе животному, отличному от человека, в котором одна или более клеток животного, не являющегося человеком, содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту и/или ген, кодирующий представляющий интерес полипептид, полностью или частично. Например, в некоторых вариантах осуществления «генетически модифицированное животное, не являющееся человеком» или «генетически сконструированное животное, не являющееся человеком», относится к животному, не являющемуся человеком, которое содержит трансген или трансгенную конструкцию в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления гетерологичную нуклеиновую кислоту и/или ген вводят в клетку прямо или косвенно путем введения в клетку-предшественник путем преднамеренного генетического воздействия, такого как микроинъекция или инфекция рекомбинантным вирусом. Термин «генетическая манипуляция» не включает классические методы селекции, а, скорее, относится к введению молекул рекомбинантной ДНК. Такие молекулы могут быть интегрированы в хромосому или могут представлять собой внехромосомно реплицирующиеся ДНК. Термины «генетически модифицированное животное, не являющееся человеком» или «генетически сконструированное животное, не являющееся человеком», относятся к животным, которые являются гетерозиготными или гомозиготными по гетерологичной нуклеиновой кислоте и/или гену, и/или к животным, которые имеют одну или более копий гетерологичной нуклеиновой кислоты и/или гена.

[00189] Термин вектор при использовании в данном документе относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В некоторых вариантах осуществления векторы способны к внехромосомной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они связаны, в клетке-хозяине, такой как эукариотическая и/или прокариотическая клетка. Векторы, способные направлять экспрессию функционально связанных генов, обозначаются в данном документе как «векторы экспрессии».

[00190] Термин дикий тип при использовании в данном документе относится к объекту, имеющему структуру и/или активность, обнаруженную в природе в «нормальном» (в отличие от мутантного, больного, измененного и т.д.) состоянии или контексте. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что гены и полипептиды дикого типа часто существуют во множестве различных форм (например, аллелей).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[00191] Настоящее раскрытие предоставляет, среди прочего, сконструированных животных, не являющихся человеком, имеющих гетерологичный генетический материал, кодирующий домен Vλ человека, в состав гетерологичного генетического материала которого входят последовательности генов Vλ и Jλ, человека (то есть, генные сегменты) и другие последовательности человек а, которые обеспечивают надлежащую перегруппировку (например, рекомбинационную сигнальную последовательность (RSS)) и экспрессию антител, имеющих легкие цепи λ Ig, которые включают человеческую часть и нечеловеческую часть, или антитела, имеющие легкие цепи λ Ig, являющиеся полностью человеческими. Например, в различных вариантах осуществления, когда генный сегмент человека присутствует в геноме сконструированного животного, не являющегося человеком, также могут присутствовать соответствующие сигнальные последовательности рекомбинации (например, RSS Vλ с сегментом гена Vλ, RSS Jλ, с сегментом гена Jλ, RSS Vκ с сегментом гена Vκ, RSS Jκ с сегментом гена Jκ и т.д.). В различных воплощениях предоставленные сконструированные животные, не являющиеся человеком, содержат гетерологичный генетический материал, который вставлен таким образом, что антитела, содержащие легкие цепи, имеют домен Vλ человека и человеческий или нечеловеческий домен Сλ, экспрессируются в спектре антител животного, не являющегося человеком. Кроме того, при условии, что сконструированные животные, не являющиеся человеком, содержат гетерологичный генетический материал, который вставлен таким образом, что антитела, содержащие легкие цепи, которые имеют домен Vλ человека и человеческий или нечеловеческий домен Сλ, экспрессируются в локусах легкой цепи κ Ig, которые включают генные последовательности (например, генные сегменты) Ig λ человека и нечеловеческого Ig λ и, в некоторых вариантах, последовательности легкой цепи Ig к человека в геноме зародышевой линии животного, не являющегося человеком.

[00192] Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, предполагается, что животные, не являющиеся людьми в соответствии с описанием в данном документе, обеспечивают улучшенную систему in vivo, которая использует экспрессию антител, содержащих домены Vλ человека, для получения терапевтических антител. Также предполагается, что животные, не являющиеся человеком в соответствии с описанием в данном документе, в некоторых вариантах осуществления предоставляют альтернативные сконструированные формы локусов легкой цепи (например, локусы легкой цепи κ Ig), которые содержат гетерологичный генетический материал для разработки терапевтических средств на основе человеческих антител (например, человеческих моноклональных антител, мультиспецифических связывающих агентов, scFv, гибридных полипептидов и т.д.) к мишеням, связанных с реакциями смещения антител (например, ответы антител, характеризующиеся преобладающей долей легких цепей κ или λ). Таким образом представленные животные, не являющиеся человеком, особенно полезны для разработки человеческих антител и молекул на основе человеческих антител (например, мультиспецифических связывающих агентов, scFv, слитых полипептидов и т.д.) в отношении мишеней, связанных с плохой иммуногенностью (например, вирусов), частично из-за искаженного спектра антител и/или ответов.

[00193] Настоящее раскрытие описывает, среди прочего, локус легкой цепи κ иммуноглобулина, который включает один или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека и ген Сλ. Такой локус называется «лямбда в каппе» или «LiK».

[00194] В частности, в настоящем раскрытии описывается получение животного, не являющегося человеком (например, грызуна), имеющего геном зародышевой линии, который содержит сконструированный локус легкой цепи κ Ig, который в некоторых вариантах характеризуется введением множества сегментов гена Vλ и Jλ человека и введение человеческого или нечеловеческого гена Сλ на место нечеловеческого гена Сκ таким образом, что указанное множество сегментов гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с указанным геном человека или нечеловеческим геном Сλ. Как описано в данном документе, получение такого сконструированного локуса легкой цепи κ Ig приводит к экспрессии антител, которые содержат легкие цепи, содержащие человеческий домен Vλ и не принадлежащий человеку или человеческий домен Сλ из указанного сконструированного локуса легкой цепи κI g в геноме зародышевой линии животного, не являющегося человеком. В некоторых вариантах осуществления геном зародышевой линии предоставленных животных, не являющихся человеком, содержит локус легкой цепи κ Ig, включая последовательности легких цепей Igλ человека. В некоторых вариантах осуществления геном зародышевой линии предоставленных животных, не являющихся человеком, включает (i) локус легкой цепи κ Ig, включая последовательности легкой цепи Igλ человека, и (ii) (а) локус легкой цепи κ Ig, включая последовательности легкой цепи Igλ человека или (ii) (b) локус легкой цепи κ Ig, включая последовательности легкой цепи κ Ig человека. Геном зародышевой линии животных, не являющихся человеком, в некоторых вариантах осуществления содержит локус легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе, и дополнительно содержит (i) гуманизированный локус IgH или (ii) гуманизированный локус IgH и функционально подавленный или иным образом сделанный нефункциональным эндогенный локус легкой цепи λ Ig. При условии, что животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, экспрессируют набор антител, которые содержат легкие цепи λ Ig, которые включают домены Vλ человека.

[00195] В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, содержат последовательности легкой цепи Igλ человека в пределах локуса легкой цепи κ Ig. В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, содержат последовательности легкой цепи Igλ человека и не принадлежащие человеку в пределах локуса легкой цепи κ Ig. В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, содержат последовательности легкой цепи Igλ человека и Igκ человека в пределах локуса легкой цепи κ Ig. В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, содержат последовательности легкой цепи Igλ человека, Igκ человека, Ig κ мыши и/или Igλ. мыши в пределах локуса легкой цепи κ Ig. В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, содержат последовательности легкой цепи Igλ человека, последовательности легкой цепи Igλ не человека, последовательности легкой цепи κ Ig человека, последовательности легкой цепи Ig κ не человека или их комбинации в локусе легкой цепи κ Ig. Во многих вариантах осуществления у животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, не принадлежащие человеку последовательности представляют собой или содержат мышиные последовательности (например, мыши или крысы).

[00196] В некоторых вариантах последовательности легкой цепи κ Ig и/или λ Ig включают межгенную ДНК, которая имеет человеческое и/или мышиное происхождение. В некоторых вариантах последовательности легкой цепи κ Ig и/или λ Ig включают межгенную ДНК, которая сконструирована и основана на исходной последовательности человеческого или мышиного происхождения. В некоторых вариантах осуществления указанная межгенная область ДНК происходит из того же локуса иммуноглобулина, в котором межгенная область ДНК размещена, вставлена, расположена или сконструирована (например, межгенная область κ Ig ДНКв локусе легкой цепи κ Ig). В некоторых вариантах осуществления указанная межгенная область ДНК происходит из иного локуса иммуноглобулина, чем тот, в котором межгенная область ДНК размещена, вставлена, расположена или сконструирована (например, межгенная область λ Ig ДНК в локусе легкой цепи κ Ig). В некоторых конкретных вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, содержат сконструированный локус легкой цепи κ Ig, который содержит межгенную область ДНК, которая включает последовательности легкой цепи κ Ig, последовательности легкой цепи λ Ig и/или их комбинации.

[00197] В различных вариантах осуществления гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина содержит по меньшей мере один сегмент гена VH человека, по меньшей мере один сегмент гена DH человека и по меньшей мере один сегмент гена JH человека, функционально связанные с константной областью тяжелой цепи нечеловеческого иммуноглобулина (например, эндогенной константной области тяжелой цепи нечеловеческого иммуноглобулина, которая включает один или более генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, таких как, например, IgM, IgD, IgG, IgE, IgA и т.д.), например, множество человеческих сегментов гена VH, DH и JH, функционально связанных с константной областью тяжелой цепи нечеловеческого иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, имеют геном зародышевой линии, который включает один или более локусов иммуноглобулина, изображенных на чертежах. Такие искусственные животные, не являющиеся людьми, обеспечивают источник человеческих антител и фрагментов человеческих антител и обеспечивают улучшенную систему in vivo, подходящую для использования последовательностей человеческого Vλ для получения терапевтических антител человека.

[00198] Как описано в разделе «Примеры» ниже, предусмотрены животные, не являющиеся человеком, которые имеют геном, который содержит по меньшей мере один из сегментов гена вариабельной области тяжелой цепи (т.е. VH, DH и JH) человека и легкой цепи (например, Vλ и Jλ в эндогенном локусе каппа), например множество сегментов гена вариабельной области тяжелых цепей (т.е. Vh, Dh и Jh) и легких цепей (например, и JX в эндогенном локусе каппа) человека на месте нечеловеческих сегментов гена вариабельной области в эндогенных локусах иммуноглобулина и включают некодирующую межгенную область ДНК человека между сегментами гена вариабельной области человека. Такая межгенная область ДНК включает, например, промоторы, лидерные последовательности и последовательности сигнала рекомбинации, которые обеспечивают надлежащую рекомбинацию и экспрессию сегментов гена человека в контексте вариабельных доменов антител. Специалистам понятно, что не принадлежащие человеку локусы иммуноглобулина также содержат такую некодирующую межгенную область ДНК. Прочитав данное раскрытие, специалисты поймут, что для создания таких локусов можно использовать другую человеческую или нечеловеческую межгенную область ДНК, что приводит к такой же экспрессии вариабельных доменов человека в контексте антител у животного, не являющегося человеком. Такие сходные локусы должны содержать только кодирующие последовательности человека (т.е. экзоны) желаемых сегментов гена человека для достижения экспрессии антител, которые содержат вариабельные домены человека.

[00199] Различные аспекты определенных вариантов осуществления подробно описаны в следующих разделах, каждый из которых может применяться к любому аспекту или варианту осуществления в соответствии с описанием в данном документе. Использование разделов не предназначено для ограничения.

Спектр антител у животных, не являющихся человечком

[00200] Иммуноглобулины (также называемые антителами) представляют собой крупные (~ 150 кДа) гликопротеины в форме буквы Y, которые вырабатываются В-клетками иммунной системы хозяина для нейтрализации патогенных микроорганизмов (например, вирусов, бактерий и т.д.). Каждый иммуноглобулин (Ig) состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, каждая из которых имеет два структурных компонента: вариабельный домен и константный домен. Вариабельные области тяжелой и легкой цепи различаются по антителам, вырабатываемым разными В-клетками, но одинаковы для всех антител, вырабатываемых одной В-клетки или одним клоном В-клетки. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей каждого антитела вместе содержат антигенсвязывающую область (или антигенсвязывающий сайт). Иммуноглобулины могут существовать в различных разновидностях, которые называются изотипами или классами на основе константных областей тяжелой цепи (или доменов), которые они содержат. Константная область тяжелой цепи идентична у всех антител одного и того же изотипа, но отличается у антител разных изотипов. В таблице ниже приведены девять изотипов антител у мыши и человека.

[00201] У других видов были идентифицированы дополнительные изотипы. Изотипы наделяют антитело специализированными биологическими свойствами из-за различных структурных характеристик среди различных изотипов и обнаруживаются в разных местах (клетках, тканях и т.д.) в теле животного. Первоначально В-клетки продуцируют IgM и IgDc идентичными антигенсвязывающими областями. После активации В-клетки переключаются на разные изотипы с помощью процесса, называемого переключением классов, который включает изменение константной области антитела, вырабатываемого В-клеткой, в то время как вариабельные области остаются неизменными, тем самым сохраняя антигенную специфичность исходного антитела (В-клетки).

[00202] Два отдельных локуса (κ Ig и λ Ig) содержат генные сегменты, которые после перестройки кодируют легкие цепи антител и показывают как аллельное, так и изотипическое исключение. Соотношения экспрессии κ+ В-клеток к λ+ В-клеткам различаются у разных видов. Например, люди демонстрируют соотношение около 60:40 (κ:λ). У мышей и крыс наблюдается соотношение 95:5 (κ:λ). Интересно, что соотношение κ:λ, наблюдаемое у кошек (5:95), противоположно мышам и крысам. Было проведено более исследований для выяснения возможных причин таких наблюдаемых соотношений, и в качестве обоснования были предложены как сложность локуса (то есть, количество сегментов гена, в частности, сегментов V-гена), так и эффективность перестройки сегмента гена. Локус легкой цепи λ Ig человека имеет длину более 1000 кб и содержит приблизительно 70 сегментов гена Vλ (от 29 до 33 функциональных) и семь пар сегментов гена Jλ-Cλ (от четырех до пяти функциональных), организованных в три кластера (см., например, фиг. 1 патента США №9,006,511, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки). Большинство наблюдаемых областей Vλ в экспрессированном спектре антител кодируются сегментами гена, содержащимися в самом проксимальном кластере (называемом кластером А). Локус легкой цепи λ Ig разительно отличается от локуса человека и, в зависимости от штамма, содержит только более сегментов гена Vλ и Jλ, организованных в виде двух отдельных генных кластеров (см., например, фиг. 2 патента США №9,006,511, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки).

[00203] Разработка терапевтических антител для лечения различных заболеваний человека в значительной степени была сосредоточена на создании искусственных линий животных, не являющихся человеком, в частности, искусственных линий грызунов, содержащих различные количества генетического материала в своих геномах, соответствующих генам иммуноглобулина человека (рассмотрено, например, в Bruggemann, М. et al., 2015, Arch. Immunol. Ther. Exp.63:101-8, включенную в данное описание в полном объеме посредством ссылки. Первоначальные усилия по созданию таких генетически сконструированных линий грызунов были направлены на интеграцию частей локусов иммуноглобулина человека, которые могли бы сами по себе поддерживать рекомбинацию сегментов гена и выработку тяжелых и/или легких цепей, которые были полностью человеческими и при этом имели инактивированные эндогенные локусы иммуноглобулина (см. например, М. et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 86:67-09-13; M. et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-6; Taylor, L.D. et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Davies, N.P. et al., 1993, Biotechnol. 11:911-4; Green, L.L. et al., 1994, Nat. Genet. 7:13-21; Lonberg, N. et al., 1994, Nature 368:856-9; Taylor, L.D. et al., 1994, Int. Immunol. 6:579-91; Wagner, S.D. et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:2672-81; Fishwild, D.M. et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-51; Wagner, S.D. et al., 1996, Genomics 35:405-14; Mendez, M.J. et al., 1997, Nat. Genet. 15:146-56; Green, L.L. et al., 1998, J. Exp. Med. 188:483-95; Xian, J. et al., 1998, Transgenics 2:333-43; Little, M. et al., 2000, Immunol. Today 21:364-70; Kellermann, S.A. and L.L. Green, 2002, Cur. Opin. Biotechnol. 13:593-7, каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки). В частности, некоторые усилия включали интеграцию последовательности легкой цепи λ Ig человека (см., например, публикации патентной заявки США №2002/0088016 А1, 2003/0217373 А1 и 2011/0236378 А1; патенты США №№6,998,514 и 7,435,871; Nicholson, IC et al., 1999, J. Immunol. 163:6898-906; Popov, A.V et al., 1999, J. Exp. Med. 189(10): 1611-19, каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки). Такие попытки были направлены на случайную интеграцию искусственных хромосом дрожжей, содержащих последовательности Vλ, Jλ и Сλ человека, таким образом создавая линии мыши, которые полностью экспрессируют легкие цепи λ Ig человека(т.е., домены Vλ и Сλчеловека). Более поздние попытки использовали аналогичные стратегии с использованием конструкций, которые также содержат последовательности Vλ, Jλ и Сλ человека (Osborn, MJ et al., 2013, J. Immunol. 190:1481-90; Lee, E-C. et al., 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63, каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки).

[00204] Тем не менее, другие попытки включали специфическую вставку сегментов гена Vλ и Jλ, человека в эндогенные локусы легкой цепи Ig грызунов (κ и λ) так что указанные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с генами константной области легкой цепи эндогенного Ig (см., например, патенты США №№9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 и 9,163,092; все они включены в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте). У таких животных все сегменты гена Vλ человека из кластеров А и В и один или четыре сегмента гена Jλ человека были вставлены в эндогенные локусы легкой цепи κ Ig и λ Ig. В результате более разных сегментов гена Vλ и Jλ человека продемонстрировали надлежащую перестройку в обоих сконструированных локусах легкой цепи Ig грызунов с образованием функциональных легких цепей, экспрессируемых в спектре антител грызунов, легкие цепи которых включали домены Vλ человека в контексте любых эндогенных областей Сκ и Сλ (см., например, таблицу 7 и фигуры 11-13 патента США №9,006,511, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки). В частности, мыши, имеющие сконструированные локусы легкой цепи κ Ig человека, несущие сегменты гена Vλ и Jλ человека продемонстрировали отношение лямбды человека к эндогенной лямбде (в соответствии с измеренным соотношением IgCκ к IgCλ) примерно 1:1 в селезеночном отделении (см., например, Таблицу 4 патента США №9,006,511, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки). Действительно, обе сконструированных линии мыши (т.е., сконструированные локусы легкой цепи κ Ig или λ Ig) продемонстрировали, что домены Vλ человека могут быть экспрессированы из эндогенных локусов легкой цепи Ig у грызунов, которые обычно демонстрируют большое смещение в экспрессии легкой цепи (см. выше). Настоящее раскрытие обеспечивает признание того, что могут быть получены альтернативные сконструированные структуры локуса легкой цепи Ig для максимального использования сегментов гена Vλ и Jλ человека в спектре антител к терапевтическим мишеням у животных, не являющихся человеком, в частности, по сравнению с животными, отличными от человека, которые содержат локус легкой цепи λ Ig, который не обладает качествами устойчивости и сложности (например, у мышей и крыс), которые обычно связаны с локусом легкой цепи λ Ig человека (т.е., таким локусом, который появляется в клетке человека). Такие альтернативные сконструированные структуры локусов легкой цепи Ig обеспечивают способность к уникальным спектрам антител, вытекающим из их конструкции.

[00205] Настоящее раскрытие иллюстрирует успешное создание животного, не являющегося человеком, чей геном зародышевой линии содержит сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ Ig, содержащий множество сегментов гена Vλ и Jλ человека в функциональной связи с нечеловеческим или человеческим геном константной области легкой цепи λ Ig, в котором не принадлежащий человеку или человеческий ген константной области легкой цепи λ Ig вставлен на место нечеловеческого гена константной области легкой цепи κ Ig эндогенного локуса легкой цепи κ Ig. В частности, настоящее раскрытие, в частности, демонстрирует успешное получение (1) сконструированного животного, не являющегося человеком, которое экспрессирует антитела, имеющие вариабельные области человека и не принадлежащие человеку константные области, причем такие антитела включают легкие цепи, которые содержат домен Vλ человека и не принадлежащий человеку домен Сλ и (2) сконструированное животное, не являющееся человеком, которое экспрессирует антитела, имеющие вариабельные области человека и константные области человека, причем такие антитела включают легкие цепи, которые содержат домены Vλ и Сλ человека. Как конкретно показано в данном документе, экспрессия таких легких цепей достигается путем введения указанного множества сегментов гена Vλ и Jλ человека в эндогенный локус легкой цепи κ Ig (или аллель). В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, сконструированы таким образом, что экспрессия эндогенной вариабельной области легкой цепи λ Ig инактивируется (например, путем делеции гена).

[00206] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, сконструированы таким образом, чтобы экспрессия эндогенной вариабельной области легкой цепи κ Ig инактивируется (например, путем замены или замещения). В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, сконструированы таким образом, чтобы животные, не являющиеся человеком, экспрессировали вариабельные области легкой цепи λ Ig человека из сконструированного эндогенного локуса легкой цепи κ Ig и вариабельные области легкой цепи κ Ig из сконструированного эндогенного локуса легкой цепи κ Ig. Таким образом, настоящее раскрытие, по меньшей мере в некоторых вариантах осуществления, охватывает разработку улучшенной системы in vivo для выработки человеческих антител путем предоставления сконструированного животного, не являющегося человеком, содержащего альтернативно сконструированный локус легкой цепи κ Ig, который приводит к экспрессированному спектру антител, содержащих домены Vλ человека и не принадлежащие человеку или человеческие домены Сλ.

Конструкции нуклеиновых кислот

[00207] Как правило, полинуклеотидная молекула, содержащая последовательности легкой цепи λ Ig человека (например, сегменты гена Vλ и Jλ, человека) или их части связана (например, вставлена) с вектором, предпочтительно с вектором ДНК, для репликации полинуклеотидной молекулы в клетке-хозяине.

[00208] Последовательности легкой цепи λ Ig человека могут быть клонированы непосредственно из известных последовательностей или источников (например, библиотек) или синтезированы из последовательностей зародышевой линии, разработанных in silico, на основе опубликованных последовательностей, доступных в GenBank или других общедоступных базах данных (например, IMGT). Альтернативно, библиотеки искусственной бактериальной хромосомы (ВАС) могут предоставлять интересующие последовательности ДНК иммуноглобулина (например, последовательности Vλ и Jλ, человека и их комбинации). Библиотеки ВАС могут содержать вставки размером от 100 до 150 КБ и способны содержать вставки размером до 300 КБ (Shizuya, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8794-8797; Swiatek, et al., 1993, Genes and Development 7:2071-2084; Kim, et al., 1996, Genomics 34 213-218; включенную в данный документ посредством ссылки во всей их полноте). Например, описана человеческая ВАС-библиотека со средним размером вставки 164-196 КБ (Osoegawa, K. et al., 2001, Genome Res. 11(3):483-96; Osoegawa, K. et al., 1998, Genomics 52:1-8, Article No. GE985423, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Геномные библиотеки ВАС человека и мыши были сконструированы и имеются в продаже (например, ThermoFisher). Геномные библиотеки ВАС также могут служить источником последовательностей ДНК иммуноглобулина, а также областей контроля транскрипции.

[00209] Альтернативно, последовательности ДНК иммуноглобулина могут быть выделены, клонированы и/или перенесены из дрожжевых искусственных хромосом (YAC). Например, была определена нуклеотидная последовательность локуса легкой цепи λ Ig человека (см., например, Dunham, I. et al., 1999, Nature 402:489-95, который включен сюда посредством ссылки во всей своей полноте). Кроме того, YAC ранее использовались для сборки трансгенного локуса легкой цепи λ Ig человека (см., например, Popov, AVet al., 1996, Gene 177:195-201; Popov, AVet al., 1999, J. Exp. Med. 189(10): 1611-19, каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки). Весь локус легкой цепи λ Ig (человека или грызуна) может быть клонирован и находиться в более YAC. Если используются более YAC и они содержат области с перекрывающимся сходством, они могут быть рекомбинированы в штаммах дрожжи- хозяина для получения единой конструкции, представляющей весь локус или желаемые части локуса (например, область, на которую нацеливается вектор-мишень). Плечо YAC может быть дополнительно модифицировано с помощью селекционных кассет млекопитающих путем модернизации для содействия введению конструкций в эмбриональные стволовые клетки или эмбрионы способами, известными в данной области техники и/или описанными в данном документе.

[00210] ДНК и аминокислотные последовательности генных сегментов легкой цепи λ Ig человека для использования в конструировании сконструированного локуса легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе могут быть получены из опубликованных баз данных (например, GenBank, IMGT и т.д.) и/или опубликованных последовательностей антител. В некоторых вариантах осуществления конструкции нуклеиновых кислот, содержащие генные сегменты легкой цепи λ Ig человека, содержат J-область (т.е. геномную последовательность, которая включает множество сегментов гена J легкой цепи), где J-область содержит кодирующие последовательности сегментов гена человеческого Jλ с их соответствующей 12RSS, где 12RSS были расположены среди некодирующей межгенной области ДНК, обычно связанной с кодирующими последовательностями сегментов гена Jκ человека с соответствующими им 23RSS.

[00211] В некоторых вариантах осуществления такая последовательность может упоминаться как сконструированная J-область легкой цепи. В некоторых определенных вариантах осуществления конструкции нуклеиновых кислот, содержащие сегменты гена легкой цепи λ Ig человека содержат последовательности Vλ и Jλ человека, функционально связанные с человеческим или нечеловеческим геном константной области (Сλ) легкой цепи λ Ig. В некоторых определенных вариантах осуществления конструкции нуклеиновых кислот, содержащие сегменты гена легкой цепи λ Ig человека содержат последовательности Vλ и Jλ человека, функционально связанные с одной или более энхансерной областью (или энхансерными последовательностями) легкой цепи κ Ig. В некоторых определенных вариантах осуществления конструкции нуклеиновых кислот, содержащие сегменты гена легкой цепи λ Ig человека содержат последовательности Vλ и Jλ человека, функционально связанные с человеческой или нечеловеческой областью гена Сλ и энхансерными областями (или энхансерными последовательностями) легкой цепи κ нечеловеческого Ig.

[00212] В некоторых вариантах осуществления конструкции нуклеиновых кислот, содержащие последовательности Vλ и Jλ человека также содержат межгенную область ДНК человеческого и/или мышиного происхождения. В некоторых вариантах осуществления межгенная область ДНК представляет собой или содержит некодирующую последовательность легкой цепи κ Ig мыши, некодирующую последовательность легкой цепи κ Ig человека, некодирующую последовательность легкой цепи λ Ig мыши, некодирующую последовательность легкой цепи λ Ig человека или их комбинации.

[00213] Конструкции нуклеиновых кислот могут быть изготовлены с использованием способов, известных в данной области. Например, конструкция нуклеиновой кислоты может быть изготовлена в качестве части большей плазмиды. Такой способ изготовления позволяет клонировать и выбирать правильные конструкции эффективным способом, известным в данной области техники. Конструкции нуклеиновых кислот, содержащие последовательности легкой цепи λ Ig человека, полностью или частично, в соответствии с описанием в данном документе, могут быть расположены между сайтами рестрикции на плазмиде, так что они могут быть выделены из других последовательностей плазмиды для включения в желаемое животное, не являющееся человеком.

[00214] В данной области известны различные способы, используемые при получении конструкций нуклеиновых кислот (например, плазмид) и трансформации организмов-хозяев. Для других подходящих систем экспрессии, как для прокариотических, так и для эукариотических клеток, а также общих рекомбинантных процедур см. Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5th Ed., ed. By Old, R.W. and S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994 and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989, каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

Нацеленные векторы

[00215] Нацеленные векторы могут быть использованы для введения конструкции нуклеиновой кислоты в геномный локус-мишень и включают конструкцию нуклеиновой кислоты и гомологические плечи, которые фланкируют указанную конструкцию нуклеиновой кислоты; специалистам в данной области техники известно о множестве вариантов и признаков, обычно применимых к конструкции, структуре и/или использованию нацеленных векторов. Например, нацеленные векторы могут иметь линейную форму или кольцевую форму, и они могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Направленными векторами могут быть дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК). Для простоты ссылки гомологические плечи обозначены как гомологические плечи 5’ и 3' (то есть, далее по ходу транскрипции или против хода транскрипции). Данная терминология относится к относительному положению гомологических плеч относительно конструкции нуклеиновой кислоты в нацеленном векторе. Гомологические плечи 5' и 3’ соответствуют областям в пределах локуса-мишени или области в пределах другого нацеленного вектора, которые упоминаются здесь как «5’ последовательность-мишень» и «3’ последовательность-мишень соответственно. В некоторых вариантах осуществления гомологические плечи также могут функционировать как 5’ или 3' последовательность-мишень.

[00216] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, используют два, три или более нацеленных векторов, способных к рекомбинации друг с другом. В различных вариантах осуществления нацеленные векторы представляют собой большие нацеленные векторы (LTVEC), как описано в другом части данного документа. В таких вариантах осуществления каждый из первого, второго и третьего нацеленного вектора содержит гомологические плечи 5’ и 3’. Гомологическое плечо 3’ первого нацеленного вектора содержит последовательность, которая перекрывается с гомологическим плечом 5’ второго нацеленного вектора (то есть, последовательности перекрываются), что обеспечивает гомологичную рекомбинацию между первым и вторым LTVEC.

[00217] В случае способов двойного нацеливания гомологическое плечо 5’ первого нацеленного вектора и гомологическое плечо 3’ второго нацеленного вектора могут быть аналогичны соответствующим сегментам в пределах целевого геномного локуса (то есть, последовательности-мишени), что может способствовать гомологичной рекомбинации первого и второго нацеленных векторов с соответствующими геномными сегментами и модифицируют целевой геномный локус.

[00218] В случае способов тройного нацеливания гомологическое плечо 3’ второго нацеленного вектора может содержать последовательность, которая перекрывается с гомологическим плечом 5’ третьего нацеленного вектора (то есть, последовательности перекрываются), что может способствовать гомологичной рекомбинации второго и третьего LTVEC. Гомологическое плечо 5’ первого нацеленного вектора и гомологическое плечо 3’ третьего нацеленного вектора аналогичны соответствующим сегментам в пределах целевого геномного локуса (то есть, последовательности-мишени), что может способствовать гомологичной рекомбинации первого и третьего нацеленных векторов с соответствующими геномными сегментами и модифицируют целевой геномный локус.

[00219] Гомологическое плечо и последовательность-мишень или два гомологических плеча «соответствуют» друг другу, когда такие две области имеют достаточный уровень идентичности последовательности друг с другом, чтобы действовать в качестве субстратов для гомологичной реакции рекомбинации. Идентичность последовательности между данной последовательностью-мишенью и соответствующим гомологическим плечом, находящимся в нацеленном векторе (то есть, последовательности перекрываются) или между двумя гомологическими плечами может представлять собой любую степень идентичности последовательности, которая допускает гомологичную рекомбинацию. В качестве одного из примеров, количественное выражение идентичности последовательности, совместно используемой плечом гомологии нацеленного вектора (или его фрагмента) и последовательностью-мишенью другого нацеленного вектора или последовательности-мишени локуса генома-мишени (или его фрагмента) может составлять, например, но не ограничиваясь этим, по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательностей, так что последовательности подвергаются гомологичной рекомбинации.

[00220] Кроме того, соответствующая аналогичная область (например, идентичность) между гомологическим плечом и соответствующей последовательностью-мишенью может иметь любую длину, достаточную для стимулирования гомологичной рекомбинации в локусе генома-мишени. Например, данное гомологическое плечо и/или соответствующая последовательность-мишень могут содержать соответствующие области сходства, которые, например, но не ограничиваясь ими, составляют приблизительно 5-10 КБ, 5-15 КБ, 5-20 КБ, 5-25 КБ, 5-30 КБ, 5-35 КБ, 5-40 КБ, 5-45 КБ, 5-50 КБ, 5-55 КБ, 5-60 КБ, 5-65 КБ, 5-70 КБ, 5-75 КБ, 5-80 КБ, 5-85 КБ, 5-90 КБ, 5-95 КБ, 5-100 КБ, 100-200 КБ или 200-300 КБ в длину (например в соответствии с описанием в данном документе в другом месте), так что гомологическое плечо имеет достаточное сходство, чтобы подвергнуться гомологичной рекомбинации с соответствующими последовательностями-мишенями в целевом геномном локусе клетки или внутри другого нацеленного вектора. В некоторых вариантах осуществления данное гомологическое плечо и/или соответствующая последовательность-мишень содержат соответствующие области сходства, которые, например, но не ограничиваясь ими, составляют приблизительно 10-100 КБ, 15-100 КБ, 20-100 КБ, 25-100 КБ, 30-100 КБ, 35-100 КБ, 40-100 КБ, 45-100 КБ, 50-100 КБ, 55-100 КБ, 60-100 КБ, 65-100 КБ, 70-100 КБ, 75-100 КБ, 80-100 КБ, 85-100 КБ, 90-100 КБ или 95-100 КБ в длину (например в соответствии с описанием в данном документе в другом месте), так что гомологическое плечо имеет достаточное сходство, чтобы подвергнуться гомологичной рекомбинации с соответствующими последовательностями-мишенями в целевом геномном локусе клетки или внутри другого нацеленного вектора.

[00221] Перекрывающиеся последовательности гомологического плеча 3’ первого вектора-мишени и гомологического плеча 5’ второго вектора-мишени или гомологического плеча 3’ второго вектора-мишени и гомологического плеча 5’ третьего вектора-мишени могут быть любой длины, достаточной для стимулирования гомологичной рекомбинации между указанными нацеленными векторами. Например, данная перекрывающаяся последовательность гомологического плеча может содержать соответствующие перекрывающиеся области, которые составляют примерно 1-5 КБ, 5-10 КБ, 5-15 КБ, 5-20 КБ, 5-25 КБ, 5-30 КБ, 5-35 КБ, 5-40 КБ, 5-45 КБ, 5-50 КБ, 5-55 КБ, 5-60 КБ, 5-65 КБ, 5-70 КБ, 5-75 КБ, 5-80 КБ, 5-85 КБ, 5-90 КБ, 5-95 КБ, 5-100 КБ, 100-200 КБ или 200-300 КБ в длину, так что перекрывающаяся последовательность гомологического плеча имеет достаточное сходство, чтобы подвергнуться гомологичной рекомбинации с соответствующей перекрывающейся последовательностью в другом нацеленном векторе. В некоторых вариантах осуществления перекрывающаяся последовательность гомологического плеча может содержать соответствующие перекрывающиеся области, которые составляют примерно 1-100 КБ, 5-100 КБ, 10-100 КБ, 15-100 КБ, 20-100 КБ, 25-100 КБ, 30-100 КБ, 35-100 КБ, 40-100 КБ, 45-100 КБ, 50-100 КБ, 55-100 КБ, 60-100 КБ, 65-100 КБ, 70-100 КБ, 75-100 КБ, 80-100 КБ, 85-100 КБ, 90-100 КБ или 95-100 КБ в длину, так что перекрывающаяся последовательность гомологического плеча имеет достаточное сходство, чтобы подвергнуться гомологичной рекомбинации с соответствующей перекрывающейся последовательностью в другом нацеленном векторе. В некоторых вариантах осуществления перекрывающаяся последовательность имеет длину 1 до 5 КБ включительно. В некоторых вариантах осуществления перекрывающаяся последовательность имеет длину от примерно 1 КБ до примерно 70 КБ включительно. В некоторых вариантах осуществления перекрывающаяся последовательность имеет длину от примерно 10 КБ до примерно 70 КБ включительно. В некоторых вариантах осуществления перекрывающаяся последовательность имеет длину от примерно 10 КБ до примерно 50 КБ включительно. В некоторых вариантах осуществления перекрывающаяся последовательность имеет длину по меньшей мере 10 КБ. В некоторых вариантах осуществления перекрывающаяся последовательность имеет длину по меньшей мере 20 КБ. Например, перекрывающаяся последовательность может иметь длину от примерно 1 КБ до примерно 5 КБ включительно, от примерно 5 КБ до примерно 10 КБ включительно, от примерно 10 КБ до примерно 15 КБ включительно, от примерно 15 КБ до примерно 20 КБ включительно, от примерно 20 КБ до примерно 25 КБ включительно, от примерно 25 КБ до примерно 30 КБ включительно, от примерно 30 КБ до примерно 35 КБ включительно, от примерно 35 КБ до примерно 40 КБ включительно, от примерно 40 КБ до примерно 45 КБ включительно, от примерно 45 КБ до примерно 50 КБ включительно, от примерно 50 КБ до примерно 60 КБ включительно, от примерно 60 КБ до примерно 70 КБ включительно, от примерно 70 КБ до примерно 80 КБ включительно, от примерно 80 КБ до примерно 90 КБ включительно, от примерно 90 КБ до примерно 100 КБ включительно, от примерно 100 КБ до примерно 120 КБ включительно, от примерно 120 КБ до примерно 140 КБ включительно, от примерно 140 КБ до примерно 160 КБ включительно, от примерно 160 КБ до примерно 180 КБ включительно, от примерно 180 КБ до примерно 200 КБ включительно, от примерно 200 КБ до примерно 220 КБ включительно, от примерно 220 КБ до примерно 240 КБ включительно, от примерно 240 КБ до примерно 260 КБ включительно, от примерно 260 КБ до примерно 280 КБ включительно или от примерно 280 КБ до примерно 300 КБ включительно. В качестве одного из примеров, перекрывающаяся последовательность может иметь длину от около 20 КБ до около 60 КБ включительно. Альтернативно, перекрывающаяся последовательность может иметь длину не менее 1 КБ, не менее 5 КБ, не менее 10 КБ, не менее 15 КБ, не менее 20 КБ, не менее 25 КБ, не менее 30 КБ, не менее 35 КБ, не менее 40 КБ, не менее 45 КБ, не менее 50 КБ, не менее 60 КБ, не менее 70 КБ, не менее 80 КБ, не менее 90 КБ, не менее 100 КБ, не менее 120 КБ, не менее 140 КБ, не менее 160 КБ, не менее 180 КБ, не менее 200 КБ, не менее 220 КБ, не менее 240 КБ, не менее 260 КБ, как минимум 280 КБ или не менее 300 КБ. В некоторых вариантах осуществления перекрывающаяся последовательность может иметь длину максимум 400 КБ, максимум 350 КБ, максимум 300 КБ, максимум 280 КБ, максимум 260 КБ, максимум 240 КБ, максимум 220 КБ, максимум 200 КБ, максимум 180 КБ, максимум 160 КБ, максимум 140 КБ, максимум 120 КБ, максимум 100 КБ, максимум 90 КБ, максимум 80 КБ, максимум 70 КБ, максимум 60 КБ или максимум 50 КБ.

[00222] Гомологические плечи могут, в некоторых вариантах осуществления, соответствовать локусу, который является нативным для клетки (например, локусу-мишени), или, альтернативно, они могут соответствовать области гетерологичного или экзогенного сегмента ДНК, который был интегрирован в геном клетки, включая, например, трансгены, кассеты экспрессии или гетерологичные или экзогенные участки ДНК. В некоторых вариантах осуществления гомологические плечи могут, в некоторых вариантах, соответствовать области нацеленного вектора в клетке. В некоторых вариантах осуществления гомологические плечи нацеленного вектора могут соответствовать области дрожжевой искусственной хромосомы (YAC), бактериальной искусственной хромосомы (ВАС), искусственной хромосомы человека или любой другой сконструированной области, содержащейся в соответствующей клетке-хозяине. Кроме того, гомологические плечи нацеленного вектора могут соответствовать или быть получены из области библиотеки ВАС, библиотеки космид или библиотеки фага Р1. В некоторых определенных вариантах осуществления гомологические плечи нацеленного вектора соответствуют локусу, который является нативным, гетерологичным или экзогенным для прокариота, дрожжей, птицы (например, курицы), млекопитающего, не являющегося человеком, грызуна, человека, крысы, мыши, хомяка, кролика, свиньи, крупного рогатого скота, оленя, овцы, козы, кошки, собаки, хорька, примата (например, мартышки, макака-резус), одомашненного млекопитающего, сельскохозяйственного млекопитающего или любого другого представляющего интерес организма. В некоторых вариантах осуществления гомологические плечи соответствуют локусу клетки, который показывает ограниченную восприимчивость к нацеливанию с использованием обычного способа или который показывает относительно низкие уровни успешной интеграции в сайте-мишени и/или значительные уровни нецелевой интеграции в отсутствие одноцепочечного или двухцепочечного разрыва, вызванного нуклеазным агентом (например, белком Cas). В некоторых вариантах осуществления гомологические плечи предназначены для включения сконструированной ДНК.

[00223] В некоторых вариантах осуществления гомологические плечи 5’ и 3’ нацеленного вектора(-ов) соответствуют целевому геному. Альтернативно, гомологические плечи соответствуют связанному геному. Например, целевой геном представляет собой мышиный геном первой линии, а нацеленные плечи соответствуют мышиному геному второй линии, где первая линия и вторая линия различны. В некоторых вариантах осуществления гомологические плечи соответствуют геному одного животного или происходят от генома одной линии, например, целевой геном представляет собой мышиный геном первой линии, а целевые плечи соответствуют геному той же мыши или мыши той же линии.

[00224] Гомологическое плечо нацеленного вектора может иметь любую длину, достаточную для стимулирования события гомологичной рекомбинации с соответствующей последовательностью-мишенью, включая, например, 1-5 КБ включительно, 5-10 КБ включительно, 5-15 КБ включительно, 5-20 КБ включительно, 5-25 КБ включительно, 5-30 КБ включительно, 5-35 КБ включительно, 5-40 КБ включительно, 5-45 КБ включительно, 5-50 КБ включительно, 5-55 КБ включительно, 5-60 КБ включительно, 5-65 КБ включительно, 5-70 КБ включительно, 5-75 КБ включительно, 5-80 КБ включительно, 5-85 КБ включительно, 5-90 КБ включительно, 5-95 КБ включительно, 5-100 КБ, включительно, 100-200 КБ включительно или 200-300 КБ включительно в длину. В некоторых вариантах осуществления гомологическое плечо нацеленного вектора может иметь любую длину, достаточную для активирования события гомологичной рекомбинации с соответствующей последовательностью-мишенью, которая составляет 1-100 КБ включительно, 5-100 КБ включительно, 10-100 КБ включительно, 15-100 КБ включительно, 20-100 КБ включительно, 25-100 КБ включительно, 30-100 КБ включительно, 35-100 КБ включительно, 40-100 КБ включительно, 45-100 КБ включительно, 50-100 КБ включительно, 55-100 КБ, включительно, 60-100 КБ включительно, 65-100 КБ включительно, 70-100 КБ включительно, 75-100 КБ включительно, 80-100 КБ включительно, 85-100 КБ включительно, 90-100 КБ включительно или 95-100 КБ включительно в длину. Как описано в данном документе, большие нацеленные векторы могут использовать плечи нацеливания большей длины.

[00225] Нуклеазные агенты (например, системы CRISPR/Cas) можно использовать в комбинации с нацеленными векторами для облегчения модификации локуса-мишени (например, модификации локуса легкой цепи κ Ig или модификации ранее модифицированного или сконструированного локуса легкой цепи κ Ig). Такие нуклеазные агенты могут способствовать гомологичной рекомбинации между нацеленным вектором и локусом-мишенью. При использовании нуклеазных агентов в комбинации с нацеленным вектором, нацеленный вектор может содержать гомологические плечи 5’ и 3' , соответствующие 5'- и 3'-последовательностям-мишеням, расположенным в достаточной близости от сайта расщепления нуклеазой, чтобы способствовать возникновению события гомологичной рекомбинации между последовательностями-мишенями и гомологическими плечами в месте одноцепочечного или двухцепочечного разрыва на сайте расщепления нуклеазой. Термин «сайт расщепления нуклеазой» включает последовательность ДНК, в которой нуклеиновым агентом (например, сайтом расщепления Cas9) создается одноцепочечный или двухцепочечный разрыв. Последовательности-мишени в пределах локуса-мишени, которые соответствуют гомологическим плечам 5' и 3’ нацеленного вектора, считаются «расположенными в достаточной близости» от сайта расщепления нуклеазой, если расстояние таково, что оно способствует возникновению события гомологичной рекомбинации между 5' и 3’ последовательностями-мишенями и гомологическими плечами в месте одноцепочечного или двухцепочечного разрыва на сайте распознания. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления последовательности-мишени, соответствующие гомологическим плечам 5' и/или 3’ нацеленного вектора, находятся в пределах по меньшей мере одного нуклеотида данного сайта распознания или находятся в пределах по меньшей мере от 10 нуклеотидов до примерно 14 КБ от данного сайта распознания. В некоторых вариантах осуществления сайт расщепления нуклеазой находится непосредственно рядом по меньшей мере с одной или обеими последовательностями-мишенями.

[00226] Пространственные отношения последовательностей-мишеней, которые соответствуют гомологическим плечам нацеленного вектора и сайта расщепления нуклеазой, могут варьироваться. Например, последовательности-мишени могут быть расположены в направлении 5' от сайта расщепления нуклеазой, последовательности-мишени могут быть расположены в направлении 3' от сайта распознания, или последовательности-мишени могут фланкировать сайт расщепления нуклеазой.

[00227] Комбинированное использование нацеленного вектора (включая, например, большой нацеленный вектор) с нуклеазным агентом может привести к повышенной эффективности нацеленного воздействия по сравнению с использованием только нацеленного вектора. Например, когда нацеленный вектор используется в сочетании с нуклеазным агентом, эффективность нацеливания нацеленного вектора может быть увеличена по меньшей мере в два раза, по меньшей мере в три раза, по меньшей мере в четыре раза, по меньшей мере в пять раз, по меньшей мере в шесть раз, по меньшей мере в семь раз, по меньшей мере в восемь раз, по меньшей мере в девять раз, по меньшей мере в десять раз или в пределах диапазона, образованного из этих целых чисел, например в 2-10 раз по сравнению с использованием только вектора нацеливания.

[00228] Некоторые нацеленные векторы представляют собой «большие нацеленные векторы» или «LTVEC», которые включают нацеленные векторы, которые содержат гомологические плечи, которые соответствуют и получены из последовательностей нуклеиновых кислот, больших, чем те, которые обычно используются при других подходах, предназначенных для осуществления гомологичной рекомбинации в клетках. Длина LTVEC может составлять, например, по меньшей мере 10 КБ, или общая длина гомологического плеча 5’ гомологии и гомологического плеча 3’ может составлять, например, по меньшей мере 10 КБ. LTVEC также включают нацеленные векторы, содержащие конструкции нуклеиновых кислот, большие, чем те, которые обычно используются в других подходах, предназначенных для осуществления гомологичной рекомбинации в клетках. Например, LTVEC делают возможным модификацию больших локусов, которые не могут быть обеспечены традиционными нацеленными векторами на основе плазмиды из-за их ограничений по размеру. Например, целевой локус может представлять собой (т.е., гомологические плечи 5’ и 3’ могут соответствовать) локусу клетки, нацеливание на который обычным способом невозможно или нацеливание на который верным способом невозможно или возможно с крайне низкой эффективностью в отсутствие одноцепочечного или двухцепочечного разрыва, вызванного нуклеазным агентом (например, белком Cas).

[00229] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, используют два или три LTVEC, которые способны рекомбинировать друг с другом и с целевым геномным локусом в случае трех- или четырехсторонней рекомбинации. Такие методы позволяют модифицировать большие локусы, чего нельзя достичь с помощь одного LTVEC.

[00230] Примеры LTVEC включают векторы, полученные из бактериальной искусственной хромосомы (ВАС), искусственной хромосомы человека или дрожжевой искусственной хромосомы (YAC). Форма LTVEC может быть линейной или кольцевой. Примеры LTVEC и способы их изготовления описаны, например, в патентах США №6,586,251, 6,596,541 и №7,105,348; и публикации международной патентной заявки № WO 2002/036789, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте.

Предоставляются животные, не являющиеся человеком, а также их клетки и ткани

[00231] Предоставляются животные, не являющиеся людьми, которые экспрессируют (например, чьи В-клетки экспрессируют) антитела, содержащие легкие цепи, которые включают домен Vλ человека, полученный в результате интеграции генетического материала, который соответствует по меньшей мере части человеческого локуса легкой цепи λ Ig (то есть, по меньшей мере части сегментов гена Vλ и Jλ человека), и который кодирует домен Vλ человека (т.е. перестроенную последовательность Vλ-Jλ человека), в месте соответствующей последовательности вариабельной области легкой цепи κ Ig в геноме зародышевой линии животного, не являющегося человеком. Подходящие примеры, описанные в данном документе, включают, но не ограничиваются ими, грызунов, в частности, мышей.

[00232] Настоящее раскрытие обеспечивает улучшенные системы in vivo для идентификации и разработки новых антител, компонентов антител (например, антигенсвязывающих участков и/или композиций или форматов, которые их включают) и/или основанных на антителах терапевтических средств, которые можно использовать, например, при лечении различных заболеваний, поражающих человека. Кроме того, настоящее раскрытие также охватывает признание того, что животные, не являющиеся людьми (например, грызуны), имеющие сконструированные локусы иммуноглобулина, такие как сконструированный иммуноглобулин (Ig) каппа (локусы легкой цепи κ) и/или иным образом экспрессирующие, продуцирующие или содержащие спектры антител, характеризующиеся легкими цепями, имеющими V лямбда человека (применимы области λ). Например, в некоторых вариантах осуществления такие животные, не являющиеся человеком, могут использоваться для эксплуатации разнообразия человеческих последовательностей Vλ в идентификации и разработке новых терапий на основе антител. В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, описанные в данном документе, обеспечивают улучшенные системы in vivo для разработки антител и/или основанных на антителах лекарственных средств для введения людям. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе животные, не являющиеся человеком, обеспечивают улучшенные системы in vivo для разработки антител и/или основанных на антителах лекарственных средств, которые содержат домены Vλ человека, характеризующиеся улучшенной эффективностью (например, экспрессией и/или представлением в спектре антиген-специфических антител) по сравнению с антителами и/или терапевтическими средствами на основе антител, полученными из существующих систем in vivo, которые содержат последовательности областей Vλ человека.

[00233] Настоящее изобретение относится, помимо прочего, к животному, не являющемуся человеком, имеющему локус легкой цепи κ Ig, который содержит сконструированный ген вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина и сконструированный ген константной области легкой цепи иммуноглобулина. Как описано в данном документе, предоставленные животные, не являющиеся людьми, содержат в своем геноме зародышевой линии локус легкой цепи κ иммуноглобулина, включающий сконструированную вариабельную область легкой цепи κ иммуноглобулина, характеризующуюся наличием одного или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека, в котором один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с геном константной области легкой цепи λ иммуноглобулина (Сλ) ген, где ген константной области легкой цепи λ иммуноглобулина (Сλ) расположен на месте нечеловеческого гена константной области легкой цепи κ человека (Сκ) в эндогенном локусе к иммуноглобулина животного, не являющегося человеком. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат локус легкой цепи κ Ig, который содержит межгенную область ДНК, которая в соответствии с происхождением представляет собой легкую цепь λ иммуноглобулина и/или легкую цепь к иммуноглобулина и их комбинации.

[00234] Во многих вариантах сконструированная вариабельная область легкой цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина, расположенную или вставленную между указанным одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ, человека. В некоторых вариантах указанная последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина, расположенная или вставленная между указанным одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ, человека представляют собой или содержат мышиную (например, крысиную или мышиную) последовательность. В некоторых вариантах указанная последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина, расположенная или вставленная между указанным одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ, человека представляют собой или содержат последовательность человека. Например, в некоторых вариантах последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человека представляет собой или содержит геномную последовательность, которая естественным образом расположена между сегментом гена Vκ4-1 человека и сегментом гена Jκ1 локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

[00235] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, включают по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24 или по меньшей мере 25 функциональных сегментов гена Vλ человека. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, включают от 5 до 25, от 5 до 24, от 5 до 23, от 5 до 22, от 5 до 21, от 5 до 20, от 5 до 19, от 5 до 18, от 5 до 17, от 5 до 16, от 5 до 15, от 5 до 14, от 5 до 13, от 5 до 12, от 5 до 11, от 5 до 10, от 5 до 9, от 5 до 8, от 5 до 7 или от 5 до 6 функциональных сегментов гена Vλ человека. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, включают от 6 до 25, от 7 до 25, от 8 до 25, от 9 до 25, от 10 до 25, от 11 до 25, от 12 до 25, от 13 до 25, от 14 до 25, от 15 до 25, от 16 до 25,от 17 до 25, от 18 до 25, от 19 до 25, от 20 до 25, от 21 до 25, от 22 до 25, от 23 до 25 или от 24 до 25 функциональных сегментов гена Vλ человека. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, включают от 6 до 24, от 7 до 23, от 8 до 22, от 9 до 21, от 10 до 20, от 11 до 19, от 12 до 18, от 13 до 17, от 14 до 16 или от 15 до 16 функциональный сегментов гена Vλ человека. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, включают от 6 до 24, от 7 до 23, от 8 до 22, от 9 до 21, от 10 до 20, от 11 до 19, от 12 до 18, от 13 до 17 или от 14 до 16 функциональных сегментов гена Vλ человека.

[00236] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, включают всего от 10 до 70, от 10 до 65, от 10 до 60, от 10 до 55, от 10 до 50, от 10 до 45, от 10 до 40, от 10 до 35, от 10 до 30, от 10 до 25, от 10 до 20 или от 10 до 15 функциональных сегментов гена Vλ человека. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, включают всего от 15 до 70, от 20 до 70, от 25 до 70, от 30 до 70, от 35 до 70, от 40 до 70, от 45 до 70, от 50 до 70, от 55 до 70, от 60 до 70, или от 65 до 70 сегментов гена Vλ человека. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат всего от 15 до 65, от 20 до 60, от 25 до 55, от 20 до 50, от 25 до 45, от 30 до 40, от 30 до 35 или от 35 до 40 сегментов гена Vλ человека.

[00237] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат сегменты гена Vλ и/или Jλ человека в естественной или зародышевой конфигурации (например, последовательность ДНК, содержащая множество кодирующих последовательностей сегмента гена Vλ и/или Jλ человека с вкраплением некодирующих последовательностей легкой цепи λ иммуноглобулина человека). В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат сегменты гена Vλ и/или Jλ человека в конфигурации, которая отклоняется или отличается от естественной или зародышевой конфигурации (например, последовательность ДНК, содержащая множество кодирующих последовательностей сегмента гена Vλ и/или Jλ человека с вкраплением некодирующих последовательностей легкой цепи κ иммуноглобулина (например, человека или мыши)). В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат сегменты гена Vλ и/или Jλ человека в конфигурации, которая не появляется в локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека в геноме зародышевой линии клетки человека.

[00238] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат последовательность ДНК в не принадлежащем человеку эндогенном локусе легкой цепи κ Ig, которая включает множество кодирующих последовательностей Vλ и Jλ человека, которые содержат вкрапления (или сопоставляются, ассоциируются и т.д.) с некодирующей последовательностью легкой цепи иммуноглобулина человека (например, κ, λ и их комбинации). В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат последовательность ДНК в не принадлежащем человеку эндогенном локусе легкой цепи λ Ig, которая включает множество кодирующих последовательностей Vλ и Jλ человека, которые содержат вкрапления некодирующей последовательности легкой цепи λ иммуноглобулина, не принадлежащей человеку (например, мышиной).

[00239] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком характеризуются экспрессией антител из эндогенных локусов легкой цепи κ иммуноглобулина в геноме зародышевой линии животных, не являющихся человеком, антитела которых содержат (1) домены Vλ человека и (2) домены Сλ человека или не принадлежащие человеку. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, характеризуются улучшенным применением области Vλ человека из сконструированных локусов легкой цепи κ иммуноглобулина (например, но не ограничиваясь ими, примерно в 2 раза) по сравнению с одним или более контрольными сконструированными животными, не являющимися людьми.

[00240] В некоторых вариантах осуществления предоставлено животное, не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, чей геном зародышевой линии содержит эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий: (а) один или более сегментов гена Vλ человека, (b) один или более сегментов гена Jλ человека и (с) ген Сλ, где (а) и (b) функционально связаны с (с), и где у грызуна отсутствует ген Сκ грызуна в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина.

[00241] В некоторых вариантах осуществления предоставлено животное, не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, чей геном зародышевой линии содержит эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий вставку одного или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека и ген Сλ, данные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с указанным геном Сλ, и где ген Сλ вставлен на место гена Сκ, не принадлежащего человеку, в эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина. Во многих вариантах осуществления животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащая человеку, ген Сλ, вставленный на место гена Сκ, не принадлежащего человеку, в эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, представляет собой ген Сλ, человека или не принадлежащий человеку. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ, не принадлежащий человеку, представляет собой или содержит ген Сλ млекопитающего, выбранный из группы, состоящей гена Сλ, примата, козы, овцы, свиньи, собаки, коровы или грызуна.

[00242] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ, не принадлежащий человеку, представляет собой или содержит ген Сλ грызуна.

[00243] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ грызуна представляет собой или содержит ген Сλ мыши. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ мыши содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична гену Сλ мыши, выбранному из группы, состоящей из Сλ1 мыши, Сλ2 мыши и Сλ3 мыши. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ мыши содержит последовательность, которая по существу идентична или идентична гену Сλ мыши, выбранному из группы, состоящей из Сλ1 мыши, Сλ2 мыши и Сλ3 мыши. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ1 мыши представляет собой или содержит SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ2 мыши представляет собой или содержит SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ3 мыши представляет собой или содержит SEQ ID NO: 5. В некоторых определенных вариантах осуществления ген Сλ мыши содержит последовательность, идентичную мышиному гену Сλ1.

[00244] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ мыши содержит последовательность, которая на 80-100%, на 85-100%, на 90-100%, на 95-100% или на 98-100% идентична гену Сλ мыши, выбранному из группы, состоящей из Сλ1 мыши, Сλ2 мыши и Сλ3 мыши. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ мыши содержит последовательность, которая на 80-98%, на 80-95%, на 80-90% или на 80-85% идентична гену Сλ мыши, выбранному из группы, состоящей из Сλ1 мыши, Сλ2 мыши и Сλ3 мыши. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ мыши содержит последовательность, которая на 85-98%, на 90-95% или на 88-93% идентична гену Сλ мыши, выбранному из группы, состоящей из Сλ1 мыши, Сλ2 мыши и Сλ3 мыши.

[00245] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ грызуна представляет собой или содержит ген Сλ крысы. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ крысы содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична гену Сλ крысы, выбранному из группы, состоящей из гена Сλ1 крысы, Сλ2 крысы, Сλ3 крысы и Сλ4 крысы. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ крысы содержит последовательность, которая по существу идентична или идентична гену Сλ крысы, выбранному из группы, состоящей из гена Сλ1 крысы, Сλ2 крысы, Сλ3 крысы и Сλ4 крысы. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ1 крысы представляет собой или содержит SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ2 крысы представляет собой или содержит SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ3 крысы представляет собой или содержит SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ4 крысы представляет собой или содержит SEQ ID NO: 13.

[00246] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ крысы содержит последовательность, которая на 80-100%, 85-100%, 90-100%, 95-100%, или 98-100% идентична гену Сλ крысы, выбранному из группы, состоящей из гена Сλ1 крысы, Сλ2 крысы, Сλ3 крысы и Сλ4 крысы. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ крысы содержит последовательность, которая на 80-98%, 80-95%, 80-90% или 80-85% идентична гену Сλ, крысы, выбранному из группы, состоящей из гена Сλ1 крысы, Сλ2 крысы, Сλ3 крысы и Сλ4 крысы. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ крысы содержит последовательность, которая на 85-98%, 90-95% или 88-93% идентична гену Сλ, крысы, выбранному из группы, состоящей из гена Сλ1 крысы, Сλ2 крысы, Сλ3 крысы и Сλ4 крысы.

[00247] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ человека содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична гену Сλ человека, выбранному из группы, состоящей из гена Сλ1 человека, Сλ2 человека, Сλ3, человека, Сλ6 человека и Сλ7 человека. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ, человека содержит последовательность, которая по существу идентична или идентична гену Сλ человека, выбранному из группы, состоящей из гена Сλ человека, Сλ2 человека, Сλ3 человека, Сλ6 человека и Сλ7 человека. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ человека содержит последовательность, которая идентична гену Сλ человека, выбранному из группы, состоящей из гена Сλ1 человека, Сλ2 человека, Сλ3, человека, Сλ6 человека и Сλ7 человека. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ1 человека представляет собой или содержит SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ2 человека представляет собой или содержит SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ3 человека представляет собой или содержит SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ6 человека представляет собой или содержит SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ7 человека представляет собой или содержит SEQ ID NO: 23. В некоторых определенных вариантах осуществления ген Сλ человека представляет собой или содержит ген Сλ2 человека.

[00248] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ человека содержит последовательность, которая на 80-100%, 85-100%, 90-100%, 95-100%, или 98-100% идентична гену Сλ человека, выбранному из группы, состоящей из гена Сλ1 человека, Сλ2 человека, Сλ3, человека, Сλ6 человека и Сλ7 человека. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ человека содержит последовательность, которая на 80-98%, 80-95%, 80-90% или 80-85% идентична гену Сλ человека, выбранному из группы, состоящей из гена Сλ1 человека, Сλ2 человека, Сλ3, человека, Сλ6 человека и Сλ7 человека. В некоторых вариантах осуществления ген Сλ человека содержит последовательность, которая на 85-98%, 90-95% или 88-93% идентична гену Сλ человека, выбранному из группы, состоящей из гена Сλ1 человека, Сλ2 человека, Сλ3, человека, Сλ6 человека и Сλ7 человека.

[00249] В некоторых вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, вставка одного или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ, человека заменяют сегменты гена Vκ и Jκ, не принадлежащие человеку, в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления вставка включает некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена между сегментами гена Vλ и Jλ, человека, и их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, вставка одного или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ, человека находятся на месте или заменяют сегменты гена Vκ и Jκ, не принадлежащие человеку, в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает вставку по меньшей мере 24, по меньшей мере 34, по меньшей мере 52, по меньшей мере 61 или по меньшей мере 70 сегментов гена Vλ человека и по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 сегментов гена Jλ, человека. В некоторых вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает вставку 39 сегментов гена Vλ человека и 5 сегментов гена Jλ, человека. В некоторых вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает вставку Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 человека или любую их комбинацию, и J Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 человека или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления вставка включает некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 человека в эндогенном локусе легкой цепи κ человека и некодирующую ДНК человека (полностью или частично), которая естественным образом расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 человека в эндогенном локусе легкой цепи λ человека. В некоторых вариантах осуществления вставка включает некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 человека в эндогенном локусе легкой цепи λ человека и некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 человека в эндогенном локусе легкой цепи κ человека. В некоторых вариантах осуществления вставка Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Ук3-1 или любой их комбинации включает некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 человека в эндогенном локусе легкой цепи λ человека и вставку Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 человека или любой их комбинации включает некодирующую ДНК человека (полностью или частично) которая естественным образом расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 человека в эндогенном локусе легкой цепи λ человека. В некоторых вариантах осуществления вставка Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любой их комбинации включает некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 человека в эндогенном локусе легкой цепи λ человека и вставку Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 человека или любой их комбинации включает некодирующую ДНК человека (полностью или частично) которая естественным образом расположена рядом с JκI, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 человека в эндогенном локусе легкой цепи κ человека.

[00250] В некоторых вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в настоящем документе, дополнительно содержит последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человека между одним или более сегментами гена Vλ человека, одним или более сегментами гена Jλ человека, одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ человека, и их комбинацию. В некоторых вариантах последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человек в соответствии с описанным в данном документе представляет собой или содержит геномную последовательность, которая естественным образом расположена между сегментом гена Vκ4-1 человека и сегментом гена Jκ1 локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

[00251] В некоторых вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, геном зародышевой линии указанного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, дополнительно содержит эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий вставку одного или более сегментов гена VH человека, одного или более сегментов гена DH человека и одного или более сегментов гена JH человека, причем эти сегменты гена VH, DH и JH человека функционально связаны с константной областью тяжелой цепи нечеловеческого иммуноглобулина в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (см., например, патенты США №№8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 и 8,791,323, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте).

[00252] В некоторых вариантах осуществления вставка одного или более сегментов гена VH человека, одного или более сегментов гена DH человека и одного или более сегментов гена JH человека расположена на месте или заменяет, полностью или частично, сегменты гена VH, DH и JH, не принадлежащие человеку (например, позиционно заменяют или заменяют кодирующие последовательности сегментов гена VH, DH и JH, не принадлежащих человеку, кодирующими последовательностями генных сегментов VH, DH и JH человека). В некоторых определенных вариантах осуществления вставка включает некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена между сегментами гена VH, DH и JH человека, и их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащая человеку, представляет собой константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащую человеку. Во многих вариантах осуществления константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащая человеку (например, эндогенная), включает один или более генов или сегментов гена константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащей человеку (например, IgM, IgD, IgG, IgE, IgA и т.д.). В некоторых вариантах осуществления локус тяжелой цепи иммуноглобулина в соответствии с описанным в данном документе содержит вставку сегментов гена VH человека: VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1 или любой их комбинации, сегментов гена DH: DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27 или любой их комбинации, сегментов гена JH: JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 или любой их комбинации. В некоторых определенных вариантах осуществления вставка включает некодирующую ДНК человека, которая естественным образом находится рядом с VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 или VH6-1, в эндогенном локусе тяжелой цепи; некодирующую ДНК человека, которая естественным образом находится рядом с DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 или DH7-27 человека и некодирующую ДНК человека, которая естественным образом находится рядом с JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 или JH в эндогенном локусе тяжелой цепи.

[00253] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, описанное в данном документе, включает в своем геноме (например, геноме зародышевой линии) ген Adam6, который кодирует полипептид ADAM6, его функциональный ортолог, функциональный гомолог его функциональный фрагмент (см., например, патенты США №8,642,835 и 8,697,940, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте). В некоторых вариантах осуществления полипептид ADAM6, функциональный ортолог, функциональный гомолог или его функциональный фрагмент экспрессируется из гена Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 не происходит от животного, не являющегося человеком, которое включает ген Adam6 (например, мышь, которая включает ген Adam6 крысы или ген Adam6 мыши, полученный из другого штамма мыши). В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, описанное в данном документе, включает эктопический ген Adam6. Термин «эктопический» ген Adam6 при использовании в данном документе относится к гену Adam6, который находится в ином контексте по сравнению с геном Adam6, встречающимся у животного дикого типа не являющегося человеком. Например, ген Adam6 может быть расположен в другой хромосоме, расположен в другом локусе или расположен рядом с иными последовательностями. Типичным эктопическим геном Adam6 является ген Adam6 мыши, расположенный внутри последовательностей иммуноглобулина человека (например, сегментов гена вариабельной области тяжелой цепи человека). В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, описанное в данном документе, включает встроенный или интегрированный ген Adam6.

[00254] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, описанное в данном документе, включает в своем геноме (например, геноме зародышевой линии) вставку одной или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов Adam6, не принадлежащих человеку, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов.

[00255] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, описанное в данном документе, включает одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов в своем геноме (например, геном зародышевой линии). В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, описанное в данном документе, включает в своем геноме ген Adam6a мыши и/или ген Adam6b мыши (например, геном зародышевой линии). В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, описанное в данном документе, включает одну или более нуклеотидных последовательностей ADAM6a мыши, функционального ортолога, функционального гомолога или его функционального фрагмента и/или ADAM6b мыши, функционального ортолога, функционального гомолога или его функционального фрагмента.

[00256] В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в той же хромосоме, что и эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в таком положении, что одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или больше полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов контактируют с сегментами гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в таком положении, что одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или больше полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов расположены рядом с сегментами гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в таком положении, что одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих одну или больше нечеловеческих полипептидов ADAM6, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов расположены между сегментами гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления ода или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены между первым и вторым сегментом гена VH человека. В некоторых вариантах осуществления первый сегмент гена VH человека представляет собой VH1-2 человека, и второй сегмент гена VH человека представляет собой VH6-1 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены на месте псевдогена Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, вставлены между сегментом гена VH человека и сегментом гена DH человека.

[00257] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, описанное в данном документе, включает ген Adam6, который восстанавливает или усиливает активность ADAM6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 восстанавливает активность ADAM6 до уровня, сопоставимого с уровнем животного, не являющегося человеком, которое включает функциональный эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 повышает активность ADAM6 до уровня, который по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз или, по меньшей мере в 10 раз по сравнению с активностью ADAM6 сопоставимого животного, не являющегося человеком, которое не включает функциональный ген Adam6.

[00258] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, описанное в данном документе, включает ген Adam6, который восстанавливает или усиливает фертильность у животного мужского пола, не являющегося человеком. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 восстанавливает фертильность у животного, не являющегося человеком, до уровня, сопоставимого с уровнем животного, не являющегося человеком, которое включает функциональный эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 восстанавливает фертильность у самца животного, не являющегося человеком, так что количество потомства, полученных в результате спаривания самца животного, не являющегося человеком, составляет по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% количество потомства, произведенного в результате сопоставимого спаривания сопоставимого животного, отличного от человека, у которого нет функционального гена Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 повышает фертильность у самца, не являющегося человеком, так что количество потомства, полученного в результате спаривания самца, не являющегося человеком, включает превышение по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз или по меньшей мере в 10 раз количества потомства, произведенного в результате сопоставимого спаривания сопоставимого животного, отличного от человека, которое не включает функциональный ген Adam6.

[00259] В некоторых вариантах осуществления локус тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку в соответствии с описанием в настоящем документе, не имеет по меньшей мере одного эндогенного гена Adam6, не принадлежащего человеку. В некоторых вариантах осуществления отсутствие по меньшей мере одного эндогенного гена Adam6, не принадлежащего человеку, снижает активность ADAM6 и/или фертильность у мышей-самцов, у которых отсутствует эндогенный ген Adam6, не принадлежащий человеку. В некоторых вариантах осуществления локус тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку в соответствии с описанием в настоящем документе, включает нарушение по меньшей мере одного эндогенного гена Adam6, не принадлежащего человеку. В некоторых вариантах осуществления нарушение по меньшей мере одного эндогенного гена Adam6, не принадлежащего человеку, снижает активность ADAM6 и/или фертильность у мышей-самцов, у которых отсутствует эндогенный ген Adam6, не принадлежащий человеку.

[00260] В некоторых вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, животное не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку являются гомозиготным или гетерозиготным по эндогенному локусу тяжелой цепи иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе.

[00261] В некоторых вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, животное не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку являются гомозиготным или гетерозиготным по эндогенному локусу легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе.

[00262] В некоторых вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина удаляется полностью или частично. В некоторых вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина функционально подавляется или иным образом не функционирует (например, путем направленного воздействия на гены). В некоторых определенных вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, животное не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку являются гомозиготным или гетерозиготным в отношении функционально подавленного или иным способом лишенного функциональности эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе.

[00263] В некоторых определенных вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, в соответствии с описанием в настоящем документе, не показывают обнаруживаемой экспрессии легких цепей λ эндогенного иммуноглобулина, легких цепей κ эндогенного иммуноглобулина или легких цепей λ эндогенного иммуноглобулина и легких цепей κ эндогенного иммуноглобулина.

[00264] В некоторых вариантах осуществления животное не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, имеет геном, дополнительно содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции.

[00265] В некоторых вариантах осуществления элемент контроля транскрипции включает элемент контроля транскрипции RAG1, элемент контроля транскрипции RAG2, элемент контроля транскрипции тяжелой цепи иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи κ иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи λ иммуноглобулина или любую их комбинацию.

[00266] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая экзогенный TdT, расположена в локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, локусе легкой цепи λ иммуноглобулина, локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, локусе RAG1 или локусе RAG2.

[00267] В некоторых вариантах осуществления TdT представляет собой TdT человека. В некоторых вариантах осуществления TdT представляет собой короткую изоформу TdT (TdTS).

[00268] Последовательность легкой цепи λ Ig человека в некоторых вариантах осуществления содержит генетический материал, представляющий собой (например, выделенный или полученный из) или идентичный локусу легкой цепи λ Ig человека, где последовательность легкой цепи λ Ig человека кодирует легкую цепь Ig, которая содержит кодированную часть генетического материала из локуса легкой цепи λ Ig человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека в соответствии с описанием в данном документе, содержит по меньшей мере один сегмент гена Vλ человека и по меньшей мере один сегмент гена Jλ человека, и одну или более последовательностей, необходимых для стимуляции перегруппировки (например, сигнальной последовательности рекомбинации) указанных по меньшей мере одного сегмент гена Vλ человека с указанным по меньшей мере одним сегментом гена Jλ человека с образованием функционально перестроенной последовательности Vλ-Jλ человека, которая кодирует домен Vλ человека. Во многих вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека содержит множество сегментов гена Vλ и Jλ человека и одну или более последовательностей, необходимых для ускорения перегруппировки указанных сегментов гена Vλ человека с указанными сегментами гена Jλ человека. Во многих вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека содержит по меньшей мере кодирующие последовательности (например, экзоны) одного или более сегментов гена Vλ человека и по меньшей мере кодирующие последовательности (например, экзоны) одного или более сегментов гена Jλ человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека в соответствии с описанием в данном документе, представляет собой геномную последовательность локуса легкой цепи λ Ig человека (например, выделенную и/или клонированную из бактериальной искусственной хромосомы) и содержит множество сегментов гена Vλ человека в конфигурации зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека содержит последовательности Vλ и Jλ человека (т.е. сегменты гена) в конфигурации зародышевой линии (то есть, множество сегментов гена Vλ человека, разделенных промежуточной ДНК, которая включает последовательности, необходимые для и способствующие рекомбинации, и множество сегментов гена Jλ, разделенных промежуточной ДНК, которая включает последовательности, необходимые для и способствующие рекомбинации)..

[00269] В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека в соответствии с описанием в данном документе представляет собой сконструированную последовательность и содержит множество сегментов гена Jλ человека в конфигурации, которая отличается от конфигурации, которая появляется в локусе легкой цепи λ Ig человека в клетке человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека в соответствии с описанием в данном документе представляет собой сконструированную последовательность и содержит множество сегментов гена Vλ и Jλ человека в конфигурации, которая напоминает или аналогична той, которая появляется в локусе легкой цепи κ Ig клетки дикого типа мыши или человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека содержит сконструированные последовательности Jλ человека (то есть, кодирующие последовательности сегментов гена Jλ человека, полученные синтезом ДНК de novo, которые включают последовательности, необходимые для и способствующие рекомбинации с одним или более сегментами гена Vλ человека). В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека содержит последовательности Igκ и Igλ, которые естественным образом появляются в геномных последовательностях Igκ и Igλ соответственно. В некоторых определенных вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека содержит последовательности Igκ, в частности, область Jκ (то есть, последовательность, которая содержит кодирующую и некодирующую последовательности, которые появляются в области, содержащей множество сегментов гена Jκ), который естественным образом расположен в локусе легкой цепи κ Ig, за исключением того, что указанная последовательность Igκ содержит кодирующие последовательности сегментов гена Jλ и Jλ 12RSS на месте соответствующих кодирующих последовательностей сегментов гена Jκ и Jκ 23RSS соответственно. В некоторых определенных вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека содержит множество сегментов гена Jλ и Jλ 12RSS на месте сегментов гена Jκ и Jκ 23RSS последовательности области Jκ. В различных вариантах осуществления промежуточная (или межгенная) ДНК, которая включает последовательности, необходимые для и способствующие рекомбинации, включает геномные последовательности Igκ человека и/или Igλ человека. Альтернативно и в некоторых вариантах осуществления промежуточная (или межгенная) ДНК, которая включает последовательности, необходимые для и способствующие рекомбинации, включает геномные последовательности Igκ мыши и/или Igλ мыши.

[00270] В некоторых определенных вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека представляет собой или содержит последовательность, которая показана на чертеже. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека кодирует или способна кодировать (например, после перегруппировки сегментов гена человека) полипептид домена Vλ, причем этот полипептид домена Vλ присутствует в иммуноглобулине, в частности, в иммуноглобулине, который экспрессируется человеческой В-клеткой. Также предоставлены животные, не являющиеся человеком, эмбрионы и клетки, не принадлежащие человеку, и нацеленные конструкции для получения животных, не являющихся человеком, эмбрионов, не являющихся человеком, и клетки, содержащие указанную последовательность легкой цепи λ Ig человека на месте соответствующей последовательности легкой цепи κ Ig человека (например, эндогенной локус легкой цепи κ Ig грызунов).

[00271] В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека вставляют на место соответствующей последовательности легкой цепи κ Ig человек в геном зародышевой линии животного, не являющегося человеком. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека вставляют по ходу транскрипции перед последовательностью легкой цепи λ Ig, не принадлежащей человеку (например, последовательностью гена константной области легкой цепи λ Ig человека), причем данная последовательность легкой цепи λ Ig, не принадлежащая человеку, расположена на месте последовательности легкой цепи κ Ig не принадлежащей человеку (например, последовательности гена константной области легкой цепи κ Ig человека). В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи κ Ig человека вставляют в середине указанной последовательности легкой цепи λ Ig человека (то есть между сегментами гена Vλ и Jλ человека), так что указанная последовательность легкой цепи κ Ig человека сопоставляется с последовательностями легкой цепи λ Ig человека.

[00272] В некоторых вариантах осуществления все или по существу все вариабельные области локуса легкой цепи κ Ig, не принадлежащие человеку, заменены или замещены одной или более последовательностями легкой цепи λ Ig человека (в соответствии с описанием в данном документе) и указанные одна или более последовательностей легкой цепи λ Ig человека функционально связаны с геном константной области легкой цепи λ Ig человека или не принадлежащим человеку. В некоторых вариантах осуществления ген константной области легкой цепи κ Ig, не принадлежащий человеку, удален или заменен у животного, не являющегося человеком, которое включает последовательность легкой цепи λ Ig человека в соответствии с описанием в данном документе. В одном неограничивающем примере в случае вставки последовательности легкой цепи λ Ig, не принадлежащей человеку, которая вставлена в локус легкой цепи κ Ig человека, указанная вставка выполняется таким образом, чтобы поддерживать целостность энхансерных областей (или энхансерных последовательностей) легкой цепи κ Ig, не принадлежащей человеку, вблизи точки вставки (например, интронного энхансера Igκ, не принадлежащего человеку, и/или 3' энхансера Igκ, не принадлежащего человеку). Таким образом, такие животные, не являющиеся человеком, имеют энхансерные области (или энхансерные последовательности) легкой цепи κ Ig дикого типа, функционально связанные с последовательностями легкой цепи λ Ig человека и не принадлежащими человеку (например, сегментами гена Vλ и Jλ человека и областью гена Сλ, не принадлежащей человеку) или функционально связаны с последовательностями легкой цепи λ Ig человека (например, с сегментами гена Vλ и Jλ человека и областью гена Сλ человека). В некоторых вариантах осуществления локус легкой цепи κ Ig, не принадлежащий человеку, который изменен, смещен, нарушен, удален, заменен или сконструирован с помощью одной или более последовательностей легкой цепи λ Ig человека в соответствии с описанием в данном документе, представляет собой локус легкой цепи κ Ig мыши. В некоторых вариантах осуществления одну или более последовательностей легкой цепи λ Ig человека в соответствии с описанием в данном документе вставляют в одну копию (т.е. аллель) локуса легкой цепи κ Ig, не принадлежащего человеку, из от двух копий указанного локуса легкой цепи κ Ig человека, что приводит к получению животного, не являющемуся человеком, которое гетерозиготно по последовательности легкой цепи κ Ig человека. В некоторых вариантах осуществления животного, не являющегося человеком, которое гетерозиготно по последовательности легкой цепи κ Ig человека, животное, не являющееся человеком, включает одну или более последовательностей легкой цепи κ Ig человека, вставленных в другую копию (т.е., аллель) локуса легкой цепи κ Ig, не принадлежащего человеку. В некоторых вариантах осуществления предоставлено животное, не являющееся человеком, которое гомозиготно по локусу легкой цепи κ Ig, которое включает одну или более последовательностей легкой цепи λ Ig человека в соответствии с описанием в данном документе.

[00273] В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус легкой цепи κ Ig, не принадлежащего человеку, в соответствии с описанным в данном документе, содержит сегменты гена Vλ и Jλ человека, функционально связанные с геном константной области легкой цепи λ Ig человека или не принадлежащего человеку, где указанный ген константной области легкой цепи λ Ig человека или не принадлежащего человеку расположен на месте гена константной области легкой цепи κ Ig, не принадлежащего человеку, который появляется в локусе легкой цепи κ Ig дикого типа у животного, не являющегося человеком, того же вида.

[00274] В некоторых вариантах осуществления одна или более эндогенных последовательностей (или их частей) легкой цепи λ Ig, не принадлежащего человеку, эндогенного локуса легкой цепи λ Ig, не принадлежащего человеку, не удаляются. В некоторых вариантах осуществления одна или более эндогенных последовательностей (или их частей) легкой цепи λ Ig, не принадлежащего человеку, эндогенного локуса легкой цепи λ Ig, не принадлежащего человеку, удаляются. В некоторых вариантах осуществления одна или более эндогенных последовательностей легких цепей λ Ig, не принадлежащего человеку, (например, V, J и/или С или любая их комбинация) эндогенного локуса легкой цепи λ Ig, не принадлежащего человеку, изменены, смещены, нарушены, удалены или заменены таким образом, что указанный локус легкой цепи λ Ig, не принадлежащего человеку, функционально подавлен. В некоторых вариантах осуществления одна или более эндогенных последовательностей легких цепей λ Ig, не принадлежащего человеку, (например, V, J и/или С или любая их комбинация) эндогенного локуса легкой цепи λ Ig, не принадлежащего человеку, изменены, смещены, нарушены, удалены или заменены нацеленным вектором таким образом, что указанный локус легкой цепи λ Ig, не принадлежащего человеку, функционально инактивирован (т.е. неспособен вырабатывать функциональную легкую цепь антитела, которое экспрессируется и/или обнаруживается в спектре антител животного, не являющегося человеком). Руководство по инактивации эндогенного локуса легкой цепи λ Ig, не принадлежащего человеку, приведено, например, в патенте США №9,006,511 (см., например, фиг. 2), который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.

[00275] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, содержит сконструированный локус легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе, который произвольно интегрирован в его геном (например, как часть произвольно интегрированной последовательности легкой цепи λ Ig человека). Таким образом, такие животные, не являющиеся человеком могут быть описаны как имеющие трансген легкой цепи λ Ig человека, содержащий множество сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанных с геном константной области легкой цепи λ Ig человека или не принадлежащего человеку и энхансерными областями (или энхансерными последовательностями) легкой цепи κ Ig человека или не принадлежащего человеку, таким образом, что указанные сегменты гена Vλ и Jλ человека способны перегруппировываться и кодировать легкую цепь Ig антитела в экспрессированном спектре животного, не являющегося человеком, причем легкая цепь Ig включает домен Vλ человека и домен Сλ, не принадлежащий человеку, или где легкая цепь Ig включает домены Vλ и Сλ человека. Сконструированный локус или трансген легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе может быть обнаружен с использованием различных методов, включая, например, ПЦР, вестерн-блот, саузерн-блот, полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP) или анализ на аллель на предмет увеличения или потери. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе гетерозиготно по сконструированному локусу легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе является гемизиготно по сконструированному локусу легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, содержит одну или более копий сконструированного локуса или трансгена легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, содержит локус легкой цепи κ Ig, как изображено на чертеже.

[00276] В настоящем раскрытии признается, что животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, будет использовать сегменты гена вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи λ и легкой цепи κ, включенные в его геном, в механизмах отбора и генерации антител (например, рекомбинации и соматической гипермутации). По существу, в различных вариантах осуществления вариабельные домены тяжелой цепи, легкой цепи λ и легкой цепи κ человеческого иммуноглобулина, генерируемые животными, не являющимися человеком, описанными в данном документе, кодируются сегментами гена вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи λ и легкой цепи κ человека, включенными в их геном, или их соматически гипермутированными вариантами соответственно.

[00277] В некоторых вариантах осуществления предоставлено животное, не являющееся человеком, чей геном содержит сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, где животное, не являющееся человеком, включает В-клетку, которая включает последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ человека, которая является соматически гипермутированной. В некоторых вариантах осуществления последовательность вариабельной области тяжелой области человека, легкую цепь λ человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ человека, присутствующая в В-клетке мыши по данному раскрытию, имеет 1, 2, 3, 4, 5 или более соматических гипермутаций. Специалистам в данной области известны способы идентификации сегментов исходного гена в последовательности зрелого антитела. Например, для помощи в этом анализе доступны различные инструменты, такие как, например, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA и Ab-origin.

[00278] Настоящее раскрытие предоставляет, среди прочего, клетки и ткани животных, не являющихся человеком, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предоставлены спленоциты (и/или другая лимфоидная ткань) животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предоставлена В-клетка животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предоставлена про-В-клетка животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предоставлена пре-В клетка животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предоставлена незрелая В-клетка животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предоставлена зрелая наивная В-клетка животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предоставлена активированная В-клетка животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предоставлена В-клетка памяти животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах представлен лимфоцит линии В животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предоставлена плазма или клетка плазмы животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предоставлена стволовая клетка животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку. В некоторых вариантах осуществления предоставлена зародышевая клетка животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления половая клетка представляет собой ооцит. В некоторых вариантах осуществления половая клетка представляет собой сперматозоид. В некоторых вариантах осуществления сперматозоид животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, экспрессирует один или более полипептидов ADAM6, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления любая клетка или ткань животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, может быть выделена. В некоторых вариантах осуществления предоставлена выделенная клетка и/или выделенная ткань животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предоставляется гибридома, в которой гибридома изготовлена с использованием В-клетки животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления гибридома состоит из В-клетки животного, не являющегося человеком, которая была иммунизирована представляющим интерес антигеном. В некоторых вариантах осуществления гибридома создается с использованием В-клетки животного, не являющегося человеком, которая экспрессирует антитело, которое связывается (например, специфически связывается) с эпитопом на представляющем интерес антигене.

[00279] Любое из животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, может быть иммунизировано одним или более исследуемыми антигенами в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы животное, не являющееся человеком, развило иммунный ответ на указанные один или более представляющих интерес антигенов. Специалистам в данной области известны способы иммунизации животных, не являющихся людьми. Примерный неограничивающий способ иммунизации животных, не являющихся людьми, можно найти в патенте США №2007/0280945 А1, полностью включенном в данный документ посредством ссылки.

[00280] Настоящее раскрытие предоставляет, среди прочего, иммунизированных животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, а также выделенные из них клетки и ткани. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, описанное в данном документе, вырабатывает популяцию В-клеток в ответ на иммунизацию антигеном, который включает один или более эпитопов. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, вырабатывает популяцию В-клеток, которые экспрессируют антитела, которые связываются (например, специфически связываются) с одним или более эпитопами интересующего антигена. В некоторых вариантах осуществления антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток, вырабатываемых в ответ на антиген, включают тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, и/или легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток в ответ на антиген, включают (i) тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, (ii) легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе (iii) легкую цепь каппа, имеющую вариабельный домен легкой цепи каппа человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи каппа человека в соответствии с описанием в данном документе, или (iv) любую их комбинацию.

[00281] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, вырабатывает популяцию В-клеток, которые экспрессируют антитела, которые связываются с одним или более эпитопами представляющего интерес антигена, где антитела, экспрессируемые популяцией В-клеток, продуцируемых в ответ на антиген, включают: (i) тяжелую цепь, имеющую вариабельный домен тяжелой цепи человека, кодируемый последовательностью вариабельной области тяжелой цепи человека, (ii) легкую цепь лямбда, имеющую вариабельный домен легкой цепи лямбда человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда человека в соответствии с описанием в данном документе (iii) легкую цепь каппа, имеющую вариабельный домен легкой цепи каппа человека, кодируемый последовательностью вариабельной области легкой цепи каппа человека в соответствии с описанием в данном документе, или (iv) любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ человека в соответствии с описанием в данном документе, является соматически гипермутированной. В некоторых вариантах по меньшей мере около 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% В-клеток в популяции В-клеток, вырабатываемых в ответ на антиген, включают последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ человека, которые соматически гипермутированы.

[00282] В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, представленные в настоящем документе, в своем геноме зародышевой линии (1) включают сконструированный локус легкой цепи κ эндогенного иммуноглобулина, содержащий (а) один или более сегментов гена Vλ человека, (b) один или более сегментов гена Jλ человека, и (с) ген Сλ, где один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с геном Сλ, (2) отсутствует ген Сκ грызуна в сконструированном эндогенном локусе иммуноглобулина κ, и (3) включают сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий (а) один или более сегментов гена Vκ человека, (б) один или более сегментов гена Jκ человека и (в) ген Сκ, где один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ человека функционально связаны с геном Сκ. В некоторых вариантах осуществления процент легких цепей в спленоцитах (например, как обнаружено или наблюдается, например, с помощью проточной цитометрии (см., например, пример 3)) у таких животных, не являющихся человеком, которые являются легкими цепями λ, составляет по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 75%. В некоторых вариантах осуществления процентное содержание легких цепей в спленоцитах (например, как обнаружено или наблюдается, например, с помощью проточной цитометрии (см., например, пример 3)) у таких животных, не являющихся людьми, которые представляют собой легкие цепи λ, находится между 35-80%. между 35-75%, между 40-80%, между 40-75%, между 50-80%, между 50-75%, между 55-80%, между 55-75%, между 60-80% или между 60-75%. В некоторых вариантах осуществления процент легких цепей в спленоцитах (например, как обнаружено или наблюдается, например, с помощью проточной цитометрии (см., например, пример 3)) таких животных, не являющихся человеком, которые представляют собой легкие цепи κ, составляют не более 65%, не более 60%, не более 55%, не более 50%, не более 45%, не более 40% и не более 35%. В некоторых вариантах осуществления процент легких цепей в спленоцитах (например, как обнаружено или наблюдается, например, с помощью проточной цитометрии (см., например, пример 3)) таких животных, не являющихся человеком, которые представляют собой легкие цепи κ, находится между 20-65%, между 25-65%, между 20-60%, между 25-60%, между 20-55%, между 25-55%, между 20-50%, между 25-50% между 20-45%, между 25-45%, между 20-40% или между 25-40%. В некоторых вариантах осуществления соотношение легких цепей κ:λ в спленоцитах (например, как обнаружено или выявлено, например, с помощью проточной цитометрии (см., например, пример 3)) таких животных, не являющихся человеком, составляет от 0,5:1 до 3:1, от 0,65:1 до 3:1, от 0,8:1 до 3:1, от 1:1 до 3:1, от 1,2:1 до 3:1, от 1:1 до 2,3:1, от 1,1:1 до 1,8:1, от 1,2:1 до 2,3:1 или от 1,2:1 до 1,8:1.

Способы получения предоставленных животных, не являющихся человеком

[00283] Композиции и способы получения животных, не являющихся человеком, чей геном зародышевой линии содержит сконструированный локус легкой цепи κ Ig, который включает одну или более последовательностей легкой цепи λ Ig человека (например, сегменты гена Vλ и Jλ человека) на месте последовательностей легкой цепи κ Ig, не принадлежащей человеку, включая последовательности, кодирующие легкую цепь λ Ig человека, которые включают специфические полиморфные формы сегментов Vλ и Jλ человека (например, специфические аллели или варианты V и/или J), включая композиции и способы получения животных, не являющихся человеком, которые экспрессируют антитела, содержащие легкие цепи λ Ig, которые содержат вариабельные области человека, и константные области человека или не принадлежащие человеку, взятые из локуса легкой цепи κ Ig, который содержит сегменты гена Vλ и Jλ человека, функционально связанные геном константной области легкой цепи λ Ig человека или не принадлежащего человеку, где ген константной области легкой цепи λIg человека или не принадлежащего человеку расположен на месте гена константной области легкой цепи κ Ig, не принадлежащего человеку, который обычно проявляется в локусе легкой цепи κ Ig, не принадлежащего человеку, дикого типа. В некоторых вариантах осуществления также предоставляются композиции и способы получения животных, не являющихся человеком, которые экспрессируют такие антитела под контролем эндогенного энхансера Ig κ и/или эндогенной регуляторной последовательности Ig κ. В некоторых вариантах осуществления также предоставляются композиции и способы получения животных, не являющихся человеком, которые экспрессируют такие антитела под контролем гетерологичного энхансера Ig κ и/или гетерологичной регуляторной последовательности Ig κ.

[00284] Способы, описанные в данном документе, включают в себя вставку последовательностей Vλ и Jλ человека, кодирующих домены Vλ человека, расположенные против хода транскрипции относительно гена константной области легкой цепи λ Ig человека или не принадлежащего человеку (например, гена области Сλ мыши или человека), где ген константной области легкой цепи λ Ig человека или не принадлежащего человеку, расположен на месте гена константной области легкой цепи κ Ig, не принадлежащего человеку, который обычно расположен в локусе легкой цепи κ Ig, не принадлежащего человеку, дикого типа таким образом, что экспрессируется антитело, антитело характеризуется наличием легкой цепи, которая содержит домен Vλ человека и домен Сλ, не принадлежащий человеку (например, домен Сλ грызуна), или наличием легкой цепи, которая содержит домены Vλ человека и Сλ, не принадлежащие человеку (например, один или более доменов Сλ грызунов), и экспрессируется как на поверхности В-клеток, так и в сыворотке крови животного, не являющегося человеком.

[00285] В некоторых вариантах осуществления способы включают вставку генетического материала, который содержит сегменты гена Vλ и Jλ человека в локусе легкой цепи κ Ig (например, модифицированный или сконструированный локус легкой цепи κ Ig дикого типа). В некоторых определенных вариантах осуществления способы включают вставку генетического материала, который содержит сегменты гена Jλ человека в локусе легкой цепи κ Ig модифицированной или сконструированной линии. В некоторых вариантах осуществления генетический материал, который содержит последовательности легкой цепи λ Ig человека, может быть сконструирован или получен из геномной библиотеки (например, клонированы из бактериальной искусственной хромосомы). В некоторых вариантах осуществления генетический материал, который содержит последовательности легкой цепи λ Ig человека, может быть сконструирован из опубликованных источников и/или бактериальных искусственных хромосом таким образом, что указанный генетический материал содержит сегменты Vλ и Jλ человека в ориентации, которая отличается от той, что появляется в человеческом локусе легкой цепи λ Ig, однако указанный генетический материал все еще содержит последовательности для поддержки перегруппировки указанных сегментов Vλ и Jλ человека для кодирования функционального домена Vλ человека легкой цепи Ig. В качестве одного из примеров, генетический материал, соответствующий множеству сегментов гена Vλ и Jλ человека, может быть сконструирован с использованием представленного в данном документе руководства по конструированию последовательности легкой цепи λIg человека, которая содержит сегменты Vλ и Jλ человека в порядке и/или расположении, которое отличается от того, который появляется в локусе легкой цепи λ Ig человека в клетке человека (например, расположение, которое напоминает или сходно с локусом легкой цепи κ Ig человека или грызуна, такое как серия сегментов гена V, с последующим введением ДНК в сторону 3'-конца и с последующей серией сегментов гена J в сторону 3'-конца). В таком примере генетическое содержание сегментов гена Vλ и J λ человека будут эквивалентны соответствующим сегментам в клетке человека, однако порядок и расположение будут другими. При конструировании сконструированного локуса легкой цепи κ Ig для генерации животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в данном документе, необходимые сигнальные последовательности рекомбинации могут быть сконфигурированы так, чтобы сегменты гена V и J человека могли правильно перестраиваться и образовывать функциональный домен Vλ человека. Руководство по конфигурации зародышевой линии сегментов гена Vλ и Jλ человека и последовательностей, необходимых для надлежащей рекомбинации, можно найти в Molecular Biology of В Cells, London: Elsevier Academic Press, 2004, Ed. Honjo, Т., Alt, F.W., Neuberger, M. Chapters 4 (pp. 37-59) and 5 (61-82); включенные в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

[00286] В некоторых вариантах осуществления способы включают множественные вставки в один клон клетки ES. В некоторых вариантах осуществления способы включают последовательные вставки, сделанные в последовательных клонах клеток ES. В некоторых вариантах осуществления способы включают одну вставку, сделанную в сконструированный клон клеток ES.

[00287] В некоторых вариантах осуществления способы включают вставку ДНК перед геном Сλ1 мыши (или геном Сλ2 человека), таким образом, что указанная вставка ДНК функционально связана с указанным геном Сλ1 мыши (или геном Сλ2 человека), причем эта вставка ДНК содержат сегменты гена Vλ человека Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию, и сегменты гена Jλ человека Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию, и данный ген Сλ1 мыши (или ген Сλ2 человека) расположен на месте гена Сκ мыши в эндогенном локусе легкой цепи κ Ig.

[00288] В некоторых вариантах осуществления способы включают вставку ДНК далее по ходу транскрипции от сегмента гена Vλ3-1 человека и ранее по ходу транскрипции от энхансерной области (или энхансерной последовательности) интрона Igκ, не принадлежащего человеку, сконструированного локуса легкой цепи κ Ig таким образом, что указанная вставка ДНК функционально связана с геном Сλ1 мыши (или геном Сλ2 человека), где вставка ДНК содержит геномную последовательность Ig κ человека, которая естественным образом расположена между сегментом гена Vκ4-1 человека и сегментом гена Jκ1 человека локуса легкой цепи κ Ig человека и одним или более сегментами гена Jλ человека (например, одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или семью), в котором ген Сλ1 мыши (или ген Сλ2 человека) расположен на месте гена Сκ мыши эндогенного локуса легкой цепи κ Ig, не принадлежащего человеку. В некоторых определенных вариантах осуществления способы включают вставку ДНК между сегментом гена Vλ3-1 человека и интронным энхансером Igκ, не принадлежащим человеку, причем такая вставка ДНК включает последовательность Vκ-Jκ человека, которая естественным образом расположена между сегментами гена Vκ4-1 и Jκ1 локуса легкой цепи κ Ig человека и пятью сегментами гена Jλ человека (например, Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 и Jλ7). В различных вариантах осуществления вставка ДНК, включая сегмент гена Jλ человека содержит геномную ДНК Jκ человека с кодирующими последовательностями сегментов гена J λ человека и 12RSS Jλ человека.

[00289] Вставка дополнительных сегментов Vλ и Jλ человека может быть достигнута с использованием способов, описанных в настоящем документе, для внесения дополнительного разнообразия сконструированного локуса легкой цепи λ Ig. Например, в некоторых вариантах осуществления способы могут включать в себя вставку около 270 килобайт ДНК против хода транскрипции относительно гена Сλ1 мыши (или гена Сλ2 человека) сконструированного локуса легкой цепи κ Ig, так что указанная ДНК функционально связана с указанным геном Сλ1 мыши (или геном Сλ2 человека), ДНК которого включает сегменты гена Vλ человека Vλ10-54, Vλ6-57, Vλ4-60, Vλ8-61 и Vλ4-69. В таких вариантах осуществления указанная ДНК встраивается против хода транскрипции относительно сегмента гена Vλ5-52 человека, который функционально связан с геном Сλ1 мыши (или геном Сλ2 человека) сконструированного локуса легкой цепи κ Ig, причем такая ДНК включает сегменты гена Vλ, человека Vλ10-54, Vλ6-57, Vλ4-60, Vλ8-61 и Vλ4-69. В некоторых определенных вариантах осуществления указанная ДНК включает ген V пре-В человека. Дополнительные сегменты гена Vλ человека, описанные выше, могут быть клонированы непосредственно из коммерчески доступных клонов ВАС и расположены в меньшем фрагменте ДНК с использованием рекомбинантных методик, описанных в данном документе или известных в данной области. Альтернативно, дополнительные сегменты гена Vλ человека, описанные выше, могут быть синтезированы в виде сконструированного фрагмента ДНК и добавлены к сконструированному локусу легкой цепи κ Ig, как описано выше, с использованием методов молекулярной биологии, известных в данной области. Кроме того, дополнительные сегменты гена Jλ человека могут быть получены из коммерчески доступных клонов ВАС или синтезированы непосредственно из опубликованных последовательностей. Примерная иллюстрация, которая показывает сконструированный локус легкой цепи κ Ig животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, представлен на фиг. 2В или 4В.

[00290] В случаях, где это уместно, последовательность легкой цепи λ Ig человека (то есть, последовательность, содержащая сегменты гена Vλ и Jλ человека), кодирующая домен Vλ человека, может быть отдельно модифицирована для включения кодонов, оптимизированных в отношении экспрессии у животного, не являющегося человеком (например, см. патенты США №№5,670,356 и 5,874,304). Кодон-оптимизированные последовательности представляют собой сконструированные последовательности и, предпочтительно, кодируют идентичный полипептид (или биологически активный фрагмент полноразмерного полипептида, который обладает практически такой же активностью, что и полноразмерный полипептид), кодируемый не кодон-оптимизированным родительским полинуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи λ Ig человека, кодирующая домен Vλ человека, может отдельно включать измененную последовательность для оптимизации использования кодонов для конкретного типа клеток (например, клетки грызунов). Например, кодоны каждой нуклеотидной последовательности, которые должны быть вставлены в геном животного, не являющегося человеком (например, грызуна), могут быть оптимизированы для экспрессии в клетке животного, не являющегося человеком. Такая последовательность может быть описана как кодон-оптимизированная последовательность.

[00291] При вставке нуклеотидных последовательностей, кодирующих домены Vλ человека, выполняется минимальная модификация генома зародышевой линии животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, и это приводит к экспрессии антител, содержащих легкие цепи, имеющие домены Vλ человека, где домены Vλ человека экспрессируются из эндогенных сконструированных локусов легкой цепи κ Ig. Способы создания искусственных животных, не являющихся человеком, включая нокауты и нокины, известны в данной области (см., например, Gene Targeting: А Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc., 2000; включенный в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте). Например, создание генетически сконструированных грызунов может необязательно включать разрушение генетических локусов одного или более эндогенных генов (или сегментов гена) грызунов и введение одного или более гетерологичных генов (или сегментов гена или нуклеотидных последовательностей) в геном грызуна, в некоторые вариантах осуществления, в то же место, в котором находился эндогенный ген (или сегменты гена) грызуна. В некоторых вариантах нуклеотидные последовательности, кодирующие домен Vλ, человека вводятся в участок против хода транскрипции относительно гена константной области легкой цепи λ Ig мыши или человека произвольно вставленного сконструированного трансгена легкой цепи в геном зародышевой линии грызуна. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности, кодирующие домены Vλ человека, вводятся в участок против хода транскрипции относительно гена константной области легкой цепи λ Ig мыши или человека эндогенного локуса легкой цепи κ Ig в геноме зародышевой линии грызуна; в некоторых определенных вариантах осуществления эндогенный локус легкой цепи κ Ig изменен, модифицирован или сконструирован таким образом, что он содержит сегменты гена Ig λ человека (например, V и J человека), функционально связанные с геном Сλ1 мыши или функционально связанные с геном Сλ2 человека.

[00292] Схематические иллюстрации (без масштабирования) примерных способов конструирования сконструированного локуса легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе, представлены на фиг. 1А, 1В, 2А, 2В, 3, 4А и 4В. В частности, на фиг. 1А и 1В представлена примерная стратегия конструирования искусственного локуса легкой цепи κ Ig, характеризующегося вставкой нуклеотидных последовательностей, содержащих множество сегментов гена Vλ и Jλ человека. Как показано на фиг. 1А и 1В, фрагмент ДНК, содержащий межгенную область Vκ-Jκ человека (см. патенты США №9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 и 9,163,092) и сконструированный фрагмент, содержащий набор сегментов гена Jλ человека (например, Jλ1, Jλ2, JA3, Jλ6 и Jλ7 человека) функционально связаны с энхансерной областью (или энхансерной последовательностью) интрона Ig κ грызуна посредством ряда стадий с использованием различных методов молекулярной биологии, описанных в примере 1. Такой сконструированный фрагмент также сконструирован с возможностью содержания константной области легкой цепи λ Ig грызуна, которая функционально связана с сегментами гена J λ человека. Селекционные кассеты (например, неомицин и гигромицин) включены в нацеленный вектор для обеспечения отбора положительных клонов в клетках бактерий и млекопитающих (например, эмбриональных стволовых клетках). Как показано, ген устойчивости к неомицину фланкирован сайтами специфической рекомбинации lox2372 и расположен между областью Vκ-Jκ человека и множеством генных сегментов Jλ человека, в то время как селекционная кассета гигромицина фланкирована сайтами специфической рекомбинации loxP и расположена в направлении 3' относительно гена константной области легкой цепи λIg грызуна (mCλ1). Затем фрагмент ДНК объединяют с фрагментом ДНК, содержащим 3' энхансер легкой цепи κ Ig грызуна для создания конечного нацеленного вектора (фиг. 1В). Полученный направленный вектор (конструкция G) линеаризуют и электропорируют в эмбриональные стволовые клетки (ES) грызунов для создания грызуна, геном зародышевой линии которого содержит сконструированный локус легкой цепи κ Ig. Как описано в разделе примеров ниже, клетки ES грызунов, используемые в электропорации нацеленного вектора, содержали сконструированный локус легкой цепи κ Ig, как описано ранее в патентах США №№9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 и 9,163,092; включенных в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Гомологичная рекомбинация с нацеленным вектором, как показано на фиг. 3, приводит к получению сконструированного локуса легкой цепи κ Ig, характеризующегося множеством сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанных с геном Сλ1 мыши, данный ген Сλ1 мыши находится на месте гена Сκген мыши, который естественным образом расположен в локусе легкой цепи κ Ig дикого типа. Сегменты гена Jλ человека уникальным образом сконструированы в последовательность, которая естественным образом расположена в геномной области Jκ человека, однако также содержит кодирующие последовательности Jλ человека и связанные 12RSS на месте кодирующей последовательности Jκ человека и связанных 23RSS. Положительные клоны клеток ES грызунов подтверждают с использованием способов скрининга, описанных в данном документе и/или известных в данной области. Любая оставшаяся селекционная кассета может быть удалена по желанию посредством опосредованной рекомбиназой делеции (см. пример 2).

[00293] Кроме того, ген Сλ человека может использоваться в нацеленном векторе вместо гена Сλ мыши. В качестве одного из примеров, на фиг. 3 показан нацеленный вектор, который был сконструирован аналогично описанному выше, за исключением того, что последовательность, кодирующая ген Сλ2 человека, была встроена в нацеленный вектор и функционально связана с пятью сегментами гена Jλ человека. Использование такого подхода обеспечивает дополнительное преимущество при разработке терапии человека на основе антител, поскольку ДНК, кодирующая вариабельную и константную области легких цепей, может быть выделена вместе, что исключает любую последующую стадию клонирования, связывающуюся с константной областью легкой цепи человека для получения полностью человеческого антитела.

[00294] Нацеленные векторы для конструирования сконструированного локуса легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе, могут быть включены в геном зародышевой линии клетки, не принадлежащей человеку (например, эмбриональной стволовой клетки грызуна). В некоторых вариантах осуществления нацеленные векторы в соответствии с описанием в данном документе включены в локус легкой цепи κ Ig дикого типа в геноме зародышевой линии клетки, не принадлежащей человеку, которая дополнительно содержит геномную ДНК VH, DH и JH человека (например, содержащую множество сегментов гена VH, DH и JH человека), функционально связанную с одним или более из генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, см. патенты США №№8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 и 8,791,323, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте). В некоторых вариантах осуществления нацеленные векторы в соответствии с описанием в данном документе включены в модифицированный или сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в геноме зародышевой линии клетки, не принадлежащей человеку, которая дополнительно содержит геномную ДНК VH, DH и JH человека (например, содержащую множество сегментов гена VH, DH и JH человека), функционально связанную с одним или более из генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, см. патенты США№№8,502,018, 8,642,835, 8,697,940, 8,791,323, 9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 и 9,163,092, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте).

[00295] Нацеленный вектор вводят в эмбриональные стволовые клетки грызунов (например, мыши) путем электропорации, так что последовательность, содержащаяся в нацеливающем векторе, приводит к способности клетки, не принадлежащей человеку, или животного, не являющегося человеком (например, мыши), экспрессировать антитела имеющие легкие цепи, которые включают домен Vλ человека и домен С λ человека или не принадлежащий человеку, и где легкие цепи экспрессируются из сконструированного эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина. Как описано в данном документе, создается генетически сконструированный грызун, в котором сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина был создан в геноме зародышевой линии грызуна (например, эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий последовательность легкой цепи λ Ig человека (т.е., множество сегментов гена Vλ и Jλ человека), функционально связан с геном Сλ грызуна или человека на месте эндогенного гена Сκ грызуна). Антитела экспрессируются на поверхности В-клеток грызунов и в сыворотке указанного грызуна, причем эти антитела характеризуются легкими цепями, имеющими домен Vλ человека и домены Сλ человека или не принадлежащие человеку. Когда эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в геноме зародышевой линии грызуна не является мишенью для нацеленного вектора, сконструированный трансген легкой цепи κ иммуноглобулина предпочтительно вставляют на место, отличное от места расположения эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина грызунов (например, произвольно вставленный трансген).

[00296] Создание сконструированного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина у животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием выше, обеспечивает сконструированную линию грызунов, который вырабатывает антитела, которые включают легкие цепи λ иммуноглобулина, экспрессируемые из такого сконструированного локуса легкой цепи κиммуноглобулина, имеющего домен Vλ человека и домен Сλ человека или не принадлежащий человеку. С использованием присутствия сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, который включает множество сегментов гена VH, DH и JH человека, функционально связанных с генами константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, была создана сконструированная линия грызунов, которые вырабатывают антитела и компоненты антител для развития терапии человека на основе антител. Таким образом реализована одна спроектированная линия грызунов, способная обеспечивать альтернативную систему in vivo для эксплуатации доменов Vλ человека для разработки новых лекарственных препаратов на основе антител для лечения заболеваний человека.

[00297] В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения животного, не являющегося человеком, чей геном зародышевой линии содержит эндогенный сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, причем способ включает (а) введение фрагмента ДНК в эмбриональную стволовую клетку, не принадлежащую человеку, причем указанный фрагмент ДНК содержит нуклеотидную последовательность, которая включает (i) один или более сегментов гена Vλ человека, (ii) один или более сегментов гена Jλ человека и (iii) ген Сλ (например, человека или не принадлежащий человеку), где (i)-(iii) функционально связаны, и где нуклеотидная последовательность дополнительно содержит последовательность легкой цепи k иммуноглобулина между (i) и (ii), (b) получение эмбриональной стволовой клетки, не принадлежащей человеку, полученной в (а); и (с) создание грызуна с использованием эмбриональной стволовой клетки грызуна (b).

[00298] В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения животного, не являющегося человеком, чей геном зародышевой линии содержит эндогенный сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, причем способ включает (а) введение фрагмента ДНК в эмбриональную стволовую клетку, не принадлежащую человеку, причем указанный фрагмент ДНК содержит нуклеотидную последовательность, которая включает один или более сегментов гена Jλ человека, один или более энхансеров легкой цепи κ иммуноглобулина, не принадлежащих человеку, и ген Сλ человека или не принадлежащий человеку, где сегменты гена Jλ человека функционально связаны с указанным одним или более энхансерами легкой цепи κ иммуноглобулина, не принадлежащими человеку, и указанным геном Сλ человека или не принадлежащим человеку, (b) получение эмбриональной стволовой клетки, не принадлежащей человеку, полученной в (а); и (с) создание грызуна с использованием эмбриональной стволовой клетки грызуна (b).

[00299] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ получения животного, не являющегося человеком, чей геном зародышевой линии содержит сконструированный эндогенный локус легкой цепи κиммуноглобулина, где сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит вставку одного или более сегментов гена Vλ человека, одного или более сегментов гена Jλ человека и ген Сλ человека или не принадлежащий человеку, где сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с указанным геном Сλ человека или не принадлежащим человеку, и где ген Сλ человека или не принадлежащий человеку вставлен на место гена Сκ, не принадлежащего человеку, в эндогенном локусе иммуноглобулина κ, включающий модификацию генома зародышевой линии животного, не являющегося человеком, таким образом, чтобы он включал сконструированный эндогенный локус легкой цепиκ иммуноглобулина, который включает вставку одного или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека и ген Сλ человека или не принадлежащий человеку, причем данные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с указанным геном Сλ человека или не принадлежащим человеку, и ген Сλ человека или не принадлежащий человеку вставлен на место гена Сκ, не принадлежащего человеку, в эндогенном локусе иммуноглобулина κ.

[00300] В некоторых вариантах осуществления способа изготовления животного, не являющегося человеком, один или более сегментов гена Vλ человека включают по меньшей мере 24, по меньшей мере 34, по меньшей мере 52, по меньшей мере 61 или по меньшей мере 70 сегментов гена Vλ человека. В некоторых вариантах осуществления способа изготовления животного, не являющегося человеком, один или более сегментов гена Vλ человека включают 39 сегментов гена Vλ человека. В некоторых определенных вариантах осуществления способа создания животного, не являющегося человеком, один или более сегментов гена Vλ человека включают Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 человека или любую их комбинацию. В некоторых определенных вариантах осуществления один или более сегментов гена Vλ человека включают некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с соответствующими сегментами гена Vλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ человека.

[00301] В некоторых вариантах осуществления способа изготовления животного, не являющегося человеком, один или более сегментов гена Jλ человека включают по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 сегментов гена Jλ человека. В некоторых вариантах осуществления способа изготовления животного, не являющегося человеком, один или более сегментов гена Jλ человека включают 5 сегментов гена Jλ человека. В некоторых вариантах осуществления способа изготовления животного, не являющегося человеком один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 человека или любую их комбинацию. В некоторых определенных вариантах осуществления один или более сегментов гена Jλ человека включают некодирующую ДНК человека, полностью или частично, которая естественным образом расположена рядом с соответствующими сегментами гена Jλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ человека. В некоторых вариантах осуществления один или более сегментов гена Jλ человека включают некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с Jκ1-Jκ5 человека в эндогенном локусе легкой цепи κ человека.

[00302] В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, фрагмент ДНК включает межгенную ДНК, которая содержит некодирующую ДНК иммуноглобулина (например, ДНК, которая естественным образом расположена между кодирующей последовательностью двух сегментов гена V, сегмента гена V и сегмента гена J или между двумя сегментами гена J). Во многих вариантах осуществления указанная некодирующая ДНК иммуноглобулина представляет собой некодирующую ДНК легкой цепи иммуноглобулина (например, человека или мыши). В некоторых вариантах осуществления некодирующая ДНК легкой цепи иммуноглобулина представляет собой ДНК легкой цепи κ иммуноглобулина, ДНК легкой цепи λиммуноглобулина или их комбинацию.

[00303] В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, фрагмент ДНК дополнительно содержит один или более маркеров отбора. В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком фрагмент ДНК дополнительно содержит один или более сайтов сайт-специфической рекомбинации. В некоторых определенных вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, фрагмент ДНК дополнительно содержит один или более наборов сайт-специфических сайтов рекомбинации, которые рекомбинируют с одной и той же рекомбиназой. В некоторых определенных вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком фрагмент ДНК дополнительно содержит один или более наборов сайт-специфических сайтов рекомбинации, которые рекомбинируют с различными рекомбиназами.

[00304] В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком фрагмент ДНК содержит сконструированную последовательность, которая включает последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина и последовательность легкой цепи λ иммуноглобулина вместе в непрерывной последовательности. В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком фрагмент ДНК содержит сконструированную последовательность, которая включает последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина и последовательность легкой цепи λ иммуноглобулина вместе в одной последовательности, но прерванной неиммуноглобулиновой последовательностью (например, сигнальной последовательностью рекомбинации, геном устойчивости и их комбинациями). В некоторых определенных вариантах осуществления способа изготовления животного, не являющегося человеком сконструированная последовательность включает части области Jκ и части области Jλ. В некоторых вариантах осуществления сконструированная последовательность включает в себя части области Jκ человека и части области Jλ человека. В некоторых определенных вариантах осуществления части области Jκ человека включает некодирующие последовательности области Jκ человека, которая естественным образом расположена в человеческом локусе легкой цепи κ иммуноглобулина клетки человека. В некоторых определенных вариантах осуществления части области Jλ человека включают кодирующие последовательности и рекомбинационные сигнальные последовательности (RSS) одного или более сегментов гена Jλ человека. В некоторых определенных вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, фрагмент ДНК содержит сконструированную последовательность, которая в некоторых вариантах характеризуется наличием кодирующих последовательностей и сигнальных последовательностей рекомбинации (RSS) одного или более сегментов гена Jλ человека, которые позиционно заменяют или замещают (т.е., располагаются на месте) соответствующие кодирующие последовательности и последовательности сигналов рекомбинации (RSS) сегментов гена Jκ человека таким образом, что указанные кодирующие последовательности и сигнальные последовательности рекомбинации (RSS) указанного одного или более сегментов гена Jλ человека находятся внутри, рядом с ними, смежны или соседствуют с указанными некодирующими последовательностями указанного одного или более сегментов гена Jκ человека.

[00305] В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, фрагмент ДНК вводят в эмбриональную стволовую клетку, не принадлежащую человеку, чей геном зародышевой линии содержит один или более сконструированных локусов иммуноглобулина (например, тяжелую цепь иммуноглобулина, легкую цепь к иммуноглобулина, легкую цепь λ иммуноглобулина и их комбинации). В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированные локусы иммуноглобулина представляют собой эндогенные сконструированные локусы иммуноглобулина.

[00306] В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, фрагмент ДНК вводят в эмбриональную стволовую клетку, не принадлежащую человеку, чей геном зародышевой линии содержит эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий вставку одного или более сегментов гена VH человека, одного или более сегментов гена DH человека и одного или более сегментов гена JH человека, где данные сегменты гена VH, DH и JH человека функционально связаны с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку.

[00307] В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, фрагмент ДНК вводят в эмбриональную стволовую клетку, не принадлежащую человеку, чей геном зародышевой линии содержит эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий вставку одного или более Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека, где данные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с геном константной области легкой цепи κ иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. В некоторых определенных вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, фрагмент ДНК вводят в эмбриональную стволовую клетку, не принадлежащую человеку, чей геном зародышевой линии содержит эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий вставку одного или более Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека и последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человека, расположенную между указанным одним или более сегментами гена Vλ человека и указанным одним или более сегментами гена Jλ человека, где данные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с геном константной области легкой цепи κ иммуноглобулина, не принадлежащего человеку.

[00308] В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, модификация генома зародышевой линии животного, не являющегося человеком, таким образом, чтобы он включал сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина осуществляется в эмбриональной стволовой клетке, не принадлежащей человеку, чей геном зародышевой линии содержит эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, включающий вставку одного или более сегментов гена VH человека, одного или более сегментов гена DH человека и одного или более сегментов гена JH человека, где данные сегменты гена VH, DH и JH человека функционально связаны с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку.

[00309] В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, модификация генома зародышевой линии животного, не являющегося человеком, таким образом, чтобы он включал сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, осуществляется в эмбриональной стволовой клетке, не принадлежащей человеку, чей геном зародышевой линии содержит эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, включающий вставку одного или более Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека, где данные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с геном константной области легкой цепи κ иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, модификация генома зародышевой линии животного, не являющегося человеком, таким образом, чтобы он включал сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, осуществляется в эмбриональной стволовой клетке, не принадлежащей человеку, чей геном зародышевой линии содержит эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий вставку одного или более Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека и последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человека, расположенную между указанным одним или более сегментами гена Vλ человека и указанным одним или более сегментами гена Jλ человека, где данные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с геном константной области легкой цепи κ иммуноглобулина, не принадлежащего человеку.

[00310] В некоторых вариантах осуществления способа получения животного, не являющегося человеком, вставка одного или более сегментов гена VH человека, одного или более сегментов гена DH человека и одного или более сегментов гена JH человека включает некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с сегментами гена VH человека, некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с сегментами гена DH человека, и некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с сегментами гена JH человека в эндогенном локусе иммуноглобулина человека.

[00311] В некоторых вариантах осуществления предоставляется животное, не являющееся человеком, полученное способом в соответствии с описанием в данном документе.

[00312] В некоторых вариантах осуществления геном животного, не являющегося человеком в соответствии с описанием в настоящем документе, дополнительно содержит одну или более вариабельных областей тяжелой цепи иммуноглобулина человека, как описано в патентах США №№8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 и 8,791,323, каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Альтернативно, сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе может быть встроен в эмбриональную стволовую клетку другой модифицированной линии, такой как, например, линия VELOCIMMUNE® (см., например, патенты США №№8,502, 018 и/или 8,642,835; полностью включенные в настоящее описание посредством ссылки). Гомозиготность сконструированного локуса легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе, может быть впоследствии получена путем селекции. Альтернативно, в случае произвольно вставленного сконструированного трансгена легкой цепи κ иммуноглобулина (описанного выше), линии грызунов могут быть выбраны на основании, среди прочего, экспрессии домена Vλ человека из трансгена. В некоторых вариантах мышь линии VELOCIMMUNE® может представлять собой мышь VELOCIMMUNE® 1 (VI-1), которая включает восемнадцать сегментов гена VH человека, все сегменты гена DH человека и все сегменты гена JH. Мышь VI-1 также может включать шестнадцать сегментов гена Vκ человека и все сегменты гена Jκ человека. В некоторых вариантах мышь линии VELOCIMMUNE® может представлять собой мышь VELOCIMMUNE® 2 (VI-2), которая включает тридцать девять сегментов гена VH человека, все сегменты гена DH человека и все сегменты гена JH. Мышь VI-2 также может включать тридцать сегментов гена Vκ человека и все сегменты гена Jκ человека. В некоторых вариантах мышь линии VELOCIMMUNE® может представлять собой мышь VELOCIMMUNE® 3 (VI-3), которая включает восемьдесят сегментов гена VH человека, все сегменты гена DH человека и все сегменты гена JH. Мышь VI-3 также может включать сорок сегментов гена Vκ человека и все сегменты гена Jκ человека.

[00313] Альтернативно и/или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления геном зародышевой линии животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, дополнительно содержит удаленный, инактивированный, функционально подавленный или иным образом нефункциональный эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина. Генетические модификации для удаления или обеспечения нефункциональности гена или генетического локуса могут быть достигнуты с использованием способов, описанных в данном документе, и/или способов, известных в данной области.

[00314] Генетически сконструированное животное-основатель, не являющееся человеком, может быть идентифицировано на основании наличия сконструированного локуса легкой цепи κ Ig в своем геноме зародышевой линии и/или экспрессии антител, имеющих домен Vλ человека и домен Сλ человека или не принадлежащий человеку в тканях или клетках животного, не являющегося человеком. Затем генетически сконструированное животное-основатель, не являющееся человеком, можно использовать для разведения дополнительных животных, не являющихся людьми, несущих сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, тем самым создавая когорту животных, не являющихся людьми, каждая из которых несет одну или более копий сконструированного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина. Кроме того, генетически сконструированные животные, не являющиеся людьми, которые несут сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в настоящем документе, могут быть далее использованы для выведения других генетически сконструированных животных, не являющихся человеком, несущих другие трансгены (например, гены иммуноглобулина человека) или сконструированные локусы иммуноглобулина по желанию.

[00315] Генетически сконструированные животные, не являющиеся людьми, также могут быть получены для содержания выбранных систем, которые обеспечивают регулируемую, направленную, индуцибельную и/или специфическую для клеточного типа экспрессию трансгена или интегрированной последовательности (последовательностей). Например, животные, не являющиеся человеком в соответствии с описанием в данном документе, могут быть сконструированы таким образом, чтобы содержать одну или более последовательностей, кодирующих домен Vλ человека антитела, который экспрессируется условно (например, обзор у Rajewski, K. et al., 1996, J. Clin. Invest. 98(3):600-3, полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки). Типичные системы включают рекомбиназную систему Cre/lox Р бактериофага Р1 (см., например, Lakso, М. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6232-6, полностью включенную в настоящее описание посредством ссылки), и систему рекомбиназы FLP/Frt S. cerevisiae (O'Gorman, S. et al, 1991, Science 251:1351-5, включенная в настоящее описание посредством ссылки в полнота). Такие животные могут быть получены посредством конструирования животных с «двойной» генетической модификацией, например, путем спаривания двух генетически сконструированных животных, одно из которых содержит трансген, содержащий выбранную модификацию (например, сконструированный локус легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе) и другой, содержащий трансген, кодирующий рекомбиназу (например, Cre рекомбиназу).

[00316] Животные, не являющиеся человеком в соответствии с описанием в данном документе, могут быть получены в соответствии с описанием выше или с использованием способов, известных в данной области, для включения дополнительных человеческих, гуманизированных или иным образом сконструированных генов, часто в зависимости от предполагаемого использования животного, не являющегося человеком. Генетический материал таких человеческих, гуманизированных или иным образом сконструированных генов может быть введен посредством дальнейшего изменения генома клеток (например, эмбриональных стволовых клеток), имеющих генетические модификации или изменения, как описано выше, или с помощью методов селекции, известных в данной области, с использованием других генетически модифицированных или сконструированных линий по желанию. В некоторых вариантах осуществления животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, получают для дополнительного включения человеческий генов или сегментов генов легкой цепи κ IgH и/или Ig (см., например, Murphy, AJ et al., (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-5158; патенты США №№8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 и 8,791,323; патент США №8,791,323; и публикация заявки на патент США №2013/0096287 А1; каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте).

[00317] В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, могут быть получены путем введения нацеленного вектора, описанного в настоящем документе, в клетку из модифицированной или сконструированной линии. Например, направленный вектор в соответствии с описанием в данном документе, может быть введен в мышь VELOCIMMUNE®. Мыши VELOCIMMUNE® экспрессируют антитела, которые имеют полностью человеческие вариабельные области и мышиные константные области. В другом примере нацеленный вектор в соответствии с описанием в настоящем документе, может быть введен в сконструированную мышь, как описано в любом из патентов США №№9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 и 9,163,092, полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления животных, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, получают для дополнительного включения генов иммуноглобулина человека (генов вариабельной и/или константной области). В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, содержат сконструированный локус легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе и генетический материал от гетерологичных видов (например, людей), где генетический материал кодирует, полностью или частично, одну или более вариабельных областей тяжелых цепей и/или легких цепей κ Ig человека.

[00318] Например в соответствии с описанием в настоящем документе, животные, не являющиеся людьми, содержащие сконструированный локус легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе, могут дополнительно включать (например, посредством стратегий перекрестного размножения или множественного нацеливания на гены) одну или более модификаций, как описано в Murphy, AJ et al., (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8; Macdonald, L.E. et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5147-52; патенты США №№8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 и 8,791,323; каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления грызуна, содержащего сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе, скрещивают с грызуном, содержащим гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина и/или локус вариабельной области легкой цепи κ иммуноглобулина (см., например, патенты США №№8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 и/или 8,791,323; полностью включенные в настоящее описание посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления грызуна, содержащего сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в настоящем документе, скрещивают с грызуном, содержащим гуманизированный локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (см., например, патенты США №№8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 и/или 8,791,323; включенные в настоящее описание посредством ссылки) и инактивированный эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина (см., например, патенты США №№9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 и 9,163,092, полностью включенные в настоящий документ посредством ссылки).

[00319] Хотя варианты осуществления, описывающие конструирование сконструированного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина у мыши (т.е., мыши с сконструированным локусом легкой цепи κ иммуноглобулина, характеризующейся наличием множества сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанных с геном Сλ мыши или человека, данный ген Сλ мыши или человека расположен на месте гена Сκ мыши таким образом, что антитела, содержащие домены Vλ человека и домены Cλ мыши или человека) широко обсуждаются в данном документе, также представлены другие животные, не являющиеся людьми, которые содержат сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина. Такие животные, не являющиеся человеком включают любых животных, которые могут быть генетически модифицированы с получением экспрессии антител в соответствии с описанием в данном документе, включая, например, млекопитающих, например мышь, крысу, кролика, свинью, крупный рогатый скот (например, корову, быка, буйвола), оленя, овцу, козу, курицу, кошку, собаку, хорька, примата (например, мартышку, макака-резуса) и т.д. Например, для тех животных, не являющихся человеком, для которых подходящие генетически модифицируемые клетки ES недоступны в данный момент, используются другие способы изготовления животного, не являющегося человеком, включающего генетическую модификацию. Такие способы включают, например, модификацию генома клеток, не являющихся клетками ES (например, фибробластов или индуцированных плюрипотентных клеток) и использование переноса ядер соматических клеток (SCNT) для переноса генетически модифицированного генома в подходящую клетку, например энуклеированный ооцит, и подсаживание модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) для вынашивания животному, не являющемся человеком, в подходящих условиях для образования эмбриона.

[00320] Способы модификации генома зародышевой линии животного, не являющегося человеком (например, генома свиньи, коровы, грызуна, курицы и т.д.) включают, например, применение цинк-пальцевой нуклеазы (ZFN), эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN) или белок Cas (то есть, система CRISPR/Cas) для включения сконструированного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе. Руководство по методам модификации генома зародышевой линии животного, не являющегося человеком, можно найти, например, в патентных заявках США №14/747,461 (поданной 23 июня 2015 г.), 14/948,221 (поданной 20 ноября 2015 г.) и 14/974,623 (подано 18 декабря 2015 г.); включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

[00321] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, представляет собой маленькое млекопитающее, например, суперсемейство Dipodoidea или Muroidea. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное в соответствии с описанием в данном документе представляет собой грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун в соответствии с описанием в данном документе выбран из мыши, крысы и хомяка. В некоторых вариантах осуществления грызун в соответствии с описанием в данном документе выбран из суперсемейства Muroidea. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное в соответствии с описанием в данном документе, принадлежит к семейству, выбранному из Calomyscidae (например, мышевидные хомячки), Cricetidae (например, хомяки, крысы Нового Света и мыши, полевки), Muridae (настоящие мыши и крысы, песчанки, колючие рисовые хомячки, косматые хомяки), Nesomyidae (рипидомисы, скалистые хомячки, белохвостые крысы, мадагаскарские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки) и Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). В некоторых конкретных вариантах осуществления генетически модифицированный грызун в соответствии с описанием в данном документе, выбран из настоящей мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, колючего рисового хомячка и косматого хомяка. В некоторых конкретных вариантах осуществления генетически модифицированная мышь в соответствии с описанием в данном документе, принадлежит к семейству Muridae. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, представляет собой грызуна. В некоторых конкретных вариантах осуществления грызун в соответствии с описанием в данном документе выбран из мыши и крысы. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, представляет собой мышь.

[00322] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком в соответствии с описанием в данном документе, представляет собой грызуна, который представляет собой мышь линии C57BL, выбранную из линий C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В некоторых конкретных вариантах осуществления мышь в соответствии с описанием в настоящем документе, представляет собой мышь линии 129, выбранную из группы, состоящей из линии, которая представляет собой 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (см., например, Festing et al., 1999, Genome Mammalian 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте). В некоторых конкретных вариантах осуществления генетически модифицированная мышь в соответствии с описанием в данном документе, представляет собой смесь вышеупомянутой линии 129 и вышеупомянутой линии C57BL/6. В некоторых конкретных вариантах осуществления мышь в соответствии с описанием в настоящем документе, представляет собой смесь вышеупомянутой линии 129 или смесь вышеупомянутых линий BL/6. В некоторых конкретных вариантах осуществления линия 129 смеси в соответствии с описанием в данном документе, представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В некоторых вариантах осуществления мышь в соответствии с описанием в данном документе представляет собой линию BALB, например, линию BALB/c. В некоторых вариантах осуществления мышь в соответствии с описанием в данном документе представляет собой смесь линии BALB и другой вышеупомянутой линии.

[00323] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, представляет собой крысу. В некоторых конкретных вариантах осуществления крысу в соответствии с описанием в данном документе выбирают из крысы Wistar, линии LEA, линии Sprague Dawley, линии Fisher, F344, F6 и Dark Agouti. В некоторых конкретных вариантах осуществления линия крыс в соответствии с описанием в настоящем документе представляет собой смесь двух или более линий, выбранных из группы, состоящей из линий Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fisher, F344, F6 и Dark Agouti.

[00324] Плюрипотентная и/или тотипотентная клетка крысы может происходить от крысы любой линии, включая, например, линию крыс ACI (инбредная линия, первоначально полученная из линий August и Copenhagen), линию крыс Dark Agouti (DA), линию крыс Wistar, линию крыс LEA, линию крыс Sprague Dawley (SD) или линию крыс Fisher, например, Fisher F344 или Fisher F6. Плюрипотентные и/или тотипотентные клетки крысы также могут быть получены из линии, полученной из смеси двух или более перечисленных выше линий. Например, плюрипотентная и/или тотипотентная клетка крысы может быть из линии DA или линии ACI. Линия крыс ACI характеризуется темным окрасом «агути», белым животом и лапами и гаплотипом RT1av1. Такие линии доступны из различных источников, включая Harlan Laboratories. Примером линии клеток ES крысы от крысы ACI является клетка ES крысы ACI.G1. Линия крыс DA характеризуется наличием шерсти цвета «агути» и гаплотипом RT1av1. Такие крысы доступны из различных источников, включая Charles River и Harlan Laboratories. Примерами линии клеток ES крысы от крысы DA являются линия клеток ES крысы DA.2B и линия клеток ES крысы DA.2C. В некоторых вариантах осуществления плюрипотентные и/или тотипотентные клетки крысы происходят от инбредной крысиной линии (см., например, публикацию патентной заявки США №2014-0235933 А1, опубликованную 21 августа 2014 г., полностью включенную в настоящий документ посредством ссылки). Руководство по внесению модификаций в геном крысы (например, в ES-клетку крысы) с использованием способов и/или конструкций в соответствии с описанием в данном документе, можно найти, например, в публикациях патентных заявок США №№2014-0310828 и 2017-0204430; обе из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

Конкретные типичные варианты осуществления - локусы тяжелой цепи иммуноглобулина

[00325] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе, и дополнительно содержит сконструированные локусы IgH (или аллели), характеризующиеся наличием множества сегментов VH, DH и JH человека, расположенных в конфигурации зародышевой линии и функционально связанных с генами константой области тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, энхансерными и регуляторными областями. В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или аллель) в соответствии с описанием в настоящем документе содержит один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека функционально связаны с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащей человеку. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или аллель) содержит, по меньшей мере сегменты гена VH человека VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1 или любую их комбинацию. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус IgH (или аллель) содержит по меньшей мере сегменты гена DH человека DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27 или любую их комбинацию. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или аллель) содержит по меньшей мере сегменты гена JH человека JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 или любую их комбинацию.

[00326] В настоящем раскрытии признается, что животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, будет использовать сегменты гена вариабельной области тяжелой цепи, содержащиеся в его геноме, в механизмах отбора и генерации антител (например, рекомбинации и соматической гипермутации). По существу, в различных вариантах осуществления вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина, генерируемые животными, не являющимися человеком, описанными в данном документе, кодируются сегментами гена вариабельной области тяжелой цепи человека, включенными в их геном, или их соматически гипермутированными вариантами соответственно.

[00327] В некоторых вариантах осуществления предоставлено животное, не являющееся человеком, чей геном содержит сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, где животное, не являющееся человеком, включает В-клетку, которая включает последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ человека, которая является соматически гипермутированной. В некоторых вариантах осуществления последовательность вариабельной области тяжелой области человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ человека, присутствующая в В-клетке мыши по данному раскрытию, имеет 1, 2, 3, 4, 5 или более соматических гипермутаций. Специалистам в данной области известны способы идентификации сегментов исходного гена в последовательности зрелого антитела. Например, для помощи в этом анализе доступны различные инструменты, такие как, например, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA и Ab-origin.

[00328] В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, включает один или более генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, таких как, например, иммуноглобулин М (IgM), иммуноглобулин D (IgD), иммуноглобулин G (IgG), иммуноглобулин Е (IgE) и иммуноглобулин A (IgA). В некоторых определенных вариантах осуществления константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, включает гены константой области IgM грызунов, IgD грызунов, IgG3 грызунов, IgG1 грызунов, IgG2b грызунов, IgG2a грызунов, IgE грызунов и IgA грызунов. В некоторых вариантах осуществления указанные сегменты гена VH, DH и JH человека функционально связаны с одним или более энхансерами тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку (т.е., энхансерными последовательностями или энхансерными областями). В некоторых вариантах осуществления указанные сегменты гена VH, DH и JH человека функционально связаны с одним или более регуляторными областями (или регуляторными последовательностями) тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. В некоторых вариантах осуществления указанные сегменты гена VH, DH и JH человека функционально связаны с одним или более энхансерами (или энхансерной последовательностью) тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, и одной или более регуляторными областями (или регуляторной последовательностью) тяжелой цепи неиммуноглобулина, не принадлежащего человеку.

[00329] В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе не содержит эндогенного гена Adam6. В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе не содержит эндогенного гена Adam6 (или последовательности, кодирующей Adam6) в том же положении генома зародышевой линии, что и в геноме зародышевой линии животного дикого типа того же вида, не являющегося человеком. В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе не содержит псевдогена Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина в соответствии с описанием в настоящем документе включает вставку по меньшей мере одной нуклеотидной последовательности, которая кодирует один или более полипептидов Adam6, не принадлежащих человеку (например, грызуна), функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления указанная вставка может находиться за пределами сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе (например, но не ограничиваясь этим, в направлении против хода транскрипции 5' относительно большей части сегмента гена VH), внутри сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина или где-либо еще в геном зародышевой линии животного, не являющегося человеком, и/или клетки или ткани, не принадлежащей человеку (например, но не ограничиваясь этим, случайно введенной последовательности, не кодирующей Adam6 человека).

[00330] В различных вариантах осуществления предоставленное животное, не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, в соответствии с описанием в данном документе, не показывает обнаруживаемой экспрессии, полностью или частично, эндогенной области VH, не принадлежащей человеку, в молекуле антитела. В различных вариантах осуществления предоставленное животное, не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, в соответствии с описанием в данном документе, не содержит (или содержит делецию) одной или более нуклеотидных последовательностей, которые кодируют, полностью или частично, эндогенную область VH, не принадлежащую человеку (например, VH, DH и/или JH) в молекуле антитела. В различных вариантах осуществления предоставленное животное, не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, в соответствии с описанием в данном документе, имеет геном зародышевой линии, который включает делецию эндогенных сегментов гена VH, DH и JH, не принадлежащего человеку, целиком или частично. В различных вариантах осуществления предоставленное животное, не являющееся человеком, является фертильным.

[00331] Руководство по созданию нацеленных векторов, клеток, не принадлежащих человеку, и животных, несущих такие сконструированные локусы (или аллели) тяжелых цепей иммуноглобулина, можно найти в патентах США №№8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 и 8,791,323, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки во всей его полноте. Специалистам в данной области известны различные технологии, известные в данной области, для осуществления такой генной инженерии и/или манипулирования геномами, отличными от человека (например, млекопитающего), или для иного изготовления, предоставления или изготовления таких последовательностей для введения в геном зародышевой линии животных, не являющихся человеком.

Конкретные типичные варианты осуществления - локусы легкой цепи κ иммуноглобулина

[00332] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, характеризующийся наличием множества сегментов гена Vλ и Jλ человека, расположенные в конфигурации зародышевой линии (т.е., не переставленные и не связанные с сигнальными последовательностями рекомбинации) и вставленные ранее хода транскрипции относительно гена Сλ человека или не принадлежащего человеку и функционально связанные с ним, где ген Сλ человека или не принадлежащий вставлен на место гена Сκ, не принадлежащего человеку. В соответствии с описанием в данном документе, такой сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина дополнительно включает энхансерные области (или энхансерные последовательности) легкой цепи κ иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. В некоторых вариантах сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека, функционально связанные с геном Сλ человека или не принадлежащим человеку. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или аллель) легкой цепи κ иммуноглобулина содержит сегменты гена Vλ человека, которые расположены по крайней мере в кластере А локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека; в некоторых вариантах осуществления в кластере А и кластере В локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека; в некоторых определенных вариантах осуществления в кластере А, кластере В и кластере С локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина (или аллель) содержит по меньшей мере сегменты гена Vλ человека Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любая их комбинация. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус легкой цепи κ Ig (или аллель) содержит по меньшей мере сегменты гена Jλ человека Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию.

[00333] В настоящем раскрытии признается, что животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, будет использовать сегменты гена вариабельной области легкой цепи λ, содержащиеся в его геноме, в механизмах отбора и генерации антител (например, рекомбинации и соматической гипермутации). По существу, в различных вариантах осуществления вариабельные домены легкой цепи λ иммуноглобулина, генерируемые животными, не являющимися человеком, описанными в данном документе, кодируются сегментами гена вариабельной области легкой цепи λ человека, включенными в их геном, или их соматически гипермутированными вариантами соответственно.

[00334] В некоторых вариантах осуществления предоставлено животное, не являющееся человеком, чей геном содержит сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, где животное, не являющееся человеком, включает В-клетку, которая включает последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ человека, которая является соматически гипермутированной. В некоторых вариантах осуществления последовательность вариабельной области тяжелой области человека, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи κ человека, присутствующая в В-клетке мыши по данному раскрытию, имеет 1, 2, 3, 4, 5 или более соматических гипермутаций. Специалистам в данной области известны способы идентификации сегментов исходного гена в последовательности зрелого антитела. Например, для помощи в этом анализе доступны различные инструменты, такие как, например, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA и Ab-origin.

[00335] Во многих вариантах сконструированный локус (или аллель) легкой цепи κ иммуноглобулина содержит те же энхансерные области (или энхансерные последовательности) легкой цепи κ иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, которые появляются в локусе (или аллели) легкой цепи κ иммуноглобулина дикого типа. В некоторых вариантах сконструированный локус (или аллель) легкой цепи κ иммуноглобулина содержит энхансерные области (или энхансерные последовательности) легкой цепи κ иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, которые появляются в локусе (или аллели) легкой цепи κ иммуноглобулина дикого типа от другого вида (например, от другого вида грызуна).

[00336] В некоторых вариантах осуществления указанные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с одним или более энхансерами легкой цепи κ иммуноглобулина, не принадлежащего человеку (т.е., энхансерными последовательностями или энхансерными областями). В некоторых определенных вариантах осуществления указанные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с областью интронного энхансера легкой цепи κ иммуноглобулина мыши (Igκ Ei или Eiκ). В некоторых определенных вариантах осуществления указанные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с областью 3' энхансера легкой цепи κ иммуноглобулина мыши (Igκ 3'Е или 3'Еκ). В некоторых определенных вариантах осуществления указанные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с Eiκ мыши и функционально связан с 3'Еκ мыши.

[00337] В некоторых вариантах сконструированный локус (или аллель) легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе не содержит (т.е., не имеет) гена V-пре-B человека (или кодирующей последовательности гена V-пре-B человека).

[00338] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ, не принадлежащий человеку, сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ иммуноглобулина включает ген Сλ грызуна, такой как, например, ген Сλ мыши или ген Сλ крысы. В некоторых определенных вариантах осуществления ген Сλ, не принадлежащий человеку, сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig представляет собой или включает ген Сλ мыши генетического происхождения, включающего линию 129, линию BALB/c, линию C57BL/6, смешанную линию 129xC57BL/6 или их комбинации.

[00339] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ, не принадлежащий человеку, сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 1 (Cλ1 мыши), SEQ ID NO: 3 (Сλ2 мыши) или SEQ ID NO: 5 (Сλ3 мыши). В некоторых вариантах осуществления ген Сλ, не принадлежащий человеку, сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе содержит последовательность, которая по сути идентична или идентична последовательности SEQ ID NO: 1 (Cλ1 мыши), SEQ ID NO: 3 (Сλ2 мыши) или SEQ ID NO: 5 (Cλ3 мыши). В некоторых вариантах осуществления ген Сλ, не принадлежащий человеку, сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе представляет собой или содержит последовательность гена Cλ1 мыши.

[00340] В некоторых вариантах осуществления домен Cλ, не принадлежащий человеку, кодированный последовательностью, расположенной в сконструированном локусе (или аллели) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе, содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 2 (Сλ1 мыши), SEQ ID NO: 4 (Сλ2 мыши) или SEQ ID NO: 6 (Сλ3 мыши). В некоторых вариантах осуществления домен Сλ, не принадлежащий человеку, кодированный последовательностью, расположенной в сконструированном локусе (или аллели) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе, содержит последовательность, которая по существу идентична или идентична последовательности SEQ ID NO: 2 (Сλ1 мыши), SEQ ID NO: 4 (Сλ2 мыши) или SEQ ID NO: 6 (Сλ3 мыши). В некоторых вариантах осуществления ген Сλ, не принадлежащий человеку, кодированный последовательностью, расположенной в сконструированном локусе (или аллели) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе представляет собой или содержит последовательность полипептида домена Cλ1 мыши.

[00341] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ, не принадлежащий человеку, сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 7 (Cλ1 крысы), SEQ ID NO: 9 (Сλ2 крысы), SEQ ID NO: 11 (Cλ3 крысы) или SEQ ID NO: 13 (Cλ4 крысы). В некоторых определенных вариантах осуществления ген Сλ, не принадлежащий человеку, сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе содержит последовательность, которая по существу идентична или идентична последовательности SEQ ID NO: 7 (Cλ1 крысы), SEQ ID NO: 9 (Сλ2 крысы), SEQ ID NO: 11 (Сλ3 крысы) или SEQ ID NO: 13 (Cλ4 крысы). В некоторых определенных вариантах осуществления ген Сλ, не принадлежащий человеку, сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе представляет собой или содержит последовательность гена Сλ1 крысы.

[00342] В некоторых вариантах осуществления домен Сλ, не принадлежащий человеку, кодированный последовательностью, расположенной в сконструированном локусе (или аллели) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 8 (Cλ1 крысы), SEQ ID NO: 10 (Сλ2 крысы), SEQ ID NO: 12 (Сλ3 крысы) или SEQ ID NO: 14 (Cλ4 крысы). В некоторых вариантах осуществления домен Сλ, не принадлежащий человеку, кодированный последовательностью, расположенной в сконструированном локусе (или аллели) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе содержит последовательность, которая по существу идентична или идентична последовательности SEQ ID NO: 8 (Cλ1 крысы), SEQ ID NO: 10 (Сλ2 крысы), SEQ ID NO: 12 (Сλ3 крысы) или SEQ ID NO: 14 (Cλ4 крысы). В некоторых вариантах осуществления домен Сλ, не принадлежащий человеку, кодированный последовательностью, расположенной в сконструированном локусе (или аллели) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе представляет собой или содержит последовательность полипептида домена Сλ1 крысы.

[00343] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ человека сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig включает ген Сλ человека, такой как, например, ген Сλ1 человека, ген Сλ2 человека, ген Cλ3 человека, ген Сλ6 человека или ген Сλ7 человека. В некоторых определенных вариантах осуществления ген Сλ человека сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig представляет собой или содержит ген Сλ2 человека.

[00344] В некоторых вариантах осуществления ген Сλ человека сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 15 (Сλ1 человека), SEQ ID NO: 17 (Сλ2 человека), SEQ ID NO: 19 (Сλ3 человека), SEQ ID NO: 21 (Сλ6 человека) или SEQ ID NO: 23 (Сλ7 человека). В некоторых вариантах осуществления ген Сλ человека сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе содержит последовательность, которая по существу идентична или идентична последовательности SEQ ID NO: 15 (Сλ1 человека), SEQ ID NO: 17 (Сλ2 человека), SEQ ID NO: 19 (Сλ3 человека), SEQ ID NO: 21 (Сλ6 человека) или SEQ ID NO: 23 (Сλ7 человека). В некоторых вариантах осуществления ген Сλ человека сконструированного локуса (или аллеля) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе представляет собой или содержит последовательность гена Сλ2 человека.

[00345] В некоторых вариантах осуществления домен Сλ человека кодированный последовательностью, расположенной в сконструированном локусе (или аллели) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 16 (Сλ1 человека), SEQ ID NO: 18 (Сλ2 человека), SEQ ID NO: 20 (Сλ3 человека), SEQ ID NO: 22 (Сλ6 человека) или SEQ ID NO: 24 (Сλ7 человека). В некоторых вариантах осуществления домен Сλ, человека, кодированный последовательностью, расположенной в сконструированном локусе (или аллели) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе содержит последовательность, которая по существу идентична или идентична последовательности SEQ ID NO: 16 (Сλ1 человека), SEQ ID NO: 18 (Сλ2 человека), SEQ ID NO: 20 (Сλ3 человека), SEQ ID NO: 22 (Сλ6 человека) или SEQ ID NO: 24 (Сλ7 человека). В некоторых вариантах осуществления домен Сλ человека, кодированный последовательностью, расположенной в сконструированном локусе (или аллели) легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в настоящем документе представляет собой или содержит последовательность полипептида домена Сλ2 человека.

[00346] Среди прочего, настоящее раскрытие демонстрирует, что присутствие сегментов гена Vλ и Jλ человека в локусах (или аллелях) легкой цепи κ Ig увеличивает разнообразие спектра легких цепей предоставленного животного, не являющегося человеком, по сравнению с разнообразием легких цепей в экспрессированном спектре антител животного, не являющегося человеком, которое не содержит таких сконструированных локусов легкой цепи κ Ig.

Конкретные типичные варианты осуществления - локусы легкой цепи λ иммуноглобулина

[00347] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе, и дополнительно содержит локусы (или аллели) легкой цепи λ инактивированного иммуноглобулина или иммуноглобулина дикого типа.

[00348] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, клетки, не принадлежащие человеку или ткани, не принадлежащие человеку, в соответствии с описанием в данном документе, содержат делецию, полностью или частично, эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, клетки, не принадлежащие человеку или ткани, не принадлежащие человеку, в соответствии с описанием в настоящем документе, содержат вставку в эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина, где указанная вставка делает эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина нефункциональным. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, клетки, не принадлежащие человеку или ткани, не принадлежащие человеку, в соответствии с описанием в настоящем документе, включают делецию одного или более сегментов гена эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина таким образом, что эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина не способен рекомбинировать и/или экспрессировать функциональную легкую цепь антитела.

[00349] В некоторых вариантах осуществления предоставленное животное, не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, в соответствии с описанием в данном документе, не показывает обнаруживаемой экспрессии, полностью или частично, эндогенной области Vλ не принадлежащей человеку, в молекуле антитела. В некоторых вариантах осуществления предоставленное животное, не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, в соответствии с описанием в данном документе, не содержит (или содержит делецию) одной или более нуклеотидных последовательностей, которые кодируют, полностью или частично, эндогенную область Vλ, не принадлежащую человеку, в молекуле антитела. В некоторых вариантах осуществления предоставленное животное, не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, в соответствии с описанием в данном документе, имеет геном зародышевой линии, который включает делецию эндогенных сегментов гена Vλ и Jλ, не принадлежащего человеку, целиком или частично. В некоторых вариантах осуществления предоставленное животное, не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, в соответствии с описанием в данном документе, имеет геном зародышевой линии, который включает делецию эндогенных сегментов гена Vλ, Jλ и Сλ, не принадлежащего человеку, целиком или частично.

[00350] Руководство по созданию нацеленных векторов, клеток, не принадлежащих человеку, и животных, несущих инактивированные локусы (или аллели) легких цепей Ig λ иммуноглобулина можно найти, например, в патентах США №№9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 и 9,163,092, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Специалистам в данной области известны различные технологии, известные в данной области, для осуществления генетической инактивации определенных локусов и/или манипулирования геномами, отличными от человека (например, млекопитающего), или для иного изготовления, предоставления или производства таких генетических инактиваций (например, делеции генов) для введения в геном зародышевой линии животных, не являющихся человеком.

Конкретные типичные варианты осуществления - комбинации локусов иммуноглобулина.

[00351] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе, и дополнительно содержит один или более дополнительных человеческих или гуманизированных генов (например, посредством стратегий перекрестного размножения или множественного нацеливания на гены). Такие животные, не являющиеся человеком, могут быть получены в соответствии с описанием выше или с использованием способов, известных в данной области, для достижения желаемого сконструированного генотипа в зависимости от предполагаемого использования животного, не являющегося человеком. Генетический материал таких дополнительных человеческих или гуманизированных генов может быть введен путем дальнейшего изменения генома клеток (например, эмбриональных стволовых клеток), имеющих генетические модификации, как описано выше, или с помощью методов селекции, известных в данной области, с другими генетически модифицированными линиями по желанию.

[00352] В некоторых вариантах осуществления при условии, что животные, не являющиеся человеком, получены с возможностью дополнительно содержать локус тяжелой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина (например, включая, но не ограничиваясь этим, множество сегментов гена VH, DH и JH человека, функционально связанных с одним или более генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина). В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, являются гетерозиготными по сконструированному локусу легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе, и гетерозиготным по локусу тяжелой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, являются гомозиготными по сконструированному локусу легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе, и гомозиготным по локусу тяжелой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина.

[00353] В некоторых вариантах осуществления при условии, что животные, не являющиеся человеком, получены с возможностью дополнительно содержать локус тяжелой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина (например, включая, но не ограничиваясь этим, множество сегментов гена VH, DH и JH человека, функционально связанных с одним или более генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина) и локус легкой цепи κ гуманизированного иммуноглобулина (например, включая, но не ограничиваясь этим, множество сегментов гена Vκ и Jκ человека, функционально связанные с геном константной области легкой цепи κ иммуноглобулина грызунов на эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, являются гетерозиготными по локусу тяжелой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина и дополнительно содержат один эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, который содержит множество сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанные с геном константной области легкой цепи λ иммуноглобулина грызунов (т.е., сконструированным локусом легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе), и другой эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, имеющий множество сегментов гена Vκ и Jκ человека, функционально связанных с геном константной области легкой цепи κ иммуноглобулина грызунов. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, являются гомозиготными по локусу тяжелой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина и дополнительно содержат эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, который содержит множество сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанные с геном константной области легкой цепи λ иммуноглобулина грызунов (т.е., сконструированным локусом легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием в данном документе), и другой эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, имеющий множество сегментов гена Vκ и Jκ человека, функционально связанных с геном константной области легкой цепи κ иммуноглобулина грызунов.

[00354] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, имеют геном, содержащий (а) гомозиготный или гетерозиготный локус тяжелой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина, содержащий сегменты гена VH, DH и JH человека, функционально связанные с одним или более эндогенными константными областями тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, так что животное, не являющееся человеком, экспрессирует тяжелую цепь иммуноглобулина, которая содержит последовательность домена VH человека, конденсированную с последовательностью домена CH, не принадлежащего человеку; (b) первый локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий сегменты гена Vλ и Jλ человека, функционально связанные с геном Сλ иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, таким образом, что животное, не являющееся человеком, экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина, которая содержит последовательность домена Vλ человека, конденсированную последовательностью домена Сλ, не принадлежащего человеку; и (с) второй локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий сегменты гена Vκ и Jκ человека, функционально связанные с эндогенным геном Сκ, не принадлежащим человеку, таким образом, что животное, не являющееся человеком, экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина, которая содержит последовательность домена Vκ человека, конденсированную с последовательностью домена Сκ мыши.

[00355] В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, имеют геном, содержащий (а) гомозиготный или гетерозиготный локус тяжелой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина, содержащий сегменты гена VH, DH и JH человека, функционально связанные с одним или более эндогенными константными областями тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, так что животное, не являющееся человеком, экспрессирует тяжелую цепь иммуноглобулина, которая содержит последовательность домена VH человека, конденсированную с последовательностью домена CH, не принадлежащего человеку; (b) первый локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий сегменты гена Vλ и Jλ человека, функционально связанные с геном Сλ иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, таким образом, что животное, не являющееся человеком, экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина, которая содержит последовательность домена Vλ человека, конденсированную последовательностью домена Сλ, не принадлежащего человеку; и (с) второй локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий сегменты гена Vκ и Jκ человека, функционально связанные с эндогенным геном Сκ, не принадлежащим человеку, таким образом, что животное, не являющееся человеком, экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина, которая содержит последовательность домена Vκ человека, конденсированную с последовательностью домена Сκ мыши; и (d) гомозиготный или гетерозиготный, функционально инактивированный или удаленный, полностью или частично, эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина.

[00356] Например в соответствии с описанием в настоящем документе, животные, не являющиеся людьми, содержащие сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в настоящем документе, могут дополнительно включать (например, посредством стратегий перекрестного размножения или множественного нацеливания на гены) одну или более модификаций, как описано в патентах США №№8,642,835, 8,697,940, 9,006,511, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 и 9,163,092, каждый из которых включен в полном объеме посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, дополнительно содержат гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (например, локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий сегменты гена VH, DH и JH человека, функционально связанные с одним или более генами константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку). В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, дополнительно содержат гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина и нефункциональный эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина (например, удаленный полностью или частично, или иным образом сделанный нефункциональным).

В некоторых вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, содержат локус легкой цепи κ иммуноглобулина, имеющий сегменты гена Vλ и Jλ человека, функционально связанные с геном Сλ человека или не принадлежащим человеку, расположенным на месте гена Сκ, не принадлежащего человеку, и второй локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий сегменты гена Vκ и Jκ человека, функционально связанные с эндогенным геном Сκ, не принадлежащим человеку. В таких вариантах осуществления предоставленные животные, не являющиеся человеком, называются гемизиготными в отношении сконструированного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления указанные гемизиготные животные, не являющиеся человеком, представленные в настоящем документе, дополнительно содержат гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления указанные гемизиготные животные, не являющиеся человеком, представленные в настоящем документе, дополнительно содержат гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина и нефункциональный эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина.

Способы использования предоставленных животных, не являющихся человеком, а также клеток или тканей, не принадлежащих человеку

[00357] Животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, можно использовать в качестве платформы для разработки антител. В частности, животные, не являющиеся человеком, описанные в данном документе, представляют собой особенно выгодную платформу для генерации и идентификации вариабельных доменов легкой цепи лямбда человека и антител, которые включают такие вариабельные домены легкой цепи лямбда человека.

[00358] Соответственно, настоящее раскрытие предусматривает, что животные, не являющиеся человеком, описанные в данном документе, могут использоваться в способах получения антител. Антитела, полученные в соответствии с настоящим раскрытием, могут включать, например, человеческие антитела, химерные антитела, обратные химерные антитела, фрагменты любого из таких антител или их комбинации.

[00359] В некоторых вариантах осуществления изобретения животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, можно использовать для получения человеческого антитела (например, полностью человеческого антитела), причем такое человеческое антитело содержит вариабельные области, полученные из последовательностей нуклеиновых кислот, кодируемых генетическим материалом клетки животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, иммунизируют исследуемым антигеном в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы животное, не являющееся человеком, развило иммунный ответ на указанный исследуемый антиген. Антитела и/или последовательности антител (т.е., последовательности, которые кодируют часть антитела, например, последовательность вариабельной области) выделяют и/или идентифицируют у иммунизированного таким образом животного, не являющегося человеком (или одной или более клеток, например, одной или более В-клеток), и характеризуют с использованием различных анализов, измеряющих, например, аффинность, специфичность, картирование эпитопа, способность блокировать взаимодействие лиганд-рецептор, ингибирование активации рецептора и т.д. В различных вариантах осуществления антитела, продуцируемые животными, не являющимися человеком, в соответствии с описанием в данном документе, содержат одну или более вариабельных областей человека, которые получены из одной или более нуклеотидных последовательностей вариабельной области человека, выделенных из животного, не являющегося человеком. В некоторых вариантах осуществления антитела к препарату (например, антитело к идиотипу) могут быть получены у животных, не являющихся людьми, в соответствии с описанием в данном документе. В различных вариантах осуществления антитела, продуцируемые животными, не являющимися человеком, в соответствии с описанием в данном документе, являются обратными химерными антителами, которые содержат вариабельный домен легкой цепи человека и константный домен легкой цепи, не принадлежащий человеку (например, грызуна), и/или вариабельный домен тяжелой цепи человека и константный домен тяжелой цепи, не принадлежащий человеку (например, грызуна).

[00360] В различных вариантах осуществления антитела, продуцируемые животными, не являющимися человеком, содержат тяжелые и легкие цепи, имеющие вариабельный домен человека и константный домен, не принадлежащий человеку. В некоторых вариантах осуществления антитела, продуцируемые животными, не являющимися человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, являются обратными химерными антителами, которые включают вариабельный домен легкой цепи человека и константный домен легкой цепи, не принадлежащий человеку (например, грызуна). В некоторых вариантах осуществления антитела, продуцируемые животными, не являющимися человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, являются обратными химерными антителами, которые включают вариабельный домен тяжелой цепи человека и константный домен тяжелой цепи, не принадлежащий человеку (например, грызуна).

[00361] В некоторых вариантах осуществления предоставленные способы включают иммунизацию животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, представляющим интерес антигеном. В некоторых вариантах осуществления предоставленные способы включают идентификацию лимфоцитов (например, клонально отобранных лимфоцитов) указанного животного, не являющегося человеком, где лимфоцит экспрессирует антитело, которое связывает (например, специфически связывает) исследуемый антиген. В некоторых вариантах реализации лимфоцит представляет собой В-клетку. В некоторых вариантах осуществления последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи лямбда человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи каппа человека получают из лимфоцита (например, В-клетки) и/или идентифицируют (например, путем генотипирования, например, путем секвенирования). В некоторых вариантах осуществления аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи человека, вариабельного домена легкой цепи лямбда человека и/или вариабельного домена легкой цепи каппа человека получают из лимфоцита (например, В-клетки) и/или идентифицируют (например, путем секвенирование). В некоторых вариантах осуществления последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательность вариабельной области легкой цепи лямбда человека и/или последовательность вариабельной области легкой цепи каппа человека из В-клетки животного, не являющегося человеком, экспрессируют в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления вариант последовательности вариабельной области тяжелой цепи человека, последовательности вариабельной области легкой цепи лямбда человека и/или последовательности вариабельной области легкой цепи каппа человека из В-клетки животного, не являющегося человеком, экспрессируется в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления вариант включает одну или более мутаций. В некоторых вариантах осуществления одна или более мутаций могут улучшить фармакокинетические и/или фармакодинамические свойства антитела, включая вариант. В некоторых вариантах осуществления одна или более мутаций могут улучшать специфичность, аффинность и/или иммуногенность антитела, включая вариант.

[00362] В некоторых вариантах осуществления способы получения человеческого антитела включают идентификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека и/или вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека из животного, не являющегося человеком, описанного в данном документе; и (i) присоединение или лигирование нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, тем самым образуя последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина человека, кодирующую полностью человеческую тяжелую цепь иммуноглобулина, (ii) присоединение или лигирование нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельный домен легкой цепи λ иммуноглобулина человека, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен легкой цепи λ иммуноглобулина человека, тем самым образуя последовательность легкой цепи λ иммуноглобулина человека, кодирующую полностью человеческую легкую цепь λ иммуноглобулина, и/или (iii) присоединение или лигирование нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельный домен легкой цепи κ иммуноглобулина человека, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен легкой цепи κ иммуноглобулина человека, тем самым образуя последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человека, кодирующая полностью человеческий легкую цепь κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина человека и (i) последовательность легкой цепи λ иммуноглобулина человека или (ii) последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человека экспрессируется в клетке (например, клетке-хозяине, клетке млекопитающего), таким образом, что полностью человеческие тяжелые цепи иммуноглобулина и (i) полностью человеческие легкие цепи λ иммуноглобулина или (ii) полностью человеческие легкие цепи κ иммуноглобулина экспрессируются и образуют антитела человека. В некоторых вариантах осуществления антитела человека выделяют из клетки или культуральной среды, включая клетку.

[00363] Животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, можно использовать для идентификации последовательности нуклеотида или нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен человека, генерируемый животным, не являющимся человеком, описанным в данном документе, например, как часть антитела к эпитопу или антигену.

[00364] Животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, можно использовать для идентификации аминокислотной последовательности человеческого вариабельного домена, вырабатываемого животным, не являющимся человеком, описанным в данном документе, например, как часть антитела к эпитопу или антигену

[00365] Животные, не являющиеся человеком в соответствии с описанием в данном документе, обеспечивают улучшенную систему in vivo и источник биологических материалов (например, таких как клетки, нуклеотиды, полипептиды, белковые комплексы) для продуцирования человеческих антител, которые полезны для различных анализов. В различных вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, используются для разработки терапевтических средств, которые нацелены на интересующий полипептид (например, трансмембранный или секретируемый полипептид) и/или модулируют одну или более активностей, связанных с указанным исследуемым полипептидом, и/или модулируют взаимодействия указанного представляющего интерес полипептида с другими партнерами по связыванию (например, с полипептидом лиганда или рецептора). Например, в различных вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком в соответствии с описанием в данном документе, используются для разработки терапевтических средств, которые нацелены на один или более рецепторных полипептидов, модулируют активность полипептида рецептора и/или модулируют взаимодействия полипептида рецептора с другими партнерами по связыванию. В различных вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, используются для идентификации, скрининга и/или разработки возможных терапевтических средств (например, антител, миРНК и т.д.), которые связывают один или более представляющих интерес полипептидов. В различных вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, используются для скрининга и разработки возможных лекарственных средств (например, антител, миРНК и т.д.), которые блокируют активность одного или более представляющих интерес полипептидов или которые блокируют активность одного или более представляющих интерес рецепторных полипептидов. В различных вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, используются для определения профиля связывания антагонистов и/или агонистов одного или более представляющих интерес полипептидов. В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, используются для определения эпитопа или эпитопов одного или более потенциальных терапевтических антител, которые связывают один или более представляющих интерес полипептидов.

[00366] В различных вариантах осуществления животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, используют для определения фармакокинетических профилей одного или более кандидатов на антитела человека. В различных вариантах осуществления одно или более животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, и одно или более контрольных или эталонных животных, не являющихся человеком, подвергают воздействию одного или более кандидатов на антитела человека в различных дозах (например, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/мг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг или более). Терапевтические антитела-кандидаты могут быть дозированы любым желаемым путем введения, включая парентеральный и непарентеральный пути введения. Парентеральные пути включают, например, внутривенный, внутриартериальный, внутрипортальный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, внутриспинальный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, внутричерепной, внутриплевральный или другие пути введения. Непарентеральные пути включают, например, пероральный, назальный, трансдермальный, легочный, ректальный, буквальный, вагинальный, глазной. Введение также может осуществляться путем непрерывной инфузии, местного введения, замедленного высвобождения из имплантатов (гелей, мембран или тому подобного) и/или внутривенной инъекции. Кровь забирают у животных, не являющихся человеком (гуманизированных и контрольных), в различные моменты времени (например, 0 часов, 6 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней или до 30 и более дней). Различные анализы могут быть выполнены для определения фармакокинетических профилей вводимых терапевтических антител-кандидатов с использованием образцов, полученных у животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, включая, но не ограничиваясь ими, общий IgG, ответ антитерапевтического антитела, агглютинацию и т.д.

[00367] В различных вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, используют для измерения терапевтического эффекта блокирования или модуляции активности представляющего интерес полипептида и влияния на экспрессию генов в результате клеточных изменений или, в контексте рецепторного полипептида, плотность рецепторного полипептида на поверхности клеток у животных, не являющихся человеком. В различных вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, или клетки, выделенные из него, подвергают воздействию потенциального терапевтического средства, которое связывает интересующий полипептид, и после последующего периода времени анализируют для оценки воздействия на специфические клеточные процессы, которые связаны с указанным представляющим интерес полипептидом, например, взаимодействия лиганд-рецептор или передача сигнала.

[00368] Животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, экспрессируют вариабельные области человеческого антитела, таким образом, клетки, клеточные линии и клеточные культуры могут быть получены в качестве источника вариабельных областей человеческого антитела для использования в связывании и функциональных анализах, например, для анализа связывания или функции антагониста или агониста, в частности, когда антагонист или агонист специфичен для представляющего интерес человеческого антигена или специфичен для эпитопа, который функционирует во взаимодействии лиганд-рецептор (связывание). В различных вариантах осуществления эпитопы, связанные с потенциальными терапевтическими антителами или миРНК, могут быть определены с использованием клеток, выделенных из животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в данном документе.

[00369] Клетки от предоставленных животных, не являющихся человеком, могут быть выделены и использованы в соответствии с ситуацией или могут поддерживаться в культуре в течение многих поколений. В различных вариантах осуществления клетки от предоставленного животного, не являющегося человеком, иммортализованы (например, посредством использования вируса) и сохраняются в культуре неограниченное время (например, в серийных культурах).

[00370] В некоторых вариантах осуществления клетка, не принадлежащая человеку, представляет собой лимфоцит, не принадлежащий человеку. В некоторых вариантах осуществления клетка, не принадлежащая человеку, выбрана из В-клетки, дендритной клетки, макрофага, моноцита и Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка, не принадлежащая человеку, представляет собой незрелую В-клетку, зрелую наивную В-клетку, активированную В-клетку, В-клетку памяти и/или плазматическую клетку.

[00371] В некоторых вариантах осуществления клетка, не принадлежащая человеку представляет собой эмбриональную стволовую клетку (ES), не принадлежащую человеку. В некоторых вариантах осуществления ES-клетка, не принадлежащая человеку, представляет собой ES-клетку грызуна. В некоторых определенных вариантах осуществления ES-клетка грызуна представляет собой ES-клетку мыши, принадлежащей к линии 129, линии C57BL, BALB/c или их смеси. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и представляет собой смесь линий 129 и C57BL. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и представляет собой смесь линий 129, C57BL и BALB/c.

[00372] В некоторых вариантах осуществления предусмотрено использование клетки ES, не принадлежащей человеку, в соответствии с описанием в данном документе, для получения животного, не являющегося человеком В некоторых определенных вариантах осуществления ES-клетка, не принадлежащая человеку, представляет собой ES-клетку мыши и используется для получения мыши, содержащей сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления ES-клетка, не принадлежащая человеку, представляет собой ES-клетку крысы и используется для получения крысы, содержащей сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе.

[00373] В некоторых вариантах осуществления ткань, не принадлежащая человеку, выбрана из жировой ткани, мочевого пузыря, мозга, молочной железы, костного мозга, глаза, сердца, кишечника, почек, печени, легких, лимфатического узла, мышц, поджелудочной железы, плазмы, сыворотки, кожи, селезенки, желудка, тимуса, яичка, яйцеклетки и их комбинации.

[00374] В некоторых вариантах осуществления предоставляется иммортализованная клетка, изготовленная, произведенная или полученная из выделенной клетки или ткани, не принадлежащей человеку, в соответствии с описанием в данном документе.

[00375] В некоторых вариантах осуществления предоставляется эмбрион, не принадлежащий человеку, полученный, созданный, произведенный или полученный из клетки ES, не принадлежащей человеку, в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбрион, не принадлежащий человеку, представляет собой эмбрион грызуна; в некоторых вариантах осуществления эмбрион мыши; в некоторых вариантах осуществления эмбрион крысы.

[00376] Животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в данном документе предоставляют систему in vivo для создания вариантов вариабельных областей человеческого антитела, которые связывают представляющий интерес полипептид (например, варианты домена Vλ человека). Такие варианты включают вариабельные области человеческого антитела, имеющие желаемую функциональность, специфичность, низкую перекрестную реактивность к общему эпитопу, разделяемую двумя или более вариантами представляющего интерес полипептида. В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, используются для создания панелей вариабельных областей антитела человека, которые содержат серию вариабельных областей варианта, которые подвергают скринингу на предмет желаемой или улучшенной функциональности.

[00377] Животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, предоставляют систему in vivo для создания библиотек вариабельных областей человеческого антитела (например, доменной библиотеки Vλ человека). Такие библиотеки обеспечивают источник последовательностей вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепи, которые могут быть введены в различные области Fc на основе желаемой эффекторной функции, для использования в качестве источника для созревания аффинности последовательности вариабельной области с использованием методик, известных в данной области техники (например, сайт-направленный мутагенез, подверженная ошибкам ПЦР и т.д.) и/или для использования в качестве источника компонентов антител для генерации терапевтических молекул на основе антител, таких как, например, химерные антигенные рецепторы (т.е., молекулы, сконструированные с использованием компонентов антител, например, scFv), мультиспецифичные связывающие агенты (например, биспецифичные связывающие агенты) и конденсированные белки (например, однодоменные антитела, scFvs и т.д.).

[00378] В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения антитела у животного, не являющегося человеком, причем способ включает стадии (а) иммунизации животного, не являющегося человеком, описанным в данном документе представляющим интерес антигеном; (b) содержание животного, не являющегося человеком, в условиях, достаточных для того, чтобы животное, не являющееся человеком, выработало иммунный ответ на исследуемый антиген; и (с) извлечение из животного, не являющегося человеком, или клетки, не принадлежащей человеку, антитела, которое связывает исследуемый антиген.

[00379] В некоторых вариантах осуществления способа получения антитела у животного, не являющегося человеком, клетка, не принадлежащая человеку, представляет собой В-клетку. В некоторых вариантах осуществления способа получения антитела у животного, не являющегося человеком, клетка, не принадлежащая человеку, представляет собой гибридому.

[00380] В некоторых вариантах осуществления предоставлено животное, не являющееся человеком, чей геном зародышевой линии содержит гомозиготный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий (i) Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 человека или любую их комбинацию, (ii) J Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 человека или любую их комбинацию и (iii) ген Сλ человека или не принадлежащий человеку, где (i)-(iii) функционально связаны друг с другом, ген Сλ человека или не принадлежащий человеку вставлен на место гена Сκ, не принадлежащего человеку, эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина, сегмент(-ы) гена Vλ человека включают некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с соответствующими сегментами гена Vλ в эндогенном локусе легкой цепи λ человека и сегмент(-ы) гена Jλ человека включают некодирующую ДНК человека, которая естественным образом расположена рядом с соответствующими сегментами гена Vλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ человека. В некоторых определенных вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, ген Сλ, не принадлежащий человеку, представляет собой или содержит ген Сλ1 мыши. В некоторых определенных вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, ген Сλ человека представляет собой или содержит ген Сλ2 человека. В некоторых определенных вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансеры легкой цепи κ иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, Еκi и 3' Еκ. В некоторых определенных вариантах осуществления предоставленного животного, не являющегося человеком, эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина включает делецию генных сегментов Vκ и Jκ, не принадлежащих человеку.

[00381] В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, полученное способом, включающим стадии: (а) предоставления животного, не являющегося человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе; (b) иммунизации животного, не являющегося человеком, представляющим интерес антигеном; (с) содержания животного, не являющегося человеком, в условиях, достаточных для того, чтобы животное, не являющееся человеком, выработало иммунный ответ на представляющий интерес антиген; и (d) выделение антитела из животного, не являющегося человеком, или клетки, не принадлежащей человеку, которое связывает исследуемый антиген, где антитело (d) включает домены VH и Vλ человека.

[00382] В некоторых вариантах осуществления антитела, полученного этим способом, домен VH человека, кодируемый перестроенной вариабельной областью тяжелой цепи человека, содержит VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 VH6-1 или их соматически гипермутированный вариант.

[00383] В некоторых вариантах осуществления антитела, полученного таким способом, домен Vλ человека, кодируемый переставленной вариабельной областью легкой цепи λ человека, содержащей Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Yλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 Vλ3-1 человека или его соматически гипермутированный вариант.

[00384] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, в соответствии с описанием в настоящем документе, предоставляется для использования при изготовлении и/или разработке лекарственного средства (например, антитела или его фрагмента) для терапии или диагностики.

[00385] В некоторых вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, клетка, не принадлежащая человеку или ткань, не принадлежащая человеку, в соответствии с описанием в настоящем документе, предназначено для использования в производстве лекарственного средства для лечения, профилактики или ослабления заболевания, расстройства или состояния.

[00386] В некоторых вариантах осуществления предусматривается использование животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку или ткани, не принадлежащей человеку, в соответствии с описанием в настоящем документе, при изготовлении и/или разработке лекарственного средства или вакцины для применения в медицине, такого как применение в качестве лекарственного средства.

[00387] В некоторых вариантах осуществления предусмотрено использование животного, не являющегося человеком, или клетки, не принадлежащей человеку, в соответствии с описанием в настоящем документе, для производства и/или разработки антитела или его фрагмента.

[00388] Животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, обеспечивают систему in vivo для анализа и тестирования лекарственного средства или вакцины. В различных вариантах осуществления лекарство или вакцина-кандидат могут быть доставлены одному или более животным, не являющимся людьми, в соответствии с описанием в данном документе, с последующим мониторингом животных, не являющихся людьми, для определения одной или более иммунных реакций на лекарство или вакцину, профиль безопасности лекарственного средства или вакцины, или влияние на заболевание или состояние и/или один или более симптомов заболевания или состояния. Типичные методы, используемые для определения профиля безопасности, включают измерения токсичности, оптимальной концентрации дозы, ответа антител (то есть, ответ антител на препарат), эффективности лекарственного средства или вакцины и возможных факторов риска. Такие лекарства или вакцины могут быть улучшены и/или разработаны с использованием таких животных, не являющихся человеком.

[00389] Эффективность вакцины можно определять рядом способов. Вкратце, животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, вакцинируют, используя способы, известные в данной области, и затем выполняют контрольное заражение, или вакцину вводят уже инфицированным животным, не являющимся людьми. Ответ животных, не являющихся человеком, на вакцину может быть измерен путем мониторинга и/или выполнения одного или более анализов показателей животных, не являющихся человеком (или клеток, выделенных из него), для определения эффективности вакцины. Ответ животных, не являющихся человеком, на вакцину затем сравнивают с контрольными животными, используя один или более показателей, известных в данной области и/или описанных в данном документе.

[00390] Эффективность вакцины может быть дополнительно определена с помощью анализов вирусной нейтрализации. Вкратце, животных, не являющихся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, иммунизируют, и сыворотку собирают в различные дни после иммунизации. Последовательные разведения сыворотки предварительно инкубируют с вирусом, в течение чего специфические для вируса антитела в сыворотке будут связываться с ним. Затем смесь вируса с сывороткой добавляется к пермиссивным клеткам для определения инфекционности с помощью анализа бляшек или анализа микронейтрализации. Если антитела в сыворотке нейтрализуют вирус, будет выявлено меньше бляшек или меньше относительных единиц люциферазы по сравнению с контрольной группой.

[00391] Животные, не являющиеся человеком в соответствии с описанием в данном документе, продуцируют вариабельные области антител человека и, следовательно, обеспечивают систему in vivo для продуцирования антител человека для использования в диагностических применениях (например, в иммунологии, серологии, микробиологии, клеточной патологии и т.д.). В различных вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в настоящем документе, могут быть использованы для получения вариабельных областей антитела человека, которые связывают соответствующие антигенные сайты, для идентификации клеточных изменений, таких как, например, экспрессия специфических маркеров клеточной поверхности, указывающих на патологические изменения. Такие антитела могут быть конъюгированы с различными химическими веществами (например, радиоактивным индикатором) и могут быть использованы в различных анализах in vivo и/или in vitro по желанию.

[00392] Животные, не являющиеся человеком, в соответствии с описанием в данном документе, обеспечивают улучшенную систему in vivo для разработки и отбора антител человека для применения при онкологии и/или инфекционных заболеваниях. В различных вариантах осуществления животным, не являющимся человеком в соответствии с описанием в данном документе, и контрольным животным, не являющимся человеком (например, имеющим генетическую модификацию, которая отличается от описанной здесь, или не имеющих генетической модификации, т.е., дикого типа), могут быть имплантированы опухоли (или опухолевые клетки) или они могут быть инфицированы вирусом (например, вирусом гриппа, ВИЧ, HCV, HPV и т.д.). После имплантации инфекции животным, не являющимся человеком, можно назначать терапевтическое средство-кандидат. Опухоли или вирусу может быть предоставлено достаточно времени для развития в одной или более локациях внутри животных, не являющихся человеком, до введения потенциального терапевтического средства. Альтернативно и/или дополнительно, у таких животных, не являющимся человеком, может контролироваться иммунный ответ для характеризации и выбора потенциальных человеческих антител, которые могут быть разработаны в качестве терапевтического средства.

Фармацевтические композиции

[00393] В некоторых вариантах осуществления антитело, нуклеиновая кислота или их терапевтически значимая часть, продуцируемые животным, отличным от человека, раскрытым в настоящем документе, или полученные из антитела, нуклеиновой кислоты или их терапевтически значимой части, продуцируемой животным, не являющимся человеком, раскрытым в данном документе, могут быть введены субъекту (например, человеку). В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает антитело, продуцируемое животным, не являющимся человеком, раскрытым в данном документе. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может включать буфер, разбавитель, наполнитель или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления композиция, если это желательно, также может содержать одно или более дополнительных терапевтически активных веществ.

[00394] Хотя описания фармацевтических композиций, представленные в данном документе, в основном направлены на фармацевтические композиции, которые подходят для этичного введения людям, специалисту в данной области техники будет понятно, что такие композиции обычно подходят для введения животным всех видов. Модификация фармацевтических композиций, подходящих для введения людям для того, чтобы сделать композиции, подходящие для введения различным животным, хорошо понятна, и квалифицированный ветеринарный фармаколог может разработать и/или выполнить такую модификацию с помощью обычных, если таковые имеются, экспериментов.

[00395] Например, фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, может быть представлена в стерильной форме для инъекций (например, в форме, которая подходит для подкожной инъекции или внутривенной инфузии). Например, в некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции предоставляются в жидкой лекарственной форме, которая подходит для инъекции. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предоставляется в виде порошков (например, лиофилизированных и/или стерилизованных), необязательно под вакуумом, которые могут быть восстановлены водным разбавителем (например, водой, буфером, солевым раствором и т.д.) перед инъекцией. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции разбавляют и/или восстанавливают в воде, растворе хлорида натрия, растворе ацетата натрия, растворе бензилового спирта, физиологическом растворе с фосфатным буфером и т.д. В некоторых вариантах осуществления порошок следует осторожно смешивать с водным разбавителем (например, не встряхивая).

[00396] Составы фармацевтических композиций, описанных в данном документе, могут быть получены любым способом, известным или разработанным в дальнейшем в области фармакологии. В целом, такие способы приготовления могут включать стадию объединения активного ингредиента с разбавителем или другим наполнителем или одним или более другими вспомогательными ингредиентами, а затем, при необходимости и/или желательности, формования и/или упаковку продукта в желаемую емкость однократной или многократной дозы.

[00397] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, включающая в себя антитело, продуцируемое животным, не являющимся человеком, описанным в данном документе, может быть включена в контейнер для хранения или введения, например, флакон, шприц (например, шприц для внутривенного вливания) или пакет (например, пакет для внутривенной инфузии). Фармацевтическая композиция в соответствии с данным раскрытием может быть получены, упакованы и/или проданы оптом, в виде единичной дозы и/или в виде единичных унифицированных доз. Используемый в данном документе термин «единичная доза» представляет собой дискретное количество фармацевтической композиции, содержащее заданное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который вводится субъекту и/или удобной фракции такой дозы, такой как, например, половина или треть такой дозы.

[00398] Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого наполнителя и/или любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции в соответствии с раскрытием будут варьироваться в зависимости от индивидуальных особенностей, телосложения и/или состояния субъекта, которого лечат, и, кроме того, в зависимости от пути введения композиции. В качестве примера композиция может содержать от 0,1% до 100% (мас./мас.) активного ингредиента.

[00399] Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, который, при использовании в данном документе, включает в себя любые и все растворители, дисперсионные среды, разбавители или другие жидкие носители, дисперсионные или суспензионные добавки, поверхностно-активные агенты, изотонические агенты, загущающие или эмульгирующие агенты, консерванты, твердые связующие носители, смазывающие вещества и тому подобное, подходящие для конкретной желаемой лекарственной формы. В Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A.R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) раскрыты различные наполнители, используемые при составлении фармацевтических композиций, и известные методы их приготовления. За исключением того, что любая среда со стандартным наполнителем может быть несовместима с веществом или его производными, например, вызывая любой нежелательный биологический эффект или иным вредным образом взаимодействуя с любым другим компонентом(ами) фармацевтической композиции, ее использование также рассматривается в рамках настоящего изобретения.

[00400] В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый наполнитель имеет чистоту по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%. В некоторых вариантах осуществления наполнитель одобрен для применения у людей и для ветеринарного применения. В некоторых вариантах осуществления наполнитель одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США. В некоторых вариантах осуществления наполнитель является наполнителем фармацевтического качества. В некоторых вариантах осуществления наполнитель соответствует стандартам Фармакопеи США (USP), Европейской Фармакопеи (ЕР), Британской Фармакопеи и/или Международной Фармакопеи.

[00401] Фармацевтически приемлемые наполнители, используемые в производстве фармацевтических композиций, включают, но не ограничиваются ими, инертные разбавители, диспергирующие и/или гранулирующие агенты, поверхностно-активные агенты и/или эмульгаторы, разрыхляющие агенты, связывающие агенты, консерванты, буферные агенты, смазывающие агенты и/или масла. Такие наполнители могут быть необязательно включены в фармацевтические препараты. Наполнители такие как масло какао и воски для суппозиториев, красящие агенты, покрывающие агенты, подсластители, ароматизаторы и/или ароматизаторы, могут присутствовать в композиции на усмотрение разработчика.

[00402] В некоторых вариантах осуществления предоставленная фармацевтическая композиция содержит один или более фармацевтически приемлемых наполнителей (например, консервант, инертный разбавитель, диспергирующий агент, поверхностно-активный агент и/или эмульгатор, буферный агент и т.д.). В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит один или более консервантов. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции не содержат консерванта.

[00403] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предоставляется в форме, которая может быть охлаждена и/или заморожена. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предоставляется в форме, которая не может быть охлаждена и/или заморожена. В некоторых вариантах осуществления восстановленные растворы и/или жидкие лекарственные формы могут храниться в течение определенного периода времени после восстановления (например, 2 часа, 12 часов, 24 часа, 2 дня, 5 дней, 7 дней, 10 дней, 2 недели, месяц, два месяца или дольше). В некоторых вариантах осуществления хранение композиций антител в течение более длительного времени, чем указанное время, приводит к деградации антител.

[00404] Жидкие лекарственные формы и/или восстановленные растворы могут содержать твердые частицы и/или обесцвечиваться перед введением. В некоторых вариантах осуществления раствор не следует использовать, если он обесцвечен или замутнен, и/или если после фильтрации остаются твердые частицы.

[00405] Общие подходы по составлению и/или изготовлению фармацевтических агентов можно найти, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

Наборы

[00406] Настоящее раскрытие дополнительно предоставляет упаковку или набор, содержащий один или более контейнеров, заполненных по меньшей мере одним животным, не являющимся человеком, клеткой, не принадлежащей человеку, фрагментом ДНК, нацеленным вектором или любой их комбинацией в соответствии с описанием в данном документе. Наборы могут использоваться любым применимым методом (например, методом исследования). При желании с такими контейнерами может быть связано уведомление в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, причем это уведомление отражает (а) утверждение органа, регулирующего производство, использование или продажу веществ, предназначенных для введения человеку, (b) инструкции по применению и/или (с) контракт, который регулирует передачу материалов и/или биологических продуктов (например, животных, не являющихся человеком, или клеток, не принадлежащих человеку в соответствии с описанием в данном документе), между двумя или более сторонами, и их комбинации.

[00407] В некоторых вариантах осуществления предоставляется набор, содержащий животное, не являющееся человеком, клетку, не принадлежащую человеку, ткань, не принадлежащую человеку, иммортализованную клетку, ES-клетку, не принадлежащую человеку, или эмбрион, не принадлежащий человеку в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предоставляется набор, содержащий аминокислоту (например, антитело или его фрагмент) животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку, ткани, не принадлежащей человеку, иммортализованной клетки, клетки ES, не принадлежащей человеку, или эмбриона, не принадлежащего человеку в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предоставляется набор, содержащий нуклеиновую кислоту (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его фрагмент) животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку, ткани, не принадлежащей человеку, иммортализованной клетки, клетки ES, не принадлежащей человеку, или эмбриона, не принадлежащего человеку в соответствии с описанием в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предоставляется набор, содержащий последовательность (последовательность аминокислоты и/или нуклеиновой кислоты), идентифицированную из животного, не являющегося человеком, клетки, не принадлежащей человеку, ткани, не принадлежащей человеку, иммортализованной клетки, клетки ES, не принадлежащей человеку, или эмбриона, не принадлежащего человеку в соответствии с описанием в данном документе.

[00408] В некоторых вариантах осуществления предоставляется набор в соответствии с описанием в данном документе, для использования при изготовлении и/или разработке лекарственного средства (например, антитела или его фрагмента) для терапии или диагностики.

[00409] В некоторых вариантах осуществления предоставляется набор в соответствии с описанием в настоящем документе, для использования при производстве и/или разработке лекарственного средства (например, антитела или его фрагмента) для лечения, профилактики или ослабления заболевания, расстройства или состояния.

[00410] Другие признаки определенных вариантов осуществления станут очевидными из следующих описаний примерных вариантов осуществления, которые приведены для иллюстрации и не предназначены для его ограничения.

ПРИМЕРЫ

[00411] Следующие примеры приведены для того, чтобы описать специалистам в данной области техник варианты изготовления и использования способов и композиций, описанных в данном документе, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения рассматривают как свое изобретение. Если не указано иное, температура указана в градусах по Цельсию, а давление равно атмосферному или близко к нему.

Пример 1. Конструирование нацеленных векторов для создания грызуна, экспрессирующего по меньшей мере одну легкую цепь лямбда из локуса легкой цепи каппа

Пример 1.1. Разработка нацеленного вектора, содержащего константную область лямбда грызуна

[00412] Данный пример иллюстрирует примерные способы конструирования нацеленного вектора для встраивания в геном животного, не являющегося человеком, такого как грызун (например, мышь). Кроме того, данный пример демонстрирует получение животного, не являющегося человеком, чей геном зародышевой линии содержит сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина. В частности, данный пример демонстрирует конструирование нацеленного вектора для конструирования эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина у грызуна, так что грызун экспрессирует и/или вырабатывает антитела, которые включают легкие цепи λ, иммуноглобулина, имеющие вариабельные области человека и константные области λ (Сλ) иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, из указанного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина в геноме зародышевой линии животного, не являющегося человеком. Как описано ниже в Примере 2, фрагменты ДНК, содержащие более кодирующих последовательностей Jλ человека (например, Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 и Jλ7) и кодирующую последовательность Сλ грызуна (например, Сλ1 мыши) встраивают в эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина грызуна. В конкретных приведенных в качестве примера вариантах осуществления ген Сλ1 мыши вставлен на место гена Сκ мыши и функционально связан с энхансерами Ig к грызуна (например, Еκi и 3'Еκ). Примерная стратегия создания нацеленного вектора для создания сконструированного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина у грызуна, характеризующегося наличием множества сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанных с геном Сλ грызуна (например, мыши) и функционально связанных с эндогенными энхансерами Ig κ, представлены на фиг. 1 (фиг. 1А: начальные этапы конструирования нацеленного вектора; фиг. 1В: дополнительные последующие этапы конструирования нацеленного вектора; последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человека между сегментами гена Vλ и Jλ человека обозначена широкой полосой, заштрихованной широкими косыми линиями (например, см. патенты США №9,006,511, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 и 9,163,092), lox: lox2372; NEO: Ген устойчивости к неомицину (neoR) под транскрипционным контролем промотора убиквитина, HYG: Ген устойчивости к гигромицину (hygR) под транскрипционным контролем промотора убиквитина, Spec: Ген устойчивости к спектиномицину (SpecR), R6K: источник репликации R6K).

[00413] Нацеленный вектор, содержащий кодирующие последовательности Jλ человека и Сλ грызуна для встраивания в локус легкой цепи κ иммуноглобулина грызуна был создан с использованием технологии VELOCIGENE® (см., например, патент США №6,586,251 и Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9; включенный в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте) и методы молекулярной биологии, известные в данной области. Специалисты в данной области техники, ознакомившись с настоящим примером, оценят, что описанные технологии и подходы могут быть использованы для использования любых кодирующих последовательностей Jλ человека и Сλ или комбинации кодирующих последовательностей (или фрагментов последовательности) по желанию.

[00414] Вкратце, фрагмент ДНК объемом 2,7 т.п.н., содержащий сегменты гена Jλ человека Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 и Jλ7 и уникальные 5' и 3' области перекрытия, соответствующие (некодирующей) геномной последовательности Vκ-Jκ и геномной последовательности 5' гена Сκ мыши соответственно, был получен синтезом ДНК de novo (рА; фиг. 1А, вверху слева, Blue Heron Biotech, Bothell, WA). Различные фрагменты распознавания рестриктаз были включены во фрагмент ДНК для облегчения последующего клонирования маркеров селекции и других фрагментов ДНК (описано ниже). Фрагмент ДНК был уникально сконструирован с возможностью содержания некодирующих последовательностей Jκ человека, сопоставленных с кодирующими последовательностями Jλ человека и сигнальными последовательностями рекомбинации (RSS) Jλ человека. Как известно в данной области техники, RSS состоит из консервативного блока из семи нуклеотидов (гептамер), за которым следует спейсер длиной 12 или 23 пары оснований, за которым следует второй консервативный блок из девяти нуклеотидов (нонамер). Таким образом, RSS имеет конфигурацию 7-12-9 (12RSS) или 7-23-9 (23RSS) в зависимости от связанного сегмента гена (см., например, рисунок 5.4 в Murphy, Kenneth, et al. "Chapter 5." Jλneway's Immunobiology, 8th ed., Garland Science/Taylor & Francis Group, LLC, 2012, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки). В частности, сегменты гена Jλ, человека (то есть, кодирующие последовательности Jλ, человека) и связанные с ними 12RSS были замещены на месте сегментов гена Jκ человека (то есть, кодирующих последовательностей Jκ человека) и связанных с ними 23RSS. Таким образом, данный фрагмент содержал последовательности ДНК Jλ, и Jκ человека. Включение таких последовательностей в нацеленные векторы, описанные в данном документе, может обеспечить (или способствовать ему) эффективное присоединение сегментов гена Vλ и Jλ человека в сконструированном локусе легкой цепи κ Ig грызуна.

[00415] Плазмиду А(рА) расщепляли AgeI и EcoRI и лигировали в селекционную кассету неомицина (т.е. ген NeoR под контролем промотора убиквитина, фланкированного сайтами lox2372), содержащую совместимые концы, для создания плазмиды В(рВ) (фиг. 1А). Отдельно уникальные фрагменты ДНК, содержащие интронный энхансер (Ei) Ig κ мыши, ген Сλ1 мыши (из клона ВАС RP23-60e14), фрагмент ДНК, содержащий 316 п.н. последовательности расположенной непосредственно далее по ходу транскрипции относительно кодирующей последовательности Сκ мыши и 80 п.н. перекрывающейся последовательности для облегчения изотермической сборки, и сайты распознания рестрикционных ферментов (NotI, MluI) для облегчения последующих этапов клонирования, а также R6K-Spec (ген спектениномицин-аденилитрансферазы и источник репликации R6K) были амплифицированы посредством полимеразной цепной реакции (ПНР) и объединены вместе изотермической сборкой (см., например, Gibson, D.G. et.al., 2009, Nat. Meth. 6(5):343-5; Gibson, D.G. et al., 2010, Nat. Meth. 7:901-903; включенный в настоящее описание посредством ссылки во всей полноте) для создания плазмиды С(рС), которую затем расщепляли NotI и MluI и лигировали в селекционную кассету гигромицина (то есть, ген HygR под контролем промотора убиквитина, фланкированного сайтами loxР) содержащую совместимые концы для создания плазмиды D(pD; Фигура 1А, вверху и в центре справа). Данную полученную плазмиду (pD; фигура 1А, в центре) затем расщепляли PI-SceI и AscI и лигировали с плазмидой В(рВ), содержащей совместимые концы (фигура 1А, внизу), для получения плазмиды Е(рЕ).

[00416] На следующем этапе направленный вектор, содержащий сегменты гена Vλ и Jλ человека, функционально связанные с геном Сκ мыши и последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человека, расположенную между сегментами гена Vλ и Jλ человека (см., например, патент США №9,006,511, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки), отдельно расщепляли NotI и повторно лигировали для удаления области Vλ человека, включающей последовательность к иммуноглобулина человека (фиг. 1В, вверху), что привело к удалению ~ 137 КБ. Полученную конструкцию (конструкцию F) объединяли с плазмидой Е(рЕ) с использованием метода изотермической сборки CRISPR/Cas9 (см., например, патент США №9,738,897 и публикацию США №2016/0145646; полностью включенные в настоящее описание посредством ссылки) таким образом, что область Jκ человека с кодирующей последовательностью Jλ-12RSS (CDS) человека была функционально связана с межгенной (некодирующей) областью Vκ-Jκ человека (см., например, патент США №9,006,511, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки) и 3' энхансер Ig κ мыши (фиг. 1В). Положительные бактериальные клоны отбирали на средах, содержащих канамицин, гигромицин и спектиномицин. Полученный направленный вектор (конструкция G) содержал, от 5' до 3', сайт распознания loxР, сайт NotI, межгенную последовательность Vκ-Jκ человека (см., например, патент США №9,006,511, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки), селекционную кассету неомицина, фланкированную сайтами распознания lox2372, область Jκ человека с пятью сегментами гена Jλ человека и их соответствующими 12RSS, интронный энхансер (Eiκ) иммуноглобулина κ мыши, ген Сλ1 мыши, селекционную кассету гигромицина, фланкированную сайтами распознания loxР, 3' энхансер (3' Еκ) иммуноглобулина κ мыши и селекционную кассету спектиномицина (фиг. 1В).

Пример 1.2. Конструирование нацеленного вектора, содержащего константную область лямбда человека

[00417] Данный пример иллюстрирует примерные способы конструирования нацеленного вектора для встраивания в геном животного, не являющегося человеком, такого как грызун (например, мышь). Кроме того, этот пример демонстрирует создание животного, не являющегося человеком, чей геном зародышевой линии содержит сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина. В частности, данный пример демонстрирует конструирование нацеленного вектора для конструирования эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина у грызуна таким образом, что грызун экспрессирует и/или вырабатывает антитела, которые включают легкие цепи λ иммуноглобулина, имеющие вариабельные области человека и константную (Сλ) область иммуноглобулина λ человека из указанного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина в геноме зародышевой линии животного, не являющегося человеком. Как описано ниже в Примере 2, фрагменты ДНК, содержащие более кодирующих последовательностей Jλ человека (например, Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 и Jλ7) и кодирующую последовательность Сλ (например, Сλ2 человека) человека вставляются в эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина грызуна. В частности, ген Сλ2 человека вставлен на место гена Сκ мыши и функционально связан с энхансерами (например, Eiκ и 3'Еκ) к иммуноглобулина грызуна. Примерная стратегия создания нацеленного вектора показана на фиг. 3.

[00418] Вектор нацеливания, содержащий кодирующие последовательности Jλ, человека и Сλ человека для вставки в локус легкой цепи κ Ig грызуна был создан с использованием технологии VELOCIGENE® (см., например, патент США №6,586,251 и Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9; включенный в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте) и методы молекулярной биологии, известные в данной области. Специалисты в данной области техники, ознакомившись с настоящим примером, оценят, что описанный подход и технологии могут быть использованы для использования любых кодирующих последовательностей Jλ и Сλ человека или комбинации кодирующих последовательностей (или фрагментов последовательности) по желанию.

[00419] Вкратце, фрагмент ДНК размером 871 п.н., содержащий кодирующую последовательность Сλ человека и уникальные области перекрытия 5' и 3', соответствующие геномным последовательностям 5' и 3' гена Сκ мыши, соответственно, был получен путем синтеза ДНК de novo (рН; фиг. 3, вверху слева, Blue Heron Biotech, Bothell, WA). Различные фрагменты распознавания рестриктаз были включены во фрагмент ДНК для возможности последующего клонирования маркеров селекции и других фрагментов ДНК (описано ниже). Плазмиду Н (рН) расщепляли AgeI и XhoI и лигировали в селекционную кассету гидромицина (т.е. ген HygR под контролем промотора убиквитина, фланкированного сайтами loxP), содержащую совместимые концы, для создания плазмиды J (pJ, фиг. 3). Промежуточная конструкция (конструкция K, полученная из конструкции F и плазмиды В с использованием Cas9 и изотермической сборки), содержащая сконструированную область Jκ человека с кодирующими последовательностями Jλ человека (описанными выше), функционально связанные с геном Сκ мыши и энхансерами Ig κ мыши объединяли с плазмидой J с использованием метода изотермической сборки CRISPR/Cas9 (см., например, патент США №9,738,897 и публикацию США №2016/0145646; включенные в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте), так что область Jκ человека с кодирующей последовательностью Jλ.-12RSS человека (CDS) функционально связаны с кодирующей последовательностью Сλ2 плазмиды J (фиг. 3). Положительные бактериальные клоны отбирали на средах, содержащих канамицин, гигромицин и спектиномицин. Полученный направленный вектор (конструкция L) содержал, от 5' до 3', сайт распознания loxР, сайт NotI, межгенную последовательность Vκ-Jκ человека (см., например, патент США №9,006,511, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки), селекционную кассету неомицина, фланкированную сайтами распознания lox2372, область Jκ человека с пятью сегментами гена Jλ, человека и их соответствующими 12RSS, интронный энхансер (Eiκ) Ig κ мыши, ген Сλ2 человека, селекционную кассету гигромицина, фланкированную сайтами распознания loxР, 3' энхансер (3' Еκ) иммуноглобулина κ мыши и селекционную кассету спектиномицина (фиг. 3).

Пример 2. Поколение грызунов, имеющих сконструированный локус легкой цепи

[00420] Данный пример демонстрирует создание животных, не являющихся человеком (например, грызунов), чей геном зародышевой линии содержит эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий вставку множества сегментов гена Vλ и Jλ человека и ген Сλ грызуна или человека, где данные сегменты гена Vλ и Jλ, человека функционально связаны с указанным геном Сλ грызуна или человека, и где данный ген Сλ грызуна или человека вставлен на место гена Сκ грызуна эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина. Такие животные, не являющиеся человеком характеризуются в некоторых вариантах экспрессией легких цепей λ (вариабельных и константных доменов) иммуноглобулина из эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина.

[00421] Целевая вставка нацеленных векторов, описанных в примерах 1.1 и 1.2, была подтверждена посредством полимеразной цепной реакции. Целевая ДНК ВАС, подтвержденная полимеразной цепной реакцией, была введена в F1-гибридные (C57BL6NTac/129S6SvEvTac) эмбриональные стволовые (ES) клетки мыши путем электропорации с последующим культивированием в среде селекции.

[00422] Клетки ES, используемые для электропорации конструкции G (Сλ1 мыши) имел геном зародышевой линии, который включал гетерозиготный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий множество сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанный с геном константной области легкой цепи κ иммуноглобулина грызунов, включая энхансеры легкой цепи κ иммуноглобулина грызуна и последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человека, расположенную между сегментами гена Vλ и Jλ человека и одним локусом легкой цепи κ иммуноглобулина грызуна дикого типа. Клетки ES до и после электропорации изображены на фигуре 2А (1741 НЕТ: клон клетки ES грызуна, имеющий геном, гетерозиготный в отношении сконструированного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий сегменты гена Vλ и Jλ человека, функционально связанные с геном константной области легкой цепи κ иммуноглобулина грызунов, включая энхансеры легкой цепи κ иммуноглобулина грызуна и последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человека, расположенные между сегментами гена Vλ и Jλ человека, что обозначено широкой полосой, заштрихованной широкими косыми линиями, и локусами тяжелой и легкой цепи λ иммуноглобулина дикого типа, например, см. патенты США №№9,006,511, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 и 9,163,092, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки; 6557НЕТ: клон мышиных клеток ES после введения конструкции G, приводящий к получению генома, гетерозиготного в отношении сконструированного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина, включающего энхансеры легкой цепи κ иммуноглобулина грызуна, где сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина характеризуется наличием множества сегментов гена Vλ и Jλ, человека, где сегменты гена Jλ, человека содержатся в последовательности области Jκ человека с кодирующими последовательностями сегмента гена Jλ, человека и 12RSS Jλ, на месте соответствующих кодирующих последовательностей сегмента гена Jκ человека и 23RSS Jκ человека, и где такие сегменты гена Vλ и Jλ, человек функционально связаны с геном константной области легкой цепи λ иммуноглобулина грызунов (например, mCλ1); lox: lox2372; NEO: ген устойчивости к неомицину (neoR) под транскрипционным контролем промотора убиквитина; HYG: ген устойчивости к гигромицину (hygR) под транскрипционным контролем промотора убиквитина; местоположения выбранных наборов праймеров/зондов для скрининга клонов клеток ES указаны рядом с местоположениями областей внутри сконструированного локуса легкой цепи κ Ig, выявленным в анализе, описанном ниже).

[00423] Клетки ES, используемые для электропорации конструкции L (Сλ2 мыши) имел геном зародышевой линии, который включал гетерозиготный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий множество сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанный с геном константной области легкой цепи κ иммуноглобулина грызунов, включая энхансеры легкой цепи κ иммуноглобулина грызуна и последовательность легкой цепи κ иммуноглобулина человека, расположенную между сегментами гена Vλ и Jλ человека и одним локусом Ig κ грызуна дикого типа. Клетки ES до и после электропорации изображены на фиг. 4А (1741НЕТ: выше; 20029НЕТ: клон мышиных клеток ES после введения нацеленного вектора, имеющего геном, в отношении локуса легкой цепи κ Ig, включая энхансеры легкой цепи κ иммуноглобулин грызунов, где данный сконструированный локус легкой цепи κ Ig характеризуется наличием множества сегментов гена Vλ и Jλ, человека, где данные сегменты гена Jλ, человека содержатся в последовательности области Jκ человека с кодирующими последовательностями сегмента гена Jλ, человека и 12RSS Jλ, человека на месте соответствующих кодирующих последовательностей сегмента гена Jκ и 23RSS Jκ человека, и где данные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с геном константной области легкой цепи λ Ig человека (например, hCλ2); lox: lox 2372; NEO: ген устойчивости к неомицину (neoR) под транскрипционным контролем промотора убиквитина; HYG: ген устойчивости к гигромицину (hygR) под транскрипционным контролем промотора убиквитина; местоположения выбранных наборов праймеров/зондов для скрининга клонов клеток ES указаны рядом с местоположениями областей внутри сконструированного локуса легкой цепи κ Ig, выявленным в анализе, описанном ниже).

[00424] Устойчивые к лекарственным средствам колонии отбирали через 10 дней после электропорации и подвергали скринингу посредством TAQMAN™ и кариотипированию для оценки правильности нацеливания, как описано ранее (Valenzuela et al., выше; Frendewey, D. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:295-307, включенный в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте). В таблице 1 приведены типичные наборы праймеров/зондов, используемые для скрининга положительных клонов клеток ES (F: вперед; R: назад; Р: зонд; GOA: прирост аллеля; LOA: потеря аллеля; WT: дикий тип).

[00425] Метод VELOCFMOUSE® (DeChiara, Т.М. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:285-294; DeChiara, T.M., 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-324; Poueymirou et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99; включенный в настоящее описание посредством ссылки во всей полноте), в котором целевые клетки ES инъецировали в некомпактные эмбрионы Swiss Webster на 8-клеточной стадии, использовали для получения здоровых полностью полученных из клеток ES мышей поколения F0, гетерозиготных в отношении сконструированного локуса легкой цепи κ Ig (фиг. 2А и 4А). Гетерозиготных мышей поколения F0 скрещивали с мышами C57Bl6/NTac для получения гетерозигот F1, которые были скрещены для получения гомозиготных животных поколения F2 для фенотипического анализа.

[00426] Альтернативно, клетки ES мыши, несущие сконструированный локус иммуноглобулина κ в соответствии с описанием выше, может быть модифицирован для удаления одной или более селекционных кассет, введенных с вектором нацеливания, по желанию (фиг. 2В: 6557НЕТ: выше; 6558НЕТ: мышиный клон клеток ES после опосредованной рекомбиназой эксцизии селекционных кассет неомицина и гигромицина, вставленных после гомологичной рекомбинации нацеленным вектором; фиг. 4В: 20029НЕТ: выше; 20030НЕТ: мышиный клон клеток ES после опосредованной рекомбиназой эксцизии селекционных кассет неомицина и гигромицина, вставленных после гомологичной рекомбинации нацеленным вектором. Cre: рекомбиназа). Например, кассета неомицина и гигромицина, введенная нацеленными векторами, может быть удалена в сконструированных ES-клетках (или эмбрионах) путем временной экспрессии рекомбиназы или путем селекции на рекомбиназо-экспрессирующий генетически сконструированный штамм (см., Например, Lakso, М. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6; Orban, P.C. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6861-5; Gu, H. et al., 1993, Cell 73(6): 1155-64; Araki, K. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:160-4; Dymecki, S.M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(12):6191-6; каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки).

[00427] В совокупности, данный пример иллюстрирует создание грызуна (например, мыши), чей геном зародышевой линии содержит сконструированный локус легкой цепи κ Ig, характеризующийся наличием множества сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанных с геном Сλ грызуна или человека, где данный ген Сλ грызуна или человека вставлен на место гена Сκ грызуна эндогенного локуса легкой цепи κ Ig. Спроектированный локус легкой цепи κ Ig в соответствии с описанием включает множество сегментов гена Vλ и Jλ человека в неэндогенном расположении. Описанная в данном документе стратегия вставки сегментов гена Vλ и Jλ человека и гена Сλ грызуна или человека на место гена Сκ грызуна, позволяет создавать грызунов, которые экспрессируют антитела, содержащие исключительно домены Vλ человека. Было неясно, способен ли подобный сконструированный локус легкой цепи κ Ig, который включает исключительно сегменты гена λ (вне эндогенного локуса λ в неэндогенной ориентации) приводить к получению функциональных легких цепей. Как описано в данном документе, такие домены Vλ человека экспрессируются из эндогенных локусов легкой цепи κ Ig в геноме зародышевой линии предоставленных грызунов.

Пример 3. Характеристика грызунов, имеющих сконструированный локус легкой цепи иммуноглобулина

Пример 3,1. Фенотипическая оценка иммунных клеток у грызунов, имеющих сконструированный локус легкой цепи иммуноглобулина

[00428] Данный пример демонстрирует характеристику различных популяций иммунных клеток у грызунов (например, мышей), сконструированных с возможностью содержания множества сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанных с геном Сλ грызуна и энхансером легкой цепи κ иммуноглобулина грызуна и регуляторными областями внутри эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина. В частности, данный пример конкретно демонстрирует, что грызуны, имеющие описанные в данном документе сконструированные локусы легкой цепи κ иммуноглобулина демонстрируют уникальный профиль экспрессии легкой цепи по сравнению с грызунами дикого типа. Данный пример также демонстрирует, что предоставленные грызуны экспрессируют широкий спектр областей Vλ человека из сконструированного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина.

[00429] Вкратце, селезенки и бедренные кости собирали у мышей дикого типа (WT, 75% C57BL/6NTac 25% 129SvEvTac) и 6558НО (гомозиготных ПК, 75% C57BL/6NTac 25% 129SvEvTac). Костный мозг извлекали из бедренной кости путем промывки 1х фосфатно-солевым буфером (ФСБ, Gibco) с 2,5% фетальной бычьей сывороткой (ФБС). Эритроциты из препаратов селезенки и костного мозга лизировали буфером для лизиса АСК (Gibco) с последующим промыванием 1хФСБ с 2,5% ФБС,

[00430] Выделенные клетки (1×106) инкубировали с отобранными смесями антител в течение 30 минут при +4°С: антитело к mIgκ-FITC (187,1, BDBiosciences), антитело к MIgλ-PE (RML-42, BioLegend; 1060-09, Southern Biotech), антитело к mIgλ-FITC (106002, Bio-Rad; ABIN303989, Antibodies-online), антитело к IgM-PeCy7 мыши (II/41, eBioscience), антитело к IgD-PerCP/Cy5.5 мыши (11-26 с. 2а, BioLegend), антитело к CD3-Pacific Blue мыши (17А2, BioLegend), антитело к В220-АРС мыши (RA3-6B2, eBioscience), антитело к CD19-APC-H7 мыши (ID3, BDBiosciences). После окрашивания клетки промывали и фиксировали в 2% формальдегиде. Сбор данных проводился на проточном цитометре BD LSRFORTESSA™, анализ был проведен с использованием программного обеспечения FLOWJO™. Репрезентативные результаты представлены на фиг. 5-7.

[00431] Как показано на фиг. 5 и 6, мыши LiK демонстрируют сходное распределение CD19+ и незрелых/зрелых В-клеток по сравнению с мышами дикого типа в отделах селезенки и костного мозга соответственно. Однако мыши LiK демонстрируют уникальную экспрессию легкой цепи по сравнению с мышами дикого типа, экспрессия Igλ+ наблюдалась у этих мышей (фиг. 7). В частности, >90% CD19+ В-клеток у мышей LiK экспрессируют легкую цепь λ иммуноглобулина, тем самым подтверждая правильную рекомбинацию и экспрессию в сконструированном локусе иммуноглобулина κ. Как и ожидалось, учитывая, что у этих мышей отсутствует ген Сκ мыши, мыши LiK не показывают обнаруживаемой посредством проточной цитометрии экспрессии иммуноглобулина κ (т.е., антитело к mIgκ обнаруживает константную область). Подобные уровни экспрессии легкой цепи λ иммуноглобулина наблюдалась у дополнительных однопометных мышей LiK (данные не показаны). Экспрессия областей Vλ человека в онтексте области Сλ мыши из локуса LiK была подтверждена, среди прочего, анализом иммуноглобулинового спектра с использованием методов секвенирования следующего поколения (описанных в примере 3.2 ниже).

Пример 3,2. Спектр иммуноглобулинов у грызунов, имеющих сконструированный локус легкой цепи иммуноглобулина

[00432] Использование генов антител человека (то есть, сегментов гена VDJ) в сконструированной линии грызунов, описанной выше, определяли анализом спектра антител путем секвенирования следующего поколения. В частности, секвенирование ОТ-ПЦР проводили на РНК, выделенной из спленоцитов мышей, гомозиготных по локусу LiK (6558 НО), для подтверждения правильной транскрипции и рекомбинации локуса LiK. Репрезентативная иллюстрация перестроенного локуса LiK представлена на фигуре 12(локус LiK: сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе; перестроенный локус LiK: репрезентативная перестройка сконструированного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина (в настоящем документе называемого «локус LiK»), приводящий к рекомбинации Vλ-Jλ человека; перестроенная мРНК LiK: репрезентативная транскрипция и процессинг мРНК перестроенного локуса LiK).

[00433] Вкратце, В-клетки селезенки были положительно обогащены из общего количества спленоцитов путем магнитной сортировки клеток с использованием магнитных сфер с анти-CD19 мыши и колонок MACS® (Miltenyi Biotech). Суммарную РНК выделяли из очищенных В-клеток селезенки с использованием набора для выделения РНК RNeasy Plus (Qiagen) в соответствии со спецификациями производителя. Обратную транскрипцию проводили для получения кДНК, содержащей последовательность гена константной области иммуноглобулина λ с использованием набора для амплификации кДНК SMARTer(RACE (Clontech) и специфических праймеров иммуноглобулина λ (см. ниже). Во время этого процесса последовательность ДНК, обратно комплементарная 3' праймеру с переключением матрицы (TS), была присоединена к 3' концу вновь синтезированных кДНК. Очищенные Igλ-специфичные кДНК затем амплифицировали с помощью 1-го проведения реакции ПЦР с использованием TS-специфического праймера и обратных праймеров, специфичных к последовательностям Сλ1 мыши. Продукты ПЦР в диапазоне ~ 450-700 п.н. выделяли, используя Pippin Prep (SAGE Science), и затем эти фрагменты дополнительно амплифицировали посредством 2-го проведения реакции ПЦР. В таблице 2 приведены последовательности выбранных праймеров, использованных для построения библиотеки спектра (for: прямой праймер; rev: обратный праймер). Продукты ПЦР в диапазоне ~ 400-700 п.н. выделяли, очищали и количественно определяли с помощью КПЦР с использованием набора для количественного определения библиотек КАРА (КАРА Biosystems) перед загрузкой в секвенатор Miseq (Illumina) для секвенирования с использованием наборов реагентов Miseq v3 (2×300 циклов).

[00434] Для биоинформационного анализа последовательности Raw Illumina были демультиплексированы и отфильтрованы по качеству, длине и соответствию соответствующему праймеру гена константной области. Считывание данных перекрывающихся парных концов были объединены и проанализированы с использованием авторского внутреннего конвейера. В конвейере использовалась локальная установка IgBLAST (NCBI, v2.2.25+) для выравнивания перегруппированных последовательностей легкой цепи с базой данных сегментов гена Vλ и Jλ, зародышевой линей человека и обозначались как продуктивные, так и непродуктивные соединения наряду с наличием стоп-кодонов. Последовательности CDR3 и ожидаемые нешаблонные нуклеотиды были выделены с использованием границ, как определено в Международной информационной иммуногенетической системе (IMGT).

[00435] Большинство функциональных сегментов гена Vλ и Jλ человека, включенных в локус LiK у сконструированных мышей, приведенных в качестве примеров в настоящем документе, были представлены в спектре экспрессированных антител у мышей LiK, включающих множество сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанных с геном Сλ грызуна в эндогенном локусе каппа (данные не показаны). В целом авторы изобретения обнаружили, что В-клетки мышей LiK экспрессировали антитела, имеющие легкие цепи, экспрессированные из локуса LiK, как и ожидалось. Измененных продуктов сплайсинга, вставок, делеций или других неожиданных мутаций в проанализированных транскриптах не наблюдалось. Данные результаты подтверждают, что рекомбинация в локусе LiK генерирует функциональные легкие цепи в качестве части спектра антител таких мышей. Аналогичный анализ проводили на мышах, содержащих множество сегментов гена Vλ и Jλ человека, функционально связанных с геном Сλ человека в эндогенном локусе каппа, где была обнаружена экспрессия множества сегментов гена Vλ и Jλ человека (данные не показаны).

Пример 3,3. Экспрессия антител у грызунов, имеющих сконструированный локус легкой цепи

[00436] Данный пример демонстрирует экспрессию антител (например, IgG) у животных, не являющихся человеком, антитела которых содержат легкие цепи, характеризующиеся присутствием областей Vλ человека и областей Сλ грызуна или человека, и того, какие легкие цепи экспрессируются из сконструированного эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина грызунов. Среди прочего, данный пример конкретно демонстрирует экспрессию антител IgG (в димерной и мономерной формах) в сыворотке животных, не являющихся человеком, (например, грызунов), чей геном зародышевой линии содержит эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий вставку одного или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека и ген Сλ грызуна, где данные сегменты гена Vλ и Jλ человека функционально связаны с указанным геном Сλ грызуна, и где данный ген Сλ грызуна вставлен на место гена Сκ грызуна эндогенного локус легкой цепи κ Ig грызуна.

[00437] Кровь брали у мышей дикого типа (WT, 75% C57BL/6NTac, 25% 129SvEvTac) и гомозиготных 6558 мышей («LiK», 75% C57BL/6NTac 25% 129SvEvTac). Сыворотку отделяли от крови, используя пробирки Эппендорфа, центрифугировали при 9000 об./мин. в течение пяти минут при 4°С. Собранную сыворотку использовали для иммуноблоттинга для выявления экспрессии антител IgG.

[00438] Мышиные сыворотки разводили 1:100 или 1:500 в ФСБ (без Са2+ и Mg+) и использовали на 4-20% гелях Novex Tris-Glycine в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Гели переносили на поливинилидендифторидные (PVDF) мембраны в соответствии с инструкциями производителя. Блоты блокировали в течение ночи с 5% обезжиренного молока в трис-буферном солевом растворе с 0,05% Твин-20 (TBST, Sigma). Мембраны PVDF подвергали воздействию первичного антитела (анти-mIgG1 козы, конъюгированное с HRP, Southern Biotech), разведенного 1:1000 в 0,1% обезжиренном молоке в TBST в течение одного часа при комнатной температуре. Блоты промывали четыре раза, каждую промывку проводили в течение десяти минут, и проявляли в течение пяти минут с помощью реагента Amersham ECL Western Blotting Detection (GE Healthcare Life Sciences) в соответствии со спецификациями производителя. Затем блоты визуализировали с использованием системы документирования геля с охлаждаемой ПЗС-камерой GE Healthcare ImageQuant LAS-4000. Изображения были сняты с 15-секундными интервалами до получения 20 изображений или до полного взаимодействия, в зависимости от того, что наступило раньше. Репрезентативные результаты представлены на фиг. 13 (номера полос указаны вверху каждого изображения геля, и назначения полос одинаковы для обоих изображений; вверху слева: укороченный выборочный контроль, внизу слева: не укороченный выборочный контроль; LiK НО: гомозиготный 6558; WT: дикий тип; молекулярные массы указаны слева от каждого изображения геля).

[00439] Как показано на фиг. 13, размер антител IgG, экспрессируемых у мышей LiK, аналогичен размеру, наблюдаемому у антител IgG, экспрессируемых у мышей дикого типа, что демонстрирует, что мыши LiK вырабатывают функциональные антитела, которые связывают антиген, и могут использоваться в качестве системы in vivo для производства антител человека и компонентов антител человека для применения при лечении заболеваний человека.

Пример 4. Создание и характеристика грызунов, содержащих более сконструированных локусов иммуноглобулина

[00440] Грызунов LiK в соответствии с описанием в данном документе отдельно разводят с использованием более сконструированных линий грызунов с проведением более разведений, с использованием способов, известные в данной области, для создания линий грызунов, содержащих следующие сконструированные локусы иммуноглобулина: (1) линия грызунов, гомозиготная в отношении тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина (см., например, патенты США №№8,642,835 и 8,697,940, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме), гомозиготный в отношении локуса легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащего сегменты гена Vλ и Jλ человека, функционально связанные с геном Сλ в соответствии с описанием в данном документе, и гомозиготный в отношении инактивированного эндогенного локуса λ легкой цепи иммуноглобулина (см., например, патент США №9,006,511, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки), в некоторых вариантах осуществления упоминаемая в данном документе как мыши HoH/LiK/λ-/-, (2) линия грызунов, гомозиготная по локусу тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина (выше), гомозиготная по инактивированному эндогенному локусу легкой цепи λ иммуноглобулина (выше) и гемизиготная по локусу легкой цепи κ иммуноглобулина, имеющая первый локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий сегменты гена Vλ и Jλ человека, функционально связанные с геном Сλ в соответствии с описанием в данном документе, и второй локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий сегменты гена Vκ и Jκ человека, функционально связанные с эндогенной геном Сκ мыши (см., например, патенты США №№8,642,835 и 8,697,940, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте), в некоторых вариантах осуществленияупоминаемая в данном документе как мыши HoH/KoK/LiK/λ-/-. Альтернативно, такие мыши могут быть получены путем введения нацеленных векторов, содержащих сконструированные локусы, в клетки ES, уже содержащие более сконструированных локусов иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления локус тяжелой цепи иммуноглобулина у указанных грызунов содержит функциональный и экспрессированный ген Adam6 грызунов.

[00441] В частности, мышей LiK разводили с использованием более сконструированных мышиных линий в течение более селекции для установления линии мышей HoH/LiK/λ-/- и линии мышей HoH/KoK/LiK/λ-/-.

[00442] После установления линий различные популяции иммунных клеток таких гуманизированных мышей были охарактеризованы посредством проточной цитометрии. Вкратце, селезенки и бедренные кости мышей HoH/LiK/λ-/- (n=3), HoH/KoK/LiK/λ-/- (n=4) и VELOCIMMUNE® («НоН/KoK»; n=3; см. патенты США №8,642,835 и 8,697,940, каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте) были собраны и подготовлены для анализа посредством проточной цитометрии в соответствии с описанием выше. Репрезентативные результаты представлены на фиг. 8-11. Среднее значение экспрессии легкой цепи (κ:λ), наблюдаемое в спленоцитах сконструированных линий мышей было примерно следующим: НоН/LiK/λ-/-: 0:100, НоН/KoK/LiK/λ-/-: 40:60, НоН/KoK: 85:15.

Пример 5. Выработка антителу сконструированных грызунов

[00443] Данный пример демонстрирует выработку антител у грызунов, содержащих сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием выше с использованием представляющего интерес антигена (например, однопроходного или многоходового мембранного белка и т.д.). Способы, описанные в данном примере, или способы иммунизации, хорошо известные в данной области, можно использовать для иммунизации грызунов, содержащих сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулин в соответствии с описанием, с использованием различных антигенов (например, полипептидов и т.д.). Для получения антител после иммунизации интересующим антигеном могут быть использованы любые генетически модифицированные грызуны, описанные в данном документе выше, например, мыши LiK - мыши, содержащие локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий сегменты гена Vλ и Jλ, человека, функционально связанные с геном Сλ такие как мыши, гомозиготные по локусу LiK); мыши HoH/LiK/λ-/- - мыши, содержащие локус LiK (такие как мыши, гомозиготные по локусу LiK), а также содержащие гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (см., например, патенты США №№8,642,835 и 8,697,940, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки) и инактивированный эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина (см., например, патент США №9,006,511, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки); и мыши HoH/KoK/LiK/λ-/- - мыши, гемизиготные по локусу легкой цепи κ иммуноглобулина, имеющие первый локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий LiK, и второй локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий сегменты гена Vκ и Jκ человека, функционально связанные с эндогенным геном Сκ мыши (см., например, патенты США №8,642,835 и 8,697,940), а также содержащий гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (см., например, патенты США №8,642,835 и 8,697,940, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте) и инактивирован локус эндогенного иммуноглобулина легкой цепи λ (см., например, патент США №9,006,511, который включен в настоящее описание посредством ссылки). Такие мыши пригодны для иммунизации и выработки человеческих антител и/или фрагментов человеческих антител.

[00444] Мышей LiK, которые дополнительно включают сконструированные локусы иммуноглобулина, описанные выше, заражают исследуемым антигеном с использованием способов иммунизации, известных в данной области. Иммунный ответ антител контролируют с помощью иммуноферментного анализа ИФА (т.е., сывороточного титра). Когда достигается желаемый иммунный ответ, спленоциты (и/или другие лимфатические ткани) собирают и конденсируют с клетками миеломы мыши для сохранения их жизнеспособности и формирования бессмертных линий гибридомных клеток. Сформированные линии гибридомных клеток подвергают скринингу (например, с помощью анализа ИФА) и отбирают для идентификации линий гибридомных клеток, которые продуцируют антигенспецифичные антитела. Гибридомы могут быть по желанию дополнительно охарактеризованы в отношении относительной аффинности связывания и изотипа. Используя данную методику и описанный выше иммуноген, получают более антиген-специфических химерных антител (то есть, антител, обладающих вариабельными доменами человека и константными доменами грызуна).

[00445] ДНК, кодирующая вариабельные области тяжелой цепи и легких цепей, может быть выделена или иным образом получена и может быть связана с константными областями тяжелой цепи и легкой цепи человека (например, желаемого изотипа) для получения полностью человеческих антител. Такие полностью человеческие антитела (и/или их тяжелые или легкие цепи) могут вырабатываться в клетке, обычно клетке млекопитающего, такой как клетка СНО. Полностью человеческие антитела могут быть затем охарактеризованы в отношении относительной аффинности связывания и/или нейтрализующей активности представляющего интерес антигена.

[00446] ДНК, кодирующая антиген-специфические химерные антитела, продуцируемые В-клетками сконструированных мышей, описанных и/или приведенных в качестве примера в настоящем документе, и/или их вариабельные домены из легких и/или тяжелых цепей, могут быть выделены непосредственно из антиген-специфических лимфоцитов. Например, химерные антитела с высокой аффинностью, имеющие вариабельную область человека и константную область грызуна, могут быть выделены и охарактеризованы таким образом, чтобы определить конкретные представляющие интерес антитела (и/или В-клетки, которые их вырабатывают). Чтобы привести лишь более примеров, оцениваемые характеристики таких антител, и/или их вариабельных и/или константных областей, могут представлять собой или включать одну или более из аффинности, селективности, идентичности эпитопа и т.д.

[00447] Константные области грызунов заменяют желаемыми константными областями человек для генерации полностью человеческих антител. В то время как выбранная константная область может варьироваться в зависимости от конкретного применения, характеристики высокоаффинного связывания антигена и целевой специфичности находятся в вариабельной области. Альтернативно, при использовании мышей LiK, содержащих ген Сλ2 на месте гена Сκ грызуна в соответствии с описанием в данном документе, этап замены константной области грызуна в антителе, выделенном у иммунизированной мыши, опущен. Антигенспецифические антитела также выделяют непосредственно из антиген-позитивных В-клеток (у иммунизированных мышей) без конденсирования с клетками миеломы, как описано, например, в патенте США №7,582,298, конкретно включенном в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте. С использованием данного метода получают более полностью человеческих антиген-специфических антител (то есть, антител, обладающих вариабельными доменами человека и константными доменами человека).

Пример 6. Создание грызунов, имеющих сконструированный локус легкой цепи и экспрессирующих ген терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) человека

Пример 6,1. Поколение грызунов, имеющих сконструированный локус легкой цепи и экспрессирующих TDT человека

[00448] Данный пример иллюстрирует поколение мышей, чей геном зародышевой линии содержит сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе, и дополнительно экспрессирующих TdT человека. Мышей, экспрессирующих TdT человека, получали в соответствии с описанием в Примере 1.1. заявки на патент WO 2017/210586, полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки. Мыши, имеющие геном, содержащий сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в соответствии с описанием в данном документе, и дополнительно экспрессирующие TdT человека, создавали посредством множественной селекции для установления когорт мышиных линий, содержащих обе модификации.

Пример 6,2. Фенотипическая оценка грызунов, имеющих сконструированный локус каппа и экспрессирующих TDT человека

[00449] После установления линий популяции иммунных клеток таких гуманизированных мышей были охарактеризованы посредством проточной цитометрии. Вкратце, селезенки и бедренные кости мышей HoH/LiK/λ-/-/TdT (n=4) и HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT (n=6) были получены и подготовлены для анализа посредством проточной цитометрии в соответствии с описанием выше (см. пример 3 выше). Репрезентативные результаты представлены на фиг. 14-17. Среднее значение экспрессии легкой цепи (κ:λ), наблюдаемое в спленоцитах сконструированных линий мышей было следующим: HoH/LiK/λ-/-/TdT: 0:100, HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT: 45:55.

Пример 6,3. Множественность J-сегментов иммуноглобулина каппа человека и добавления областей, не принадлежащих к зародышевой линии, у мышей LiK, содержащих TdTS человека

[00450] Как продемонстрировано в заявке на патент WO 2017/210586 (полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки), мыши, содержащие экзогенно введенный TdT, продемонстрировали увеличение множественности J-сегментов и добавлений нуклеотидов, не принадлежащих к зародышевой линии (также «добавление нешаблонных нуклеотидов», что также используется в данном описании) в легких цепях. Мыши, содержащие HoH/LiK/λ-/-/TdT и HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT, были оценены для определения разнообразия последовательностей спектра иммуноглобулина и наличия нешаблонных нуклеотидных добавлений в CDR3 с использованием технологии секвенирования следующего поколения.

[00451] Вкратце, были собраны спленоциты мышей, и В-клетки были положительно обогащены из общего количества спленоцитов с использованием магнитных сфер с анти- CD19 мыши и колонок MACS (Miltenyi Biotech). Суммарную РНК выделяли из В-клеток селезенки с использованием набора RNeasy Plus (Qiagen).

[00452] Проводили обратную транскрипцию с олиго-dT праймером с последующей геноспецифической ПЦР для получения кДНК, содержащей последовательность СА1 мыши, с использованием набора для амплификации кДНК SMARTer™ RACE (Clontech). Во время обратной транскрипции конкретную последовательность ДНК (PIIA: 5'-CCCATGTACT CTGCGTTGAT ACCACTGCTT-3', SEQ ID NO: 71) присоединяли к 3' концу новых синтезированных кДНК. КДНК очищали с использованием геля NucleoSpin и набора для очистки ПЦР (Clontech), затем дополнительно амплифицировали с использованием обратного комплемента праймера к PIIA (5'-AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGTACAT-3', SEQ ID NO: 72), спаренным со специфичным праймером Cλ1 мыши (5'-CACCAGTGTG GCCTTGTTAG ТСТС-3', SEQ ID NO:73).

[00453] Очищенные ампликоны затем амплифицировали посредством ПЦР с использoванием специфического для PIIA праймера (5'-GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATCTAAGCAG TGGTATCAAC GCAGAGT-3', SEQ ID NO:74 и специфичного к Сλ1 мыши вложенного праймера (5'-АСАСТСТТТС CCTACACGAC GCTCTTCCGA TCTAAGGTGG AAACAGGGTG ACTGATG-3', SEQ ID NO:75). Продукты ПЦР длиной от 450 до 690 п.н. выделяли и собирали с помощью Pippin Prep (SAGE Science). Данные фрагменты были дополнительно амплифицированы посредством ПЦР с использованием следующих праймеров: 5'-AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACX XXXXXACACT СТТТСССТАС ACGACGCTCT TCCGATC-3', SEQ ID NO:76 and 5'-CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATXXXXXX GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG АТСТ-3', SEQ ID NO:77 («ХХХХХХ» представляет собой индексную последовательность 6 п.н. для включения мультиплексированных образцов для секвенирования). Продукты ПЦР длиной от 490 до 710 п.н. выделяли и собирали с помощью Pippin Prep, затем количественно определяли посредством КПЦР с использованием набора для количественного определения библиотеки КАРА (КАРА Biosystems) перед загрузкой в секвенатор Miseq (Illumina) для секвенирования (v3, 600 циклов).

[00454] Для биоинформационного анализа полученные последовательности Illumina были демультиплексированы и усечены для обеспечения качества. Затем перекрывающиеся считанные парные концы были собраны и аннотированы с использованием локальной установки igblast (NCBI, v2.2.25+). Считывания были выровнены с базой данных сегментов Vλ и Jλ зародышевой линии человека и отсортированы для лучшего сравнения. Последовательность была помечена как неоднозначная и удалена из анализа в случае обнаружения более лучших совпадений с одинаковой оценкой. Для анализа результатов был разработан набор собственных Perl-скриптов.

[00455] Легкие цепи лямбда В-клеток селезенки мышей HoH/LiK/λ-/-/TdT и легкие цепи лямбда и каппа В-клеток селезенки мышей HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT тестировали для определения увеличения нешаблонных добавлений и множественности J-сегментов в локусах лямбда и/или каппа. Легкие цепи мышей HoH/LiK/λ-/-/TdT и HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT показывали по меньшей мере 2-кратное увеличение множественности J-сегментов, измеренное по количеству уникальных CDR3/ 10000 чтений (данные не показаны). Кроме того, около 50% легких цепей (лямбда и/или каппа) мышей HoH/LiK/λ-/-/TdT и HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT демонстрировали нешаблонные добавления по сравнению с легкими цепями у контрольных мышей без TdT, которые демонстрировали только около 10% нешаблонных добавлений (данные не показаны).

Пример 7. Иммунизация сконструированных грызунов и анализ иммунного ответа на иммуногены

[00456] Данный пример иллюстрирует иммунизацию мышей LiK/VI-3 и LiK/VI-3/TdT и анализ ответов антител сыворотки на иммуногены. Вкратце, (1) VI-3/TdT (например, положительный контроль для легкой цепи каппа человека, который также имеет эндогенные локусы легкой цепи лямбда мыши) и мышей VI-3 с легкими цепями лямбда человека, (2) LiK/VI-3 и (3) LiK/VI-3/TdT, соответственно, были иммунизированы белковыми иммуногенами с использованием стандартных протоколов и адъювантов. У мышей брали кровь до начала иммунизации и периодически брали кровь после введения иммуногена. Антисывороточные титры анализировали на соответствующие антигены.

[00457] Титры антител к иммуногенам в сыворотке определяли с помощью ИФА. Планшеты для микротитроваия на девяносто шесть лунок (Pierce) покрывали антигенами в количестве 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, Irvine Scientific) в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали ФСБ, содержащим 0,05% Tween-20 (ФСБ-Т, Sigma-Aldrich), и блокировали добавлением 250 мкл 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma-Aldrich) в ФСБ в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали ФСБ-Т. Преиммунные и иммунные антисыворотки серийно разводили трехкратно в 1% БСА-ФСБ и добавляли на планшеты в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали и на планшеты добавляли вторичные козьи антитела Fc к IgG мыши, коньюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (Jackson Immunoresearch), козьи антитела к цепи каппа мыши, коньюгированные cHRP (SouthernBiotech) или козьи антитела к цепи лямбда мыши, коньюгированные с HRP (SouthernBiotech) при разведении 1:5000, и выдерживали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали и проявляли, используя ТМВ/Н2О2 в качестве субстрата, путем инкубации в течение 15-20 минут.Реакцию останавливали кислотой и планшеты считывали на спектрофотометре (Victor, Perkin Elmer) при 450 нм. Титры антител рассчитывали с использованием программного обеспечения Graphpad PRISM. Титр определяется как интерполированный коэффициент разведения сыворотки, сигнал связывания которого в 2 раза превышает фоновый.

[00458] Гуморальные иммунные ответы у мышей LiK/VI-3, LiK/VI-3/TdT и VI-3/TdT были исследованы после иммунизации белковым иммуногеном. Антисыворотки мышей, иммунизированных белком, показывают высокие титры антигена в штаммах LiK/VI-3 и LiK/VI-3/TdT, сравнимые со штаммом VI-3/TdT (фиг. 18). Высокие титры лямбда были выявлены как у мышей LiK/VI-3, так и у мышей LiK/VI-3/TdT. У мышей линии VI-3/TdT титры лямбда не наблюдались у трех мышей, тогда как у двух мышей наблюдались низкие титры, что соответствует низкому использованию вариабельных областей лямбда у мышей у мышей данной линии. Как и ожидалось, титры каппа не были выявлены у мышей LiK/VI-3 и LiK/VI-3/TdT, поскольку у них отсутствует легкая цепь каппа, в то время как VI-3/TdT показали высокие титры каппа. На фиг. 19 показаны исходные титры (самое низкое сывороточное разведение), которые наблюдались на нерелевантном белковом антигене для His-метки у всех трех мышей с анти-Fc и анти-каппа-детекцией, в то время как очень низкие титры наблюдались при анти-лямбда-детекции у мышей LiK/VI-3 и LiK/VI-3/TdT.

ОПРЕДЕЛЕННЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Вариант осуществления 1. Генетически модифицированный грызун, геном зародышевой линии которого содержит:

первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(a) один или более сегментов гена Vλ человека,

(b) один или более сегментов гена Jλ человека и

(c) ген Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с геном Сλ; и

где у грызуна отсутствует ген Сκ грызуна в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина;

Вариант осуществления 2. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 1, в котором грызун гомозиготен по первому сконструированному эндогенному локусу легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 3. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 1, в котором грызун гетерозиготен по первому сконструированному эндогенному локусу легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 4. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 3, в котором геном зародышевой линии грызуна содержит второй сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(a) один или более сегментов гена Vκ человека, и

(b) один или более сегментов гена Jκ человека,

где один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ человека функционально связаны с геном Сκ.

Вариант осуществления 5. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 4, в котором ген Сκ во втором сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина представляет собой эндогенный ген Сκ грызуна.

Вариант осуществления 6. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-5, в котором у грызуна отсутствует ген Сκ грызуна в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 7. Генетически модифицированный грызун, геном зародышевой линии которого содержит:

(а) первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека,

(ii) один или более сегментов гена Jλ, человека и

(iii) ген Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с геном Сλ; и

где у грызуна отсутствует ген Сκ грызуна в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина; и

(b) второй сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(i) один или более сегментов гена Vκ человека, и

(ii) один или более сегментов гена Jκ человека,

где один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ человека функционально связаны с геном Сκ.

Вариант осуществления 8. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 7, в котором ген Сκ во втором сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина представляет собой эндогенный ген Сκ грызуна.

Вариант осуществления 9. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-8, в котором ген Сλ в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина содержит ген Сλ грызуна.

Вариант осуществления 10. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-9, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Vλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Vλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека;

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Jλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Jλ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Jλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека; или

(iii) любую их комбинацию.

Вариант осуществления 11. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-10, в котором:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3- 25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию;

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 12. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 11, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека, и

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ естественным образом расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 13. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 11, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ.3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека; и

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ-7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 14. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-13, в котором:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию.

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 15. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 14, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, VλJ-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ.2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека; и

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ расположена рядом с jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ естественным образом расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 16. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 14, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-l эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека; и

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 17. Генетически модифицированный грызун, геном зародышевой линии которого содержит:

первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека, где один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию.

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека, где один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλ1, Jλ2, J A3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию,

(iii) ген Сλ грызуна,

(iv) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ является смежной с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7- 46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человек,

(v) одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека, и

(vi) некодирующую последовательность легкой цепи κ человека между одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ человека, которая имеет последовательность, которая естественным образом расположена между сегментом гена Vκ4-1 человека и сегментом гена Jκ1 человека в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека,

где один или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека и ген Сλ грызуна функционально связаны друг с другом, и

где ген Сλ грызуна расположен на месте гена Сκ грызуна эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 18. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 17, в котором геном зародышевой линии грызуна содержит второй сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(a) один или более сегментов гена Vκ человека, и

(b) один или более сегментов гена Jκ человека,

где один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ человека функционально связаны с геном Сκ.

Вариант осуществления 19. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 18, в котором ген Сκ во втором сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина представляет собой эндогенный ген Сκ грызуна.

Вариант осуществления 20. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-19, в котором геном зародышевой линии грызуна дополнительно содержит:

сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий:

(а) один или более сегментов гена VH человека,

(b) один или более сегментов гена DH человека, и

(c) один или более сегментов гена JH человека,

где один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека функционально связаны с одним или более из генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

Вариант осуществления 21. Генетически модифицированный грызун, геном зародышевой линии которого содержит:

(a) сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека, функционально связанных с одним или более генами константных областей тяжелой цепи эндогенного иммуноглобулина таким образом, что грызун экспрессирует тяжелые цепи иммуноглобулина, которые содержат последовательность вариабельного домена тяжелой цепи человека и последовательность константного домена тяжелой цепи грызуна, где геном зародышевой линии гомозиготен по сконструированному эндогенному локусу тяжелой цепи иммуноглобулина;

(b) первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека, где один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию.

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека, где один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλ1, Jλ2, J A3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию,

(iii) ген Сλ грызуна,

(iv) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ 5-52, Vλ 1-51, Vλ 9-49, Vλ 1-47, Vλ 7-46, Vλ 5-45, Vλ 1-44, Vλ 7-43, Vλ 1-40, Vλ 3-27, Vλ 3-25, Vλ 2-23, Vλ 3-22, Vλ 3-21, Vλ 3-19, Vλ 2-18, Vλ 3-16, Vλ 2-14, Vλ 3-12, Vλ 2-11, Vλ 3-10, Vλ 3-9, Vλ 2-8, Vλ 4-3 или Vλ 3-1 во втором сконструированном эндогенном локусе легкой цепи иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ 5-52, Vλ 1-51, Vλ 9-49, Vλ 1-47, Vλ 7-46, Vλ 5-45, Vλ 1-44, Vλ 7-43, Vλ 1-40, Vλ 3-27, Vλ 3-25, Vλ 2-23, Vλ 3-22, Vλ 3-21, Vλ 3-19, Vλ 2-18, Vλ 3-16, Vλ 2-14, Vλ 3-12, Vλ 2-11, Vλ 3-10, Vλ 3-9, Vλ 2-8, Vλ 4-3 или Vλ 3-1 эндогенного локуса легкой цепи иммуноглобулина человека,

(v) одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 во втором сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека, и

(vi) некодирующую последовательность легкой цепи κ человека между одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ человека, которая имеет последовательность, которая естественным образом расположена между сегментом гена Vκ4-1 человека и сегментом гена Jκ1 человека в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека,

где один или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека и ген Сλ грызуна функционально связаны друг с другом,

где ген Сλ грызуна расположен на месте гена Сκ грызуна во втором эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина; и

(b) второй сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ, функционально связанных с эндогенной областью гена Сκ грызуна, таким образом, что грызун экспрессирует легкие цепи иммуноглобулина, которые содержат последовательность вариабельного домена легкой цепи κ человека и последовательность константного домена легкой цепи κ грызуна,

так что грызун экспрессирует легкие цепи иммуноглобулина, которые содержат последовательность вариабельного домена легкой цепи λ человека и последовательность константного домена легкой цепи λ грызуна.

Вариант осуществления 22. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 20 или 21, в котором один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека находятся на месте одного или более сегментов гена VH грызуна, одного или более сегментов гена DH грызуна, одного или более сегментов гена JH грызуна или их комбинации.

Вариант осуществления 23. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 20-22, в котором один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека заменяют один или более сегментов гена VH грызуна, один или более сегментов гена DH грызуна, один или более сегментов гена JH грызуна или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 24. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 20-23, в котором сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей VH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена VH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей VH естественным образом расположена рядом с сегментом гена VH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека;

(ii) одну или более некодирующих последовательностей DH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена DH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей DH естественным образом расположена рядом с сегментом гена DH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека;

(iii) одну или более некодирующих последовательностей JH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена JH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей JH естественным образом расположена рядом с сегментом гена JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека; или

(iv) любую их комбинацию.

Вариант осуществления 25. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 20-24, в котором один или более генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна представляют собой один или более эндогенных генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна.

Вариант осуществления 26. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 20-25, в котором:

(i) один или более сегментов гена VH человека содержат VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1 или любую их комбинацию,

(ii) один или более сегментов гена DH человека содержат DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27 или любую их комбинацию; и

(iii) один или более сегментов гена JH человека содержат JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 27. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 20-26, в котором в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызуна.

Вариант осуществления 28. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 20-27, в котором геном зародышевой линии дополнительно содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов.

Вариант осуществления 29. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 28, в котором экспрессируются один или более полипептидов ADAM6, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов.

Вариант осуществления 30. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 28 или 29, в котором одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, включены в ту же хромосому, что и сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина.

Вариант осуществления 31. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 28-30, в котором одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, включены в сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина.

Вариант осуществления 32. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 28-31, в котором одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, расположены на месте псевдогена Adam6 человека.

Вариант осуществления 33. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 28-32, в котором одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов заменяют псевдоген Adam6 человека.

Вариант осуществления 34. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 28-33, в котором одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, находятся между первым сегментом гена VH человека и вторым сегментом гена VH человека.

Вариант осуществления 35. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 34, в котором первый сегмент гена VH человека представляет собой VH1-2, и второй сегмент гена VH человека представляет собой VH6- 1.

Вариант осуществления 36. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 28-31, в котором одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, находятся между сегментом гена VH человека и сегментом гена DH человека.

Вариант осуществления 37. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 20 и 22-36, в котором грызун гомозиготен по сконструированному эндогенному локусу тяжелой цепи иммуноглобулина.

Вариант осуществления 38. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 9-37, в котором ген Сλ грызуна имеет последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична гену Сλ1 мыши, гену Сλ2 мыши или гену Сλ3 мыши.

Вариант осуществления 39. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 9-38, в котором ген Сλ грызуна содержит ген Сλ1 мыши.

Вариант осуществления 40. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 9-39, в котором ген Сλ грызуна содержит ген Сλ крысы.

Вариант осуществления 41. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 40, в котором ген Сλ крысы имеет последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична гену Сλ1 крысы, гену Сλ2 крысы, гену Сλ3 крысы или гену Сλ4 крысы.

Вариант осуществления 42. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-41, в котором один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека расположены на месте одного или более сегментов гена Vκ грызуна, одного или более сегментов гена Jκ грызуна или любой их комбинации.

Вариант осуществления 43. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-42, в котором один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека заменяют один или более сегментов гена Vκ грызуна, один или более сегментов гена Jκ грызуна или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 44. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-43, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит некодирующую последовательность легкой цепи κ между одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ человека.

Вариант осуществления 45. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 44, в котором некодирующая последовательность легкой цепи κ представляет собой некодирующую последовательность легкой цепи κ человека.

Вариант осуществления 46. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 45, в котором некодирующая последовательность легкой цепи κ человека имеет последовательность, которая естественным образом расположена между сегментом гена Vκ4-1 человека и сегментом гена Jκ1 человека в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 47. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-46, дополнительно содержащий инактивированный эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 48. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 47, в котором грызун гетерозиготен по инактивированному эндогенному локусу легкой цепи λ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 49. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 47, в котором грызун гомозиготен по инактивированному эндогенному локусу легкой цепи λ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 50. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-49, в котором эндогенные сегменты гена Vλ, эндогенные сегменты гена Jλ и эндогенные гены Сλ удаляются полностью или частично.

Вариант осуществления 51. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-50, в котором у грызуна не обнаруживается экспрессия эндогенных вариабельных доменов легкой цепи λ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 52. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-51, в котором у грызуна не обнаруживается экспрессия эндогенных вариабельных доменов легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 53. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-52, в котором грызун содержит популяцию В-клеток, которые экспрессируют антитела, включая легкие цепи λ иммуноглобулина, каждая из которых включает вариабельный домен легкой цепи λ человеческого иммуноглобулина.

Вариант осуществления 54. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 53, в котором вариабельный домен легкой цепи λ иммуноглобулина человека кодируется перестроенной последовательностью вариабельной области легкой цепи λ иммуноглобулина человека, содержащей (i) один из одного или более сегментов гена Vλ человека или их соматически гипермутированный вариант и (ii) один из одного или более сегментов гена Jλ человека или их соматически гипермутированный вариант.

Вариант осуществления 55. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 1-54, в котором геном зародышевой линии грызуна дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции.

Вариант осуществления 56. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 55, в котором TdT представляет собой короткую изоформу TdT (TdTS).

Вариант осуществления 57. Генетически модифицированный грызун по варианту осуществления 55 или 56, в котором элемент контроля транскрипции содержит элемент контроля транскрипции RAG1, элемент контроля транскрипции RAG2, элемент контроля транскрипции тяжелой цепи иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи κ иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи λ иммуноглобулина или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 58. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 55-57, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая экзогенный TdT, расположена в геноме зародышевой линии в локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, локусе легкой цепи λ иммуноглобулина, локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, локусе RAG1 или локусе RAG2.

Вариант осуществления 59. Генетически модифицированный грызун, геном зародышевой линии которого содержит

(a) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции;

(b) сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека, функционально связанных с одним или более генами константных областей тяжелой цепи эндогенного иммуноглобулина таким образом, что грызун экспрессирует тяжелые цепи иммуноглобулина, каждая из которых содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи человека и последовательность константного домена тяжелой цепи грызуна, где геном зародышевой линии гомозиготен по сконструированному эндогенному локусу тяжелой цепи иммуноглобулина; и

(c) сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(i) один или более сегментов гена Vλ, где один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ5-52, Vλ-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию,

(ii) один или более сегментов гена человека, где один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию,

(iii) ген Сλ грызуна,

(iv) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи иммуноглобулина λ человека,

(v) одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 и Jλ7 в сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека, и

(vi) некодирующую последовательность легкой цепи κ человека между одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ человека, которая содержит последовательность, которая естественным образом расположена между сегментом гена Vκ4-1 человека и сегментом гена Jκ1 человека в эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина человека,

где один или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека и ген Сλ грызуна функционально связаны друг с другом,

где ген Сλ грызуна расположен на месте гена Сκ грызуна эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина,

где геном зародышевой линии гомозиготен по сконструированному эндогенному локусу легкой цепи κ иммуноглобулина, и

так что грызун экспрессирует легкие цепи иммуноглобулина, которые содержат последовательность вариабельного домена легкой цепи λ человека, конденсированную с последовательностью константного домена легкой цепи λ грызуна.

Вариант осуществления 60. Генетически модифицированный грызун по любому из вариантов осуществления 1-59, в котором грызун представляет собой крысу или мышь.

Вариант осуществления 61. Выделенная клетка грызуна, полученная от грызуна по любому из вариантов осуществления 1-60.

Вариант осуществления 62. Иммортализованная клетка, полученная из выделенной клетки грызунов по варианту осуществления 61.

Вариант осуществления 63. Выделенная клетка грызуна по п. 61, причем клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна.

Вариант осуществления 64. Эмбрион грызуна, полученный из клетки ES грызуна по варианту осуществления 63.

Вариант осуществления 65. Применение грызуна по любому из вариантов осуществления 1-60 для получения антитела.

Вариант осуществления 66. Применение грызуна по любому из вариантов осуществления 1-60 для получения последовательности вариабельной области легкой цепи.

Вариант осуществления 67. Применение грызуна по любому из вариантов осуществления 1-60 для получения последовательности вариабельного домена легкой цепи.

Вариант осуществления 68. Выделенная В-клетка, полученная от грызуна по любому из вариантов осуществления 1-60, где геном В-клетки содержит:

(а) перестроенную последовательность вариабельной области легкой цепи лямбда человека, функционально связанную с последовательностью вариабельной области легкой цепи лямбда, где перестроенная последовательность вариабельной области легкой цепи лямбда человека содержит:

(i) один из одного или более сегментов гена Vλ человека или их соматически гипермутированный вариант, и

(ii) один из одного или более сегментов гена Jλ, человека или их соматически гипермутированный вариант.

Вариант осуществления 69. Выделенная В-клетка по варианту осуществления 68, дополнительно содержащая:

(b) перестроенную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, функционально связанную с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи грызуна, где перестроенная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека содержит:

(i) один из одного или более сегментов гена VH человека или его соматически гипермутированный вариант, и

(ii) один из одного или более сегментов гена DH человека или их соматически гипермутированный вариант, и

(ш) один из одного или более сегментов гена JH человека или их соматически гипермутированный вариант.

Вариант осуществления 70. Антитело, полученное способом, включающим стадии:

(a) предоставления грызуна по любому из вариантов осуществления 1-60;

(b) иммунизации грызуна исследуемым антигеном;

(c) содержания грызуна в условиях, достаточных для вызова у грызуна иммунного ответа на исследуемый антиген; и

(d) получение от грызуна:

(i) антитела, связывающего исследуемый антиген,

(ii) нуклеотида, кодирующего вариабельный домен легкой или тяжелой цепи человека, легкую цепь или тяжелую цепь антитела, связывающего исследуемый антиген, или

(iii) клетки, экспрессирующей антитело, связывающее представляющий интерес антиген,

где антитело (d) включает вариабельные домены тяжелой цепи человека и вариабельные домены легкой цепи λ человека.

Вариант осуществления 71. Выделенная клетка грызуна, геном которой содержит:

первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(a) один или более сегментов гена Vλ человека,

(b) один или более сегментов гена Jλ человека и

(c) ген Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ, человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с геном Сλ; и

где у выделенной клетки грызуна отсутствует ген Сκ грызуна в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 72. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 71, в которой выделенная клетка грызуна гомозиготна по первому сконструированному эндогенному локусу легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 73. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 71, в которой выделенная клетка грызуна гетерозиготна по первому сконструированному эндогенному локусу легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 74. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 73, в которой геном выделенной клетки грызуна содержит второй сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(a) один или более сегментов гена Vκ человека, и

(b) один или более сегментов гена Jκ человека,

где один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ человека функционально связаны с геном Сκ.

Вариант осуществления 75. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 74, в которой ген Сκ во втором сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина представляет собой эндогенный ген Сκ грызуна.

Вариант осуществления 76. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 71-75, в которой у выделенной клетки грызуна отсутствует ген Сκ грызуна в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 77. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 71-76, в которой ген Сλ в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина содержит ген Сλ грызуна.

Вариант осуществления 78. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 71-77, в которой первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Vλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Vλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека;

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Jλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Jλ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Jλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека; или

(iii) любую их комбинацию.

Вариант осуществления 79. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 71-78, в которой:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, УХ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, У73-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, УХ2-П, Vλ3-10, УХ3-9, Vλ2-8, УХ4-3, УХ3-1 или любую их комбинацию;

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 80. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 79, в которой первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-l в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека, и

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ естественным образом расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 81. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 79, в которой первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека,

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 82. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 71-81, в которой:

(a) один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию; и

(b) один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 83. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 82, в которой первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или УХ3-l эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека; и

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ естественным образом расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 84. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 82, в которой первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека; и

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 85. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 71-84, в которой геном клетки грызуна дополнительно содержит:

сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий:

(a) один или более сегментов гена VH человека,

(b) один или более сегментов гена DH человека, и

(c) один или более сегментов гена JH человека,

где один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека функционально связаны с одним или более из генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

Вариант осуществления 86. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 85, в которой один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека находятся на месте одного или более сегментов гена VH грызуна, одного или более сегментов гена DH грызуна, одного или более сегментов гена JH грызуна или их комбинации.

Вариант осуществления 87. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 85 или 86, в которой один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека заменяют один или более сегментов гена VH грызуна, один или более сегментов гена DH грызуна, один или более сегментов гена JH грызуна или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 88. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 85-87, в которой сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей VH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена VH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей VH естественным образом расположена рядом с сегментом гена VH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека;

(ii) одну или более некодирующих последовательностей DH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена DH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей DH естественным образом расположена рядом с сегментом гена DH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека;

(iii) одну или более некодирующих последовательностей JH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена JH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей JH естественным образом расположена рядом с сегментом гена JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека; или

(iv) любую их комбинацию.

Вариант осуществления 89. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 85-88, в которой один или более генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна представляют собой один или более генов константной области тяжелой цепи эндогенного иммуноглобулина грызуна.

Вариант осуществления 90. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 85-89, в которой:

(i) один или более сегментов гена VH человека содержат VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1 или любую их комбинацию,

(ii) один или более сегментов гена DH человека содержат DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27 или любую их комбинацию; и

(iii) один или более сегментов гена JH человека содержат JHI, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 91. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 85-90, в которой в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызуна.

Вариант осуществления 92. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 85-91, в которой геном клетки грызуна дополнительно содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов.

Вариант осуществления 93. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 92, в которой одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, включены в ту же хромосому, что и сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина.

Вариант осуществления 94. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 92 или 93, в которой одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, включены в сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина.

Вариант осуществления 95. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 92-94, в которой одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, расположены на месте псевдогена Adam6 человека.

Вариант осуществления 96. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 92-95, в которой одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов заменяют псевдоген Adam6 человека.

Вариант осуществления 97. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 92-96, в которой одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, находятся между первым сегментом гена VH человека и вторым сегментом гена VH человека.

Вариант осуществления 98. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 97, в которой первый сегмент гена VH человека представляет собой VH1-2, и второй сегмент гена VH человека представляет собой VH6-1.

Вариант осуществления 99. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 92-94, в которой одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызунов, функциональных ортологов, функциональных гомологов или их функциональных фрагментов, находятся между сегментом гена VH человека и сегментом гена DH человека.

Вариант осуществления 100. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 85-99, в которой выделенная клетка грызуна гомозиготна по сконструированному эндогенному локусу тяжелой цепи иммуноглобулина.

Вариант осуществления 101. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 71-100, в которой геном выделенной клетки грызуна дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), функционально связанную с элементом контроля транскрипции.

Вариант осуществления 102. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 101, в которой TdT представляет собой короткую изоформу TdT (TdTS).

Вариант осуществления 103. Выделенная клетка грызуна по варианту осуществления 101 или 102, в которой элемент контроля транскрипции содержит элемент контроля транскрипции RAG1, элемент контроля транскрипции RAG2, элемент контроля транскрипции тяжелой цепи иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи κ иммуноглобулина, элемент контроля транскрипции легкой цепи λ иммуноглобулина или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 104. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 101-103, в которой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая экзогенный TdT, расположена в геноме клетки грызуна в локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, локусе легкой цепи λ иммуноглобулина, локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, локусе RAG1 или локусе RAG2.

Вариант осуществления 105. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 71-104, в которой клетка грызуна представляет собой клетку крысы или клетку мыши.

Вариант осуществления 106. Иммортализованная клетка, полученная из выделенной клетки грызуна по любому из вариантов осуществления 71-105.

Вариант осуществления 107. Выделенная клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 71-105, в которой клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна.

Вариант осуществления 108. Эмбрион грызуна, полученный из клетки ES грызуна по варианту осуществления 107.

Вариант осуществления 109. Способ получения генетически модифицированного грызуна, включающий стадии:

(a) введения одного или более фрагментов ДНК в первый сконструированный локус легкой цепи κ иммуноглобулина в геноме клетки ES грызуна, где один или более фрагментов ДНК содержат:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека,

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека и

(iii) ген Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека, и ген Сλ вводятся в геном клетки ES грызуна в эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина и где один или более сегментов гена Vλ человека, один или более сегментов гена Jλ человека, и ген Сλ функционально связаны; и

(b) создание грызуна с использованием клетки ES грызуна, полученной в (а).

Вариант осуществления 110. Способ по варианту осуществления 109, в котором геном клетки ES грызуна содержит второй сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, содержащий:

(i) один или более сегментов гена Vκ человека, и

(ii) один или более сегментов гена Jκ человека,

где один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ человека функционально связаны с геном Сκ.

Вариант осуществления 111. Способ по варианту осуществления 109 или 110, в котором геном клетки ES грызуна содержит сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий:

(i) один или более сегментов гена VH человека,

(ii) один или более сегментов гена DH человека, и

(iii) один или более сегментов гена JH человека,

где один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека функционально связаны с одним или более из генов константной области тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

Вариант осуществления 112. Способ по любому из вариантов осуществления 109-

111, в котором один или более фрагментов ДНК дополнительно содержат по меньшей мере один маркер селекции.

Вариант осуществления 113. Способ по любому из вариантов осуществления 109-112, в котором один или более фрагментов ДНК дополнительно содержат по меньшей мере один сайт-специфичный сайт рекомбинации.

Вариант осуществления 114. Способ по любому из вариантов осуществления 109-113, дополнительно содержащий введение одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека и одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека в первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с сегментом гена Vλ человека, и каждая из одной или более некодирующих последовательностей JX человека является смежной с сегментом гена Jλ человека.

Вариант осуществления 115. Способ по любому из вариантов осуществления 109-114, дополнительно включающий введение некодирующей последовательности легкой цепи κ в геном клетки ES грызуна таким образом, что некодирующая последовательность легкой цепи κ находится между одним или более сегментами гена Vλ человека и одним или более сегментами гена Jλ человека в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 116. Способ по любому из вариантов осуществления 109-115, в котором клетка ES грызуна представляет собой клетку ES крысы или клетку ES мыши.

Вариант осуществления 117. Способ получения генетически модифицированного грызуна, включающий стадию:

(а) конструирования первого эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина в геноме зародышевой линии грызуна, чтобы включить:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека,

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека и

(iii) ген Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с геном Сλ; и

где ген Сλ вставлен в первый эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 118. Способ по варианту осуществления 117, в котором способ дополнительно содержит стадию:

(b) конструирования второго эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина

в геноме зародышевой линии грызуна, чтобы включить:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека,

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека и

(iii) ген Сλ,

где один или более сегментов гена Vλ человека и один или более сегментов гена Jλ человека функционально связаны с геном Сλ; и

где ген Сλ вставлен во второй эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина.

Вариант осуществления 119. Способ по варианту осуществления 117, в котором способ дополнительно содержит стадию:

(b) конструирования второго сконструированного эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина в геноме зародышевой линии грызуна, чтобы включить:

(i) один или более сегментов гена Vκ человека, и

(ii) один или более сегментов гена Jκ человека,

где один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ человека функционально связаны с геном Сκ.

Вариант осуществления 120. Способ по варианту осуществления 119, в котором ген Сκ во втором сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина представляет собой эндогенный ген Сκ грызуна.

Вариант осуществления 121. Способ по любому из вариантов осуществления 117-120, в котором способ дополнительно содержит стадию:

(c) конструирования сконструированного эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина в геноме зародышевой линии грызуна, чтобы включить:

(i) один или более сегментов гена VH человека,

(ii) один или более сегментов гена DH человека, и

(iii) один или более сегментов гена JH человека, где один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека функционально связаны с одним или более геном константной области тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна.

Вариант осуществления 122. Способ по любому из вариантов осуществления 117-121, в котором стадия конструирования первого эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина в геноме зародышевой линии грызуна проводится в клетке ES грызуна, геном которой содержит второй сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина, включающий один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ человека, где один или более сегментов гена Vκ человека и один или более сегментов гена Jκ человека функционально связаны с геном Сκ.

Вариант осуществления 123. Способ по варианту осуществления 122, в котором ген Сκ во втором сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина представляет собой эндогенный ген Сκ грызуна.

Вариант осуществления 124. Способ по любому из вариантов осуществления 117-120, 122 и 123, в котором стадия конструирования выполняется в клетке ES грызуна, геном которой содержит сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека, один или более сегментов гена JH человека, функционально связанных с одним или более генами константной области тяжелой цепи иммуноглобулин человека.

Вариант осуществления 125. Способ по любому из вариантов осуществления 121-124, в котором сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина содержит одну или более некодирующих последовательностей VH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена VH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей VH человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена VH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 126. Способ по любому из вариантов осуществления 121-125, в котором сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина содержит одну или более некодирующих последовательностей DH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена DH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей DH естественным образом расположена рядом с сегментом гена DH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 127. Способ по любому из вариантов осуществления 121-126, в котором сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина содержит одну или более некодирующих последовательностей JH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена JH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей JH естественным образом расположена рядом с сегментом гена JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 128. Способ по любому из вариантов осуществления 109-127, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина не содержит ген Сκ грызуна.

Вариант осуществления 129. Способ по любому из вариантов осуществления 110-115 и 119-128, в котором ген Сκ во втором сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина представляет собой эндогенный ген Сκ грызуна.

Вариант осуществления 130. Способ по любому из вариантов осуществления 109-129, в котором ген Сκ в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина содержит ген Сκ грызуна.

Вариант осуществления 131. Способ по любому из вариантов осуществления 109-130, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Vλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Vλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека;

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена Jλ человека, где одна или более некодирующих последовательностей Jλ человека естественным образом расположена рядом с сегментом гена Jλ человека в эндогенном локусе легкой цепи λ иммуноглобулина человека; или

(iii) любую их комбинацию.

Вариант осуществления 132. Способ по любому из вариантов осуществления 109-131, в котором:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию;

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 133. Способ по варианту осуществления 132, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека, и

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ естественным образом расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 134. Способ по варианту осуществления 132, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека; и

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 135. Способ по любому из вариантов осуществления 109- 134, в котором:

(i) один или более сегментов гена Vλ человека содержат Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 или любую их комбинацию.

(ii) один или более сегментов гена Jλ человека содержат Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 136. Способ по варианту осуществления 135, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека; и

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jλ естественным образом расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 137. Способ по варианту осуществления 135, в котором первый сконструированный эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей Vλ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека является смежной с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Vλ человека естественным образом расположена рядом с Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ1-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 или Vλ3-1 эндогенного локуса легкой цепи λ иммуноглобулина человека; и

(ii) одну или более некодирующих последовательностей Jκ человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ расположена рядом с Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 или Jλ7 в первом сконструированном эндогенном локусе легкой цепи κ иммуноглобулина, и где каждая из одной или более некодирующих последовательностей Jκ естественным образом расположена рядом с Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5 эндогенного локуса легкой цепи κ иммуноглобулина человека.

Вариант осуществления 138. Способ по любому из вариантов осуществления 111-116 и 121-137, в котором один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека находятся на месте одного или более сегментов гена VH грызуна, одного или более сегментов гена DH грызуна, одного или более сегментов гена JH грызуна или их комбинации.

Вариант осуществления 139. Способ по любому из вариантов осуществления 111-116 и 121-138, в котором один или более сегментов гена VH человека, один или более сегментов гена DH человека и один или более сегментов гена JH человека заменяют один или более сегментов гена VH грызуна, один или более сегментов гена DH грызуна, один или более сегментов гена JH грызуна или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 140. Способ по любому из вариантов осуществления 111-116 и 121-139, в котором сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит:

(i) одну или более некодирующих последовательностей VH человека, каждая из которых смежна по меньшей мере с одним из одного или более сегментов гена VH человека, где каждая из одной или более некодирующих последовательностей VH естественным образом расположена рядом с сегментом гена VH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека;

(ii) одну или более некоди