Однородная прозрачная коллагеновая мембрана, способ ее получения и ее применение для восстановления роговицы

Группа изобретений относится к медицине, а именно к офтальмологии. Предложена коллагеновая мембрана для восстановления роговицы, представляющая собой коллагеновый гидрогель, содержащий нативный коллаген I типа, где содержание нативного коллагена I типа составляет от 5 до 20 мас.% от совокупной массы коллагенового гидрогеля, и где указанная искусственная роговица характеризуется максимальной нагрузкой на разрыв более 20 Н. Коллагеновая мембрана для восстановления роговицы по изобретению является биосовместимой, неиммуногенной, оптически прозрачной и прочной, изготовлена из высокоочищенного биоматериала без применения химической модификации, и подходит для имплантации в организм человека с целью улучшения и/или восстановления анатомических и функциональных характеристик роговицы глаза. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 пр., 3 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Предлагаемое изобретение относится к области биодеградируемых имплантатов для введения человеку, в частности к материалам для восстановления поврежденной роговицы глаза.

Уровень техники

Роговица, роговая оболочка – передняя наиболее выпуклая прозрачная часть глазного яблока, одна из светопреломляющих сред глаза. Она имеет вид выпукло-вогнутой линзы, обращенной вогнутой частью назад. Диаметр роговицы составляет 10±0,56 мм. Толщина роговицы в центральной части 0,56 – 0,6 мм, по краям – 1,0 – 1,2 мм. Максимальная нагрузка на разрыв нормальной роговицы человека составляет 10-12 Ньютон.

Проблема восстановления поврежденных тканей роговицы, их целостности и прозрачности является актуальной для офтальмологии. Бельмо (лейкома) - патологический процесс, сопровождающийся частичным или полным помутнением роговицы. Наиболее частыми причинами образования бельма являются: кератиты различной этиологии (вирусные, туберкулезные и другие), травмы (ранения, химические и термические ожоги), оперативные вмешательства на глазу. Также встречаются врожденные помутнения роговицы, обусловленные внутриутробным воспалительным процессом.

Для восстановления прозрачности поврежденной роговицы в клинической практике используют пересадку пациенту донорской роговицы, полученной от донора. На данный момент более чем 10 млн людей во всем мире нуждаются в пересадке донорской роговицы. Однако клиническое использование аллогенного материала осложнено ввиду отсутствия необходимого количества донорских роговиц. Более того, в некоторых случаях наблюдается реакция иммунной системы пациента на антигены донорской роговицы, что приводит к помутнению трансплантата. Одним из возможных вариантов решения данной проблемы является разработка материала для кератопластики, биосовместимого с тканями роговицы и обладающего минимальной иммуногенностью. В данном случае идет речь об отказе от использования донорской роговицы и использовании биокомпозитных полимеров.

Близким к заявляемому изобретению по свойствам является однородный коллагеновый гидрогель на основе рекомбинантного коллагена человека III типа, описанный в документе WO 2006/020859 A3. Авторы этого изобретения предлагают использовать вместе с коллагеном III типа белки, способствующие адгезии и пролиферации клеток роговицы. Основным недостатком такого изделия является тот факт, что для увеличения прочностных характеристик изделие подвергается химической модификации (в том числе, обработке глютаровым альдегидом), что, является причиной повышенной иммуногенности, ограниченной биосовместимости и нарушения оптической прозрачности после имплантации.

Из статьи Xiao X., Pan S., Liu X., Zhu X., Connon C.J., Wu J., Mi S. «In vivo study of the biocompatibility of a novel compressed collagen hydrogel scaffold for artificial corneas», J. Biomed. Mater. Res., 2013, 102 (6), 1782–1787 и статьи Mi S., Chen B., Wright B., Connon C.J. «Plastic compression of a collagen gel forms a much improved scaffold for ocular surface tissue engineering over conventional collagen gels», J. Biomed. Mater. Res. A, 2010, 95 (2), 447–453 известен однородный коллагеновый гидрогель на основе коллагена крысы I типа в концентрации менее 5 мг/мл. Способ приготовления такой мембраны состоит из нескольких этапов. На первом этапе проводят нейтрализацию кислого раствора коллагена путем смешивания со средой для культивирования клеток и 1,0 М раствор NaOH. Далее, для формирования коллагенового гидрогеля полученный нейтральный раствор коллагена разливают в специальные прямоугольные формы и инкубируют при +37°С в течение 30 минут. Далее полученные коллагеновые гидрогели подвергают пластической компрессии путем приложения к ним постоянной нагрузки в 120 г к большему основанию гидрогеля на протяжении 5 минут, избегая высыхания материала. Полученный таким образом материал является гидратированным, полупрозрачным и механически слабым, не держит хирургический шов, что ограничивает его применение для имплантации.

Еще одним близким к заявляемому изобретению по способу изготовления техническим решением является сухая однородная коллагеновая мембрана на основе свиного ателоколлагена I типа в концентрации менее 5 мг/мл в виде коллагеновой мембраны Vitrigel, описанная в статье Calderón-Colón X., Xia Z., Breidenich J.L., Mulreany D.G., Guo Q., Uy O.M., Tiffany J.E., Freund D.E., McCally R.L., Schein O.D., Elisseeff J.H., Trexler M.M. «Structure and properties of collagen vitrigel membranes for ocular repair and regeneration applications», Biomaterials, 2012, 33(33), 8286–8295 и статье Chae J.J., Ambrose W.M., Espinoza F.A., Mulreany D.G., Ng S., Takezawa T., Trexler M.M., Schein O.D., Chuck R.S., Elisseeff J.H. «Regeneration of corneal epithelium utilizing a collagen Vitrigel membrane in rabbit models for corneal stromal wound and limbal stem cell deficiency», Acta Ophthalmol., 2015, 93 (1), e57–e66. Способ приготовления такой мембраны состоит из нескольких этапов. На первом этапе проводят нейтрализацию кислого раствора коллагена. Далее нейтральный раствор коллагена переводится в форму гидрогеля путем инкубации при +37°С. На третьем этапе полученный гидрогель переводится в форму жесткой стеклоподобной мембраны путем высушивания на воздухе. Полученная таким образом сухая коллагеновая мембрана является биосовместимой и прозрачной в in vivo условиях. Мембрана хранится в сухом виде, перед применением ее необходимо регидратировать. Однако, описываемая сухая коллагеновая мембрана на основе свиного ателоколлагена имеет существенный недостаток, заложенный в природе такого изделия и технологии его получения - слишком слабые прочностные характеристики (не держит хирургический шов), суживающие область применения этого изделия только до лечения поверхностных дефектов эпителия роговицы человека.

Еще одним близким к изобретению по способу изготовления техническим решением является однородный коллагеновый гидрогель, приготовленный из концентрированного раствора коллагена (90 мг/мл), описанный в статье Tidu A., Ghoubay-Benallaoua D., Lynch B., Haye B., Illoul C., Allain J.M., Borderie V.M., Mosser G. «Development of human corneal epithelium on organized fibrillated transparent collagen matrices synthesized at high concentration», Acta Biomater., 2015, 22, 50–58. Авторы этой работы предлагают повышать механические характеристики изделия не за счет его химической модификации, а за счет повышения концентрации коллагена в конечном изделии. Способ приготовления такого материала состоит из концентрирования раствора коллагена при помощи ультрацентрифугирования, а затем перевод раствора коллагена в конечную форму коллагенового гидрогеля, в парах аммиака. В итоге, полученная искусственная роговица является прочной, прозрачной в дистиллированной воде (87% светопропускания в диапазоне длин волн 380-780 нм) и совместимой с клетками роговицы. На такой искусственной роговице успешно культивируются эпителиальные клетки роговицы человека, повторяя свое естественное поведение в in vitro условиях. Однако стоит отметить, что описываемая искусственная роговица на основе концентрированного раствора коллагена имеет существенный недостаток, заложенный в технологии его получения - это значительное помутнение коллагеновых гидрогелей в условиях, максимально приближенных к in vivo (см. статью Achilli M, Mantovani D. «Tailoring Mechanical Properties of Collagen-Based Scaffolds for Vascular Tissue Engineering: The Effects of pH, Temperature and Ionic Strength on Gelation», Polymers, 2010, 2(4), 664-680).

Наиболее близким к изобретению по технической сущности, способу изготовления и применения является сухая коллагеновая мембрана гетерогенной плотности на основе нативного коллагена I типа (предпочтительно нативного коллагена свиньи I типа), описанная в патенте RU 2714943. В этом патенте предложена коллагеновая мембрана, которая в гидратированном состоянии является коллагеновым гидрогелем гетерогенной плотности (жесткости), имеющая форму плоского цилиндра, основным компонентом которой является коллаген I типа. Помимо коллагена I типа в состав предлагаемой мембраны входит также коллаген V типа. Согласно патенту, добавление коллагена V типа позволяет регулировать размер фибрилл в коллагеновом гидрогеле и, как следствие, прозрачность готового изделия.

В патенте RU 2714943 предложен также способ изготовления коллагеновой мембраны. Способ приготовления подразделяется на две стадии: получение гидрогеля из стерильного прозрачного водного раствора коллагена и витрификация гидрогеля при постоянный пластической компрессии. Для приготовления геля авторы использовали стерильный прозрачный водный раствор, содержащий коллаген I типа и коллаген V типа.

В патенте RU 2714943 предложен также способ применения коллагеновой мембраны для усиления биомеханических характеристик роговицы человека без потери ее прозрачности; для усиления биомеханических характеристик бельм роговицы человека с целью их подготовки к кератопротезированию; для лечения методом DALK несквозных бельм роговицы, при которых не повреждена десцеметова мембрана и сохранены эндотелиальные клетки, находящиеся на ней; и/или для создания тканеинженерной конструкции аналога роговицы путем формирования слоя эпителиальных клеток роговицы человека на одной из поверхностей мембраны, и формирования слоя эндотелиальных клеток роговицы человека на противоположной поверхности мембраны.

Одним из недостатков искусственной роговицы, описанной в патенте RU 2714943, является ее сложный состав (смесь коллагена I типа и коллагена V типа), что существенно повышает себестоимость производства такого материала. Другим недостатком является ограниченный срок хранения искусственной роговицы, так как при хранении в сухом состоянии (более 3 недель) данный материал становится излишне жестким и очень хрупким, и, как следствие, его становится невозможно использовать по назначению.

Таким образом, в данной области техники остается актуальной потребность в искусственной роговице, которая является биосовместимой, неиммуногенной, оптически прозрачной и прочной, изготовленной из высокоочищенного биоматериала без применения химической модификации.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось улучшение технологии получения искусственной роговицы, описанной в патенте RU 2714943, с целью устранения обозначенных выше недостатков для создания прозрачного, предпочтительно однородного, коллагенового гидрогеля для восстановления роговицы человека, полученного с использованием стерильного прозрачного раствора коллагена, полученного путем экстракции из тканей человека или животных без химической модификации.

В первом варианте осуществления изобретения предлагается коллагеновая мембрана для восстановления роговицы, представляющая собой коллагеновый гидрогель, содержащий нативный коллаген I типа, где содержание нативного коллагена I типа составляет от 5 до 20% мас. Коллагеновая мембрана по изобретению может иметь максимальную нагрузку на разрыв более 20Н.

Вторым вариантом осуществления изобретения является способ получения описанной выше коллагеновой мембраны. Процесс приготовления коллагеновой мембраны разделяется на три стадии: а) получение гидрогеля из стерильного прозрачного водного раствора коллагена, б) витрификация гидрогеля при постоянной пластической компрессии, и в) стадию регидратации коллагеновой мембраны, полученной на стадии б).

Для приготовления геля используют стерильный прозрачный водный раствор, содержащий коллаген I типа. Например, в рамках способа по изобретению раствор коллагена можно центрифугировать в цилиндрическом сосуде, затем инкубировать в парах аммиака, а затем инкубировать в стерильной очищенной воде с получением геля. На втором этапе осуществляют компрессионную витрификацию гидрогеля. На данном этапе осуществляют сушку коллагенового гидрогеля. Одновременно с сушкой коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергают пластической компрессии путем приложения к основаниям цилиндрического гидрогеля постоянной нагрузки в диапазоне от 1 до 5 кг. В результате витрификации получают однородную стеклоподобную мембрану, которая при дальнейшем вымачивании в стерильной очищенной воде принимает вид коллагеновой мембраны по изобретению.

В третьем варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению коллагеновой мембраны, описанной выше, для улучшения/восстановления анатомических и функциональных характеристик роговицы глаза. Указанное изделие можно применять для проведения передней послойной и укрепляющей кератопластики для лечения бельм и язв роговицы различной этиологии, птеригиума, кератоконуса, а также при хирургическом лечении травматических повреждений глазного яблока и для создания тканеинженерной конструкции аналога роговицы путем формирования слоя эпителиальных клеток роговицы человека на одной из поверхностей коллагенового гидрогеля и формирования слоя эндотелиальных клеток роговицы человека на противоположной его поверхности.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена фотография упакованного образца изделия.

На фиг. 2A и фиг. 2B представлена фотография образца изделия, представляющего собой однородную коллагеновую мембрану диаметром 21 мм и толщиной 500 мкм.

На фиг. 3A и фиг. 3B представлена фотография оперированного глаза кролика, через 6 месяцев после операции, до снятия швов (фиг. 3A) и после снятия швов (фиг. 3B).

Осуществление изобретения

В настоящем изобретении выражения «содержит» и «включает» и их производные используются взаимозаменяемо и понимаются как неограничивающие, т.е. допускающие присутствие/использование других компонентов, стадий, условий и т.п., помимо тех, что перечислены в явном виде. Напротив, выражения «состоит из» и «составлен из» и их производные предназначены для указания на то, что перечисленные затем компоненты, стадии, условия и т.п. являются исчерпывающими.

Термин «мембрана» используется в настоящем изобретения в широком смысле как обозначение тонкого прозрачного слоя, предназначенного для размещения на наружной поверхности структур глаза с целью восстановления роговицы глаза.

Термин «восстановление роговицы» используется в настоящем изобретении в широком смысле для обозначения устранения любых дефектов/повреждений роговицы глаза, в том числе для улучшения и/или восстановления анатомических и функциональных характеристик роговицы глаза.

В настоящем изобретении, когда для какой-либо величины приводится диапазон возможных значений, подразумевается, что граничные точки этого диапазона также включены в объем настоящего изобретения. Следует понимать, что все поддиапазоны, лежащие в приведенных диапазонах, также включены в объем настоящего изобретения, как если бы они были указаны в явном виде. В случае, когда для какой-либо величины приведены несколько диапазонов возможных значений, все диапазоны, получаемые путем комбинирования различных граничных точек из указанных диапазонов, также включены в настоящее изобретение, как если бы они были указаны в явном виде.

В случае, когда какие-то признаки изобретения раскрыты в настоящем документе для одного варианта осуществления, эти признаки также могут быть использованы и во всех других вариантах осуществления изобретения, при условии, что это не противоречит букве и духу изобретения.

В рамках настоящего изобретения термины в единственном числе охватывают также и соответствующие термины во множественном числе, и наоборот, при условии, что из контекста явно не следует иное.

В настоящем документе выражение «или» следует воспринимать как «и/или», при условии, что это не противоречит контексту, даже несмотря на то, что в некоторых случаях выражение «и/или» может использоваться в явном виде.

В настоящем документе выражение «изготовлен по существу из» следует понимать, как указание на то, что, хотя в изделии и могут присутствовать известные специалистам в данной области техники примеси и дополнительные компоненты, эти примеси и дополнительные компоненты могут присутствовать лишь в таком количестве, которое не оказывает существенного влияния на обсуждаемые в настоящем изобретении явления и свойства. В частности (но не ограничиваясь только этим), выражение «изготовлен по существу из» охватывает в том числе вариант «изготовлен исключительно из».

За исключением экспериментальной части описания, все численные значения, выражающие какие-либо количества и условия в настоящем изобретении, являются приближенными, и их следует читать, как предваряемые термином «приблизительно» или «около», даже если эти термины и не приводятся в явном виде. Напротив, в экспериментальной части описания все численные величины приведены настолько точно, насколько это возможно, однако следует понимать, что любая экспериментально определенная величина по природе своей несет в себе некоторую погрешность. Таким образом, все численные величины, приведенные в экспериментальной части описания, следует воспринимать с учетом существования указанной экспериментальной погрешности и, по меньшей мере, с учетом количества приведенных значащих цифр и стандартных методик округления.

В настоящем документе все проценты являются массовыми, если явно не указано иное.

Как указано выше, настоящее изобретение основано на однородном коллагеновом гидрогеле, имеющем форму плоского округлого диска, который содержит коллагена I типа и таким образом обеспечивает необходимую жесткость искусственной роговицы.

В предпочтительном варианте толщина коллагеновой мембраны согласно изобретению составляет от 0,3 до 1,2 мм, предпочтительно 400-800 мкм, более предпочтительно 410-710 мкм, а диаметр ее лежит в диапазоне от 15 до 25 мм, предпочтительно составляет 18-23 мм, более предпочтительно 20-23 мм.

В предпочтительном варианте коллагеновая мембрана изготовлена по существу из гидрогеля коллагена I типа, в некоторых вариантах осуществления - исключительно из гидрогеля коллагена I типа.

Предпочтительно коллаген I типа в настоящем изобретении является нативным коллагеном I типа. Под нативностью коллагена в настоящем изобретении понимается то, что данный белок был экстрагирован в раствор из ткани без ферментативной обработки пепсином или другими протеолитическими препаратами.

Коллаген I типа для использования в настоящем изобретении может быть получен известными методами от различных животных, включая свиней, крыс, коров, людей и т.п. В наиболее предпочтительном варианте в рамках настоящего изобретения коллаген является коллагеном свиней.

В предпочтительном варианте осуществления в коллагеновой мембране по изобретению на коллаген I типа приходится от 5 до 20% мас., наиболее предпочтительно от 8 до 15% мас. от совокупной массы гидрогеля.

Коэффициент пропускания света в диапазоне длин волн от 400 до 780 нм (прозрачность) коллагеновой мембраны по изобретению, как правило, составляет не менее, чем 80% при толщине коллагенового гидрогеля 0,5 мм, в случае, когда мембрана изготовлена из раствора коллагена с концентрацией 20 мг/мл.

Одной из отличительных особенностей коллагеновой мембраны по изобретению является то, что ее получают и хранят в гидратированном состоянии, и такая коллагеновая мембрана в течение долгого времени сохраняет прочностные характеристики, достаточные для ее фиксации с использованием хирургического шва. Это позволяет увеличить срок хранения минимум до 1 года.

Коллагеновая мембрана по изобретению может быть получена способом согласно второму варианту осуществления изобретения, где указанный способ включает стадию образования геля, стадию витрификации при постоянной пластической компрессии и стадию регидратации.

Стадия образования геля

Для осуществления стадии образования геля наиболее предпочтительно используют стерильный прозрачный водный раствор, содержащий нативный коллаген свиньи I типа, полученный в соответствии с описанием, приведенным в патенте RU 2715715 и/или в патенте RU 2714943. Для наглядности, ниже приводится краткое описание способа получения стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого коллагена согласно патенту RU 2715715.

Этот способ получения раствора коллагена включает несколько этапов, выполняемых в заданной последовательности:

1) экстракция коллаген-содержащей ткани, такой как сухожилия, плацента млекопитающих животных, таких как бык, свинья, крыса или человек, в раствор разбавленной (не более 0,5 М) органической кислоты после тщательной отмывки от белковых неколлагеновых примесей с использованием щелочных или нейтральных водно-солевых растворов (например, 0,5М Na₂HPO₄) и от примесных белков, гликопротеинов, жиросодержащих агрегатов с использованием органических растворителей (например, ацетон, этанол, ацетонитрил);

2) многократная (не менее 3 раз) очистка кислого водно-солевого экстракта от потенциально иммуногенных макромолекул путем избирательного осаждения коллагена высокими концентрациями хлорида натрия (до 3М) при низкой температуре раствора (менее 10°С);

3) Очистка кислого водно-солевого экстракта от оставшихся примесей потенциально иммуногенных макромолекул методом адсорбции оставшихся примесей на ДЭАЭ-целлюлозе;

4) Очистка от пирогенных примесей методом адсорбции липосахаридов на аффинном сорбенте (например, с иммобилизованным полимиксином (Affi-Prep®) или специфичными к ЛПС антителами);

5) Очистка от примесей обычных и спорообразующих микроорганизмов, а также надмолекулярных агрегатов коллагена методом микрофильтрации кислых растворов коллагена через мембраны с диаметром пор 0,22-0,45 мкм;

6) Доведение раствора коллагена до требуемой концентрации в нем белка-коллагена, молекулы которого сохраняют структуру тройной спирали и имеют молекулярную массу не менее 300 кДа, одним из известных методов: ультрафильтрация, упаривание, лиофилизация и растворение, или абсорбция воды нерастворимыми гидрофильными полимерами.

Общая концентрация коллагена в водном растворе коллагена, используемом в настоящем изобретении, может быть подобрана специалистом в данной области техники, но обычно она лежит в диапазоне от 5 до 35 мг/мл, наиболее предпочтительно – в диапазоне от 20 до 30 мг/мл.

Для формирования коллагенового гидрогеля необходимый объем стерильного прозрачного раствора коллагена аккуратно, избегая появления пузырьков воздуха, добавляют в цилиндрическую чашу. Далее чашу с раствором центрифугируют, например при скорости вращения ротора 3000-5000 об/ мин, наиболее предпочтительно 4000 об/мин. Центрифугирование предпочтительно осуществляют при температуре +5°С в течение 30 мин. В одном варианте осуществления центрифугирование может осуществляться в планшете (например, в 24-х луночном планшете).

После завершения центрифугирования форму с раствором коллагена инкубируют в парах аммиака. В предпочтительном варианте осуществления инкубирование в парах аммиака проводят при +4°С в течение 12 часов. Полученный коллагеновый гидрогель извлекают из формы и инкубируют в стерильной очищенной воде. В предпочтительном варианте осуществления инкубирование в стерильной очищенной воде проводят в течение 24 часов при +20°С. В качестве стерильной очищенной воды может быть использована вода, очищенная известными специалисту методами, такими как дистилляция, обратный осмос и т.п.

Следующий этап представляет собой компрессионную витрификацию. На данном этапе осуществляют сушку коллагенового гидрогеля. В предпочтительном варианте осуществления сушку осуществляют в условиях контролируемой температуры и влажности, например при 20°С и при относительной влажности 60-70% в течение 1 недели. Одновременно с сушкой коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергают пластической компрессии, путем приложения к основаниям гидрогеля постоянной нагрузки на протяжении всего времени сушки.

Отличительным признаком способа получения коллагеновой мембраны согласно изобретению является то, что, в отличие от использованной в патенте RU 2714943 на стадии компрессионной витрификации нагрузки в 15-50 г, в настоящем изобретении используется более высокая нагрузка в диапазоне от 1 до 5 кг, предпочтительно около 3 кг. Прикладывание такой нагрузки во время сушки и компрессионной витрификации позволяет сформировать однородную прозрачную и прочную коллагеновую мембрану без использования коллагена V типа.

Следующий этап представляет собой регидратацию высушенной коллагеновой мембраны. Для этого полученную мембрану вымачивают в стерильной очищенной воде. В предпочтительном варианте осуществления вымачивание осуществляют в течение небольшого промежутка времени, такого как 5 минут. Затем изделие, как будет понятно специалистам, можно разместить в предварительно простерилизованной первичной упаковке, соответствующей требованиям ГОСТ ИСО 11607-1-2018, например путем выкладывания изделия на плоской подложке, например на подложке из фторопласта. После этого изделие упаковывают под вакуумом, например в стерильный металлизированный вакуумный пакет. Такая упаковка изделия позволяет сохранять ее свойства (толщина, диаметр, прозрачность, прочность, биосовместимость, стерильность), как минимум, в течение одного года при хранении при температуре от 4°С до 10°С.

При использовании необходимый размер коллагеновой мембраны хирург может подрезать непосредственно в ходе операции.

Коллагеновая мембрана по изобретению выгодным образом характеризуется максимальной нагрузкой на разрыв более 20Н, а предпочтительно - более 23Н. Максимальная нагрузка на разрыв может быть измерена любым известным специалисту способом, например в соответствии с масштабированным аналогом теста ASTM D5748.

Далее в описании более подробно описаны осуществление изобретения, способ изготовления коллагеновой мембраны и ее применение. Приведенные примеры являются иллюстративными и не должны восприниматься, как основание для ограничения притязаний по изобретению.

Пример 1. Способ изготовления

Для приготовления изделия был использован стерильный прозрачный водный раствор, содержащий 30 мг/мл нативного коллагена свиньи I типа, полученный согласно патенту RU 2715715, как раскрыто выше в настоящем изобретении. Для формирования коллагенового гидрогеля 0,5 мл стерильного прозрачного раствора коллагена аккуратно, избегая появления пузырьков воздуха, добавляют в цилиндрическую чашу с диаметром 15,4 мм. Далее чашу с раствором центрифугируют на скорости 4000 об/мин при температуре +5°С в течение 30 мин, после чего форму с раствором коллагена инкубируют в парах аммиака при +4°С в течение 12 часов. Полученный коллагеновый гидрогель извлекают из формы и инкубируют в 20 мл стерильной дистиллированной воды в течение 24 часов при +20°С.

Затем осуществляли сушку коллагенового гидрогеля в условиях контролируемой температуры (20°С) и влажности (60-70%) на протяжении 1 недели. Одновременно с этим коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергали пластической компрессии путем приложения к основаниям гидрогеля постоянной нагрузки в 3 кг на протяжении всего времени сушки. По окончании процесса витрификации компрессированный коллагеновый гидрогель принимал форму однородной стеклоподобной мембраны.

Полученную мембрану вымачивали в стерильной очищенной воде на протяжении 5 минут, после чего выкладывали на плоскую подложку из фторопласта, помещали в предварительно простерилизованную первичную упаковку, соответствующую требованиям ГОСТ ИСО 11607-1-2018, а затем упаковывали под вакуумом в стерильный металлизированный вакуумный пакет.

Толщина мембраны после регидратации составила 0,52±0,03 мм, а диаметр – 21,0±0,3 мм (cм. Фиг. 1). Упакованное таким образом изделие может сохранять свои свойства (толщина, диаметр, прозрачность, прочность, биосовместимость, стерильность), как минимум, в течение одного года при хранении при температуре от 4°С до 10°С.

Измерение максимальной нагрузки на разрыв

Полученное изделие зажимали между двух металлических пластин с отверстием 3 мм в центре, таким образом, чтобы отверстие было в центральной области. Готовую конструкцию опускали в физиологический раствор, чтобы препятствовать высыханию мембраны во время исследования. Биомеханические свойства оценивали, используя масштабированный аналог теста ASTM D5748. Исследование состоит в двухосном нагружении коллагеновой мембраны с постоянной скоростью до прокола. Испытания проводили на универсальной испытательной машине фирмы «Instron» модель 5982 с использованием датчика нагрузки ±50 Н серии 2530. По результатам испытаний определялась максимальная нагрузка на разрыв, характеризующая прочность образцов, которая для данной мембраны составила 23,2±0,5Н.

Пример 2. Влияние прикладываемой во время пластической компрессии нагрузки на прозрачность и прочность готового изделия

В соответствии с методом, описанным в примере 1, и методом, описанным в патенте RU 2714943, варьируя прикладываемую во время пластической компрессии нагрузку, были приготовлены различные образцы коллагеновый мембраны толщиной около 500 мкм из стерильного прозрачного раствора коллагена с концентрацией 25 мг/мл. Контроль прозрачности изделий осуществляли при помощи спектрофотометра ПЭ-5400УФ (Экросхим, Россия) в диапазоне длин волн от 400 до 780 нм. Из результатов, представленных в таблице 1, видно, что при нагрузке от 1 до 5 кг образцы коллагеновых гидрогелей, как с коллагеном V типа, так и без него, имеют сопоставимую прозрачность. При этом образцы коллагеновых гидрогелей без коллагена V типа обладали лучшими механическим характеристиками. Таким образом, прикладываемая во время пластической компрессии нагрузка в диапазоне от 1 до 5 кг, предпочтительно 3 кг, позволяет изготавливать коллагеновый гидрогель, который по своим оптическим характеристикам сопоставим с коллагеновым гидрогелем, приготовленным по методике, описанной в патенте RU 2714943. Однако более высокая нагрузка позволяет упростить состав гидрогеля и повысить прочность коллагенового гидрогеля по сравнению с коллагеновым гидрогелем, приготовленным по методике, описанной в патенте RU 2714943.

Таблица 1

Изделие	Прикладываемая во время пластической компрессии нагрузка	Коэффициент пропускания света через изделие толщиной 500 мкм,%	Максимальная нагрузка на разрыв, Н
По патенту RU 2714943 (с использованием коллагена V типа)	30 г	85,1±1,5 (λ=400) 95,3±1,1 (λ=780)	17,1 ± 0,6
	500 г	85,5±1,1 (λ=400) 95,6±1,6 (λ=780)	17,7 ± 0,8
	1000 г	85,8±1,7 (λ=400) 95,9±1,4 (λ=780)	17,6 ± 0,3
	3000 г	85,8±1,5 (λ=400) 95,9±1,6 (λ=780)	17,8 ± 0,7
	5000 г	85,8±1,3 (λ=400) 95,9±1,7 (λ=780)	17,6 ± 0,3
10000 г	Разрушение материала
По примеру 1 (согласно изобретению)	30 г	75,1±1,2 (λ=400) 83,3±1,1 (λ=780)	23,2 ± 0,5
	500 г	78,1±1,2 (λ=400) 85,3±0,9 (λ=780)	23,5 ± 0,3
	1000 г	80,1±1,0 (λ=400) 90,3±1,3 (λ=780)	23,5 ± 0,6
	3000 г	81,2±0,5 (λ=400) 92,3±1,0 (λ=780)	23,4 ± 0,1
	5000 г	81,3±0,8 (λ=400) 92,4±1,1 (λ=780)	23,5 ± 0,2
10000 г	Разрушение материала

Пример 3. Вариант применения для усиления биомеханических характеристик глаза

В соответствии с методом, описанным в примере 1, были приготовлены коллагеновые мембраны толщиной около 500 мкм и диаметром 18,5 мм из стерильного прозрачного раствора коллагена с концентрацией 30 мг/мл.

Двенадцати кроликам-самцам породы шиншилла, массой 3,5 кг, оперировали левый глаз. Выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% новокаином. Производился разрез роговицы протяженностью 5 мм на 2/3 ее глубины концентрично лимбу. В данной плоскости при помощи расслаивателя формировали роговичный интрастромальный карман «от лимба до лимба». При помощи пинцета для завязывания и шпателя вводили имплантат в полость сформированного кармана. На разрез накладывались швы. Далее в течение одной недели инстиллировали окомистин по 1 капле 2 раза в день.

Клиническую оценку состояния глаз животных проводили по степени воспалительной реакции, васкуляризации роговицы, интенсивности помутнения роговицы.

Результаты экспериментов оценивали морфологически. Роговую оболочку вырезали по окружности лимба, а затем фиксировали ее в формалине в течение суток. Полученный диск роговицы разрезали пополам. Оба фрагмента обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Срезы толщиной 8-10 мкм изготавливали на микротоме и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование срезов роговицы проводили под световым микроскопом при 16- и 40-кратном увеличении.

Для исследования биомеханических характеристик роговую оболочку вырезали по окружности, захватывая при этом участок склеры, отступая 3 мм от лимба. Для чистоты эксперимента использовали свежевыкроенные ткани животных, полученные непосредственно перед проведением исследования. Полученный диск роговицы зажимали между двух металлических пластин с отверстием в центре, соответствующем диаметру роговицы, таким образом, чтобы фиксация происходила за ткань склеры, а роговица была интактной. Готовую конструкцию опускали в физиологический раствор, чтобы препятствовать высыханию тканей во время исследования. Оценку биомеханических свойств проводили при помощи исследования тканей на прокол на разрывных машинах фирмы «Instron».

В раннем послеоперационном периоде отмечено наличие незначительного отека роговицы. Отек был слабо выражен и обусловлен, по всей видимости, наличием операционной травмы. Клинических признаков острого инфекционного поражения окружающих тканей при осмотре не обнаружено. Далее клиническая картина была стабильная. Через 2 месяца клинически значимых изменений не отмечалось. К концу периода наблюдения, через 6 месяцев, гистологическое исследование области трансплантата показало его частичное разволокнение и интеграцию с окружающей стромой. Роговица при этом незначительно утолщена. Исследование биомеханических свойств показало повышение прочностных характеристик тканей в 2,5 раза.

Пример 4. Вариант применения для восстановления целостности роговицы

В соответствии с методом, описанным в примере 1, были приготовлены коллагеновые мембраны толщиной около 410 мкм и диаметром 18,5 мм из стерильного прозрачного раствора коллагена с концентрацией 30 мг/мл.

Шести кроликам-самцам породы шиншилла, массой 3,5 кг, оперировали левый глаз. Выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% новокаином. Выполняли несквозную трепанацию поверхностных слоёв роговицы на 2\3 её глубины. Затем при помощи расслаивателя проводили иссечение поверхностных слоёв чтобы сформировалось трепанационное ложе в области операции, в которое затем помещали коллагеновый имплантат в виде диска диаметром на 1 мм больше диаметра трепанационного отверстия и фиксировали его непрерывным швом. Излишки материала подворачивались под край трепанации и обеспечивали дополнительную механическую фиксацию. Далее в течение одной недели инстиллировали окомистин по 1 капле 2 раза в день.

Клиническую оценку состояния глаз животных, морфологические проводили согласно примеру 3.

В раннем послеоперационном периоде отмечено наличие незначительного отека роговицы. Отек был слабо выражен и обусловлен, по всей видимости, наличием операционной травмы. Клинических признаков острого инфекционного поражения окружающих тканей при осмотре не обнаружено. На 7-й день отмечалось появление новообразованных сосудов эксцентрично лимбу которые запустевали к концу 2ой недели. К концу первого месяца отмечалась стойкая стабилизация клинической картины. Через 2 месяца клинически значимых изменений не отмечалось. К концу периода наблюдения (6 месяцев) у кролика наблюдалось прозрачное приживление трансплантата и отсутствие признаков воспаления (фиг. 3). Гистологическое исследование области трансплантата показало его частичное разволокнение и интеграцию с окружающей стромой, особенно в месте контакта с краем трепанационного отверстия, в некоторых местах под трансплантатом наблюдалось образование незначительного количества соединительной ткани и признаки рубцевания. Роговица хорошо эпителизирована, гладкая и блестящая.

Пример 5. Иллюстрация необходимости использования вакуумной упаковки для сохранения основных свойств изделия

В соответствии с методом, описанным в примере 1, были приготовлены коллагеновые мембраны толщиной около 500 мкм и диаметром 18,5 мм из стерильного прозрачного раствора коллагена с концентрацией 30 мг/мл. Мембраны были разделены на 3 группы по способу хранения. Первая - в герметичной вакуумной упаковке; вторая – в герметичной упаковке, соответствующей требованиям ГОСТ ИСО 11607-1-2018; третья - в герметичном стакане с дистиллированной водой. По пять мембран в каждой группе было заложено на опытное хранение в интервале температур от +4°С до +10°С. Через год мембраны извлекались для проведения оценки их основных свойств (толщина, диаметр, прозрачность, прочность, биосовместимость, стерильность) в сравнении со свежеприготовленным материалом. Результаты приведены в таблице 2. Как видно из результатов, представленных в таблице 2, только мембраны из группы 1 (в герметичной вакуумной упаковке) могут сохранять все свои свойства (толщина, диаметр, прозрачность, прочность, биосовместимость, стерильность), как минимум, в течение одного года при хранении при температуре от +4°С до +10°.

Таблица 2

	Толщина, мкм	Диаметр, мм	Коэффициент пропускания света, %	Нагрузка на разрыв, Н	Биосовмести- мость*	Стерильность
Группа 1	500; 490; 510; 505; 502	20,1; 20,3; 20,2; 20,1; 20,0	λ=400: 81,1; 82,0; 80,5; 80,8; 81,4 λ=780: 92,3; 93,1; 92,0; 92,5;92,8	23,4; 23,3; 23,5; 23,6; 23,4	Да, для всех	Да, для всех
Группа 2	300; 310; 305; 300; 306	20,1; 20,3; 20,2; 20,1; 20,0	λ=400: 82,1; 81,0; 81,5; 81,8; 80,4 λ=780: 91,3; 92,1; 92,0; 91,5;92,8	Не пригоден для проведения оценки, разрушился при манипуляциях	Да, для всех	Да, для всех
Группа 3	1100; 1050; 1070; 1060; 1005	20,1; 20,3; 20,2; 20,1; 20,0	λ=400: 80,1; 80,0; 79,5; 79,8; 80,4 λ=780: 90,3; 91,1; 90,0; 90,5;90,8	10,4; 10,3; 9,7; 10,3; 8,4	Да, для всех	Да, для всех
Контроль	500; 495; 505; 510; 508	20,1; 20,3; 20,2; 20,1; 20,0	λ=400: 81,1; 82,0; 80,5; 80,8; 81,4 λ=780: 92,3; 93,1; 92,0; 92,5;92,8	23,3; 23,4; 23,3; 23,5; 23,5	Да, для всех	Да, для всех

*Биосовместимость проверяли in vitro с использованием стромальных клеток роговицы кролика.

Пример 6. Влияние содержания нативного коллагена I типа в готовом изделии на прозрачность и прочность

В соответствии с методом, описанным в примере 1, были приготовлены коллагеновые мембраны толщиной около 500 мкм и диаметром 20 мм, в которых содержание нативного коллагена I типа варьировалось в диапазоне от 2% до 30% в расчете на совокупную массу изделия.

Контроль прозрачности изделий осуществляли при помощи спектрофотометра ПЭ-5400УФ (Экросхим, Россия) в диапазоне длин волн от 400 до 780 нм. Нагрузку на разрыв измеряли по методу, описанному в примере 1. В соответствии с полученными результатами, представленными в таблице 3, оптимальным по параметрам прозрачность-прочность содержанием нативного коллагена I типа в изделии является содержание от 5 до 20% мас., предпочтительно от 8 до 15% в расчете на совокупную массу готового изделия.

Таблица 3

Содержание нативного коллагена I типа, %	Коэффициентом пропускания света, %	Нагрузка на разрыв, Н
2	87,5±0,3 (λ=400); 98,3±0,2 (λ=780)	18,2
5	85,2±0,6 (λ=400); 95,3±0,8 (λ=780)	20,4
8	83,2±0,8 (λ=400); 93,2±0,5 (λ=780)	21,4
10	81,0±0,8 (λ=400); 91,5±1,0 (λ=780)	23,4
15	80,5±0,6 (λ=400); 90,6±1,2 (λ=780)	25,4
20	80,0±0,2 (λ=400); 90,1±1,1 (λ=780)	26,4
30	73,0±0,2 (λ=400); 84,1±1,1 (λ=780)	35,1

1. Коллагеновая мембрана для восстановления роговицы, представляющая собой коллагеновый гидрогель, содержащий нативный коллаген I типа, где содержание нативного коллагена I типа составляет от 5 до 20 мас.% от совокупной массы коллагенового гидрогеля, и где указанная коллагеновая мембрана характеризуется максимальной нагрузкой на разрыв более 20 Н.

2. Коллагеновая мембрана по п. 1, где коллагеновая мембрана изготовлена по существу из гидрогеля коллагена I типа.

3. Коллагеновая мембрана по п. 1, где коллагеновая мембрана изготовлена исключительно из гидрогеля коллагена I типа.

4. Коллагеновая мембрана по любому из пп. 1-3, толщина которой находится в диапазоне от 0,3 до 1,2 мм, а диаметр которой находится в диапазоне от 18 до 25 мм.

5. Коллагеновая мембрана по любому из пп. 1-4, толщина которой находится в диапазоне от 0,4 до 0,8 мм, а диаметр которой находится в диапазоне от 20 до 23 мм.

6. Коллагеновая мембрана по любому из пп. 1-5, в которой содержание нативного коллагена I типа составляет от 8 до 15 мас.% в расчете на совокупную массу коллагенового гидрогеля.

7. Коллагеновая мембрана по любому из пп. 1-6, в которой нативный коллаген I типа является нативным коллагеном свиньи I типа.

8. Коллагеновая мембрана по любому из пп. 1-7, где максимальная нагрузка на разрыв составляет более 23 Н.

9. Коллагеновая мембрана по любому из пп. 1-8, которая является биосовместимой, стерильной и оптически прозрачной.

10. Коллагеновая мембрана по любому из пп. 1-9, прозрачность которой характеризуется коэффициентом пропускания света в диапазоне длин волны от 400 до 780 нм не менее 80% при толщине искусственной роговицы 0,5 мм, в случае, когда она изготовлена из раствора коллагена с концентрацией 20 мг/мл.

11. Коллагеновая мембрана по любому из пп. 1-10, упакованная в вакуумную упаковку и имеющая срок годности как минимум 1 год.

12. Способ получения коллагеновой мембраны для восстановления роговицы по любому из пп. 1-11, включающий следующие стадии:

а) стадию получения гидрогеля цилиндрической формы из стерильного прозрачного водного раствора коллагена I типа;

б) стадию витрификация гидрогеля, полученного на стадии a), при постоянной пластической компрессии с получением однородной стеклоподобной мембраны, причем пластическую компрессию осуществляют путем приложения к основаниям коллагенового гидрогеля постоянной нагрузки в диапазоне от 1 до 5 кг;

в) стадию регидратации коллагеновой мембраны, полученной на стадии б).

13. Способ по п. 12, в котором пластическую компрессию осуществляют путем приложения к основаниям коллагенового гидрогеля постоянной нагрузки 3 кг.

14. Способ по п. 13, в котором постоянную нагрузку прикладывают на протяжении всего времени витрификации.

15. Способ по любому из пп. 12-14, в котором общая концентрация коллагена в растворе коллагена составляет от 5 до 35 мг/мл.

16. Способ по п. 15, в котором общая концентрация коллагена в растворе коллагена составляет от 20 до 30 мг/мл.

17. Способ по любому из пп. 12-16, в котором получение гидрогеля на стадии a) осуществляют путем центрифугирования раствора коллагена в цилиндрическом сосуде, инкубирования в парах аммиака с последующим инкубированием в стерильной очищенной воде.

18. Способ по любому из пп. 12-17, в котором стадию витрификации осуществляют в условиях контролируемой температуры и влажности.

19. Способ по п. 18, в котором стадию витрификации осуществляют при температуре 20°С и при относительной влажности 60-70%.

20. Способ по любому из пп. 12-19, в котором на стадии регидратации полученную мембрану вымачивают в стерильной очищенной воде на протяжении 5 минут.

21. Способ по любому из пп. 12-20, в котором регидратированную коллагеновую мембрану дополнительно выкладывают на плоскую подложку из фторопласта, помещают в предварительно простерилизованную первичную упаковку, а затем упаковывают под вакуумом в стерильный металлизированный вакуумный пакет.

22. Коллагеновая мембрана для восстановления роговицы, полученная способом по любому из пп. 12-21.

23. Применение коллагеновой мембраны для восстановления роговицы по любому из пп. 1-11 или 22 для улучшения и/или восстановления анатомических и функциональных характеристик роговицы глаза.

24. Применение по п. 23, где коллагеновую мембрану для восстановления роговицы применяют для передней послойной и укрепляющей кератопластики для лечения бельм и/или язв роговицы различной этиологии, птеригиума или кератоконуса, или при хирургическом лечении травматических повреждений глазного яблока, или для создания тканеинженерной конструкции аналога роговицы путем формирования слоя эпителиальных клеток роговицы человека на одной из поверхностей коллагенового гидрогеля и формирования слоя эндотелиальных клеток роговицы человека на противоположной его поверхности.