Биоклей на основе активных компонентов слизи кожи рыб vetglu

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к области ветеринарной хирургии. Биоклей на основе раствора альбумина и раствора альдегида в качестве активного компонента содержит лиофилизат слизи кожи рыб, имеющий удельный вес 0,19 г/см³, растворенный в количестве 5% масса/объем в 35% растворе бычьего сывороточного альбумина и смешанный с 1,5% раствором глутарового альдегида в соотношении белковый раствор/раствор альдегида от 50:1 до 25:1 по объему. Также биоклей на основе раствора альбумина и раствора альдегида в качестве активного компонента содержит лиофилизат слизи кожи рыб, имеющий удельный вес 0,19 г/см³, растворенный в количестве 5% масса/объем в 25% растворе бычьего сывороточного альбумина и смешанный с 3,0% раствором глутарового альдегида в соотношении белковый раствор/раствор альдегида от 50:1 до 25:1 по объему. Также биоклей на основе раствора альбумина и раствора альдегида в качестве активного компонента содержит лиофилизат слизи кожи рыб, имеющий удельный вес 0.19 г/см³, растворенный в количестве 5% масса/объем в 35% растворе бычьего сывороточного альбумина и смешанный с 3,0% раствором глутарового альдегида в соотношении белковый раствор/раствор альдегида от 50:1 до 25:1 по объему. Также биоклей на основе раствора альбумина и раствора альдегида содержит в качестве активного компонента лиофилизат слизи кожи рыб, имеющий удельный вес 0,19 г/см³, растворенный в количестве 5% масса/объем в 25% растворе бычьего сывороточного альбумина и смешанный с 1,5% раствором параформальдегида в соотношении белковый раствор/раствор альдегида от 50:1 до 25:1 по объему. Также биоклей на основе раствора альбумина и раствора альдегида в качестве активного компонента содержит лиофилизат слизи кожи рыб, имеющий удельный вес 0,19 г/см³, растворенный в количестве 5% масса/объем в 35% растворе бычьего сывороточного альбумина и смешанный с 1,5% раствором параформальдегида в соотношении белковый раствор/раствор альдегида от 50:1 до 25:1 по объему. Предлагаемый биоклей обладает высокими адгезивными, фиксирующими и кровеостанавливающими свойствами, что делает его пригодным в ветеринарной хирургии. 5 н.п. ф-лы, 4 табл.

 

Изобретение относится к ветеринарии, а именно ветеринарной хирургии, и касается получения и состава биоклея.

Известен следующий ближайший аналог - патент US 8252747 В2, в котором изложен состав и способы применения биологического клея, разработанного на основе белковых растворов и альдегидов. Отличительной особенностью предлагаемой разработки является наличие в составе активных компонентов слизи кожи рыб в виде лиофилизата, растворенного в белковом растворе, а также массовое соотношение компонентов.

Также существуют патенты, описывающие разработки, обладающие сходными функциями (адгезивная и фиксирующая), однако, не являющиеся близкими аналогами, из-за разного компонентного состава (основаны на 2-октилцианоакрилате): CA 2538255 С, в котором описан полимеризуемый противомикробный состав для формирования клея для закрытия ран, содержащий цианоакрилатный мономер и дийодометил-п-толилсульфон; и способ закрытия аппроксимированных краев раны полимерной пленкой, которая ингибирует рост микроорганизмов, где полимерная пленка образуется с использованием полимеризуемой противомикробной композиции.

В патенте US 20110117047 А1 представлена стерилизованная цианоакрилатная адгезивная композиция, включающая цианоакрилатную композицию и усилитель скорости отверждения, где указанная стерилизованная цианоакрилатная адгезивная композиция не отверждается при стерилизации, и где композиция при отверждении с образованием пленки на ткани пациента имеет скорость пропускания водяного пара от примерно 950 до около 3000 г/м²/день.

Недостатками вышеуказанных препаратов являются сложный и дорогой состав.

Наиболее близким, принятым за прототип является патент - US 8252747 В2.

Цель изобретения - разработать биоклей, обладающий адгезивными, фиксирующими и кровоостанавливающими свойствами, для применения в ветеринарии, в частности, ветеринарной хирургии.

Способ осуществляется следующим образом.

Лиофилизат слизи кожи рыб растворяется в растворе бычьего сывороточного альбумина или овальбумина куриного, или альфа-лактальбумина, или альбумина другого происхождения (количественное содержание активного компонента в растворе: около 5% (масса/объем)) для получения компонента А, после чего полученный компонент А смешивается с компонентом Б, представляющий собой водный раствор альдегида (параформальдегида или глутарового альдегида, или другого альдегида) в соотношении: от 50:1 до 25:1 (по объемам).

Способ поясняется следующими примерами.

1. Изготовление лиофилизата, содержащего активные компоненты слизи кожи рыб и криопротектор

Изготовление лиофилизата, содержащего активные компоненты слизи кожи рыб, а также криопротектор, проводили следующим образом: центрифугирование раствора слизи - отбор надосадочной жидкости (супернатанта) - добавление криопротектора - замораживание в жидком азоте - лиофилизация.

В качестве криопротектора был выбран D-маннитол, добавляемый в раствор, исходя из массы слизи, в концентрации 1%.

Таким образом, лиофилизат представляет собой лиофилизированный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета, что соответствует заявленному критерию - «порошок от светло-белого до светло-коричневого цвета».

Количество сухого вещества в слизи, рассчитанное на основе массовых данных до и после лиофилизации, составляет 2.23±0.05%; влажность лиофилизата, определенная в соответствии с ГФ XIII, составляет 2.97±0.1%; таким образом, содержание активных сухих веществ в лиофилизате составляет 97.03±0.1%.

Удельный вес лиофилизата, измеренный с помощью пикнометра, составляет 0.188±0.002 г/см³.

Для осуществления хранения лиофилизата, он был помещен в герметично закрывающийся пластиковый контейнер с завинчивающейся крышкой. Условия хранения: температура, не превышающая 20°С, в месте, исключающем воздействие прямых солнечных лучей.

Транспортировка может осуществляться всеми видами транспорта в соответствии с правилами перевозки грузов, действующими на данном виде транспорта.

2. Разработка рецептуры двухкомпонентной клеевой основы: исследование использования в качестве компонента А различных белковых растворов; сравнение в качестве компонента Б раствора параформальдегида и глутарового альдегида; исследование скорости полимеризации in vitro

С помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях было выявлено, что в присутствие различных концентраций полимеризующих агентов (ГА или ПФА) в различных конечных концентрациях (0.5%, 1% или 2%) приводило к образованию высокомолекулярных белковых агрегатов в разной степени. Для полной остановки в состав реакции вводили 2-х кратный молярный избыток этилендиамина по отношению к внесенному ангидриду.

Так, в присутствии 0.5% ПФА степень полимеризации овальбумина была выше в сравнении с 0.5% ГА. Следует отметить присутствие большого количества неполимеризованного белка в составе образцов. Однако, в присутствие 1% и 2% конечных концентраций как ГА, так и ПФА степень полимеризации овальбумина различалась незначительно. Важно отметить, что уже после 1.5 минут инкубации образовывался достаточно вязкий стабильный гель, состоящий из полимеризованного белка.

Исследование влияния присутствия 0.5% ПФА и ГА на степень полимеризации α-лактальбумина выявила, что, в целом, в сравнении с овальбумином, она была ниже в присутствие аналогичных концентраций обоих исследуемых альдегидов. Так, по данным денситометрии, в присутствии 0.5% как ПФА, так и ГА степень полимеризации была на уровне 52-60%. Следует отметить присутствие большого количества неполимеризованного белка в составе образцов. В то же самое время, увеличение концентрации альдегидов до незначительно увеличивало степень полимеризации α-лактальбумина в сравнении с концентрацией 0.5%. Важно отметить, что степень полимеризации в присутствие 1% и 2% двух исследованных альдегидов различалась незначительно, что вероятно свидетельствует об ограниченном присутствии доступных групп для конъюгации с альдегидными амино- и сульфгидрильных групп. Из особенностей, следует отметить достаточно непрочную структуру сформированного геля, которая образовывалась только на 2-ую минуту инкубации.

Исследование влияния присутствия 0.5% ПФА и ГА на степень полимеризации БСА выявила, что, в целом, в сравнении с овальбумином, она была ниже в присутствие аналогичных концентраций обоих исследуемых альдегидов. Так, по данным денситометрии, в присутствии 0.5% как ПФА, так и ГА степень полимеризации была на уровне 36-41%. Следует отметить присутствие большого количества неполимеризованного белка в составе образцов. В то же самое время, увеличение концентрации альдегидов значительно увеличивало степень полимеризации БСА в сравнении с концентрацией 0.5%. Важно отметить, что степень полимеризации в присутствие 1% и 2% двух исследованных альдегидов различалась, так, в присутствие 2% ГА альбумин практически полностью находился в полимеризованном состоянии, в присутствии аналогичных концентраций ПФА наблюдалась незначительная фракция нативного неполимеризованного белка.

Важно отметить, достаточно прочную структуру сформированного геля, и высокую скорость его образования - окончательное формирование наблюдалось на 30-40 секунде инкубации.

Таким образом, было показано, что использование раствора БСА в присутствие 1-2% концентраций ГА является наиболее перспективной двухкомпонентной системой при создании основы биосовместимого клея и фиксации раневых поверхностей.

3. Разработка технических условий опытного образца биомедицинского (ветеринарного) препарата на основе лиофилизата активных компонентов слизи кожи рыб

Гемостатический препарат биомедицинского назначения на основе активных компонентов слизи кожи рыб состоит из двух компонентов:

- компонент I: лиофилизат активных компонентов слизи кожи рыб, растворенный в бычьем сывороточном альбумине;

- компонент II: раствор альдегида.

Лиофилизат активных компонентов слизи кожи рыб представляет собой лиофилизированный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета, что соответствует критерию - «порошок от светло-белого до светло-коричневого цвета».

Количество сухого вещества в слизи, рассчитанное на основе массовых данных до и после лиофилизации, составляет 2.23±0.05%; влажность лиофилизата, определенная в соответствии с ГФ XIII, составляет 2.97±0.1%; таким образом, содержание активных сухих веществ в лиофилизате составляет 97.03±0.1%.

Лиофилизат содержит в своем составе криопротектор D-Маннитол, добавляемый в раствор слизи кожи рыб перед лиофилизацией в концентрации 1%, исходя из массы слизи.

Удельный вес лиофилизата, измеренный с помощью пикнометра, составляет 0.188±0.002 г/см3.

Для осуществления хранения лиофилизата, он хранится в герметично закрывающемся пластиковом контейнере с завинчивающейся крышкой. Условия хранения: температура, не превышающая 20°С, в месте, исключающем воздействие прямых солнечных лучей.

Для получения компонента I лиофилизат растворяют в растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА), приготовленного на основе 1×PBS (натрий-фосфатный буфер) до получения 30-35%-ного раствора. Количественное содержание активного компонента в растворе составляет около 5% (масса/объем).

Компонент II представляет собой 2-3%-ный раствор глутарового альдегида (ГА), приготовленный на основе деионизированной воды.

Оба компонента смешиваются непосредственно перед нанесением на рану/операционный разрез. Соотношение белковый раствор:раствор альдегида составляет от 50:1 до 25:1 (по объемам).

Опытный образец биомедицинского (ветеринарного) препарата представляет собой протеин-гидрогелевый комплекс (ковалентная связь между аминами и альдегидами в месте нанесения), визуально - полимерную композицию - биоклей от бесцветного до светло-белого цвета.

Опытный образец биомедицинского (ветеринарного) препарата помещен в двухкамерный блистер, изготовленный из фольги (2 полости, разделенные перегородкой, которая разрушается после нажатия на блистер), с аппликатором для нанесения. Обе полости имеют объем 2.3 мл каждая для компонента I и компонента II.

Объемные соотношения компонентов составляют 1 и 2: от 0.5 мл : 0.01 мл до 0.5 мл : 0.02 мл

Скорость полимеризации составляет 1-4 мин.

Скорость остановки кровотечения (время формирования сгустка) составляет 5-7 мин.

Условия хранения: при температуре 4-5°С, относительной влажности воздуха не выше 60%, в защищенном от прямых солнечных лучей месте.

Условия использования: при температуре от 4 до 25°С и естественной влажности воздуха.

Условия транспортировки: может осуществляться всеми видами транспорта в соответствии с правилами перевозки лекарственных препаратов для конкретных видов транспорта.

4. Влияния слизи кожи рыб в составе наиболее оптимальных вариантов клеевой основы на скорость полимеризации in vitro

Было проведено сравнительное исследование возможности использования в качестве основы для тканевого клея нескольких коммерчески-доступных белков: бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, A4503), овальбумин (Ова) (Sigma, A5253), казеин (Каз) (Sigma, C7078), альфа-лактальбумин (Лакт) (Sigma, L5385). В качестве сшивающего агента были использованы глутаровый альдегид (Panreac), параформальдегид (Реахим) и окисленный периодатом натрия крахмал.

Глутаровый альдегид (ГА) поставлялся в виде готового 25% раствора. Параформальдегид (ПФА - полимеризованная форма формальдегида) плохо растворим в воде; для приготовления 6% раствора, необходимое количество смешивали с водой, добавляли 5мкЛ 1М NaOH на 10 мл раствора и оставляли перемешиваться при температуре 60-65°С в течении часа в вытяжном шкафу. Крахмал относительно плохо растворим в воде, вследствие чего для повышения его растворимости производили его дополнительную обработку согласно ранее описанному методу [Mehdi Jalali Jivan, Mohamadsaeed Yarmand, and Ashkan Madadlou. Preparation of cold water-soluble potato starch and its characterization. J Food Sci Technol. 2014 Mar; 51(3): 601-605]. Получение окисленного периодатом натрия крахмала проводили по методу описанному Zuo и соавторами [Zuo Y, Liu W, Xiao J, Zhao X, Zhu Y, Wu Y. Preparation and characterization of dialdehyde starch by one-step acid hydrolysis and oxidation. Int J Biol Macromol. 2017;103:1257-1264. doi:10.1016/j.ijbiomac.2017.05.188].

Последующий анализ содержания относительного количества альдегидных групп (Sigma, MAK139) в исследуемых растворах выявил следующий ряд по убыванию концентрации альдегидных групп: 4% ГА > 4% ПФА >> окисленный крахмал в максимальной концентрации.

Последующий анализ с использованием 20% раствора альбумина выявил, что раствор окисленного крахмала не приводил к образованию полимерной матрицы в короткие промежутки времени (менее 5 минут), в отличие от ПФА и ГА. Вследствие этого дальнейшие испытания окисленного крахмала не проводили.

Помимо присутствия в растворе сшивающего агента в необходимой концентрации, в ткневом клее также необходимо присутствие в значительном количестве полимеризуемой основы (белков). Для этого белки растворяли по соответствующим методикам, для получения максимально возможных концентраций. БСА растворяли в фосфатном буфере pH 7.4 при перемешивании при комнатной температуре в течение 2 часов (максимальная концентрация - 25% масса/объем). Овальбумин растворяли в бикарбонатном буфере pH 9.2 при перемешивании при комнатной температуре в течение 8 часов, на начальном этапе растворения использовали ультразвуковую обработку суспензии (максимальная концентрация - 5% масса/объем). Казеин растворяли в бикарбонатном буфере pH 9.0 при перемешивании при комнатной температуре в течение суток, на начальном этапе растворения поддерживали добавлением 0,1М NaOH (максимальная концентрация - 2% масса/объем). Альфа-лактальбумин растворяли в фосфатном буфере pH 7.5 50мМ NaCl при перемешивании при 65°C в течение 30 мин (максимальная концентрация - 5% масса/объем). Полученные растворы использовали в качестве основы для тканевого клея.

В отличие от цианакрилатного тканевого клея, разрабатываемый состав - двухкомпонентный. Как и в ближайшем аналоге «Bioglue», компоненты (растворы, содержащие сшивающую часть и белковую матрицу) будут смешиваться непосредственно перед нанесением и последующей полимеризацией в течение короткого промежутка времени. Ниже приведены результаты экспериментов измерения времени полимеризации после внесения в вышеперечисленные белковые растворы альдегидной составляющей и влияния на него слизи кожи рыб. Последняя вводилась в состав белкового раствора до начала эксперимента, в виде лиофилизата - 1 % (масса/объем). Максимальный промежуток времени составил 120 сек ввиду того, что для ветеринарного применения необходимо короткое время фиксации шва, аналогичное ближайшим аналогам, указанным ранее.

Так, было выявлено отсутствие начала процесса полимеризации после внесения в 2% раствор казеина растворов ГА и ПФА до 1.5% в течение 2 минут. Внесение слизи кожи рыб на указанный процесс не влияло.

Наиболее объективной причиной отсутствия полимеризации, вероятно, явилась достаточно низкая концентрация белковой составляющей, что обусловлено низкой растворимостью казеина.

Аналогичные результаты показал альфа-лактальбумин - было выявлено отсутствие начала процесса полимеризации после внесения в 5% раствор альфа-лактальбумина растворов ГА и ПФА до 1.5% в течение 2 минут. Внесение слизи кожи рыб на указанный процесс не влияло.

Аналогично казеину, несмотря на более высокую концентрацию, наиболее вероятной причиной отсутствия полимеризации явилась достаточно низкая концентрация белковой составляющей, что обусловлено низкой растворимостью альфа-лактальбумина.

Схожая картина наблюдалась и в отношении яичного овальбумина - было выявлено отсутствие начала процесса полимеризации после внесения в 5% раствор овальбумина растворов ГА и ПФА до 1.5% в течение 2 минут. Внесение слизи кожи рыб на указанный процесс не влияло.

В данной ситуации можно сделать аналогичный предыдущим двум вывод о недостаточности концентрации белковой матрицы для быстрой полимеризации раствора.

В отличие от вышеуказанных белков, БСА обладает достаточно высокой растворимостью - для эксперимента был использован 25% раствор белка. Было выявлено формирование относительно прочной матрицы уже на 1-ой минуте после смешивания растворов. Можно заметить, что в присутствие ПФА процесс полимеризации был незначительно более замедленным в сравнении с другими растворами после аналогичного времени, однако, в присутствии слизи кожи рыб, смесь ПФА и БСА полимеризовалась быстрее, что вероятно, связано с разбавлением БСА при внесении 6% ПФА. Внесение слизи кожи рыб при этом, вероятно, частично компенсировало, данное разбавление своей белковой составляющей, что в целом положительно влияло в процесс полимеризации. Внесение слизи кожи рыб на указанный процесс в присутствие ГА - не влияло.

Основываясь на полученных данных можно заключить, концентрация белковой матрицы является одним из важнейших параметров разрабатываемого тканевого клея - при ее низком значении скорость полимеризации будет недостаточной, что потребует длительного времени фиксации и скажется на удобстве работы с данным клеем. Немаловажным фактором является стоимость белковой матрицы: для наших экспериментов были подобраны распространенные и недорогие белки, среди которых БСА, являющийся по результатам экспериментов наиболее перспективным, один из самых дешевых. Вероятно, используя природные или синтетичные полиамины (например, полиамидоаминовые дендримеры), можно добиться значительно более впечатляющих результатов - скорости полимеризации и прочности шва, за счет увеличения плотности образования сшивок, однако, это может значительно увеличить стоимость разрабатываемого клея. Кроме того, параформальдегид, продукт полимеризации формальдегида, представляет значительно более высокую опасность в работе в сравнении с глутаровым альдегидом. Основываясь на полученных данных, в дальнейших экспериментах был использован состав на основе БСА и глутарового альдегида.

5. Влияние слизи кожи рыб в составе наиболее оптимальных вариантов клеевой основы на скорость сворачивания крови in vitro

В качестве основы клеевой составляющей были использованы растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрациях 25% и 35%, глутаровый альдегид (ГА) в концентрациях 1,5% и 3% и параформальдегид (ПФА) в концентрации 1,5%. Использование белка, несущего большое количество свободных аминогрупп на поверхности, а также бивалентного сшивавшего агента позволяет сформировать достаточно прочную полимерную сеть в течение короткого промежутка времени после смешивания составляющих. Как было показано ранее - использование растворов альбумина концентрацией ниже 25% приводит к формированию непрочных, тянущихся, вязких гелей, что, наиболее вероятно, будет препятствовать плотному связыванию и фиксации краев ран и поверхностей, на которых предполагается применение данного типа геля. В то же самое время концентрации БСА от 25% при смешивании с ГА приводили к образованию достаточно прочных, эластичных, не тянущихся и стойких к разрывам гелей. Бычий сывороточный альбумин был выбран ввиду своей широкой распространенности, экономической, технической доступности чистого лиофилизата белка. Кроме того, как показали предварительные испытания - высокая растворимость является преимуществом БСА, в сравнении с такими доступными белками как казеин, овальбумин и альфа-лактальбумин. Глутаровый альдегид и параформальдегид были использованы ввиду удобства их применения, экономической и технической доступности. Несмотря на более низкую цену, следует отметить меньшую токсичность ГА, а также большее удобство его применения, в сравнении с ПФА. ГА был использован в концентрациях 1,5% и 3%, ПФА в концентрации 1,5% (в виду сильного разбавления раствора БСА при увеличении концентрации ПФА). При использовании растворов глутарового альдегида наблюдали прямую корреляцию - уменьшение времени полимеризации и формирования геля при повышении концентрации ГА. Исходя из ранее полученных данных, наиболее оптимальными концентрациями ГА в рабочем растворе были - 1,5%-3%, поскольку время полимеризации и формирования геля можно считать достаточным для смешивания компонентов, нанесения на рану и закрепления ее краев.

Исходя из вышеприведенной информации, в качестве клеевой основы для исследования были выбраны растворы с высокой концентрацией БСА в комбинации с ГА или ПФА. Следует отметить, что согласно ранее полученным данным добавление лиофилизата слизи кожи рыб, содержащего криопротектор, в раствор БСА до 1%-5% (масса/объем) и последующая инициация реакции полимеризации добавление ГА не влияло значительно на скорость процесса и механические свойства формируемого геля.

Было определено влияние лиофилизата слизи кожи рыб в составе наиболее оптимальных вариантов клеевой основы (1,5% ГА + 25% БСА; 1,5% ПФА + 25% БСА; 3% ГА + 35% БСА) на гемостатические свойства крови in vitro при ее взаимодействии с интактной кровью, а также влияние на агрегационные свойства при взаимодействии с фракцией тромбоцитов.

Исследование влияния слизи кожи рыб в составе клеевой основы на агрегационную активность тромбоцитов

Для определения гемостатической активности 100 мкл клеевой основы (1,5% ГА + 25% БСА; 1,5% ПФА + 25% БСА; 3% ГА + 35% БСА) содержащей 1% слизи кожи рыб (масса/объем) вносили в плазму крови человека, обогащенную тромбоцитами. После чего проводили оценку времени образования сгустка. Контролем служил индуктор агрегации тромбоцитов млекопитающих - аденозиндифосфат (АДФ). По изменению времени свертывания относительно контроля оценивали влияние препарата на гемостаз.

Для оценки агрегационной активности слизи кожи рыб в составе клеевой основы кровь забирали из средней локтевой вены здорового добровольца в пробирки с 3.8%-ным цитратом натрия в соотношении 9:1, центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП).

Для оценки агонистической способности слизи кожи рыб в составе клеевой основы применяли количественный метод, основанный на регистрации изменений светопропускания богатой тромбоцитами плазмы с применением фотоэлектроколориметра (ФЭК). Определяли суммирующий индекс агрегации тромбоцитов (СИАТ), скорость агрегации (СА) и индекс дезагрегации тромбоцитов (ИДТ) человека со слизью рыб в составе клеевой основы (опытная группа) и индуктором агрегации - АДФ в концентрации 0.1 мг/мл (контрольная группа). При добавлении АДФ в плазму богатую тромбоцитами, формировались агрегаты, повышалась прозрачность плазмы и, следовательно, увеличивался поток проходящего через кювету света.

1.2 мл исследуемой ОТП вносили в кювету ФЭК с длиной оптического пути 3 мм и измеряли оптическую плотность при длине волны 500-560 нм против дистиллированной воды.

Плазму переливали из кюветы в пробирку, прогревали при температуре 37°С, через 1 мин вносили в пробирку один из активаторов и включали секундомер.

Оптическую плотность исследуемой плазмы измеряли через 1, 3, 5 и 10 мин инкубации. Также определяли оптическую плотность БТП (бедной тромбоцитами плазмы).

Суммирующий индекс агрегации тромбоцитов (СИАТ) рассчитывали по формуле:

Где

Е - оптическая плотность БТП в единицах оптической плотности;

Е₁ - оптическая плотность ОТП до агрегации в единицах оптической плотности;

Е₂ - оптическая плотность ОТП после агрегации в единицах оптической плотности.

Скорость агрегации (СА) рассчитывали по формуле:

Где

Е₁ - оптическая плотность ОТП до агрегации в единицах оптической плотности;

Е₂ - оптическая плотность ОТП после агрегации в единицах оптической плотности;

t - время, за которое произошло максимальное падение оптической плотности (мин).

Индекс дезагрегации тромбоцитов (ИДТ) рассчитывали по формуле:

Где

Е₃ - максимальная оптическая плотность ОТП, измеренная через 10 мин после добавления активатора;

Е₂ - оптическая плотность ОТП после агрегации в единицах оптической плотности.

Оценку агрегационной активности слизи кожи рыб проводили с помощью метода по Howard M.A.

Исследование влияния слизи кожи рыб в составе клеевой основы на скорость формирования тромба в интактной крови ex vivo

Для оценки прямого влияния слизи кожи рыб в составе клеевой основы исследовали скорость формирования сгустка в цельной крови на предметных стеклах in vitro. Для проведения анализа предметные стекла обезжиривали в смеси этанола и ацетона (1:1 объем/ объем), высушивали под тягой и подписывали. На стекла наносили 50 мкл образца крови человека (2 образца на 1 стекло) собранной в пробирки содержащие антикоагулянт (ЭДТА). К нанесенным образцам добавляли 50 мкл исследуемых образцов клеевой основы содержащей слизь кожи рыб. В качестве контроля использовали ФСБ или индуктор коагуляции АДФ (50 мкл в концентрации 1 мг/мл). После внесения индукторов коагуляции засекали время, за которое формируется сгусток, который определяли визуально путем осторожного смешения стекла относительно горизонтальной плоскости. Измерения проводились в 3-х повторениях.

В данном эксперименте использовалась кровь млекопитающих (человека).

Результаты исследования влияния на агрегационную активность тромбоцитов

Было проведено исследования влияния гемостатической активности слизи в составе различных вариантов клеевой основы на аггрегационную активность тромбоцитов при взаимодействии с плазмой крови (определение индуцированной агрегации тромбоцитов). Как и в первом случае, была использована кровь человека.

Активность оценивалась по следующим параметрам - суммирующий индекс агрегации тромбоцитов (СИАТ), скорость агрегации (СА), индекс агрегации тромбоцитов (ИАТ) и индекс дезагрегации тромбоцитов (ИДТ).

Полученные результаты продемонстрированы в таблице 1.

Таблица 1 - Контрольные значения гемостатической (агрегационная) активности слизи кожи рыб в составе ФСБ pH 7.4 (1% и 5% масса/объем) при взаимодействии с плазмой, обогащенной тромбоцитами
Критерий	АДФ	Слизь кожи рыб 1%	Слизь кожи рыб 5%
СИАТ, %	22,62	35,71	36,31
СА, мин	0,11	0,01	0,01
ИДТ, %	9,68	9,06	8,77

Эксперимент проводился в 3 повторах.

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что при использовании слизи кожи рыб в составе клеевой основы в обеих исследованных концентрациях в качестве агониста тромбоцитов был получен более высокий ИАТ и СА, в сравнении с АДФ. Стоит отметить, что значительной разницы между концентрациями 1% и 5% в исследованных показателях отмечено не было. Образовавшиеся агрегаты, охарактеризованные по показателю ИДТ, обладали такой же устойчивостью, как и полученные при воздействии АДФ, что говорит об оптимальной структуре сгустка.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о сохранении высокой гемостатической активности слизи кожи рыб в концентрации 1% масс в сравнении с АДФ.

Далее было проведено изучение гемостатической активности 1% слизи в составе различных вариантов клеевой основы на аггрегационную активность тромбоцитов при взаимодействии с плазмой крови обогащенной тромбоцитами (определение индуцированной агрегации тромбоцитов). Как и в первом случае, была использована плазма крови человека.

Активность оценивалась по аналогичным параметрам - СИАТ, СА и ИДТ.

Полученные результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Сравнение агрегационной активности слизи кожи рыб в составе различных вариантов клеевой основы при воздействии на тромбоциты
Критерий	25%БСА, 1,5% ГА	35%БСА, 1,5% ГА	25%БСА, 3% ГА	35%БСА, 3% ГА	25%БСА, 1,5% ПФА	35%БСА, 1,5% ПФА
СИАТ, %	35,89	33,48	32,22	35,92	32,42	31,85
СА, мин	0,01	0,01	0,01	0,01	0,01	0,01
ИДТ, %	8,61	8,69	8,77	8,8	8,43	8,35

Эксперимент проводился в 3 повторах.

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что клеевая основа не влияет значительно на параметры агрегации тромбоцитов. Образовавшиеся под действием слизи в составе различных вариантов клеевой основы агрегаты, охарактеризованные по показателю ИДТ, обладали такой же устойчивостью, как и полученные при воздействии АДФ, что говорит об оптимальной структуре сгустка.

Таким образом, полученные образцы указывают на неизменную в сравнении с интактной слизью гемостатическую активность.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью теста Колмогорова-Смирнова, а также теста Левина. После чего проводилось согласование с параметрическими допущениями.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента с применением программ (Excel (Microsoft) и Statistica 8 (StatSoft)).

Результаты исследования влияния слизи кожи рыб в составе клеевой основы на скорость формирования тромба в интактной крови ex vivo

При исследовании влияния образцов слизи кожи рыб в составе различных вариантов клеевой основы и контрольных растворов на скорость формирования сгустка крови человека были получены данные, представленные в таблице 3.

В таблице 3 продемонстрированы результаты экспериментов с нативной кровью человека.

Таблица 3 - Контрольные показатели гемостатической активности слизи кожи рыб при взаимодействии на интактную кровь человека
№ пробы п/п	Добавляемый к крови реагент (объем 0.05 мл)	Время свертывания, мин
1	1% слизь кожи рыб в ФСБ pH 7,4 (объем 0.05 мл)	3.31
2	5% слизь кожи рыб в ФСБ pH 7,4 (объем 0.05 мл)	3.42
3	АДФ (объем 0.05 мл)	4.08
4	Интактная кровь (объем 0.1 мл)	8.31

Эксперимент проводился в 10 повторах.

Как видно из представленных данных, слизь кожи рыб ускоряла формирование тромба в сравнении с аденозиндифосфатом (АДФ), который является индуктором агрегации тромбоцитов, и а также в сравнении с необработанным контролем.

Затем проводили исследование 1% слизи кожи рыб в составе наиболее оптимальных вариантов клеевой основы. Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Гемостатическая активность 1% слизи кожи рыб в составе различных вариантов клеевой основы при взаимодействии с интактной кровью человека
Образец	Время формирования сгустка, мин
Контроль + ФСБ	9.4±1.1
Контроль + 3% ГА	8.8±1.3
Контроль + 1,5% ГА	9.6±1.3
Контроль + 1,5% ПФА	10.1±0.8
Контроль + 35% БСА	9.3±0.9
Контроль + АДФ	7.4±1.4
25% БСА, 1,5% ГА	6.1±1.2
35% БСА, 1,5% ГА	5.8±1.1
25% БСА, 3% ГА	6.3±1.1
35% БСА, 3% ГА	6.4±0.9
25% БСА, 1,5% ПФА	5.9±1.2
35% БСА, 1,5% ПФА	6.2±1.5

Эксперимент проводился в 3 повторах.

Как видно из представленных данных, слизь кожи рыб в составе различных вариантов клеевой основы обладала значительно большей активностью по сравнению с отрицательным контролем - интактной кровью или АДФ. Стоит отметить, что значительной разницы между во влиянии различных вариантов клеевой основы на скорость формирования сгустка отмечено не было, что вероятно свидетельствует о превалирующей роли в ускорении процесса тромбообразования слизи кожи рыб. Таким образом, можно сделать вывод о том, что природа клеевой основы не влияет значительно на тромбообразвоание.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии значительного влияния клеевой основы в комбинации со слизью кожи рыб на гемостатическую активность и процесс агрегации тромбоцитов в сравнении с контрольными образцами.

6. Испытание опытного образца биомедицинского (ветеринарного) препарата in vivo

Испытания in vivo проводили на ограниченном количестве здоровых интактных животных (мыши - 1 самец линии BALB/c; крысы - 2 самцы линии Wistar). Перед испытаниями животных анестезировали с помощью ксилазина и золетила и удаляли шерстный покров. Глубокий надрез длиной от 3 до 5 см, не повреждая мышечную ткань, наносили стерильными инструментами по центру спины. Надрез промывали стерильным физиологическим раствором и просушивали стерильными салфетками. На края ткани наносили 250-300 мкл тканевого клея и фиксировали, прижимая друг к другу в течение 60-90 сек. Излишки клея удаляли.

Края надреза после фиксации не расходились. Раны регулярно обрабатывали и вели наблюдение за животными в течение всего периода заживления. Каких-либо воспалительных процессов, раздражения, атипичных или других поведенческих изменений у животных не наблюдалось. После прохождения действия наркоза и в течение всего периода наблюдения животные были активны и внешне выглядели здоровыми.

Данные полученные в ходе испытаний in vivo показывают достаточно высокую перспективность разрабатываемого тканевого клея: основные компоненты (БСА и глутаровый альдегид) широко распространённые, недорогие и малотоксичные; приготовление подобного клея не требует использования дорогостоящих средств и сложных условий; разрабатываемый клей достаточно прост в применении, формирует прочный шов, не вызывает воспалительных реакций раздражения.

1. Биоклей на основе раствора альбумина и раствора альдегида, характеризующийся тем, что в качестве активного компонента содержит лиофилизат слизи кожи рыб, имеющий удельный вес 0,19 г/см³, растворенный в количестве 5% масса/объем в 35% растворе бычьего сывороточного альбумина и смешанный с 1,5% раствором глутарового альдегида в соотношении белковый раствор/раствор альдегида от 50:1 до 25:1 по объему.

2. Биоклей на основе раствора альбумина и раствора альдегида, характеризующийся тем, что в качестве активного компонента содержит лиофилизат слизи кожи рыб, имеющий удельный вес 0,19 г/см³, растворенный в количестве 5% масса/объем в 25% растворе бычьего сывороточного альбумина и смешанный с 3,0% раствором глутарового альдегида в соотношении белковый раствор/раствор альдегида от 50:1 до 25:1 по объему.

3. Биоклей на основе раствора альбумина и раствора альдегида, характеризующийся тем, что в качестве активного компонента содержит лиофилизат слизи кожи рыб, имеющий удельный вес 0,19 г/см3, растворенный в количестве 5% масса/объем в 35% растворе бычьего сывороточного альбумина и смешанный с 3,0% раствором глутарового альдегида в соотношении белковый раствор/раствор альдегида от 50:1 до 25:1 по объему.

4. Биоклей на основе раствора альбумина и раствора альдегида, характеризующийся тем, что в качестве активного компонента содержит лиофилизат слизи кожи рыб, имеющий удельный вес 0,19 г/см³, растворенный в количестве 5% масса/объем в 25% растворе бычьего сывороточного альбумина и смешанный с 1,5% раствором параформальдегида в соотношении белковый раствор/раствор альдегида от 50:1 до 25:1 по объему.

5. Биоклей на основе раствора альбумина и раствора альдегида, характеризующийся тем, что в качестве активного компонента содержит лиофилизат слизи кожи рыб, имеющий удельный вес 0,19 г/см³, растворенный в количестве 5% масса/объем в 35% растворе бычьего сывороточного альбумина и смешанный с 1,5% раствором параформальдегида в соотношении белковый раствор/раствор альдегида от 50:1 до 25:1 по объему.