Способ получения коллагенового материала и многослойных коллагеновых мембран для хирургии

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способу получения коллагенового материала из перикардиальной ткани, включающему очистку перикарда от сопутствующих компонентов, обработку растворами солей, обезжиривание, отмывание, высушивание, упаковку и стерилизацию, отличающемуся тем, что перикард обрабатывают насыщенным раствором NaCl, раствором 8 М мочевины и раствором 4 М гуанидин гидрохлорида, обезжиривают в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 1:2 и в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 2:1, обрабатывают 1,5-3% Н₂О₂ в течение 20 часов, инкубируют в 0,4 N NaOH, отмывают, лиофильно высушивают, помещают под пресс на 24 часа, разрезают на фрагменты, пакуют и стерилизуют радиационным облучением, а также относится к способу получения коллагенового материала из перикардиальной ткани, характеризующемуся тем, что коллагеновый материал без дополнительной обработки, либо покрытый с одной стороны несколькими слоями клея БФ-6, инкубируют в растворе, содержащем NaOH и Na₂SO₄, в течение 1,5-4 часов, отмывают, обрабатывают 0,2 N уксусной кислотой, лиофильно высушивают, фиксируют в растворе спирт-формалина или глутарового альдегида, отмывают, снова лиофильно высушивают и прессуют. Группа изобретений обеспечивает повышение качества выделения коллагена из перикарда и получение многослойных, полифункциональных коллагеновых мембран. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

 

Группа изобретений относится к медицине, а более конкретно к имплантату в виде коллагеновой мембраны для использования при направленной регенерации, а именно к технологии получения биологических - барьерных и композиционных материалов, которые применяются в качестве пластических средств при оперативном замещении дефектов при повреждении и деструкции разных видов соединительной ткани (кожа, хрящ, кость и т.д.), в пластической хирургии при восстановлении объёма органов или тканей, а также в качестве носителя клеток, активных соединений или лекарственных средств [МПК A61K35/34, A61K38/39, A01N1/02, A61L27/24, A61L15/32] .  

Из уровня техники известен СПОСОБ ПРЕДИМПЛАНТАЦИОННОЙ ОБРАБОТКИ БИОПРОТЕЗОВ СОСУДОВ И КЛАПАНОВ СЕРДЦА [RU 2120212C1, опубл. 20.10.1998], включающий обработку ткани в растворе глутарового альдегида с последующей обработкой поверхностно-активным веществом, отличающийся тем, что поверхностно-активное вещество используют в режиме интенсивного встряхивания при многократной смене рабочего раствора, по меньшей мере четырехкратной.   

Также из уровня техники известен СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МНОГОСЛОЙНОЙ МЕМБРАНЫ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИ НАПРАВЛЕННОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНЕЙ [RU 2217171C2, опубл. 27.11.2003], при котором перитонеальные мембраны молодых телят используют в качестве барьерного слоя, содержащего коллаген I и III типов. При этом на такой слой наносят пасту из коллагена типа II и, таким образом, после многочисленных процедур, получают двухслойную мембрану, губчатый слой которой содержит коллаген хрящевой ткани. Для получения трёхслойной мембраны матриксный губчатый слой размещают между двумя барьерными слоями, изготовленными из перитонеальной мембраны.    

Недостатками данных аналогов является их высокие трудоёмкости и затратности, они не обеспечивают высокую чистоту коллагена в барьерном слое, и для создания определённой величины пор в губчатом слое требуются сложные технологические подходы.        

Кроме того, из уровня техники известен СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУХСЛОЙНОЙ БАРЬЕРНОЙ МЕМБРАНЫ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ КОСТНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ [RU 2689782C1, опубл. 29.05.2019], при котором для получения внутреннего гидрофильного пористого слоя используют хитозан в конечной концентрации 2 мг/мл, а для получения внешнего гидрофобного сплошного слоя поли-L-лактид-гликолид.    

Недостатками данного способа является то, что он не обеспечивает природную структуру соединительно-тканного матрикса и не обладает высокими прочностными характеристиками.  Кроме того, такая обработка также трудоёмка и высоко затратна.   

Также из уровня техники известен СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАТЕРИАЛА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ОФТАЛЬМОЛОГИИ [RU 2054283 C1, опубл. 20.02.1996], который осуществляется путем обработки перикарда сельскохозяйственных животных, который механически очищают, заливают 0,9% раствором хлорида натрия и дистиллированной водой, после чего помещают в раствор аммиака и этилового спирта, затем отмывают водой и заливают этиловым спиртом.    

Недостатком данного аналога является то, что обработка перикарда не обеспечивает полное освобождение данной ткани от антигенов - неколлагеновых белков, жиров, липопротеидов, протеогликанов и других веществ, которые снижают биосовместимость и биоинтеграцию материала. Такая обработка не позволяет обеспечить получение губчатых мембран с определённой величиной пор коллагеновой матрицы и разным количеством слоёв, выполняющих различные функции, такие как барьерную, матриксную, депонирующую и стимулирующую регенерацию.   

Наиболее близким по технической сущности является СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНОВЫХ ИМПЛАНТАТОВ [RU 2360690C1, опубл. 10.07.2009], включающий механическую очистку, обработку раствором щелочи, обработку раствором кислоты, консервацию и стерилизацию, отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют сухожилия, связки, фасции, твердую мозговую оболочку, перикард, хрящи человека и животных, заготовки обрабатывают смесью 1%-ного раствора Triton х-100 и 3%-ного раствора дезоксихолата натрия при температуре 30°С в течение 3-6 ч с двукратной сменой раствора, обрабатывают 0,1М раствором гидроксида натрия в течение 10 ч, обрабатывают раствором, содержащим 1М соляной кислоты и 1М хлорида натрия в течение 10 ч, обрабатывают раствором, содержащим 1М хлорида натрия и 0,1М фосфатного буфера в течение 10 ч, промывают 0,1М раствором фосфатного буфера, трехкратно промывают дистиллированной водой. Обработанный таким образом материал лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.   

Основной технической проблемой данного прототипа является то, что применение мягкого детергента тритон Х-100, который используют в биохимии главным образом для выделения мембранных белков, не обеспечивает полное освобождение тканей от неколлагоеновых белков и гликопротеинов, которых остаётся в материале 7%, тогда как в предлагаемом нами способе менее 1%. Кроме того, тритон Х-100 в применяемой концентрации способен разрушать коллаген, как показано при использовании данного препарата в электрофорезе для разделения белковых фракций. Известно также, что Тритон Х-100 является высоко токсичным и взрывоопасным веществом, что делает его мало удобным в промышленном применении и требует тщательной и высокозатратной очистки биоматериалов после их обработки данным соединением. Установлено, что особенно он опасен для водной среды – острая и хроническая токсичность.   

Применение дезоксихолата натрия также не позволяет добиться высокой очистки материала от содержащихся в нем жиров и жиросодержащих соединений. В медицине это соединение в основном используют в косметологии при мезодиссолюции для проведения коррекции жировой ткани. Следует также отметить, что стоимость данных химических веществ велика и составляет для Тритон Х-100 более 350 долларов США за 1 литр, а для дезоксихолата натрия – 100 евро за 100 гр вещества. Это вносит существенный вклад в высокую затратность данного способа.  

Кроме того, полученный данным способом коллагеновый материал не обладает высокими прочностными характеристиками и в организме подвергается очень быстрому разрушению. Это практически сводит на нет выполнение им барьерных функции, а также использование его как носителя клеток и в качестве депо лекарственных и биологически активных веществ.  

Главным отличием является то, что с помощью данного способа невозможно получить мембраны, имеющие многослойную структуру коллагенового матрикса и обладающие уникальными прочностными и функциональными качествами.  

Задачей изобретения является устранение недостатков прототипа.

Техническим результатом изобретения является повышение качества выделения коллагена из перикарда и получение многослойных, полифункциональных коллагеновых мембран.    

Указанный технический результат достигается за счет того, что способ получения коллагенового материала из перикардиальной ткани, включающий очистку перикарда от сопутствующих компонентов, обработку растворами солей, обезжиривание, отмывание, высушивание, упаковку и стерилизацию, отличающийся тем, что перикард обрабатывают насыщенным раствором NaCl, раствором 8 М мочевины и раствором 4 М гуанидин гидрохлорида, обезжиривают в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 1:2 и в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 2:1, обрабатывают 1,5- 3% Н2О2 в течение 20 часов, инкубируют в 0,4 N NaOH, отмывают, лиофильно высушивают, помещают под пресс на 24 часа, разрезают на фрагменты, пакуют и стерилизуют радиационным облучением.

Указанный технический результат достигается за счет того, что способ получения коллагенового материала из перикардиальной ткани, характеризующийся тем, что коллагеновый материал полученный по п.1 без дополнительной обработки, либо покрытый с одной стороны несколькими слоями клея БФ-6 инкубируют в растворе, содержащем NaOH и Na₂SO₄, в течение 1,5- 4 часов, отмывают, обрабатывают 0,2 N уксусной кислотой, лиофильно высушивают, фиксируют в растворе спирт-формалина или глутарового альдегида, отмывают, снова лиофильно высушивают и прессуют.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показана фотография со сканирующего электронного микроскопа Jeol JSM-6380LA мембраны без обработки щелочью.   

На фиг.2 и фиг.3 показаны фотографии с электронного микроскопа после инкубации мембраны в щёлочи в течение 4 часов.   

На фиг.4 показана фотография с электронного микроскопа мембраны с покрытием одной стороны клеем БФ-6.   

Осуществление изобретения 

В качестве сырья для получения коллагеновых мембран используют перикард свиней или крупно рогатого скота, очищенный от мышечной ткани и жира.  

Далее для получения коллагенового материала перикард обрабатывают насыщенным раствором NaCl в течение 24 часов, после чего перикард промывают и инкубируют в растворе 8 М мочевины в течение 48 часов, затем перикард промывают, подсушивают и инкубируют в растворе 4 М гуанидин гидрохлорида в течение 48 часов, далее перикард промывают и лиофильно высушивают, после чего обезжиривают полученный материал из перикарда в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 1:2 и в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 2:1 по 24 часа в каждой смене, далее полученный материал обрабатывают раствором 0.4 N NaOH в течение 24 часов, после чего его промывают в проточной воде и помещают в 1,5 % раствор перекиси водорода на 24 часа, после чего промывают и лиофильно высушивают.   

Для получения коллагенового материала из перикарда животных, полученный на предыдущем этапе материал (см. Фиг.1) инкубируют в растворе гидроксида натрия и насыщенного сульфата натрия от 1,5 до 4 часов, после чего материал из перикарда промывают и подкисляют раствором 0,2 Н HCl до нейтрального рН, затем материал из перикарда обрабатывают  раствором 0,2 N уксусной кислоты в течение 2-24 часов, затем его промывают в дистиллированной воде, и лиофильно высушивают, после чего фиксируют в растворе спирт-формалина в течение 72-96 часов, затем снова промывают, лиофильно высушивают и прессуют (см. фиг 2 и 3). 

Для получения мембраны, имеющей три слоя, сухую пластину из перикарда необходимо обрабатывать в растворе гидроксида натрия, насыщенном сульфатом натрия, от 1.5 до 2-х часов, как это установлено нами экспериментально. При этом щёлочь гидролизует коллаген не на всю глубину пластины, а затрагивает только её поверхностные слои. Дальнейшая обработка уксусной кислотой приводит к образованию на обеих поверхностях пластины губчатой коллагеновой структуры, а внутренний барьерный слой остаётся сохранённым и имеет плотную, относительно непроницаемую для клеток структуру. Такие пластины могут с успехом применяться там, где необходимо эффективно предотвращать врастание клеток различных тканей. При имплантации губчатые поверхностные слои мембраны способны стимулировать клеточную реакцию в зоне контакта, что приводит к сокращению сроков приживления и формированию механически стабильного комплекса ткань-имплантат. 

Для получения двухслойного материала из перикарда животных одну сторону материала из перикарда покрывают клеем БФ-6, высушивают и помещают на 2-4 часа в раствор гидроксида натрия, насыщенном сульфатом натрия, после чего промывают, затем обрабатывают 0,2-0,5 N раствором уксусной кислоты до требуемого объёма набухания, затем промывают и лиофильно высушивают, после чего фиксируют в растворе спирт-формалина в течение 72-96 часов, затем промывают, лиофильно высушивают и прессуют.   

Таким образом, получают материал для хирургической пластики, выполненный в виде прессованной пластины из материала перикарда животного, имеющего пористую структуру коллагенового матрикса, которые обладают исключительной прочностью и эластичностью и в них сохранена природная архитектоника коллагенового матрикса перикарда.  

В спрессованном состоянии пластина из материала перикарда животного имеет толщину 0,1-0,15 мм. Тогда как при смачивании губчатый слой или слои такой пластины моментально впитывают жидкость, и они принимают губчатую структуру, которая была задана им во время набухания в уксусной кислоте.    

Заявителем экспериментально показано, что один квадратный сантиметр такой мембраны способен впитывать от 0,1 до 0,5 мл жидкости. Этот факт открывает большие возможности в их применении. Установлено, что один кубический сантиметр губчатого коллагенового матрикса, полученный по ранее разработанной нами технологии (патент РФ 2273489 С1) способен специфически связывать более 90% тромбоцитов из 1 мл периферической крови. Известно, что тромбоциты в процессе формирования сгустка способны выделять не менее 7 факторов роста, тем самым ускоряя регенерацию тканей (метод применения богатой тромбоцитами плазмы Foster T.E. et.al.,2009). Кроме того, такой коллаген в составе мембран также способен специфически связывать сульфатированные гликозаминогликаны, которые оказывают влияние на многие показатели обмена соединительной ткани (Панасюк А.Ф., Ларионов Е.В., « Хондроитинсульфаты и их роль в обмене хондроцитов и межклеточного матрикса хрящевой ткани». Научно-практическая ревматология, № 2, 2000, стр. 46-55, 2000).  При этом, как сказано выше, такие мембраны, обладая отличной пластичностью, сохраняют и очень высокие прочностные характеристики. Они легко шьются и крайне устойчивы на разрыв.    

Таким образом достигается заявленный технический результат - повышение качества выделения коллагена из перикарда и получение на его основе многослойных, полифункциональных, коллагеновых мембран.    

Рассмотрим влияние на достижение технического результата существенных признаков изобретения.

Перикард животного происхождения, очищенный от мышечной ткани и жира, обрабатывали последовательно насыщенным раствором NaCl, раствором 8М мочевины и раствором 4М гуанидин гидрохлорида. Такая обработка позволяет удалить из ткани практически все белковые соединения, кроме коллагена, а инкубация в растворе гуанидин гидрохлорида позволяет провести изменения конкретных конформаций антигенов и удалить все протеогликаны. Дальнейшее обезжиривание в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 1:2 и в 2-х сменах смеси этанол-хлорофор в соотношении 2:1, а также обработка раствором 0,4 N NaOH и 3% H₂O₂ позволяют полностью удалить из материала жиры и жиросодержащие соединения и получить материал в виде коллагеновой пластины, имеющей уникальные характеристики.    

Существенным признаком изобретения является то, что после обработки перикарда в течение 2-4 часов в растворе гидроксида натрия, насыщенном сульфатом натрия, его обрабатывают в 0,2-0,5 N уксусной кислоте 2-24 часа, лиофильно высушивают и фиксируют в растворе спирт-формалина. Инкубация в щёлочи 2-4 часа при комнатной температуре определена экспериментально и является оптимальной для дальнейшего получения мембран с определенной величиной пор в коллагеновой пластине. Так, при меньшем сроке воздействия щелочи на коллаген перикарда не удается получить достаточного набухания коллагеновой структуры при дальнейшей инкубации в уксусной кислоте и обеспечить заданную порозность. При воздействии щёлочи 3-4 часа и последующем воздействии кислоты происходит набухание (формирование пор) практически на всю толщину перикардиальной пластины (см. фиг. 2 и 3). При воздействии щёлочи 6 часов и более, волокна коллагена сильно гидролизуются, и дальнейшая инкубация в уксусной кислоте приводит к их полному растворению и обеспечивает возможность получения жидкого коллагена.

Время обработки уксусной кислотой и её концентрация также являются существенным признаком, потому что от этих параметров зависят как конечная толщина коллагеновой пластины, так и величина пор в ней. При инкубации в течение 2-4 часов в 0,2 N уксусной кислоте толщина мембраны составляет 1,0-1,5 мм, тогда как в 0,5 N CH₃COOH эта характеристика будет равна 1.8-2.5 мм. С увеличением времени инкубации до 24 часов в 0,5 или 1,0 N CH₃COOH толщина пластины увеличивается и может достигать 5,0-6,0 мм за счет увеличения величины пор. После набухания в уксусной кислоте материал отмывают в воде, замораживают и лиофильно высушивают.      

Существенным признаком изобретения является то, что перед фиксацией в растворе спирт-формалина или глутаровом альдегиде материал, обработанный щёлочью и уксусной кислотой, обязательно должен быть лиофильно высушен. В противном случае при фиксации влажного материала не удается стабилизировать пористую структуру коллагенового слоя и соответственно получить мембраны с заданными характеристиками величины пор. При этом если фиксацию вести под давлением, то толщина мембраны будет меняться в зависимости от силы сдавливания материала. Последнее условие также существенно влияет на окончательную пористость материала.   

Сухие пластины помещают в фиксатор спирт-формалин на 72-96 часов, затем тщательно отмывают в 5-и сменах проточной воды и 2-х сменах дистиллированной воды, лиофильно высушивают и прессуют. Полученные данным способом мембраны имеют уникальную характеристику.    

Существенным признаком изобретения является также то, что по крайней мере 2-кратное покрытие клеем БФ-6 одной из сторон сухой пластины до её обработки в растворе гидроксида натрия, насыщенном сульфатом натрия, обеспечивает получение двухслойной мембраны, где один слой остаётся гладким и имеет неизменённую структуру перикарда, представляя из себя барьерный слой. Второй слой является губчатой структурой, при этом толщина данного губчатого («вспененного») слоя и величина пор в нём зависят от времени последующей обработки в уксусной кислоте, как описано выше.   

Следовательно, все выше представленные технические действия открывают возможность получать различные виды коллагеновых мембран, обладающих уникальными биологическими и функциональными свойствами и имеющих широкую сферу их применения в медицине и ветеринарии.    

Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.   

Пример 1 

Перикардиальную ткань свиней механическими способами полностью освобождали от жира и других тканевых включений, промывали проточной водой и помещали в насыщенный раствор NaCl на 24 часа. Затем материал отмывали в проточной воде и обрабатывали в течение 48 часов раствором 8 М мочевины. После этого мембраны отмывали, подсушивали и инкубировали 48 часов в растворе 4 М гуанидин гидрохлорида. Промытый в проточной воде и лиофильно высушенный материал обезжиривали в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 1:2 и в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 2:1 по 24 часа в каждой смене. Далее в течение 24 часов проводили обработку раствором 0.4 N NaOH, промывали в проточной воде и помещали на 24 часа в 1,5 % раствор перекиси водорода. Снова отмывали в дистиллированной воде, лиофильно высушивали и помещали под пресс с давлением до 10 тонн. В результате были получены натуральные животные барьерные мембраны, содержащие чистые коллаген I и III типов.   

Пример 2

Перикардиальную ткань крупного рогатого скота механическими способами полностью освобождали от жира и других тканевых включений, промывали и помещали на 24 часа в насыщенный раствор NaCl. Затем материал отмывали и инкубировали сначала в течение 48 часов в растворе 8 М мочевины, потом 48 часов в растворе 4 М гуанидин гидрохлорида. Промытый в проточной воде и лиофильно высушенный материал обезжиривали в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 1:2 и в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 2:1 по 24 часа в каждой смене. Далее в течение 24 часов проводили обработку раствором 0.4 N NaOH, промывали в проточной воде и помещали на 24 часа в 1,5 % раствор перекиси водорода. Снова отмывали, лиофильно высушивали и инкубировали в растворе, содержащем в литре раствора 100 грамм NaOH и 100 грамм Na₂SO₄. Через 4 часа пластины перикарда отмывали в проточной воде и подкисляли 0,2 Н HCl до нейтрального рН. Далее пластины переносили в 0,2 N уксусную кислоту на 2-24 часа.  Время инкубации зависело от процесса набухания коллагеновой матрицы. Затем материал споласкивали в дистиллированной воде, замораживали и лиофильно высушивали. Сухие пластины фиксировали в растворе спирт-формалина в течение 72-96 часов, отмывали, сначала в проточной, потом в дистиллированной воде, лиофильно сушили и помещали под пресс. В результате были получены натуральные животные мембраны, содержащие чистые коллаген I и III типов и имеющие пористую структуру коллагенового матрикса.   

Пример 3 

Та же последовательность действий, что в примере № 2 за исключением того, что время инкубации в растворе гидроксида натрия, насыщенном сульфатом натрия, составляет от 1.5 до 2 часов. Это позволяет гидролизовать коллагеновый матрикс перикарда не на всю его глубину и при последующей обработке получить мембрану, имеющую три слоя. Внутренний слой такой мембраны является барьерным и практически препятствует проникновению в него и росту в нём клеток из-за его плотной соединительнотканной структуры. Внешние, покрывающие его слои имеют губчатую структуру и могут служить хорошим матриксом для роста и функциональной активности различных клеточных типов.   

Пример 4 

Та же последовательность действий, что в примере № 2 за исключением того, что сухие пластины до инкубации в растворе гидроксида натрия, насыщенном сульфатом натрия, с одной из сторон дважды покрывают 6% спиртовым раствором клея БФ-6. Покрытые клеем пластины высушивают и помещают на 3 часа в раствор гидроксида натрия, насыщенном сульфатом натрия. Далее материал отмывают в проточной воде, подкисляют 0,2 N HCl до нейтрального рН, переносят в 0,2 N уксусную кислоту на 2-24 часа. Время инкубации в уксусной кислоте зависело от процесса набухания коллагеновой матрицы. Затем материал споласкивали в дистиллированной воде, замораживали и лиофильно высушивали. Пластины фиксировали в растворе спирт-формалина в течение 72-96 часов. Снова отмывали, лиофильно высушивали и помещали под пресс. В результате такого способа получаются натуральные животные мембраны, имеющие двухслойную структуру, где один из слоёв гладкий и является барьерным, практически не проницаемым для клеток, тогда как второй представляет из себя губчатую структуру, пригодную для активной жизнедеятельности клеток в нём.

1. Способ получения коллагенового материала из перикардиальной ткани, включающий очистку перикарда от сопутствующих компонентов, обработку растворами солей, обезжиривание, отмывание, высушивание, упаковку и стерилизацию, отличающийся тем, что перикард обрабатывают насыщенным раствором NaCl, раствором 8 М мочевины и раствором 4 М гуанидин гидрохлорида, обезжиривают в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 1:2 и в 2-х сменах смеси этанол-хлороформ в соотношении 2:1, обрабатывают 1,5-3% Н₂О₂ в течение 20 часов, инкубируют в 0,4 N NaOH, отмывают, лиофильно высушивают, помещают под пресс на 24 часа, разрезают на фрагменты, пакуют и стерилизуют радиационным облучением.

2. Способ получения коллагенового материала из перикардиальной ткани, характеризующийся тем, что коллагеновый материал, полученный по п. 1, без дополнительной обработки, либо покрытый с одной стороны несколькими слоями клея БФ-6, инкубируют в растворе, содержащем NaOH и Na₂SO₄, в течение 1,5-4 часов, отмывают, обрабатывают 0,2 N уксусной кислотой, лиофильно высушивают, фиксируют в растворе спирт-формалина или глутарового альдегида, отмывают, снова лиофильно высушивают и прессуют.