Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: Т–клетки, содержащие конструкцию химерное антитело – T–клеточный рецептор и конструкцию химерного сигнального рецептора. Химерное антитело – T–клеточный рецептор содержит антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, и модуль Т–клеточного рецептора, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР–ассоциированную сигнальную молекулу, а химерный сигнальный рецептор содержит лигандсвязывающий домен, который специфически связывается с целевым лигандом, и костимулирующий сигнальный домен, способный обеспечивать стимулирующий сигнал иммунной клетке. Также предложены: нуклеиновая кислота, экспрессионный вектор, фармацевтическая композиция, способ уничтожения целевой клетки, способ лечения ракового заболевания у нуждающегося в этом индивида и способ обеспечения костимулирующего сигнала Т-клетке. Изобретение позволяет лечить раковое заболевания у нуждающегося в этом индивида, где раковое заболевание связано с экспрессией целевого антигена у индивида и где целевой антиген распознается Т-клеткой. 8 н. и 33 з.п. ф-лы, 18 ил., 9 табл., 7 пр.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США № 62/490,576, поданной 26 апреля 2017 г., предварительной заявке США № 62/490,578, поданной 26 апреля 2017 г., и предварительной заявке США № 62/490,580, поданной 26 апреля 2017 г., содержание которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.

ПРЕДОСТАВЛЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ВИДЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА ASCII

[0002] Содержание следующего предоставленного текстового файла ASCII полностью включено в данный документ посредством ссылки: машиночитаемая форма (CRF) перечня последовательностей (название файла: 750042001040SEQLIST.txt, дата записи: 24 апреля 2018 г., размер: 107 КБ).

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0003] Данное изобретение относится к иммунным клеткам (таким как Т-клетки), содержащим конструкцию химерное антитело - T-клеточный рецептор (ТКР) (хаТКР) и конструкцию химерного сигнального рецептора (ХСР). хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, и модуль Т-клеточного рецептора (МТКР), способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, а ХСР содержит лиганд-связывающий домен, который специфически связывается с целевым лигандом, и костимулирующий сигнальный домен, способный обеспечивать стимулирующий сигнал иммунной клетке.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Опосредованный Т-клетками иммунитет представляет собой адаптивный процесс развития антиген (Ag)-специфических Т-лимфоцитов для устранения вирусов, бактериальных, паразитарных инфекций или злокачественных клеток. Он также может включать аберрантное распознавание аутоантигенов, приводящее к аутоиммунным воспалительным заболеваниям. Ag-специфичность Т-лимфоцитов основана на распознавании посредством Т-клеточного рецептора (ТКР) уникальных антигенных пептидов, представляемых молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) на Ag-представляющих клетках (АПК) (Broere, et al., Principles of Immunopharmacology, 2011). Каждый Т-лимфоцит экспрессирует уникальный ТКР на клеточной поверхности в результате связанного с развитием отбора после созревания в тимусе. ТКР может находиться в двух формах - в виде гетеродимера αβ или в виде гетеродимера γδ. Т-клетки экспрессируют либо αβ-форму, либо γδ-форму ТКР на клеточной поверхности. Все четыре цепи α/β/γ/δ имеют характерную внеклеточную структуру, состоящую из высокополиморфного подобного «вариабельной области иммуноглобулина» N-концевого домена и подобного «константной области иммуноглобулина» второго домена. Каждый из этих доменов содержит характерный внутридоменный дисульфидный мостик. Константная область является проксимальной к клеточной мембране, за ней следует соединительный пептид, трансмембранная область и короткий цитоплазматический хвост. Ковалентная связь между 2-мя цепями гетеродимерного ТКР образована остатком цистеина, расположенным в пределах короткой соединительной пептидной последовательности, соединяющей внеклеточный константный домен и трансмембранную область, который образует дисульфидную связь с парным остатком цистеина цепи ТКР в соответствующей позиции (The T cell Receptor Factsbook, 2001).

[0005] ТКР αβ и γδ связаны с неполиморфными мембраносвязанными белками CD3, с образованием функционального октамерного комплекса ТКР-CD3, состоящего из гетеродимера ТКР и трех димерных сигнальных молекул CD3δ/ε, CD3γ/ε и CD3ζ/ζ или ζ/η. Ионизируемые остатки в трансмембранном домене каждой субъединицы образуют полярную сеть взаимодействий, которые удерживают комплекс. В случае Т-клеточной активации N-концевые вариабельные области ТКР распознают комплекс пептид/ГКГС, представляемый на поверхности целевой клетки, тогда как белки CD3 участвуют в передаче сигнала (Call et al., Cell. 111(7):967-79, 2002; The T cell Receptor Factsbook, 2001).

[0006] ТКР αβ, также называемый традиционным ТКР, экспрессируется на большинстве лимфоцитов и состоит из гликозилированных полиморфных α- и β-цепей. Различные αβ ТКР могут различаться среди разных пептидов, погруженных в поверхность молекул ГКГС II (главным образом экспрессируемых на поверхности клеток АПК) и ГКГС I (экспрессируемых на всех ядросодержащих клетках), чьи размеры и формы являются относительно постоянными. Хотя γδ ТКР и обладает структурным сходством с αβ ТКР, он распознает антигены, несущие углеводы, нуклеотиды или фосфор, независимо от представления ГКГС (The T cell Receptor Factsbook, 2001; Girardi et al., J. Invest. Dermatol. 126(1):25-31, 2006; Hayes et al., Immunity. 16(6):827-38, 2002).

[0007] За последние два десятилетия фундаментальные достижения в области иммунологии и биологии опухолей в сочетании с идентификацией большого числа опухолевых антигенов привели к существенному прогрессу в области клеточной иммунотерапии. Т-клеточная терапия занимает значительное место в области клеточной иммунотерапии с целью лечения рака путем переноса аутологичных и ex vivo размноженных T-клеток пациентам и приводит к некоторым заметным противоопухолевым ответам (Blattman et al., Science. 305(5681):200-5, 2004). Например, введение опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (ОИЛ) природного происхождения, размноженных ex vivo, опосредовало объективную частоту ответа в диапазоне 50-70% у пациентов с меланомой, включая массивные инвазивные опухоли в нескольких участках, включая печень, легкое, мягкую ткань и головной мозг (Rosenberg et al., Nat. Rev. Cancer. 8(4):299-308, 2008; Dudley ME et al., J. Clin. Oncol. 23(10):2346-57, 2005).

[0008] Основным ограничением повсеместного применения терапии на основе ОИЛ является сложность создания человеческих Т-клеток с противоопухолевым потенциалом. В качестве альтернативного подхода в нормальные аутологичные Т-клетки пациентов посредством Т-клеточной инженерии можно вводить экзогенные высокоаффинные ТКР. Было показано, что адоптивный перенос этих клеток пациентам со сниженным количеством лимфоцитов опосредует регрессию рака при таких раковых заболеваниях, как меланома, колоректальная карцинома и синовиальная саркома (Kunert R et al., Front. Immunol. 4:363, 2013). В недавнем клиническом исследовании фазы I с применением анти-NY-ESO-1 ТКР против синовиальной саркомы сообщалось об общей частоте ответов 66%, а у одного из пациентов, получавших Т-клеточную терапию, был достигнул полный ответ (Robbins PF et al., Clin. Cancer Res. 21(5):1019-27, 2015).

[0009] Одним из преимуществ терапии на основе ТКР-сконструированных Т-клеток является то, что она может быть нацелена на весь спектр потенциальных внутриклеточных опухолеспецифических белков, которые процессируются и доставляются на поверхность клетки посредством представления ГКГС. Более того, ТКР является очень чувствительным и может активироваться лишь несколькими молекулами антигенный пептид/ГКГС, что, в свою очередь, может вызвать цитолитический Т-клеточный ответ, включая секрецию цитокинов, пролиферацию Т-клеток и цитолиз определенных целевых клеток. Следовательно, по сравнению с вариантами терапии на основе антител или низкомолекулярных соединений, ТКР-сконструированные Т-клетки особенно ценны за счет своей способности уничтожать целевые клетки с очень малым числом копий целевых внутриклеточных антигенов (Kunert R et al., Front. Immunol. 4:363, 2013).

[0010] Однако, в отличие от терапевтических антител, которые в основном открывают с помощью технологий гибридомы или дисплея, для идентификации мишень-специфических ТКР требуется создание клонов ТКР, специфических в отношении целевого пептида/ГКГС, из Т-клеток пациента и скрининг в отношении правильной комбинации α-β-цепей, которая обладает оптимальной аффинностью связывания с целевым антигеном. Очень часто после клонирования ТКР из Т-клеток пациента применяют фаговый/дрожжевой дисплей, чтобы дополнительно повысить аффинность связывания ТКР с мишенью. Весь процесс требует экспертных знаний во многих областях и отнимает много времени (Kobayashi E et al., Oncoimmunology. 3(1):e27258, 2014). Трудности в процессе выявления ТКР в значительной степени препятствовали широкому применению терапии на основе ТКР-сконструированных Т-клеток. Его также затрудняет связанная с лечением токсичность, в частности, в случае ТКР против антигенов, сверхэкспрессируемых на опухолевых клетках, но также экспрессируемых на здоровых клетках, или в случае ТКР, распознающих комплексы не-целевой пептид/ГКГС (Rosenberg SA et al., Science. 348(6230):62-8, 2015).

[0011] В последние годы был разработан другой подход для привлечения Т-клеток для нацеленной иммунотерапии рака. Этот новый подход называется Т-клеточной терапией на основе химерного антигенного рецептора (ХАР-T). Он объединяет превосходную специфичность нацеливания моноклональных антител с эффективной цитотоксичностью и долгосрочной продолжительностью, обеспечиваемыми цитотоксическими Т-клетками. ХАР состоит из внеклеточного домена, который распознает антиген клеточной поверхности, трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен. Внеклеточный домен состоит из антигенсвязывающих вариабельных областей из тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела, которые слиты в одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). Внутриклеточный сигнальный домен содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM), например, из CD3ζ или FcRγ, и один или более костимулирующих сигнальных доменов, например, из CD28, 4-1BB или OX40 (Barrett DM et al., Annu. Rev. Med. 65:333-47, 2014; Davila ML et al., Oncoimmunology. 1(9):1577-1583, 2012). Связывание целевых антигенов ХАР, привитыми на поверхность Т-клеток, может активировать Т-клеточные эффекторные функции независимо от взаимодействия комплекса ТКР-пептид/ГКГС. Таким образом, Т-клетки, имеющие ХАР, можно перенаправлять для атаки на широкий спектр клеток, включая те, которые не совпадают с типом ГКГС ТКР на Т-клетках, но экспрессируют целевые антигены клеточной поверхности. Этот подход позволяет преодолеть ограничения ГКГС-рестриктированного распознавания ТКР и избежать уклонения опухоли за счет нарушений в представлении антигенов или экспрессии молекул ГКГС. Клинические исследования продемонстрировали клинически значимую противоопухолевую активность терапии на основе ХАР-T при нейробластоме (Louis CU et al., Blood. 118(23):6050-6056, 2011), B-ОЛЛ (Maude, SL, et al., New England Journal of Medicine 371:16:1507-1517, 2014), ХЛЛ (Brentjens, RJ, et al. Blood 118:18:4817-4828, 2011) и B-клеточной лимфоме (Kochenderfer, JN, et al. Blood 116:20:4099-4102, 2010). В одном исследовании сообщается об уровне полной ремиссии в 90% у 30 пациентов с В-ОЛЛ, которых лечили с помощью терапии CD19-ХАР-Т (Maude, SL, et al., выше).

[0012] Все исследованные на данный момент ХАР были направлены на опухолевые антигены с высокой экспрессией на клеточной поверхности. Для нацеливания на опухолевые антигены клеточной поверхности и внутриклеточные опухолевые антигены с низким числом копий, которые представляют 95% всех известных опухолеспецифических антигенов, существует необходимость в разработке более сильных и эффективных вариантов инженерной клеточной терапии (Cheever, et al., Clin. Cancer Res. 15(17):5323-37, 2009).

[0013] Было предпринято несколько попыток сконструировать молекулы химерного рецептора, обладающие специфичностью антитела с эффекторными функциями Т-клеточного рецептора. Смотрите, например, Kuwana, Y, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 149(3):960-968, 1987; Gross, G, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:10024-10028, 1989; Gross, G & Eshhar, Z, FASEB J. 6(15):3370-3378, 1992; и патент США № 7 741 465. На данный момент ни один из этих химерных рецепторов не был одобрен для клинического применения, и необходимы новые разработки для химерных рецепторов антитело-ТКР с улучшенными экспрессией и функциональностью в человеческих Т-клетках.

[0014] Описания всех публикаций, патентов, патентных заявок и опубликованных патентных заявок, на которые ссылается данный документ, в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки. Заявка PCT № PCT/US2016/058305 в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

Краткое изложение сущности изобретения

[0015] В одном аспекте данной заявки предложены иммунные клетки (такие как Т-клетки), содержащие конструкцию химерное антитело - T-клеточный рецептор (ТКР) (хаТКР) и конструкцию химерного сигнального рецептора (ХСР). хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, и модуль Т-клеточного рецептора (МТКР), способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, а ХСР содержит лиганд-связывающий домен, который специфически связывается с целевым лигандом, и костимулирующий сигнальный домен, способный обеспечивать стимулирующий сигнал иммунной клетке.

[0016] В некоторых вариантах реализации предложена иммунная клетка, содержащая: a) конструкцию химерное антитело - T-клеточный рецептор (ТКР) (хаТКР), содержащую: i) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном; и ii) модуль Т-клеточного рецептора (МТКР), содержащий первый домен ТКР (ДТКР), содержащий первый трансмембранный домен ТКР (ТКР-ТМ), и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, причем МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы; и b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий: i) лиганд-связывающий модуль, который способен связываться или взаимодействовать с целевым лигандом; ii) трансмембранный модуль; и iii) костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки, который способен обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке, при этом лиганд-связывающий модуль и костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки не получены из одной и той же молекулы, и при этом в ХСР отсутствует функциональный первичный сигнальный домен иммунной клетки.

[0017] В некоторых вариантах реализации предложены одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих хаТКР и ХСР, описанных в данном документе, при этом каждый из хаТКР и ХСР состоит из одной или более полипептидных цепей, кодируемых одной или более нуклеиновыми кислотами.

[0018] В некоторых вариантах реализации предложены одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих: a) конструкцию химерное антитело - T-клеточный рецептор (ТКР) (хаТКР), содержащую: i) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном; и ii) модуль Т-клеточного рецептора (МТКР), содержащий первый домен ТКР (ДТКР), содержащий первый трансмембранный домен ТКР (ТКР-ТМ), и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, при этом МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы, и при этом хаТКР состоит из одной или более полипептидных цепей; и b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий: i) лиганд-связывающий модуль, который способен связываться или взаимодействовать с целевым лигандом; ii) трансмембранный модуль; и iii) костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки, который способен обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке, при этом лиганд-связывающий модуль и костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки не получены из одной и той же молекулы, при этом в ХСР отсутствует функциональный первичный сигнальный домен иммунной клетки, и при этом ХСР состоит из одной или более полипептидных цепей.

[0019] В некоторых вариантах реализации предложены один или более векторов, содержащих одну или более нуклеиновых кислот, описанных в данном документе.

[0020] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая одну или более нуклеиновых кислот или один или более векторов, описанных в данном документе.

[0021] В некоторых вариантах реализации предложена иммунная клетка, содержащая одну или более нуклеиновых кислот или один или более векторов, описанных в данном документе.

[0022] В некоторых вариантах реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая иммунную клетку, описанную в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0023] В некоторых вариантах реализации предложен способ уничтожения целевой клетки, представляющей целевой антиген, включающий приведение целевой клетки в контакт с иммунной клеткой, описанной в данном документе.

[0024] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения связанного с целевым антигеном заболевания у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в данном документе.

[0025] В некоторых вариантах реализации предложен способ обеспечения костимулирующего сигнала иммунной клетке, содержащей хаТКР или трансдуцированной нуклеиновой кислотой, кодирующей хаТКР, включающий внесение в указанную клетку одной или более нуклеиновых кислот или одного или более векторов, описанных в данном документе.

Краткое описание графических материалов

[0026] На Фиг. 1 приведено схематическое изображение нескольких молекул хаТКР, имеющих разные антигенсвязывающие модули.

[0027] На Фиг. 2 приведен процент специфического лизиса при уничтожении раковой клеточной линии NALM6 (CD19⁺), опосредованном Т-клетками, трансдуцированными только анти-CD19 хаТКР-1-0, только анти-CD19 ХСР или анти-CD19 хаТКР (1-0 и 1-TM5) + анти-CD19 ХСР.

[0028] На Фиг. 3 приведена концентрация цитокинов (IL-2, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α), обнаруженных в супернатанте после in vitro уничтожения раковой клеточной линии NALM6, опосредованного Т-клетками, трансдуцированными только анти-CD19 хаТКР-1-0, только анти-CD19 ХСР или анти-CD19 хаТКР (1-0 и 1-TM5) + анти-CD19 ХСР.

[0029] На Фиг. 4 проиллюстрирована активность дегрануляции (определяемая по экспрессии CD107a) в Т-клетках, трансдуцированных только анти-CD19 хаТКР-1-0, только анти-CD19 ХСР или анти-CD19 хаТКР (1-0 и 1-TM5) + анти-CD19 ХСР, после стимуляции раковой клеточной линией NALM6.

[0030] На Фиг. 5 проиллюстрирована пролиферация (определяемая по разведению красителя CFSE) Т-клеток, трансдуцированных только анти-CD19 хаТКР-1-0 или анти-CD19 хаТКР (1-0 и 1-TM5) + анти-CD19 ХСР, после стимуляции раковыми клеточными линиями BV173 или NALM6.

[0031] На Фиг. 6 приведен процент специфического лизиса при уничтожении раковых клеточных линий HepG2 (AFP⁺/GPC3⁺) и HepG2-GPC3.ko (AFP⁺/GPC3^-), опосредованном Т-клетками, трансдуцированными только анти-AFP158/HLA-A*2:01 хаТКР-1-0, только анти-GPC3 ХСР или анти-AFP158/HLA-A*2:01 хаТКР (1-0 и 1-TM5) + анти-GPC3 ХСР.

[0032] На Фиг. 7 приведена концентрация цитокинов (IL-2, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α), обнаруженных в супернатанте после in vitro уничтожения раковых клеточных линий HepG2 и HepG2-GPC3.ko, опосредованного Т-клетками, трансдуцированными только анти-AFP158/HLA-A*2:01 хаТКР-1-0, только анти-GPC3 ХСР или анти-AFP158/HLA-A*2:01 хаТКР (1-0 и 1-TM5) + анти-GPC3 ХСР.

[0033] На Фиг. 8 проиллюстрирована активность дегрануляции (определяемая по экспрессии CD107a) в Т-клетках, трансдуцированных только анти-AFP158/HLA-A*2:01 хаТКР-1-0, только анти-GPC3 ХСР или анти-AFP158/HLA-A*2:01 хаТКР (1-0 и 1-TM5) + анти-GPC3 ХСР, после стимуляции раковой клеточной линией HepG2.

[0034] На Фиг. 9 проиллюстрирована пролиферация (определяемая по разведению красителя CFSE) Т-клеток, трансдуцированных только анти-AFP158/HLA-A*2:01 хаТКР-1-0, только анти-GPC3 ХСР или анти-AFP158/HLA-A*2:01 хаТКР (1-0 и 1-TM5) + анти-GPC3 ХСР, после стимуляции раковой клеточной линией HepG2.

[0035] На Фиг. 10 приведен процент специфического лизиса при уничтожении раковых клеточных линий Raji, BV173, NALM6 и Jeko-1 (каждая CD19⁺/CD20⁺), опосредованном Т-клетками, трансдуцированными анти-CD19 хаТКР (1-0 и 1-TM5) + анти-CD20 ХСР.

[0036] На Фиг. 11 приведена концентрация цитокинов (IL-2, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α), обнаруженных в супернатанте после in vitro уничтожения раковой клеточной линии Raji, опосредованного Т-клетками, трансдуцированными только анти-CD19 хаТКР-1-0 или анти-CD19 хаТКР (1-0 и 1-TM5) + анти-CD20 ХСР.

[0037] На Фиг. 12 проиллюстрирована активность дегрануляции (определяемая по экспрессии CD107a) в Т-клетках, трансдуцированных только анти-CD19 хаТКР-1-0, только анти-CD20 ХСР или анти-CD19 хаТКР (1-0 и 1-TM5) + анти-CD20 ХСР, после стимуляции раковой клеточной линией Raji.

[0038] На Фиг. 13A-13E приведены схематические структуры типовых биспецифических молекул хаТКР.

[0039] На Фиг. 14-15 проиллюстрирована пролиферация (определяемая по разведению красителя CFSE) Т-клеток, экспрессирующих анти-CD19 хаТКР-1-0 и анти-CD19 ХСР, после стимуляции раковой клеточной линией NALM6.

[0040] На Фиг. 16 проиллюстрирован рост опухоли в подкожной мышиной модели NALM6 с контрольной обработкой или однократной внутриопухолевой инъекцией Т-клеток, экспрессирующих анти-CD19 хаТКР-1 или анти-CD19 хаТКР-1 в комбинации с анти-CD19 ХСР-1.

[0041] На Фиг. 17 приведены сывороточные уровни цитокинов у мышей, обработанных T-клетками, экспрессирующими анти-CD19 ХАР, или T-клетками, экспрессирующими как анти-CD19 хаТКР-1, так и анти-CD19 ХСР-1. t-критерий Стьюдента используют для анализа статистической значимости сывороточных уровней цитокинов в двух группах (** P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001).

[0042] На Фиг. 18 проиллюстрирован рост опухоли в подкожной мышиной модели HepG2 с контрольной обработкой или однократной внутриопухолевой инъекцией Т-клеток, экспрессирующих анти-AFP ХАР или анти-AFP ХАР в комбинации с анти-GPC3 ХСР.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0043] В настоящей заявке предложены иммунные клетки (такие как Т-клетки), содержащие конструкцию химерное антитело - T-клеточный рецептор (ТКР) (хаТКР) и конструкцию химерного сигнального рецептора (ХСР). хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, и модуль Т-клеточного рецептора (МТКР), способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу. ХСР содержит лиганд-связывающий домен, который специфически связывается с целевым лигандом, и костимулирующий сигнальный домен иммунной клетки, способный обеспечивать стимулирующий сигнал иммунной клетке, и не содержит функциональную первичную сигнальную последовательность иммунной клетки. Целевой антиген и целевой лиганд могут представлять собой белки, экспрессируемые на клеточной поверхности, или комплексы, содержащие пептид и белок ГКГС (называемые в данном документе «комплексом бГКГС» или «бГКГС»), такие как представляемый ГКГС ассоциированный с заболеванием антигенный пептид на поверхности клетки заболевания. хаТКР регулируются естественным механизмом, который управляет активацией Т-клеточного рецептора, а сигнализация посредством ХСР может усиливать иммунный ответ, опосредованный хаТКР.

[0044] Мы разработали ряд новых Т-клеток, содержащих конструкции хаТКР и ХСР. Они демонстрировали сильную цитотоксичность против несущих мишень опухолевых клеток с повышенной экспрессией цитокинов в ответ на взаимодействие с целевыми клетками по сравнению с клетками, экспрессирующими только хаТКР в отсутствие ХСР. Включение ХСР в эти клетки дополнительно усиливало дегрануляцию, пролиферацию и жизнеспособность по сравнению с клетками, экспрессирующими только хаТКР.

[0045] Таким образом, в настоящей заявке предложены иммунные клетки, содержащие хаТКР, специфический к целевому антигену, и ХСР, специфический к целевому лиганду, причем хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, и модуль Т-клеточного рецептора (МТКР), способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, и при этом ХСР a) содержит лиганд-связывающий домен, который специфически связывается с целевым лигандом, и костимулирующий сигнальный домен иммунной клетки, способный обеспечивать стимулирующий сигнал иммунной клетке, и b) не содержит функциональную первичную сигнальную последовательность иммунной клетки. хаТКР может принимать любой из ряда форматов с вариациями в антигенсвязывающем модуле и/или МТКР. Например, хаТКР может иметь антигенсвязывающий модуль, содержащий фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab’, (Fab’)₂, Fv и scFv, и МТКР, содержащий одну или более последовательностей, полученных из α/β или γ/δ ТКР, включая варианты в одном или более из трансмембранного домена, соединительного пептида и внутриклеточного домена. Смотрите Фиг. 1. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим). Аналогично, ХСР может иметь лиганд-связывающий модуль, содержащий фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab’, (Fab’)₂, Fv и scFv. В некоторых вариантах реализации целевой антиген и целевой лиганд являются одинаковыми. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль хаТКР и лиганд-связывающий модуль ХСР являются одинаковыми или содержат одинаковые последовательности, придающие специфичность к антигену, такие как CDR или вариабельные домены. В некоторых вариантах реализации целевой антиген и целевой лиганд являются разными.

[0046] В других аспектах предложены а) одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих хаТКР и ХСР, b) иммунные клетки, содержащие одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих хаТКР и ХСР, и c) композиции, содержащие иммунные клетки, содержащие i) хаТКР и ХСР или ii) одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих хаТКР и ХСР. Композиции могут представлять собой фармацевтические композиции.

[0047] Также предложены способы получения и применения иммунных клеток, содержащих хаТКР и ХСР в целях лечения, а также наборы и готовые изделия, применимые в таких способах. Дополнительно предложены способы лечения заболевания с помощью иммунных клеток, содержащих хаТКР и ХСР.

Определения

[0048] Термин «антитело» или «фрагмент антитела» включает полноразмерные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. Полноразмерное антитело содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей отвечают за связывание антигена. Вариабельные области в обеих цепях в общем случае содержат три высоковариабельные петли, называемые определяющими комплементарность областями (CDR) (CDR легкой цепи (LC), включая LC-CDR1, LC-CDR2 и LC-CDR3, CDR тяжелой цепи (HC), включая HC-CDR1, HC-CDR2 и HC-CDR3). Границы CDR для антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, могут быть определены или идентифицированы по системам Kabat, Chothia или Al-Lazikani (Al-Lazikani 1997; Chothia 1985; Chothia 1987; Chothia 1989; Kabat 1987; Kabat 1991). Три CDR тяжелой или легкой цепей расположены между фланкирующими участками, известными как каркасные области (FR), которые являются более высококонсервативными чем CDR и образуют каркас для поддержки гипервариабельных петель. Константные области тяжелой и легкой цепей не участвуют в связывании антигена, но проявляют различные эффекторные функции. Антителам приписывается определенный класс на основании аминокислотной последовательности константной области их тяжелой цепи. Пятью основными классами или изотипами антител являются IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, которые характеризуются наличием тяжелых цепей α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Некоторые из основных классов антител разделены на подклассы, такие как IgG1 (тяжелая цепь γ1), IgG2 (тяжелая цепь γ2), IgG3 (тяжелая цепь γ3), IgG4 (тяжелая цепь γ4), IgA1 (тяжелая цепь α1) или IgA2 (тяжелая цепь α2).

[0049] В контексте данного документа термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к фрагменту антитела, включая, например, диатело, Fab, Fab', F(ab')2, фрагмент Fv, дисульфидно-стабилизированный фрагмент Fv (dsFv), (dsFv)2, биспецифический dsFv (dsFv-dsFv'), дисульфидно-стабилизированное диатело (ds-диатело), одноцепочечную молекулу антитела (scFv), димер scFv (двухвалентное диатело), мультиспецифическое антитело, образованное из части антитела, содержащей одну или более CDR, верблюдизированное однодоменное антитело, нанотело, доменное антитело, двухвалентное доменное антитело или любой другой фрагмент антитела, который связывается с антигеном, но не содержит полную структуру антитела. Антигенсвязывающий фрагмент способен связываться с тем же антигеном, с которым связывается родительское антитело или родительский фрагмент антитела (например, родительский scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий фрагмент может содержать одну или более CDR из конкретного человеческого антитела, привитых в каркасную область из одного или более отличных человеческих антител.

[0050] В контексте данного документа первый фрагмент антитела «конкурирует» за связывание с целевым антигеном со вторым фрагментом антитела, если первый фрагмент антитела ингибирует связывание целевого антигена со вторым фрагментом антитела по меньшей мере на около 50% (например, по меньшей мере около 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) в присутствии эквимолярной концентрации первого фрагмента антитела, или наоборот. Высокопроизводительный процесс для «сортировки» антител на основании их перекрестной конкуренции описан в публикации PCT № WO 03/48731.

[0051] В контексте данного документа термин «специфически связывается» или «является специфическим в отношении» относится к измеримым и воспроизводимым взаимодействиям, таким как связывание между мишенью и антителом или фрагментом антитела, которые позволяют определять присутствие мишени при наличии гетерогенной популяции молекул, включая биологические молекулы. Например, фрагмент антитела, который специфически связывается с мишенью (которая может быть эпитопом), представляет собой фрагмент антитела, который связывается с этой мишенью с большей аффинностью, авидностью, более быстро и/или с большей продолжительностью, чем он связывается с другими мишенями. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела, который специфически связывается с антигеном, вступает в реакцию с одной или более антигенными детерминантами антигена (например, антигеном клеточной поверхности или белковым комплексом пептид/ГКГС) с аффинностью связывания, которая по меньшей мере в около 10 раз превышает аффинность связывания с другими мишенями.

[0052] Термин «Т-клеточный рецептор» или «ТКР» относится к гетеродимерному рецептору, состоящему из цепей αβ или γδ, которые спарены на поверхности Т-клетки. Каждая цепь α, β, γ и δ состоит из двух Ig-подобных доменов: вариабельного домена (V), который обеспечивает распознавание антигена посредством определяющих комплементарность областей (CDR), за которым следует константный домен (C), прикрепленный к клеточной мембране соединительным пептидом и трансмембранной (ТМ) областью. Область TM связывается с инвариантными субъединицами сигнального механизма CD3. Каждый из V-доменов имеет три CDR. Эти CDR взаимодействуют с комплексом между антигенным пептидом, связанным с белком, кодируемым основным комплексом гистосовместимости (бГКГС) (Davis and Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402; Davis et al. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544; Murphy (2012), xix, 868 p.).

[0053] Термин «ТКР-ассоциированная сигнальная молекула» относится к молекуле, имеющей цитоплазматический иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM), который является частью комплекса ТКР-CD3. ТКР-ассоциированные сигнальные молекулы включают CD3γε, CD3δε и ζζ (также известный как CD3ζ или CD3ζζ).

[0054] В контексте данного документа термин «активация», употребляемый в отношении клетки, экспрессирующей CD3, относится к состоянию клетки, которую достаточно стимулировали для индукции выявляемого повышения последующих эффекторных функций сигнального пути CD3, включая, без ограничений, клеточную пролиферацию и выработку цитокинов.

[0055] Подразумевается, что термин «модуль» применительно к части белка включает структурно и/или функционально связанные части одного или более полипептидов, из которых состоит белок. Например, трансмембранный модуль димерного рецептора может относиться к частям каждой полипептидной цепи рецептора, которые проходят через мембрану. Модуль также может относиться к связанным частям одной полипептидной цепи. Например, трансмембранный модуль мономерного рецептора может относиться к частям одной полипептидной цепи рецептора, которая проходит через мембрану. Модуль может также содержать только одну часть полипептида.

[0056] В контексте данного документа подразумевается, что термин «выделенная нуклеиновая кислота» означает нуклеиновую кислоту геномного, кДНК или синтетического происхождения или некоторые их комбинации, которая за счет того, что она является «выделенной нуклеиновой кислотой», (1) не связана со всем или частью полинуклеотида, в котором «выделенная нуклеиновая кислота» находится в природе, (2) функционально связана с полинуклеотидом, с которым он не связана в природе, или (3) не существует в природе как часть большей последовательности.

[0057] В контексте данного документа подразумевается, что термин «CDR» или «определяющая комплементарность область» означает не-непрерывные антигенсвязывающие участки, находящиеся в вариабельной области полипептидов тяжелой и легкой цепей. Эти конкретные области описаны в Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Al-Lazikani B. et al., J. Mol. Biol., 273: 927-948 (1997); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996); Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008); Lefranc M.P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 (2003); и Honegger and Plückthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001), в которых определения включают перекрывание или подгруппы аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Тем не менее, предполагается, что применение любого определения для указания CDR антител или привитых антител или их вариантов входит в объем этого термина, определенного и употребляемого в данном документе. Аминокислотные остатки, которые включают CDR, определенные в каждой из вышеперечисленных ссылок, приведены ниже в таблице 1 в качестве сравнения. Алгоритмы и интерфейсы прогнозирования CDR известны в данной области техники, включая, например, Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008); Ehrenmann F. et al., Nucleic Acids Res., 38: D301-D307 (2010); и Adolf-Bryfogle J. et al., Nucleic Acids Res., 43: D432-D438 (2015). Содержание ссылок, цитируемых в этом параграфе, в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки для применения в настоящем изобретении и для возможного включения в один или более пунктов формулы изобретения.

ТАБЛИЦА 1: ОПРЕДЕЛЕНИЯ CDR

	Kabat¹	Chothia²	MacCallum³	IMGT⁴	AHo⁵
V_H CDR1	31-35	26-32	30-35	27-38	25-40
V_HCDR2	50-65	53-55	47-58	56-65	58-77
V_H CDR3	95-102	96-101	93-101	105-117	109-137
V_L CDR1	24-34	26-32	30-36	27-38	25-40
V_L CDR2	50-56	50-52	46-55	56-65	58-77
V_L CDR3	89-97	91-96	89-96	105-117	109-137

¹Нумерация остатков соответствует номенклатуре Kabat et al., выше

²Нумерация остатков соответствует номенклатуре Chothia et al., выше

³Нумерация остатков соответствует номенклатуре MacCallum et al., выше

⁴Нумерация остатков соответствует номенклатуре Lefranc et al., выше

⁵Нумерация остатков соответствует номенклатуре Honegger and Plückthun, выше

[0058] Термин «химерные» антитела относится к антителам, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретного вида или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, а оставшаяся часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител при условии, что они проявляют биологическую активность по данному изобретению (смотрите патент США № 4,816,567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

[0059] Термин «полусинтетический» в отношении антитела или фрагмент антитела означает, что антитело или фрагмент антитела имеют одну или более встречающихся в природе последовательностей и одну или более не встречающихся в природе последовательностей (т. е. синтетических).

[0060] Термин «полностью синтетический» в отношении антитела или фрагмента антитела означает, что антитело или фрагмент антитела имеют фиксированные встречающиеся в природе каркасные пары V_H/V_L, но не встречающиеся в природе (т. е. синтетические) последовательности всех 6 CDR как тяжелой, так и легкой цепей.

[0061] «Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, принадлежащих грызунам) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельной области (HVR) реципиента заменены остатками из гипервариабельной области отличного от человека вида (антитело-донор), например мыши, крысы, кролика или отличного от человека примата, имеющей необходимые специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими нечеловеческими остатками. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в антителе-реципиенте или антителе-доноре. Эти модификации вносят для дополнительного улучшения характеристик антител. В общем случае гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют таковым из нечеловеческого иммуноглобулина, а все или практически все FR соответствуют таковым из последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело, необязательно, также содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Более подробную информацию смотрите в Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

[0062] Термин «гомология» относится к сходству последовательности или идентичности последовательности между двумя полипептидами или между двумя молекулами нуклеиновых кислот. Если позиция в обеих из двух сравниваемых последовательностей занята одним и тем же основанием или одной и той же субъединицей аминокислотного мономера, например, если позиция в каждой из двух молекул ДНК занята аденином, то эти молекулы являются «гомологичными» в этой позиции. «Процент гомологии» или «процент идентичности последовательности» между двумя последовательностями является функцией числа совпадающих или гомологичных позиций, общих для двух последовательностей, деленного на число сравниваемых позиций и умноженного на 100, с учетом любых консервативных замен как части идентичности последовательности. Например, если 6 из 10 позиций в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, то две последовательности являются на 60% гомологичными. В качестве примера, последовательности ДНК ATTGCC и TATGGC имеют 50% гомологии. В общем случае сравнение проводят, когда две последовательности выровнены для получения максимальной гомологии. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно осуществлять различными способами, известными в данной области техники, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) или MUSCLE. Специалисты в данной области техники могут определить подходящие параметры для определения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. При этом в целях данного документа значения % идентичности аминокислотной последовательности получают, используя компьютерную программу для сравнения последовательностей MUSCLE (Edgar, R.C., Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797, 2004; Edgar, R.C., BMC Bioinformatics 5(1):113, 2004).

[0063] «Домен C_H1» Fc-области человеческого IgG (также называемый доменом «C1» «H1») обычно идет приблизительно от аминокислоты 118 приблизительно до аминокислоты 215 (система нумерации EU).

[0064] Если не указано иное, «нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность» включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Выражение нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК, также может включать интроны поскольку нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в некоторых версиях содержать интрон(ы).

[0065] Термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, приводящей к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор оказывает влияние на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. В общем случае функционально связанные последовательности ДНК являются смежными и, при необходимости объединения двух кодирующих белок областей, находятся в одной рамке считывания.

[0066] Термин «индуцибельный промотор» относится к промотору, активность которого можно регулировать путем добавления или удаления одного или более определенных сигналов. Например, индуцибельный промотор может активировать транскрипцию функционально связанной нуклеиновой кислоты в определенных условиях, например, в присутствии индуктора или условий, которые активируют промотор и/или ослабляют репрессию промотора.

[0067] В данном документе термин «лечение» относится к подходу для достижения благоприятных или желательных результатов, включая клинические результаты. В целях этого изобретения благоприятные или желательные результаты включают, но не ограничиваются этим, один или более из следующих результатов: ослабление одного и более симптомов, вызванных заболеванием, уменьшение степени заболевания, стабилизацию заболевания (например, предотвращение или замедление ухудшения заболевания), предотвращение или замедление распространения (например, метастазирования) заболевания, предотвращение или замедление повторного появления заболевания, отсрочку или замедление прогрессирования заболевания, облегчение состояния заболевания, обеспечение ремиссии (частичной или полной) заболевания, снижение дозы одного или более других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, замедление прогрессирования заболевания, повышение или улучшение качества жизни, увеличение прибавления массы и/или продление времени жизни. Также в термин «лечение» включено снижение патологических последствий заболевания (таких как, например, объем опухоли при раке). Способы по изобретению предусматривают любой один или более из этих аспектов лечения.

[0068] Термины «повторное появление», «рецидив» или «рецидивирующий» относятся к повторному появлению рака или заболевания после исчезновения заболевания согласно клинической оценке. Диагностику отдаленного метастазирования или местного повторного появления можно считать рецидивом.

[0069] Термин «рефрактерный» или «резистентный» относится к раку или заболеванию, которое не восприимчиво к лечению.

[0070] «Эффективное количество» хаТКР или композиции, содержащей хаТКР, описанных в данном документе, представляет собой количество, достаточное для выполнения конкретно установленной цели. «Эффективное количество» можно определить эмпирически и с помощью известных способов, относящихся к установленной цели.

[0071] Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству хаТКР или композиции, содержащей хаТКР, описанные в данном документе, которое является эффективным для «лечения» заболевания или расстройства у индивида. В случае рака терапевтически эффективное количество хаТКР или композиции, содержащей хаТКР, описанные в данном документе, может снижать число раковых клеток; снижать размер или массу опухоли; подавлять (т. е. в некоторой степени замедлять и предпочтительно останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; подавлять (т. е. в некоторой степени замедлять и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; подавлять в некоторой степени рост опухоли; и/или облегчать в некоторой степени один или более симптомов, связанных с раком. Поскольку хаТКР или композиция, содержащая хаТКР, описанные в данном документе, могут предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, они могут быть цитостатическими и/или цитотоксическими. В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективное количество представляет собой ингибирующее рост количество. В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое улучшает выживаемость пациента без прогрессирования. В случае инфекционного заболевания, такого как вирусная инфекция, терапевтически эффективное количество хаТКР или композиции, содержащей хаТКР, описанные в данном документе, может снижать число клеток, инфицированных патогеном; снижать выработку или высвобождение патогенных антигенов; подавлять (т. е. в некоторой степени замедлять и предпочтительно останавливать) распространение патогена на неинфицированные клетки; и/или облегчать в некоторой степени один или более симптомов, связанных с инфекцией. В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое продлевает время жизни пациента.

[0072] В контексте данного документа под термином «фармацевтически приемлемый» или «фармакологически совместимый» подразумевается материал, который не является биологически или иным образом нежелательным, например, материал может быть включен в фармацевтическую композицию, вводимую пациенту, и не вызывать при этом каких-либо существенных нежелательных биологических эффектов или не взаимодействовать вредным образом с любыми другими компонентами композиции, в состав которой он входит. Фармацевтически приемлемые носители или наполнители предпочтительно соответствуют необходимым стандартам токсикологических и производственных испытаний и/или включены в Руководство по неактивным ингредиентам, подготовленное Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США.

[0073] Следует понимать, что варианты реализации изобретения, описанные в данном документе, включают «состоящие» и/или «состоящие преимущественно из» вариантов реализации.

[0074] Указание «около» в применении к значению или параметру в данном документе включает (и описывает) вариации, которые относятся к этому значению или параметру как таковому. Например, описание, относящееся к «около X», включает описание X.

[0075] В контексте данного документа указание на «не» в применении к значению или параметру в общем случае означает и описывает величины, «отличные от» значения или параметра. Например, то, что способ не используется для лечения рака типа X, означает, что этот способ используется для лечения рака других типов, отличных от X.

[0076] В контексте данного документа и прилагаемой формулы изобретения формы единственного числа включают отсылки на множественное число, если контекстом явно не предусмотрено иное.

Иммунные клетки хаТКР плюс ХСР

[0077] В настоящем изобретении предложена иммунная клетка (такая как Т-клетка), представляющая на своей поверхности хаТКР и ХСР в соответствии с любыми хаТКР и ХСР, описанными в данном документе (такая иммунная клетка также называется в данном документе «иммунной клеткой хаТКР плюс ХСР»). В некоторых вариантах реализации иммунная клетка содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую хаТКР и ХСР, причем хаТКР и ХСР экспрессируются из нуклеиновой кислоты и локализованы на поверхности иммунной клетки. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой Т-клетку. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической Т-клетки, хелперной Т-клетки, естественной киллерной T-клетки и супрессорной Т-клетки. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка не экспрессирует субъединицы ТКР, из которых получены ТКР-ТМ хаТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей δ и γ ТКР, или же Т-клетка представляет собой γδ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей α и β ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунную клетку модифицируют для блокирования или снижения экспрессии одной или обеих субъединиц эндогенного ТКР иммунной клетки. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей α и/или β ТКР, или же иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей γ и/или δ ТКР. Модификации клеток, направленные на нарушение генной экспрессии, включают любые такие способы, известные в данной области техники, включая, например, РНК-интерференцию (например, миРНК, кшРНК, микроРНК), редактирование генов (например, генный нокаут с применением CRISPR или TALEN) и т. п.

[0078] Например, в некоторых вариантах реализации предложена иммунная клетка (такая как Т-клетка), содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, и ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, причем хаТКР и ХСР экспрессируются из нуклеиновой кислоты и локализованы на поверхности иммунной клетки. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую первую полипептидную цепь хаТКР, вторую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую вторую полипептидную цепь хаТКР, и последовательность нуклеиновой кислоты ХСР, кодирующую полипептидную цепь ХСР. В некоторых вариантах реализации каждая из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот хаТКР и последовательности нуклеиновой кислоты ХСР содержатся в разных векторах. В некоторых вариантах реализации некоторые или все последовательности нуклеиновых кислот содержатся в одном векторе. Векторы могут быть выбраны, например, из группы, состоящей из экспрессионных векторов млекопитающих и вирусных векторов (таких как полученные из ретровирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, герпесвирусов и лентивирусов). В некоторых вариантах реализации один или более векторов интегрированы в хозяйский геном иммунной клетки. В некоторых вариантах реализации каждая из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот хаТКР и последовательности нуклеиновой кислоты ХСР находятся под управлением разных промоторов. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют одинаковую последовательность. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют разные последовательности. В некоторых вариантах реализации некоторые или все последовательности нуклеиновых кислот находятся под управлением одного промотора. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы являются индуцибельными. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической Т-клетки, хелперной Т-клетки, естественной киллерной T-клетки и супрессорной Т-клетки.

[0079] Таким образом, в некоторых вариантах реализации предложена иммунная клетка хаТКР плюс ХСР (такая как Т-клетка), экспрессирующая на своей поверхности хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, и ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, причем иммунная клетка хаТКР плюс ХСР содержит a) первую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую первую полипептидную цепь хаТКР; b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую вторую полипептидную цепь хаТКР; и c) последовательность нуклеиновой кислоты ХСР, кодирующую полипептидную цепь ХСР, причем первая и вторая полипептидные цепи хаТКР экспрессируются из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот хаТКР с образованием хаТКР, причем полипептидная цепь ХСР экспрессируется из нуклеиновой кислоты ХСР с образованием ХСР, и причем хаТКР и ХСР локализованы на поверхности иммунной клетки. В некоторых вариантах реализации первая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР содержится в первом векторе (таком как лентивирусный вектор), вторая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР содержится во втором векторе (таком как лентивирусный вектор), а последовательность нуклеиновой кислоты ХСР содержится в третьем векторе (таком как лентивирусный вектор). В некоторых вариантах реализации некоторые или все из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот хаТКР и последовательности нуклеиновой кислоты ХСР содержатся в одном векторе (таком как лентивирусный вектор). В некоторых вариантах реализации каждая из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот хаТКР и последовательности нуклеиновой кислоты ХСР, по отдельности, функционально связаны с промотором. В некоторых вариантах реализации некоторые или все последовательности нуклеиновых кислот находятся под управлением одного промотора. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют одинаковую последовательность. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют разные последовательности. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы являются индуцибельными. В некоторых вариантах реализации некоторые или все векторы представляют собой вирусные векторы (такие как лентивирусные векторы). В некоторых вариантах реализации иммунная клетка не экспрессирует субъединицы ТКР, из которых получены ТКР-ТМ хаТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей δ и γ ТКР, или же иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей α и β ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунную клетку модифицируют для блокирования или снижения экспрессии одной или обеих субъединиц эндогенного ТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей α и/или β ТКР, или же иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей γ и/или δ ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической Т-клетки, хелперной Т-клетки, естественной киллерной T-клетки и супрессорной Т-клетки. В некоторых вариантах реализации некоторые или все векторы представляют собой вирусные векторы (такие как лентивирусные векторы), интегрированные в хозяйский геном иммунной клетки.

[0080] В некоторых вариантах реализации предложена иммунная клетка хаТКР плюс ХСР (такая как Т-клетка), экспрессирующая на своей поверхности хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, и ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, причем иммунная клетка хаТКР плюс ХСР содержит a) первый вектор, содержащий первый промотор, функционально связанный с первой последовательностью нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующей первую полипептидную цепь хаТКР; b) второй вектор, содержащий второй промотор, функционально связанный со второй последовательностью нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующей вторую полипептидную цепь хаТКР; и c) третий вектор, содержащий третий промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты ХСР, кодирующей полипептидную цепь ХСР, причем первая и вторая полипептидные цепи хаТКР экспрессируются из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот хаТКР с образованием хаТКР, а полипептидная цепь ХСР экспрессируется из последовательности нуклеиновой кислоты ХСР с образованием ХСР, и причем хаТКР и ХСР локализованы на поверхности иммунной клетки. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют одинаковую последовательность. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют разные последовательности. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы являются индуцибельными. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка не экспрессирует субъединицы ТКР, из которых получены ТКР-ТМ хаТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей δ и γ ТКР, или же иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей α и β ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунную клетку модифицируют для блокирования или снижения экспрессии одной или обеих субъединиц эндогенного ТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей α и/или β ТКР, или же иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей γ и/или δ ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической Т-клетки, хелперной Т-клетки, естественной киллерной T-клетки и супрессорной Т-клетки. В некоторых вариантах реализации первый и второй векторы представляют собой вирусные векторы (такие как лентивирусные векторы), интегрированные в хозяйский геном иммунной клетки.

[0081] В некоторых вариантах реализации предложена иммунная клетка хаТКР плюс ХСР (такая как Т-клетка), экспрессирующая на своей поверхности хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, и ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, причем иммунная клетка хаТКР плюс ХСР содержит a) первый вектор, содержащий i) первый промотор, функционально связанный с первой последовательностью нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующей первую полипептидную цепь хаТКР, и ii) второй промотор, функционально связанный со второй последовательностью нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующей вторую полипептидную цепь хаТКР; и c) второй вектор, содержащий третий промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты ХСР, кодирующей полипептидную цепь ХСР, причем первая и вторая полипептидные цепи хаТКР экспрессируются из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот хаТКР с образованием хаТКР, а полипептидная цепь ХСР экспрессируется из последовательности нуклеиновой кислоты ХСР с образованием ХСР, и причем хаТКР и ХСР локализованы на поверхности иммунной клетки. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют одинаковую последовательность. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют разные последовательности. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы являются индуцибельными. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка не экспрессирует субъединицы ТКР, из которых получены ТКР-ТМ хаТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей δ и γ ТКР, или же иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей α и β ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунную клетку модифицируют для блокирования или снижения экспрессии одной или обеих субъединиц эндогенного ТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей α и/или β ТКР, или же иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей γ и/или δ ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической Т-клетки, хелперной Т-клетки, естественной киллерной T-клетки и супрессорной Т-клетки. В некоторых вариантах реализации первый и второй векторы представляют собой вирусные векторы (такие как лентивирусные векторы), интегрированные в хозяйский геном иммунной клетки. Следует понимать, что предусмотрены также варианты реализации с обменом любой из последовательностей нуклеиновых кислот, например, когда первая или вторая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР обменена на последовательность нуклеиновой кислоты ХСР.

[0082] В некоторых вариантах реализации предложена иммунная клетка хаТКР плюс ХСР (такая как Т-клетка), экспрессирующая на своей поверхности хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, и ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, причем иммунная клетка хаТКР плюс ХСР содержит a) первый вектор, содержащий i) первую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующей первую полипептидную цепь хаТКР, и ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую вторую полипептидную цепь хаТКР, причем первая и вторая последовательности нуклеиновых кислот хаТКР находятся под управлением первого промотора; и c) второй вектор, содержащий второй промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты ХСР, кодирующей полипептидную цепь ХСР, причем первая и вторая полипептидные цепи хаТКР экспрессируются из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот хаТКР с образованием хаТКР, а полипептидная цепь ХСР экспрессируется из последовательности нуклеиновой кислоты ХСР с образованием ХСР, и причем хаТКР и ХСР локализованы на поверхности иммунной клетки. В некоторых вариантах реализации первый промотор функционально связан с 5’ концом первой последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР, и присутствует нуклеотидный линкер, выбранный из группы, состоящей из внутреннего сайта связывания рибосомы (IRES) и нуклеиновой кислоты, кодирующей саморасщепляемый пептид 2A (такой как P2A, T2A, E2A или F2A), связывающий 3’ конец первой последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР с 5’ концом второй последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР и вторая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР транскрибируются в виде одной РНК под управлением промотора. В некоторых вариантах реализации первый промотор функционально связан с 5’ концом второй последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР, и присутствует нуклеотидный линкер, выбранный из группы, состоящей из внутреннего сайта связывания рибосомы (IRES) и нуклеиновой кислоты, кодирующей саморасщепляемый пептид 2A (такой как P2A, T2A, E2A или F2A), связывающий 3’ конец второй последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР с 5’ концом первой последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР и вторая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР транскрибируются в виде одной РНК под управлением промотора. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй промоторы имеют одинаковую последовательность. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй промоторы имеют разные последовательности. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй промоторы являются индуцибельными. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка не экспрессирует субъединицы ТКР, из которых получены ТКР-ТМ хаТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей δ и γ ТКР, или же иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей α и β ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунную клетку модифицируют для блокирования или снижения экспрессии одной или обеих субъединиц эндогенного ТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей α и/или β ТКР, или же иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей γ и/или δ ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической Т-клетки, хелперной Т-клетки, естественной киллерной T-клетки и супрессорной Т-клетки. В некоторых вариантах реализации вектор представляет собой вирусный вектор (такой как лентивирусный вектор), интегрированный в хозяйский геном иммунной клетки. Следует понимать, что предусмотрены также варианты реализации с обменом любой из последовательностей нуклеиновых кислот, например, когда первая или вторая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР обменена на последовательность нуклеиновой кислоты ХСР.

[0083] В некоторых вариантах реализации предложена иммунная клетка хаТКР плюс ХСР (такая как Т-клетка), экспрессирующая на своей поверхности хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, и ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, причем иммунная клетка хаТКР плюс ХСР содержит вектор, содержащий a) первую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую первую полипептидную цепь хаТКР; b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую вторую полипептидную цепь хаТКР; и c) последовательность нуклеиновой кислоты ХСР, кодирующую полипептидную цепь ХСР, причем первая и вторая последовательности нуклеиновых кислот хаТКР и последовательность нуклеиновой кислоты ХСР находятся под управлением одного промотора; причем первая и вторая полипептидные цепи хаТКР экспрессируются из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот хаТКР с образованием хаТКР, а полипептидная цепь ХСР экспрессируется из последовательности нуклеиновой кислоты ХСР с образованием ХСР, и причем хаТКР и ХСР локализованы на поверхности иммунной клетки. В некоторых вариантах реализации промотор функционально связан с одной из последовательностей нуклеиновых кислот, которая связана с другими последовательностями нуклеиновых кислот нуклеотидными линкерами, выбранными, по отдельности, из группы, состоящей из внутреннего сайта связывания рибосомы (IRES) и нуклеиновой кислоты, кодирующей саморасщепляемый пептид 2A (такой как P2A, T2A, E2A или F2A), так, что первая и вторая последовательности нуклеиновых кислот хаТКР и последовательность нуклеиновой кислоты ХСР транскрибируются в виде одной РНК под управлением промотора. В некоторых вариантах реализации промотор является индуцибельным. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка не экспрессирует субъединицы ТКР, из которых получены ТКР-ТМ хаТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей δ и γ ТКР, или же иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку, а ТКР-ТМ внесенных хаТКР содержат последовательности, полученные из цепей α и β ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунную клетку модифицируют для блокирования или снижения экспрессии одной или обеих субъединиц эндогенного ТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей α и/или β ТКР, или же иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей γ и/или δ ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической Т-клетки, хелперной Т-клетки, естественной киллерной T-клетки и супрессорной Т-клетки. В некоторых вариантах реализации вектор представляет собой вирусный вектор (такой как лентивирусный вектор), интегрированный в хозяйский геном иммунной клетки.

Конструкции химерное антитело/Т-клеточный рецептор (хаТКР)

[0084] В одном аспекте конструкция специфическое к целевому антигену химерное антитело/Т-клеточный рецептор (хаТКР), описанная в данном документе, специфически связывается с целевым антигеном (таким как антиген клеточной поверхности или комплекс пептид/ГКГС) и способна рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу (такую как CD3δε, CD3γε и/или ζζ). В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит встречающиеся в природе домены ТКР. В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит по меньшей мере один не встречающийся в природе домен ТКР. хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль, который обеспечивает антигенную специфичность, и модуль Т-клеточного рецептора (МТКР), который позволяет осуществлять рекрутирование и сигнализацию CD3. Антигенсвязывающий модуль не является встречающимся в природе антигенсвязывающим фрагментом Т-клеточного рецептора. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль связан с амино-концом полипептидной цепи в МТКР. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим). МТКР содержит трансмембранный модуль, полученный из трансмембранных доменов одного или более ТКР (ТКР-ТМ), таких как αβ и/или γδ ТКР, и необязательно, дополнительно содержит один или оба соединительных пептида ТКР или их фрагменты и/или один или более внутриклеточных доменов ТКР или их фрагментов. В некоторых вариантах реализации МТКР содержит две полипептидные цепи, причем каждая полипептидная цепь содержит, от амино-конца к карбокси-концу, соединительный пептид, трансмембранный домен и, необязательно, внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации МТКР содержит один или более не встречающихся в природе доменов ТКР. Например, в некоторых вариантах реализации МТКР содержит один или два не встречающихся в природе трансмембранных домена ТКР. Не встречающийся в природе домен ТКР может представлять собой соответствующий домен встречающегося в природе ТКР, модифицированный путем замены одной или более аминокислот и/или путем замещения части соответствующего домена частью аналогичного домена из другого ТКР. хаТКР может содержать первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, причем первая и вторая полипептидные цепи вместе образуют антигенсвязывающий модуль и МТКР. В некоторых вариантах реализации первая и вторая полипептидные цепи представляют собой отдельные полипептидные цепи, а хаТКР представляет собой мультимер, такой как димер. В некоторых вариантах реализации первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны, например, пептидной связью или другой химической связью, такой как дисульфидная связь. В некоторых вариантах реализации первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь связаны по меньшей мере одной дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит одну или более Т-клеточных костимулирующих сигнальных последовательностей. Одна или более костимулирующих сигнальных последовательностей могут представлять собой, по отдельности, весь или часть внутриклеточного домена костимулирующей молекулы, включая, например, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, лимфоцитарный функциональный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83, и т. п. В некоторых вариантах реализации одна или более костимулирующих сигнальных последовательностей находятся между первым ТКР-TM и первым внутриклеточным доменом ТКР и/или между вторым ТКР-TM и вторым внутриклеточным доменом ТКР. В некоторых вариантах реализации одна или более костимулирующих сигнальных последовательностей являются карбокси-концевыми относительно первого ДТКР и/или второго ДТКР. В некоторых вариантах реализации в хаТКР отсутствует Т-клеточная костимулирующая сигнальная последовательность. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации модуль стабилизации расположен между антигенсвязывающим модулем и МТКР. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит спейсерный модуль между любыми двумя модулями или доменами хаТКР. В некоторых вариантах реализации спейсерный модуль содержит один или более пептидных линкеров, соединяющих два модуля или домена хаТКР.

[0085] хaТКР, описанные в данном документе, могут иметь один или более признаков, описанных в этом разделе. Предполагается, что любые признаки для каждого компонента хаТКР (например, антигенсвязывающий модуль, ДТКР, ТКР-TM, спейсерный модуль, модуль стабилизации, T-клеточные костимулирующие последовательности и различные линкеры т. д.), описанные в данном документе, можно комбинировать друг с другом, с любым из признаков ХСР и с любым из признаков СВЭ, как если бы каждая комбинация была описана отдельно.

[0086] В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль (такой как фрагмент антитела) специфически связывается с целевым антигеном с a) аффинностью, которая по меньшей мере в около 10 (включая, например, по меньшей мере около 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 или более) раз больше, чем аффинность связывания в отношении других молекул; или b) K_д составляет не более чем около 1/10 (например, не более чем около 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000 или менее) K_д связывания с другими молекулами. Аффинность связывания можно определять способами, известными в данной области техники, такими как ELISA, анализ сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или анализ радиоиммунопреципитации (РИА). K_д можно определять способами, известными в данной области техники, такими как анализ методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) с применением, например, инструментов Biacore или анализ кинетического исключения (KinExA) с применением, например, инструментов Sapidyne.

[0087] Примеры доменов стабилизации включают Fc-область; шарнирную область; домен C_H3; домен C_H4; домен C_H1 или C_L; домен лейциновой молнии (например, домен лейциновой молнии jun/fos, смотрите, например, Kostelney et al, J. Immunol, 148: 1547-1553, 1992; или дрожжевой домен лейциновой молнии GCN4); домен изолейциновой молнии; димеризирующуюся область димеризирующегося рецептора клеточной поверхности (например, рецептора интерлейкина-8 (IL-8R); или гетеродимер интегрина, такой как LFA-1 или GPIIIb/IIIa); димеризирующуюся область секретируемого, димеризирующегося лиганда (например, фактора роста нервов (NGF), нейротрофина-3 (NT-3), интерлейкина-8 (IL-8), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) или нейротрофического фактора головного мозга (BDNF); смотрите, например, Arakawa et al, J. Biol. Chem. 269:27833-27839, 1994, и Radziejewski et al, Biochem. 32: 1350, 1993); домен димеризации суперспирали (смотрите, например, WO2014152878; Fletcher et al, ACS Synth. Biol. 1:240-250, 2012; и Thomas et al., J. Am. Chem. Soc. 135(13):5161-5166, 2013); и полипептид, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина (например, от около одного, двух или трех до около десяти остатков цистеина), так что становится возможным образование дисульфидной(ых) связи(ей) между полипептидом и вторым полипептидом, содержащим по меньшей мере один остаток цистеина.

[0088] В некоторых вариантах реализации описанный в данном документе МТКР содержит a) первый домен Т-клеточного рецептора (ДТКР), содержащий первый трансмембранный домен ТКР (ТКР-ТМ), и b) второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, причем МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ не встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации первый ТКР-ТМ получен из одного из трансмембранных доменов Т-клеточного рецептора (такого как αβ ТКР или γδ ТКР), а второй ТКР-ТМ получен из другого трансмембранного домена Т-клеточного рецептора. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора. Рекрутирование ТКР-ассоциированных сигнальных молекул можно определять способами, известными в данной области техники, такими как анализ FACS в отношении поверхностной экспрессии комплекса ТКР-CD3 или совместная иммунопреципитация субъединиц CD3 с хаТКР.

[0089] Например, в некоторых вариантах реализации первый ТКР-ТМ описанного в данном документе МТКР, содержит, состоит преимущественно из или состоит из α-цепи трансмембранного домена ТКР (например, GenBank, номер доступа: CCI73895) или ее варианта, а второй ТКР-ТМ МТКР, содержит, состоит преимущественно из или состоит из β-цепи трансмембранного домена ТКР (например, GenBank, номер доступа: CCI73893) или ее варианта. В некоторых вариантах реализации первый ТКР-ТМ содержит, состоит преимущественно из или состоит из δ-цепи трансмембранного домена ТКР (например, GenBank, номер доступа: AAQ57272) или ее варианта, а второй ТКР-ТМ содержит, состоит преимущественно из или состоит из γ-цепи трансмембранного домена ТКР (например, GenBank, номер доступа: AGE91788) или ее варианта. В некоторых вариантах реализации первый и второй ТКР-ТМ описанного в данном документе МТКР, содержат, состоят преимущественно из или состоят из константного домена α-цепи трансмембранного домена ТКР (например, SEQ ID NO: 1) или его варианта и константного домена β-цепи трансмембранного домена ТКР (например, SEQ ID NO: 2) или его варианта, соответственно. В некоторых вариантах реализации первый и второй ТКР-ТМ содержат, состоят преимущественно из или состоят из константного домена δ-цепи трансмембранного домена ТКР (например, SEQ ID NO: 3) или его варианта и константного домена γ-цепи трансмембранного домена ТКР (например, SEQ ID NO: 4) или его варианта, соответственно. В некоторых вариантах реализации первый и второй ТКР-ТМ содержат, состоят преимущественно из или состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 5 и 6 или их вариантов, соответственно. В некоторых вариантах реализации первый и второй ТКР-ТМ содержат, состоят преимущественно из или состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и 8 или их вариантов, соответственно. Варианты трансмембранных доменов включают, без ограничений, трансмембранные домены с одной или более аминокислотными заменами по сравнению с эталонной последовательностью. В некоторых вариантах реализации вариант трансмембранного домена содержит не более 5 аминокислотных замен по сравнению с эталонной последовательностью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид, амино-концевой по отношению к трансмембранному домену, и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид, амино-концевой по отношению к трансмембранному домену. В некоторых вариантах реализации первый соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, или его вариант, и/или второй соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ, или его вариант. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй соединительные пептиды содержат, состоят преимущественно из или состоят из всего или части соединительного пептида константного домена α-цепи ТКР (например, SEQ ID NO: 1) или его варианта и всего или части соединительного пептида константного домена β-цепи ТКР (например, SEQ ID NO: 2) или его варианта, соответственно. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй соединительные пептиды содержат, состоят преимущественно из или состоят из всего или части соединительного пептида с SEQ ID NO: 27 или 28 или его варианта и всего или части соединительного пептида с SEQ ID NO: 29 или 30 или его варианта, соответственно. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй соединительные пептиды содержат, состоят преимущественно из или состоят из всего или части соединительного пептида константного домена δ-цепи ТКР (например, SEQ ID NO: 3) или его варианта и всего или части соединительного пептида константного домена γ-цепи ТКР (например, SEQ ID NO: 4) или его варианта, соответственно. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй соединительные пептиды содержат, состоят преимущественно из или состоят из всего или части соединительного пептида с SEQ ID NO: 31 или 32 или его варианта и всего или части соединительного пептида с SEQ ID NO: 33 или 34 или его варианта, соответственно. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР, карбокси-концевой по отношению к первому ТКР-ТМ, и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР, карбокси-концевой по отношению к второму ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый внутриклеточный домен ТКР содержит весь или часть внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, или его вариант, и/или второй внутриклеточный домен ТКР содержит весь или часть внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ, или его вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй внутриклеточные домены ТКР содержат любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 35-36 или их варианты. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР представляет собой фрагмент одной цепи встречающегося в природе ТКР или его варианта и/или второй ДТКР представляет собой фрагмент другой цепи встречающегося в природе ТКР или его варианта. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ДТКР не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации первый и второй ДТКР связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй ДТКР связаны дисульфидной связью между остатком в первом соединительном пептиде и остатком во втором соединительном пептиде. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать каждый из CD3δε, CD3γε и ζζ с образованием комплекса хаТКР-CD3 (т. е. способствует образованию комплекса хаТКР-CD3).

[0090] Предусмотренные конструкции хаТКР включают, например, хаТКР, которые специфически связываются с антигенами клеточной поверхности, хаТКР, которые специфически связываются с представляемыми на клеточной поверхности комплексами пептид/ГКГС, и хаТКР, которые специфически связываются как с антигенами клеточной поверхности, так и с представляемыми на клеточной поверхности комплексами пептид/ГКГС.

[0091] В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечного Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела является моноспецифическим. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела является мультиспецифическим. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела является биспецифическим. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой тандемный scFv, диатело (Db), одноцепочечное диатело (scDb), переориентирующееся антитело с двойной аффинностью (DART), антитело с двойным вариабельным доменом (DVD), химически перекрестно-сшитое антитело, гетеромультимерное антитело или гетероконъюгированное антитело. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой тандемный scFv, содержащий два scFv, связанных пептидным линкером. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой два scFv, которые не связаны напрямую. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела является полностью человеческим, полусинтетическим с каркасными областями человеческого антитела или гуманизированным.

[0092] В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль содержит первый антигенсвязывающий домен, содержащий домен V_H антитела, и второй антигенсвязывающий домен, содержащий домен V_L антитела. В некоторых вариантах реализации CDR домена V_H антитела и домена V_L антитела получены из одного фрагмента антитела. В некоторых вариантах реализации некоторые CDR домена V_H антитела и домена V_L антитела получены из разных фрагментов антитела. В некоторых вариантах реализации домен V_H антитела и/или домен V_L антитела являются человеческими, гуманизированными, химерными, полусинтетическими или полностью синтетическими.

[0093] В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела, который является полусинтетическим и содержит полностью человеческие последовательности и одну или более синтетических областей. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой полусинтетический фрагмент антитела, содержащий полностью человеческую V_L и полусинтетическую V_H, содержащую полностью человеческие области FR1, HC-CDR1, FR2, HC-CDR2, FR3 и FR4 и синтетическую HC-CDR3. В некоторых вариантах реализации полусинтетическая V_H содержит полностью синтетическую HC-CDR3, имеющую последовательность длиной от около 5 до около 25 (например, около 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) аминокислот. В некоторых вариантах реализации полусинтетическая V_H или синтетическая HC-CDR3 получены из полусинтетической библиотеки (такой как полусинтетическая человеческая библиотека), содержащей полностью синтетические области HC-CDR3, имеющие последовательность длиной от около 5 до около 25 (например, около 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) аминокислот, причем каждая аминокислота в последовательности, независимо от других, случайным образом выбрана из стандартных человеческих аминокислот минут цистеин. В некоторых вариантах реализации синтетическая HC-CDR3 имеет длину от около 10 до около 19 (например, около 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19) аминокислот. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой полусинтетический фрагмент антитела, содержащий полусинтетическую V_L и полусинтетическую V_H. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой полностью синтетический фрагмент антитела, содержащий фиксированные пары каркасных областей человеческих V_H/V_L, но рандомизированные и синтетические последовательности для всех 6 CDR как тяжелой, так и легкой цепей.

[0094] В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела, содержащий конкретные последовательности CDR, полученные из одного или более фрагментов антитела (такого как моноклональное антитело), или определенные варианты таких последовательностей, содержащие одну или более аминокислотных замен. В некоторых вариантах реализации аминокислотные замены в вариантных последовательностях практически не снижают способность антигенсвязывающего модуля связывать целевой антиген. Также предусмотрены изменения, которые существенно улучшают аффинность связывания с целевым антигеном или влияют на некоторые другие свойства, такие как специфичность и/или перекрестная реактивность с родственными вариантами целевого антигена.

[0095] В некоторых вариантах реализации модуль стабилизации получен из фрагмента антитела. Например, в некоторых вариантах реализации модуль стабилизации содержит первый домен стабилизации, содержащий домен C_H1 антитела или его вариант, и второй домен стабилизации, содержащий домен C_L антитела или его вариант. В другом варианте реализации модуль стабилизации содержит первый домен стабилизации, содержащий домен C_H3 антитела или его вариант, и второй домен стабилизации, содержащий домен C_H3 антитела или его вариант. В некоторых вариантах реализации константные домены тяжелой цепи (например, C_H1 или C_H3), содержащиеся в модуле стабилизации, получены из тяжелой цепи IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA (например, IgA1 или IgA2), IgD, IgM или IgE, необязательно, человека. В некоторых вариантах реализации константный домен тяжелой цепи антитела (например, C_H1 или C_H3), содержащийся в модуле стабилизации, представляет собой вариант, содержащий одну или более модификаций (например, аминокислотных замен, вставок и/или делеций) по сравнению с последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации константные домены легкой цепи антитела (C_L), содержащиеся в модуле стабилизации, получены из легкой цепи каппа или лямбда, необязательно, человека. В некоторых вариантах реализации константный домен легкой цепи антитела (C_L), содержащийся в модуле стабилизации, представляет собой вариант, содержащий одну или более модификаций (например, аминокислотных замен, вставок и/или делеций) по сравнению с последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй домены стабилизации содержат одну или более модификаций, которые практически не меняют их аффинность связывания между собой. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй домены стабилизации содержат одну или более модификаций, которые повышают их аффинность связывания между собой и/или вносят не встречающуюся в природе дисульфидную связь. В некоторых вариантах реализации модуль стабилизации содержит модификацию типа выступ-во-впадину (смотрите, например, Carter P. J Immunol Methods. 248:7-15, 2001). Например, в некоторых вариантах реализации модуль стабилизации содержит области константного домена антитела (например, домены C_H3), содержащие модификацию типа выступ-во-впадину. В некоторых вариантах реализации модуль стабилизации содержит области константного домена антитела (например, домены C_H3), модифицированные путем электростатического направления для повышения их ассоциации (смотрите, например, WO2006106905 и Gunasekaran K, et al. J Biol Chem. 285:19637-46, 2010). В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью.

[0096] В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль, описанный в данном документе, связанный с МТКР, описанным в данном документе, необязательно, содержащий модуль стабилизации. Например, в некоторых вариантах реализации хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль, связанный с N-концом одного или обоих ДТКР. В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит модуль стабилизации между МТКР и антигенсвязывающим модулем. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит спейсерный модуль между любыми двумя модулями или доменами хаТКР. В некоторых вариантах реализации спейсерный модуль содержит один или более пептидных линкеров длиной от около 5 до около 70 (например, около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70, включая любые диапазоны между этими значениями) аминокислот. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит один или более вспомогательных внутриклеточных доменов. В некоторых вариантах реализации один или более вспомогательных внутриклеточных доменов являются карбокси-концевыми по отношению к первому и/или второму ДТКР. В некоторых вариантах реализации один или более вспомогательных внутриклеточных доменов находятся между первым ТКР-TM и первым внутриклеточным доменом ТКР и/или между вторым ТКР-TM и вторым внутриклеточным доменом ТКР. В некоторых вариантах реализации один или более вспомогательных внутриклеточных доменов содержат, по отдельности, костимулирующий домен ТКР. В некоторых вариантах реализации костимулирующий домен ТКР содержит весь или часть внутриклеточного домена иммунной костимулирующей молекулы (например, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, лимфоцитарный функциональный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83, и т. п.). В некоторых вариантах реализации костимулирующий домен ТКР содержит всю или часть аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 51-56 или их варианты.

[0097] В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль специфически связывается с антигеном клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации антиген клеточной поверхности выбран из группы, состоящей из белка, углевода и липида. В некоторых вариантах реализации антиген клеточной поверхности представляет собой связанный с заболеванием антиген, экспрессируемый в пораженной клетке. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль специфически связывается с комплексом, содержащим пептид и белок ГКГС. Комплексы пептид/ГКГС включают, например, представляемый на поверхности комплекс, содержащий пептид, полученный из связанного с заболеванием антигена, экспрессируемого в пораженной клетке, и белок ГКГС. В некоторых вариантах реализации полноразмерный связанный с заболеванием антиген обычно не экспрессируется на поверхности пораженной клетки (например, связанный с заболеванием антиген представляет собой внутриклеточный или секретируемый белок). В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой рак, а связанный с заболеванием антиген представляет собой опухолеассоциированный антиген, экспрессируемый в раковой клетке. В некоторых вариантах реализации опухолеассоциированный антиген представляет собой онкопротеин. В некоторых вариантах реализации онкопротеин является результатом мутации в прото-онкогене и онкопротеин содержит неоэпитоп, содержащий мутацию. Например, в некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль специфически связывается с опухолеассоциированным антигеном клеточной поверхности (например, онкопротеином, содержащим неоэпитоп). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль специфически связывается с комплексом, содержащим пептид, полученный из опухолеассоциированного антигена (например, онкопротеина, содержащего неоэпитоп), который обычно не экспрессируется на поверхности раковой клетки (например, внутриклеточный или секретируемый опухолеассоциированный антиген), и белок ГКГС. В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой вирусную инфекцию, а связанный с заболеванием антиген представляет собой вирус-ассоциированный антиген, экспрессируемый в инфицированной клетке. Например, в некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль специфически связывается с вирус-ассоциированным антигеном клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль специфически связывается с комплексом, содержащим пептид, полученный из вирус-ассоциированного антигена, который обычно не экспрессируется на поверхности инфицированной вирусом клетки (например, внутриклеточный или секретируемый вирус-ассоциированный антиген), и белок ГКГС. В некоторых вариантах реализации конструкция хаТКР связывает целевой антиген с K_д от около 0,1 пМ до около 500 нМ (например, около 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями).

[0098] В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, причем антиген клеточной поверхности представляет собой CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D или FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. Специфическое связывание с полным антигеном, например антигеном клеточной поверхности, иногда называется «не ограниченным ГКГС связыванием».

[0099] В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид и белок ГКГС, причем пептид получен из белка, выбранного из группы, состоящей из WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистона H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. Специфическое связывание с комплексом, содержащим пептид и белок ГКГС, иногда называется «ГКГС-рестриктированным связыванием».

[0100] В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид, полученный из связанного с заболеванием антигена (такого как опухолеассоциированный или кодируемый вирусом антиген), и белок ГКГС класса I, причем белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F или HLA-G. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A, HLA-B или HLA-C. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-B. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-C. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A01, HLA-A02, HLA-A03, HLA-A09, HLA-A10, HLA-A11, HLA-A19, HLA-A23, HLA-A24, HLA-A25, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A29, HLA-A30, HLA-A31, HLA-A32, HLA-A33, HLA-A34, HLA-A36, HLA-A43, HLA-A66, HLA-A68, HLA-A69, HLA-A74 или HLA-A80. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой любой из HLA-A*02:01-555, такой как HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03, HLA-A*02:04, HLA-A*02:05, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*02:08, HLA-A*02:09, HLA-A*02:10, HLA-A*02:11, HLA-A*02:12, HLA-A*02:13, HLA-A*02:14, HLA-A*02:15, HLA-A*02:16, HLA-A*02:17, HLA-A*02:18, HLA-A*02:19, HLA-A*02:20, HLA-A*02:21, HLA-A*02:22 или HLA-A*02:24. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A*02:01.

[0101] В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид, полученный из связанного с заболеванием антигена (такого как опухолеассоциированный или кодируемый вирусом антиген), и белок ГКГС класса II, причем белок ГКГС класса II представляет собой HLA-DP, HLA-DQ или HLA-DR. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса II представляет собой HLA-DP. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса II представляет собой HLA-DQ. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса II представляет собой HLA-DR.

[0102] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, содержит a) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, и b) МТКР, содержащий первый и второй ТКР-ТМ, полученные из трансмембранных доменов ТКР (таких как αβ ТКР или γδ ТКР), причем МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль связан с амино-концом одной или более полипептидных цепей в МТКР. Например, в некоторых вариантах реализации МТКР содержит две полипептидные цепи, а антигенсвязывающий модуль связан с амино-концом одной или обеих полипептидных цепей МТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации первый и второй ТКР-ТМ не встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации МТКР дополнительно содержит по меньшей мере один соединительный пептид или его фрагмент из ТКР, амино-концевой по отношению к ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации МТКР дополнительно содержит по меньшей мере один внутриклеточный домен ТКР, содержащий последовательность из внутриклеточного домена ТКР, карбокси-концевой по отношению к ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации МТКР содержит ДТКР, полученные из фрагментов цепей ТКР. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ДТКР не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40), карбокси-концевой по отношению к ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации в хаТКР отсутствует костимулирующая сигнальная последовательность. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит домен V_H антитела и домен V_L антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела является человеческим, гуманизированным, химерным, полусинтетическим или полностью синтетическим. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации модуль стабилизации содержит по меньшей мере одну дисульфидную связь, связывающую домены стабилизации. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации хаТКР представляет собой гетеромультимер, такой как гетеродимер. Например, в некоторых вариантах реализации хаТКР представляет собой гетеродимер, содержащий первую полипептидную цепь, содержащую первый ДТКР, и вторую полипептидную цепь, содержащую второй ДТКР, причем антигенсвязывающий модуль связан с первой и/или второй полипептидными цепями. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0103] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, который способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации ТКР представляет собой αβ ТКР, а первый и второй ТКР-ТМ получены из трансмембранных доменов субъединиц α и β ТКР. В некоторых вариантах реализации ТКР представляет собой γδ ТКР, а первый и второй ТКР-ТМ получены из трансмембранных доменов субъединиц γ и δ ТКР. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации первый соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, или его вариант, и/или второй соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ, или его вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации первый внутриклеточный домен ТКР содержит последовательность из внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, и/или второй внутриклеточный домен ТКР содержит последовательность из внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР представляет собой фрагмент субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, и/или второй ДТКР представляет собой фрагмент субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0104] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов встречающегося в природе αβ ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена встречающегося в природе αβ ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, который способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации первый соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, или его вариант, и/или второй соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ, или его вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации первый внутриклеточный домен ТКР содержит последовательность из внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, и/или второй внутриклеточный домен ТКР содержит последовательность из внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР представляет собой фрагмент субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, и/или второй ДТКР представляет собой фрагмент субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены встречающегося в природе αβ Т-клеточного рецептора. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0105] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов встречающегося в природе γδ ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена встречающегося в природе γδ ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, который способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации первый соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, или его вариант, и/или второй соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ, или его вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации первый внутриклеточный домен ТКР содержит последовательность из внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, и/или второй внутриклеточный домен ТКР содержит последовательность из внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР представляет собой фрагмент субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, и/или второй ДТКР представляет собой фрагмент субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены встречающегося в природе γδ Т-клеточного рецептора. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0106] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в другой аминокислотной последовательности, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность соединительного пептида, содержащегося в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность внутриклеточного домена, содержащегося в любой из SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности трансмембранных доменов, содержащиеся в SEQ ID NO: 1 и 2. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0107] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в другой аминокислотной последовательности, причем по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен, а первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит, независимо от других, одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из первого ТКР-ТМ и/или второго ТКР-ТМ содержит, независимо от другого, не более 5 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными последовательностями, из которых они получены. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот в первом ТКР-ТМ расположена так, что в пределах хаТКР она может взаимодействовать с по меньшей мере одной из замещенных аминокислот во втором ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность соединительного пептида, содержащегося в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность внутриклеточного домена, содержащегося в любой из SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности трансмембранных доменов, содержащиеся в SEQ ID NO: 1 и 2. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0108] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в другой аминокислотной последовательности, причем по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит химерную последовательность, содержащую часть последовательных аминокислот из трансмембранного домена, содержащегося в SEQ ID NO: 3 или 4, а первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит, независимо от других, химерную последовательность, содержащую часть последовательных аминокислот из трансмембранного домена, содержащегося в SEQ ID NO: 3 или 4. В некоторых вариантах реализации каждый из первого ТКР-ТМ и/или второго ТКР-ТМ содержит, независимо от другого, химерную последовательность, содержащую часть из не более чем около 10 (например, не более чем около 9, 8, 7, 6, 5 или менее) последовательных аминокислот из трансмембранного домена, содержащегося в SEQ ID NO: 3 или 4. В некоторых вариантах реализации химерная последовательность в первом или втором ТКР-ТМ получена из трансмембранного домена, содержащегося в SEQ ID NO: 3, а химерная последовательность в другом ТКР-ТМ получена из трансмембранного домена, содержащегося в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации химерная последовательность в первом ТКР-ТМ расположена так, что она может взаимодействовать с химерной последовательностью во втором ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность соединительного пептида, содержащегося в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность внутриклеточного домена, содержащегося в любой из SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности трансмембранных доменов, содержащиеся в SEQ ID NO: 1 и 2. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0109] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в другой аминокислотной последовательности, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность соединительного пептида, содержащегося в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность внутриклеточного домена, содержащегося в любой из SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности трансмембранных доменов, содержащиеся в SEQ ID NO: 3 и 4. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0110] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в другой аминокислотной последовательности, причем по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен, а первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит, независимо от других, одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из первого ТКР-ТМ и/или второго ТКР-ТМ содержит, независимо от другого, не более 5 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными последовательностями, из которых они получены. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот в первом ТКР-ТМ расположена так, что в пределах хаТКР она может взаимодействовать с по меньшей мере одной из замещенных аминокислот во втором ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность соединительного пептида, содержащегося в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность внутриклеточного домена, содержащегося в любой из SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности трансмембранных доменов, содержащиеся в SEQ ID NO: 3 и 4. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0111] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из трансмембранного домена, содержащегося в другой аминокислотной последовательности, причем по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит химерную последовательность, содержащую часть последовательных аминокислот из трансмембранного домена, содержащегося в SEQ ID NO: 1 или 2, а первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит, независимо от других, химерную последовательность, содержащую часть последовательных аминокислот из трансмембранного домена, содержащегося в SEQ ID NO: 1 или 2. В некоторых вариантах реализации каждый из первого ТКР-ТМ и/или второго ТКР-ТМ содержит, независимо от другого, химерную последовательность, содержащую часть из не более чем около 10 (например, не более чем около 9, 8, 7, 6, 5 или менее) последовательных аминокислот из трансмембранного домена, содержащегося в SEQ ID NO: 1 или 2. В некоторых вариантах реализации химерная последовательность в первом или втором ТКР-ТМ получена из трансмембранного домена, содержащегося в SEQ ID NO: 1, а химерная последовательность в другом ТКР-ТМ получена из трансмембранного домена, содержащегося в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации химерная последовательность в первом ТКР-ТМ расположена так, что она может взаимодействовать с химерной последовательностью во втором ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность соединительного пептида, содержащегося в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность внутриклеточного домена, содержащегося в любой из SEQ ID NO: 1-4, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности трансмембранных доменов, содержащиеся в SEQ ID NO: 3 и 4. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0112] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другой аминокислотной последовательности, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности SEQ ID NO: 5 и 6. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0113] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другой аминокислотной последовательности, причем по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен, а первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит, независимо от других, одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из первого ТКР-ТМ и/или второго ТКР-ТМ содержит, независимо от другого, не более 5 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными последовательностями, из которых они получены. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот в первом ТКР-ТМ расположена так, что в пределах хаТКР она может взаимодействовать с по меньшей мере одной из замещенных аминокислот во втором ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности SEQ ID NO: 5 и 6. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0114] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другой аминокислотной последовательности, причем по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит химерную последовательность, содержащую часть последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 7 или 8, а первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит, независимо от других, химерную последовательность, содержащую часть последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 7 или 8. В некоторых вариантах реализации каждый из первого ТКР-ТМ и/или второго ТКР-ТМ содержит, независимо от другого, химерную последовательность, содержащую часть из не более чем около 10 (например, не более чем около 9, 8, 7, 6, 5 или менее) последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 7 или 8. В некоторых вариантах реализации химерная последовательность в первом или втором ТКР-ТМ получена из SEQ ID NO: 7, а химерная последовательность в другом ТКР-ТМ получена из SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации химерная последовательность в первом ТКР-ТМ расположена так, что она может взаимодействовать с химерной последовательностью во втором ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности SEQ ID NO: 5 и 6. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0115] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другой аминокислотной последовательности, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0116] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другой аминокислотной последовательности, причем по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен, а первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит, независимо от других, одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из первого ТКР-ТМ и/или второго ТКР-ТМ содержит, независимо от другого, не более 5 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными последовательностями, из которых они получены. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот в первом ТКР-ТМ расположена так, что в пределах хаТКР она может взаимодействовать с по меньшей мере одной из замещенных аминокислот во втором ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0117] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другой аминокислотной последовательности, причем по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит химерную последовательность, содержащую часть последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 5 или 6, а первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит, независимо от других, химерную последовательность, содержащую часть последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 5 или 6. В некоторых вариантах реализации каждый из первого ТКР-ТМ и/или второго ТКР-ТМ содержит, независимо от другого, химерную последовательность, содержащую часть из не более чем около 10 (например, не более чем около 9, 8, 7, 6, 5 или менее) последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 5 или 6. В некоторых вариантах реализации химерная последовательность в первом или втором ТКР-ТМ получена из SEQ ID NO: 5, а химерная последовательность в другом ТКР-ТМ получена из SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах реализации химерная последовательность в первом ТКР-ТМ расположена так, что она может взаимодействовать с химерной последовательностью во втором ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации каждый из первого соединительного пептида и второго соединительного пептида содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-34, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации каждый из первого внутриклеточного домена ТКР и второго внутриклеточного домена ТКР содержит, независимо от другого, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36, или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим).

[0118] Разные аспекты более подробно обсуждаются в различных разделах ниже.

Варианты ТКР-ТМ

[0119] В некоторых вариантах реализации ТКР-ТМ хаТКР получены из Т-клеточного рецептора, причем по меньшей мере один из ТКР-ТМ не встречается в природе. Не встречающиеся в природе ТКР-ТМ, полученные из Т-клеточного рецептора, включают трансмембранный домен из Т-клеточного рецептора, который был модифицирован путем замены одной или более аминокислот. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот является проксимальной (либо в первичной последовательности, либо пространственно) к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3. Например, в некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот отделена от аминокислоты в МТКР, участвующей в связывании CD3, не более чем 3 (например, 0, 1, 2 или 3) аминокислотами. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот отделена от аминокислоты в МТКР, участвующей в связывании CD3, не более чем около 15 (например, не более чем около 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 или 1) аминокислотами. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3.

[0120] Например, в некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ, полученный из Т-клеточного рецептора, содержит, состоит преимущественно из или состоит из трансмембранного домена субъединицы α, β, γ или δ ТКР, модифицированной путем замены одного или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы ТКР модифицирован путем замены не более 5 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы ТКР модифицирован путем замены одного аминокислотного остатка. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3.

[0121] Таким образом, в некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ, полученный из Т-клеточного рецептора, описанного в данном документе, содержит, состоит преимущественно из или состоит из трансмембранного домена субъединицы α ТКР, содержащей аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 1 (например, SEQ ID NO: 5), модифицированную путем замены одного или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы α ТКР модифицирован путем замены не более 5 аминокислотных остатков в трансмембранном домене, содержащемся в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы α ТКР модифицирован путем замены одного аминокислотного остатка в трансмембранном домене, содержащемся в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3.

[0122] В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ, полученный из Т-клеточного рецептора, описанного в данном документе, содержит, состоит преимущественно из или состоит из трансмембранного домена субъединицы α ТКР, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, модифицированную путем замены одного или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы α ТКР модифицирован путем замены не более 5 аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы α ТКР модифицирован путем замены одного аминокислотного остатка в SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3.

[0123] В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ, полученный из Т-клеточного рецептора, описанного в данном документе, содержит, состоит преимущественно из или состоит из трансмембранного домена субъединицы β ТКР, содержащей аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 2 (например, SEQ ID NO: 6), модифицированную путем замены одного или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы β ТКР модифицирован путем замены не более 5 аминокислотных остатков в трансмембранном домене, содержащемся в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы β ТКР модифицирован путем замены одного аминокислотного остатка в трансмембранном домене, содержащемся в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3.

[0124] В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ, полученный из Т-клеточного рецептора, описанного в данном документе, содержит, состоит преимущественно из или состоит из трансмембранного домена субъединицы β ТКР, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, модифицированную путем замены одного или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы β ТКР модифицирован путем замены не более 5 аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы β ТКР модифицирован путем замены одного аминокислотного остатка в SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3.

[0125] В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ, полученный из Т-клеточного рецептора, описанного в данном документе, содержит, состоит преимущественно из или состоит из трансмембранного домена субъединицы δ ТКР, содержащей аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 3 (например, SEQ ID NO: 7), модифицированную путем замены одного или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы δ ТКР модифицирован путем замены не более 5 аминокислотных остатков в трансмембранном домене, содержащемся в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы δ ТКР модифицирован путем замены одного аминокислотного остатка в трансмембранном домене, содержащемся в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3.

[0126] В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 3 (например, SEQ ID NO: 7), модифицированную путем одной или более замен (таких как замены более гидрофобными остатками) в аминокислотах, соответствующих следующим аминокислотам в SEQ ID NO: 7: L4, M6, V12, N15, F245 и L25. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 3, модифицированную путем одной или более замен (таких как замены более гидрофобными остатками) в аминокислотах, соответствующих V12 и N15 в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 3, модифицированную путем одной или более замен, соответствующих следующим заменам в SEQ ID NO: 7: L4C, M6V, V12F, N15S, F245S и L25S. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 3, модифицированную путем замен, соответствующих заменам V12F и N15S в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 9-13.

[0127] В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ, полученный из Т-клеточного рецептора, описанного в данном документе, содержит, состоит преимущественно из или состоит из трансмембранного домена субъединицы δ ТКР, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, модифицированную путем замены одного или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы δ ТКР модифицирован путем замены не более 5 аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы δ ТКР модифицирован путем замены одного аминокислотного остатка в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3.

[0128] В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, модифицированную путем одной или более замен (таких как замены более гидрофобными остатками) в аминокислотах, соответствующих следующим аминокислотам в SEQ ID NO: 7: L4, M6, V12, N15, F245 и L25. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, модифицированную путем замен (таких как замены более гидрофобными остатками) в аминокислотах, соответствующих V12 и N15 в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, модифицированную путем одной или более замен, соответствующих следующим заменам в SEQ ID NO: 7: L4C, M6V, V12F, N15S, F245S и L25S. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, модифицированную путем замен, соответствующих заменам V12F и N15S в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 9-13.

[0129] В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ, полученный из Т-клеточного рецептора, описанного в данном документе, содержит, состоит преимущественно из или состоит из трансмембранного домена субъединицы γ ТКР, содержащей аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 4 (например, SEQ ID NO: 8), модифицированную путем замены одного или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы γ ТКР модифицирован путем замены не более 5 аминокислотных остатков в трансмембранном домене, содержащемся в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы γ ТКР модифицирован путем замены одного аминокислотного остатка в трансмембранном домене, содержащемся в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3.

[0130] В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 4 (например, SEQ ID NO: 8), модифицированную путем одной или более замен (таких как замены более гидрофобными остатками) в аминокислотах, соответствующих следующим аминокислотам в SEQ ID NO: 8: Y1, Y2, M3, L5, L8, V12, V13, F15, A16, I18, C19, C20 и C21. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 4, модифицированную путем замен (таких как замены более гидрофобными остатками) в аминокислотах, соответствующих Y2, M3, A16 и I18 в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 4, модифицированную путем замен (таких как замены более гидрофобными остатками) в аминокислотах, соответствующих L8, V12 и F15 в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 4, модифицированную путем одной или более замен, соответствующих следующим заменам в SEQ ID NO: 8: Y1Q, Y2L, Y2I, M3V, M3I, L5C, L8F, V12F, V13Y, F15S, A16V, A16I, I18V, I18L, C19M, C20M и C21G. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 4, модифицированную путем замен, соответствующих заменам Y2L, M3V, A16V и I18V в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 4, модифицированную путем замен, соответствующих заменам Y2I, M3I, A16I и I18L в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена, содержащуюся в SEQ ID NO: 4, модифицированную путем замен, соответствующих заменам L8F, V12F и F15S в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 14-26.

[0131] В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ, полученный из Т-клеточного рецептора, описанного в данном документе, содержит, состоит преимущественно из или состоит из трансмембранного домена субъединицы γ ТКР, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, модифицированную путем замены одного или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы γ ТКР модифицирован путем замены не более 5 аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен субъединицы γ ТКР модифицирован путем замены одного аминокислотного остатка в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот замещена остатком, более гидрофобным, чем соответствующий незамещенный остаток. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3. В некоторых вариантах реализации каждая из замещенных аминокислот является проксимальной к аминокислоте в МТКР, участвующей в связывании CD3.

[0132] В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, модифицированную путем одной или более замен (таких как замены более гидрофобными остатками) в аминокислотах, соответствующих следующим аминокислотам в SEQ ID NO: 8: Y1, Y2, M3, L5, L8, V12, V13, F15, A16, I18, C19, C20 и C21. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, модифицированную путем замен (таких как замены более гидрофобными остатками) в аминокислотах, соответствующих Y2, M3, A16 и I18 в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, модифицированную путем замен (таких как замены более гидрофобными остатками) в аминокислотах, соответствующих L8, V12 и F15 в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, модифицированную путем одной или более замен, соответствующих следующим заменам в SEQ ID NO: 8: Y1Q, Y2L, Y2I, M3V, M3I, L5C, L8F, V12F, V13Y, F15S, A16V, A16I, I18V, I18L, C19M, C20M и C21G. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, модифицированную путем замен, соответствующих заменам Y2L, M3V, A16V и I18V в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, модифицированную путем замен, соответствующих заменам Y2I, M3I, A16I и I18L в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, модифицированную путем замен, соответствующих заменам L8F, V12F и F15S в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации не встречающийся в природе ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 14-26.

[0133] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и 9-13, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 8 или 14-26, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации первый ТКР-ТМ и второй ТКР-ТМ выбраны в соответствии с любым из хаТКР, перечисленных в Таблице 2. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации первый соединительный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32 или ее вариант и/или второй соединительный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 или 34 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации второй внутриклеточный домен ТКР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv).

Таблица 2

ID хаТКР	Первый ТКР-ТМ (δ-субъединица)	Второй ТКР-ТМ (γ-субъединица)
TM0	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 7)	YYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLL (SEQ ID NO: 8)
TM1	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFSL (SEQ ID NO: 9)	YYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLL (SEQ ID NO: 8)
TM2	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 7)	YYMYLLLLLKSVYYFAIITCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 14)
TM3	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 7)	YYMYLLLLLKSVVYFAIITCGLLRRTAF (SEQ ID NO: 15)
TM4	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 7)	YLVYLLLLLKSVVYFVIVTCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 16)
TM5	VLGLRVLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 10)	YLVYLLLLLKSVVYFVIVTCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 16)
TM6	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 7)	YLMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 17)
TM7	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 7)	YYVYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 18)
TM8	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 7)	YYMYLLLLLKSVVYFVIITCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 19)
TM9	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 7)	YYMYLLLLLKSVVYFAIVTCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 20)
TM10	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 7)	YYIYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 21)
TM11	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 7)	YIIYLLLLLKSVVYFIILTCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 22)
TM12	VLGCRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 11)	YYMYCLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 23)
TM13	VLGLRMLFAKTFAVSFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 12)	YYMYLLLFLKSFVYSAIITCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 24)
TM14	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL (SEQ ID NO: 7)	YYMYLLLLLKSVVYFAIITMCLLRRTAF (SEQ ID NO: 25)
TM15	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFS (SEQ ID NO: 13)	QYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAF (SEQ ID NO: 26)

Антигенсвязывающие модули

[0134] В некоторых вариантах реализации в соответствии с любым из хаТКР, описанных в данном документе, антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv и одноцепочечного Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации, в которых фрагмент антитела представляет собой мультимер, содержащий первую цепь фрагмента антитела и вторую цепь фрагмента антитела, хаТКР содержит первый ДТКР, связанный с первой или второй цепью фрагмента антитела, и второй ДТКР, связанный с другой цепью фрагмента антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы.

[0135] В некоторых вариантах реализации в соответствии с любым из хаТКР, описанных в данном документе, антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела, содержащий домены C_H1 и C_L. В некоторых вариантах реализации домен C_H1 получен из тяжелой цепи IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), необязательно, человека. В некоторых вариантах реализации домен C_H1 представляет собой вариант, содержащий одну или более модификаций (например, аминокислотных замен, вставок и/или делеций) по сравнению с последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации домен C_H1 содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 37-47 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации домен C_H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации домен C_L получен из легкой цепи каппа или лямбда, необязательно, человека. В некоторых вариантах реализации домен C_L представляет собой вариант, содержащий одну или более модификаций (например, аминокислотных замен, вставок и/или делеций) по сравнению с последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации домен C_L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации домены C_H1 и/или C_L содержат одну или более модификаций, которые практически не меняют их аффинность связывания между собой. В некоторых вариантах реализации домены C_H1 и/или C_L содержат одну или более модификаций, которые повышают их аффинность связывания между собой и/или вносят не встречающуюся в природе дисульфидную связь.

[0136] В некоторых вариантах реализации в соответствии с любым из хаТКР, описанных в данном документе, содержащих фрагмент антитела, который специфически связывается с целевым антигеном, фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к целевому антигену. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD19 (смотрите, например, WO2017066136A2). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD19 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD20 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 60, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD22 (смотрите, например, USSN 62/650955, поданную 30 марта 2018 г., содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD22 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 101, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 102, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к GPC3 (смотрите, например, USSN 62/490586, поданную 26 апреля 2017 г., содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к GPC3 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к ROR1 (смотрите, например, WO2016/187220 и WO2016/187216). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к ROR2 (смотрите, например, WO2016/142768). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к BCMA (смотрите, например, WO2016/090327 и WO2016/090320). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к GPRC5D (смотрите, например, WO2016/090329 и WO2016/090312). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к FCRL5 (смотрите, например, WO2016/090337). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к WT-1 (смотрите, например, WO2012/135854, WO2015/070078 и WO2015/070061). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к AFP (смотрите, например, WO2016/161390). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к HPV16-E7 (смотрите, например, WO2016/182957). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к NY-ESO-1 (смотрите, например, WO2016/210365). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к PRAME (смотрите, например, WO2016/191246). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к EBV-LMP2A (смотрите, например, WO2016/201124). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к KRAS (смотрите, например, WO2016/154047). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к PSA (смотрите, например, WO2017/015634). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, содержащий одну цепь Fab, содержащую домен V_H и домен C_H1, и другую цепь Fab, содержащую домен V_L и домен C_L. В некоторых вариантах реализации домен C_H1 содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 37-47 и/или домен C_L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах реализации домен C_H1 содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, а домен C_L содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48.

Конструкции хаТКР

[0137] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, который способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) фрагмент антитела, который специфически связывается с целевым антигеном, причем фрагмент антитела связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv и одноцепочечного Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации модуль стабилизации расположен между МТКР и фрагментом антитела. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе.

[0138] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и 9-13, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 8 или 14-26, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) фрагмент антитела, который специфически связывается с целевым антигеном, причем фрагмент антитела связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации первый ТКР-ТМ и второй ТКР-ТМ выбраны в соответствии с любым из хаТКР, перечисленных в Таблице 2. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv и одноцепочечного Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации первый соединительный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32 или ее вариант и/или второй соединительный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 или 34 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации второй внутриклеточный домен ТКР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе.

[0139] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, причем первый и второй ТКР-ТМ содержат, состоят преимущественно из или состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и 8, 9 и 8, 7 и 14, 7 и 15, 7 и 16, 10 и 16, 7 и 17, 7 и 18, 7 и 19, 7 и 20, 7 и 21, 7 и 22, 11 и 23, 12 и 24, 7 и 25 или 13 и 26, соответственно, и причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) фрагмент антитела, который специфически связывается с целевым антигеном, причем фрагмент антитела связан с первым и/или вторым ДТКР. Например, в некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) фрагмент антитела, который специфически связывается с целевым антигеном, причем фрагмент антитела связан с первым и/или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv и одноцепочечного Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации первый соединительный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32 или ее вариант и/или второй соединительный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 или 34 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации второй внутриклеточный домен ТКР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль.

[0140] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первую полипептидную цепь, содержащую первый антигенсвязывающий домен, содержащий первую цепь Fab, связанную с первым ДТКР, содержащим первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов ТКР; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую второй антигенсвязывающий домен, содержащий вторую цепь Fab, связанную со вторым ДТКР, содержащим второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, и причем первая и вторая цепи Fab образуют Fab-подобный антигенсвязывающий модуль, который специфически связывает целевой антиген. В некоторых вариантах реализации a) первая цепь Fab содержит домены V_H и C_H1 антитела, а вторая цепь Fab содержит домены V_L и C_L антитела; или b) первая цепь Fab содержит домены V_L и C_L антитела, а вторая цепь Fab содержит домены V_H и C_H1 антитела. Например, в некоторых вариантах реализации хаТКР содержит a) первую полипептидную цепь, содержащую первую цепь Fab, содержащую домены V_H и C_H1 антитела, связанные с первым ДТКР, и b) вторую цепь Fab, содержащую домены V_L и C_L антитела, связанные со вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит a) первую цепь Fab, содержащую домены V_L и C_L антитела, связанные с первым ДТКР, и b) вторую цепь Fab, содержащую домены V_H и C_H1 антитела, связанные со вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации присутствует пептидный линкер между одним или обоими ДТКР и связанной с ними цепью Fab. В некоторых вариантах реализации присутствует дисульфидная связь между остатком в домене C_H1 и остатком в домене C_L. В некоторых вариантах реализации домены C_H1 и/или C_L содержат одну или более модификаций, которые повышают аффинность связывания цепей Fab между собой. В некоторых вариантах реализации домены C_H1 и C_L поменяны так, что одна из цепей Fab содержит домены V_H и C_L антитела, а другая цепь Fab содержит домены V_L и C_H1 антитела. В некоторых вариантах реализации Fab-подобный антигенсвязывающий модуль специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации Fab-подобный антигенсвязывающий модуль специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый или второй домен стабилизации расположен между первым ДТКР и связанной с ним цепью Fab, а другой домен стабилизации расположен между вторым ДТКР и связанной с ним цепью Fab. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе.

[0141] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первую полипептидную цепь, содержащую первый антигенсвязывающий домен, содержащий первую цепь Fab, связанную с первым ДТКР, содержащим первый ТКР-ТМ, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и 9-13; и b) вторую полипептидную цепь, содержащую второй антигенсвязывающий домен, содержащий вторую цепь Fab, связанную со вторым ДТКР, содержащим второй ТКР-ТМ, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 8 и 14-26, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, и причем первая и вторая цепи Fab образуют Fab-подобный антигенсвязывающий модуль, который специфически связывает целевой антиген. В некоторых вариантах реализации первый ТКР-ТМ и второй ТКР-ТМ выбраны в соответствии с любым из хаТКР, перечисленных в Таблице 2. В некоторых вариантах реализации a) первая цепь Fab содержит домены V_H и C_H1 антитела, а вторая цепь Fab содержит домены V_L и C_L антитела; или b) первая цепь Fab содержит домены V_L и C_L антитела, а вторая цепь Fab содержит домены V_H и C_H1 антитела. В некоторых вариантах реализации домен C_H1 содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 37-47 и/или домен C_L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах реализации домен C_H1 содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, а домен C_L содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах реализации Fab-подобный антигенсвязывающий модуль специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации Fab-подобный антигенсвязывающий модуль специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации первый соединительный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32 или ее вариант и/или второй соединительный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 или 34 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации второй внутриклеточный домен ТКР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе.

[0142] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первую полипептидную цепь, содержащую первый антигенсвязывающий домен, содержащий первую цепь Fab, связанную с первым ДТКР, содержащим первый ТКР-ТМ, и вторую полипептидную цепь, содержащую второй антигенсвязывающий домен, содержащий вторую цепь Fab, связанную со вторым ДТКР, содержащим второй ТКР-ТМ, причем первый и второй ТКР-ТМ содержат, состоят преимущественно из или состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и 8, 9 и 8, 7 и 14, 7 и 15, 7 и 16, 10 и 16, 7 и 17, 7 и 18, 7 и 19, 7 и 20, 7 и 21, 7 и 22, 11 и 23, 12 и 24, 7 и 25 или 13 и 26, соответственно, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, и причем первая и вторая цепи Fab образуют Fab-подобный антигенсвязывающий модуль, который специфически связывает целевой антиген. В некоторых вариантах реализации a) первая цепь Fab содержит домены V_H и C_H1 антитела, а вторая цепь Fab содержит домены V_L и C_L антитела; или b) первая цепь Fab содержит домены V_L и C_L антитела, а вторая цепь Fab содержит домены V_H и C_H1 антитела. В некоторых вариантах реализации домен C_H1 содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 37-47 и/или домен C_L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах реализации домен C_H1 содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, а домен C_L содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах реализации Fab-подобный антигенсвязывающий модуль специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации Fab-подобный антигенсвязывающий модуль специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации первый соединительный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32 или ее вариант и/или второй соединительный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 или 34 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации второй внутриклеточный домен ТКР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или ее вариант. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора, имеющие последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль.

[0143] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, который способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) Fab’, который специфически связывается с целевым антигеном, причем Fab’ содержит первую цепь Fab’, содержащую домены V_H, C_H1 и частично шарнирный домен антитела, и вторую цепь Fab’, содержащую домены V_L и C_L антитела, и причем первая цепь Fab’ связана с первым или вторым ДТКР, а вторая цепь Fab’ связана с другим ДТКР. В некоторых вариантах реализации присутствует пептидный линкер между одним или обоими ДТКР и связанной с ними цепью Fab’. В некоторых вариантах реализации присутствует дисульфидная связь между остатком в домене C_H1 и остатком в домене C_L. В некоторых вариантах реализации домены C_H1 и/или C_L содержат одну или более модификаций, которые повышают аффинность связывания цепей Fab’ между собой. В некоторых вариантах реализации домены C_H1 и C_L поменяны так, что одна из цепей Fab’ содержит домены V_H, C_L и частично шарнирный домен антитела, а другая цепь Fab’ содержит домены V_L и C_H1. В некоторых вариантах реализации Fab’ специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации Fab’ специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый или второй домен стабилизации расположен между первым ДТКР и связанной с ним цепью Fab’, а другой домен стабилизации расположен между вторым ДТКР и связанной с ним цепью Fab’. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе.

[0144] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, который способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) (Fab’)2, который специфически связывается с целевым антигеном, причем (Fab’)2 содержит первую и вторую цепи (Fab’)2, содержащие домены V_H, C_H1 и частично шарнирный домен антитела, и третью и четвертую цепи (Fab’)2, содержащие домены V_L и C_L антитела, и причем первая цепь (Fab’)2 связана с первым или вторым ДТКР, а вторая цепь (Fab’)2 связана с другим ДТКР. В некоторых вариантах реализации присутствует пептидный линкер между одним или обоими ДТКР и связанной с ними цепью (Fab’)2. В некоторых вариантах реализации присутствует дисульфидная связь между остатком в домене C_H1 и остатком в домене C_L. В некоторых вариантах реализации домены C_H1 и/или C_L содержат одну или более модификаций, которые повышают аффинность связывания цепей (Fab’)2 между собой. В некоторых вариантах реализации домены C_H1 и C_L поменяны так, что первая и вторая цепи (Fab’)2 содержат домены V_H, C_L и частично шарнирный домен антитела, а третья и четвертая цепи (Fab’)2 содержат домены V_L и C_H1. В некоторых вариантах реализации (Fab’)2 специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации (Fab’)2 специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый или второй домен стабилизации расположен между первым ДТКР и связанной с ним цепью (Fab’)2, а другой домен стабилизации расположен между вторым ДТКР и связанной с ним цепью (Fab’)2. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе.

[0145] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, который способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) Fv, который специфически связывается с целевым антигеном, причем Fv содержит первую цепь Fv, содержащую домен V_H антитела, и вторую цепь Fv, содержащую домен V_L антитела, и причем первая цепь Fv связана с первым или вторым ДТКР, а вторая цепь Fv связана с другим ДТКР. В некоторых вариантах реализации присутствует пептидный линкер между одним или обоими ДТКР и связанной с ними цепью Fv. В некоторых вариантах реализации Fv специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации Fv специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый или второй домен стабилизации расположен между первым ДТКР и связанной с ним цепью Fv, а другой домен стабилизации расположен между вторым ДТКР и связанной с ним цепью Fv. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе.

[0146] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, который способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) первый scFv, который специфически связывается с целевым антигеном, причем первый scFv содержит домены V_H и V_L антитела, и причем первый scFv связан с первым или вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит второй антигенсвязывающий модуль, связанный с первым scFv или с ДТКР, который не связан с первым scFv. В некоторых вариантах реализации второй антигенсвязывающий модуль специфически связывается с целевым антигеном. В некоторых вариантах реализации второй антигенсвязывающий модуль специфически связывается с антигеном, отличным от целевого антигена. В некоторых вариантах реализации второй антигенсвязывающий модуль представляет собой второй scFv. В некоторых вариантах реализации присутствует пептидный линкер между первым scFv и связанным с ним ДТКР и/или между вторым антигенсвязывающим модулем и связанным с ним scFv или ДТКР. В некоторых вариантах реализации scFv специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации scFv специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый или второй домен стабилизации расположен между первым scFv и связанным с ним ДТКР, а другой домен стабилизации связан со вторым ДТКР. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе.

[0147] В некоторых вариантах реализации хаТКР, описанный в данном документе, специфически связывает целевой антиген и содержит a) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, который способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) первый scFv, который специфически связывается с целевым антигеном, и второй scFv, причем первый и второй scFv содержат домены V_H и V_L антитела, и причем первый scFv связан с первым или вторым ДТКР, а второй scFv связан с другим ДТКР. В некоторых вариантах реализации второй ДТКР специфически связывается с целевым антигеном. В некоторых вариантах реализации второй scFv содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности первого scFv. В некоторых вариантах реализации второй scFv специфически связывается с антигеном, отличным от целевого антигена. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй scFv специфически связываются, по отдельности, с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй scFv специфически связываются, по отдельности, с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистон H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый или второй домен стабилизации расположен между первым scFv и связанным с ним ДТКР, а другой домен стабилизации расположен между вторым scFv и связанным с ним ДТКР. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе.

Мультиспецифические хаТКР

[0148] В некоторых вариантах реализации хаТКР представляет собой мультиспецифический хаТКР, который специфически связывается с двумя или более (например, 2, 3, 4 или более) разными целевыми антигенами или эпитопами. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический хаТКР специфически связывается с двумя или более (например, 2, 3, 4 или более) разными целевыми антигенами. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический хаТКР специфически связывается с двумя или более (например, 2, 3, 4 или более) разными эпитопами на одном целевом антигене. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический хаТКР содержит антигенсвязывающий модуль для каждого антигена или эпитопа. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический хаТКР содержит более двух антигенсвязывающих модулей для по меньшей мере одного антигена или эпитопа. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический хаТКР содержит мультиспецифический антигенсвязывающий модуль, содержащий два или более (например, 2, 3, 4 или более) антигенсвязывающих доменов, каждый из которых специфически связывается с антигеном или эпитопом. В некоторых вариантах реализации хаТКР является биспецифическим. В некоторых вариантах реализации хаТКР является триспецифическим.

[0149] Мультиспецифические молекулы представляют собой молекулы, обладающие специфичностью связывания по меньшей мере с двумя разными антигенами или эпитопами (например, биспецифические антитела обладают специфичностью связывания с двумя антигенами или эпитопами). Также предусмотрены мультиспецифические хаТКР с более чем двойной валентностью и/или специфичностью. Биспецифические антитела были описаны, например, смотрите Brinkmann U. and Kontermann R.E. (2017) MABS, 9(2), 182-212. Можно получать триспецифические антитела. Смотрите, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). Следует понимать, что специалист в данной области техники может выбрать соответствующие признаки отдельных мультиспецифических молекул, известных в данной области техники, для получения мультиспецифического хаТКР.

[0150] В некоторых вариантах реализации, хаТКР (также называемый в данном документе «мультиспецифическим хаТКР») содержит: a) мультиспецифический (например, биспецифический) антигенсвязывающий модуль, содержащий первый антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с первым целевым антигеном, и второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывается со вторым целевым антигеном; и b) МТКР, содержащий первый ДТКР (ДТКР1), содержащий первый ТКР-ТМ, и второй ДТКР (ДТКР2), содержащий второй ТКР-ТМ; причем МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации первый соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, или его вариант, и/или второй соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ, или его вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации первый внутриклеточный домен ТКР содержит последовательность из внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, и/или второй внутриклеточный домен ТКР содержит последовательность из внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР представляет собой фрагмент субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, и/или второй ДТКР представляет собой фрагмент субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат фрагмент антитела, такой как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены встречающегося в природе αβ Т-клеточного рецептора. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации как первый ТКР-ТМ, так и второй ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации первый ТКР-ТМ содержит до 5 аминокислотных замен (например, замену одной аминокислоты) по сравнению с трансмембранным доменом, из которого он получен, и/или второй ТКР-ТМ содержит до 5 аминокислотных замен (например, замену одной аминокислоты) по сравнению с трансмембранным доменом, из которого он получен. В некоторых вариантах реализации замещенная аминокислота в первом ТКР-ТМ является проксимальной к замещенной аминокислоте во втором ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации одна или более замещенных аминокислот являются проксимальными к аминокислоте в первом или втором ТКР-ТМ, участвующей в связывании CD3. В некоторых вариантах реализации одна или более (например, каждая) замещенных аминокислот являются более гидрофобными, чем соответствующая незамещенная аминокислота. В некоторых вариантах реализации первый ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 7 и 9-13, и при этом второй ТКР-ТМ содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 8 и 14-26.

[0151] Типовые структуры биспецифических хаТКР проиллюстрированы на Фиг. 13A-13E, где целевыми антигенами являются CD19 и CD22, но специалисту в данной области нетрудно понять, что можно получать биспецифические хаТКР, нацеленные на другие целевые антигены или эпитопы, используя те же структурные форматы.

[0152] Например, двойные вариабельные домены (DVD), полученные из DVD IgG (смотрите, DiGiammarino et al., mAbs 3(5): 487-494) можно использовать в качестве биспецифического антигенсвязывающего модуля в хаТКР (Фиг. 13A). Были разработаны и оптимизированы для DVD-Ig различные линкеры для слияния внешнего вариабельного домена и внутреннего вариабельного домена, которые можно применять для конструирования биспецифических хаТКР, имеющих модуль DVD. Однако подход стэкинга вариабельных доменов в модулях DVD может влиять на сворачивание и аффинность связывания с мишенью внутреннего вариабельного домена. Линкеры между двумя вариабельными доменами и порядок двух вариабельных доменов могут влиять на эффективность хаТКР.

[0153] В некоторых вариантах реализации, хаТКР содержит: a) мультиспецифический (например, биспецифический) антигенсвязывающий модуль, содержащий Fv, который специфически связывается с первым целевым антигеном, и Fab, который специфически связывается со вторым целевым антигеном; и b) МТКР, содержащий первый ДТКР (ДТКР1), содержащий первый ТКР-ТМ, и второй ДТКР (ДТКР2), содержащий второй ТКР-ТМ; причем МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы.

[0154] В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит: (i) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_H1-L1-V_H2-C_H1-ДТКР1; и вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_L1-L2-V_L2-C_L-ДТКР2; (ii) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_H1-L1-V_L2-C_L-ДТКР1; и вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_L1-L2-V_H2-C_H1-ДТКР2; (iii) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_L1-L1-V_H2-C_H1-ДТКР1; и вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_H1-L2-V_L2-C_L-ДТКР2; или (iv) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_L1-L1-V_L2-C_L-ДТКР1; и вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_H1-L2-V_H2-C_H1-ДТКР2, причем V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с первым целевым антигеном, а V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывается со вторым целевым антигеном, причем ДТКР1 и ДТКР2 образуют МТКР, который облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы, и причем L1 и L2 представляют собой пептидные линкеры. В некоторых вариантах реализации L1 и/или L2 имеют длину от около 5 до около 50 (например, около 5-10, около 10-15 или около 15-30) аминокислот. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют одинаковую длину. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют разную длину. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют разную аминокислотную последовательность. Типовой биспецифический хаТКР проиллюстрирован на Фиг. 13A.

[0155] Кроссоверные двойные вариабельные домены (CODV), полученные из CODV-IgG (смотрите, Steinmetz, et al.; mAbs (2016), 8(5): 867-878), можно использовать в качестве биспецифического антигенсвязывающего модуля в хаТКР (Фиг. 13B). CODV обеспечивает наличие относительно свободных антигенсвязывающих сайтов для каждого Fv. Были разработаны и оптимизированы для CODV-Ig различные линкеры для слияния вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, которые можно применять для конструирования биспецифических хаТКР, имеющих модуль CODV. Однако надлежащее сворачивание модуля CODV может представлять сложности, а длинные линкеры, используемые в модуле CODV, могут быть потенциальным источником иммуногенности и восприимчивыми к протеолитическому расщеплению.

[0156] В некоторых вариантах реализации, хаТКР содержит: a) мультиспецифический (например, биспецифический) антигенсвязывающий модуль, содержащий первый Fv, который специфически связывается с первым целевым антигеном, и второй Fv, который специфически связывается со вторым целевым антигеном; и b) МТКР, содержащий первый ДТКР (ДТКР1), содержащий первый ТКР-ТМ, и второй ДТКР (ДТКР2), содержащий второй ТКР-ТМ; причем МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит C_H1 и C_L.

[0157] В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит: (i) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_H1-L1-V_H2-C_H1-ДТКР1, и вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_L2-L2-V_L1-C_L-ДТКР2; или (ii) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_L1-L1-V_L2-C_L-ДТКР1, и вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_H2-L2-V_H1-C_H1-ДТКР2, причем V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с первым целевым антигеном, а V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывается со вторым целевым антигеном, причем ДТКР1 и ДТКР2 образуют МТКР, который облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы, и причем L1 и L2 представляют собой пептидные линкеры. В некоторых вариантах реализации L1 и/или L2 имеют длину от около 5 до около 50 (например, около 5-20, около 15-30 или около 30-50) аминокислот. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют одинаковую длину. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют разную длину. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют разную аминокислотную последовательность. Типовой биспецифический хаТКР проиллюстрирован на Фиг. 13B.

[0158] Биспецифические антигенсвязывающие модули, полученные из scFv-слитных белков, такие как описанные в Chen et al., mAbs 8(4): 761-774, можно использовать в биспецифическом хаТКР (Фиг. 13C). Экспрессия биспецифических антител со сходным форматом слияния продемонстрировала надлежащие сворачивание и стабильность в этом формате. Для этих биспецифических антител были разработаны и оптимизированы различные линкеры для слияния scFv с константными доменами, что можно применять при конструировании биспецифических хаТКР, имеющих сходный слитый домен scFv. Однако стерическое несоответствие между scFv может нарушать связывание scFv и их целевых антигенов.

[0159] В некоторых вариантах реализации, хаТКР содержит: a) мультиспецифический (например, биспецифический) антигенсвязывающий модуль, содержащий первый scFv, который специфически связывается с первым целевым антигеном, и второй scFv, который специфически связывается со вторым целевым антигеном; и b) МТКР, содержащий первый ДТКР (ДТКР1), содержащий первый ТКР-ТМ, и второй ДТКР (ДТКР2), содержащий второй ТКР-ТМ; причем МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит C_H1 и C_L.

[0160] В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит: (i) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: scFv1-L1-C_H1-ДТКР1, и вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: scFv2-L2-C_L-ДТКР2; или (ii) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: scFv2-L1-C_H1-ДТКР1, и вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: scFv1-L2-C_L-ДТКР2; причем scFv1 специфически связывается с первым целевым антигеном, а scFv2 специфически связывается со вторым целевым антигеном, причем ДТКР1 и ДТКР2 образуют МТКР, который облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы, и причем L1 и L2 представляют собой пептидные линкеры. В некоторых вариантах реализации L1 и/или L2 имеют длину от около 5 до около 50 (например, около 5-10, около 10-15 или около 15-30) аминокислот. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют одинаковую длину. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют разную длину. В некоторых вариантах реализации L1 и L2 имеют разную аминокислотную последовательность. Типовой биспецифический хаТКР проиллюстрирован на Фиг. 13C.

[0161] Биспецифические антигенсвязывающие модули, полученные из биспецифического антитела IgG-scFv или биспецифического антитела Fab-scFv-Fc, можно использовать в биспецифическом хаТКР. В одном формате (Фиг. 13D) scFv присоединен к V_H или V_L Fab, что обеспечивает большую гибкость scFv и, таким образом, больший доступ Fab к целевому антигену. Однако, модуль scFv-Fab может иметь проблемы со стабильностью. Во втором формате (Фиг. 13E) Fab слит с первым ДТКР, а scFv слит со вторым ДТКР.

[0162] В некоторых вариантах реализации, хаТКР содержит: a) мультиспецифический (например, биспецифический) антигенсвязывающий модуль, содержащий scFv, который специфически связывается с первым целевым антигеном, и Fab, который специфически связывается со вторым целевым антигеном; и b) МТКР, содержащий первый ДТКР (ДТКР1), содержащий первый ТКР-ТМ, и второй ДТКР (ДТКР2), содержащий второй ТКР-ТМ; причем МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы.

[0163] В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит: (i) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: scFv-L1-V_H-C_H1-ДТКР1, и вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_L-C_L-ДТКР2; или (ii) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_H-C_H1-ДТКР1, и вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: scFv-L2-V_L-C_L-ДТКР2; причем scFv специфически связывается с первым целевым антигеном, а V_H и V_L образуют второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывается со вторым целевым антигеном, причем ДТКР1 и ДТКР2 образуют МТКР, который облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы, и причем L1 и L2 представляют собой пептидные линкеры. В некоторых вариантах реализации L1 и/или L2 имеют длину от около 5 до около 50 (например, около 5-10, около 10-15 или около 15-30) аминокислот. Типовой биспецифический хаТКР проиллюстрирован на Фиг. 13D.

[0164] В некоторых вариантах реализации хаТКР содержит: (i) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_L-C_L-L1-ДТКР1, вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_H-C_H1, и третью полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: scFv-L2-ДТКР2; (ii) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_H-C_H1-L1-ДТКР1, вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_L-C_L, и третью полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: scFv-L2-ДТКР2; (iii) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: scFv-L1-ДТКР1, вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_H-C_H1, и третью полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_L-C_L-L2-ДТКР2; или (iv) первую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: scFv-L1-ДТКР1, вторую полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_L-C_L, и третью полипептидную цепь, содержащую от N-конца к C-концу: V_H-C_H1-L2-ДТКР2; причем scFv специфически связывается с первым целевым антигеном, а V_H и V_L образуют второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывается со вторым целевым антигеном, причем ДТКР1 и ДТКР2 образуют МТКР, который облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы, и причем L1 и L2 представляют собой пептидные линкеры. В некоторых вариантах реализации L1 и/или L2 имеют длину от около 5 до около 50 (например, около 5-10, около 10-15 или около 15-30) аминокислот. Типовой биспецифический хаТКР проиллюстрирован на Фиг. 13E. Длину пептидного линкера между scFv и ДТКР и длину пептидного линкера между Fab и ДТКР можно оптимизировать, так как они могут влиять на доступ scFv и Fab к их целевым антигенам.

[0165] Мультиспецифический антигенсвязывающий модуль мультиспецифического хаТКР может специфически связываться с любой подходящей комбинацией целевых антигенов или эпитопов. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический антигенсвязывающий модуль специфически связывается по меньшей мере с одним антигеном клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один антиген клеточной поверхности выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический антигенсвязывающий модуль специфически связывается по меньшей мере с одним комплексом пептид/ГКГС. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один комплекс пептид/ГКГС содержит пептид, полученный из белка, выбранного из группы, состоящей из WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, гистона H3.3 и PSA, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический антигенсвязывающий модуль специфически связывается с первым антигеном клеточной поверхности и вторым антигеном клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический антигенсвязывающий модуль специфически связывается с CD19 и CD22. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический антигенсвязывающий модуль специфически связывается с CD19 и CD20. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический антигенсвязывающий модуль специфически связывается с первым комплексом пептид/ГКГС и вторым комплексом пептид/ГКГС. В некоторых вариантах реализации мультиспецифический антигенсвязывающий модуль специфически связывается с антигеном клеточной поверхности и комплексом пептид/ГКГС.

Конструкции химерного костимулирующего рецептора (ХСР)

[0166] Лиганд-специфический химерный костимулирующий рецептор (ХСР), описанный в данном документе, специфически связывается с целевым лигандом (таким как антиген клеточной поверхности или комплекс пептид/ГКГС) и способен стимулировать иммунную клетку, на поверхности которой он функционально экспрессируется после связывания целевого лиганда. ХСР содержит лиганд-связывающий модуль, который обеспечивает лиганд-связывающую специфичность, трансмембранный модуль и костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки, который позволяет стимулировать иммунную клетку. В ХСР отсутствует функциональная первичная сигнальная последовательность иммунной клетки. В некоторых вариантах реализации в ХСР отсутствует любая первичная сигнальная последовательность иммунной клетки. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит одну полипептидную цепь, содержащую лиганд-связывающий модуль, трансмембранный модуль и костимулирующий сигнальный модуль. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, причем первая и вторая полипептидные цепи вместе образуют лиганд-связывающий модуль, трансмембранный модуль и костимулирующий сигнальный модуль. В некоторых вариантах реализации первая и вторая полипептидные цепи представляют собой отдельные полипептидные цепи, а ХСР представляет собой мультимер, такой как димер. В некоторых вариантах реализации первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны, например, пептидной связью или другой химической связью, такой как дисульфидная связь. В некоторых вариантах реализации первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь связаны по меньшей мере одной дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации экспрессия ХСР в иммунной клетке хаТКР плюс ХСР является индуцибельной. В некоторых вариантах реализации экспрессия ХСР в иммунной клетке хаТКР плюс ХСР является индуцибельной после сигнализации посредством хаТКР.

[0167] Примеры костимулирующих сигнальных доменов иммунных клеток для применения в ХСР по изобретению включают цитоплазматические последовательности корецепторов Т-клеточного рецептора (ТКР), которые могут действовать вместе с хаТКР для инициации передачи сигнала после задействования хаТКР, а также любое производное или вариант этих последовательностей и любую синтетическую последовательность, которая имеет такие же функциональные способности.

[0168] В некоторых обстоятельствах сигналов, генерируемых только посредством ТКР, недостаточно для полной активации Т-клетки, и также необходим вторичный или костимулирующий сигнал. Таким образом, в некоторых вариантах реализации активация Т-клеток опосредована двумя разными классами внутриклеточной сигнальной последовательности: теми, которые инициируют антиген-зависимую первичную активацию посредством ТКР (называемыми в данном документе «первичными сигнальными последовательностями T-клеток»), и теми, которые действуют антиген-независимым образом, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал (называемыми в данном документе «костимулирующими сигнальными последовательностями Т-клеток»).

[0169] Первичные сигнальные последовательности иммунных клеток, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, известные как иммунорецепторные тирозиновые ингибирующие мотивы или ITAM. Примеры клеток, ITAM-содержащих первичных сигнальных последовательностей иммунных клеток, включают полученные из TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. «Функциональная» первичная сигнальная последовательность иммунной клетки представляет собой последовательность, которая способна передавать сигнал активации иммунной клетки при функциональном сопряжении с соответствующим рецептором. «Нефункциональные» первичные сигнальные последовательности иммунных клеток, которые могут содержать фрагменты или варианты первичных сигнальных последовательностей иммунных клеток, не могут передавать сигнал активации иммунной клетки. В ХСР, описанных в данном документе, отсутствует функциональная первичная сигнальная последовательность иммунной клетки, такая как функциональная сигнальная последовательность, содержащая ITAM. В некоторых вариантах реализации в ХСР отсутствует любая первичная сигнальная последовательность иммунной клетки.

[0170] Костимулирующая сигнальная последовательность иммунной клетки может представлять собой часть внутриклеточного домена костимулирующей молекулы, включая, например, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD27, CD40, PD-1, ICOS, лимфоцитарный функциональный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83, и т. п.

[0171] В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой антиген клеточной поверхности. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой комплекс пептид/ГКГС. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд является таким же, как и целевой антиген хаТКР, экспрессируемый в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд отличается от целевого антигена хаТКР, экспрессируемого в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой молекулу, представляемую на поверхности клетки, представляющей целевой антиген. Например, в некоторых вариантах реализации целевой антиген хаТКР представляет собой связанный с раком антиген, представляемый на раковой клетке, а целевой лиганд представляет собой общераспространенную молекулу, экспрессируемую на поверхности раковой клетки, такую как интегрин. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с заболеванием лиганд. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с раком лиганд. В некоторых вариантах реализации связанный с раком лиганд представляет собой, например, CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D или FCRL5. В некоторых вариантах реализации связанный с раком лиганд представляет собой комплекс пептид/ГКГС, содержащий пептид, полученный из белка, включая WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A и PSA. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с вирусом лиганд. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой молекулу иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации молекула иммунной контрольной точки включает PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40 и GAL9. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой апоптотическую молекулу. В некоторых вариантах реализации апоптотическая молекула включает FasL, FasR, TNFR1 и TNFR2.

[0172] В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, включая, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела специфически связывается с комплексом пептид/ГКГС, причем пептид получен из белка, включая, без ограничений, WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A и PSA. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD19 (смотрите, например, WO2017066136A2). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD19 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD20 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 60, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD22 (смотрите, например, USSN 62/650955 поданную 30 марта 2018 г.). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD22 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 101, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 102, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к GPC3 (смотрите, например, USSN 62/490586 поданную 26 апреля 2017 г.). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к GPC3 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к ROR1 (смотрите, например, WO2016/187220 и WO2016/187216). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к ROR2 (смотрите, например, WO2016/142768). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к BCMA (смотрите, например, WO2016/090327 и WO2016/090320). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к GPRC5D (смотрите, например, WO2016/090329 и WO2016/090312). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к FCRL5 (смотрите, например, WO2016/090337). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к WT-1 (смотрите, например, WO2012/135854, WO2015/070078 и WO2015/070061). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к AFP (смотрите, например, WO2016/161390). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к HPV16-E7 (смотрите, например, WO2016/182957). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к NY-ESO-1 (смотрите, например, WO2016/210365). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к PRAME (смотрите, например, WO2016/191246). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к EBV-LMP2A (смотрите, например, WO2016/201124). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к KRAS (смотрите, например, WO2016/154047). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к PSA (смотрите, например, WO2017/015634).

[0173] В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий модуль представляет собой (или получен из) весь или часть внеклеточного домена рецептора для целевого лиганда. В некоторых вариантах реализации рецептор включает, например, FasR, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27 и TIM-3.

[0174] В некоторых вариантах реализации трансмембранный модуль содержит один или более трансмембранных доменов, полученных, например, из CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154.

[0175] В некоторых вариантах реализации костимулирующий модуль содержит, состоит преимущественно из или состоит из всего или части внутриклеточного домена костимулирующей молекулы иммунной клетки, включая, например, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, лимфоцитарный функциональный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83, и т. п. В некоторых вариантах реализации костимулирующая сигнальная молекула содержит фрагмент CD28, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах реализации костимулирующая сигнальная молекула содержит фрагмент CD28, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52. В некоторых вариантах реализации костимулирующая сигнальная молекула содержит фрагмент 4-1BB, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации костимулирующая сигнальная молекула содержит фрагмент 4-1BB, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах реализации костимулирующая сигнальная молекула содержит фрагмент CD8, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах реализации костимулирующая сигнальная молекула содержит фрагмент OX40, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах реализации костимулирующая сигнальная молекула содержит фрагмент OX40, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56. В некоторых вариантах реализации костимулирующая сигнальная молекула содержит фрагмент CD27, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 86 или 87. В некоторых вариантах реализации костимулирующая сигнальная молекула содержит фрагмент CD30, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88 или 89.

[0176] В некоторых вариантах реализации ХСР содержит спейсерный модуль между любыми из лиганд-связывающего модуля, трансмембранного модуля и костимулирующего сигнального модуля. В некоторых вариантах реализации спейсерный модуль содержит один или более пептидных линкеров, соединяющих два модуля ХСР. В некоторых вариантах реализации спейсерный модуль содержит один или более пептидных линкеров длиной от около 5 до около 70 (например, около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70, включая любые диапазоны между этими значениями) аминокислот.

[0177] В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий модуль (такой как фрагмент антитела) специфически связывается с целевым антигеном с a) аффинностью, которая по меньшей мере в около 10 (включая, например, по меньшей мере около 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 или более) раз больше, чем аффинность связывания в отношении других молекул; или b) K_д составляет не более чем около 1/10 (например, не более чем около 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000 или менее) K_д связывания с другими молекулами. Аффинность связывания можно определять способами, известными в данной области техники, такими как ELISA, анализ сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или анализ радиоиммунопреципитации (РИА). K_д можно определять способами, известными в данной области техники, такими как анализ методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) с применением, например, инструментов Biacore или анализ кинетического исключения (KinExA) с применением, например, инструментов Sapidyne.

[0178] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с целевым лигандом (таким как антиген клеточной поверхности или комплекс пептид/ГКГС) и содержит a) связывающий целевой лиганд домен (ЛСД); b) трансмембранный домен; и c) и костимулирующий сигнальный домен, причем ХСР способен стимулировать иммунную клетку, на поверхности которой он функционально экспрессируется после связывания целевого лиганда. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой антиген клеточной поверхности. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой комплекс пептид/ГКГС. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд является таким же, как и целевой антиген хаТКР, экспрессируемый в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд отличается от целевого антигена хаТКР, экспрессируемого в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с заболеванием лиганд. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с раком лиганд. В некоторых вариантах реализации связанный с раком лиганд представляет собой, например, CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D или FCRL5. В некоторых вариантах реализации связанный с раком лиганд представляет собой комплекс пептид/ГКГС, содержащий пептид, полученный из белка, включая WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A и PSA. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с вирусом лиганд. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой молекулу иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации молекула иммунной контрольной точки включает PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40 и GAL9. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой апоптотическую молекулу. В некоторых вариантах реализации апоптотическая молекула включает FasL, FasR, TNFR1 и TNFR2. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен представляет собой (или получен из) весь или часть внеклеточного домена рецептора для целевого лиганда. В некоторых вариантах реализации рецептор включает, например, FasR, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27 и TIM-3. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен содержит трансмембранный домен, полученный из трансмембранного белка, включая, например, CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент трансмембранного белка (фТМБ), причем фТМБ содержит трансмембранный домен ХСР. В некоторых вариантах реализации костимулирующий домен содержит, состоит преимущественно из или состоит из всего или части внутриклеточного домена костимулирующей молекулы иммунной клетки, включая, например, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, лимфоцитарный функциональный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83, и т. п. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент костимулирующей молекулы иммунной клетки (фКСМ), причем фКСМ содержит трансмембранный домен ХСР и костимулирующий сигнальный домен ХСР. В некоторых вариантах реализации ХСР дополнительно содержит спейсерный домен между любыми из лиганд-связывающего домена, трансмембранного домена и костимулирующего сигнального домена. В некоторых вариантах реализации спейсерный домен содержит пептидный линкер, соединяющий два домена ХСР.

[0179] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с целевым лигандом и содержит a) связывающий целевой лиганд домен; b) трансмембранный домен; и c) и костимулирующий сигнальный домен, причем целевой лиганд представляет собой антиген клеточной поверхности, и причем ХСР способен стимулировать иммунную клетку, на поверхности которой он функционально экспрессируется после связывания целевого лиганда. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд является таким же, как и целевой антиген хаТКР, экспрессируемый в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд отличается от целевого антигена хаТКР, экспрессируемого в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с заболеванием лиганд. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с раком лиганд. В некоторых вариантах реализации связанный с раком лиганд представляет собой, например, CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D или FCRL5. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с вирусом лиганд. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой молекулу иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации молекула иммунной контрольной точки включает PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40 и GAL9. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой апоптотическую молекулу. В некоторых вариантах реализации апоптотическая молекула включает FasL, FasR, TNFR1 и TNFR2. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен представляет собой (или получен из) весь или часть внеклеточного домена рецептора для целевого лиганда. В некоторых вариантах реализации рецептор включает, например, FasR, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27 и TIM-3. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен содержит трансмембранный домен, полученный из трансмембранного белка, включая, например, CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент трансмембранного белка (фТМБ), причем фТМБ содержит трансмембранный домен ХСР. В некоторых вариантах реализации костимулирующий домен содержит, состоит преимущественно из или состоит из всего или части внутриклеточного домена костимулирующей молекулы иммунной клетки, включая, например, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, лимфоцитарный функциональный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83, и т. п. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент костимулирующей молекулы иммунной клетки (фКСМ), причем фКСМ содержит трансмембранный домен ХСР и костимулирующий сигнальный домен ХСР. В некоторых вариантах реализации ХСР дополнительно содержит спейсерный домен между любыми из лиганд-связывающего домена, трансмембранного домена и костимулирующего сигнального домена. В некоторых вариантах реализации спейсерный домен содержит пептидный линкер, соединяющий два домена ХСР.

[0180] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с целевым лигандом и содержит a) связывающий целевой лиганд домен; b) трансмембранный домен; и c) и костимулирующий сигнальный домен, причем целевой лиганд представляет собой комплекс пептид/ГКГС, и причем ХСР способен стимулировать иммунную клетку, на поверхности которой он функционально экспрессируется после связывания целевого лиганда. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд является таким же, как и целевой антиген хаТКР, экспрессируемый в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд отличается от целевого антигена хаТКР, экспрессируемого в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с заболеванием лиганд. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с раком лиганд. В некоторых вариантах реализации связанный с раком лиганд представляет собой комплекс пептид/ГКГС, содержащий пептид, полученный из белка, включая WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A и PSA. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с вирусом лиганд. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен содержит трансмембранный домен, полученный из трансмембранного белка, включая, например, CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент трансмембранного белка (фТМБ), причем фТМБ содержит трансмембранный домен ХСР. В некоторых вариантах реализации костимулирующий домен содержит, состоит преимущественно из или состоит из всего или части внутриклеточного домена костимулирующей молекулы иммунной клетки, включая, например, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, лимфоцитарный функциональный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83, и т. п. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент костимулирующей молекулы иммунной клетки (фКСМ), причем фКСМ содержит трансмембранный домен ХСР и костимулирующий сигнальный домен ХСР. В некоторых вариантах реализации ХСР дополнительно содержит спейсерный домен между любыми из лиганд-связывающего домена, трансмембранного домена и костимулирующего сигнального домена. В некоторых вариантах реализации спейсерный домен содержит пептидный линкер, соединяющий два домена ХСР.

[0181] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с целевым лигандом (таким как антиген клеточной поверхности или комплекс пептид/ГКГС) и содержит a) связывающий целевой лиганд домен; b) трансмембранный домен; и c) и костимулирующий сигнальный домен, причем лиганд-связывающий домен представляет собой фрагмент антитела, и причем ХСР способен стимулировать иммунную клетку, на поверхности которой он функционально экспрессируется после связывания целевого лиганда. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой антиген клеточной поверхности. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой комплекс пептид/ГКГС. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд является таким же, как и целевой антиген хаТКР, экспрессируемый в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд отличается от целевого антигена хаТКР, экспрессируемого в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с заболеванием лиганд. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с раком лиганд. В некоторых вариантах реализации связанный с раком лиганд представляет собой, например, CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D или FCRL5. В некоторых вариантах реализации связанный с раком лиганд представляет собой комплекс пептид/ГКГС, содержащий пептид, полученный из белка, включая WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A и PSA. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с вирусом лиганд. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой молекулу иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации молекула иммунной контрольной точки включает PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40 и GAL9. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой апоптотическую молекулу. В некоторых вариантах реализации апоптотическая молекула включает FasL, FasR, TNFR1 и TNFR2. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен содержит трансмембранный домен, полученный из трансмембранного белка, включая, например, CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент трансмембранного белка (фТМБ), причем фТМБ содержит трансмембранный домен ХСР. В некоторых вариантах реализации костимулирующий домен содержит, состоит преимущественно из или состоит из всего или части внутриклеточного домена костимулирующей молекулы иммунной клетки, включая, например, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, лимфоцитарный функциональный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83, и т. п. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент костимулирующей молекулы иммунной клетки (фКСМ), причем фКСМ содержит трансмембранный домен ХСР и костимулирующий сигнальный домен ХСР. В некоторых вариантах реализации ХСР дополнительно содержит спейсерный домен между любыми из лиганд-связывающего домена, трансмембранного домена и костимулирующего сигнального домена. В некоторых вариантах реализации спейсерный домен содержит пептидный линкер, соединяющий два домена ХСР. В некоторых вариантах реализации домены ХСР выбраны в соответствии с любым из ХСР, перечисленных в Таблице 3.

Таблица 3

ID ХСР	Спейсер, следующий за ЛСД (SEQ ID NO)	фТМБ (SEQ ID NO)	фКСМ (SEQ ID NO)	Полный домен ХСР (без ЛСД; SEQ ID NO)
1	103	-	51	90
2	104	57	54	91
3	104	-	53	92
4	104	57	87	93
5	104	-	86	94
6	104	57	89	95
7	104	-	88	96
8	104	57	56	97
9	104	-	55	98

[0182] В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фКСМ CD28. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: a) связывающий целевой лиганд домен; b) трансмембранный домен CD8, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; и c) фрагмент CD28, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: a) связывающий целевой лиганд домен; и b) фрагмент CD28, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: связывающий целевой лиганд домен и домен ХСР, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90.

[0183] В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фКСМ 4-1BB. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: a) связывающий целевой лиганд домен; b) трансмембранный домен CD8, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; и c) фрагмент 4-1BB, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: a) связывающий целевой лиганд домен; и b) фрагмент 4-1BB, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: связывающий целевой лиганд домен и домен ХСР, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91 или 92.

[0184] В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фКСМ CD27. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: a) связывающий целевой лиганд домен; b) трансмембранный домен CD8, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; и c) фрагмент CD27, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: a) связывающий целевой лиганд домен; и b) фрагмент CD27, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 86. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: связывающий целевой лиганд домен и домен ХСР, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93 или 94.

[0185] В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фКСМ CD30. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: a) связывающий целевой лиганд домен; b) трансмембранный домен CD8, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; и c) фрагмент CD30, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: a) связывающий целевой лиганд домен; и b) фрагмент CD30, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: связывающий целевой лиганд домен и домен ХСР, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95 или 96.

[0186] В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фКСМ OX40. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: a) связывающий целевой лиганд домен; b) трансмембранный домен CD8, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; и c) фрагмент OX40, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: a) связывающий целевой лиганд домен; и b) фрагмент OX40, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит: связывающий целевой лиганд домен и домен ХСР, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97 или 98.

[0187] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с целевым лигандом (таким как антиген клеточной поверхности или комплекс пептид/ГКГС) и содержит a) связывающий целевой лиганд домен; b) трансмембранный домен; и c) и костимулирующий сигнальный домен, причем лиганд-связывающий домен представляет собой (или получен из) весь или часть внеклеточного домена рецептора для целевого лиганда, и причем ХСР способен стимулировать иммунную клетку, на поверхности которой он функционально экспрессируется после связывания целевого лиганда. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой антиген клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд является таким же, как и целевой антиген хаТКР, экспрессируемый в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд отличается от целевого антигена хаТКР, экспрессируемого в той же иммунной клетке. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с заболеванием лиганд. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с раком лиганд. В некоторых вариантах реализации связанный с раком лиганд представляет собой, например, CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D или FCRL5. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой молекулу иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации молекула иммунной контрольной точки включает PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40 и GAL9. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой апоптотическую молекулу. В некоторых вариантах реализации апоптотическая молекула включает FasL, FasR, TNFR1 и TNFR2. В некоторых вариантах реализации рецептор целевого лиганда включает, например, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27 и TIM-3. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен содержит трансмембранный домен, полученный из, например, CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154. В некоторых вариантах реализации костимулирующий домен содержит, состоит преимущественно из или состоит из всего или части внутриклеточного домена костимулирующей молекулы иммунной клетки, включая, например, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, лимфоцитарный функциональный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83, и т. п. В некоторых вариантах реализации ХСР дополнительно содержит спейсерный домен между любыми из лиганд-связывающего домена, трансмембранного домена и костимулирующего сигнального домена. В некоторых вариантах реализации спейсерный домен содержит пептидный линкер, соединяющий два домена ХСР.

[0188] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с CD19 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; и b) фрагмент CD28, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51 или 52. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах реализации фрагмент CD28 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 103, и фрагмент CD28. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 80.

[0189] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с CD20 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; и b) фрагмент CD28, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51 или 52. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах реализации фрагмент CD28 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 103, и фрагмент CD28. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 81.

[0190] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с GPC3 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; и b) фрагмент CD28, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51 или 52. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 79. В некоторых вариантах реализации фрагмент CD28 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 103, и фрагмент CD28. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 82.

[0191] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с CD20 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; и b) фрагмент CD28, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51 или 52. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах реализации фрагмент CD28 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 103, и фрагмент CD28. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 81.

[0192] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с CD19 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; и b) фрагмент 4-1BB, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53 или 54. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации фрагмент 4-1BB содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 104, и фрагмент 4-1BB.

[0193] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с CD19 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; b) фрагмент CD8, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57; и с) фрагмент 4-1BB, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 104, фрагмент CD8 и фрагмент 4-1BB.

[0194] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с CD19 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; b) фрагмент CD8, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57; и c) фрагмент OX40, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 104, фрагмент CD8 и фрагмент OX40.

[0195] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с CD19 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; и b) фрагмент OX40, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56 или 57. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации фрагмент OX40 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 104, и фрагмент OX40.

[0196] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с CD19 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; b) фрагмент CD8, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57; и c) фрагмент CD27, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 87. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 104, фрагмент CD8 и фрагмент CD27.

[0197] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с CD19 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; и b) фрагмент CD27, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 86 или 87. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации фрагмент CD27 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 86. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 104, и фрагмент CD27.

[0198] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с CD19 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; b) фрагмент CD8, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57; и c) фрагмент CD30, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 89. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 104, фрагмент CD8 и фрагмент CD30.

[0199] В некоторых вариантах реализации ХСР, описанный в данном документе, специфически связывается с CD19 и содержит a) scFv, содержащий домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; и b) фрагмент CD30, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 88 или 89. В некоторых вариантах реализации scFv содержит, от амино-конца к карбокси-концу, домен V_L, пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и домен V_H. В некоторых вариантах реализации фрагмент CD30 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит, от амино-конца к карбокси-концу, scFv, пептидный линкер, содержащий SEQ ID NO: 104, и фрагмент CD30.

[0200] В некоторых вариантах реализации экспрессия ХСР в иммунной клетке хаТКР плюс ХСР является индуцибельной. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка хаТКР плюс ХСР содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ХСР, функционально связанную с индуцибельным промотором, включая любой из индуцибельных промоторов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации экспрессия ХСР в иммунной клетке хаТКР плюс ХСР является индуцибельной после сигнализации посредством хаТКР. В некоторых таких вариантах реализации иммунная клетка хаТКР плюс ХСР содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ХСР, функционально связанную с промотором или регуляторным элементом, ответственным за сигнализацию посредством хаТКР. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ХСР, функционально связана с промотором ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). В некоторых вариантах реализации промотор NFAT, представляет собой минимальный промотор NFAT (смотрите, например, Durand, D. et. al., Molec. Cell. Biol. 8, 1715-1724 (1988); Clipstone, NA, Crabtree, GR. Nature. 1992 357(6380): 695-7; Chmielewski, M., et al. Cancer research 71.17 (2011): 5697-5706; и Zhang, L., et al. Molecular therapy 19.4 (2011): 751-759). В некоторых вариантах реализации промотор NFAT содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ХСР, функционально связана с промотором IL-2.

Секреторные вторичные эффекторные (СВЭ) конструкции

[0201] В некоторых вариантах реализации иммунная клетка хаТКР плюс ХСР (такая как Т-клетка) способна секретировать секреторный вторичный эффектор (СВЭ). Такая иммунная клетка также называется в данном документе «иммунной клеткой хаТКР плюс ХСР и СВЭ». СВЭ усиливает иммунный ответ, опосредованный иммунной клеткой хаТКР плюс ХСР и СВЭ, в которой он функционально экспрессируется и из которой секретируется. В некоторых вариантах реализации СВЭ способен перенаправлять другие иммунные клетки (такие как не вовлеченные в процесс Т-клетки или NK-клетки) на целевые клетки заболевания (такие как целевые раковые клетки). В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой мультиспецифическое антитело (такое как биспецифическое антитело), нацеленное на иммунную клетку (такую как Т-клетка или NK-клетка) и клетку заболевания (такую как раковая клетка). В некоторых вариантах реализации СВЭ защищает иммунную клетку хаТКР плюс ХСР и СВЭ от иммуносупрессивного окружения, такого как иммуносупрессивное опухолевое окружение. В некоторых вариантах реализации СВЭ обеспечивает аутокринную активацию стимулирующих рецепторов на иммунной клетке хаТКР плюс ХСР и СВЭ. В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой экзогенный фактор роста или стимулирующий цитокин. В некоторых вариантах реализации экспрессия СВЭ в иммунной клетке хаТКР плюс ХСР и СВЭ является индуцибельной. В некоторых вариантах реализации экспрессия СВЭ в иммунной клетке хаТКР плюс ХСР и СВЭ является индуцибельной после сигнализации посредством хаТКР.

[0202] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой мультиспецифическое антитело (такое как биспецифическое антитело), нацеленное на Т-клетку и клетку заболевания. В некоторых вариантах реализации СВЭ содержит фрагмент антитела, который специфически связывается с поверхностным антигеном Т-клетки. В некоторых вариантах реализации антиген Т-клеточной поверхности представляет собой CD3. В некоторых вариантах реализации СВЭ содержит фрагмент антитела, который специфически связывается со связанным с заболеванием антигеном (таким как связанный с раком антиген). В некоторых вариантах реализации связанный с заболеванием антиген представляет собой поверхностный антиген клетки заболевания (такой как раковая клетка). В некоторых вариантах реализации связанный с заболеванием антиген представляет собой глипикан-3 (GPC3), CD47, муцин-16 (MUC16), CD19, CD20, CD22, EpCAM, EGFR, HER2, CEA, PSMA, AFP, PSA, BCMA, FCRL5, NY-ESO, HPV16 или FoxP3, включая их варианты и мутантные формы. В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой мультиспецифическое антитело, выбранное из группы, состоящей из тандемного scFv, диатела (Db), одноцепочечного диатела (scDb), переориентирующегося антитела с двойной аффинностью (DART) и антитела с двойным вариабельным доменом (DVD). В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой биспецифическое антитело. В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, нацеленный на антиген Т-клеточной поверхности, и второй scFv, нацеленный на связанный с заболеванием антиген.

[0203] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, нацеленный на CD3, и второй scFv, нацеленный на связанный с заболеванием антиген. В некоторых вариантах реализации связанный с заболеванием антиген представляет собой GPC3, CD47, MUC16, CD19, CD20, CD22, EpCAM, EGFR, HER2, CEA, PSMA, AFP, PSA, BCMA, FCRL5, NY-ESO, HPV16 или FoxP3, включая их варианты и мутантные формы.

[0204] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, нацеленный на CD3, и второй scFv, нацеленный на GPC3. В некоторых вариантах реализации второй scFv содержит домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64, и домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах реализации домен V_H является амино-концевым к домену V_L. В некоторых вариантах реализации домен V_L является амино-концевым к домену V_H. В некоторых вариантах реализации второй scFv содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 79. В некоторых вариантах реализации первый scFv является амино-концевым к второму scFv. В некоторых вариантах реализации второй scFv является амино-концевым к первому scFv. В некоторых вариантах реализации СВЭ содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 105.

[0205] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, нацеленный на CD3, и второй scFv, нацеленный на CD47. В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, нацеленный на CD3, и второй scFv, нацеленный на MUC16.

[0206] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой мультиспецифическое антитело (такое как биспецифическое антитело), нацеленное на NK-клетку и связанный с заболеванием антиген (такой как связанный с раком антиген). В некоторых вариантах реализации СВЭ содержит фрагмент антитела, который специфически связывается с поверхностным антигеном NK-клетки. В некоторых вариантах реализации антиген NK-клеточной поверхности представляет собой CD16a. В некоторых вариантах реализации СВЭ содержит фрагмент антитела, который специфически связывается со связанным с заболеванием антигеном (таким как связанный с раком антиген). В некоторых вариантах реализации связанный с заболеванием антиген представляет собой поверхностный антиген клетки заболевания (такой как раковая клетка). В некоторых вариантах реализации связанный с заболеванием антиген представляет собой GPC3, CD47, MUC16, CD19, CD20, CD22, EpCAM, EGFR, HER2, CEA, PSMA, AFP, PSA, BCMA, FCRL5, NY-ESO, HPV16 или FoxP3, включая их варианты и мутантные формы. В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой мультиспецифическое антитело, выбранное из группы, состоящей из тандемного scFv, диатела (Db), одноцепочечного диатела (scDb), переориентирующегося антитела с двойной аффинностью (DART) и антитела с двойным вариабельным доменом (DVD). В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой биспецифическое антитело. В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, нацеленный на антиген NK-клеточной поверхности, и второй scFv, нацеленный на связанный с заболеванием антиген.

[0207] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, нацеленный на CD16a, и второй scFv, нацеленный на связанный с заболеванием антиген. В некоторых вариантах реализации связанный с заболеванием антиген представляет собой GPC3, CD47, MUC16, CD19, CD20, CD22, EpCAM, EGFR, HER2, CEA, PSMA, AFP, PSA, BCMA, FCRL5, NY-ESO, HPV16 или FoxP3, включая их варианты и мутантные формы.

[0208] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, нацеленный на CD16a, и второй scFv, нацеленный на GPC3. В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, нацеленный на CD16a, и второй scFv, нацеленный на CD47. В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, нацеленный на CD16a, и второй scFv, нацеленный на MUC16.

[0209] В некоторых вариантах реализации СВЭ, описанный в данном документе, содержит фрагмент антитела, который специфически связывается со связанным с заболеванием антигеном, причем фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к связанному с заболеванием антигену. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD19 (смотрите, например, WO2017066136A2). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD19 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD20 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 60, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены VH и/или VL) фрагмента антитела, специфического к CD22 (смотрите, например, USSN 62/650955, поданную 30 марта 2018 г., содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к CD22 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 101, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 102, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены VH и/или VL) фрагмента антитела, специфического к GPC3 (смотрите, например, USSN 62/490586, поданную 26 апреля 2017 г., содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к GPC3 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к ROR1 (смотрите, например, WO2016/187220 и WO2016/187216). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к ROR2 (смотрите, например, WO2016/142768). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к BCMA (смотрите, например, WO2016/090327 и WO2016/090320). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к GPRC5D (смотрите, например, WO2016/090329 и WO2016/090312). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к FCRL5 (смотрите, например, WO2016/090337). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к WT-1 (смотрите, например, WO2012/135854, WO2015/070078 и WO2015/070061). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к AFP (смотрите, например, WO2016/161390). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к HPV16-E7 (смотрите, например, WO2016/182957). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к NY-ESO-1 (смотрите, например, WO2016/210365). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к PRAME (смотрите, например, WO2016/191246). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к EBV-LMP2A (смотрите, например, WO2016/201124). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к KRAS (смотрите, например, WO2016/154047). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) фрагмента антитела, специфического к PSA (смотрите, например, WO2017/015634). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой scFv. В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий a) первый scFv, который специфически связывается с поверхностным антигеном Т-клетки (таким как CD3) или NK-клетки (таким как CD16a), и b) фрагмент антитела, причем фрагмент антитела представляет собой второй scFv. В некоторых вариантах реализации СВЭ содержит первый и второй scFv, соединенные пептидным линкером. В некоторых вариантах реализации первый scFv является амино-концевым к второму scFv. В некоторых вариантах реализации второй scFv является амино-концевым к первому scFv.

[0210] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой мультиспецифическое антитело (такое как биспецифическое антитело), нацеленное на один или более растворимых иммуносупрессивных агентов. Такой СВЭ может действовать как ловушка для изоляции растворимых иммуносупрессивных агентов от их мишеней, тем самым снижая их иммуносупрессивные эффекты. В некоторых вариантах реализации СВЭ содержит один или более фрагментов антитела, которые специфически связываются с одним или более растворимыми иммуносупрессивными агентами. В некоторых вариантах реализации иммуносупрессивные агенты представляют собой иммуносупрессивные цитокины. В некоторых вариантах реализации иммуносупрессивные цитокины включают представителей семейства TGF-β (таких как TGF-β 1-4), IL-4 и IL-10, включая их варианты или мутантные формы. В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой мультиспецифическое антитело, выбранное из группы, состоящей из тандемного scFv, диатела (Db), одноцепочечного диатела (scDb), переориентирующегося антитела с двойной аффинностью (DART) и антитела с двойным вариабельным доменом (DVD). В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой биспецифическое антитело. Например, в некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, нацеленный на первый иммуносупрессивный цитокин (такой как TGF-β), и второй scFv, нацеленный на второй иммуносупрессивный цитокин (такой как IL-4).

[0211] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой фрагмент антитела, нацеленный на молекулу иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации СВЭ является антагонистом ингибирующей молекулы иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации ингибирующая молекула иммунной контрольной точки выбрана из группы, состоящей из PD-1, PD-L1, CTLA-4, HVEM, BTLA, KIR, LAG-3, TIM-3 и A2aR. В некоторых вариантах реализации СВЭ является агонистом стимулирующей молекулы иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации стимулирующая молекула иммунной контрольной точки выбрана из группы, состоящей из CD28, ICOS, 4-1BB, OX40, CD27 и CD40. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой полноразмерное антитело, Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой scFv.

[0212] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой антагонистический фрагмент антитела, нацеленный на PD-1. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) антагонистического фрагмента антитела, специфического к PD-1 (смотрите, например, WO2016/210129). В некоторых вариантах реализации антагонистический фрагмент антитела представляет собой полноразмерное антитело, Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антагонистический фрагмент антитела представляет собой scFv.

[0213] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой антагонистический фрагмент антитела, нацеленный на CD47. В некоторых вариантах реализации антагонистический фрагмент антитела содержит CDR или вариабельные домены (домены V_H и/или V_L) антагонистического фрагмента антитела, специфического к CD47 (например, домен V_H, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 66, и/или домен V_L, содержащий, состоящий преимущественно из или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67, или CDR, содержащихся в них). В некоторых вариантах реализации антагонистический фрагмент антитела представляет собой полноразмерное антитело, Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антагонистический фрагмент антитела представляет собой scFv.

[0214] В некоторых вариантах реализации СВЭ содержит фрагмент антитела, который связывается с целевым антигеном с a) аффинностью, которая по меньшей мере в около 10 (включая, например, по меньшей мере около 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 или более) раз больше, чем аффинность связывания в отношении других молекул; или b) K_д составляет не более чем около 1/10 (например, не более чем около 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000 или менее) K_д связывания с другими молекулами. Аффинность связывания можно определять способами, известными в данной области техники, такими как ELISA, анализ сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или анализ радиоиммунопреципитации (РИА). K_д можно определять способами, известными в данной области техники, такими как анализ методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) с применением, например, инструментов Biacore или анализ кинетического исключения (KinExA) с применением, например, инструментов Sapidyne.

[0215] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой растворимую молекулу, которая специфически связывает лиганд иммуносупрессивного рецептора. В некоторых вариантах реализации СВЭ содержит лиганд-связывающий домен, полученный из внеклеточного домена иммуносупрессивного рецептора. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен представляет собой часть внеклеточного домена рецептора. В некоторых вариантах реализации иммуносупрессивный рецептор выбран из группы, состоящей из FasR, TNFR1, TNFR2, SIRPα, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27, CD40 и TIM-3.

[0216] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой растворимую молекулу, которая специфически связывает и антагонизирует иммуносупрессивный рецептор. В некоторых вариантах реализации СВЭ содержит рецептор-связывающий домен, полученный из внеклеточного домена лиганда для иммуносупрессивного рецептора. В некоторых вариантах реализации рецептор-связывающий домен представляет собой часть внеклеточного домена лиганда. В некоторых вариантах реализации лиганд выбран из группы, состоящей из FasL, PD-L1, PD-L2, CD47, CD80, CD86, ICOSL, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40L и GAL9.

[0217] В некоторых вариантах реализации СВЭ представляет собой экзогенный стимулирующий цитокин. Экзогенный цитокин, описанный в данном документе, представляет собой цитокин, экспрессируемый из экзогенного гена. В некоторых вариантах реализации экзогенный стимулирующий цитокин является представителем семейства IL-12. В некоторых вариантах реализации представитель семейства IL-12 представляет собой IL-12, IL-23, IL-27 или IL-35. В некоторых вариантах реализации экзогенный стимулирующий цитокин представляет собой IL-2, IL-15, IL-18 или IL-21. В некоторых вариантах реализации экзогенный стимулирующий цитокин способен обеспечивать аутокринную активацию рецепторов для цитокина на иммунной клетке хаТКР плюс ХСР и СВЭ.

[0218] В некоторых вариантах реализации экспрессия СВЭ в иммунной клетке хаТКР плюс ХСР и СВЭ является индуцибельной. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка хаТКР плюс ХСР и СВЭ содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую СВЭ, функционально связанную с индуцибельным промотором, включая любой из индуцибельных промоторов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации экспрессия СВЭ в иммунной клетке хаТКР плюс ХСР и СВЭ является индуцибельной после сигнализации посредством хаТКР. В некоторых таких вариантах реализации иммунная клетка хаТКР плюс ХСР и СВЭ содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую СВЭ, функционально связанную с промотором или регуляторным элементом, ответственным за сигнализацию посредством хаТКР. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая СВЭ, функционально связана с промотором ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). В некоторых вариантах реализации промотор NFAT, представляет собой минимальный промотор NFAT (смотрите, например, Durand, D. et. al., Molec. Cell. Biol. 8, 1715-1724 (1988); Clipstone, NA, Crabtree, GR. Nature. 1992 357(6380): 695-7; Chmielewski, M., et al. Cancer research 71.17 (2011): 5697-5706; и Zhang, L., et al. Molecular therapy 19.4 (2011): 751-759). В некоторых вариантах реализации промотор NFAT содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая СВЭ, функционально связана с промотором IL-2.

Нуклеиновые кислоты

[0219] Также предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие хаТКР, ХСР и/или СВЭ, описанные в данном документе. В некоторых вариантах реализации в соответствии с любыми хаТКР, ХСР и СВЭ, описанными в данном документе, предложена нуклеиновая кислота (или набор нуклеиновых кислот), кодирующая хаТКР, ХСР и/или СВЭ.

[0220] В настоящем изобретении также предложены векторы, в которые вставлена нуклеиновая кислота по настоящему изобретению.

[0221] Вкратце, экспрессию описанных в данном документе хаТКР и/или ХСР и/или СВЭ нуклеиновой кислотой, кодирующей хаТКР и/или ХСР и/или СВЭ, можно обеспечить путем вставки нуклеиновой кислоты в соответствующий экспрессионный вектор так, чтобы нуклеиновая кислота была функционально связана с 5’ и 3’ регуляторными элементами, включая, например, промотор (например, лимфоцит-специфический промотор) и 3’ нетранслируемую область. Векторы могут подходить для репликации и интеграции в эукариотические клетки-хозяев. Типичные клонирующие и экспрессионные векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности инициации и промоторы, подходящие для регуляции экспрессии необходимой последовательности нуклеиновой кислоты.

[0222] Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению также можно применять для иммунизации нуклеиновыми кислотами и генной терапии, используя стандартные протоколы генной доставки. Способы генной доставки известны в данной области техники. Смотрите, например, патенты США №№ 5399346, 5580859, 5589466, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации в изобретении предложен вектор для генной терапии.

[0223] Нуклеиновую кислоту можно клонировать в некоторое число типов векторов. Например, нуклеиновую кислоту можно клонировать в вектор, включая, но не ограничиваясь этим, плазмиду, фагмиду, фаговое производное, вирус животного и космиду. Векторы, представляющие особый интерес, включают экспрессионные векторы, репликационные векторы, векторы генерации зондов и векторы секвенирования.

[0224] Кроме того, экспрессионный вектор можно доставлять в клетку в форме вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна в данной области техники и описана, например, в Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), а также в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые можно использовать в качестве векторов, включают, но не ограничиваются этим, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы и лентивирусы. В общем случае подходящий вектор содержит точку начала репликации, функциональную по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, подходящие рестрикционные эндонуклеазные сайты и один или более селективных маркеров (смотрите, например, WO 01/96584; WO 01/29058; И патент США № 6326193).

[0225] Для переноса генов в клетки млекопитающих был разработан ряд вирусных систем. Например, ретровирусы обеспечивают удобную платформу для систем генной доставки. Выбранный ген можно вставлять в вектор и упаковывать в ретровирусные частицы, используя методики, известные в данной области техники. Затем рекомбинантный вирус можно выделять и доставлять в клетки субъекта in vivo или ex vivo. В данной области техники известен ряд ретровирусных систем. В некоторых вариантах реализации используют аденовирусные векторы. В данной области техники известен ряд аденовирусных векторов. В некоторых вариантах реализации используют лентивирусные векторы. Векторы, полученные из ретровирусов, таких как лентивирус, являются подходящими инструментами для обеспечения долгосрочного переноса генов, поскольку они обеспечивают долгосрочную, стабильную интеграцию трансгена и его размножение в дочерних клетках. Лентивирусные векторы обладают дополнительным преимуществом по сравнению с векторами, полученными из онко-ретровирусов, таких как вирусы мышиного лейкоза, в том, что они могут трансдуцировать непролиферирующие клетки, такие как гепатоциты. Они также обладают дополнительным преимуществом низкой иммуногенности.

[0226] Дополнительные промоторные элементы, например, энхансеры, регулируют частоту инициации транскрипции. Как правило, они расположены в области на 30-110 п. о. выше стартового сайта, хотя недавно было показано, что ряд промоторов также содержат функциональные элементы ниже стартового сайта. Расстояние между промоторными элементами часто является гибким, так что функция промотора сохраняется при перестановке или перемещении элементов относительно друг друга. В промоторе тимидинкиназы (tk) расстояние между промоторными элементами можно увеличивать до 50 п. о., прежде чем начинает снижаться активность.

[0227] Одним из примеров подходящего промотора является последовательность немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV). Эта промоторная последовательность представляет собой сильную конститутивную промоторную последовательность, способную обеспечивать высокие уровни экспрессии любой функционально связанной с ней полинуклеотидной последовательности. Другим примером подходящего промотора является фактор элонгации 1α (EF-1α). При этом также можно использовать другие конститутивные промоторные последовательности, включая, но не ограничиваясь этим, ранний промотор вируса обезьян 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор длинных концевых повторов (ДКП) вируса иммунодефицита человека (HIV), промотор MoMuLV, промотор вируса лейкоза птиц, немедленно-ранний промотор вируса Эпштейна-Барр, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы человеческих генов, такие как, но не ограничиваясь этим, промотор актина, промотор миозина, промотор гемоглобина и промотор креатинкиназы.

[0228] Кроме того, изобретение не должно ограничиваться применением конститутивных промоторов. Индуцибельные промоторы также предусмотрены как часть изобретения. Применение индуцибельного промотора обеспечивает молекулярный переключатель, способный «включать» экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он функционально связан, в случае, когда такая экспрессия необходима, или «выключать» экспрессию, в случае, когда экспрессия не нужна. Примеры индуцибельных промоторных систем для применения в эукариотических клетках включают, но не ограничиваются этим, регулируемые гормонами элементы (например, смотрите Mader, S. and White, J. H. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607), синтетические регулируемые лигандами элементы (смотрите, например, Spencer, D. M. et al 1993) Science 262: 1019-1024) и регулируемые ионизирующим излучением элементы (например, смотрите Manome, Y. et al. (1993) Biochemistry 32: 10607-10613; Datta, R. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1014-10153). Дополнительные примеры индуцибельных промоторных систем для применения в in vitro или in vivo системах млекопитающих рассмотрены в Gingrich et al. (1998) Annual Rev. Neurosci 21:377-405.

[0229] Примером индуцибельной промоторной системы для применения в настоящем изобретении является система Tet. Такие системы основаны на системе Tet, описанной Gossen et al. (1993). В типовом варианте реализации представляющий интерес полинуклеотид находится под управлением промотора, который содержит один или более сайтов оператора Tet (TetO). В неактивном состоянии Tet-репрессор (TetR) связывается с сайтами TetO и подавляет транскрипцию из промотора. В активном состоянии, например, в присутствии индуцирующего агента, такого как тетрациклин (Tc), ангидротетрациклин, доксициклин (Dox) или их активный аналог, индуцирующий агент вызывает высвобождение TetR из TetO, тем самым обеспечивая транскрипцию. Доксициклин является представителем тетрациклинового семейства антибиотиков и имеет химическое название 1-диметилмино-2,4a,5,7,12-пентагидрокси-11-метил-4,6-диоксо-1,4a,11,11a,12,12a-гексагидротетрацен-3-карбоксамид.

[0230] В одном варианте реализации TetR кодон-оптимизирован для экспрессии в клетках млекопитающих, например, мышиных или человеческих клетках. Большинство аминокислот кодируются более чем одним кодоном вследствие вырожденности генетического кода, что делает возможными существенные вариации нуклеотидной последовательности данной нуклеиновой кислоты без какого-либо изменения в аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновой кислотой. Однако многие организмы проявляют различия в частоте использования кодонов, что также известно как «предпочтение кодонов» (т. е. предпочтение в отношении использования конкретного(ых) кодона(ов) в случае заданной аминокислоты). Предпочтение кодонов часто коррелирует с присутствием преобладающих молекул тРНК для конкретного кодона, что, в свою очередь, повышает эффективность трансляции мРНК. Соответственно, кодирующая последовательность, полученная из конкретного организма (например, прокариота), может быть адаптирована для улучшенной экспрессии в другом организме (например, эукариоте) путем оптимизации кодонов.

[0231] Другие конкретные вариации системы Tet включают системы «Tet-Off» и «Tet-On». В системе Tet-Off транскрипция неактивна в присутствии Tc или Dox. В этой системе регулируемый тетрациклином белок-трансактиватор (tTA), который состоит из TetR, слитого с сильным трансактивирующим доменом VP16 из вируса простого герпеса, регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты, которая находится под транскрипционным управлением тетрациклин-чувствительного промоторного элемента (TRE). TRE состоит из конкатамеров последовательности TetO, слитых с промотором (обычно минимальной промоторной последовательностью, полученной из немедленного-раннего промотора цитомегаловируса человека (hCMV)). В отсутствие Tc или Dox tTA связывается с TRE и активирует транскрипцию целевого гена. В присутствии Tc или Dox tTA не может связываться с TRE, а экспрессия из целевого гена остается неактивной.

[0232] В системе Tet-On транскрипция активна в присутствии Tc или Dox. В основе системы Tet-On лежит реверсивный тетрациклин-управляемый трансактиватор rtTA. Как и tTA, rtTA представляет собой слитый белок, состоящий из репрессора TetR и домена трансактивации VP16. Однако изменение четырех аминокислот в ДНК-связывающем фрагменте TetR меняет характеристики связывания rtTA так, что он может распознавать только последовательности tetO в TRE целевого трансгена в присутствии Dox. Таким образом, в системе Tet-On транскрипция TRE-регулируемого целевого гена стимулируется rtTA только в присутствии Dox.

[0233] Другой индуцибельной промоторной системой является система lac-репрессора из E. coli. (Смотрите, Brown et al., Cell 49:603-612 (1987). Система lac-репрессора функционирует путем регуляции транскрипции представляющего интерес полинуклеотида, функционально связанного с промотором, содержащим оператор lac (lacO). lac-репрессор (lacR) связывается с LacO, таким образом, предотвращая транскрипцию представляющего интерес полинуклеотида. Экспрессия представляющего интерес полинуклеотида индуцируется подходящим индуцирующим агентом, например, изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (IPTG).

[0234] Другим примером индуцибельной промоторной системы для применения в настоящем изобретении является система ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). Представители семейства транскрипционных факторов NFAT являются важными регуляторами активации Т-клеток. NFAT-отвечающие элементы можно найти, например, в промоторе IL-2 (смотрите, например, Durand, D. et. al., Molec. Cell. Biol. 8, 1715-1724 (1988); Clipstone, NA, Crabtree, GR. Nature. 1992 357(6380): 695-7; Chmielewski, M., et al. Cancer research 71.17 (2011): 5697-5706; и Zhang, L., et al. Molecular therapy 19.4 (2011): 751-759). В некоторых вариантах реализации индуцибельный промотор, описанный в данном документе, содержит один или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более) NFAT-отвечающих элементов. В некоторых вариантах реализации индуцибельный промотор содержит 6 NFAT-отвечающих элементов, например, содержащих нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 83. В некоторых вариантах реализации индуцибельный промотор, описанный в данном документе, содержит один или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более) NFAT-отвечающих элементов, связанных с минимальным промотором, таким как минимальный промотор TA. В некоторых вариантах реализации минимальный промотор TA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 84. В некоторых вариантах реализации индуцибельный промотор содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 85.

[0235] Для оценки экспрессии полипептида или его частей экспрессионный вектор, подлежащий внесению в клетку, может также содержать ген селективного маркера или репортерный ген, или их оба, для облегчения идентификации и отбора экспрессирующих клеток из популяции клеток, предполагаемо трансфицированных или инфицированных вирусными векторами. В других аспектах селективный маркер можно помещать в отдельный фрагмент ДНК и использовать в процедуре ко-трансфекции. Как селективные маркеры, так и репортерные гены могут фланкироваться соответствующими регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии в клетках-хозяевах. Применимые селективные маркеры включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как neo и т. п.

[0236] Репортерные гены используют для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательностей. В общем случае репортерный ген представляет собой ген, который не присутствует или не экспрессируется в реципиентных организме или ткани и который кодирует полипептид, экспрессия которого проявляется в виде некоторой легко обнаруживаемой характеристики, например, ферментативной активности. Экспрессию репортерного гена анализируют в подходящее время после внесения ДНК в клетки-реципиенты. Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, β-галактозидазу, хлорамфеникол-ацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу, или ген зеленого флуоресцентного белка (например, Ui-Tel et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Подходящие экспрессионные системы хорошо известны, и их можно получать, используя известные методики, или приобретать на коммерческом основании. В общем случае в качестве промотора определяют конструкцию с минимальной 5′ фланкирующей областью, демонстрирующую самый высокий уровень экспрессии репортерного гена. Такие промоторные области можно связывать с репортерным геном и использовать для оценки агентов в отношении способности модулировать обусловленную промотором транскрипцию.

[0237] В некоторых вариантах реализации предложена нуклеиновая кислота, кодирующая хаТКР и/или ХСР в соответствии с любыми хаТКР, ХСР и СВЭ, описанными в данном документе. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота содержит одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих все полипептидные цепи хаТКР. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота содержит одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих все полипептидные цепи ХСР. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота содержит одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих все полипептидные цепи хаТКР и ХСР. В некоторых вариантах реализации каждая из одной или более последовательностей нуклеиновых кислот содержится в отдельном векторе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере некоторые из последовательностей нуклеиновых кислот содержатся в одном векторе. В некоторых вариантах реализации все последовательности нуклеиновых кислот содержатся в одном векторе. Векторы могут быть выбраны, например, из группы, состоящей из экспрессионных векторов млекопитающих и вирусных векторов (таких как полученные из ретровирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, герпесвирусов и лентивирусов).

[0238] Например, в некоторых вариантах реализации хаТКР представляет собой димер, содержащий первую полипептидную цепь хаТКР и вторую полипептидную цепь хаТКР, а ХСР представляет собой мономер, содержащий одну полипептидную цепь ХСР, а нуклеиновая кислота содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первую полипептидную цепь хаТКР, вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую цепь хаТКР, и третью последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептидную цепь ХСР. В некоторых вариантах реализации первая последовательность нуклеиновой кислоты содержится в первом векторе, вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержится во втором векторе, а третья последовательность нуклеиновой кислоты содержится в третьем векторе. В некоторых вариантах реализации первая и вторая последовательности нуклеиновых кислот содержатся в первом векторе, а третья последовательность нуклеиновой кислоты содержится во втором векторе. В некоторых вариантах реализации первая и третья последовательности нуклеиновых кислот содержатся в первом векторе, а вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержится во втором векторе. В некоторых вариантах реализации вторая и третья последовательности нуклеиновых кислот содержатся в первом векторе, а первая последовательность нуклеиновой кислоты содержится во втором векторе. В некоторых вариантах реализации первая, вторая и третья последовательности нуклеиновых кислот содержатся в одном векторе. В некоторых вариантах реализации первая последовательность нуклеиновой кислоты находится под управлением первого промотора, вторая последовательность нуклеиновой кислоты находится под управлением второго промотора, а третья последовательность нуклеиновой кислоты находится под управлением третьего промотора. В некоторых вариантах реализации некоторые или все из первого, второго и третьего промоторов имеют одинаковую последовательность. В некоторых вариантах реализации некоторые или все из первого, второго и третьего промоторов имеют разные последовательности. В некоторых вариантах реализации некоторые или все из первой, второй и третьей последовательностей нуклеиновых кислот экспрессируются в виде одного транскрипта под управление одного промотора в мультицистронном векторе. Смотрите, например, Kim, JH, et al., PLoS One 6(4):e18556, 2011. В некоторых вариантах реализации один или более промоторов являются индуцибельными. В некоторых вариантах реализации третья последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептидную цепь ХСР, функционально связана с индуцибельным промотором. В некоторых вариантах реализации индуцибельный промотор содержит один или более элементов, отвечающих на активацию иммунных клеток, таких как NFAT-отвечающие элементы.

[0239] В некоторых вариантах реализации некоторые или все из первой, второй и третьей последовательностей нуклеиновых кислот имеют сходные (такие как по существу или приблизительно одинаковые) уровни экспрессии в клетке-хозяине (такой как Т-клетка). В некоторых вариантах реализации некоторые из первой, второй и третьей последовательностей нуклеиновых кислот имеют уровни экспрессии в клетке-хозяине (такой как Т-клетка), которые отличаются по меньшей мере в около двух (например, по меньшей мере в около 2, 3, 4, 5 или более) раз. Экспрессию можно определять на уровне мРНК или белка. Уровень экспрессии мРНК можно определять путем измерения количества мРНК, транскрибированной из нуклеиновой кислоты, используя различные хорошо известные способы, включая нозерн-блоттинг, количественную РВ-ПЦР, микроматричный анализ и т. п. Уровень экспрессии белка можно измерять известными способами, включая иммуноцитохимическое окрашивание, ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), вестерн-блоттинг, люминесцентный анализ, масс-спектрометрию, высокоэффективную жидкостную хроматографию, жидкостную хроматографию высокого давления - тандемную масс-спектрометрию и т. п.

[0240] Следует понимать, что признаки вариантов реализации, описанные в данном документе, можно адаптировать и комбинировать для включения вариантов реализации, содержащих любое число последовательностей нуклеиновых кислот, например, тех, в которых нуклеиновая кислота, кодирующая хаТКР и/или ХСР и/или СВЭ, содержит пять или более последовательностей нуклеиновых кислот (например, когда каждый хаТКР и СВЭ содержит по 2 или более разных полипептидных цепей).

[0241] Таким образом, в некоторых вариантах реализации предложена нуклеиновая кислота, кодирующая a) димерный хаТКР, содержащий первую полипептидную цепь хаТКР и вторую полипептидную цепь хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, причем нуклеиновая кислота содержит i) первую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую первую полипептидную цепь хаТКР, и ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую вторую полипептидную цепь хаТКР; и b) мономерный ХСР, содержащий одну полипептидную цепь ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, причем нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты ХСР, кодирующую полипептидную цепь ХСР. В некоторых вариантах реализации первая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР содержится в первом векторе (таком как лентивирусный вектор), вторая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР содержится во втором векторе (таком как лентивирусный вектор), а последовательность нуклеиновой кислоты ХСР содержится в третьем векторе (таком как лентивирусный вектор). В некоторых вариантах реализации некоторые или все из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот хаТКР и последовательности нуклеиновой кислоты ХСР содержатся в одном векторе (таком как лентивирусный вектор). В некоторых вариантах реализации каждая из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот хаТКР и последовательности нуклеиновой кислоты ХСР, по отдельности, функционально связаны с промотором. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют одинаковую последовательность. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют разные последовательности. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы являются индуцибельными. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты ХСР функционально связана с индуцибельным промотором. В некоторых вариантах реализации индуцибельный промотор содержит один или более элементов, отвечающих на активацию иммунных клеток. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты ХСР функционально связана с полученным из NFAT промотором. В некоторых вариантах реализации некоторые или все векторы представляют собой вирусные векторы (такие как лентивирусные векторы).

[0242] В некоторых вариантах реализации предложены a) первый вектор (такой как лентивирусный вектор), содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую димерный хаТКР, содержащий первую полипептидную цепь хаТКР и вторую полипептидную цепь хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, содержащий i) первый промотор, функционально связанный с первой последовательностью нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующей первую полипептидную цепь хаТКР; и ii) второй промотор, функционально связанный со второй последовательностью нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующей вторую полипептидную цепь хаТКР; и b) второй вектор (такой как лентивирусный вектор), содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую мономерный ХСР, содержащий полипептидную цепь ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, содержащий третий промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты ХСР, кодирующей полипептидную цепь ХСР. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют одинаковую последовательность. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы имеют разные последовательности. В некоторых вариантах реализации некоторые или все промоторы являются индуцибельными. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй векторы представляют собой вирусные векторы (такие как лентивирусные векторы).

[0243] В некоторых вариантах реализации предложены a) первый вектор (такой как лентивирусный вектор), содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую димерный хаТКР, содержащий первую полипептидную цепь хаТКР и вторую полипептидную цепь хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, содержащий i) первую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую первую полипептидную цепь хаТКР; и ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую вторую полипептидную цепь хаТКР, причем первая и вторая последовательности нуклеиновых кислот хаТКР находятся под управлением первого промотора; и b) второй вектор (такой как лентивирусный вектор), содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую мономерный ХСР, содержащий полипептидную цепь ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, содержащий второй промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты ХСР, кодирующей полипептидную цепь ХСР. В некоторых вариантах реализации первый промотор функционально связан с 5’ концом первой последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР, и присутствует нуклеотидный линкер, выбранный из группы, состоящей из внутреннего сайта связывания рибосомы (IRES) и нуклеиновой кислоты, кодирующей саморасщепляемый пептид 2A (такой как P2A, T2A, E2A или F2A), связывающий 3’ конец первой последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР с 5’ концом второй последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР и вторая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР транскрибируются в виде одной РНК под управлением первого промотора. В некоторых вариантах реализации первый промотор функционально связан с 5’ концом второй последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР, и присутствует нуклеотидный линкер, выбранный из группы, состоящей из внутреннего сайта связывания рибосомы (IRES) и нуклеиновой кислоты, кодирующей саморасщепляемый пептид 2A (такой как P2A, T2A, E2A или F2A), связывающий 3’ конец второй последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР с 5’ концом первой последовательности нуклеиновой кислоты хаТКР, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР и вторая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР транскрибируются в виде одной РНК под управлением первого промотора. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй промоторы являются индуцибельными. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй векторы представляют собой вирусные векторы (такие как лентивирусные векторы). Следует понимать, что предусмотрены также варианты реализации с обменом любой из последовательностей нуклеиновых кислот, например, когда первая или вторая последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР обменена на последовательность нуклеиновой кислоты ХСР.

[0244] В некоторых вариантах реализации предложен вектор (такой как вирусный вектор, например, лентивирусный вектор), содержащий a) нуклеиновую кислоту, кодирующую димерный хаТКР, содержащий первую полипептидную цепь хаТКР и вторую полипептидную цепь хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, содержащий i) первую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую первую полипептидную цепь хаТКР; и ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую вторую полипептидную цепь хаТКР; и b) нуклеиновую кислоту, кодирующую мономерный ХСР, содержащий полипептидную цепь ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты ХСР, кодирующую полипептидную цепь ХСР, причем первая и вторая последовательности нуклеиновых кислот хаТКР находятся под управлением первого промотора, и причем последовательность нуклеиновой кислоты ХСР находится под управлением второго промотора. В некоторых вариантах реализации первый промотор функционально связан с одной из последовательностей нуклеиновых кислот хаТРК, которая связана с другой последовательностью нуклеиновой кислоты хаТКР нуклеотидным линкером, выбранным из группы, состоящей из внутреннего сайта связывания рибосомы (IRES) и нуклеиновой кислоты, кодирующей саморасщепляемый пептид 2A (такой как P2A, T2A, E2A или F2A), так, что первая и вторая последовательности нуклеиновых кислот хаТКР транскрибируются в виде одной РНК под управлением первого промотора. В некоторых вариантах реализации первый и/или второй промоторы являются индуцибельными. В некоторых вариантах реализации второй промотор представляет собой индуцибельный промотор. В некоторых вариантах реализации индуцибельный промотор содержит один или более элементов, отвечающих на активацию иммунных клеток. В некоторых вариантах реализации второй промотор представляет собой промотор NFAT. В некоторых вариантах реализации промотор NFAT содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85. В некоторых вариантах реализации вектор представляет собой вирусный вектор (такой как лентивирусный вектор).

[0245] В некоторых вариантах реализации предложен вектор (такой как лентивирусный вектор), содержащий a) нуклеиновую кислоту, кодирующую димерный хаТКР, содержащий первую полипептидную цепь хаТКР и вторую полипептидную цепь хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, содержащий i) первую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую первую полипептидную цепь хаТКР; и ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты хаТКР, кодирующую вторую полипептидную цепь хаТКР; и b) нуклеиновую кислоту, кодирующую мономерный ХСР, содержащий полипептидную цепь ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты ХСР, кодирующую полипептидную цепь ХСР, причем первая и вторая последовательности нуклеиновых кислот хаТКР и последовательность нуклеиновой кислоты ХСР находятся под управлением одного промотора. В некоторых вариантах реализации промотор функционально связан с одной из последовательностей нуклеиновых кислот, которая связана с другими последовательностями нуклеиновых кислот нуклеотидными линкерами, выбранными, по отдельности, из группы, состоящей из внутреннего сайта связывания рибосомы (IRES) и нуклеиновой кислоты, кодирующей саморасщепляемый пептид 2A (такой как P2A, T2A, E2A или F2A), так, что первая и вторая последовательности нуклеиновых кислот хаТКР и последовательность нуклеиновой кислоты ХСР транскрибируются в виде одной РНК под управлением промотора. В некоторых вариантах реализации промотор является индуцибельным. В некоторых вариантах реализации вектор представляет собой вирусный вектор (такой как лентивирусный вектор).

[0246] Способы внесения и экспрессии генов в клетке известны в данной области техники. В контексте экспрессионного вектора вектор можно легко вносить в клетку-хозяина, например клетку млекопитающего, бактерии, дрожжей или насекомого любым способом, известным в данной области техники. Например, экспрессионный вектор можно переносить в клетку-хозяина физическими, химическими или биологическими средствами.

[0247] Физические способы внесения полинуклеотида в клетку-хозяина включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и т. п. Способы получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны в данной области техники. Смотрите, например, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). В некоторых вариантах реализации внесение полинуклеотида в клетку-хозяина осуществляют посредством трансфекции с фосфатом кальция.

[0248] Биологические способы внесения представляющего интерес полинуклеотида в клетку-хозяина включают применение ДНК- и РНК-векторов. Вирусные векторы и в особенности ретровирусные векторы, стали наиболее широко применяемым способом вставки генов в клетки млекопитающих, например, в клетки человека. Другие вирусные векторы можно получить из лентивирусов, поксвирусов, вируса простого герпеса 1, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов и т. п. Смотрите, например, патенты США №№ 5 350 674 и 5 585 362.

[0249] Химические средства внесения полинуклеотида в клетку-хозяина включают коллоидные дисперсионные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии типа «масло в воде», мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Примером коллоидной системы для применения в качестве средства доставки in vitro и in vivo является липосома (например, искусственная мембранная везикула).

[0250] В случае применения невирусной системы доставки типовым средством доставки является липосома. Предусмотрено применение липидных составов для внесения нуклеиновых кислот в клетку-хозяина (in vitro, ex vivo или in vivo). В другом аспекте нуклеиновая кислота может быть связана с липидом. Нуклеиновая кислота, связанная с липидом, может быть инкапсулирована в водной внутренней части липосомы, находиться внутри липидного бислоя липосомы, прикреплена к липосоме посредством связывающей молекулы, которая связана как с липосомой, так и с олигонуклеотидом, заключена в липосоме, находиться в комплексе с липосомой, диспергирована в растворе, содержащем липид, смешана с липидом, скомбинирована с липидом, содержаться в виде суспензии в липиде, содержаться или находиться в комплексе с мицеллой или иным образом быть связанной с липидом. Композиции на основе липидов, липидов/ДНК или липидов/экспрессионных векторов не ограничены какой-либо конкретной структурой в растворе. Например, они могут присутствовать в бислоевой структуре, в виде мицелл или в «сжатой» структуре. Их также можно просто перемешивать в растворе, возможно, с образованием агрегатов, которые не являются однородными по размеру или форме. Липиды представляют собой жирные вещества, которые могут быть природными или синтетическими липидами. Например, липиды включают жирные капли, которые встречаются в природе в цитоплазме, а также класс соединений, которые содержат длинноцепочечные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды.

[0251] Независимо от способа, применяемого для внесения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку-хозяина или иного воздействия на клетку ингибитора по настоящему изобретению, для подтверждения наличия рекомбинантной последовательности ДНК в клетке-хозяине можно проводить ряд анализов. Такие анализы включают, например, «молекулярные биологические» анализы, хорошо известные специалистам в данной области техники, такие как саузерн- и нозерн-блоттинг, РВ-ПЦР и ПЦР; «биохимические» анализы, такие как обнаружение наличия или отсутствия конкретного пептида, например, иммунологическими средствами (ELISA и вестерн-блоттинг) или с помощью анализов, описанных в данном документе, для идентификации агентов, входящих в объем данного изобретения.

Получение хаТКР, ХСР и СВЭ

[0252] В некоторых вариантах реализации в соответствии с любым хаТКР, ХСР и СВЭ, описанными в данном документе, содержащими фрагмент антитела, фрагмент антитела (например, Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или scFv) содержит последовательности, полученные из моноклонального антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит домены V_H и V_L или их варианты из моноклонального антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела дополнительно содержит домены C_H1 и C_L или их варианты из моноклонального антитела. Моноклональные антитела можно получать, например, используя гибридомные способы, такие как описанные Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975) и Sergeeva et al., Blood, 117(16):4262-4272.

[0253] В гибридомном способе, хомяка, мышь или другое подходящее животное-хозяина, как правило, иммунизируют иммунизирующим агентом для появления лимфоцитов, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые специфически связываются с иммунизирующим агентом. В альтернативном варианте лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Иммунизирующий агент может включать полипептид или слитый белок представляющего интерес белка, или комплекс, содержащий по меньшей мере две молекулы, такой как комплекс, содержащий пептид и белок ГКГС. В общем случае, если нужны клетки человеческого происхождения, используют лимфоциты периферической крови («ЛПК»), а если нужны источники клеток отличного от человека млекопитающего, используют клетки селезенки или клетки лимфатических узлов. Затем лимфоциты сливают с иммортализованной клеточной линией, используя подходящий сшивающий агент, такой как полиэтиленгликоль, для образования клетки гибридомы. Смотрите, например, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103. Иммортализованные клеточные линии обычно представляют собой трансформированные клетки млекопитающих, в частности клетки миеломы грызунов, бычьих или человека. Обычно применяют линии клеток миеломы крыс или мышей. Клетки гибридомы можно культивировать в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживаемость неслитых, иммортализованных клеток. Например, если в родительских клетках отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом, как правило, будет содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин («среда HAT»), которые предотвращают рост HGPRT-дефицитных клеток.

[0254] В некоторых вариантах реализации иммортализованные клеточные линии обеспечивают эффективное слияние, поддерживают стабильный высокий уровень экспрессии антитела выбранными вырабатывающими антитела клетками и являются восприимчивыми к среде, такой как среда HAT. В некоторых вариантах реализации иммортализованные клеточные линии представляют собой линии миеломы мышей, которые можно получить, например, из центра распределения клеток института Солка, Сан-Диего, Калифорния, и Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния. Линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши/человека также были описаны в контексте выработки человеческих моноклональных антител. Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63.

[0255] Культуральную среду, в которой культивируют клетки гибридомы, анализируют в отношении наличия моноклональных антител, направленных против полипептида. Специфичность связывания моноклональных антител, вырабатываемых клетками гибридомы, можно определять с помощью иммунопреципитации или с помощью in vitro анализа связывания, такого как радиоиммунноанализ (РИА) или ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA). Такие методики и анализы известны в данной области техники. Аффинность связывания моноклонального антитела можно, например, определить с помощью анализа Скэтчарда, описанного в Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

[0256] После идентификации необходимых клеток гибридомы клоны можно субклонировать с помощью процедур предельного разведения и выращивать стандартными способами. Goding, выше. Подходящие культуральные среды для этой цели включают, например, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла и среду RPMI-1640. В альтернативном варианте клетки гибридомы можно выращивать in vivo в виде асцитов у млекопитающих.

[0257] Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно выделять или очищать из культуральной среды или асцитной жидкости с помощью традиционных процедур очистки иммуноглобулина, таких как, например, хроматография с протеином А-сефарозой, гидроксиапатитом, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

[0258] В некоторых вариантах реализации в соответствии с любыми хаТКР, ХСР и СВЭ, описанными в данном документе, содержащими фрагмент антитела, фрагмент антитела содержит последовательности из клона, выбранного из библиотеки фрагментов антител (такой как фаговая библиотека, представляющая фрагменты scFv или Fab). Клон можно идентифицировать путем скрининга комбинаторных библиотек в отношении фрагментов антитела с необходимым видом активности или видами активности. Например, в данной области техники известны различные способы создания библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек в отношении антител, обладающих необходимыми характеристиками связывания. Такие способы описаны, например, в Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001) и дополнительно описаны, например, в McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

[0259] В определенных способах фагового дисплея репертуары генов V_H и V_L отдельно клонируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и случайным образом рекомбинируют в фаговых библиотеках, по которым впоследствии можно проводить поиск в отношении антигенсвязывающего фага, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаг, как правило, отображает фрагменты антител в виде одноцепочечных фрагментов Fv (scFv) или в виде фрагментов Fab. Библиотеки из иммунизированных источников обеспечивают высокоаффинные антитела к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. В альтернативном варианте наивный репертуар можно клонировать (например, от человека) для обеспечения единого источника антител к широкому диапазону несобственных и собственных антигенов без какой-либо иммунизации, как описано в Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки также можно создавать синтетически, клонируя неперестроенные V-генные сегменты из стволовых клеток и используя ПЦР-праймеры, содержащие случайную последовательность, для кодирования высоковариабельных областей CDR3 и для осуществления перестройки in vitro, как описано в Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, описывающие фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например: патент США № 5 750 373 и патентные публикации США №№ 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.

[0260] Фрагмент антитела можно получать, используя фаговый дисплей для скрининга библиотек в отношении антител, специфических к целевому антигену (такому как комплекс пептид/ГКГС класса I/II или антиген клеточной поверхности). Библиотека может представлять собой библиотеку фагового дисплея scFv человека, имеющую разнообразие по меньшей мере один x 10⁹ (например, по меньшей мере 1×10⁹, 2,5×10⁹, 5×10⁹, 7,5×10⁹, 1×10¹⁰, 2,5×10¹⁰, 5×10¹⁰, 7,5×10¹⁰ или 1×10¹¹) уникальных фрагментов антитела человека. В некоторых вариантах реализации библиотека представляет собой наивную человеческую библиотеку, сконструированную из ДНК, выделенной из человеческих МКПК и селезенки здоровых доноров, охватывающую все подсемейства тяжелой и легкой цепей человека. В некоторых вариантах реализации библиотека представляет собой наивную человеческую библиотеку, сконструированную из ДНК, выделенной из МКПК, полученных от пациентов с различными заболеваниями, таких как пациенты с аутоиммунными заболеваниями, онкологические пациенты и пациенты с инфекционными заболеваниями. В некоторых вариантах реализации библиотека представляет собой полусинтетическую человеческую библиотеку, в которой CDR3 тяжелой цепи полностью рандомизирована, причем все аминокислоты (за исключением цистеина) в равной степени могут присутствовать в любой заданной позиции (смотрите, например, Hoet, R.M. et al., Nat. Biotechnol. 23(3):344-348, 2005). В некоторых вариантах реализации CDR3 тяжелой цепи полусинтетической человеческой библиотеки имеет длину от около 5 до около 24 (например, около 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24) аминокислот. В некоторых вариантах реализации библиотека представляет собой полностью синтетическую библиотеку фагового дисплея. В некоторых вариантах реализации библиотека представляет собой нечеловеческую библиотеку фагового дисплея.

[0261] Фаговые клоны, которые связываются с целевым антигеном с высокой аффинностью, можно отбирать посредством итеративного связывания фага с целевым антигеном, который связан с твердой подложкой (такой как, например, гранулы для пэннинга в растворе или клетки млекопитающих для пэннинга в клетках), с последующим удалением несвязанного фага и элюированием специфически связанного фага. В примере пэннинга в растворе целевой антиген можно биотинилировать для иммобилизации на твердой подложке. Биотинилированный целевой антиген смешивают с фаговой библиотекой и твердой подложкой, такой как конъюгированные с стрептавидином гранулы Dynabeads M-280, а затем выделяют комплексы целевой антиген-фаг-гранула. Связанные фаговые клоны затем элюируют и используют для инфицирования соответствующей клетки-хозяина, такой как E. coli XL1-Blue, для экспрессии и очистки. В примере пэннинга в клетках клетки T2 (TAP-дефицитная, HLA-A*02:01⁺ линия клеток лимфобластов), нагруженные пептидом AFP, смешивают с фаговой библиотекой, после чего клетки собирают, а связанные клоны элюируют и используют для инфицирования соответствующей клетки-хозяина для экспрессии и очистки. Пэннинг можно проводить на протяжении некоторого количества (например, около 2, 3, 4, 5, 6 или более) раундов, как пэннинг в растворе, так и пэннинг в клетках или их комбинацию, для обогащения фаговых клонов, специфически связывающихся с целевым антигеном. Обогащенные фаговые клоны можно исследовать в отношении специфического связывания с целевым антигеном любыми способами, известными в данной области техники, включая, например, ELISA и FACS.

Человеческие и гуманизированные фрагменты антител

[0262] Фрагменты антител к хаТКР, ХСР и СВЭ могут быть человеческими или гуманизированными. Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) фрагментов антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab’, F(ab’)₂, scFv или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые, как правило, содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизированные фрагменты антител включают человеческие иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (антитело-реципиент), в которых остатки из CDR реципиента замещены остатками из CDR не относящегося к человеку вида (антитело-донор), такого как мышь, крыса или кролик, обладающей необходимой специфичностью, аффинностью и способностью. В некоторых случаях каркасные остатки Fv человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими нечеловеческими остатками. Гуманизированные фрагменты антител также могут содержать остатки, которые отсутствуют как в антителе-реципиенте, так и в импортированных последовательностях CDR или каркасных последовательностях. В общем случае гуманизированный фрагмент антитела может содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все области CDR соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина, а все или практически все области FR соответствуют таковым консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Смотрите, например, Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

[0263] В общем случае гуманизированный фрагмент антитела содержит один или более аминокислотных остатков, внесенных в него из нечеловеческого источника. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто называют «импортными» остатками, которые, как правило, берут из «импортного» вариабельного домена. В соответствии с некоторыми вариантами реализации гуманизацию можно по существу проводить в соответствии со способом Winter и коллег (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), путем замены CDR грызуна или последовательностей CDR соответствующими последовательностями человеческого фрагмента антитела. Соответственно, такие «гуманизированные» фрагменты антител представляют собой фрагменты антител (патент США № 4 816 567), в которых участок значительно меньшего размера, чем интактный человеческий вариабельный домен, был замещен соответствующей последовательностью от отличного от человека вида. На практике гуманизированные фрагменты антител, как правило, представляют собой человеческие фрагменты антител, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR замещены остатками из аналогичных сайтов антител грызуна.

[0264] В качестве альтернативы гуманизации можно создавать человеческие фрагменты антител. Например, в настоящее время возможно получать трансгенных животных (например, мышей), которые после иммунизации способны вырабатывать полный репертуар человеческих антител в отсутствие эндогенной выработки иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена соединительной области тяжелой цепи (JH) антитела у химерных и мутантных в отношении зародышевой линии мышей приводит к полному ингибированию эндогенной выработки антител. Перенос группы генов иммуноглобулина человеческой зародышевой линии таким мутантным в отношении зародышевой мышам приведет к выработке человеческих антител после антигенной стимуляции. Смотрите, например, Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); патенты США №№ 5 545 806, 5 569 825, 5 591 669; 5 545 807; и WO 97/17852. В альтернативном варианте человеческие антитела можно получать путем внесения локусов человеческого иммуноглобулина трансгенным животным, например, мышам, у которых частично или полностью инактивированы эндогенные гены иммуноглобулина. После стимуляции наблюдается выработка человеческих антител, которая во всех отношениях очень схожа с наблюдаемой у людей, включая генную перестройку, сборку и репертуар антител. Этот подход описан, например, в патентах США №№ 5 545 807; 5 545 806; 5 569 825; 5 625 126; 5 633 425; и 5 661 016, и Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

[0265] Человеческие антитела также могут генерироваться in vitro активированными B-клетками (смотрите патенты США 5 567 610 и 5 229 275) или с помощью различных методик, известных в данной области техники, включая библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Методики согласно Cole et al. и Boerner et al. также доступны для получения человеческих моноклональных антител. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) и Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991).

Дополнительные варианты

[0266] В некоторых вариантах реализации предусмотрены варианты аминокислотных последовательностей антигенсвязывающих модулей, предложенных в данном документе. Например, может существовать необходимость в улучшении аффинности связывания и/или других биологических свойств антигенсвязывающего модуля. Варианты аминокислотной последовательности антигенсвязывающего модуля можно получать путем внесения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенсвязывающий модуль, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в пределах аминокислотных последовательностей антигенсвязывающего модуля. Любую комбинацию делеции, вставки и замены можно осуществлять так, чтобы в итоге получить конечную конструкцию, при этом конечная конструкция должна обладать необходимыми характеристиками, например, связыванием антигена.

[0267] В некоторых вариантах реализации предложены варианты антигенсвязывающих модулей, содержащие одну или более аминокислотных замен. Представляющие интерес для заместительного мутагенеза сайты включают HVR и FR фрагментов антител. Аминокислотные замены можно вносить в представляющий интерес антигенсвязывающий модуль и проводить скрининг продуктов в отношении необходимой активности, например, сохранения/улучшения связывания антигена или снижения иммуногенности.

[0268] Консервативные замены приведены в Таблице 4 ниже.

ТАБЛИЦА 4: КОНСЕРВАТИВНЫЕ ЗАМЕНЫ

Исходный остаток	Типовые замены	Предпочтительные замены
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Норлейцин	Leu
Leu (L)	Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин	Leu

[0269] Аминокислоты можно отнести к разным классам в соответствии с общими свойствами боковых цепей:

a. гидрофобные: Норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

b. нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

c. кислые: Asp, Glu;

d. основные: His, Lys, Arg;

e. остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

f. ароматические: Trp, Tyr, Phe.

[0270] Неконсервативные замены включают замену представителя одного из этих классов представителем другого класса.

[0271] Типовым заместительным вариантом является фрагмент антитела с созревшей аффинностью, который можно легко получать, например, используя методики созревания аффинности на основании фагового дисплея. Вкратце, мутируют один или более остатков CDR, а вариантные фрагменты антител отображают на фаге и проводят скрининг в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания). Изменения (например, замены) можно осуществлять в HVR, например, чтобы улучшить аффинность фрагмента антитела. Такие изменения можно осуществлять в «горячих точках» HVR, т. е. остатках, кодируемых кодонами, которые мутируют с высокой частотой во время процесса соматического созревания (смотрите, например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), и/или определяющих специфичность остатках (SDR), а получаемые в результате вариантные V_H и V_L исследовать в отношении аффинности связывания. Созревание аффинность путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек было описано, например, в Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).)

[0272] В некоторых вариантах реализации созревания аффинности в вариабельные гены, выбранные для созревания, вносят разнообразие с помощью любого из множества способов (например, ПЦР с внесением ошибок, перетасовки цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). Затем создают вторичную библиотеку. Затем проводят скрининг библиотеки для идентификации всех вариантов фрагментов антител с необходимой аффинностью. Другой способ внесения разнообразия включает направленные на HVR подходы, в которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за раз). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, можно прямым образом идентифицировать, например, используя аланин-сканирующий мутагенез или моделирование. В частности, мишенями часто являются CDR-H3 и CDR-L3.

[0273] В некоторых вариантах реализации замены, вставки или делеции могут находиться в одной или более HVR при условии, что такие изменения существенно не снижают способность фрагмента антитела связываться с антигеном. Например, консервативные изменения (например, консервативные замены, описанные в данном документе), которые существенно не снижают аффинность связывания, можно осуществлять в HVR. Такие изменения могут находиться за пределами «горячих точек» HVR или SDR. В некоторых вариантах реализации описанных выше вариантных последовательностей V_H и V_L каждая HVR остается без изменений или содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

[0274] Применимый способ идентификации остатков или областей антигенсвязывающего модуля, которые могут являться мишенями для мутагенеза, называется «аланин-сканирующим мутагенезом» и описан Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. В этом способе идентифицируют остаток или группу целевых остатков (например, заряженных остатков, таких как arg, asp, his, lys и glu) и замещают нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином), чтобы определить, отражается ли это на взаимодействии антигенсвязывающего модуля с антигеном. Дополнительные замены можно вносить в аминокислотные локации, демонстрирующие функциональную чувствительность к первоначальным заменам. В альтернативном или дополнительном варианте можно определять кристаллическую структуру комплекса антигена и антигенсвязывающего модуля, чтобы идентифицировать точки контакта между антигенсвязывающим модулем и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут стать мишенями или быть исключены как кандидаты для замены. Можно проводить скрининг вариантов, чтобы определить, имеют ли они необходимые свойства.

[0275] Вставки аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбокси-концевые слияния с длиной в диапазоне от одного остатка до полипептидов, содержащих сотни или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или нескольких аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антигенсвязывающий модуль с N-концевым остатком метионила. Другие инсерционные варианты антигенсвязывающего модуля включают слияние N- или C-конца антигенсвязывающего модуля с ферментом (например, в случае ADEPT) или полипептидом, который повышает сывороточное время полужизни антигенсвязывающего модуля.

Производные

[0276] В некоторых вариантах реализации, хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, и/или ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, и/или СВЭ в соответствии с любыми описанными в данном документе, можно дополнительно модифицировать так, чтобы они содержали дополнительные небелковые фрагменты, известные в данной области техники и доступные в продаже. Фрагменты, подходящие для дериватизации хаТКР и/или ХСР и/или СВЭ, включают, но не ограничиваются этим, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но не ограничиваются этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или случайные сополимеры) и декстран или поли(n-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества при производстве благодаря устойчивости в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к хаТКР и/или ХСР и/или СВЭ, может варьироваться, и, в случае присоединения более одного полимера, они могут быть одинаковыми или разными молекулами. В общем случае число и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, можно определить на основании соображений, включая, но не ограничиваясь этим, конкретные свойства или функции хаТКР и/или ХСР и/или СВЭ, которые необходимо улучшить, то, будут ли производное хаТКР и/или ХСР и/или СВЭ использовать в терапии в определенных условиях и т. д.

[0277] В некоторых вариантах реализации предложены конъюгаты хаТКР и/или ХСР и/или СВЭ и небелкового фрагмента, которые могут избирательно нагреваться под воздействием излучения. В некоторых вариантах реализации небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны и включает, но не ограничивается этим, длины волн, которые не наносят вреда обычным клеткам, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой происходит уничтожение клеток, расположенных близко к хаТКР- и/или ХСР- и/или СВЭ-небелковому фрагменту.

Получение иммунных клеток хаТКР плюс ХСР

[0278] В одном аспекте в настоящем изобретении предложены иммунные клетки (такие как лимфоциты, например, Т-клетки), экспрессирующие хаТКР и ХСР в соответствии с любым из вариантов реализации, описанных в данном документе. В данном документе предложены типовые способы получения иммунных клеток (таких как Т-клетки), экспрессирующих хаТКР и ХСР (иммунные клетки хаТКР плюс ХСР, такие как Т-клетки хаТКР плюс ХСР).

[0279] В некоторых вариантах реализации иммунную клетку хаТКР плюс ХСР (такую как Т-клетка хаТКР плюс ХСР) можно создавать путем внесения одной или более нуклеиновых кислот (включая, например, лентивирусный вектор), кодирующих хаТКР (такой как любой из хаТКР, описанных в данном документе), который специфически связывается с целевым антигеном (таким как связанный с заболеванием антиген), и ХСР (такой как любой из ХСР, описанных в данном документе), который специфически связывается с целевым лигандом, в иммунную клетку. Внесение одной или более нуклеиновых кислот в иммунную клетку можно осуществлять, используя методики, известные в данной области техники, такие как описаны в данном документе для нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации иммунные клетки хаТКР плюс ХСР (такие как Т-клетки хаТКР плюс ХСР) по изобретению способны реплицироваться in vivo, что приводит к длительной персистенции, которая может приводить к продолжительному контролю заболевания, связанного с экспрессией целевого антигена (такого как рак или вирусная инфекция).

[0280] В некоторых вариантах реализации данное изобретение относится к введению генетически модифицированной Т-клетки, экспрессирующей хаТКР, который специфически связывается с целевым антигеном, в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, и ХСР, который специфически связывается с целевым лигандом, в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе, для лечения пациента, имеющего или подвергнутого риску развития заболевания и/или расстройства, связанного с экспрессией целевого антигена (также называемого в данном документе «положительным по целевому антигену» или «TA-положительным» заболеванием или расстройством), включая, например, рак или вирусную инфекцию, используя инфузию лимфоцитов. В некоторых вариантах реализации в лечении используют инфузию аутологичных лимфоцитов. Аутологичные МКПК собирают у пациента, нуждающегося в лечении, а Т-клетки активируют и размножают, используя способы, описанные в данном документе и известные в данной области техники, а затем инфузируют обратно в организм пациента.

[0281] В некоторых вариантах реализации предложена Т-клетка, экспрессирующая хаТКР, который специфически связывается с целевым антигеном, в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, и ХСР, который специфически связывается с целевым лигандом, в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе (также называемым в данном документе «Т-клеткой хаТКР плюс ХСР»). Т-клетки хаТКР плюс ХСР по изобретению могут претерпевать сильное in vivo размножение Т-клеток и могут создавать специфические к целевому антигену клетки памяти, которые постоянно присутствуют на высоком уровне в течение продолжительного периода времени в крови и костном мозге. В некоторых вариантах реализации Т-клетки хаТКР плюс ХСР по изобретению, которые инфузируют в организм пациента, могут уничтожать представляющие целевой антиген клетки, такие как представляющие целевой антиген раковые или инфицированные вирусом клетки, in vivo у пациентов, имеющих заболевание, связанное с целевым антигеном. В некоторых вариантах реализации Т-клетки хаТКР плюс ХСР по изобретению, которые инфузируют в организм пациента, могут уничтожать представляющие целевой антиген клетки, такие как представляющие целевой антиген раковые или инфицированные вирусом клетки, in vivo у пациентов, имеющих заболевание, связанное с целевым антигеном, которое является устойчивым к по меньшей мере одному варианту традиционного лечения.

[0282] Перед размножением и генетической модификацией Т-клеток от субъекта получают источник Т-клеток. Т-клетки можно получать из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из участка инфекции, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения можно использовать любое число Т-клеточных линий, доступных в данной области техники. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения Т-клетки можно получать из единицы цельной крови, полученной от субъекта, используя любое число методик, известных специалисту в данной области техники, таких как разделение FICOLL™. В некоторых вариантах реализации клетки из циркулирующей крови индивида получают путем афереза. Продукт афереза, как правило, содержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядерные белые кровяные тельца, красные кровяные тельца и тромбоциты. В некоторых вариантах реализации клетки, собранные методом афереза, можно промывать для удаления фракции плазмы и помещать клетки в соответствующий буфер или среду для последующей обработки. В некоторых вариантах реализации клетки промывают фосфатно-солевым буфером (ФСБ). В некоторых вариантах реализации промывочный раствор не содержит кальций и может не содержать магний или может не содержать многие, если не все двухвалентные катионы. Как понятно специалисту в данной области техники, стадию промывки можно осуществлять способами, известными специалистам в данной области техники, например, используя полуавтоматизированную «проточную» центрифугу (например, устройство для обработки клеток Cobe 2991, Baxter CytoMate или Haemonetics Cell Saver 5) в соответствии с инструкциями производителя. После промывки клетки можно ресуспендировать в различных биосовместимых буферах, таких как ФСБ без Ca²⁺, без Mg²⁺, PlasmaLyte A, или другие солевые растворы с буфером или без. В альтернативном варианте нежелательные компоненты образца афереза можно удалять, а клетки непосредственно ресуспендировать в культуральной среде.

[0283] В некоторых вариантах реализации Т-клетки выделяют из лимфоцитов периферической крови путем лизиса красных кровяных телец и истощения моноцитов, например, путем центрифугирования в градиенте PERCOLL™ или путем проточного элютриационного центрифугирования. Определенные популяции Т-клеток, таких как CD3⁺, CD28⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD45RA⁺ и CD45RO⁺ Т-клетки, можно дополнительно выделять, используя методики положительного или отрицательного отбора. Например, в некоторых вариантах реализации Т-клетки выделяют путем инкубации с гранулами, конъюгированными с анти-CD3/анти-CD28 (т. е. 3×28), такими как DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, в течение периода времени, достаточного для положительного отбора необходимых Т-клеток. В некоторых вариантах реализации период времени составляет около 30 минут. В некоторых вариантах реализации период времени находится в диапазоне от 30 минут до 36 часов или более (включая все диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах реализации период времени составляет по меньшей мере один, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В некоторых вариантах реализации период времени составляет от 10 до 24 часов. В некоторых вариантах реализации период инкубации составляет 24 часа. В случае выделения Т-клеток из организма пациентов с лейкемией более длительное время инкубации, такое как 24 часа, может увеличить выход клеток. Более длительное время инкубации можно применять для выделения Т-клеток в любой ситуации, когда имеется небольшое количество Т-клеток по сравнению с клетками других типов, например, при выделении опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (ОИЛ) из опухолевой ткани или из организма индивидов с ослабленным иммунитетом. Кроме того, более длительное время инкубации может повышать эффективность захвата CD8⁺Т-клеток. Таким образом, за счет простого уменьшения или увеличения времени, в течение которого Т-клетки могут связываться с CD3/CD28-гранулами, и/или путем увеличения или уменьшения соотношения гранул к Т-клеткам, можно осуществлять предпочтительный положительный или отрицательный отбор субпопуляций Т-клеток в начале культивирования или в другие моменты времени во время процесса. Кроме того, путем увеличения или уменьшения соотношения анти-CD3 и/или анти-CD28 антител на гранулах или другой поверхности можно осуществлять предпочтительный положительный или отрицательный отбор субпопуляций Т-клеток в начале культивирования или в другие необходимые моменты времени. Специалисту в данной области техники понятно, что в контексте этого изобретения также можно использовать некоторое количество раундов отбора. В некоторых вариантах реализации может существовать необходимость в проведении процедуры отбора и применении «неотобранных» клеток в процессе активации и размножения. «Неотобранные» клетки также можно подвергать дополнительным раундам отбора.

[0284] Обогащение популяции Т-клеток за счет отрицательного отбора можно проводить, используя комбинацию антител, направленных на поверхностные маркеры, уникальные для отрицательно отобранных клеток. Одним из способов является сортировка и/или отбор клеток с помощью отрицательной магнитной иммунной адгезии или проточной цитометрии, в которых используется коктейль из моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на отрицательно отобранных клетках. Например, для обогащения CD4+ клеток за счет отрицательного отбора коктейль из моноклональных антител, как правило, содержит антитела к CD 14, CD20, CD11b, CD 16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах реализации может существовать необходимость в обогащении или положительном отборе для регуляторных Т-клеток, которые, как правило, экспрессируют CD4⁺, CD25⁺, CD62Lhi, GITR⁺ и FoxP3⁺. В альтернативном варианте в некоторых вариантах реализации регуляторные Т-клетки истощают с помощью конъюгированных с анти-CD25 гранул или других подобных способов отбора.

[0285] В случае выделения необходимой популяции клеток путем положительного или отрицательного отбора концентрация клеток и поверхности (например, частиц, таких как гранулы) может варьироваться. В некоторых вариантах реализации может существовать необходимость в существенном снижении объема, в котором смешивают вместе гранулы и клетки (т. е. увеличении концентрации клеток), чтобы гарантировать максимальный контакт клеток и гранул. Например, в некоторых вариантах реализации используют концентрацию, составляющую около 2 миллиардов клеток/мл. В некоторых вариантах реализации используют концентрацию, составляющую около 1 миллиарда клеток/мл. В некоторых вариантах реализации используют концентрацию большую, чем около 100 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах реализации используют концентрацию клеток, составляющую около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах реализации используют концентрацию клеток, составляющую около 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах реализации используют концентрацию, составляющую около 125 или около 150 миллионов клеток/мл. Применение высоких концентраций может привести к увеличению выхода клеток, активации клеток и размножению клеток. Кроме того, применение высоких концентраций клеток обеспечивает более эффективный захват клеток, которые могут слабо экспрессировать представляющие интерес целевые антигены, таких как CD28-отрицательные Т-клетки, или клеток из образцов, в которых присутствует много опухолевых клеток (т. е. лейкозная кровь, опухолевая ткань и т. д.). Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность и было бы желательно их получить. Например, применение высокой концентрации клеток позволяет более эффективно проводить отбор CD8⁺ Т-клеток, которые обычно имеют более слабую экспрессию CD28.

[0286] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения Т-клетки получают от пациента непосредственно после лечения. В связи с этим было отмечено, что после определенных вариантов лечения рака, в частности вариантов лечения лекарственными препаратами, которые наносят вред иммунной системе, вскоре после лечения в тот период, когда пациенты обычно восстанавливаются после лечения, качество получаемых Т-клеток может быть оптимальным или улучшенным в отношении их способности к ex vivo размножению. Аналогично, после ex vivo манипуляции с применением способов, описанных в данном документе, эти клетки могут находиться в предпочтительном состоянии для усиления прививания и ex vivo размножения. Таким образом, в контексте настоящего изобретения предполагается собирать клетки крови, включая Т-клетки, дендритные клетки или другие клетки гемопоэтической линии дифференцировки, во время этой фазы восстановления. Дополнительно, в некоторых вариантах реализации можно использовать мобилизацию (например, мобилизацию GM-CSF) и схемы кондиционирования для создания условий в организме субъекта, при которых предпочтение отдается репопуляции, рециркуляции, регенерации и/или размножению конкретных типов клеток, особенно в течение определенного окна времени после терапии. Иллюстративные типы клеток включают Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки и другие клетки иммунной системы.

[0287] Как до, так и после генетической модификации Т-клеток для экспрессии необходимых хаТКР, ХСР и, необязательно, СВЭ, Т-клетки можно активировать и размножать, используя в общем случае способы, описанные, например, в патентах США №№ 6 352 694; 6 534 055; 6 905 680; 6 692 964; 5 858 358; 6 887 466; 6 905 681; 7 144 575; 7 067 318; 7 172 869; 7 232 566; 7 175 843; 5 883 223; 6 905 874; 6 797 514; 6 867 041; и публикации заявки на патент США № 20060121005.

[0288] В общем случае Т-клетки по изобретению размножают путем приведения в контакт с поверхностью с прикрепленным к ней агентом, который стимулирует связанный с комплексом CD3/ТКР сигнал, и лигандом, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности Т-клеток. В частности, популяции Т-клеток можно стимулировать, например, обеспечивая контакт с анти-CD3 антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или анти-CD2 антителом, иммобилизованным на поверхности, или обеспечивая контакт с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в сочетании с кальциевым ионофором. Для совместной стимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток используют лиганд, который связывает вспомогательную молекулу. Например, популяцию Т-клеток можно приводить в контакт с анти-CD3 антителом и анти-CD28 антителом в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации Т-клеток. Для стимуляции пролиферации CD4⁺ Т-клеток или CD8⁺ Т-клеток используют анти-CD3 антитело и анти-CD28 антитело. Примеры анти-CD28 антитела включают 9.3, B-T3, XR-CD28 и их можно использовать, как и другие способы, общеизвестные в данной области техники (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

Генетическая модификация

[0289] В некоторых вариантах реализации иммунные клетки хаТКР плюс ХСР (такие как Т-клетки хаТКР плюс ХСР) по изобретению создают, трансдуцируя иммунные клетки (такие как Т-клетки, полученные способами, описанными в данном документе) одним или более вирусными векторами, кодирующими хаТКР, описанные в данном документе, и ХСР, описанные в данном документе. Системы доставки на основе вирусных векторов включают ДНК- и РНК-вирусы, которые имеют эписомальный или интегрированный геномы после доставки в иммунную клетку. Обзор процедур генной терапии смотрите в Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11 : 167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1 154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(l):31-44 (1995); и Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994). В некоторых вариантах реализации иммунная клетка хаТКР плюс ХСР содержит один или более векторов, интегрированных в геном иммунной клетки хаТКР плюс ХСР. В некоторых вариантах реализации один или более вирусных векторов представляют собой лентивирусные векторы. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка хаТКР плюс ХСР представляет собой Т-клетку хаТКР плюс ХСР, содержащую лентивирусные векторы, интегрированные в ее геном.

[0290] В некоторых вариантах реализации иммунная клетка хаТКР плюс ХСР представляет собой Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии одной или обеих цепей эндогенного ТКР. Например, в некоторых вариантах реализации иммунная клетка хаТКР плюс ХСР представляет собой αβ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей α и/или β ТКР, или же иммунная клетка хаТКР плюс ХСР представляет собой γδ Т-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии цепей γ и/или δ ТКР. Модификации клеток, направленные на нарушение генной экспрессии, включают любые такие способы, известные в данной области техники, включая, например, РНК-интерференцию (например, миРНК, кшРНК, микроРНК), редактирование генов (например, генный нокаут с применением CRISPR или TALEN) и т. п.

[0291] В некоторых вариантах реализации создают Т-клетки хаТКР плюс ХСР со сниженной экспрессией одной или обеих цепей эндогенного ТКР Т-клетки, используя систему CRISPR/Cas. Обзор системы генного редактирования на основе CRISPR/Cas смотрите, например, в Jian W & Marraffini LA, Annu. Rev. Microbiol. 69, 2015; Hsu PD et al., Cell, 157(6):1262-1278, 2014; и O’Connell MR et al., Nature 516: 263-266, 2014. В некоторых вариантах реализации создают Т-клетки хаТКР плюс ХСР со сниженной экспрессией одной или обеих цепей эндогенного ТКР Т-клетки, используя геномное редактирование на основе TALEN.

Обогащение

[0292] В некоторых вариантах реализации предложен способ обогащения гетерогенной популяции клеток иммунными клетками хаТКР плюс ХСР в соответствии с любыми иммунными клетками хаТКР плюс ХСР, описанными в данном документе.

[0293] Конкретную субпопуляцию иммунных клеток хаТКР плюс ХСР (таких как Т-клетки хаТКР плюс ХСР), которые специфически связываются с целевым антигеном и целевым лигандом, можно обогащать методами положительного отбора. Например, в некоторых вариантах реализации иммунные клетки хаТКР плюс ХСР (такие как Т-клетки хаТКР плюс ХСР) обогащают путем инкубации с конъюгированными с целевым антигеном гранулами и/или конъюгированными с целевым лигандом гранулами в течение периода времени, достаточного для положительного отбора необходимых иммунных клеток хаТКР плюс ХСР. В некоторых вариантах реализации период времени составляет около 30 минут. В некоторых вариантах реализации период времени находится в диапазоне от 30 минут до 36 часов или более (включая все диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах реализации период времени составляет по меньшей мере один, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В некоторых вариантах реализации период времени составляет от 10 до 24 часов. В некоторых вариантах реализации период инкубации составляет 24 часа. В случае выделения иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, присутствующих на низких уровнях в гетерогенной популяции клеток, большее время инкубации, такое как 24 часа, может повысить выход клеток. Большее время инкубации можно использовать для выделения иммунных клеток хаТКР плюс ХСР в любой ситуации, когда присутствует мало иммунных клеток хаТКР плюс ХСР по сравнению с клетками других типов. Специалисту в данной области техники понятно, что в контексте этого изобретения также можно использовать некоторое количество раундов отбора.

[0294] В случае выделения необходимой популяции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР путем положительного отбора концентрация клеток и поверхности (например, частиц, таких как гранулы) может варьироваться. В некоторых вариантах реализации может существовать необходимость в существенном снижении объема, в котором смешивают вместе гранулы и клетки (т. е. увеличении концентрации клеток), чтобы гарантировать максимальный контакт клеток и гранул. Например, в некоторых вариантах реализации используют концентрацию, составляющую около 2 миллиардов клеток/мл. В некоторых вариантах реализации используют концентрацию, составляющую около 1 миллиарда клеток/мл. В некоторых вариантах реализации используют концентрацию большую, чем около 100 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах реализации используют концентрацию клеток, составляющую около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах реализации используют концентрацию клеток, составляющую около 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах реализации используют концентрацию, составляющую около 125 или около 150 миллионов клеток/мл. Применение высоких концентраций может привести к увеличению выхода клеток, активации клеток и размножению клеток. Кроме того, применение высоких концентраций клеток обеспечивает более эффективный захват иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, которые могут слабо экспрессировать хаТКР и/или ХСР.

[0295] В некоторых из таких вариантов реализации, описанных в данном документе, обогащение приводит к минимальному истощению иммунных клеток хаТКР плюс ХСР или практически его отсутствию. Например, в некоторых вариантах реализации обогащение приводит к истощению менее чем около 50% (например, менее чем около 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5%) иммунных клеток хаТКР плюс ХСР. Истощение иммунных клеток можно определять любыми средствами, известными в данной области техники, включая любые средства, описанные в данном документе.

[0296] В некоторых из таких вариантов реализации, описанных в данном документе, обогащение приводит к минимальной терминальной дифференцировке иммунных клеток хаТКР плюс ХСР или практически ее отсутствию. Например, в некоторых вариантах реализации обогащение приводит к терминальной дифференцировке менее чем около 50% (например, менее чем около 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5%) иммунных клеток хаТКР плюс ХСР. Терминальную дифференцировку иммунных клеток можно определять любыми средствами, известными в данной области техники, включая любые средства, описанные в данном документе.

[0297] В некоторых из таких вариантов реализации, описанных в данном документе, обогащение приводит к минимальной интернализации хаТКР и/или ХСР или практически его отсутствию на иммунных клетках хаТКР плюс ХСР. Например, в некоторых вариантах реализации обогащение приводит к интернализации менее чем около 50% (например, менее чем около 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5%) хаТКР и/или ХСР на иммунных клетках хаТКР плюс ХСР. Интернализацию хаТКР и/или ХСР на иммунных клетках хаТКР плюс ХСР можно определять любыми средствами, известными в данной области техники, включая любые средства, описанные в данном документе.

[0298] В некоторых из таких вариантов реализации, описанных в данном документе, обогащение приводит к повышению пролиферации иммунных клеток хаТКР плюс ХСР. Например, в некоторых вариантах реализации обогащение приводит к увеличению, составляющему по меньшей мере около 10% (например, по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000% или более), числа иммунных клеток хаТКР плюс ХСР после обогащения.

[0299] Таким образом, в некоторых вариантах реализации предложен способ обогащения гетерогенной популяции клеток в отношении иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, экспрессирующих хаТКР, который специфически связывается с целевым антигеном, и ХСР, который специфически связывается с целевым лигандом, включающий: a) приведение гетерогенной популяции клеток в контакт с первой молекулой, содержащей целевой антиген или один или более эпитопов, содержащихся в нем, и/или второй молекулой, содержащей целевой лиганд или один или более эпитопов, содержащихся в нем, для образования комплексов, содержащих иммунную клетку хаТКР плюс ХСР, связанную с первой молекулой, и/или комплексов, содержащих иммунную клетку хаТКР плюс ХСР, связанную со второй молекулой; и b) отделение комплексов от гетерогенной популяции клеток, тем самым создавая популяцию клеток, обогащенную в отношении иммунных клеток хаТКР плюс ХСР. В некоторых вариантах реализации первая и/или вторая молекулы иммобилизованы, по отдельности, на твердой подложке. В некоторых вариантах реализации твердая подложка состоит из частиц (таких как гранулы). В некоторых вариантах реализации твердая подложка представляет собой поверхность (такую как дно лунки). В некоторых вариантах реализации первая и/или вторая молекулы помечены, по отдельности, меткой. В некоторых вариантах реализации метка представляет собой флуоресцентную молекулу, аффинную метку или магнитную метку. В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает элюирование иммунных клеток хаТКР плюс ХСР из первой и/или второй молекул и восстановление элюата.

Скрининг библиотек

[0300] В некоторых вариантах реализации для выделения кандидатных конструкций хаТКР, специфических к целевому антигену, библиотеку хаТКР, например клетки, экспрессирующие библиотеку нуклеиновых кислот, кодирующих некоторое количество хаТКР, можно подвергать воздействию молекулы захвата, содержащей целевой антиген или один или более эпитопов, содержащихся в нем, с последующим выделением аффинных представителей библиотеки, которые специфически связывают молекулу захвата. В некоторых вариантах реализации молекулу захвата иммобилизуют на твердой подложке. В некоторых вариантах реализации подложка может представлять собой поверхности гранул, микротитровальных планшетов, иммунотрубок или любой материал, известный в данной области техники, подходящий для таких целей. В некоторых вариантах реализации взаимодействие происходит в растворе с меченой молекулой захвата (например, биотинилированной молекулой захвата). В некоторых вариантах реализации процедура включает один или более этапов промывки для удаления неспецифических и нереакционноспособных представителей библиотеки (пэннинг). В некоторых вариантах реализации для очистки комплексов в растворе их собирают путем иммобилизации или путем центрифугирования. В некоторых вариантах реализации проводят захват аффинных представителей на растворимой биотинилированной молекуле захвата с последующей иммобилизацией аффинного комплекса (аффинного представителя и молекулы захвата) на стрептавидиновых гранулах. В некоторых вариантах реализации твердая подложка представляет собой гранулу. В некоторых вариантах реализации гранулы включают, например, магнитные гранулы (например, от Bangs Laboratories, Polysciences inc., Dynal Biotech, Miltenyi Biotech или Quantum Magnetic), немагнитные гранулы (например, Pierce и Upstate technology), монодисперсные гранулы (например, Dynal Biotech и Microparticle Gmbh) и полидисперсные гранулы (например, Chemagen). Применение магнитных гранул было подробно описано в литературе (Uhlen, M, et al (1994) в Advances in Biomagnetic Separation, BioTechniques press, Westborough, MA). В некоторых вариантах реализации проводят очистку аффинных представителей путем положительного отбора. В некоторых вариантах реализации проводят очистку аффинных представителей путем отрицательного отбора для удаления нежелательных представителей библиотеки. В некоторых вариантах реализации проводят очистку аффинных представителей с помощью этапов как положительного, так и отрицательного отбора.

[0301] В некоторых вариантах реализации для выделения кандидатных конструкций хаТКР, специфических к целевому лиганду, библиотеку хаТКР, например клетки, экспрессирующие библиотеку нуклеиновых кислот, кодирующих некоторое количество хаТКР, можно подвергать воздействию молекулы захвата, содержащей целевой лиганд или один или более эпитопов, содержащихся в нем, с последующим выделением аффинных представителей библиотеки, которые специфически связывают молекулу захвата. В некоторых вариантах реализации молекулу захвата иммобилизуют на твердой подложке. В некоторых вариантах реализации подложка может представлять собой поверхности гранул, микротитровальных планшетов, иммунотрубок или любой материал, известный в данной области техники, подходящий для таких целей. В некоторых вариантах реализации взаимодействие происходит в растворе с меченой молекулой захвата (например, биотинилированной молекулой захвата). В некоторых вариантах реализации процедура включает один или более этапов промывки для удаления неспецифических и нереакционноспособных представителей библиотеки (пэннинг). В некоторых вариантах реализации для очистки комплексов в растворе их собирают путем иммобилизации или путем центрифугирования. В некоторых вариантах реализации проводят захват аффинных представителей на растворимой биотинилированной молекуле захвата с последующей иммобилизацией аффинного комплекса (аффинного представителя и молекулы захвата) на стрептавидиновых гранулах. В некоторых вариантах реализации твердая подложка представляет собой гранулу. В некоторых вариантах реализации гранулы включают, например, магнитные гранулы (например, от Bangs Laboratories, Polysciences inc., Dynal Biotech, Miltenyi Biotech или Quantum Magnetic), немагнитные гранулы (например, Pierce и Upstate technology), монодисперсные гранулы (например, Dynal Biotech и Microparticle Gmbh) и полидисперсные гранулы (например, Chemagen). В некоторых вариантах реализации проводят очистку аффинных представителей путем положительного отбора. В некоторых вариантах реализации проводят очистку аффинных представителей путем отрицательного отбора для удаления нежелательных представителей библиотеки. В некоторых вариантах реализации проводят очистку аффинных представителей с помощью этапов как положительного, так и отрицательного отбора.

[0302] В общем случае в основе технологий, применяемых для получения конструкций библиотеки, лежат известные технологии генной инженерии. В связи с этим, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие хаТКР или ХСР, предполагаемые для экспрессии в библиотеке, вносят в экспрессионные векторы, подходящие для используемого типа экспрессионной системы. Подходящие экспрессионные векторы для применения в дисплее в клетках, таких как клетки CD3+, хорошо известны и описаны в данной области техники. Например, в некоторых вариантах реализации экспрессионный вектор представляет собой вирусный вектор, такой как лентивирусный вектор.

[0303] В некоторых вариантах реализации предложена библиотека нуклеиновых кислот, содержащая последовательности, кодирующие множество хаТКР в соответствии с любыми вариантами реализации, описанными в данном документе. В некоторых вариантах реализации библиотека нуклеиновых кислот содержит вирусные векторы, кодирующие множество хаТКР. В некоторых вариантах реализации вирусные векторы представляют собой лентивирусные векторы.

[0304] В некоторых вариантах реализации предложена библиотека нуклеиновых кислот, содержащая последовательности, кодирующие множество ХСР в соответствии с любыми вариантами реализации, описанными в данном документе. В некоторых вариантах реализации библиотека нуклеиновых кислот содержит вирусные векторы, кодирующие множество ХСР. В некоторых вариантах реализации вирусные векторы представляют собой лентивирусные векторы.

[0305] В некоторых вариантах реализации предложен способ скрининга библиотеки нуклеиновых кислот в соответствии с любыми вариантами реализации, описанными в данном документе, в отношении последовательностей, кодирующих хаТКР, специфические к целевому антигену, включающий: a) внесение библиотеки нуклеиновых кислот в множество клеток таким образом, чтобы хаТКР экспрессировались на поверхности множества клеток; b) инкубацию множества клеток с молекулой захвата, содержащей целевой антиген или один или более эпитопов, содержащихся в нем; c) сбор клеток, связанных с молекулой захвата; и d) выделение последовательностей, кодирующих хаТКР, из клеток, собранных на этапе c), тем самым идентифицируя хаТКР, специфические к целевому антигену. В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает один или более этапов промывки. В некоторых вариантах реализации один или более этапов промывки проводят между этапами b) и c). В некоторых вариантах реализации множество клеток представляет собой множество клеток CD3+. В некоторых вариантах реализации молекулу захвата иммобилизуют на твердой подложке. В некоторых вариантах реализации твердая подложка представляет собой гранулу. В некоторых вариантах реализации сбор клеток, связанных с молекулой захвата, включает элюирование клеток с лиганда захвата, связанного с твердой подложкой, и сбор элюата. В некоторых вариантах реализации молекулу захвата метят меткой. В некоторых вариантах реализации метка представляет собой флуоресцентную молекулу, аффинную метку или магнитную метку. В некоторых вариантах реализации сбор клеток, связанных с молекулой захвата, включает выделение комплексов, содержащих клетки и меченый лиганд. В некоторых вариантах реализации клетки диссоциируют от комплексов.

[0306] В некоторых вариантах реализации предложен способ скрининга библиотеки нуклеиновых кислот в соответствии с любыми вариантами реализации, описанными в данном документе, в отношении последовательностей, кодирующих ХСР, специфические к целевому лиганду, включающий: a) внесение библиотеки нуклеиновых кислот в множество клеток таким образом, чтобы ХСР экспрессировались на поверхности множества клеток; b) инкубацию множества клеток с молекулой захвата, содержащей целевой лиганд или один или более эпитопов, содержащихся в нем; c) сбор клеток, связанных с молекулой захвата; и d) выделение последовательностей, кодирующих ХСР, из клеток, собранных на этапе c), тем самым идентифицируя ХСР, специфические к целевому лиганду. В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает один или более этапов промывки. В некоторых вариантах реализации один или более этапов промывки проводят между этапами b) и c). В некоторых вариантах реализации множество клеток представляет собой множество клеток CD3+. В некоторых вариантах реализации молекулу захвата иммобилизуют на твердой подложке. В некоторых вариантах реализации твердая подложка представляет собой гранулу. В некоторых вариантах реализации сбор клеток, связанных с молекулой захвата, включает элюирование клеток с лиганда захвата, связанного с твердой подложкой, и сбор элюата. В некоторых вариантах реализации молекулу захвата метят меткой. В некоторых вариантах реализации метка представляет собой флуоресцентную молекулу, аффинную метку или магнитную метку. В некоторых вариантах реализации сбор клеток, связанных с молекулой захвата, включает выделение комплексов, содержащих клетки и меченый лиганд. В некоторых вариантах реализации клетки диссоциируют от комплексов.

Белки ГКГС

[0307] Белки ГКГС класса I представляют собой один из двух основных классов молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) (другим являются ГКГС класса II) и встречаются практически во всех ядросодержащих клетках организма. Их функция заключается в представлении фрагментов белков из внутренней части клетки Т-клеткам; при этом здоровые клетки игнорируются, тогда как клетки, содержащие чужеродные или мутированные белки подвергаются атаке со стороны иммунной системы. Поскольку белки ГКГС класса I представляют пептиды, полученные из цитозольных белков, путь представления молекул ГКГС класса I часто называют цитозольным или эндогенным путем. Молекулы ГКГС класса I связывают пептиды, образующиеся, главным образом, вследствие деградации цитозольных белков протеасомой. Затем в плазматическую мембрану клетки вводится комплекс ГКГС I:пептид. Пептид связан с внеклеточной частью молекулы ГКГС класса I. Таким образом, функция ГКГС класса I заключается в представлении внутриклеточных белков цитотоксическим Т-клеткам (ЦТЛ). Однако ГКГС класса I также могут представлять пептиды, полученные из экзогенных белков, в процессе, известном как перекрестное представление.

[0308] Белки ГКГС класса I состоят из двух полипептидных цепей, α и β2-микроглобулина (β2M). Две цепи связаны нековалентно посредством взаимодействия β2M и домена α3. Только цепь α является полиморфной и кодируется геном HLA, тогда как субъединица β2M не является полиморфной и кодируется геном β-2 микроглобулина. Домен α3 является трансмембранным и взаимодействует с корецептором CD8 Т-клеток. Взаимодействие α3-CD8 удерживает молекулу ГКГС I на месте, тогда как Т-клеточный рецептор (ТКР) на поверхности цитотоксической Т-клетки связывает его гетеродимерный лиганд α1-α2 и осуществляет проверку связанного пептида в отношении антигенности. Домены α1 и α2 сворачиваются, образуя бороздку для связывания пептидов. Белки ГКГС класса I связывают пептиды, имеющие длину 8-10 аминокислот.

[0309] Молекулы ГКГС класса II представляют собой семейство молекул, обычно встречающихся только на антигенпредставляющих клетках, таких как дендритные клетки, мононуклеарные фагоциты, некоторые эндотелиальные клетки, тимусные эпителиальные клетки и B-клетки. Антигены, представляемые пептидами класса II, получены из внеклеточных белков (не цитозольных, как в случае класса I); следовательно, зависимый от ГКГС класса II путь представления антигенов называют эндоцитарным или экзогенным путем. Загрузка молекулы ГКГС класса II происходит посредством фагоцитоза; внеклеточные белки подвергаются эндоцитозу, расщепляются в лизосомах, а полученные в результате эпитопные пептидные фрагменты загружаются в молекулы ГКГС класса II перед их перемещением на поверхность клеток.

[0310] Как и молекулы ГКГС класса I, молекулы класса II также являются гетеродимерами, но, в данном случае, состоят из двух гомогенных пептидов и α и β цепи. Обозначения α1, α2 и т. д. относятся к отдельным доменам в пределах гена HLA; каждый домен обычно кодируется разными экзонами в гене, а некоторые гены имеют дополнительные домены, которые кодируют лидерные последовательности, трансмембранные последовательности и т. п. Так как антигенсвязывающая бороздка молекул ГКГС класса II открыта в обоих концах, а соответствующая бороздка в молекулах класса I закрыта в каждом конце, антигены, представляемые молекулами ГКГС класса II, длиннее и в общем случая имеют длину от 15 до 24 аминокислотных остатков.

[0311] Гены человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) представляют собой человеческие версии генов ГКГС. Тремя основными белками ГКГС класса I у людей являются HLA-A, HLA-B и HLA-C, тогда как 3 второстепенными являются HLA-E, HLA-F и HLA-G. Тремя основными белками ГКГС класса II, вовлеченными в презентацию антигенов у людей, являются HLA-DP, HLDA-DQ и HLA-DR, тогда как другие белки ГКГС класса II, такие как HLA-DM и HLA-DO, вовлечены во внутренний процессинг и загрузку антигенов. У людей HLA-A является одним из генов с наиболее быстро развивающейся кодирующей последовательностью. По состоянию на декабря 2013 г. существовало 2432 известных аллели HLA-A, кодирующих 1740 активных белков и 117 нулевых белков. Ген HLA-A расположен в коротком плече хромосомы 6 и кодирует большую α-цепь, составляющую часть HLA-A. Вариация α-цепи HLA-A является ключевой для функции HLA. Эта вариация стимулирует генетическое разнообразие в популяции. Так как каждый HLA имеет разную аффинность в отношении пептидов с определенными структурами, большее разнообразие HLA означает большее разнообразие антигенов, которые должны быть «представлены» на клеточной поверхности, что повышает вероятность того, что определенная подгруппа популяции будет резистентной к любому заданному чужеродному агенту. Это снижает вероятность того, что один патоген сможет уничтожить всю человеческую популяцию. Каждый индивид может экспрессировать до двух типов HLA-A, по одному от каждого из своих родителей. Некоторые индивиды наследуют один и тот же HLA-A от обоих родителей, что снижает их индивидуальное разнообразие HLA; однако большинство индивидов получат две разные копии HLA-A. Такая же схема присуща для всех групп HLA. Иными словами, индивид может экспрессировать только одну или две из 2432 известных аллелей HLA-A.

[0312] Всем аллелям приписывается по меньшей мере четырехзначная классификация, например, HLA-A*02:12. A обозначает, к какому гену HLA принадлежит аллель. Существует множество аллелей HLA-A, поэтому классификация по серотипу упрощает категоризацию. Следующая пара цифр указывает это отнесение. Например, HLA-A*02:02, HLA-A*02:04 и HLA-A*02:324, все, являются представителями серотипа A2 (обозначаемого префиксом *02). Эта группа является основным фактором, отвечающим за HLA-совместимость. Все числа после этого нельзя определить с помощью серотипирования, и их определяют путем секвенирования генов. Второй набор цифр указывает на то, какой белок HLA вырабатывается. Они приписаны в порядке обнаружения, и по состоянию на декабря 2013 г. существует 456 разных известных белков HLA-A02 (обозначаемых названиями от HLA-A*02:01 до HLA-A*02:456). Самое короткое возможное название HLA включает оба эти элемента. Каждое дополнение, добавляемое помимо этого, означает нуклеотидное изменение, которое может или не может изменить белок.

[0313] В некоторых вариантах реализации Fab-подобный антигенсвязывающий модуль специфически связывается с комплексом, содержащим пептид, полученный из связанного с заболеванием антигена (такого как опухолеассоциированный или кодируемый вирусом антиген), и белок ГКГС класса I, причем белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F или HLA-G. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A, HLA-B или HLA-C. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-B. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-C. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A01, HLA-A02, HLA-A03, HLA-A09, HLA-A10, HLA-A11, HLA-A19, HLA-A23, HLA-A24, HLA-A25, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A29, HLA-A30, HLA-A31, HLA-A32, HLA-A33, HLA-A34, HLA-A36, HLA-A43, HLA-A66, HLA-A68, HLA-A69, HLA-A74 или HLA-A80. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой любой из HLA-A*02:01-555, такой как HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03, HLA-A*02:04, HLA-A*02:05, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*02:08, HLA-A*02:09, HLA-A*02:10, HLA-A*02:11, HLA-A*02:12, HLA-A*02:13, HLA-A*02:14, HLA-A*02:15, HLA-A*02:16, HLA-A*02:17, HLA-A*02:18, HLA-A*02:19, HLA-A*02:20, HLA-A*02:21, HLA-A*02:22 или HLA-A*02:24. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A*02:01. HLA-A*02:01 экспрессируется у 39-46% из всех представителей европеоидной расы и, следовательно, представляет собой подходящий вариант белка ГКГС класса I для применения в настоящем изобретении.

[0314] В некоторых вариантах реализации Fab-подобный антигенсвязывающий модуль специфически связывается с комплексом, содержащим пептид, полученный из связанного с заболеванием антигена (такого как опухолеассоциированный или кодируемый вирусом антиген), и белок ГКГС класса II, причем белок ГКГС класса II представляет собой HLA-DP, HLA-DQ или HLA-DR. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса II представляет собой HLA-DP. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса II представляет собой HLA-DQ. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса II представляет собой HLA-DR.

[0315] Пептиды, подходящие для применения в создании Fab-подобных антигенсвязывающих модулей, можно определить, например, на основании наличия HLA (таких как HLA-A*02:01)-связывающих мотивов и сайтов расщепления для протеасом и иммунных протеасом, используя компьютерные прогностические модели, известные специалистам в данной области техники. Для прогнозирования сайтов связывания ГКГС такие модели включают, но не ограничиваются этим, ProPred1 (более подробно описанную в Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237, 2001), и SYFPEITHI (see Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93, 2007).

[0316] После идентификации соответствующих пептидов можно проводить синтез пептидов в соответствии с протоколами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Из-за относительно небольшого размера пептиды по изобретению можно непосредственно синтезировать в растворе или на твердой подложке в соответствии с традиционными методиками синтеза пептидов. Различные автоматические синтезаторы являются коммерчески доступными и их можно использовать в соответствии с известными протоколами. Синтез пептидов в фазе раствора стал общепринятой процедурой для крупномасштабного производства синтетических пептидов и, таким образом, является подходящим альтернативным способом получения пептидов по изобретению (смотрите, например, Solid Phase Peptide Synthesis by John Morrow Stewart and Martin et al. Application of Almez-mediated Amidation Reactions to Solution Phase Peptide Synthesis, Tetrahedron Letters Vol. 39, pages 1517-1520, 1998).

Фармацевтические композиции

[0317] В данном документе также предложены композиции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР (такие как фармацевтические композиции, также называемые в данном документе составами), содержащие иммунную клетку (такую как Т-клетка), представляющую на своей поверхности хаТКР в соответствии с любыми хаТКР, описанными в данном документе, и ХСР в соответствии с любыми ХСР, описанными в данном документе. В некоторых вариантах реализации композиция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР представляет собой фармацевтическую композицию.

[0318] Композиция может содержать гомогенную популяцию клеток, содержащую иммунные клетки хаТКР плюс ХСР одного типа и экспрессирующие одинаковые хаТКР и ХСР, или гетерогенную популяцию клеток, содержащую множество популяций иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, содержащих иммунные клетки хаТКР плюс ХСР разных типов, экспрессирующие разные хаТКР и/или экспрессирующие разные ХСР. Композиция может дополнительно содержать клетки, которые не являются иммунными клетками хаТКР плюс ХСРР.

[0319] Таким образом, в некоторых вариантах реализации предложена композиция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, содержащая гомогенную популяцию иммунных клеток хаТКР плюс ХСР (таких как Т-клетки хаТКР плюс ХСР) одного типа и экспрессирующих одинаковые хаТКР и ХСР. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка хаТКР плюс ХСР представляет собой Т-клетку. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка хаТКР плюс ХСР выбрана из группы, состоящей из цитотоксической Т-клетки, хелперной Т-клетки, естественной киллерной T-клетки и супрессорной Т-клетки. В некоторых вариантах реализации композиция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР представляет собой фармацевтическую композицию.

[0320] В некоторых вариантах реализации предложена композиция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, содержащая гетерогенную популяцию клеток, содержащую множество популяций иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, содержащих иммунные клетки хаТКР плюс ХСР разных типов, экспрессирующие разные хаТКР и/или экспрессирующие разные ХСР. В некоторых вариантах реализации иммунные клетки хаТКР плюс ХСР представляют собой Т-клетки. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, независимо от других, принадлежит типу клеток, выбранному из группы, состоящей из цитотоксических Т-клеток, хелперных Т-клеток, естественных киллерных T-клеток и супрессорных Т-клеток. В некоторых вариантах реализации все иммунные клетки хаТКР плюс ХСР в композиции имеют одинаковый тип (например, все иммунные клетки хаТКР плюс ХСР являются цитотоксическими Т-клетками). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР принадлежит отличному типу клеток, чем другие (например, одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР состоит из цитотоксических Т-клеток, а другая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР состоит из естественных киллерных T-клеток). В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует одинаковый хаТКР. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует отличный от других хаТКР. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует отличный от других хаТКР. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с одним и тем же целевым антигеном. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с отличным от других целевым антигеном (например, одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связывается с комплексом бГКГС, а другие популяции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связываются с рецептором клеточной поверхности). В некоторых вариантах реализации, в которых по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с отличным целевым антигеном, каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с целевым антигеном, связанным с одним заболеванием или расстройством (например, каждый из целевых антигенов связан с раком, таким как рак молочной железы). В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует одинаковый ХСР. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует отличный от других ХСР. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует отличный от других ХСР. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с одним и тем же целевым лигандом. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с отличным от других целевым лигандом (например, одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связывается с комплексом бГКГС, а другие популяции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связываются с рецептором клеточной поверхности). В некоторых вариантах реализации, в которых по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с отличным целевым лигандом, каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с целевым лигандом, связанным с одним заболеванием или расстройством (например, каждый из целевых лигандов связан с раком, таким как рак молочной железы). В некоторых вариантах реализации композиция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР представляет собой фармацевтическую композицию.

[0321] Таким образом, в некоторых вариантах реализации предложена композиция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, содержащая множество популяций иммунных клеток хаТКР плюс ХСР в соответствии с любыми вариантами реализации, описанными в данном документе, причем все иммунные клетки хаТКР плюс ХСР в композиции принадлежат одному типу (например, иммунные клетки хаТКР плюс ХСР представляют собой цитотоксические Т-клетки) и причем каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует отличный от других хаТКР. В некоторых вариантах реализации иммунные клетки хаТКР плюс ХСР представляют собой Т-клетки. В некоторых вариантах реализации иммунные клетки хаТКР плюс ХСР выбраны из группы, состоящей из цитотоксических Т-клеток, хелперных Т-клеток, естественных киллерных T-клеток и супрессорных Т-клеток. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с одним и тем же целевым антигеном. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с отличным от других целевым антигеном (например, одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связывается с комплексом бГКГС, а другие популяции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связываются с рецептором клеточной поверхности). В некоторых вариантах реализации, в которых по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с отличным целевым антигеном, каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с целевым антигеном, связанным с одним заболеванием или расстройством (например, каждый из целевых антигенов связан с раком, таким как рак молочной железы). В некоторых вариантах реализации композиция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР представляет собой фармацевтическую композицию.

[0322] В некоторых вариантах реализации предложена композиция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, содержащая множество популяций иммунных клеток хаТКР плюс ХСР в соответствии с любыми вариантами реализации, описанными в данном документе, причем все иммунные клетки хаТКР плюс ХСР в композиции принадлежат одному типу (например, иммунные клетки хаТКР плюс ХСР представляют собой цитотоксические Т-клетки) и причем каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует отличный от других ХСР. В некоторых вариантах реализации иммунные клетки хаТКР плюс ХСР представляют собой Т-клетки. В некоторых вариантах реализации иммунные клетки хаТКР плюс ХСР выбраны из группы, состоящей из цитотоксических Т-клеток, хелперных Т-клеток, естественных киллерных T-клеток и супрессорных Т-клеток. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с одним и тем же целевым лигандом. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с отличным от других целевым лигандом (например, одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связывается с комплексом бГКГС, а другие популяции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связываются с рецептором клеточной поверхности). В некоторых вариантах реализации, в которых по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с отличным целевым лигандом, каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с целевым лигандом, связанным с одним заболеванием или расстройством (например, каждый из целевых лигандов связан с раком, таким как рак молочной железы). В некоторых вариантах реализации композиция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР представляет собой фармацевтическую композицию.

[0323] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая множество популяций иммунных клеток хаТКР плюс ХСР в соответствии с любыми вариантами реализации, описанными в данном документе, причем по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР принадлежит отличному от других типу клеток. В некоторых вариантах реализации все популяции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР принадлежат разным типам. В некоторых вариантах реализации иммунные клетки хаТКР плюс ХСР представляют собой Т-клетки. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, независимо от других, принадлежит типу клеток, выбранному из группы, состоящей из цитотоксических Т-клеток, хелперных Т-клеток, естественных киллерных T-клеток и супрессорных Т-клеток. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует одинаковый хаТКР. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует отличный от других хаТКР. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует отличный от других хаТКР. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с одним и тем же целевым антигеном. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с отличным от других целевым антигеном (например, одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связывается с комплексом бГКГС, а другие популяции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связываются с рецептором клеточной поверхности). В некоторых вариантах реализации, в которых по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с отличным целевым антигеном, каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует хаТКР, который специфически связывается с целевым антигеном, связанным с одним заболеванием или расстройством (например, каждый из целевых антигенов связан с раком, таким как рак молочной железы). В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует одинаковый ХСР. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует отличный от других ХСР. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует отличный от других ХСР. В некоторых вариантах реализации каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с одним и тем же целевым лигандом. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с отличным от других целевым лигандом (например, одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связывается с комплексом бГКГС, а другие популяции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР специфически связываются с рецептором клеточной поверхности). В некоторых вариантах реализации, в которых по меньшей мере одна популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с отличным целевым лигандом, каждая популяция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР экспрессирует ХСР, который специфически связывается с целевым лигандом, связанным с одним заболеванием или расстройством (например, каждый из целевых лигандов связан с раком, таким как рак молочной железы). В некоторых вариантах реализации композиция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР представляет собой фармацевтическую композицию.

[0324] В различные моменты во время приготовления композиции может быть необходимо или предпочтительно осуществлять криоконсервацию клетки. Термины «замороженный/замораживание» и «криоконсервированный/криоконсервация» могут употребляться взаимозаменяемо. Замораживание включает сублимационную сушку.

[0325] Как понятно специалисту в данной области техники, замораживание клеток может быть разрушительным (смотрите Mazur, P., 1977, Cryobiology 14:251-272), но существует множество процедур для предотвращения такого повреждения. Например, повреждения можно избежать посредством (а) применения криозащитного агента, (b) регуляции скорости замораживания и/или (c) хранения при температуре, достаточно низкой для сведения к минимуму реакций разложения. Примеры криозащитных агентов включают диметилсульфоксид (ДМСО) (Lovelock and Bishop, 1959, Nature 183:1394-1395; Ashwood-Smith, 1961, Nature 190:1204-1205), глицерин, поливинилпирролидин (Rinfret, 1960, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85:576), полиэтиленгликоль (Sloviter and Ravdin, 1962, Nature 196:548), альбумин, декстран, сахарозу, этиленгликоль, i-эритрит, D-рибит, D-маннит (Rowe et al., 1962, Fed. Proc. 21:157), D-сорбит, i-инозитол, D-лактозу, холина хлорид (Bender et al., 1960, J. Appl. Physiol. 15:520), аминокислоты (Phan The Tran and Bender, 1960, Exp. Cell Res. 20:651), метанол, ацетамид, моноацетат глицерина (Lovelock, 1954, Biochem. J. 56:265) и неорганические соли (Phan The Tran and Bender, 1960, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104:388; Phan The Tran and Bender, 1961, in Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, llbery ed., Butterworth, London, p. 59). В конкретных вариантах реализации можно использовать ДМСО. Добавление плазмы (например, в концентрации 20-25%) может усиливать защитное действие ДМСО. После добавления ДМСО клетки можно поддерживать при 0°C до замораживания, так как концентрации ДМСО, составляющие 1%, могут быть токсичными при температурах выше 4 °C.

[0326] При криоконсервации клеток важную роль могут играть медленные регулируемые скорости охлаждения, а разные криозащитные агенты (Rapatz et al., 1968, Cryobiology 5(1): 18-25) и разные типы клеток имеют разные оптимальные скорости охлаждения (смотрите, например, Rowe and Rinfret, 1962, Blood 20:636; Rowe, 1966, Cryobiology 3(1):12-18; Lewis, et al., 1967, Transfusion 7(1):17-32; и Mazur, 1970, Science 168:939-949 в отношении действия скорости охлаждения на выживаемость стволовых клеток и их трансплантационный потенциал). Температура фазы слияния, при которой вода превращается в лед, должна быть минимальной. Процедуру охлаждения можно проводить, используя, например, программируемое замораживающее устройство или процедуру с метаноловой баней. Программируемые замораживающие устройства позволяют определять оптимальные скорости охлаждения и облегчают осуществление стандартного воспроизводимого охлаждения.

[0327] В конкретных вариантах реализации обработанные ДМСО клетки можно предварительно охлаждать на льду и переносить в лоток, содержащий охлажденный метанол, который, в свою очередь, помещают в механический холодильник (например, Harris или Revco) при -80°C. Измерения, проводимые с помощью термопары в метаноловой бане и образцах, указывают на то, что предпочтительной может быть скорость охлаждения от 1° до 3 °C/минута. Через по меньшей мере два часа образцы могут достигать температуры -80 °C и их можно помещать непосредственно в жидкий азот (-196 °C).

[0328] После тщательного замораживания клетки можно быстро перенести в сосуд для долгосрочного криогенного хранения. В предпочтительном варианте реализации образцы можно криогенно хранить в жидком азоте (-196 °C) или паре (-1 °C). Такое хранение облегчается наличием высокоэффективных холодильников с охлаждением жидким азотом.

[0329] Дополнительные аспекты и процедуры для обработки, криоконсервации и долгосрочного хранения клеток можно найти в следующих типовых ссылках: патенты США №№ 4 199 022; 3 753 357; и 4 559 298; Gorin, 1986, Clinics In Haematology 15(1):19-48; Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscow, July 22-26, 1968, International Atomic Energy Agency, Vienna, pp. 107- 186; Livesey and Linner, 1987, Nature 327:255; Linner et al., 1986, J. Histochem. Cytochem. 34(9):1 123-1 135; Simione, 1992, J. Parenter. Sci. Technol. 46(6):226-32).

[0330] После криоконсервации замороженные клетки можно размораживать для применения в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники. Замороженные клетки предпочтительно размораживают быстро и охлаждают незамедлительно после размораживания. В конкретных вариантах реализации флакон, содержащий замороженные клетки, можно погружать по горлышко в теплую водяную баню; плавное вращение гарантирует смешивание клеточной суспензии по мере ее размораживания и увеличение теплопередачи от теплой воды ко внутренней массе льда. Как только лед полностью растает, флакон можно незамедлительно поместить на лед.

[0331] В конкретных вариантах реализации способы можно применять для предотвращения агрегации клеток во время размораживания. Типовые способы включают: добавление до и/или после замораживания ДНКазы (Spitzer et al., 1980, Cancer 45:3075-3085), низкомолекулярного декстрана и цитрата, гидроксиэтилкрахмала (Stiff et al., 1983, Cryobiology 20:17-24) и т. д. [0162] Как будет понятно специалисту в данной области техники, при применении криозащитного агента, токсичного для человека, его следует удалить перед терапевтическим применением. ДМСО не обладает серьезной токсичностью.

[0332] Примеры носителей и схем введения клеток описаны на страницах 14-15 в публикации патента США № 2010/0183564. Дополнительные фармацевтические носители описаны в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21 st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005).

[0333] В конкретных вариантах реализации клетки можно собирать из культуральной среды, промывать и концентрировать в носитель в терапевтически эффективном количестве. Типовые носители включают солевой раствор, буферный солевой раствор, физиологический солевой раствор, воду, раствор Хэнкса, раствор Рингера, Nonnosol-R (Abbott Labs), Plasma-Lyte A(R) (Baxter Laboratories, Inc., Morton Grove, IL), глицерин, этанол и их комбинации.

[0334] В конкретных вариантах реализации носители можно дополнять человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) или другими компонентами человеческой сыворотки или фетальной бычьей сывороткой. В конкретных вариантах реализации носитель для инфузии включает буферный солевой раствор с 5% ЧСА или декстрозой. Дополнительные изотонические агенты включают многоатомные сахарные спирты, включая трехатомные или высшие сахарные спирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит или маннит.

[0335] Носители могут включать буферные агенты, такие как цитратные буферы, сукцинатные буферны, тартратные буферы, фумаратные буферы, глюконатные буферы, оксалатные буферы, лактатные буферы, ацетатные буферы, фосфатные буферы, гистидиновые буферы и/или соли триметиламина.

[0336] Стабилизаторы относятся к широкой категории наполнителей, которые могут варьироваться по функции от объемообразующего агента до добавки, которая помогает предотвращать прилипание клеток к стенкам контейнера. Типичные стабилизаторы могут включать многоатомные сахарные спирты; аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота и треонин; органические сахара или сахарные спирты, такие как лактоза, трегалоза, стахиоза, маннит, сорбит, ксилит, рибит, миоинозит, галактит, глицерин и циклиты, такие как инозит; ПЭГ; аминокислотные полимеры; серосодержащие восстанавливающие агенты, такие как мочевина, глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолят натрия, тиоглицерин, альфа-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные полипептиды (т. е. < 10 остатков); белки, такие как ЧСА, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза и глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза и сахароза; трисахариды, такие как рафиноза, и полисахариды, такие как декстран.

[0337] Если это необходимо или целесообразно, композиции могут содержать местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции.

[0338] Типовые консерванты включают фенол, бензиловый спирт, мета-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, хлорид октадецилдиметилбензиламмония, галиды бензалкония, хлорид гексаметания, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехол, циклогексанол и 3-пентанол.

[0339] Терапевтически эффективные количества клеток в композициях могут составлять более чем 10² клеток, более чем 10³ клеток, более чем 10⁴ клеток, более чем 10⁵ клеток, более чем 10⁶ клеток, более чем 10⁷ клеток, более чем 10⁸ клеток, более чем 10⁹ клеток, более чем 10¹⁰ клеток или более чем 10¹¹ клеток.

[0340] В композициях и составах, описанных в данном документе, клетки в общем случае находятся в объеме, составляющем литр или менее, 500 мл или менее, 250 мл или менее или 100 мл или менее. Таким образом, плотность вводимых клеток, как правило, составляет более чем 10⁴ клеток/мл, 10⁷ клеток/мл или 10⁸ клеток/мл.

[0341] В данном документе также предложены композиции нуклеиновых кислот (такие как фармацевтические композиции, также называемые в данном документе составами), содержащие любую из нуклеиновых кислот, кодирующих хаТКР и/или ХСР и/или СВЭ, описанные в данном документе. В некоторых вариантах реализации композиция нуклеиновой кислоты представляет собой фармацевтическую композицию. В некоторых вариантах реализации композиция нуклеиновой кислоты дополнительно содержит любой из изотонического агента, наполнителя, разбавителя, загустителя, стабилизатора, буфера и/или консерванта; и/или водный носитель, такой как очищенная вода, водный сахарный раствор, буферный раствор, физиологический солевой раствор, водный раствор полимера или не содержащая РНКазу вода. Количества таких добавок и водных носителей, которые необходимо добавить, можно удобно выбирать в соответствии с формой применения композиции нуклеиновой кислоты.

[0342] Композиции и составы, описанные в данном документе, можно получать для введения, например, путем инъекции, инфузии, перфузии или лаважа. Композиции и составы можно дополнительно готовить для инъекции в костный мозг, внутривенной, внутрикожной, внутриартериальной, внутриузловой, внутрилимфатической, внутрибрюшинной, внутриочаговой, интрапростатической, внутривагинальной, ректальной, местной, интратекальной, внутриопухолевой, внутримышечной, внутрипузырной и/или подкожной инъекции.

[0343] Составы, предназначенные для применения для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществить, например, путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны.

Способы лечения с помощью иммунных клеток хаТКР плюс ХСР

[0344] Иммунные клетки хаТКР плюс ХСР по изобретению можно вводить индивидам (например, млекопитающим, таким как люди) для лечения заболевания и/или расстройства, связанного с экспрессией целевого антигена (TA) (также называемого в данном документе «положительным в отношении целевого антигена» или «TA-положительным» заболеванием или расстройством), включая, например, рак и инфекционное заболевание (такое как вирусная инфекция). Таким образом, в некоторых вариантах реализации предложен способ лечения положительного в отношении целевого антигена заболевания (такого как рак или вирусная инфекция) у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции (такой как фармацевтическая композиция), содержащей иммунные клетки хаТКР плюс ХСР, в соответствии с любыми вариантами реализации, описанными в данном документе. В некоторых вариантах реализации рак выбран, например, из группы, состоящей из адренокортикальной карциномы, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиокарциномы, колоректального рака, рака пищевода, глиобластомы, глиомы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака головы и шеи, рака почки, лейкоза, рака легкого, лимфомы, меланомы, мезотелиомы, множественной миеломы, рака поджелудочной железы, феохромоцитомы, плазмацитомы, нейробластомы, рака яичника, рака предстательной железы, саркомы, рака желудка, рака матки и рака щитовидной железы. В некоторых вариантах реализации вирусная инфекция вызвана вирусом, выбранным, например, из группы, состоящей из цитомегаловируса (CMV), вируса Эпштейна-Барр (EBV), вируса гепатита B (HBV), герпесвируса, ассоциированного с саркомой Капоши (KSHV), папилломавируса человека (HPV), вируса контагиозного моллюска (MCV), вируса Т-клеточного лейкоза человека 1 (HTLV-1), HIV (вируса иммунодефицита человека) и вируса гепатита C (HCV).

[0345] Например, в некоторых вариантах реализации предложен способ лечения связанного с целевым антигеном заболевания (такого как рак или вирусная инфекция) у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции, содержащей иммунные клетки (такие как Т-клетки или естественные клетки-киллеры), представляющие на своей поверхности a) хаТКР, содержащий i) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей меру одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, и ii) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР; и b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий i) лиганд-связывающий домен, который специфически связывается с целевым лигандом, ii) трансмембранный домен, и iii) внутриклеточный сигнальный домен, способный обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке. В некоторых вариантах реализации оба ТКР-ТМ встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе. В некоторых вариантах реализации ТКР представляет собой αβ ТКР, а первый и второй ТКР-ТМ получены из трансмембранных доменов субъединиц α и β ТКР. В некоторых вариантах реализации ТКР представляет собой γδ ТКР, а первый и второй ТКР-ТМ получены из трансмембранных доменов субъединиц γ и δ ТКР. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый соединительный пептид ТКР или его фрагмент и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй соединительный пептид ТКР или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации первый соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, или его вариант, и/или второй соединительный пептид содержит весь или часть соединительного пептида субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ, или его вариант. В некоторых вариантах реализации первый и второй соединительные пептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР дополнительно содержит первый внутриклеточный домен ТКР и/или второй ДТКР дополнительно содержит второй внутриклеточный домен ТКР. В некоторых вариантах реализации первый внутриклеточный домен ТКР содержит последовательность из внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, и/или второй внутриклеточный домен ТКР содержит последовательность из внутриклеточного домена субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ДТКР представляет собой фрагмент субъединицы ТКР, из которой получен первый ТКР-ТМ, и/или второй ДТКР представляет собой фрагмент субъединицы ТКР, из которой получен второй ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один вспомогательный внутриклеточный домен, содержащий T-клеточную костимулирующую сигнальную последовательность (такую как из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 или CD40). В некоторых вариантах реализации хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации первый и второй домены стабилизации содержат домены антитела, такие как домены C_H1 и C_L антитела, или их варианты. В некоторых вариантах реализации МТКР способен рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ. В некоторых вариантах реализации МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены Т-клеточного рецептора. В некоторых вариантах реализации МТКР стимулирует образование комплекса хаТКР-CD3. В некоторых вариантах реализации между любыми двумя модулями или доменами хаТКР присутствует спейсерный модуль. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим (например, биспецифическим). В некоторых вариантах целевой антиген представляет собой антиген клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации антиген клеточной поверхности выбран из группы, состоящей из белка, углевода и липида. В некоторых вариантах реализации антиген клеточной поверхности представляет собой связанный с заболеванием антиген, такой как опухолеассоциированный антиген или кодируемый вирусом антиген. В некоторых вариантах реализации антиген клеточной поверхности представляет собой CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D или FCRL5. В некоторых вариантах целевой антиген представляет собой представляемый на поверхности комплекс пептид/ГКГС. В некоторых вариантах реализации комплекс пептид/ГКГС содержит пептид, полученный из связанного с заболеванием антигена (такого как опухолеассоциированный или кодируемый вирусом антиген), и белок ГКГС. В некоторых вариантах реализации комплекс пептид/ГКГС содержит пептид и белок ГКГС, причем пептид получен из белка, выбранного из группы, состоящей из WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A и PSA. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС представляет собой белок ГКГС класса I. В некоторых вариантах реализации белок ГКГС класса I представляет собой HLA-A. В некоторых вариантах реализации HLA-A представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах реализации HLA-A02 представляет собой HLA-A*02:01. В некоторых вариантах целевой лиганд ХСР представляет собой антиген клеточной поверхности. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой комплекс пептид/ГКГС. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд ХСР и целевой антиген хаТКР являются одинаковыми. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд и целевой антиген являются разными. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с заболеванием лиганд. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с раком лиганд. В некоторых вариантах реализации связанный с раком лиганд представляет собой, например, CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D или FCRL5. В некоторых вариантах реализации связанный с раком лиганд представляет собой комплекс пептид/ГКГС, содержащий пептид, полученный из белка, включая WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A и PSA. В некоторых вариантах целевой лиганд представляет собой связанный с вирусом лиганд. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой молекулу иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах реализации молекула иммунной контрольной точки включает PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40 и GAL9. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой апоптотическую молекулу. В некоторых вариантах реализации апоптотическая молекула включает FasL, FasR, TNFR1 и TNFR2. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен фрагмента антитела представляет собой Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен представляет собой (или получен из) весь или часть внеклеточного домена рецептора для целевого лиганда. В некоторых вариантах реализации рецептор включает, например, FasR, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27 и TIM-3. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен ХСР содержит трансмембранный домен, полученный из, например, CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154. В некоторых вариантах реализации костимулирующий домен ХСР содержит, состоит преимущественно из или состоит из всего или части внутриклеточного домена костимулирующей молекулы иммунной клетки, включая, например, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, лимфоцитарный функциональный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83, и т. п. В некоторых вариантах реализации ХСР дополнительно содержит спейсерный домен между любыми из лиганд-связывающего домена, трансмембранного домена и костимулирующего сигнального домена. В некоторых вариантах реализации спейсерный домен содержит пептидный линкер, соединяющий два домена ХСР. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой γδ Т-клетку. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка представляет собой αβ T-клетку, модифицированную для блокирования или снижения экспрессии α и/или β цепей ТКР. В некоторых вариантах реализации иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической Т-клетки, хелперной Т-клетки, естественной киллерной T-клетки и супрессорной Т-клетки.

[0346] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения связанного с целевым антигеном заболевания (такого как рак или вирусная инфекция) у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции, содержащей иммунные клетки (такие как Т-клетки или естественные клетки-киллеры), представляющие на своей поверхности a) хаТКР, который специфически связывает целевой антиген, содержащий i) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов встречающегося в природе αβ ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена встречающегося в природе αβ ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей меру одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, и ii) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР; и b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий i) лиганд-связывающий домен, который специфически связывается с целевым лигандом, ii) трансмембранный домен, и iii) внутриклеточный сигнальный домен, способный обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке.

[0347] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения связанного с целевым антигеном заболевания (такого как рак или вирусная инфекция) у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции, содержащей иммунные клетки (такие как Т-клетки или естественные клетки-киллеры), представляющие на своей поверхности a) хаТКР, который специфически связывает целевой антиген, содержащий i) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из одного из трансмембранных доменов встречающегося в природе γδ ТКР, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из другого трансмембранного домена встречающегося в природе γδ ТКР, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей меру одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу, и ii) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР; и b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий i) лиганд-связывающий домен, который специфически связывается с целевым лигандом, ii) трансмембранный домен, и iii) внутриклеточный сигнальный домен, способный обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке.

[0348] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения связанного с целевым антигеном заболевания (такого как рак или вирусная инфекция) у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции, содержащей иммунные клетки (такие как Т-клетки или естественные клетки-киллеры), представляющие на своей поверхности a) хаТКР, который специфически связывает целевой антиген, содержащий i) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР; и b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий i) лиганд-связывающий домен, который специфически связывается с целевым лигандом, ii) трансмембранный домен, и iii) внутриклеточный сигнальный домен, способный обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит, независимо от других, одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из первого ТКР-ТМ и/или второго ТКР-ТМ содержит, независимо от другого, не более 5 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными последовательностями, из которых они получены. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот в первом ТКР-ТМ расположена так, что в пределах хаТКР она может взаимодействовать с по меньшей мере одной из замещенных аминокислот во втором ТКР-ТМ.

[0349] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения связанного с целевым антигеном заболевания (такого как рак или вирусная инфекция) у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции, содержащей иммунные клетки (такие как Т-клетки или естественные клетки-киллеры), представляющие на своей поверхности a) хаТКР, который специфически связывает целевой антиген, содержащий i) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, полученный из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, полученный из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР; и b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий i) лиганд-связывающий домен, который специфически связывается с целевым лигандом, ii) трансмембранный домен, и iii) внутриклеточный сигнальный домен, способный обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит, независимо от других, одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из первого ТКР-ТМ и/или второго ТКР-ТМ содержит, независимо от другого, не более 5 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотными последовательностями, из которых они получены. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации каждый из ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой он получен. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из замещенных аминокислот в первом ТКР-ТМ расположена так, что в пределах хаТКР она может взаимодействовать с по меньшей мере одной из замещенных аминокислот во втором ТКР-ТМ. В некоторых вариантах реализации первый ТКР-ТМ и второй ТКР-ТМ выбраны в соответствии с любым из хаТКР, перечисленных в Таблице 2. В некоторых вариантах реализации домены ХСР выбраны в соответствии с любым из ХСР, перечисленных в Таблице 3.

[0350] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения связанного с целевым антигеном заболевания (такого как рак или вирусная инфекция) у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции, содержащей иммунные клетки (такие как Т-клетки или естественные клетки-киллеры), представляющие на своей поверхности a) хаТКР, который специфически связывает целевой антиген, содержащий i) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном, причем антигенсвязывающий модуль связан с первым и/или вторым ДТКР; и b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий i) лиганд-связывающий домен, который специфически связывается с целевым лигандом, ii) трансмембранный домен и iii) фрагмент костимулирующей молекулы иммунной клетки (фКСМ), содержащий внутриклеточный сигнальный домен, который способен обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке, причем фрагмент костимулирующей молекулы содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 51-56 и 86-89. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен ХСР получен из CD8. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент трансмембранного белка (фТМБ), причем фрагмент трансмембранного белка содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит спейсерный пептид после лиганд-связывающего домена. В некоторых вариантах реализации спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103 или 104. В некоторых вариантах реализации домены ХСР выбраны в соответствии с любым из ХСР, перечисленных в Таблице 3. В некоторых вариантах реализации целевой антиген представляет собой CD19. В некоторых вариантах реализации целевой лиганд представляет собой CD19. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль хаТКР представляет собой Fab-подобный антигенсвязывающий фрагмент, содержащий домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59. В некоторых вариантах реализации целевой антиген представляет собой CD19, и целевой лиганд представляет собой CD19. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен ХСР представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах реализации целевой антиген представляет собой CD19, а целевой лиганд представляет собой CD20. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен ХСР представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах реализации целевой антиген представляет собой комплекс пептид/ГКГС AFP (например, комплекс AFP158/HLA-A02), а целевой лиганд представляет собой GPC3. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий модуль хаТКР представляет собой Fab-подобный антигенсвязывающий фрагмент, содержащий домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен ХСР представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79.

[0351] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения связанного с целевым антигеном CD19 заболевания (такого как рак) у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции, содержащей иммунные клетки (такие как Т-клетки или естественные клетки-киллеры), представляющие на своей поверхности a) хаТКР, который специфически связывает CD19, содержащий i) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) a Fab-подобный антигенсвязывающий модуль, содержащий первую цепь Fab, содержащую домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и вторую цепь Fab, содержащую домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, причем первая цепь Fab связана с одним из первого и второго ДТКР, а вторая цепь Fab связана с другим ДТКР; и b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий i) scFv, который специфически связывает CD19, содержащий домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, ii) трансмембранный домен и iii) фрагмент костимулирующей молекулы иммунной клетки (фКСМ), содержащий внутриклеточный сигнальный домен, который способен обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке, причем фрагмент костимулирующей молекулы содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 51-56 и 86-89. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен ХСР получен из CD8. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент трансмембранного белка (фТМБ), причем фрагмент трансмембранного белка содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит спейсерный пептид после лиганд-связывающего домена. В некоторых вариантах реализации спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103 или 104. В некоторых вариантах реализации домены ХСР выбраны в соответствии с любым из ХСР, перечисленных в Таблице 3. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен ХСР представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах реализации CD19-ассоциированное заболевание представляет собой лейкоз, например, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ).

[0352] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения CD19/CD20-ассоциированного заболевания (такого как рак) у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции, содержащей иммунные клетки (такие как Т-клетки или естественные клетки-киллеры), представляющие на своей поверхности a) хаТКР, который специфически связывает CD19, содержащий i) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) a Fab-подобный антигенсвязывающий модуль, содержащий первую цепь Fab, содержащую домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и вторую цепь Fab, содержащую домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, причем первая цепь Fab связана с одним из первого и второго ДТКР, а вторая цепь Fab связана с другим ДТКР; и b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий i) scFv, который специфически связывает CD20, содержащий домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, ii) трансмембранный домен и iii) фрагмент костимулирующей молекулы иммунной клетки (фКСМ), содержащий внутриклеточный сигнальный домен, который способен обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке, причем фрагмент костимулирующей молекулы содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 51-56 и 86-89. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен ХСР получен из CD8. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент трансмембранного белка (фТМБ), причем фрагмент трансмембранного белка содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит спейсерный пептид после лиганд-связывающего домена. В некоторых вариантах реализации спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103 или 104. В некоторых вариантах реализации домены ХСР выбраны в соответствии с любым из ХСР, перечисленных в Таблице 3. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен ХСР представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81.

[0353] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения AFP/GPC3-ассоциированного заболевания (такого как рак, например, рак печени) у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции, содержащей иммунные клетки (такие как Т-клетки или естественные клетки-киллеры), представляющие на своей поверхности a) хаТКР, который специфически связывает комплекс пептид/ГКГС AFP (например, комплекс AFP158/HLA-A02), содержащий i) первый ДТКР, содержащий первый ТКР-ТМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, причем первый и второй ДТКР образуют МТКР, способный рекрутировать по меньшей мере одну ТКР-ассоциированную сигнальную молекулу; и b) a Fab-подобный антигенсвязывающий модуль, содержащий первую цепь Fab, содержащую домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, и вторую цепь Fab, содержащую домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, причем первая цепь Fab связана с одним из первого и второго ДТКР, а вторая цепь Fab связана с другим ДТКР; и b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий i) scFv, который специфически связывает GPC3, содержащий домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, ii) трансмембранный домен и iii) фрагмент костимулирующей молекулы иммунной клетки (фКСМ), содержащий внутриклеточный сигнальный домен, который способен обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке, причем фрагмент костимулирующей молекулы содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 51-56 и 86-89. В некоторых вариантах реализации трансмембранный домен ХСР получен из CD8. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит фрагмент трансмембранного белка (фТМБ), причем фрагмент трансмембранного белка содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах реализации ХСР содержит спейсерный пептид после лиганд-связывающего домена. В некоторых вариантах реализации спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103 или 104. В некоторых вариантах реализации домены ХСР выбраны в соответствии с любым из ХСР, перечисленных в Таблице 3. В некоторых вариантах реализации лиганд-связывающий домен ХСР представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82.

[0354] Также предусмотрены способы лечения связанного с целевым антигеном заболевания у нуждающегося в этом индивида, включающие введение индивиду композиции, содержащей множество иммунных клеток, экспрессирующих разные хаТКР и/или разные ХСР. Таким образом, в некоторых вариантах реализации в соответствии с любыми способам лечения связанного с целевым антигеном заболевания у индивида, описанными в данном документе, композиция представляет собой гетерогенную композицию иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, описанную в данном документе.

[0355] В некоторых вариантах реализации индивид представляет собой млекопитающее (например, человека, отличного от человека примата, крысу, мышь, корову, лошадь, свинью, овцу, козу, собаку, кошку и т. д.). В некоторых вариантах реализации индивид представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации индивид является клиническим пациентом, добровольцем, участвующим в клиническом исследовании, экспериментальным животным и т. д. В некоторых вариантах реализации возраст индивида составляет менее чем около 60 лет (включая, например, менее чем около 50, 40, 30, 25, 20, 15 или 10 лет). В некоторых вариантах реализации возраст индивида составляет более чем около 60 лет (включая, например, более чем около 70, 80, 90 или 100 лет). В некоторых вариантах реализации у индивида диагностировано одно или более заболеваний или расстройств, описанных в данном документе (таких как рак или вирусная инфекция), или же он предрасположен к ним по причине окружающих условий или наследственности. В некоторых вариантах реализации индивид имеет один или более факторов риска, связанных с одним или более заболеваниями или расстройствами, описанными в данном документе.

[0356] В некоторых вариантах реализации композиции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР по изобретению вводят в комбинации со вторым, третьим или четвертым агентом (включая, например, антинеопластический агент, ингибирующий рост агент, цитотоксический агент или химиотерапевтический агент) для лечения заболеваний или расстройств, связанных с экспрессией целевого антигена. В некоторых вариантах реализации композицию иммунных клеток хаТКР плюс ХСР вводят в комбинации с цитокином (таким как IL-2). В некоторых вариантах реализации композицию иммунных клеток хаТКР плюс ХСР вводят в комбинации с агентом, который повышает экспрессию белков ГКГС и/или повышает поверхностное представление пептидов белками ГКГС. В некоторых вариантах реализации агент включает, например, агонисты рецептора IFN, ингибиторы Hsp90, энхансеры экспрессии p53 и химиотерапевтические агенты. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой агонист рецептора IFN, включая, например, IFNγ, IFNβ и IFNα. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой ингибитор Hsp90, включая, например, танеспимицин (17-AAG), альвеспимицин (17-DMAG), ретаспимицин (IPI-504), IPI-493, CNF2024/BIIB021, MPC-3100, Debio 0932 (CUDC-305), PU-H71, ганетеспиб (STA-9090), NVP-AUY922 (VER-52269), HSP990, KW-2478, AT13387, SNX-5422, DS-2248 и XL888. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой энхансер экспрессии p53, включая, например, 5-фторурацил и нутлин-3. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой химиотерапевтический агент, включая, например, топотекан, этопозид, цисплатин, паклитаксел и винбластин.

[0357] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения положительного в отношении целевого антигена заболевания у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду композиции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР в соответствии с любыми вариантами реализации, описанными в данном документе, в комбинации с цитокином (таким как IL-2). В некоторых вариантах реализации композицию иммунных клеток хаТКР плюс ХСР и цитокин вводят одновременно. В некоторых вариантах реализации композицию иммунных клеток хаТКР плюс ХСР и цитокин вводят последовательно.

[0358] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения положительного в отношении целевого антигена заболевания у нуждающегося в этом индивида, причем клетки, экспрессирующие целевой антиген, обычно не представляют или представляют на относительно низких уровнях комплекс, содержащий целевой антиген и белок ГКГС класса I, на своей поверхности, причем способ включает введение индивиду композиций иммунных клеток хаТКР плюс ХСР в соответствии с любыми вариантами реализации, описанными в данном документе, в комбинации с агентом, который повышает экспрессию белков ГКГС класса I и/или повышает поверхностное представление целевого антигена белками ГКГС класса I. В некоторых вариантах реализации агент включает, например, агонисты рецептора IFN, ингибиторы Hsp90, энхансеры экспрессии p53 и химиотерапевтические агенты. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой агонист рецептора IFN, включая, например, IFNγ, IFNβ и IFNα. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой ингибитор Hsp90, включая, например, танеспимицин (17-AAG), альвеспимицин (17-DMAG), ретаспимицин (IPI-504), IPI-493, CNF2024/BIIB021, MPC-3100, Debio 0932 (CUDC-305), PU-H71, ганетеспиб (STA-9090), NVP-AUY922 (VER-52269), HSP990, KW-2478, AT13387, SNX-5422, DS-2248 и XL888. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой энхансер экспрессии p53, включая, например, 5-фторурацил и нутлин-3. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой химиотерапевтический агент, включая, например, топотекан, этопозид, цисплатин, паклитаксел и винбластин. В некоторых вариантах реализации композицию иммунных клеток хаТКР плюс ХСР и агент вводят одновременно. В некоторых вариантах реализации композицию иммунных клеток хаТКР плюс ХСР и агент вводят последовательно.

[0359] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения связанного с целевым антигеном заболевания (такого как рак или вирусная инфекция) у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую хаТКР и ХСР в соответствии с любыми вариантами реализации, описанными в данном документе. Способы генной доставки известны в данной области техники. Смотрите, например, патенты США №№ 5 399 346, 5 580 859, 5 589 466, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки.

[0360] Варианты лечения рака можно оценивать, например, по регрессии опухоли, снижению массы или размера опухоли, времени до прогрессирования, продолжительности выживаемости, выживаемости без прогрессирования, общему уровню ответа, продолжительности ответа, качеству жизни, экспрессии и/или активности белка. Можно применять некоторые подходы для определения эффективности терапии, включая, например, измерение ответа с помощью рентгеновской визуализации.

[0361] В некоторых вариантах реализации эффективность лечения определяют как процент ингибирования роста опухоли (% ИРО), рассчитанный по уравнению 100-(T/C x 100), где T представляет собой средний относительный объем опухоли для подвергаемой лечению опухоли, а C представляет собой средний относительный объем опухоли для не подвергаемой лечению опухоли. В некоторых вариантах реализации % ИРО составляет около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95% или более 95%.

[0362] Варианты лечения вирусной инфекции можно оценивать, например, по вирусной нагрузке, продолжительности выживаемости, качеству жизни, экспрессии и/или активности белка.

Заболевания

[0363] Иммунные клетки хаТКР плюс ХСР в некоторых вариантах реализации можно использовать для лечения раковых заболеваний, связанных с целевым антигеном. Раковые заболевания, которые можно лечить, используя любой из способов, описанных в данном документе, включают опухоли, которые не васкуляризированы или еще не достаточно васкуляризированы, а также васкуляризированные опухоли. Раковые заболевания могут включать несолидные опухоли (такие как гематологические опухоли, например, лейкозы и лимфомы) или могут включать солидные опухоли. Типы раковых заболеваний, подлежащих лечению иммунными клетками хаТКР плюс ХСР по изобретению включают, но не ограничиваются этим, карциному, бластому и саркому, а также определенные лейкозные или лимфоидные злокачественные образования, доброкачественные и злокачественные опухоли и злокачественные образования, например, саркомы, карциномы и меланомы. Также включены опухоли/раковые заболевания взрослых и опухоли/раковые заболевания детей.

[0364] Гематологические раковые заболевания представляют собой раковые заболевания крови или костного мозга. Примеры гематологических (или гематогенных) видов рака включают лейкозы, включая острые лейкозы (такие как острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, острый миелогенный лейкоз и миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный и эритролейкоз), хронические лейкозы (такие как хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический миелогенный лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз), истинную полицитемию, лимфому, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому (невыраженную и низкодифференцированную формы), множественную миелому, плазмацитому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, миелодиспластический синдром, волосатоклеточный лейкоз и миелодисплазию.

[0365] Солидные опухоли представляют собой аномальные массы ткани, которые обычно не содержат цист или жидких областей. Солидные опухоли могут быть доброкачественными или злокачественными. Разные типы солидных опухолей называют по типу клеток, которые их образуют (например, саркомы, карциномы и лимфомы). Примеры солидных опухолей, таких как саркомы и карциномы, включают адренокортикальную карциному, холангиокарциному, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеосаркому и другие саркомы, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, карциному толстой кишки, рак желудка, лимфолейкоз, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак легкого, рак яичника, рак предстательной железы, гепатоцеллюлярную карциному, плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, рак щитовидной железы (например, медуллярную карциному щитовидной железы и папиллярную карциному щитовидной железы), феохромоцитому, карциному сальной железы, папиллярную карциному, папиллярную аденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечно-клеточную карциному, гепатому, карциному желчного протока, хориокарциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки (например, карциному шейки матки и преинвазивную дисплазию шейки матки), колоректальный рак, раковые заболевания ануса, анального канала или заднего прохода и прямой кишки, рак влагалища, рак вульвы (например, плоскоклеточную карциному, интраэпителиальную карциному, аденокарциному и фибросаркому), рак полового члена, рак ротоглотки, рак пищевода, раковые заболевания головы (например, плоскоклеточную карциному), раковые заболевания шеи (например, плоскоклеточную карциному), рак яичка (например, семиному, тератому, эмбриональную карциному, тератокарциному, хориокарциному, саркому, опухоль из клеток Лейдига, фиброму, фиброаденому, аденомутоидные опухоли и липому), карциному мочевого пузыря, рак почки, меланому, рак матки (например, карциному эндометрия), раковые заболевания уротелия (например, плоскоклеточную карциному, переходно-клеточную карциному, аденокарциному, рак мочеточника и рак мочевого пузыря) и опухоли ЦНС (такие как глиома (такая как глиома ствола головного мозга и смешанные глиомы), глиобластома (также известная как мультиформная глиома) астроцитома, лимфома ЦНС, герминома, медуллобластома, шваннома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, акустическая невринома, олигодендроглиома, менингиома, нейробластома, ретинобластома и метастазы в головной мозг).

[0366] Варианты лечения рака можно оценивать, например, по регрессии опухоли, снижению массы или размера опухоли, времени до прогрессирования, продолжительности выживаемости, выживаемости без прогрессирования, общему уровню ответа, продолжительности ответа, качеству жизни, экспрессии и/или активности белка. Можно применять некоторые подходы для определения эффективности терапии, включая, например, измерение ответа с помощью рентгеновской визуализации.

[0367] Иммунные клетки хаТКР плюс ХСР в других вариантах реализации можно использовать для лечения инфекционных заболеваний путем нацеливания на патоген-ассоциированные (такие как кодируемые вирусом) антигены. Инфекция, подлежащая предотвращению или лечению, например, может быть вызвана вирусами, бактериями, простейшими или паразитами. Целевой антиген может представлять собой патогенный белок, полипептид или пептид, который отвечает за заболевание, вызываемое патогеном, или способен индуцировать иммунологический ответ у хозяина, инфицированного патогеном. Патогенные антигены, на которые можно проводить нацеливание иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, включают, но не ограничиваются этим, антигены, полученные из Acinetobacter baumannii, рода Anaplasma, Anaplasma phagocytophilum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenale, Arcanobacterium haemolyticum, Ascaris lumbricoides, рода Aspergillus, Astroviridae, рода Babesia, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, вируса BK, Blastocystis hominis, Blastomyces dermatitidis, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, рода Borrelia, вида Borrelia, рода Brucella, Brugia malayi, семейства Bunyaviridae, Burkholderia cepacia и других видов Burkholderia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, семейства Caliciviridae, рода Campylobacter, Candida albicans, вида Candida, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, приона CJD, Clonorchis sinensis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens, вида Clostridium, Clostridium tetani, вида Coccidioides, коронавирусов, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, вируса конго-крымской геморрагической лихорадки, Cryptococcus neoformans, рода Cryptosporidium, цитомегаловируса (CMV), вирусов денге (DEN-1, DEN-2, DEN-3 и DEN-4), Dientamoeba fragilis, эболавируса (EBOV), рода Echinococcus, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, рода Ehrlichia, Entamoeba histolytica, рода Enterococcus, рода Enterovirus, энтеровирусов, главным образом вируса Коксаки A и энтеровируса 71 (EV71), вида Epidermophyton, вируса Эпштейна-Барр (EBV), Escherichia coli O157:H7, O111 и O104:H4, Fasciola hepatica и Fasciola gigantica, приона FFI, суперсемейства Filarioidea, флавивирусов, Francisella tularensis, рода Fusobacterium, Geotrichum candidum, Giardia intestinalis, вида Gnathostoma, приона GSS, вируса Гуанарито, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, хенипавируса (вируса Хендра, вируса Нипах), вируса гепатита A, вируса гепатита B (HBV), вируса гепатита C (HCV), вируса гепатита D, вируса гепатита E, вируса простого герпеса 1 и 2 (HSV-1 и HSV-2), Histoplasma capsulatum, HIV (вируса иммунодефицита человека), Hortaea werneckii, бокавируса человека (HBoV), герпесвируса человека 6 (HHV-6) и герпесвируса человека 7 (HHV-7), метапневмовируса человека (hMPV), папилломавируса человека (HPV), вирусов парагриппа человека (HPIV), вируса Т-клеточного лейкоза человека 1 (HTLV-1), вируса японского энцефалита, вируса Джона Каннингема, вируса Джунин, герпесвируса, ассоциированного с саркомой Капоши (KSHV), Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, приона Kuru, вируса Ласса, Legionella pneumophila, рода Leishmania, рода Leptospira, Listeria monocytogenes, вируса лимфатического хориоменингита (LCMV), вируса Мачупо, вида Malassezia, марбургского вируса, вируса кори, Metagonimus yokagawai, Microsporidia phylum, вируса контагиозного моллюска (MCV), вируса свинки, Mycobacterium leprae и Mycobacterium lepromatosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Naegleria fowleri, Necator americanus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, вида Nocardia, Onchocerca volvulus, Orientia tsutsugamushi, семейства Orthomyxoviridae (грипп), Paracoccidioides brasiliensis, вида Paragonimus, Paragonimus westermani, парвовируса B19, рода Pasteurella, рода Plasmodium, Pneumocystis jirovecii, полиовируса, вируса бешенства, респираторно-синцитиального вируса (RSV), риновируса, риновирусов, Rickettsia akari, рода Rickettsia, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, вируса лихорадки долины Рифт, ротавируса, вируса коревой краснухи, вируса Сабиа, рода Salmonella, Sarcoptes scabiei, коронавируса SARS, рода Schistosoma, рода Shigella, вируса Син Номбре, хантавируса, Sporothrix schenckii, рода Staphylococcus, рода Staphylococcus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, рода Taenia, Taenia solium, вируса клещевого энцефалита (TBEV), Toxocara canis или Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, вида Trichophyton, Trichuris trichiura, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Ureaplasma urealyticum, вируса ветряной оспы (VZV), вируса ветряной оспы (VZV), Variola major или Variola minor, приона vCJD, вируса венесуэльского энцефалита лошадей, Vibrio cholerae, вируса Западного Нила, вируса западного энцефалита лошадей, Wuchereria bancrofti, вируса желтой лихорадки, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis.

[0368] В некоторых вариантах реализации иммунные клетки хаТКР плюс ХСР используют для лечения онконогенных инфекционных заболеваний, таких как инфекции, вызванные онкогенными вирусами. Онкогенные вирусы включают, но не ограничиваются этим, CMV, EBV, HBV, KSHV, HPV, MCV, HTLV-1, HIV-1 и HCV. Целевой антиген хаТКР может представлять собой вирусный онкопротеин, включая, но не ограничиваясь этим, Tax, E7, E6/E7, E6, HBx, белки EBNA (например, EBNA3 A, EBNA3 C и EBNA 2), v-циклин, LANA1, LANA2, LMP-1, k-bZIP, RTA, KSHV K8 и их фрагменты. Смотрите Ahuja, Richa, et al., Curr. Sci., 2014.

Готовые изделия и наборы

[0369] В некоторых вариантах реализации изобретения предложено готовое изделие, содержащее материалы для применения для лечения положительного в отношении целевого антигена заболевания, такого как рак (например, адренокортикальная карцинома, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиокарцинома, колоректальный рак, рак пищевода, глиобластома, глиома, гепатоцеллюлярная карцинома, рак головы и шеи, рак почки, лейкоз, рак легкого, лимфома, меланома, мезотелиома, множественная миелома, рак поджелудочной железы, феохромоцитома, плазмацитома, нейробластома, рак яичника, рак предстательной железы, саркома, рак желудка, рак матки или рак щитовидной железы) или вирусная инфекция (например, инфекция, вызываемая CMV, EBV, HBV, KSHV, HPV, MCV, HTLV-1, HIV-1 или HCV). Готовое изделие может содержать контейнер и этикетку или листок-вкладыш на контейнере или связанные с ним. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и т. д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. В общем случае контейнер содержит композицию, которая является эффективной для лечения заболевания или расстройства, описанного в данном документе, и может иметь отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон с пробкой, прокалываемой гиподермической иглой для инъекций). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой иммунную клетку, представляющую на своей поверхности хаТКР и ХСР по изобретению. На этикетке или листке-вкладыше указано, что композицию используют для лечения конкретного патологического состояния. Этикетка или листок-вкладыш дополнительно содержат инструкции по введению композиции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР пациенту. Также предусмотрены готовые изделия и наборы, содержащие комбинированные терапевтические средства, описанные в данном документе.

[0370] Листок-вкладыш относится к инструкциям, обычно включаемым в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или мерах предосторожности в отношении применения таких терапевтических продуктов. В некоторых вариантах реализации на листке-вкладыше дополнительно указано, что композицию применяют для лечения положительного в отношении целевого антигена рака (такого как адренокортикальная карцинома, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиокарцинома, колоректальный рак, рак пищевода, глиобластома, глиома, гепатоцеллюлярная карцинома, рак головы и шеи, рак почки, лейкоз, рак легкого, лимфома, меланома, мезотелиома, множественная миелома, рак поджелудочной железы, феохромоцитома, плазмацитома, нейробластома, рак яичника, рак предстательной железы, саркома, рак желудка, рак матки или рак щитовидной железы). В других вариантах реализации на листке-вкладыше указано, что композицию применяют для лечения положительной в отношении целевого антигена вирусной инфекции (например, инфекции, вызываемой CMV, EBV, HBV, KSHV, HPV, MCV, HTLV-1, HIV-1 или HCV).

[0371] Кроме того, готовое изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (БВДИ), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно содержать другие материалы, необходимые с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

[0372] Также предложены наборы, применимые в различных целях, например, для лечения положительного в отношении целевого антигена заболевания или расстройства, описанного в данном документе, необязательно, в комбинации готовыми изделиями. Наборы по изобретению содержат один или более контейнеров, содержащих композицию иммунных клеток хаТКР плюс ХСР (или единичную дозированную форму и/или готовое изделие), а в некоторых вариантах реализации дополнительно содержат другой агент (такой как описанные в данном документе агенты) и/или инструкции по применению в соответствии с любыми способами, описанными в данном документе. Набор может дополнительно содержать описание отбора индивидов, подходящих для лечения. Инструкции, поставляемые в наборах по изобретению, как правило, представляют собой печатные инструкции на этикетке или листке-вкладыше (например, листе бумаги, включенном в набор), но также приемлемыми являются машиночитаемые инструкции (например, инструкции, записанные на магнитном или оптическом диске хранения).

[0373] Например, в некоторых вариантах реализации набор содержит композицию, содержащую иммунную клетку, представляющую на своей поверхности хаТКР и ХСР. В некоторых вариантах реализации набор содержит a) композицию, содержащую иммунную клетку, представляющую на своей поверхности хаТКР и ХСР, и b) эффективное количество по меньшей мере одного другого агента, причем другой агент повышает экспрессию белков ГКГС и/или повышает поверхностное представление пептидов белками ГКГС (например, IFNγ, IFNβ, IFNα или ингибитора Hsp90). В некоторых вариантах реализации набор содержит a) композицию, содержащую иммунную клетку, представляющую на своей поверхности хаТКР и ХСР, и b) инструкции по введению композиции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР индивиду для лечения положительного в отношении целевого антигена заболевания (такого как рак или вирусная инфекция). В некоторых вариантах реализации набор содержит a) композицию, содержащую иммунную клетку, представляющую на своей поверхности хаТКР и ХСР, b) эффективное количество по меньшей мере одного другого агента, причем другой агент повышает экспрессию белков ГКГС и/или повышает поверхностное представление пептидов белками ГКГС (например, IFNγ, IFNβ, IFNα или ингибитора Hsp90), и c) инструкции по введению композиции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР и другого(их) агента(ов) индивиду для лечения положительного в отношении целевого антигена заболевания (такого как рак или вирусная инфекция). Композиция иммунных клеток хаТКР плюс ХСР и другой(ие) агент(ы) могут находиться в отдельных контейнерах или в одном контейнере. Например, набор может содержать одну отдельную композицию или две или более композиций, причем одна композиция содержит иммунные клетки хаТКР плюс ХСР, а другая композиция содержит другой агент.

[0374] В некоторых вариантах реализации набор содержит a) одну или более композиций, содержащих хаТКР и ХСР, и b) инструкции по объединению хаТКР и ХСР с иммунными клетками (такими как иммунные клетки, например, Т-клетки или естественные клетки-киллеры, полученные от индивида) для получения композиции, содержащей иммунные клетки, представляющие на своей поверхности хаТКР и ХСР, и введению индивиду композиции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР клеток для лечения положительного в отношении целевого антигена заболевания (такого как рак или вирусная инфекция). В некоторых вариантах реализации набор содержит a) одну или более композиций, содержащих хаТКР и ХСР, и b) иммунную клетку (такую как цитотоксическая клетка). В некоторых вариантах реализации набор содержит a) одну или более композиций, содержащих хаТКР и ХСР, b) иммунную клетку (такую как цитотоксическая клетка) и c) инструкции по объединению хаТКР и ХСР с иммунными клетками для получения композиции, содержащей иммунные клетки, представляющие на своей поверхности хаТКР и ХСР, и введению индивиду композиции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР клеток для лечения положительного в отношении целевого антигена заболевания (такого как рак или вирусная инфекция).

[0375] В некоторых вариантах реализации набор содержит нуклеиновую кислоту (или набор нуклеиновых кислот), кодирующую хаТКР и ХСР. В некоторых вариантах реализации набор содержит a) нуклеиновую кислоту (или набор нуклеиновых кислот), кодирующую хаТКР и ХСР, и b) клетку-хозяина (такую как иммунная клетка) для экспрессии нуклеиновой кислоты (или набора нуклеиновых кислот). В некоторых вариантах реализации набор содержит a) нуклеиновую кислоту (или набор нуклеиновых кислот), кодирующую хаТКР и ХСР, и b) инструкции по i) экспрессии хаТКР и ХСР в клетке-хозяине (такой как иммунная клетка, например, Т-клетка), ii) получению композиции, содержащей клетки-хозяев, экспрессирующие хаТКР и ХСР, и iii) введению композиции, содержащей клетки-хозяев, экспрессирующие хаТКР и ХСР, индивиду для лечения положительного в отношении целевого антигена заболевания (такого как рак или вирусная инфекция). В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин получена от индивида. В некоторых вариантах реализации набор содержит a) нуклеиновую кислоту (или набор нуклеиновых кислот), кодирующую хаТКР и ХСР, b) клетку-хозяина (такую как иммунная клетка) для экспрессии нуклеиновой кислоты (или набора нуклеиновых кислот) и c) инструкции по i) экспрессии хаТКР и ХСР в клетке-хозяине, ii) получению композиции, содержащей клетки-хозяев, экспрессирующие хаТКР и ХСР, и iii) введению композиции, содержащей клетки-хозяев, экспрессирующие хаТКР и ХСР, индивиду для лечения положительного в отношении целевого антигена заболевания (такого как рак или вирусная инфекция).

[0376] Наборы по изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящие упаковки включают, но не ограничиваются этим, флаконы, бутылки, банки, гибкие упаковки (например, запаянные пакеты из пленки майлар или пластика) и т. п. В наборах необязательно могут присутствовать дополнительные компоненты, такие как буферы, и пояснительная информация. Таким образом, в настоящей заявке также предложены готовые изделия, которые включают флаконы (такие как герметично закрываемые флаконы), бутылки, банки, гибкие упаковки и т. п.

[0377] Инструкции, относящиеся к применению композиций иммунных клеток хаТКР плюс ХСР в общем случае содержат информацию о дозировке, схеме дозирования и пути введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут содержать единичные дозы, нерасфасованные упаковки (например, многодозовые упаковки) или субъединичные дозы. Например, могут предоставляться наборы, которые содержат достаточную дозировку композиции иммунных клеток хаТКР плюс ХСР, описанной в данном документе, для обеспечения эффективного лечения индивида в течение продолжительного периода, такого как неделя, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток, 12 суток, 13 суток, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 6 недель, 8 недель, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев или более. Наборы также могут содержать некоторое количество единичных доз хаТКР и ХСР и фармацевтические композиции и инструкции по применению, которые упакованы в количествах, достаточных для хранения и применения в аптеках, например больничных аптеках и рецептурно-производственных аптеках.

[0378] Специалистам в данной области техники понятно, что в пределах сущности и объема этого изобретения возможно некоторое количество вариантов реализации. Далее данное изобретение будет описано более подробно со ссылкой на представленные ниже неограничивающие примеры. Представленные ниже примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но, конечно, их не следует рассматривать как ограничивающие каким-либо образом его объем.

Типовые варианты реализации

[0379] Вариант реализации 1. В одном варианте реализации предложена иммунная клетка, содержащая:

a) конструкцию химерное антитело - Т-клеточный рецептор (ТКР) (хаТКР), содержащую:

i) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном; и

и ii) модуль Т-клеточного рецептора (МТКР), содержащий первый домен ТКР (ДТКР), содержащий первый трансмембранный домен ТКР (ТКР-ТМ), и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ,

причем МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы; и

b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий:

i) лиганд-связывающий модуль, который способен связываться или взаимодействовать с целевым лигандом;

ii) трансмембранный модуль; и

iii) костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки, который способен обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке,

причем лиганд-связывающий модуль и костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки не получены из одной молекулы, и причем в ХСР отсутствует функциональный первичный сигнальный домен иммунной клетки.

[0380] Вариант реализации 2. Иммунная клетка по варианту реализации 1, отличающаяся тем, что в ХСР отсутствуют любые первичные сигнальные последовательности иммунной клетки.

[0381] Вариант реализации 3. Иммунная клетка по варианту реализации 1 или 2, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой антиген клеточной поверхности.

[0382] Вариант реализации 4. Иммунная клетка по варианту реализации 3, отличающаяся тем, что антиген клеточной поверхности выбран из группы, состоящей из белка, углевода и липида.

[0383] Вариант реализации 5. Иммунная клетка по варианту реализации 4, отличающаяся тем, что антиген клеточной поверхности выбран из группы, состоящей из CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, и FCRL5.

[0384] Вариант реализации 6. Иммунная клетка по варианту реализации 1 или 2, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой комплекс, содержащий пептид и белок главного комплекса гистосовместимости (ГКГС).

[0385] Вариант реализации 7. Иммунная клетка по варианту реализации 6, отличающаяся тем, что пептид получен из белка, выбранного из группы, состоящей из WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A и PSA.

[0386] Вариант реализации 8. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-7, отличающаяся тем, что первый ТКР-ТМ получен из одного из трансмембранных доменов первого Т-клеточного рецептора, а второй ТКР-ТМ получен из другого трансмембранного домена первого Т-клеточного рецептора.

[0387] Вариант реализации 9. Иммунная клетка по варианту реализации 8, отличающаяся тем, что по меньшей мере один ТКР-ТМ не встречается в природе.

[0388] Вариант реализации 10. Иммунная клетка по варианту реализации 9, отличающаяся тем, что МТКР обеспечивает повышенное рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы по сравнению с МТКР, содержащим трансмембранные домены первого Т-клеточного рецептора.

[0389] Вариант реализации 11. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 8-10, отличающаяся тем, что первый ТКР-ТМ содержит до 5 аминокислотных замен по сравнению с трансмембранным доменом, из которого он получен, и/или второй ТКР-ТМ содержит до 5 аминокислотных замен по сравнению с трансмембранным доменом, из которого он получен.

[0390] Вариант реализации 12. Иммунная клетка по варианту реализации 11, отличающаяся тем, что первый ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену и/или второй ТКР-ТМ содержит одну аминокислотную замену.

[0391] Вариант реализации 13. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 8-12, отличающаяся тем, что первый Т-клеточный рецептор представляет собой γ/δ Т-клеточный рецептор.

[0392] Вариант реализации 14. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 8-12, отличающаяся тем, что первый Т-клеточный рецептор представляет собой α/β Т-клеточный рецептор.

[0393] Вариант реализации 15. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-14, отличающаяся тем, что антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv и одноцепочечного Fv (scFv).

[0394] Вариант реализации 16. Иммунная клетка по варианту реализации 15, отличающаяся тем, что антигенсвязывающий модуль содержит домен V_H и домен V_L и при этом домен V_H связан с амино-концом одного из ДТКР, а домен V_L связан с амино-концом другого ДТКР.

[0395] Вариант реализации 17. Иммунная клетка по варианту реализации 16, отличающаяся тем, что домен V_H связан с одним из ДТКР посредством домена C_H1, а домен V_L связан с другим ДТКР посредством домена C_L.

[0396] Вариант реализации 18. Иммунная клетка по варианту реализации 15, отличающаяся тем, что хаТКР дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный антигенсвязывающий модуль.

[0397] Вариант реализации 19. Иммунная клетка по варианту реализации 18, отличающаяся тем, что по меньшей мере один дополнительный антигенсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела.

[0398] Вариант реализации 20. Иммунная клетка по варианту реализации 18 или 19, отличающаяся тем, что хаТКР является мультиспецифическим.

[0399] Вариант реализации 21. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 15-20, отличающаяся тем, что антигенсвязывающий модуль содержит scFv, слитый с амино-концом одного из ДТКР.

[0400] Вариант реализации 22. Иммунная клетка по варианту реализации 21, отличающаяся тем, что хаТКР содержит первый scFv, слитый с амино-концом первого ДТКР, и второй scFv, слитый с амино-концом второго ДТКР.

[0401] Вариант реализации 23. Иммунная клетка по варианту реализации 22, отличающаяся тем, что первый scFv связывается с отличной мишенью, чем второй scFv.

[0402] Вариант реализации 24. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-23, отличающаяся тем, что хаТКР представляет собой гетеродимер, содержащий первую полипептидную цепь, содержащую первый ДТКР, и вторую полипептидную цепь, содержащую второй ДТКР, и при этом антигенсвязывающий модуль связан с амино-концом одного или обоих из первого и второго ДТКР.

[0403] Вариант реализации 25. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-24, отличающаяся тем, что хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР.

[0404] Вариант реализации 26. Иммунная клетка по варианту реализации 25, отличающаяся тем, что модуль стабилизации выбран из группы, состоящей из модуля C_H1-C_L, модуля C_H2-C_H2, модуля C_H3- C_H3 и модуля C_H4-C_H4.

[0405] Вариант реализации 27. Иммунная клетка по варианту реализации 25 или 26, отличающаяся тем, что между первым и вторым доменами стабилизации существует ковалентная связь.

[0406] Вариант реализации 28. Иммунная клетка по варианту реализации 27, отличающаяся тем, что ковалентная связь представляет собой дисульфидную связь.

[0407] Вариант реализации 29. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 25-28, отличающаяся тем, что модуль стабилизации расположен между антигенсвязывающим модулем и МТКР.

[0408] Вариант реализации 30. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 25-29, отличающаяся тем, что хаТКР представляет собой гетеродимер, содержащий:

a) первую полипептидную цепь, содержащую первый домен стабилизации, слитый с амино-концом первого ДТКР, и вторую полипептидную цепь, содержащую второй домен стабилизации, слитый с амино-концом второго ДТКР, и при этом антигенсвязывающий модуль слит с амино-концом одного или обоих из первого и второго доменов стабилизации.

[0409] Вариант реализации 31. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-30, отличающаяся тем, что хаТКР связывается с целевым антигеном с равновесной константой диссоциации (Kд), составляющей от около 0,1 пМ до около 500 нМ.

[0410] Вариант реализации 32. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-31, отличающаяся тем, что ТРК-ассоциированная сигнальная молекула выбрана из группы, состоящей из CD3δε, CD3γε и ζζ.

[0411] Вариант реализации 33. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-32, отличающаяся тем, что целевой антиген и целевой лиганд являются одинаковыми.

[0412] Вариант реализации 34. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-32, отличающаяся тем, что целевой антиген и целевой лиганд являются разными.

[0413] Вариант реализации 35. Иммунная клетка по варианту реализации 34, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой лиганд, экспрессируемый на поверхности клетки, представляющей целевой антиген.

[0414] Вариант реализации 36. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-35, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой связанный с заболеванием лиганд.

[0415] Вариант реализации 37. Иммунная клетка по варианту реализации 36, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой связанный с раком лиганд.

[0416] Вариант реализации 38. Иммунная клетка по варианту реализации 37, отличающаяся тем, что связанный с раком лиганд выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5.

[0417] Вариант реализации 39. Иммунная клетка по варианту реализации 37, отличающаяся тем, что связанный с раком лиганд представляет собой комплекс пептид/ГКГС, содержащий пептид, полученный из белка, выбранного из группы, состоящей из WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A и PSA.

[0418] Вариант реализации 40. Иммунная клетка по варианту реализации 36, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой связанный с вирусом лиганд.

[0419] Вариант реализации 41. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-35, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой иммуномодулирующую молекулу.

[0420] Вариант реализации 42. Иммунная клетка по варианту реализации 41, отличающаяся тем, что иммуномодулирующая молекула представляет собой иммуносупрессивный рецептор, а ХСР является антагонистом иммуносупрессивного рецептора.

[0421] Вариант реализации 43. Иммунная клетка по варианту реализации 41, отличающаяся тем, что иммуномодулирующая молекула представляет собой иммуностимулирующий рецептор, а ХСР является агонистом иммуностимулирующего рецептора.

[0422] Вариант реализации 44. Иммунная клетка по варианту реализации 41, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой молекулу иммунной контрольной точки.

[0423] Вариант реализации 45. Иммунная клетка по варианту реализации 44, отличающаяся тем, что молекула иммунной контрольной точки выбрана из группы, состоящей из PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40 и GAL9.

[0424] Вариант реализации 46. Иммунная клетка по варианту реализации 41, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой ингибирующий цитокин.

[0425] Вариант реализации 47. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-35, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой апоптотическую молекулу.

[0426] Вариант реализации 48. Иммунная клетка по варианту реализации 47, отличающаяся тем, что апоптотическая молекула выбрана из группы, состоящей из FasL, FasR, TNFR1 и TNFR2.

[0427] Вариант реализации 49. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-48, отличающаяся тем, что лиганд-связывающий модуль представляет собой фрагмент антитела.

[0428] Вариант реализации 50. Иммунная клетка по варианту реализации 49, отличающаяся тем, что фрагмент антитела ХСР выбран из группы, состоящей из Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv и одноцепочечного Fv (scFv).

[0429] Вариант реализации 51. Иммунная клетка по варианту реализации 50, отличающаяся тем, что фрагмент антитела ХСР представляет собой scFv.

[0430] Вариант реализации 52. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-48, отличающаяся тем, что лиганд-связывающий модуль получен из внеклеточного домена рецептора.

[0431] Вариант реализации 53. Иммунная клетка по варианту реализации 52, отличающаяся тем, что рецептор выбран из группы, состоящей из FasR, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27, TIM-3, IL-10R, IL-6R и IL-4R.

[0432] Вариант реализации 54. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-53, отличающаяся тем, что трансмембранный модуль ХСР содержит трансмембранные домены, полученные из CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154.

[0433] Вариант реализации 55. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-54, отличающаяся тем, что костимулирующая сигнальная молекула иммунной клетки получена из внутриклеточного домена костимулирующего рецептора ТКР.

[0434] Вариант реализации 56. Иммунная клетка по варианту реализации 55, отличающаяся тем, что костимулирующий рецептор выбран из группы, состоящей из CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, CD27 и CD40.

[0435] Вариант реализации 57. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-56, отличающаяся тем, что экспрессия ХСР является индуцибельной.

[0436] Вариант реализации 58. Иммунная клетка по варианту реализации 57, отличающаяся тем, что экспрессия ХСР индуцируется после активации иммунной клетки.

[0437] Вариант реализации 59. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-32, отличающаяся тем, что антигенсвязывающий модуль хаТКР содержит фрагмент антитела, который связывается с CD19, причем лиганд-связывающий модуль ХСР содержит scFv, который связывается с CD19, и причем трансмембранный модуль и костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки, оба, получены из CD28.

[0438] Вариант реализации 60. Иммунная клетка по варианту реализации 59, отличающаяся тем, что фрагмент антитела, который связывается с CD19, содержит домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, причем scFv, который связывается с CD19, содержит домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, и при этом ХСР содержит фрагмент CD28, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51.

[0439] Вариант реализации 61. Иммунная клетка по варианту реализации 60, отличающаяся тем, что хаТКР содержит две полипептидные цепи, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 72 и 73 или SEQ ID NO: 74 и 75, и/или при этом ХСР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80.

[0440] Вариант реализации 62. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-32, отличающаяся тем, что антигенсвязывающий модуль хаТКР содержит фрагмент антитела, который связывается с AFP, причем лиганд-связывающий модуль ХСР содержит scFv, который связывается с GPC3, и причем трансмембранный модуль и костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки, оба, получены из CD28.

[0441] Вариант реализации 63. Иммунная клетка по варианту реализации 62, отличающаяся тем, что фрагмент антитела, который связывается с AFP, содержит домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, причем scFv, который связывается с GPC3, содержит домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, и при этом ХСР содержит фрагмент CD28, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51.

[0442] Вариант реализации 64. Иммунная клетка по варианту реализации 63, отличающаяся тем, что хаТКР содержит две полипептидные цепи, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 68 и 69 или SEQ ID NO: 70 и 71, и/или при этом ХСР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82.

[0443] Вариант реализации 65. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-32, отличающаяся тем, что антигенсвязывающий модуль хаТКР содержит фрагмент антитела, который связывается с CD19, причем лиганд-связывающий модуль ХСР содержит scFv, который связывается с CD20, и причем трансмембранный модуль и костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки, оба, получены из CD28.

[0444] Вариант реализации 66. Иммунная клетка по варианту реализации 65, отличающаяся тем, что фрагмент антитела, который связывается с CD19, содержит домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, причем scFv, который связывается с CD20, содержит домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, и при этом ХСР содержит фрагмент CD28, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51.

[0445] Вариант реализации 67. Иммунная клетка по варианту реализации 66, отличающаяся тем, что хаТКР содержит две полипептидные цепи, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 72 и 73 или SEQ ID NO: 74 и 75, и/или при этом ХСР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81.

[0446] Вариант реализации 68. В одном варианте реализации предложены одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих хаТКР и ХСР по любому из вариантов реализации 1-67, отличающиеся тем, что каждый из хаТКР и ХСР состоит из одной или более полипептидных цепей, кодируемых одной или более нуклеиновыми кислотами.

[0447] Вариант реализации 69. В одном варианте реализации предложены одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих:

a) конструкцию химерное антитело - Т-клеточный рецептор (ТКР) (хаТКР), содержащую:

i) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном; и

ii) модуль Т-клеточного рецептора (МТКР), содержащий первый домен ТКР (ДТКР), содержащий первый трансмембранный домен ТКР (ТКР-ТМ), и второй ДТКР, содержащий второй ТКР-ТМ, при этом МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР-ассоциированной сигнальной молекулы, и при этом хаТКР состоит из одной или более полипептидных цепей; и

b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий:

i) лиганд-связывающий модуль, который способен связываться или взаимодействовать с целевым лигандом;

ii) трансмембранный модуль; и

iii) костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки, который способен обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной клетке, при этом лиганд-связывающий модуль и костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки не получены из одной и той же молекулы, причем в ХСР отсутствует функциональный первичный сигнальный домен иммунной клетки, и при этом ХСР состоит из одной или более полипептидных цепей.

[0448] Вариант реализации 70. Одна или более нуклеиновых кислот по варианту реализации 68 или 69, отличающихся тем, что хаТКР и ХСР кодируются одной молекулой нуклеиновой кислоты.

[0449] Вариант реализации 71. Одна или более нуклеиновых кислот по варианту реализации 68 или 69, отличающихся тем, что хаТКР и ХСР кодируются разными молекулами нуклеиновых кислот.

[0450] Вариант реализации 72. Одна или более нуклеиновых кислот по любому из вариантов реализации 68-71, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую ХСР, функционально связанную с индуцибельным промотором.

[0451] Вариант реализации 73. Одна или более нуклеиновых кислот по варианту реализации 72, отличающихся тем, что индуцибельный промотор индуцируется после активации иммунной клетки.

[0452] Вариант реализации 74. Одна или более нуклеиновых кислот по варианту реализации 72, отличающихся тем, что индуцибельный промотор представляет собой промотор ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT).

[0453] Вариант реализации 75. В одном варианте реализации предложены один или более векторов, содержащих одну или более нуклеиновых кислот по любому из вариантов реализации 68-74.

[0454] Вариант реализации 76. Один или более векторов по варианту реализации 75, отличающихся тем, что по меньшей мере один из векторов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую хаТКР, и по меньшей мере один другой вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ХСР.

[0455] Вариант реализации 77. Один или более векторов по варианту реализации 75, содержащих один вектор, содержащий одну или более нуклеиновых кислот.

[0456] Вариант реализации 78. В одном варианте реализации предложена композиция, содержащая одну или более нуклеиновых кислот по любому из вариантов реализации 68-74 или один или более векторов по любому из вариантов реализации 75-77.

[0457] Вариант реализации 79. В одном варианте реализации предложена иммунная клетка, содержащая одну или более нуклеиновых кислот по любому из вариантов реализации 68-74 или один или более векторов по любому из вариантов реализации 75-77.

[0458] Вариант реализации 80. Иммунная клетка по варианту реализации 79, отличающаяся тем, что иммунная клетка дополнительно содержит хаТКР, экспрессируемый из одной или более нуклеиновых кислот по любому из вариантов реализации 68-74 или одного или более векторов по любому из вариантов реализации 75-77.

[0459] Вариант реализации 81. Иммунная клетка по варианту реализации 79 или 80, отличающаяся тем, что иммунная клетка дополнительно содержит ХСР, экспрессируемый из одной или более нуклеиновых кислот по любому из вариантов реализации 68-74 или одного или более векторов по любому из вариантов реализации 75-77.

[0460] Вариант реализации 82. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-67 или 79-81, отличающаяся тем, что иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической Т-клетки, хелперной Т-клетки, естественной киллерной T-клетки и супрессорной Т-клетки.

[0461] Вариант реализации 83. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 1-67 или 79-82, отличающаяся тем, что

a) хаТКР представляет собой гетеродимер, содержащий первую полипептидную цепь, содержащую первый ДТКР, и вторую полипептидную цепь, содержащую второй ДТКР, и при этом антигенсвязывающий модуль содержит одну или более полипептидных цепей, связанных с амино-концом одного или обоих ДТКР, и

b) ХСР содержит одну полипептидную цепь, причем иммунная клетка содержит:

i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первую полипептидную цепь хаТКР;

ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вторую полипептидную цепь хаТКР; и

iii) третью последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ХСР.

[0462] Вариант реализации 84. Иммунная клетка по варианту реализации 83, содержащая:

a) первый вектор, содержащий первую последовательность нуклеиновой кислоты под управлением первого промотора;

b) второй вектор, содержащий вторую последовательность нуклеиновой кислоты под управлением второго промотора; и

с) третий вектор, содержащий третью последовательность нуклеиновой кислоты под управлением третьего промотора.

[0463] Вариант реализации 85. Иммунная клетка по варианту реализации 83, содержащая:

a) первый вектор, содержащий:

i) первую последовательность нуклеиновой кислоты под управлением первого промотора; и

ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты под управлением второго промотора; и

b) второй вектор, содержащий третью последовательность нуклеиновой кислоты под управлением третьего промотора.

[0464] Вариант реализации 86. Иммунная клетка по варианту реализации 83, содержащая вектор, содержащий:

a) первую последовательность нуклеиновой кислоты под управлением первого промотора;

b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты под управлением второго промотора; и

с) третью последовательность нуклеиновой кислоты под управлением третьего промотора.

[0465] Вариант реализации 87. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 84-86, отличающаяся тем, что первый промотор и/или второй промотор являются конститутивно активными промоторами.

[0466] Вариант реализации 88. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 84-87, отличающаяся тем, что третий промотор является индуцибельным промотором.

[0467] Вариант реализации 89. Иммунная клетка по варианту реализации 83, содержащая:

a) первый вектор, содержащий первую последовательность нуклеиновой кислоты и вторую последовательность нуклеиновой кислоты под управлением одного первого промотора; и

b) второй вектор, содержащий третью последовательность нуклеиновой кислоты под управлением второго промотора.

[0468] Вариант реализации 90. Иммунная клетка по варианту реализации 83, содержащая вектор, содержащий:

a) первую последовательность нуклеиновой кислоты и вторую последовательность нуклеиновой кислоты под управлением одного первого промотора; и

b) третью последовательность нуклеиновой кислоты под управлением второго промотора.

[0469] Вариант реализации 91. Иммунная клетка по варианту реализации 89 или 90, отличающаяся тем, что первый промотор является конститутивно активным промотором.

[0470] Вариант реализации 92. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 89-91, отличающаяся тем, что второй промотор является индуцибельным промотором.

[0471] Вариант реализации 93. Иммунная клетка по варианту реализации 88 или 92, отличающаяся тем, что индуцибельный промотор индуцируется после активации иммунной клетки.

[0472] Вариант реализации 94. Иммунная клетка по варианту реализации 88 или 92, отличающаяся тем, что индуцибельный промотор представляет собой полученный из NFAT промотор.

[0473] Вариант реализации 95. Иммунная клетка по варианту реализации 83, содержащая вектор, содержащий первую последовательность нуклеиновой кислоты, вторую последовательность нуклеиновой кислоты и третью последовательность нуклеиновой кислоты, все под управлением одного промотора.

[0474] Вариант реализации 96. Иммунная клетка по любому из вариантов реализации 84-95, отличающаяся тем, что векторы интегрированы в геном иммунной клетки.

[0475] Вариант реализации 97. В одном варианте реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая иммунную клетку по любому из вариантов реализации 1-67 и 79-96 и фармацевтически приемлемый носитель.

[0476] Вариант реализации 98. В одном варианте реализации предложен способ уничтожения целевой клетки, представляющей целевой антиген (или лечения связанного с целевым антигеном заболевания), включающий приведение целевой клетки в контакт с иммунной клеткой по любому из вариантов реализации 1-67 и 79-96.

[0477] Вариант реализации 99. Способ по варианту реализации 98, отличающийся тем, что приведение в контакт осуществляют in vivo.

[0478] Вариант реализации 100. Способ по варианту реализации 98, отличающийся тем, что приведение в контакт осуществляют in vitro.

[0479] Вариант реализации 101. В одном варианте реализации предложен способ лечения связанного с целевым антигеном заболевания у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества фармацевтической композиции по варианту реализации 97.

[0480] Вариант реализации 102. Способ по варианту реализации 101, отличающийся тем, что связанное с целевым антигеном заболевание представляет собой рак.

[0481] Вариант реализации 103. Способ по варианту реализации 102, отличающийся тем, что рак выбран из группы, состоящей из адренокортикальной карциномы, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиокарциномы, колоректального рака, рака пищевода, глиобластомы, глиомы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака головы и шеи, рака почки, лейкоза, рака легкого, лимфомы, меланомы, мезотелиомы, множественной миеломы, рака поджелудочной железы, феохромоцитомы, плазмацитомы, нейробластомы, рака яичника, рака предстательной железы, саркомы, рака желудка, рака матки и рака щитовидной железы.

[0482] Вариант реализации 104. Способ по варианту реализации 101, отличающийся тем, что связанное с целевым антигеном заболевание представляет собой вирусную инфекцию.

[0483] Вариант реализации 105. Способ по варианту реализации 104, отличающийся тем, что вирусная инфекция вызвана вирусом, выбранным из группы, состоящей из цитомегаловируса (CMV), вируса Эпштейна-Барр (EBV), вируса гепатита B (HBV), герпесвируса, ассоциированного с саркомой Капоши (KSHV), папилломавируса человека (HPV), вируса контагиозного моллюска (MCV), вируса Т-клеточного лейкоза человека 1 (HTLV-1), вируса иммунодефицита человека (HIV) и вируса гепатита C (HCV).

[0484] Вариант реализации 106. Способ по любому из вариантов реализации 101-105, отличающийся тем, что иммунная клетка является аутологичной для индивида.

[0485] Вариант реализации 107. В одном варианте реализации предложен способ обеспечения костимулирующего сигнала иммунной клетке, содержащей хаТКР или трансдуцированной нуклеиновой кислотой, кодирующей хаТКР, включающий внесение в указанную клетку одной или более нуклеиновых кислот по любому из вариантов реализации 68-74 или одного или более векторов по любому из вариантов реализации 75-77.

Примеры

Материалы и способы

Образцы клеток, линии клеток и антитела

[0486] Линии клеток HepG2 (ATCC HB-8065; HLA-A2+, AFP⁺), SK-HEP-1 (ATCC HTB-52; HLA-A2+, AFP^-), Raji (ATCC CCL-86; CD19⁺), CA46 (ATCC CRL-1648; CD19⁺), Jurkat (ATCC CRL-2899, CD19^-), J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), Jeko-1 (ATCC CRL-3006; CD19⁺), THP-1 (ATCC TIB-202, CD19^-), Daudi (ATCC CCL-213; CD19⁺), HeLa (ATCC CCL-2), MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) и MCF-7 (ATCC HTB-22) получали от Американской коллекции типовых культур. Jurkat - это клеточная линия T-лимфоцитов человека, полученная из Т-клеточного лейкоза. J.RT3-T3.5 - это мутантная линия, полученная из клеток Jurkat, в которой отсутствует β-цепь Т-клеточного рецептора. Raji - это клеточная линия лимфомы Беркитта, которая экспрессирует CD19. Линия Raji с нокаутом CD19 (Raji CD19KO) была создана с помощью технологии CRISPR. Были разработаны три разные направляющие последовательности для нацеливания на CD19 в клетках Raji. Вектор CRISPR-Cas9 был приобретен у Origene, а каждую направляющую отдельно клонировали в вектор pCas-Guide. Через трое суток после электропорации эффективность нокаута для каждой направляющей оценивали методом проточной цитометрии, а наилучший пул с нокаутом CD19 отбирали для клонального отбора методом предельного разведения. Отобранный клон подтверждали как соответствующий полному нокауту CD19 методом секвенирования. Все клеточные линии культивировали в RPMI 1640 или DMEM, дополненных 10% ФБС и 2 мМ глутамина при 37 °C/5% CO₂.

[0487] Приобретали моноклональное Ab против человеческого HLA-A02 (клон BB7.2), конъюгированное с FITC или APC, и его изотипический контрольный мышиный IgG 2b, конъюгированный с FITC или APC, антитела против человеческого или мышиного CD3, различные субъединицы человеческого Т-клеточного рецептора, метку 3xFlag, метку HA, козий F(ab)2 античеловеческий IgG, конъюгированный с PE или FITC, и флуоресцентно-конъюгированные козьи F(ab’)2 антимышиные Ig (Invitrogen). Антиидиотипическое антитело против AFP158/HLA-A*02:01-специфического антитела разрабатывали и получали в лаборатории Eureka Therapeutics. Данные проточной цитометрии получали, используя BD FACSCanto II, и анализировали, используя программный пакет FlowJo.

[0488] Все пептиды были приобретены и синтезированы Elim Biopharma. Чистота пептидов составляла >90%. Пептиды растворяли в ДМСО или разводили в солевом растворе в концентрации 10 мг/мл и замораживали при -80 °C. Биотинилированный одноцепочечный AFP158/HLA-A*02:01 и комплексные мономеры контрольные пептиды/HLA-A*02:01 получали путем повторного сворачивания пептидов с рекомбинантным HLA-A*02:01 и бета-2 микроглобулином (β2M). Мономеры биотинилировали с помощью пептида BSP, связанного с C-концом внеклеточного домена (ВКД) HLA-A*02:01 ферментом BirA. Флуоресцентно-меченный стрептавидин смешивали с биотинилированным комплексным мономером пептид/HLA-A*02:01 для получения флуоресцентно-меченного тетрамера пептид/HLA-A*02:01.

[0489] Получали лентивирусы, содержащие специфические к человеческому CD19 или AFP158/HLA-A*02:01 ХАР или хаТКР, например, путем трансфекции клеток 293T векторами, кодирующими химерные конструкции. Первичные человеческие T-клетки использовали для трансдукции после односуточной стимуляции гранулами CD3/CD28 (Dynabeads®, Invitrogen) в присутствии интерлейкина-2 (IL-2) в концентрации 100 Е/мл. Концентрированные лентивирусы наносили на Т-клетки в покрытых ретронектином (Takara) 6-луночных планшетах в течение 96 часов. Эффективность трансдукции анти-AFP и анти-CD19 химерных конструкций оценивали методом проточной цитометрии, используя биотинилированный тетрамер AFP158/HLA-A*02:01 («тетрамер AFP158») с PE-конъюгированным стрептавидином или анти-myc антителом, соответственно. Повторный анализ методом проточной цитометрии проводили на 5 сутки и после этого - каждые 3-4 суток.

[0490] Клеточные линии трансдуцировали одним или двумя векторами, которые кодируют две субъединицы конструкции хаТКР. Через пять суток после трансдукции получали клеточные лизаты для вестерн-блоттинга, используя анти-HA (антитело против метки HA - уровень ChIP, Abcam) или анти-Flag антитело (анти-Flag, вырабатываемое у кролика, Sigma).

[0491] Цитотоксичность опухоли оценивали с помощью нерадиоактивного анализа цитотоксичности ЛДГ Cytox 96 (Promega). CD3⁺ Т-клетки получали из обогащенной МКПК цельной крови, используя набор для выделения человеческих T-клеток EasySep (StemCell Technologies), который обеспечивает отрицательное истощение клеток, экспрессирующих CD14, CD16, CD19, CD20, CD36, CD56, CD66b, CD123, гликопротеин А. Человеческие Т-клетки активировали и размножали, например, с помощью гранул CD3/CD28 Dynabeads (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Активированные Т-клетки (АТК) культивировали и поддерживали в среде RPMI1640 с добавлением 10% ФБС плюс 100 Е/мл IL-2 и использовали на 7-14 сутки. Активированные Т-клетки (иммунные клетки) и целевые клетки совместно культивировали в различных соотношениях эффектор - мишень (например, 2,5:1 или 5:1) в течение 16 часов и анализировали в отношении цитотоксичности.

Пример 1. Варианты конструкций химерное антитело - Т-клеточный рецептор (хаТКР)

[0492] Предусмотрены различные варианты конструкций химерное антитело - Т-клеточный рецептор (хаТКР), а на Фиг. 1 проиллюстрированы шесть разных примеров (хаТКР-1, хаТКР-2, хаТКР-3, хаТКР-4, хаТКР-5 и хаТКР-6). В этих вариантах конструкций различные фрагменты антител (Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv или scFv) слиты с амино-концом α/β цепей или γ/δ цепей T-клеточного рецептора, в которых отсутствуют вариабельный и константный домены и которые содержат весь или часть соединительного пептида (область после константного домена), трансмембранный домен или его вариант и любой внутриклеточный домен для образования гетеродимеров хаТКР, которые можно экспрессировать на поверхности Т-клеток. В нативном ТКР домены Vα/Vβ или Vδ/Vγ образуют антигенсвязывающий домен ТКР. В наших вариантах конструкций области Vα-Cα/Vβ-Cβ или Vδ-Cδ/Vγ-Cγ замещены различными фрагментами антител и внесен по меньшей мере один вариантный трансмембранный домен, таким образом, обеспечивая конструкции специфичность связывания антитела и приводя к повышению способности конструкции рекрутировать в ТКР-комплекс вспомогательные молекулы, такие как CD3δε, CD3γε и CD3ζζ, по сравнению с ТКР или родственными конструкциями, содержащими только встречающиеся в природе трансмембранные домены ТКР. Конструкции хаТКР называли следующим образом: хаТКР-[вариант конструкции#]-[расположение варианта][#]. Вариант конструкции # 1 соответствует хаТКР с фрагментом антитела Fab, вариант конструкции # 2 соответствует хаТКР с фрагментом антитела Fab’, вариант конструкции # 3 соответствует хаТКР с фрагментом антитела (Fab’)2, вариант конструкции # 4 соответствует хаТКР с фрагментом антитела Fv, вариант конструкции # 5 соответствует хаТКР с одним фрагментом антитела scFv, а вариант конструкции # 6 соответствует хаТКР с двумя фрагментами антитела scFv (смотрите Фиг. 1). Без расположения варианта и # 0 (например, хаТКР-1-0) соответствует конструкции с встречающимися в природе доменами ТКР, а # ≥ 1 соответствует хаТКР с конкретными вариантами в расположении варианта (например, хаТКР-1-ТМ1 соответствует одному варианту трансмембранного домена, хаТКР-1-ВК1 соответствует одному варианту внеклеточного домена; смотрите Таблицу 2).

[0493] В варианте конструкции хаТКР-1 (IgV_H-IgC_H1-ТКРδ/IgV_L-IgC_L-ТКРγ) вариабельный домен и первый константный домен (IgV_H-IgC_H1) тяжелой цепи антитела замещают амино-концевую часть δ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене δ-цепи ТКР после области Vδ-Cδ, необязательно, при этом трансмембранный домен δ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот. Вариабельный домен и константный домен (IgV_L-IgC_L) соответствующей легкой цепи антитела замещают амино-концевую часть γ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене γ-цепи ТКР после области Vγ-Cγ, необязательно, при этом трансмембранный домен γ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот.

[0494] В одном варианте реализации хаТКР-1 одна цепь содержит домен IgV_H анти-AFP158/HLA-A*02:01 антитела (SEQ ID NO: 62), слитый с доменом IgC_H1 (любая из SEQ ID NO: 37-47), слитым с карбокси-концевой частью δ-цепи ТКР, содержащей трансмембранный домен и весь или часть соединительного пептида δ-цепи ТКР, а другая цепь содержит домен IgV_L анти-AFP158/HLA-A*02:01 антитела (SEQ ID NO: 63), слитый с доменом IgC_L (SEQ ID NO: 48), слитым с карбокси-концевой частью γ-цепи ТКР, содержащей трансмембранный домен и весь или часть соединительного пептида γ-цепи ТКР. В некоторых вариантах реализации оба трансмембранных домена ТКР встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из трансмембранных доменов ТКР представляет собой вариант, не встречающийся в природе, содержащий одну или более аминокислотных замен. В некоторых вариантах реализации карбокси-концевая часть δ-цепи ТКР содержит соединительный пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32. В некоторых вариантах реализации карбокси-концевая часть δ-цепи ТКР содержит трансмембранный домен, имеющий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 7 и 9-13. В некоторых вариантах реализации карбокси-концевая часть γ-цепи ТКР содержит соединительный пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 или 34. В некоторых вариантах реализации карбокси-концевая часть γ-цепи ТКР содержит трансмембранный домен, имеющий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 8 и 14-26.

[0495] В варианте конструкции хаТКР-2 (IgV_H-IgC_H1-шарнир-ТКРδ/IgV_L-IgC_L-линкер-ТКРγ) вариабельный домен, первый константный домен и шарнирная область (IgV_H-IgC_H1-шарнир) тяжелой цепи антитела замещают амино-концевую часть δ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене δ-цепи ТКР после области Vδ-Cδ, необязательно, при этом трансмембранный домен δ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот. Вариабельный домен и константный домен соответствующей легкой цепи антитела, слитые с линкером (IgV_L-IgC_L-линкер), замещают амино-концевую часть γ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене γ-цепи ТКР после области Vγ-Cγ, необязательно, при этом трансмембранный домен γ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот.

[0496] В варианте конструкции хаТКР-3 (IgV_H-IgC_H1-шарнир-ТКРδ/IgV_H-IgC_H1-шарнир-ТКРγ+IgV_L-IgC_L) вариабельный домен, первый константный домен и шарнирная область (IgV_H-IgC_H1-шарнир) тяжелой цепи антитела замещают амино-концевую часть δ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене δ-цепи ТКР после области Vδ-Cδ, необязательно, при этом трансмембранный домен δ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот. Вариабельный домен, первый константный домен и шарнирная область (IgV_H-IgC_H1-шарнир) тяжелой цепи антитела замещают амино-концевую часть γ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене γ-цепи ТКР после области Vγ-Cγ, необязательно, при этом трансмембранный домен γ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот. Вариабельный домен и константный домен соответствующей легкой цепи антитела (IgV_L-IgC_L) связаны с доменами IgV_H-IgC_H1.

[0497] В варианте конструкции хаТКР-4 (IgV_H-ТКРδ/IgV_L-TCRγ) вариабельный домен (IgV_H) тяжелой цепи антитела замещает амино-концевую часть δ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене δ-цепи ТКР после области Vδ-Cδ, необязательно, при этом трансмембранный домен δ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот. Вариабельный домен (IgV_L) соответствующей легкой цепи антитела замещает амино-концевую часть γ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене γ-цепи ТКР после области Vγ-Cγ, необязательно, при этом трансмембранный домен γ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот.

[0498] В варианте конструкции хаТКР-5 (IgV_H-IgV_L-ТКРδ/ТКРγ) вариабельный домен тяжелой цепи антитела, слитый с вариабельным доменом соответствующей легкой цепи антитела (IgV_H-IgV_L или IgV_L-IgV_H) замещает амино-концевую часть δ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене δ-цепи ТКР после области Vδ-Cδ, необязательно, при этом трансмембранный домен δ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот. Амино-концевая часть γ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене γ-цепи ТКР после области Vγ-Cγ, удалена, необязательно, при этом трансмембранный домен γ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот.

[0499] В варианте конструкции хаТКР-6 (IgV_H-IgV_L-ТКРδ/IgV_H-IgV_L-ТКРγ) вариабельный домен тяжелой цепи антитела, слитый с вариабельным доменом соответствующей легкой цепи антитела (IgV_H-IgV_L или IgV_L-IgV_H) замещает амино-концевую часть δ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене δ-цепи ТКР после области Vδ-Cδ, необязательно, при этом трансмембранный домен δ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот. Вариабельный домен тяжелой цепи антитела, слитый с вариабельным доменом соответствующей легкой цепи антитела (IgV_H-IgV_L или IgV_L-IgV_H) замещает амино-концевую часть γ-цепи ТКР вплоть до позиции, граничащей или находящейся в пределах соединительного пептида во внеклеточном домене γ-цепи ТКР после области Vγ-Cγ, необязательно, при этом трансмембранный домен γ-цепи ТКР модифицирован, например, путем замены одной или более аминокислот.

Пример 2. Конструирование и изучение характеристик Т-клеток, трансдуцированных анти-CD19 хаТКР-1 и анти-CD19 химерным стимулирующим рецептором

[0500] Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий анти-CD19 связывающий фрагмент (SEQ ID NO: 58 и 59), использовали для получения как химерного, так и костимулирующего рецептора (ХСР; также называемого в данном документе «ХСР1»), содержащего трансмембранную и внутриклеточную сигнальную последовательности CD28 (SEQ ID NO: 51) и конструкции хаТКР-1 (хаТКР-1-0 или хаТКР-1-TM5). Первичные Т-клетки трансдуцировали одним ХСР, одним хаТКР-1-0, хаТКР-1-0 в комбинации с ХСР или хаТКР-1-TM5 в комбинации с ХСР. Эффективность трансдукции определяли по окрашиванию поверхности клеток, а все Т-клетки хаТКР-1 подбирали так, чтобы они соответствовали приблизительно 40% рецептор-положительных клеток, путем смешивания с контрольными Т-клетками.

In vitro уничтожение

[0501] CD80/86-отрицательные клетки NALM6 (клетки лейкоза, экспрессирующие CD19) использовали в качестве целевых клеток для стимуляции Т-клеток в соотношении эффектор - мишень 2,5:1. Специфический лизис Т-клеток измеряли после 16 ч инкубации, используя нерадиоактивный анализ цитотоксичности Cytox 96 (Promega).

[0502] Экспрессия анти-CD19-ХСР с анти-CD19-хаТКР-1-0 или анти-CD19-хаТКР-1-ТМ5 позволила получить полностью функциональные цитотоксические Т-клетки, способные к лизису опухолевых клеток NALM6 in vitro (Фиг. 2). Так как Т-клетки, экспрессирующие только хаТКР-1-0, и клетки, экспрессирующие как хаТКР-1 (хаТКР-1-0 или хаТКР-1-ТМ5), так и ХСР все были способны к лизису практически 100% целевых клеток NALM6, существенной разницы между числом уничтоженных целевых клеток между двумя типами Т-клеток не наблюдали.

Секреция цитокинов

[0503] Концентрацию цитокинов, высвобождаемых в супернатант реакций in vitro уничтожения, измеряли с помощью Bioplex200 (Luminex), используя 8-канальный набор Bio-plex Pro Human Cytokine (BioRad). Т-клетки, экспрессирующие ХСР в комбинации с хаТКР (ХСР-положительные и хаТКР-положительные Т-клетки), высвобождали большее количество цитотоксических цитокинов, чем Т-клетки, экспрессирующие только хаТКР-1-0 (Фиг. 3).

Экспрессия внутриклеточных цитокинов

[0504] Т-клетки стимулировали целевыми клетками в соотношении Э:М 1:2 в присутствии ингибитора секреции брефелдина A (BFA) в течение 4 часов. Т-клетки пермеабилизировали и использовали специфические к цитокинам антитела для обнаружения цитокинов, экспрессируемых в ответ на опухолевую стимуляцию. Процент цитокин-положительных клеток определяли методом проточной цитометрии. ХСР-положительные и хаТКР-положительные Т-клетки экспрессировали большее количество внутриклеточных цитокинов, чем T-клетки, экспрессирующие только хаТКР-1-0 (Таблица 5).

Таблица 5

Экспрессия внутриклеточного TNFα в CD8+ Т-клетках
% Положительных	Raji	NALM6	Только T-клетки
ХСР	0,58	0,44	0,04
хаТКР-1-0	24,3	20,1	0,04
хаТКР-1-0+ХСР	28,7	28,2	0,07
хаТКР-1-ТМ5+ХСР	29	31,5	0,04
Экспрессия внутриклеточного IL-2 в CD8+ Т-клетках
% Положительных	Raji	NALM6	Только T-клетки
ХСР	0,97	0,71	0,49
хаТКР-1-0	8,5	4,36	0,61
хаТКР-1-0+ХСР	12,5	8,2	0,53
хаТКР-1-ТМ5+ХСР	10,6	8,2	0,65
Экспрессия внутриклеточного IFN-γ в CD8+ Т-клетках
% Положительных	Raji	NALM6	Только T-клетки
ХСР	1,43	2,28	0,17
хаТКР-1-0	18,2	15,5	0,78
хаТКР-1-0+ХСР	21,8	18,8	1,72
хаТКР-1-ТМ5+ХСР	18,5	16,4	0,51

[0505] В совокупности полученные результаты указывают на то, что добавление ХСР повышает чувствительность и ответ Т-клеток хаТКР. Повышение количества цитокинов, экспрессируемых и высвобождаемых из двойных ХСР-хаТКР-положительных Т-клеток, указывает на то, что костимуляция как хаТКР-1, так и ХСР повышает цитотоксический потенциал Т-клеток.

Дегрануляция

[0506] Основной механизм, посредством которого Т-клетки осуществляют лизис опухолевых клеток, заключается в выработке секреторных гранул цитотоксических молекул, которые высвобождаются в целевые клетки. CD107a можно использовать в качестве маркера активности дегрануляции, а повышенная экспрессия CD107a коррелирует с повышение цитотоксической функции Т-клеток.

[0507] Т-клетки смешивали с флуоресцентно-конъюгированным анти-CD107a и стимулировали целевыми клетками в соотношении Э:М 1:2 в присутствии ингибитора эндоцитоза монензина в течение 4 часов. Количество CD107a, обнаруживаемое на поверхности Т-клеток, является прямым показателем степени цитотоксической дегрануляции, индуцируемой распознаванием антигена. Привлечение ХСР к Т-клеткам хаТКР повышало дегрануляцию Т-клеток, дополнительно демонстрируя, что ХСР делает терапевтические Т-клетки более реакционноспособными в отношении предполагаемых опухолевых клеток (Фиг. 4).

Пролиферация

[0508] Пролиферация и персистенция генетически модифицированных Т-клеток являются важными для успеха терапии на основе адоптивного переноса Т-клеток при лечении раковых заболеваний. Чтобы оценить эффект ХСР на пролиферацию и персистенцию Т-клеток, Т-клетки метили внутриклеточным красителем CFSE и наблюдали разведение красителя по мере деления Т-клеток при стимуляции опухолевыми клетками. Мы также смогли определить персистенцию Т-клеток путем подсчета числа CFSE-положительных клеток, остававшихся на указанные сутки.

[0509] Соответствующие Т-клетки избавляли от сыворотки в течение ночи и метили CFSE, используя CellTrace CFSE (Thermo Fisher C34554). 100 000 Т-клеток инкубировали в соотношении Э:М 2:1, и использовали метод проточной цитометрии для наблюдения серийного разведения красителя CFSE по мере деления Т-клеток в указанные сутки. Общее число Т-клеток подсчитывали с помощью FACS.

[0510] Разведение CFSE увеличилось при стимуляции ХСР, что указывает на то, что эти Т-клетки имели более высокий потенциал пролиферации (Фиг. 5). Важно также повышение числа клеток, что означает, что клетки не только лучше пролиферируют, но также поддерживается их персистенция (Таблица 6).

Таблица 6

# T-клеток, сохраняющихся после взаимодействия
	BV173	NALM6
	-0	-0 +ХСР	-ТМ5 +ХСР	-0	-0 +ХСР	-ТМ5 +ХСР
Сутки 3	10354	28847	38830	6591	17260	32331
Сутки 5	2945	16049	26551	1240	2988	8620
Сутки 7	253	2135	5985	329	158	684

[0511] Результаты показывают, что мы смогли одновременно стимулировать как ХСР, так и хаТКР опухолевыми клетками, экспрессирующими как целевой лиганд, так и целевой антиген, и что костимуляция ХСР и хаТКР повышала цитотоксичность, пролиферационный потенциал и персистенцию Т-клеток хаТКР. Все эти характеристики смогут повысить терапевтический потенциал терапии на основе хаТКР с применением адоптивного переноса.

Пример 3. Конструирование и изучение характеристик Т-клеток, трансдуцированных анти-AFP хаТКР-1 и анти-GPC3 ХСР

[0512] Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий анти-AFP связывающий фрагмент (SEQ ID NO: 62 и 63) использовали для создания конструкций хаТКР-1 (хаТКР-1-0 или хаТКР-1-TM5). Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий анти-GPC3 связывающий фрагмент (SEQ ID NO: 64 и 65) использовали для создания ХСР (т. е. ХСР1), содержащего трансмембранную и внутриклеточную сигнальную последовательности CD28 (SEQ ID NO: 51).

In vitro уничтожение

[0513] Клетки HEPG2 (клетки рака печени человека, экспрессирующие AFP и GPC3) и клетки HEPG2-GPC3.KO (клетки HEPG2 с целевым нокаутом гена GPC3) использовали в качестве целевых мишеней для стимуляции Т-клеток в соотношении эффекторных и целевых клеток 2,5:1. Специфический лизис Т-клеток измеряли после 16 ч инкубации, используя нерадиоактивный анализ цитотоксичности Cytox 96 (Promega).

[0514] Экспрессия анти-GPC3-ХСР с анти-AFP-хаТКР-1-0 или анти-AFP-хаТКР-1-ТМ5 позволила получить полностью функциональные цитотоксические Т-клетки, способные к лизису клеток HEPG2 in vitro (Фиг. 6). Т-клетки, экспрессирующие только хаТКР-1-0, характеризовались намного меньшим специфическим уничтожением (около 15%), чем те, которые экспрессировали как хаТКР-1 (хаТКР-1-0 или хаТКР-1-ТМ5), так и ХСР (от около 55% до около 65%). В противоположность этому, специфическое уничтожение было снижено до около 10% для Т-клеток, экспрессирующих как хаТКР, так и ХСР, при применении целевых клеток HEPG2-GPC3.KO (Фиг. 6), что указывает на то, что взаимодействие ХСР со своим целевым лигандом отвечает за повышение цитотоксичности.

Секреция цитокинов

[0515] Концентрацию цитокинов, высвобождаемых в супернатант экспериментов in vitro уничтожения, измеряли с помощью Bioplex200 (Luminex), используя 8-канальный набор Bio-plex Pro Human Cytokine (BioRad). CDR-положительные и хаТКР-положительные Т-клетки высвобождали большее количество цитотоксических цитокинов, чем Т-клетки, экспрессирующие только хаТКР-1-0, в случае целевых клеток HEPG2, экспрессирующих как целевой антиген хаТКР, так и целевой лиганд ХСР (Фиг 7). В противоположность этому, между Т-клетками, экспрессирующими только хаТКР-1-0 или как хаТКР, так и ХСР, в случае целевых клеток HEPG2-GPC3.KO с отсутствием целевого лиганда ХСР, различия были небольшими или отсутствовали (Фиг. 7).

Экспрессия внутриклеточных цитокинов

[0516] Т-клетки стимулировали целевыми клетками (HEPG2) в соотношении Э:М 1:2 в присутствии ингибитора секреции брефелдина A (BFA) в течение 4 часов. Т-клетки пермеабилизировали и использовали специфические к цитокинам антитела для обнаружения цитокинов, экспрессируемых в ответ на опухолевую стимуляцию. Процент цитокин-положительных клеток определяли методом проточной цитометрии. ХСР-положительные и хаТКР-положительные Т-клетки экспрессировали большее количество внутриклеточных цитокинов, чем T-клетки, экспрессирующие только хаТКР-1-0 (Таблица 7).

Таблица 7

Экспрессия внутриклеточного TNFα в CD8+ Т-клетках
% Положительных	HEPG2	Только T-клетки
ХСР	0,3	0,2
хаТКР-1-0	14,7	0,1
хаТКР-1-0+ХСР	17,0	0,1
хаТКР-1-ТМ5+ХСР	15,7	0,1
Экспрессия внутриклеточного IL-2 в CD4+ Т-клетках
% Положительных	HEPG2	Только T-клетки
ХСР	0,1	0,04
хаТКР-1-0	8,2	0,11
хаТКР-1-0+ХСР	9,8	0,05
хаТКР-1-ТМ5+ХСР	11,2	0,03
Экспрессия внутриклеточного IFN-γ в CD8+ Т-клетках
% Положительных	HEPG2	Только T-клетки
ХСР	0,2	0,08
хаТКР-1-0	3,1	0,2
хаТКР-1-0+ХСР	4,5	0,1
хаТКР-1-ТМ5+ХСР	5,1	0,06

[0517] В совокупности полученные результаты показывают, что добавление ХСР повышает чувствительность и ответ Т-клеток хаТКР плюс ХСР, имеющих разные целевые антигены хаТКР и целевые лиганды ХСР. Повышение количества цитокинов, экспрессируемых и высвобождаемых из этих двойных ХСР-хаТКР-положительных Т-клеток, обеспечивает дополнительные свидетельства того, что костимуляция как хаТКР-1, так и ХСР повышает цитотоксический потенциал Т-клеток.

Дегрануляция

[0518] Т-клетки смешивали с флуоресцентно-конъюгированным анти-CD107a и стимулировали целевыми клетками HEPG2 в соотношении Э:М 1:2 в присутствии ингибитора эндоцитоза монензина в течение 4 часов. Привлечение ХСР к Т-клеткам хаТКР повышало дегрануляцию Т-клеток, дополнительно демонстрируя, что ХСР делает терапевтические Т-клетки более реакционноспособными в отношении предполагаемых опухолевых клеток (Фиг. 8).

Пролиферация

[0519] Т-клетки метили внутриклеточным красителем CFSE, и измеряли разведение красителя и число CFSE-положительных клеток, остававшихся в указанные сутки.

[0520] Соответствующие Т-клетки избавляли от сыворотки в течение ночи и метили CFSE, используя CellTrace CFSE (Thermo Fisher C34554). 100 000 Т-клеток инкубировали в соотношении Э:М 2:1, и использовали метод проточной цитометрии для наблюдения серийного разведения красителя CFSE по мере деления Т-клеток в указанные сутки. Общее число Т-клеток подсчитывали с помощью FACS.

[0521] Разведение CFSE увеличилось при стимуляции ХСР, что указывает на то, что эти Т-клетки имели более высокий потенциал пролиферации (Фиг. 9). Важно также повышение числа клеток, что означает, что клетки не только лучше пролиферируют, но также поддерживается их персистенция (Таблица 8).

Таблица 8

# T-клеток, сохраняющихся после взаимодействия с HEPG2
	Сутки 3	Сутки 5	Сутки 7
ХСР	7147	4519	3055
хаТКР1-0	5674	4362	3372
хаТКР1-0 +ХСР	31422	18689	8833
хаТКР-1-ТМ5+ХСР	28874	21978	9471

[0522] Результаты показывают, что мы смогли одновременно стимулировать как ХСР, так и хаТКР лиганд-положительными опухолевыми клетками и что костимуляция ХСР и хаТКР повышала цитотоксичность, пролиферационный потенциал и персистенцию Т-клеток хаТКР. Все эти характеристики смогут повысить терапевтический потенциал терапии на основе хаТКР с применением адоптивного переноса.

Пример 4. Конструирование и изучение характеристик Т-клеток, трансдуцированных анти-CD19 хаТКР-1 и анти-CD20 ХСР

[0523] Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий анти-CD20 связывающий фрагмент (SEQ ID NO: 60 и 61) использовали для создания анти-CD20 ХСР (т. е. «ХСР1»), который содержит трансмембранную и внутриклеточную сигнальную последовательности CD28 (SEQ ID NO: 51), который экспрессировали в том же векторе, который экспрессировал анти-CD19 хаТКР-1-0 или хаТКР-1-TM5, полученном с помощью анти-CD19 связывающего фрагмента (SEQ ID NO: 58 и 59).

In vitro уничтожение

[0524] Клетки Raji, BV173, NALM6 и Jeko-1 (клеточные линии, которые экспрессируют CD19 и CD20) использовали в качестве целевых клеток для Т-клеточного уничтожения в соотношении эффектор - мишень 2,5:1. Специфический лизис Т-клеток измеряли после 16 ч инкубации, используя нерадиоактивный анализ цитотоксичности Cytox 96 (Promega).

[0525] Экспрессия анти-CD20-ХСР с анти-CD19-хаТКР-1-0 или анти-CD19-хаТКР-1-TM5 позволила получить полностью функциональные цитотоксические Т-клетки, способные к лизису ряда CD19-положительных, CD20-положительных опухолевых клеток in vitro (Фиг. 10).

Секреция цитокинов

[0526] Концентрацию цитокинов, высвобождаемых в супернатант экспериментов по in vitro уничтожению Raji, измеряли с помощью Bioplex200 (Luminex), используя 8-канальный набор Bio-plex Pro Human Cytokine (BioRad). ХСР-положительные и хаТКР-положительные Т-клетки высвобождали большее количество GM-CSF, IFNγ и TNFα, чем T-клетки, экспрессирующие только хаТКР-1-0 (Фиг. 11).

Дегрануляция

[0527] Т-клетки смешивали с флуоресцентно-конъюгированным анти-CD107a и стимулировали целевыми клетками Raji в соотношении Э:М 1:2 в присутствии ингибитора эндоцитоза монензина в течение 4 часов. Привлечение ХСР к Т-клеткам хаТКР повышало дегрануляцию Т-клеток, дополнительно демонстрируя, что ХСР делает терапевтические Т-клетки более реакционноспособными в отношении предполагаемых опухолевых клеток (Фиг. 12).

[0528] Примеры 2-4 демонстрируют, что ХСР представляет собой модульную молекулу, которую можно использовать в комбинации с различными антигенсвязывающими фрагментами для повышения терапевтического потенциала хаТКР-экспрессирующих Т-клеток для широкого спектра клеток заболеваний.

Пример 5. Конструирование и изучение характеристик Т-клеток, трансдуцированных вариантами анти-CD19 хаТКР-1 и анти-CD19 химерного стимулирующего рецептора

[0529] Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий анти-CD19 связывающий фрагмент (SEQ ID NO: 58 и 59) использовали для создания как химерного костимулирующего рецептора (ХСР), так и конструкции хаТКР-1-0 (называемой в этом примере «хаТКР-1»). Разные ХСР получали путем слияния анти-CD19 связывающего фрагмента с последовательностью ХСР. ХСР1 содержит трансмембранную и внутриклеточную сигнальную последовательности CD28 (SEQ ID NO: 90). ХСР2 содержит трансмембранную последовательность CD8 и внутриклеточную сигнальную последовательность 4-1BB (SEQ ID NO: 91). ХСР3 содержит трансмембранную и внутриклеточную сигнальную последовательности 4-1BB (SEQ ID NO: 92). ХСР4 содержит трансмембранную последовательность CD8 и внутриклеточную сигнальную последовательность CD27 (SEQ ID NO: 93). ХСР5 содержит трансмембранную и внутриклеточную сигнальную последовательности CD27 (SEQ ID NO: 94). ХСР6 содержит трансмембранную последовательность CD8 и внутриклеточную сигнальную последовательность CD30 (SEQ ID NO: 95). ХСР7 содержит трансмембранную и внутриклеточную сигнальную последовательности CD30 (SEQ ID NO: 96). ХСР8 содержит трансмембранную последовательность CD8 и внутриклеточную сигнальную последовательность OX40 (SEQ ID NO: 97). ХСР9 содержит трансмембранную и внутриклеточную сигнальную последовательности OX40 (SEQ ID NO: 98).

[0530] Первичные Т-клетки трансдуцировали только анти-CD19 ХСР или анти-CD19 хаТКР-1 в комбинации с анти-CD19 ХСР. Эффективность трансдукции определяли по окрашиванию поверхности клеток, а все хаТКР-трансдуцированные Т-клетки подбирали так, чтобы они соответствовали приблизительно 40% рецептор-положительных клеток, путем смешивания с контрольными Т-клетками.

Т-клетки, экспрессирующие только анти-CD19 ХСР

In vitro уничтожение

[0531] Клетки Raji или NALM6 использовали в качестве целевых клеток для стимуляции Т-клеток в соотношении эффектор - мишень 2,5:1. Специфический лизис Т-клеток измеряли после 16 ч инкубации, используя нерадиоактивный анализ цитотоксичности Cytox 96 (Promega). Т-клетки, экспрессирующие только анти-CD19 ХСР-6, ХСР-7, ХСР-8 или ХСР-9, не приводили к увеличению числа уничтоженных целевых клеток по сравнению с нетрансдуцированными контрольными Т-клетками (данные не показаны).

Секреция цитокинов

[0532] Концентрацию цитокинов, высвобождаемых в супернатант реакций in vitro уничтожения, измеряли с помощью Bioplex200 (Luminex), используя 8-канальный набор Bio-plex Pro Human Cytokine (BioRad). Т-клетки, экспрессирующие только анти-CD19 ХСР-6, ХСР-7, ХСР-8 или ХСР-9, не приводили к высвобождению существенного количества IFNγ при инкубации с Raji или NALM6 (данные не показаны).

Т-клетки, экспрессирующие анти-CD19 хаТКР-1 и анти-CD19 ХСР

[0533] В двух разных партиях экспериментов соответствующие Т-клетки, экспрессирующие как анти-CD19 хаТКР-1, так и анти-CD19 ХСР, избавляли от сыворотки в течение ночи и метили CFSE, используя CellTrace CFSE (Thermo Fisher C34554). Т-клетки инкубировали с NALM6 в соотношении Э:М 2:1, и использовали метод проточной цитометрии для наблюдения серийного разведения красителя CFSE по мере деления Т-клеток в указанные сутки. Общее число Т-клеток подсчитывали с помощью FACS. Эти эксперименты повторяли, используя первичные Т-клетки, полученные от второго донора. Наблюдали аналогичные результаты (данные не показаны).

[0534] Разведение CFSE наблюдали во всех Т-клетках, экспрессирующих как анти-CD19 хаТКР-1, так и анти-CD19 ХСР, что указывает на высокий потенциал пролиферации этих Т-клеток (Фиг. 14-15). Кроме того, Т-клетки, экспрессирующие как анти-CD19 хаТКР-1, так и анти-CD19 ХСР, демонстрировали существенную персистенцию в течение 10 суток (Таблица 9). В контрольном эксперименте Т-клетки, экспрессирующие только любой из анти-CD19 ХСР-1 - анти-CD19 ХСР-5, не демонстрировали повышенный потенциал пролиферации или персистенцию в течении времени (данные не показаны).

Таблица 9

# T-клеток, сохраняющихся после взаимодействия с NALM6
	хаТКР-1+ХСР-1	хаТКР-1+ХСР-2	хаТКР-1+ХСР-3	хаТКР-1+ХСР-4	хаТКР-1+ХСР-5
Сутки 3	144622	171874	128353	158852	173153
Сутки 5	307957	196842	126643	237138	275630
Сутки 7	187440	184933	75822	163892	168092
Сутки 10	88562	114640	36480	111527	118921
# T-клеток, сохраняющихся после взаимодействия с NALM6
	хаТКР-1+ХСР-1	хаТКР-1+ХСР-6	хаТКР-1+ХСР-7	хаТКР-1+ХСР-8	хаТКР-1+ХСР-9
Сутки 3	206073	234073	202600	264248	240125
Сутки 5	89685	243962	226587	264685	225515
Сутки 7	111523	186479	187614	175982	150052
Сутки 10	141112	285946	278322	274536	228298

Пример 6: In vivo исследование эффективности Т-клеток, трансдуцированных анти-CD19 хаТКР-1 и анти-CD19 ХСР

[0535] In vivo противоопухолевую активность Т-клеток, экспрессирующих как анти-CD19 хаТКР-1, так и анти-CD19 ХСР-1, исследовали в модели острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) с человеческими CD19+ NALM-6 пре-B. Экспрессирующие люциферазу клетки NALM-6 внутривенно (в/в) имплантировали мышам NOD SCID гамма (NSG) с ослабленным иммунитетом и оценивали опухолевую нагрузку путем измерения биолюминесценции из опухоли. Через шесть суток после имплантации опухоли мышей рандомизировали на основании общего биолюминесцентного потока по группам обработки: (1) в/в инъекция 5×10⁶ нетрансдуцированных соответствующих донорным (контрольных) Т-клеток, (2) в/в инъекция 2×10⁶Т-клеток, экспрессирующих только анти-CD19 хаТКР-1 («хаТКР-1 Т-клетка»), и (3) в/в инъекция 2×10⁶ Т-клеток, экспрессирующих как анти-CD19 хаТКР-1, так и анти-CD19 ХСР-1 («хаТКР-1 ХСР-1 Т-клетка»; n=6 мышей/группа). Эффект на здоровье в результате инфузий Т-клеток у мышей оценивали, отслеживая их общий внешний вид, массу тела и другие клинические признаки неблагоприятного ответа (включая гипотермию, затрудненное дыхание и паралич/слабость задних конечностей).

[0536] Как проиллюстрировано на Фиг. 16, хотя обработка как Т-клетками хаТКР-1, так и Т-клетками хаТКР-1 ХСР-1 приводила к ингибированию роста опухоли, Т-клетки хаТКР-1 ХСР-1 демонстрировали повышенную противоопухолевую активность по сравнению с Т-клетками хаТКР-1. Все мыши, обработанные Т-клетками хаТКР-1 и Т-клетками хаТКР-1 ХСР-1, демонстрировали нормальную походку, состояние и активность/ответ в течение всего исследования. Кроме того, мыши, обработанные Т-клетками хаТКР-1, и мыши, обработанные Т-клетками хаТКР-1 ХСР-1, не теряли массу тела во время исследования. В целом, отсутствие наблюдаемых аномальных параметров у обработанных мышей демонстрирует безопасность терапии на основе Т-клеток хаТКР-1 ХСР-1.

[0537] Чтобы определить уровень высвобождения цитокинов in vivo, ключевые цитокины, включая связанные с клиническим синдромом высвобождения цитокинов, анализировали через 24 часа после введения несущим опухоли NALM-6 мышам анти-CD19 ХАР-Т-клеток или Т-клеток хаТКР-1 ХСР-1. Уровни цитокинов количественно оценивали с помощью технологии Luminex Magpix, используя наборы BioRad Bio-Plex. Как проиллюстрировано на Фиг. 17, мыши, обработанные Т-клетками хаТКР-1 ХСР-1, имели существенно меньший уровень высвобождения цитокинов, чем мыши, обработанные ХАР-Т.

Пример 7: In vivo исследование эффективности Т-клеток, трансдуцированных анти-AFP хаТКР-1 и анти-GPC3 ХСР

[0538] In vivo противоопухолевую активность Т-клеток, экспрессирующих как анти-AFP хаТКР-1, так и анти-GPC3 ХСР-1 (смотрите пример 3 в отношении информации о конструкции), исследовали в ксенографтной модели развитого AFP⁺/HLA-A2⁺ Hep G2 рака печени человека. Клетки Hep G2 имплантировали подкожно (п/к) в правый бок мышей линии SCID-Beige. Когда опухоли достигали ~100 мм³, мышам внутриопухолево (в/о) вводили (1) 5×10⁶нетрансдуцированных соответствующих донорным (контрольных) Т-клеток, (2) 2×10⁶Т-клеток, экспрессирующих анти-AFP ХАР, содержащий такой же анти-AFP связывающий фрагмент (SEQ ID NO: 62 и 63), или (3) 2×10 ⁶ Т-клеток, экспрессирующих как анти-AFP хаТКР-1, так и анти-GPC3 ХСР-1 (n=6 мышей/группа). Эффект на здоровье в результате инфузий Т-клеток у мышей оценивали, отслеживая их общий внешний вид, массу тела и другие клинические признаки неблагоприятного ответа (включая гипотермию, затрудненное дыхание и паралич/слабость задних конечностей).

[0539] Как проиллюстрировано на Фиг. 18, как обработка Т-клетками анти-AFP ХАР, так и обработка Т-клетками анти-AFP хаТКР-1/анти-GPC3 ХСР-1 приводили к выраженному и существенному (****P < 0,0001; критерий множественного сравнения Даннета) ингибированию роста опухоли. Все мыши, обработанные анти-AFP ХАР-Т и Т-клетками анти-AFP хаТКР-1/анти-GPC3 ХСР-1, демонстрировали нормальную походку, состояние и активность/ответ в течение всего исследования. Кроме того, мыши, обработанные анти-AFP ХАР-Т и Т-клетками анти-AFP хаТКР-1/анти-GPC3 ХСР-1, не теряли массу тела во время исследования. В целом отсутствие наблюдаемых аномальных параметров у обработанных мышей демонстрирует безопасность терапии на основе Т-клеток анти-AFP хаТКР-1/анти-GPC3 ХСР-1.

Перечень последовательностей

SEQ ID NO	Описание	Последовательность
1	Константный домен ТКРα	PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
2	Константный домен ТКРβ	EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
3	Константный домен ТКРδ	SQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
4	Константный домен ТКРγ	DKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS
5	Трансмембранный домен ТКРα	ILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
6	Трансмембранный домен ТКРβ	TILYEILLGKATLYAVLVSALVL
7	Трансмембранный домен ТКРδ	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
8	Трансмембранный домен ТКРγ (такой же, как uniprot)	YYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLL
9	Трансмембранный домен ТКРδ F24S	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFSL
10	Трансмембранный домен ТКРδ M6V	VLGLRVLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
11	Трансмембранный домен ТКРδ L4C	VLGCRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
12	Трансмембранный домен ТКРδ V12F, N15S	VLGLRMLFAKTFAVSFLLTAKLFFL
13	Трансмембранный домен ТКРδ L25S	VLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFS
14	Трансмембранный домен ТКРγ V13Y	YYMYLLLLLKSVYYFAIITCCLLRRTAF
15	Трансмембранный домен ТКРγ C21G	YYMYLLLLLKSVVYFAIITCGLLRRTAF
16	Трансмембранный домен ТКРγ Y2L, M3V, A16V, I18V	YLVYLLLLLKSVVYFVIVTCCLLRRTAF
17	Трансмембранный домен ТКРγ Y2L	YLMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAF
18	Трансмембранный домен ТКРγ M3V	YYVYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAF
19	Трансмембранный домен ТКРγ A16V	YYMYLLLLLKSVVYFVIITCCLLRRTAF
20	Трансмембранный домен ТКРγ I18V	YYMYLLLLLKSVVYFAIVTCCLLRRTAF
21	Трансмембранный домен ТКРγ M3I	YYIYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAF
22	Трансмембранный домен ТКРγ Y2I, M3I, A16I, I18L	YIIYLLLLLKSVVYFIILTCCLLRRTAF
23	Трансмембранный домен ТКРγ L5C	YYMYCLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAF
24	Трансмембранный домен ТКРγ L8F, V12F, F15S	YYMYLLLFLKSFVYSAIITCCLLRRTAF
25	Трансмембранный домен ТКРγ C19M	YYMYLLLLLKSVVYFAIITMCLLRRTAF
26	Трансмембранный домен ТКРγ Y1Q	QYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAF
27	Соединительный пептид ТКРα	ESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFR
28	Соединительный пептид ТКРα MD	IPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFR
29	Соединительный пептид ТКРβ	ADCGFTSVSYQQGVLSA
30	Соединительный пептид ТКРβ MD	GRADCGFTSVSYQQGVLSA
31	Соединительный пептид ТКРδ	DHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLR
32	Соединительный пептид ТКРδ MD	EVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLR
33	Соединительный пептид ТКРγ	MDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSA
34	Соединительный пептид ТКРγ MD	PIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSA
35	Внутриклеточный домен ТКРβ	MAMVKRKDF
36	Внутриклеточный домен ТКРγ	RRTAFCCNGEKS
37	IgG1 C_H1	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
38	IgG2-°C C_H1	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERK
39	IgG2-1C C_H1	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC
40	IgG2-2C C_H1	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC
41	IgG3 C_H1	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTP
42	IgG4 C_H1	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG
43	IgA1 C_H1	ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPS
44	IgA2 C_H1	ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPP
45	IgD C_H1	APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP
46	IgE C_H1	ASTQSPSVFPLTRCCKNIPSNATSVTLGCLATGYFPEPVMVTWDTGSLNGTTMTLPATTLTLSGHYATISLLTVSGAWAKQMFTCRVAHTPSSTDWVDNKTFS
47	IgM C_H1	GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLP
48	Домен IgC_L	GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
49	Фрагмент CD28	IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
50	Фрагмент CD3-дзета	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
51	Костимулирующий фрагмент CD28 1	IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
52	Костимулирующий фрагмент CD28 2	RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
53	Костимулирующий фрагмент 4-1BB 1	PADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
54	Костимулирующий фрагмент 4-1BB 2	KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
55	Костимулирующий фрагмент OX40 1	DPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
56	Костимулирующий фрагмент OX40 2	ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
57	Фрагмент ТМ CD8	TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
58	Домен IgV_H анти-CD19 антитела	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARQVWGWQGGMYPRSNWWYNLDSWGQGTLVTVSS
59	Домен IgV_L анти-CD19 антитела	LPVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDYVVFGGGTKLTVLG
60	Домен IgV_H анти-CD20 антитела	QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSS
61	Домен IgV_L анти-CD20 антитела	QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKR
62	Домен IgV_H анти-AFP антитела	EVQLVQSGAEVKKPGESLTISCKASGYSFPNYWITWVRQMSGGGLEWMGRIDPGDSYTTYNPSFQGHVTISIDKSTNTAYLHWNSLKASDTAMYYCARYYVSLVDIWGQGTLVTVSS
63	Домен IgV_L анти-AFP антитела	QSVLTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNNRPSEVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTTGSRAVFGGGTKLTVL
64	Домен IgV_H анти-GPC3 антитела	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSS
65	Домен IgV_L анти-GPC3 антитела	QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLG
66	Домен IgV_H анти-CD47	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNFNEKFKNRVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYTMDYWGQGTLVTVSS
67	Домен IgV_L анти-CD47	DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYKVSYRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPRTFGQGTKVEIKR
68	анти-AFP158/HLA-A*02:01-хаТКР-1-0 дельта	EVQLVQSGAEVKKPGESLTISCKASGYSFPNYWITWVRQMSGGGLEWMGRIDPGDSYTTYNPSFQGHVTISIDKSTNTAYLHWNSLKASDTAMYYCARYYVSLVDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
69	анти-AFP158/HLA-A*02:01-хаТКР-1-0 гамма	QSVLTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNNRPSEVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTTGSRAVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS
70	анти-AFP158/HLA-A*02:01-хаТКР-1-TM5 дельта	EVQLVQSGAEVKKPGESLTISCKASGYSFPNYWITWVRQMSGGGLEWMGRIDPGDSYTTYNPSFQGHVTISIDKSTNTAYLHWNSLKASDTAMYYCARYYVSLVDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRVLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
71	анти-AFP158/HLA-A*02:01-хаТКР-1-TM5 гамма	QSVLTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNNRPSEVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTTGSRAVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYLVYLLLLLKSVVYFVIVTCCLLRRTAFCCNGEKS
72	анти-CD19-хаТКР-1-0 дельта	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARQVWGWQGGMYPRSNWWYNMDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
73	анти-CD19-хаТКР-1-0 гамма	LPVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSEYVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS
74	анти-CD19-хаТКР-1-TM5 дельта	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARQVWGWQGGMYPRSNWWYNMDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRVLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
75	анти-CD19-хаТКР-1-TM5 гамма	LPVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSEYVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYLVYLLLLLKSVVYFVIVTCCLLRRTAFCCNGEKS
76	Линкер scFv	SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA
77	анти-CD19 scFv	LPVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDYVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARQVWGWQGGMYPRSNWWYNLDSWGQGTLVTVSS
78	анти-CD20 scFv	QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRSRGGGGSGGGGSGGGGSLEQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSS
79	анти-GPC3 #37 scFv	QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSS
80	анти-CD19 ХСР	LPVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDYVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARQVWGWQGGMYPRSNWWYNLDSWGQGTLVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
81	анти-CD20 ХСР	QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRSRGGGGSGGGGSGGGGSLEQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
82	анти-GPC3 ХСР	QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
83	Элемент ответа 6NFAT	GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT
84	Промотор ТА	GCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCCAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAG
85	Промотор NFAT	GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTCTCGAGGCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCCAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAG
86	Костимулирующий фрагмент CD27 1	PTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
87	Костимулирующий фрагмент CD27 2	QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
88	Костимулирующий фрагмент CD30 1	APPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDAGPVLFWVILVLVVVVGSSAFLLCHRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
89	Костимулирующий фрагмент CD30 2	HRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
90	ХСР1	AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
91	ХСР2	AAATGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
92	ХСР3	AAATGPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
93	ХСР4	AAATGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
94	ХСР5	AAATGPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
95	ХСР6	AAATGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCHRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
96	ХСР7	AAATGAPPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDAGPVLFWVILVLVVVVGSSAFLLCHRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
97	ХСР8	AAATGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
98	ХСР9	AAATGDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
99	Домен IgV_H анти-CD19 антитела	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTIADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARQVWGWQGGMYPRSNWWYNLDSWGQGTLVTVSS
100	Домен IgV_L анти-CD19 антитела	LPVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDYVVFGGGTKLTVL
101	Домен IgV_H анти-CD22 антитела	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGSAAWMDSWGQGTLVTVSS
102	Домен IgV_L анти-CD22 антитела	DIQLTQSPSSLSTSVGDRVTITCQASHDIRNYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASNLQTGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQYDGLPLTFGQGTRLEIKR
103	Пептидный линкер	AAA
104	Пептидный линкер	AAATG
105	GPC3-37/CD3 BsAb	QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSTSGGGGSDVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSSGEGTSTGSGGSGGSGGADDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Eureka Therapeutics, Inc.

Liu, Hong

Zhang, Pengbo

Horan, Lucas

Xu, Yiyang

Staley, Binnaz K.

Liu, Lianxing

Yun, Hongruo

<120> КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ХИМЕРНЫЕ АКТИВИРУЮЩИЕ РЕЦЕПТОРЫ И

ХИМЕРНЫЕ СТИМУЛИРУЮЩИЕ РЕЦЕПТОРЫ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 75004-20010.40

<140> Еще не присвоен

<141> Одновременно прилагается

<150> US 62/490,580

<151> 2017-04-26

<150> US 62/490,578

<151> 2017-04-26

<150> US 62/490,576

<151> 2017-04-26

<160> 105

<170> FastSEQ для Windows, версия 4.0

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 1

Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser

1 5 10 15

Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln

20 25 30

Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys

35 40 45

Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val

50 55 60

Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn

65 70 75 80

Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys

85 90 95

Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn

100 105 110

Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val

115 120 125

Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135 140

<210> 2

<211> 177

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

130 135 140

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

165 170 175

Phe

<210> 3

<211> 153

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 3

Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly Thr

1 5 10 15

Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile

20 25 30

Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val

35 40 45

Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr Glu

50 55 60

Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val

65 70 75 80

His Ser Thr Asp Phe Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys

85 90 95

Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys

100 105 110

Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr

115 120 125

Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

145 150

<210> 4

<211> 173

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu

1 5 10 15

Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys

20 25 30

Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His Trp Gln Glu

35 40 45

Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys

50 55 60

Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys

65 70 75 80

Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys

85 90 95

Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val

100 105 110

Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr

115 120 125

Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu

145 150 155 160

Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

165 170

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg

1 5 10 15

Leu Trp Ser Ser

<210> 6

<211> 23

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

1 5 10 15

Leu Val Ser Ala Leu Val Leu

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 7

Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

20 25

<210> 8

<211> 23

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu

<210> 9

<211> 25

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Ser Leu

20 25

<210> 10

<211> 25

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Val Leu Gly Leu Arg Val Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

20 25

<210> 11

<211> 25

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 11

Val Leu Gly Cys Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

20 25

<210> 12

<211> 25

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Phe Ala Val Ser Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

20 25

<210> 13

<211> 25

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 13

Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Ser

20 25

<210> 14

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Tyr Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 15

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 15

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Gly Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 16

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

Tyr Leu Val Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Val

1 5 10 15

Ile Val Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 17

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 17

Tyr Leu Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 18

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Tyr Tyr Val Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 19

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 19

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Val

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 20

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 20

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Val Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 21

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 21

Tyr Tyr Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 22

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 22

Tyr Ile Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ile

1 5 10 15

Ile Leu Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 23

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 23

Tyr Tyr Met Tyr Cys Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 24

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser Phe Val Tyr Ser Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 25

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 25

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Met Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 26

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

Gln Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 27

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 27

Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp

1 5 10 15

Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg

20 25 30

<210> 28

<211> 40

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 28

Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val

1 5 10 15

Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg

35 40

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 29

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

1 5 10 15

Ala

<210> 30

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 30

Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val

1 5 10 15

Leu Ser Ala

<210> 31

<211> 41

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 31

Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys

1 5 10 15

Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met

20 25 30

Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg

35 40

<210> 32

<211> 48

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 32

Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu

1 5 10 15

Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val

20 25 30

His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg

35 40 45

<210> 33

<211> 24

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 33

Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu

1 5 10 15

Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala

<210> 34

<211> 32

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 34

Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser

1 5 10 15

Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala

20 25 30

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 35

Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe

1 5

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 36

Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

1 5 10

<210> 37

<211> 101

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 37

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

65 70 75 80

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

85 90 95

Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 38

<211> 99

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 38

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val

85 90 95

Glu Arg Lys

<210> 39

<211> 100

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 39

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val

85 90 95

Glu Arg Lys Cys

100

<210> 40

<211> 101

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 40

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val

85 90 95

Glu Arg Lys Cys Cys

100

<210> 41

<211> 101

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 41

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

85 90 95

Glu Leu Lys Thr Pro

100

<210> 42

<211> 101

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 42

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

85 90 95

Glu Ser Lys Tyr Gly

100

<210> 43

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 43

Asp Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr Gln Pro

1 5 10 15

Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro Gln

20 25 30

Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val Thr Ala

35 40 45

Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Thr Thr

50 55 60

Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly Lys Ser

65 70 75 80

Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp Val Thr

85 90 95

Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr

100 105 110

Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser

115

<210> 44

<211> 106

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 44

Asp Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr Pro Gln

1 5 10 15

Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro Gln

20 25 30

Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val Thr Ala

35 40 45

Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Thr Thr

50 55 60

Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly Lys Ser

65 70 75 80

Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp Val Thr

85 90 95

Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro

100 105

<210> 45

<211> 159

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 45

Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg

1 5 10 15

His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly

20 25 30

Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser

35 40 45

Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr

50 55 60

Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly

65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu

85 90 95

Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro

100 105 110

Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala

115 120 125

Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys

130 135 140

Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro

145 150 155

<210> 46

<211> 103

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 46

Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg Cys Cys Lys

1 5 10 15

Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr

20 25 30

Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu

35 40 45

Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu Ser Gly

50 55 60

His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys

65 70 75 80

Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp

85 90 95

Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser

100

<210> 47

<211> 104

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 47

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

1 5 10 15

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

20 25 30

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

35 40 45

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

65 70 75 80

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

85 90 95

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro

100

<210> 48

<211> 106

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 48

Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 49

<211> 105

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 49

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

50 55 60

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

65 70 75 80

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

85 90 95

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

100 105

<210> 50

<211> 108

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 50

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

50 55 60

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

65 70 75 80

Gly Lys Gly His Asp Gly Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

85 90 95

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105

<210> 51

<211> 105

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 51

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

50 55 60

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

65 70 75 80

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

85 90 95

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

100 105

<210> 52

<211> 41

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 52

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 53

<211> 94

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 53

Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala

20 25 30

Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg

35 40 45

Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

50 55 60

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

65 70 75 80

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

85 90

<210> 54

<211> 42

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 54

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 55

<211> 106

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 55

Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg

1 5 10 15

Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly

20 25 30

Pro Ser Trp Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu

35 40 45

Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu

50 55 60

Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His

65 70 75 80

Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln

85 90 95

Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

100 105

<210> 56

<211> 42

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 56

Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His

1 5 10 15

Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln

20 25 30

Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

35 40

<210> 57

<211> 69

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 57

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

<210> 58

<211> 130

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 58

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg Ser Asn

100 105 110

Trp Trp Tyr Asn Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 59

<211> 109

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 59

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 60

<211> 121

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 60

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 61

<211> 105

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 61

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Asp Gly Glu Lys

1 5 10 15

Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp

20 25 30

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr

35 40 45

Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala

65 70 75 80

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 62

<211> 117

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 62

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Ser Gly Gly Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ile Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Val Ser Leu Val Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 63

<211> 110

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 63

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Glu Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Gly

85 90 95

Ser Arg Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 64

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Ser Tyr Leu Asn His Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 65

<211> 111

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 65

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Val Tyr Gly Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Thr Leu

85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 66

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 66

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Val Phe Trp Val Arg Gln Arg Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Asp

35 40 45

Ile Asn Pro Val Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Arg Gly

85 90 95

Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 67

<211> 113

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 67

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 68

<211> 286

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 68

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Ser Gly Gly Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ile Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Val Ser Leu Val Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser

210 215 220

Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser

225 230 235 240

Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn

245 250 255

Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr

260 265 270

Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

275 280 285

<210> 69

<211> 283

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 69

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Glu Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Gly

85 90 95

Ser Arg Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr

210 215 220

Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu

225 230 235 240

Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu

245 250 255

Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg

260 265 270

Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

275 280

<210> 70

<211> 286

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Ser Gly Gly Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ile Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Val Ser Leu Val Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser

210 215 220

Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser

225 230 235 240

Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn

245 250 255

Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Val Leu Phe Ala Lys Thr

260 265 270

Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

275 280 285

<210> 71

<211> 283

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 71

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Glu Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Gly

85 90 95

Ser Arg Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr

210 215 220

Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu

225 230 235 240

Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Leu Val Tyr Leu Leu Leu Leu

245 250 255

Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Val Ile Val Thr Cys Cys Leu Leu Arg

260 265 270

Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

275 280

<210> 72

<211> 299

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 72

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg Ser Asn

100 105 110

Trp Trp Tyr Asn Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

130 135 140

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

145 150 155 160

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

165 170 175

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

195 200 205

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

210 215 220

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His

225 230 235 240

Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys

245 250 255

His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser

260 265 270

Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val

275 280 285

Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

290 295

<210> 73

<211> 281

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 73

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Tyr

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp

210 215 220

Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln

225 230 235 240

Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys

245 250 255

Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr

260 265 270

Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

275 280

<210> 74

<211> 299

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg Ser Asn

100 105 110

Trp Trp Tyr Asn Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

130 135 140

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

145 150 155 160

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

165 170 175

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

195 200 205

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

210 215 220

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His

225 230 235 240

Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys

245 250 255

His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser

260 265 270

Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Val Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val

275 280 285

Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

290 295

<210> 75

<211> 281

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 75

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Tyr

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp

210 215 220

Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln

225 230 235 240

Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Leu Val Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys

245 250 255

Ser Val Val Tyr Phe Val Ile Val Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr

260 265 270

Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

275 280

<210> 76

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 76

Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Glu Met Ala

<210> 77

<211> 260

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 77

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu

115 120 125

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

145 150 155 160

Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

165 170 175

Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro

180 185 190

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr

195 200 205

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr

210 215 220

Tyr Cys Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg

225 230 235 240

Ser Asn Trp Trp Tyr Asn Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser

260

<210> 78

<211> 245

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 78

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Asp Gly Glu Lys

1 5 10 15

Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp

20 25 30

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr

35 40 45

Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala

65 70 75 80

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Gln Val Gln Leu

115 120 125

Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met

130 135 140

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp

145 150 155 160

Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr

165 170 175

Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala

180 185 190

Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

195 200 205

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 79

<211> 250

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 79

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Val Tyr Gly Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Thr Leu

85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser

100 105 110

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Leu Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

145 150 155 160

Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr

180 185 190

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

195 200 205

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Tyr Leu Asn His Gly Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 80

<211> 368

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 80

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu

115 120 125

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

145 150 155 160

Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

165 170 175

Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro

180 185 190

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr

195 200 205

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr

210 215 220

Tyr Cys Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg

225 230 235 240

Ser Asn Trp Trp Tyr Asn Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

260 265 270

Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys

275 280 285

His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp

290 295 300

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Leu Leu Val Thr Val

305 310 315 320

Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His

325 330 335

Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys

340 345 350

His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

355 360 365

<210> 81

<211> 353

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 81

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Asp Gly Glu Lys

1 5 10 15

Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp

20 25 30

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr

35 40 45

Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala

65 70 75 80

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Gln Val Gln Leu

115 120 125

Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met

130 135 140

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp

145 150 155 160

Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr

165 170 175

Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala

180 185 190

Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

195 200 205

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro

245 250 255

Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly

260 265 270

Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe

275 280 285

Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Leu Leu Val Thr

290 295 300

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu

305 310 315 320

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

325 330 335

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

340 345 350

Ser

<210> 82

<211> 358

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 82

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Val Tyr Gly Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Thr Leu

85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser

100 105 110

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Leu Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

145 150 155 160

Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr

180 185 190

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

195 200 205

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Tyr Leu Asn His Gly Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val

245 250 255

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile

260 265 270

Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly

275 280 285

Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala

290 295 300

Cys Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

305 310 315 320

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

325 330 335

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

340 345 350

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

355

<210> 83

<211> 180

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 83

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 180

<210> 84

<211> 149

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 84

gccgccccga ctgcatctgc gtgttccaat tcgccaatga caagacgctg ggcggggttt 60

gtgtcatcat agaactaaag acatgcaaat atatttcttc cggggacacc gccagcaaac 120

gcgagcaacg ggccacgggg atgaagcag 149

<210> 85

<211> 335

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 85

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 180

ctcgaggccg ccccgactgc atctgcgtgt tccaattcgc caatgacaag acgctgggcg 240

gggtttgtgt catcatagaa ctaaagacat gcaaatatat ttcttccggg gacaccgcca 300

gcaaacgcga gcaacgggcc acggggatga agcag 335

<210> 86

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 86

Pro Thr His Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala

1 5 10 15

Gly His Met Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr

20 25 30

Leu Ser Thr His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe

35 40 45

Ile Arg Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu

50 55 60

Ala Gly Ala Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys

65 70 75 80

Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro

85 90 95

Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys

100 105 110

Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

115

<210> 87

<211> 48

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 87

Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro

1 5 10 15

Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr

20 25 30

Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

35 40 45

<210> 88

<211> 264

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 88

Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn Pro Thr Pro Glu Asn

1 5 10 15

Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln Ser Leu Leu Val Asp

20 25 30

Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr Ser Ala Pro Val Ser

35 40 45

Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala Gly Pro Val Leu Phe Trp Val

50 55 60

Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys

65 70 75 80

His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys

85 90 95

Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg

100 105 110

Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu

115 120 125

Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Cys His

130 135 140

Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Asp Ala

145 150 155 160

Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr

165 170 175

Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp

180 185 190

Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly

195 200 205

Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp

210 215 220

His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser

225 230 235 240

Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro

245 250 255

Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys

260

<210> 89

<211> 184

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 89

His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys

1 5 10 15

Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg

20 25 30

Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu

35 40 45

Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Cys His

50 55 60

Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Asp Ala

65 70 75 80

Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr

85 90 95

Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp

100 105 110

Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly

115 120 125

Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp

130 135 140

His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser

145 150 155 160

Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro

165 170 175

Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys

180

<210> 90

<211> 108

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 90

Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu

1 5 10 15

Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro

20 25 30

Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val

35 40 45

Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

50 55 60

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

65 70 75 80

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

85 90 95

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

100 105

<210> 91

<211> 116

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 91

Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

20 25 30

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

35 40 45

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

50 55 60

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

65 70 75 80

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

85 90 95

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

100 105 110

Gly Cys Glu Leu

115

<210> 92

<211> 99

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 92

Ala Ala Ala Thr Gly Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val

1 5 10 15

Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile

20 25 30

Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe

35 40 45

Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

50 55 60

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

65 70 75 80

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

85 90 95

Cys Glu Leu

<210> 93

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 93

Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

20 25 30

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

35 40 45

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

50 55 60

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Gln Arg Arg Lys Tyr Arg

65 70 75 80

Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr

85 90 95

Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp

100 105 110

Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

115 120

<210> 94

<211> 124

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 94

Ala Ala Ala Thr Gly Pro Thr His Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu

1 5 10 15

Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln

20 25 30

Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu

35 40 45

Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe

50 55 60

Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys

65 70 75 80

Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys

85 90 95

Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln

100 105 110

Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

115 120

<210> 95

<211> 258

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 95

Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

20 25 30

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

35 40 45

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

50 55 60

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys His Arg Arg Ala Cys Arg

65 70 75 80

Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser

85 90 95

Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr

100 105 110

Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg

115 120 125

Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr

130 135 140

Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Asp Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro

145 150 155 160

Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys

165 170 175

Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr

180 185 190

Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu

195 200 205

Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro

210 215 220

Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu

225 230 235 240

Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser

245 250 255

Gly Lys

<210> 96

<211> 269

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 96

Ala Ala Ala Thr Gly Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn

1 5 10 15

Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln

20 25 30

Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr

35 40 45

Ser Ala Pro Val Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala Gly Pro

50 55 60

Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly Ser Ser

65 70 75 80

Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln

85 90 95

Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu

100 105 110

Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly

115 120 125

Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln

130 135 140

Pro Leu Met Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro

145 150 155 160

Leu Gln Asp Asp Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu

165 170 175

Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr

180 185 190

Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu

195 200 205

Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu

210 215 220

Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu

225 230 235 240

Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu

245 250 255

Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys

260 265

<210> 97

<211> 116

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 97

Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

20 25 30

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

35 40 45

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

50 55 60

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Ala Leu Tyr Leu Leu Arg

65 70 75 80

Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly

85 90 95

Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr

100 105 110

Leu Ala Lys Ile

115

<210> 98

<211> 113

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 98

Ala Ala Ala Thr Gly Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu

1 5 10 15

Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala

20 25 30

Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Trp Val Glu Val Pro Gly Gly

35 40 45

Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu

50 55 60

Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln

65 70 75 80

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

85 90 95

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

100 105 110

Ile

<210> 99

<211> 129

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 99

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg Ser Asn Trp

100 105 110

Trp Tyr Asn Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 100

<211> 108

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 100

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 101

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 101

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Ser Ala Ala Trp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 102

<211> 106

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 102

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser His Asp Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

65 70 75 80

Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Gly Leu Pro Leu Thr Phe

85 90 95

Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 103

<211> 3

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 103

Ala Ala Ala

<210> 104

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 104

Ala Ala Ala Thr Gly

1 5

<210> 105

<211> 500

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 105

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Val Tyr Gly Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Thr Leu

85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser

100 105 110

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Leu Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

145 150 155 160

Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr

180 185 190

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

195 200 205

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Tyr Leu Asn His Gly Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly

245 250 255

Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

260 265 270

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg

275 280 285

Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

290 295 300

Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser

305 310 315 320

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala

325 330 335

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

340 345 350

Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

355 360 365

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser

370 375 380

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln

385 390 395 400

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser

405 410 415

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys

420 425 430

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala

435 440 445

Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr

450 455 460

Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

465 470 475 480

Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

485 490 495

Val Glu Ile Lys

500

<---

1. Т-клетка для уничтожения целевой клетки, представляющей целевой антиген, где Т-клетка содержит:

a) конструкцию химерное антитело – Т–клеточный рецептор (ТКР) (хаТКР), содержащую:

i) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном; и

ii) модуль ТКР (МТКР), где МТКР содержит первый домен ТКР (ДТКР), содержащий первый трансмембранный домен ТКР (ТКР–ТМ), и второй ДТКР, содержащий второй ТКР–ТМ,

причем МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР–ассоциированной сигнальной молекулы; и

b) химерный сигнальный рецептор (ХСР), содержащий:

i) лигандсвязывающий модуль, который способен связываться или взаимодействовать с целевым лигандом;

ii) трансмембранный модуль; и

iii) костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки, который способен обеспечивать костимулирующий сигнал Т-клетке,

причем лигандсвязывающий модуль и костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки не получены из одной молекулы и причем в ХСР отсутствует функциональный первичный сигнальный домен иммунной клетки.

2. Т-клетка по п. 1, отличающаяся тем, что в ХСР отсутствуют любые первичные сигнальные последовательности иммунной клетки.

3. Т-клетка по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой антиген клеточной поверхности.

4. Т-клетка по п. 3, где антиген клеточной поверхности выбирают из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D и FCRL5.

5. Т-клетка по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой комплекс, содержащий пептид и белок главного комплекса гистосовместимости (ГКГС).

6. Т-клетка по п. 5, где пептид получают из белка, выбранного из группы, состоящей из WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, Histone H3.3 и PSA.

7. Т-клетка по любому из пп. 1–6, отличающаяся тем, что первый ТКР–ТМ получен из одного из трансмембранных доменов первого ТКР, а второй ТКР–ТМ получен из другого трансмембранного домена первого ТКР.

8. Т-клетка по п. 7, отличающаяся тем, что по меньшей мере один ТКР–ТМ не встречается в природе.

9. Т-клетка по п. 7 или 8, отличающаяся тем, что первый ТКР представляет собой γ/δ ТКР.

10. Т-клетка по любому из пп. 1–9, отличающаяся тем, что антигенсвязывающий модуль является мультиспецифическим.

11. Т-клетка по любому из пп. 1–10, отличающаяся тем, что хаТКР дополнительно содержит модуль стабилизации, содержащий первый домен стабилизации и второй домен стабилизации, причем первый и второй домены стабилизации имеют аффинность связывания в отношении друг друга, что стабилизирует хаТКР.

12. Т-клетка по п. 11, отличающаяся тем, что модуль стабилизации выбран из группы, состоящей из константной области ТКР или ее фрагмента, модуля C_H1–C_L, модуля C_H2–C_H2, модуля C_H3–C_H3 и модуля C_H4–C_H4.

13. Т-клетка по любому из пп. 1–12, отличающаяся тем, что целевой антиген и целевой лиганд являются одинаковыми.

14. Т-клетка по любому из пп. 1–12, отличающаяся тем, что целевой антиген и целевой лиганд являются разными.

15. Т-клетка по п. 14, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой лиганд, экспрессируемый на поверхности клетки, представляющей целевой антиген.

16. Т-клетка по любому из пп. 1–15, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой связанный с заболеванием лиганд.

17. Т-клетка по п. 16, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой связанный с раком лиганд или связанный с вирусом лиганд.

18. Т-клетка по любому из пп. 1–15, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой иммуномодулирующую молекулу.

19. Т-клетка по п. 18, отличающаяся тем, что иммуномодулирующая молекула представляет собой иммуносупрессивный рецептор, а ХСР является антагонистом иммуносупрессивного рецептора.

20. Т-клетка по п. 18, отличающаяся тем, что иммуномодулирующая молекула представляет собой иммуностимулирующий рецептор, а ХСР является агонистом иммуностимулирующего рецептора.

21. Т-клетка по п. 18, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой молекулу иммунной контрольной точки или ингибирующий цитокин.

22. Т-клетка по любому из пп. 1–15, отличающаяся тем, что целевой лиганд представляет собой апоптотическую молекулу.

23. Т-клетка по любому из пп. 1–22, отличающаяся тем, что лигандсвязывающий модуль представляет собой фрагмент антитела или получен из внеклеточного домена рецептора.

24. Т-клетка по любому из пп. 1–23, отличающаяся тем, что трансмембранный модуль ХСР содержит трансмембранный домен, полученный из CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154.

25. Т-клетка по любому из пп. 1–24, отличающаяся тем, что костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки получен из внутриклеточного домена костимулирующего рецептора ТКР.

26. Т-клетка по п. 25, отличающаяся тем, что костимулирующий рецептор выбран из группы, состоящей из CD28, 4–1BB, OX40, ICOS, CD27, CD30 и CD40.

27. Т-клетка по любому из пп. 1–26, отличающаяся тем, что экспрессия ХСР является индуцибельной.

28. Т-клетка по п. 27, отличающаяся тем, что экспрессия ХСР индуцируется после активации Т-клетки.

29. Т-клетка по любому из пп. 1–28, отличающаяся тем, что антигенсвязывающий модуль хаТКР содержит фрагмент антитела, который связывается с CD19, причем лигандсвязывающий модуль ХСР содержит scFv, который связывается с CD19, и причем трансмембранный модуль и костимулирующий сигнальный модуль ХСР иммунной клетки, оба, получены из CD28.

30. Т-клетка по любому из пп. 1–28, отличающаяся тем, что антигенсвязывающий модуль хаТКР содержит фрагмент антитела, который связывается с AFP, причем лигандсвязывающий модуль ХСР содержит scFv, который связывается с GPC3, и причем трансмембранный модуль и костимулирующий сигнальный модуль ХСР иммунной клетки, оба, получены из CD28.

31. Т-клетка по любому из пп. 1–28, отличающаяся тем, что антигенсвязывающий модуль хаТКР содержит фрагмент антитела, который связывается с CD19, причем лигандсвязывающий модуль ХСР содержит scFv, который связывается с CD20, и причем трансмембранный модуль и костимулирующий сигнальный модуль ХСР иммунной клетки, оба, получены из CD28.

32. Т-клетка по любому из пп. 29-31,

(i) где фрагмент антитела, который связывается с CD19, содержит домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;

(ii) где scFv, который связывается CD19, содержит домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;

(iii) где фрагмент антитела, который связывается с AFP, содержит домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;

(iv) где scFv, который связывается GPC3, содержит домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65;

(v) где scFv, который связывается CD20, содержит домен V_H, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и домен V_L, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; и/или

(vi) где ХСР содержит фрагмент CD28, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51.

33. Т-клетка по любому из пп. 1-32, где:

(i) (a) хаТКР содержит две полипептидные цепи, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 72 и 73 или SEQ ID NO: 74 и 75; и/или (b) где ХСР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80 или 81; или

(ii) (a) хаТКР содержит две полипептидные цепи, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 68 и 69 или SEQ ID NO: 70 и 71; и/или (b) где ХСР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82.

34. Нуклеиновая кислота, кодирующая конструкцию химерное антитело – Т–клеточный рецептор (ТКР) (хаТКР) и химерный сигнальный рецептор (ХСР), где указанная хаТКР и ХСР содержаться в Т-клетке по пп. 1-33,

где хаТКР содержит:

i) антигенсвязывающий модуль, который специфически связывается с целевым антигеном; и

причем МТКР облегчает рекрутирование по меньшей мере одной ТКР–ассоциированной сигнальной молекулы; и

где ХСР содержит:

i) лигандсвязывающий модуль, который способен связываться или взаимодействовать с целевым лигандом;

ii) трансмембранный модуль; и

iii) костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки, который способен обеспечивать костимулирующий сигнал иммунной Т-клетке, причем лигандсвязывающий модуль и костимулирующий сигнальный модуль иммунной клетки не получены из одной молекулы и причем в ХСР отсутствует функциональный первичный сигнальный домен иммунной клетки.

35. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 34.

36. Т-клетка для уничтожения целевой клетки, представляющей целевой антиген, где Т-клетка содержит одну или более нуклеиновых кислот по п. 36 или экспрессионный вектор по п. 35.

37. Т-клетка по любому из пп. 1–33 и 36, отличающаяся тем, что Т-клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической Т–клетки, хелперной Т–клетки, естественной киллерной T–клетки и супрессорной Т–клетки.

38. Фармацевтическая композиция для лечения ракового заболевания у нуждающегося в этом индивида, где фармацевтическая композиция содержит эффективное количество Т-клеток по любому из пп. 1–33, 36 и 37 и фармацевтически приемлемый носитель, где раковое заболевание связано с экспрессией целевого антигена у индивида и где целевой антиген распознается Т-клеткой по любому из пп.1-33, 36 и 37.

39. Способ уничтожения целевой клетки, представляющей целевой антиген, включающий приведение целевой клетки в контакт с Т-клеткой по любому из пп. 1–33, 36 и 37.

40. Способ лечения ракового заболевания у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду эффективного количества фармацевтической композиции по п. 38, где раковое заболевание связано с экспрессией целевого антигена у индивида и где целевой антиген распознается Т-клеткой, содержащейся в фармацевтической композиции.

41. Способ обеспечения костимулирующего сигнала Т-клетке, содержащей хаТКР или трансдуцированной нуклеиновой кислотой, кодирующей хаТКР, включающий введение в указанную Т-клетку одну или более нуклеиновых кислот по п. 34 или экспрессионного вектора по п. 35, кодирующего ХСР.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к клеточной линии рака мочевого пузыря человека 190 BlCan KAG, депонированной в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 793Д. Указанная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, экспрессирует раково-тестикулярные антигены NY-ESO1, MAGEA1, PASD1, PRAME.

Вето-клетки, полученные из т-клеток памяти // 2779844

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины и раскрывает способы получения выделенной популяции не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GvHD) клеток, обладающих фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Тсm), а также популяцию, полученную такими способами, и способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации клеток или тканей.

Способ получения суспензии единичных жизнеспособных клеток из клеточных сфероидов // 2779742

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения суспензии единичных жизнеспособных клеток подготовки из клеточных сфероидов – трехмерных клеточных культур. Для осуществления указанного способа сначала проводят ферментативную обработку клеточных сфероидов диссоциирующим агентом до получения суспензии единичных клеток при температуре 37°С на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирок 15-20 раз/мин в течение 10 минут.

Рекомбинантная экспрессия белка orf2 pcv2b в клетках насекомых // 2779423

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, в частности к клетке насекомого, обеспечивающей оптимизированную экспрессию мутантного белка ORF2 PCV2b; к вирусоподобной частице (VLP) мутантного белка ORF2 PCV2b; к способу экспрессии и получения мутантного белка ORF2 PCV2b в клетках насекомых; к вакцине для свиней для подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания, содержащей мутантный белок ORF2 PCV2b, и способу ее получения; к способу подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания у свиньи с помощью вышеупомянутой вакцины, а также к мутантному белку ORF2 PCV2b и его применению.

Функционализированные эритроидные клетки // 2779315

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и генетической инженерии, в частности к способам получения безъядерной эритроидной клетки, ковалентно связанной с экзогенным полипептидом, где указанная клетка и указанный полипептид связаны ковалентно посредством реакции клик-химии. Для осуществления способов согласно настоящему изобретению сначала получают безъядерную эритроидную клетку, ковалентно связанную с первым химическим фрагментом посредством реакции клик-химии.

Система культивирования ex-vivo и способы ее применения // 2778891

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и раскрывает систему культивирования ткани, способ культивирования ткани, а также способ определения эффективности лекарственного средства, способ выбора лекарственного средства для лечения заболевания и способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, использующие указанный выше способ культивирования ткани.

Способы культивирования клеток и наборы и устройство для них // 2778411

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу стимулирования Т-клеток, с помощью первого и второго стимулирующих средств, где первое стимулирующее средство специфически связывается с молекулой CD3, экспрессируемой на поверхности Т-клеток, и где второе стимулирующее средство специфически связывается с молекулой CD28, экспрессируемой на поверхности Т-клеток.

Белковые композиции против vegf и способы их получения // 2778325

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения афлиберцепта из клетки-хозяина, культивированной в химически определенной среде (ХОС). Предложенный способ, включающий культивирование клетки-хозяина в ХОС в подходящих условиях, причем кумулятивная концентрация никеля в ХОС составляет не более 0,4 мкмоль, кумулятивная концентрация железа составляет не более 55,0 мкмоль, кумулятивная концентрация меди составляет не более 0,8 мкмоль, кумулятивная концентрация цинка составляет не более 56,0 мкмоль, кумулятивная концентрация цистеина составляет не более 10,0 мкмоль, а кумулятивная концентрация антиоксиданта составляет от 0,001 ммоль до 10,0 ммоль, позволяет получать афлиберцепт с повышенной производительностью.

Композиции из культивируемого мяса // 2778255

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и пищевой промышленности, в частности к способу получения пригодной к употреблению в пищу композиции и композиции, полученной таким способом. Для осуществления способа сначала инкубируют множество типов клеток животного, не являющегося человеком, и пригодную к употреблению в пищу трехмерную пористую матрицу.

Частицы pm21 для улучшения хоминга nk-клеток в костном мозге // 2777993

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к способу переноса NK-клеток в костный мозг субъекта и способу лечения злокачественного новообразования костного мозга. Для осуществления указанных способов NK-клетки приводят в контакт с частицами PM21 и/или питающими клетками FC21 до переноса NK-клеток в организм указанного субъекта и затем вводят NK-клетки указанному субъекту.

Гетеродимерные fc-слитые белки il15/il15rα // 2779938

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению IL15/IL15Rα гетеродимерного cлитого с Fc белка, и может быть использовано в медицине. Полученный гетеродимерный белок, содержащий IL-15, присоединенный посредством первого доменного линкера к Fc-домену, и фрагмент рецептора IL-15 альфа (IL-15Rα), присоединенный к N-концу второго Fc-домена посредством второго доменного линкера, может быть использован для активации Т-клеток и эффективной терапии рака.