Новый биспецифический формат, подходящий для применения в скрининге с высокой пропускной способностью

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биспецифическому белковому комплексу, имеющему формулу A-X:Y-B где: A-X представляет собой слитый белок; Y-B представляет собой второй слитый белок; X:Y представляет собой гетеродимерный связующий фрагмент; : обозначает связывающее взаимодействие между X и Y; А представляет собой первый белковый компонент биспецифического белкового комплекса, выбранный из фрагмента Fab или Fab'; В представляет собой второй белковый компонент биспецифического белкового комплекса, выбранный из фрагмента Fab или Fab'. Изобретение эффективно для скрининга синергической биологической функции. 5 з.п. ф-лы, 11 табл., 16 пр., 45 ил.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает способ, в частности in vitro/ex vivo способ детекции синергической биологической функции биспецифического белкового комплекса, соединенного посредством гетеродимерного связующего фрагмента, библиотеки/мультиплексы биспецифических белковых комплексов, а также наборы и композиции на их основе. Изобретение также относится к указанным новым биспецифическим белковым комплексам и к способам их применения в терапевтических, исследовательских и экспериментальных целях (в частности, в анализах синергетической биологической функции). Настоящее изобретение также относится к способам получения указанных биспецифических комплексов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Биологические механизмы in vivo представляют собой чрезвычайно сложные каскады сигналов, которые трудно развернуть и понять. Примером такого механизма является сигнальный путь, необходимый для активации Т-клеток, см. фиг. 1 в www.cellsignal.com. Для активации Т-клеток нужны, по меньшей мере, два сигнала.

Первым сигналом считается распознавание антигена Т-клеточным рецептором, а второй сигнал возникает при совместной стимуляции в результате лигирования других поверхностных молекул на Т-клетке с другими молекулами на антигенпрезентирующей клетке.

Таким образом, активацию Т-клеток можно использовать для иллюстрации того, что в модуляции биологических функций может участвовать несколько сигналов. Другие биологические процессы являются в равной степени сложными или более сложными. Хотя скрининг in vitro с использованием клеток способствует пониманию и может облегчить понимание механизмов in vivo, остается проблема, связанная с идентификацией соответствующих пар лигандов, которые модулируют биологическую функцию.

Многие полагают, что биспецифические антитела будут играть главную роль в разработке следующего поколения биотерапевтических средств (D. Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798). Они могут обеспечить превосходную, долговременную эффективность с широкой направленностью у большей части пациентов. Такая эффективность может обуславливаться либо специфичностью одновременно к разным антигенам, участвующим в одном патологическом процессе, приводящей к уменьшению избыточности; либо специфичностью к антигенам из независимых путей, обеспечивающей аддитивный или синергический эффект.

Биспецифические антитела можно использовать для разработки подходов новой биологии, включающих в себя:

1) сшивку рецепторов, присутствующих на клетке,

2) индукцию эффектов, опосредуемых клетками,

3) локализацию цитокина в клетке с целью регуляции сигнального пути или локальной блокады функции цитокина,

4) одновременную направленность на несколько эпитопов с целью формирования "новой активности", повышения функционирования или специфичности, что не может быть достигнуто с использованием одного моноклонального антитела или даже смесей несвязанных антител ("поли-моноклональные антитела").

Современные стратегии, направленные на двойные мишени, как правило, основаны на детальной схеме известных механизмов и включают в себя: сшивку ингибиторных рецепторов, совместное задействование/кластеризацию рецепторов, блокирование нескольких стимуляторных путей, селективную направленность на ингибиторные рецепторы и блокирование разных путей, таких как костимуляция и сигнальный путь цитокина. Однако нынешний уровень техники, касающийся известных механизмов и мишеней, является ограничивающим фактором для развития данной области.

Хотя применение биспецифических антител в качестве биологических терапевтических средств является весьма перспективным, оно также связано с более широким рядом проблем, возникающих в процессе исследования и разработки, чем применение моноклональных антител. В основном затруднения связаны с двумя направлениями, включающими в себя: 1) разработку эффективного формата биспецифического антитела и 2) выбор пары мишеней, с которыми биспецифическое антитело перекрестно связывается или одновременно взаимодействует.

В настоящее время разработано много перспективных форматов биспецифических антител, потенциально подходящих для применения в качестве эффективных терапевтических средств, которые включают в себя DVD-Ig (Abbvie), DuoBodies (Genmab), Knobs-in-Holes (Genentech), Common light chain (Merus). Однако в каждом из указанных случаев данные форматы не являются идеальными для применения в скрининге с высокой пропускной способностью с использованием двойной мишени-антигена, проводимом с целью обнаружения новых пар антигенов для перекрестного связывания с биспецифическими антителами.

Как правило, для получения одной конструкции биспецифического антитела нужно субклонировать, по меньшей мере, два вариабельных участка из первоначального источника экспериментальных векторов (такого как фаговый дисплей, гибридома или клонирование отдельных В-клеток) в соответствующих биспецифических векторах, обеспечивающих экспрессию каждого плеча биспецифической конструкции, с получением и последующей очисткой биспецифического антитела. Усилия, предпринимаемые для клонирования и последующей экспрессии, быстро становятся ограничивающим фактором, если требуется объединение большого числа пар вариабельных участков с целью скрининга на наиболее эффективное сочетание исследуемых вариабельных участков или обнаружения новых пар антигенов.

Например, если обнаружено 50 уникальных антител против панели из 50 мишеней, присутствующих на клеточной поверхности, можно получить в общей сложности 2500 биспецифических антител (что иллюстрируется матрицей X на Y). Для реализации описанных выше форматов биспецифических антител может потребоваться, по меньшей мере, 100 отдельных реакций клонирования (50 для X и 50 для Y) и затем 2500 экспериментов по экспрессии антител. Увеличение числа исходных моноклональных антител до 100 приведет к увеличению минимального числа реакций клонирования до 200 (100 для X и 100 для Y) и числа экспериментов по экспрессии до 10000.

Как правило, основной причиной указанного "ограничивающего фактора экспрессии" является тот факт, что для реализации описанных выше форматов требуется одновременная экспрессия обоих "половинок" белковой цепи конечной биспецифической конструкции в рамках одного процесса экспрессии в одной клетке. Следовательно, при реализации большинства форматов для получения 2500 биспецифических антител нужно провести 2500 процессов экспрессии.

"Ограничивающий фактор экспрессии" приобретает большее значение, если биспецифическое антитело получают в моноцистронном формате (т.е. его клонируют и экспрессируют в виде одной белковой цепи), например, одноцепочечные диатела, так как число экспериментов по клонированию может составлять 2500 и 10000, соответственно, для приведенных выше чисел.

Кроме того, для выделения целевой конструкции после экспрессии может потребоваться глубокая очистка.

В некоторых способах получения биспецифических конструкций используют общую легкую цепь, чтобы уменьшить число процессов клонирования, хотя это не приводит к уменьшению числа процессов экспрессии. Кроме того, использование общей цепи, такой как общая легкая цепь, осложняет задачу обнаружения антител, поскольку труднее найти вариабельные домены исходного антитела, так как антитело должно связываться со своим антигеном с достаточно высоким сродством посредством только одной цепи, такой как тяжелая цепь.

Соответственно, применение существующих в настоящее время биспецифических форматов в широкомасштабном скрининге с высокой пропускной способностью с целью выявления новых пар антигенов является непрактичным и приводит к продолжению использования способов получения биспецифических конструкций, основанных лишь на гипотезах.

Авторы изобретения полагают, что в большей степени, чем конструирование и тестирование ограниченного выбора биспецифических антител, направленных на заданные эпитопы двух известных мишеней, реальным потенциалом в отношении подхода к новой биологии с использованием биспецифических антител может обладать только обширный функциональный скрининг, проводимый с использованием большой, разнообразной комбинаторной панели биспецифических антител или белковых лигандов. Для разработки такого скрининга требуются формат и способ, позволяющие получать большое число разнообразных биспецифических белков, которые можно легко конструировать и анализировать на функциональные эффекты с помощью разных функциональных скринингов. Такой подход позволяет осуществлять успешную идентификацию синергических пар.

Таким образом, существует потребность в способах получения и скрининга большого числа биспецифических белковых комплексов, присутствующих в виде сочетаний фрагментов, обладающих специфичностью к разным антигенам. В частности, существует потребность в способах, позволяющих быстро и эффективно получать и анализировать большое число разных биспецифических комплексов антител. Существует ряд промышленных способов получения биспецифических антител, как описано выше. Однако каждый из этих способов имеет свои недостатки, как и альтернативные способы, более подробно описанные ниже.

Проблема, заключающаяся в том, как эффективно идентифицировать мишени для биспецифических и мультиспецифических конструкций, должным образом не решена в данной области техники. Например, в WO2014/001326 описана химическая конъюгация белка с фрагментом ДНК, где фрагмент ДНК гибридизуется с комплементарной последовательностью ДНК, связывая два таких белка вместе, с получением нестандартных, сделанных специально для пациента мультиспецифических молекул, содержащих, по меньшей мере, два специфичных фрагмента. Существует ряд проблем, связанных с данным подходом, применяющимся для идентификации новых биспецифических сочетаний, например, конъюгация белка с ДНК может привести к снижению активности и/или повреждению структуры белка. В частности, гибриды белок-ДНК не встречаются в природе, следовательно, существует возможность взаимного влияния. Кроме того, химическая конъюгация, используемая для соединения белка с ДНК, увеличивает сложность процесса, а также затраты времени и средств.

Существуют способы присоединения и конъюгации, используемые для получения конъюгатов антител с лекарственными средствами, и технологии направленной доставки in vivo. Традиционная химическая сшивка является трудоемким процессом, поскольку может потребоваться очистка целевых продуктов от гомодимеров и других нежелательных побочных продуктов. Кроме того, стадии химической модификации могут изменять целостность белков, приводя к низкой стабильности или изменению биологической функции. В результате получение биспецифических антител путем химической сшивки часто является неэффективным и может приводить к потере активности антител.

Другой способ получения биспецифических антител включает в себя слияние клеток (например, с получением гибридом), где рекомбинантные клетки экспрессируют две тяжелые и две легкие цепи антитела, сборка которых происходит случайным образом. Существующий выбор из 4 возможных вариантов приводит к образованию 10 возможных структур биспецифических антител, из которых только некоторые (зачастую только одна) обладают желательными характеристиками. Следовательно, способ получения биспецифических антител путем слияния клеток характеризуется низким выходом продукта и, кроме того, требует дополнительной стадии очистки, чтобы отделить желательные биспецифические антитела от других биспецифических антител. Указанные недостатки увеличивают время и стоимость производства.

Для получения биспецифических антител также используют методы рекомбинантных ДНК. Например, методы рекомбинантных ДНК используют для получения биспецифических антител по принципу "выступ-во-впадине". Метод "выступ-во-впадине" включает в себя введенные рекомбинантными методами стерически комплементарные мутации в доменах, участвующих в мультимеризации, на границе домена СН3 (см., например, Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-621 (1996); Merchant et al., Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998); см. также патенты США №№5731168 и 7183076). Одно из ограничений данной стратегии состоит в том, что легкие цепи двух исходных антител должны быть идентичны, чтобы предотвратить ошибочное спаривание и образование нежелательных и/или неактивных молекул при экспрессии в одной клетке. Каждая биспецифическая молекула (ее тяжелые и легкие цепи) должна экспрессироваться в одной клетке, причем белковый продукт, как правило, содержит примерно 20% гомодимера, который впоследствии удаляют путем очистки.

Другие способы основаны на естественном обмене цепей полноразмерных молекул IgG4 (Genmab Dubody). Однако данный способ также имеет свои недостатки, поскольку он не позволяет получать конструкции, в которых отсутствуют участки Fc. Поскольку Fc-область может вносить вклад в биологическую активность, иногда трудно установить, обусловлена ли наблюдаемая активность сочетанием вариабельных участков, участком Fc, или участками обоих типов, входящими в состав биспецифических молекул, содержащих Fc. Кроме того, поскольку обмен представляет собой динамический процесс, зачастую сложно идентифицировать существующие в действительности молекулы.

Таким образом, существует потребность в новых способах получения биспецифических белковых комплексов, позволяющих проводить более эффективный скрининг биспецифических антител с повышенной пропускной способностью. В частности, существует потребность в формате и способе, позволяющем легко объединять любые два антитела или два фрагмента антител, выбранные из пула доступных антител или фрагментов антител, и эффективно получать разные комплексы биспецифических антител, и при этом, например, избегать или сводить к минимуму образование гомодимеров. Эффективная сборка разных биспецифических антител является особенно важной при проведении скрининга новых сочетаний антиген-специфичных элементов на синергическую биологическую функцию, в частности, где гетеродимеры имеют важное значение для проявления указанной функции.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте изобретение предлагает новый биспецифический формат, особенно подходящий для использования в скрининге, так как все компоненты можно экспрессировать в клетке в виде отдельных элементов, по существу в отсутствии агрегации, после чего можно осуществить сборку элементов путем простого смешивания, без применения реакций конъюгации или присоединения и при минимальной гомодимеризации.

Таким образом, изобретение предлагает биспецифический белковый комплекс, имеющий формулу A-X:Y-B, где:

А-Х представляет собой первый слитый белок;

Y-B представляет собой второй слитый белок;

X:Y представляет собой гетеродимерный связующий фрагмент;

: обозначает связывающее взаимодействие между X и Y;

А представляет собой первый белковый компонент биспецифического белкового комплекса, выбранный из фрагмента Fab или Fabʹ;

В представляет собой второй белковый компонент биспецифического белкового комплекса, выбранный из фрагмента Fab или Fabʹ;

Х представляет собой первый партнер по связыванию связывающей пары, независимо выбранный из антигена или антитела или его связывающего фрагмента; и

Y представляет собой второй партнер по связыванию связывающей пары, независимо выбранный из антигена или антитела или его связывающего фрагмента;

с условием, что если Х представляет собой антиген, Y представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, специфичные к антигену, обозначаемому X, и если Y представляет собой антиген, Х представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, специфичные к антигену, обозначаемому Y.

В одном варианте осуществления переменный компонент Х или Y представляет собой связывающий фрагмент антитела, такой как ScFv, Fv, VH, VL или VHH, а другой переменный компонент представляет собой пептид.

В одном варианте осуществления переменный компонент Х или Y представляет собой ScFv или VHH, а другой переменный компонент представляет собой пептид.

Таким образом, биспецифический формат включает в себя два плеча Fab, обладающие разной специфичностью, соединенные, например, по C-концу посредством связывающего фрагмента антитела (такого как scFv или VHH) и пептид-связывающего взаимодействия. Данный тип расположения компонентов идеально подходит для применения в скрининге, поскольку проблемы с экспрессией элемента A-X или элемента B-Y отсутствуют. Фрагмент Fab/Fabʹ очень стабилен и не участвует в ненадлежащей димеризации. Следовательно, после экспрессии каждого элемента (A-X или B-Y) очистка требуется в минимальной степени, или совсем не требуется. Биспецифический комплекс можно получить путем простого смешивания соответствующих компонентов в молярном соотношении 1:1, т.е. не используя химические реакции конъюгации и присоединения. Константные участки фрагмента Fab/Fabʹ отвечают за димеризацию компонентов Fab/Fabʹ, а партнеры по связыванию X и Y отвечают за устойчивость, обеспечивая образование желательного гетеродимерного биспецифического комплекса. Опять же, после образования комплекса в результате гетеродимеризации очистка требуется в минимальной степени, или совсем не требуется. Таким образом, можно легко получить большое количество A-X и B-Y с последующим их объединением.

Присутствующие в комплексе компоненты Fab/Fabʹ, которые представляют собой связывающие домены, удерживаются в биологически надлежащей ориентации, которая имитирует классическую геометрию антитела и может вносить вклад в успешную трансляцию пар вариабельных участков, идентифицированных с помощью описанного ниже метода скрининга, в другие биспецифические терапевтические форматы, сохраняющие активность. Возможность получения и скрининга биспецифического комплекса, в котором отсутствуют участки CH2-CH3 фрагмента Fc, позволяет подтвердить, что наблюдаемая биологическая активность в действительности обуславливается исключительно парой вариабельных участков, присутствующих в комплексе. Простота биспецифического комплекса настоящего изобретения и способы его получения обладают огромным преимуществом, заключающимся в том, что они позволяют проводить высокопроизводительный скрининг пар вариабельных доменов с целью выявления новых сочетаний антигенов-мишеней, а также с целью оптимизации последовательностей вариабельных участков для заданного сочетания.

В одном варианте осуществления А представляет собой фрагмент Fab. В одном варианте осуществления B представляет собой фрагмент Fab. В одном варианте осуществления и А и В представляют собой фрагменты Fab (также называемые здесь Fab-Kd-Fab).

В одном варианте осуществления Х присоединяют к С-концу тяжелой или легкой цепи фрагмента Fab или Fab', в частности, к С-концу тяжелой цепи.

В одном варианте осуществления Y присоединяют к С-концу тяжелой или легкой цепи фрагмента Fab или Fab', в частности, к С-концу тяжелой цепи.

В одном варианте осуществления Х независимо выбран из ScFv, VHH и пептида, при условии, что если Х представляет собой пептид, Y представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, такой как ScFv или VHH, а если Х представляет собой ScFv или VHH, Y представляет собой антиген, такой как пептид.

В одном варианте осуществления Y независимо выбран из ScFv, VHH и пептида, при условии, что если Y представляет собой пептид, Х представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, такой как ScFv или VHH, а если Y представляет собой ScFv или VHH, Х представляет собой антиген, такой как пептид.

В одном варианте осуществления длина пептида (который является одним из партнеров по связыванию) варьирует от 5 до 25 аминокислот.

В одном варианте осуществления сродство Х к Y составляет 5 нМ или выше, например, связывающее сродство гетеродимерного связующего фрагмента составляет 900 пМ или выше, например, 800, 700, 600, 500, 400 или 300 пМ.

В одном варианте осуществления Х или Y представляет собой ScFv или VHH, специфичный к пептиду GCN4, например, ScFv представляет собой 52SR4 (SEQ ID NO: 3, или аминокислоты 1-243 последовательности SEQ ID NO: 3).

В одном варианте осуществления Х или Y представляет собой пептид GCN4 (SEQ ID NO: 1, или аминокислоты 1-38 последовательности SEQ ID NO: 1).

В одном варианте осуществления A и/или В является специфичным к антигену, выбранному из группы, включающей в себя: рецепторы клеточной поверхности, такие как Т-клеточные или В-клеточные сигнальные рецепторы, костимуляторные молекулы, ингибиторы контрольных точек, рецепторы естественных клеток-киллеров, иммуноглобулиновые рецепторы, иммуноглобулиноподобные рецепторы, матриксные металлопротеазы и тканевые ингибиторы матриксных металлопротеаз мембранного типа, рецепторы семейства TNFR, рецепторы семейства В7, молекулы адгезии, интегрины, рецепторы цитокинов/хемокинов, GPCR, рецепторы фактора роста, киназы-содержащие рецепторы, тканеспецифические антигены, раковые антигены (ассоциированные с опухолью антигены и пептиды), рецепторы, распознающие патогены, рецепторы комплемента, рецепторы гормонов, фагоцитарные рецепторы или растворимые молекулы, такие как цитокины, хемокины, лейкотриены, факторы роста, гормоны, ферменты или ионные каналы, включающие в себя версии, содержащие посттрансляционные модификации, и фрагменты, содержащие, по меньшей мере, один эпитоп.

В одном варианте осуществления изобретение предлагает композицию, например, фармацевтическую композицию, содержащую один или несколько биспецифических комплексов настоящего изобретения.

Кроме того, авторы настоящего изобретения разработали способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса формулы A-X:Y-B

где Х:Y представляет собой гетеродимерный связующий фрагмент, причем, например, X и Y не способны к образованию гомодимеров,

А и В представляют собой компоненты биспецифического комплекса, присутствующие в виде слитых белков с X и Y соответственно, а указанный способ включает в себя следующие стадии:

(i) тестирование части или всего мультиплекса, содержащего, по меньшей мере, один гетеродимер-связанный биспецифичный белок, на активность с помощью функционального анализа; и

(ii) анализ результатов функционального анализа с целью детекции синергической биологической функции биспецифического белкового комплекса.

В указанном способе используют новый формат биспецифического белкового комплекса, имеющего формулу A-X:Y-В, где:

А-Х представляет собой первый слитый белок;

Y-B представляет собой второй слитый белок;

X:Y представляет собой гетеродимерный связующий фрагмент;

А представляет собой первый белковый компонент биспецифического комплекса;

В представляет собой второй белковый компонент биспецифического комплекса;

X представляет собой первый партнер по связыванию связывающей пары;

Y представляет собой второй партнер по связыванию связывающей пары; и

: обозначает взаимодействие (например, связывающее взаимодействие) между Х и Y, в частности, взаимодействие, достаточное для образования комплекса и сохранения слитых белков в виде комплекса.

В частности, гетеродимер-связанный биспецифический белковый комплекс получают путем смешивания А-Х и В-Y in vitro. Таким образом, в одном варианте осуществления способ включает в себя стадию смешивания in vitro с приведением в контакт A-X и B-Y.

Таким образом, слитый белки А-Х и В-Y, как правило, не экспрессируют совместно в одной клетке. Это выгодно, так как позволяет экспрессировать, необязательно с последующей очисткой, например, 100 слитых белков, смешивание которых в разных сочетаниях может дать 10000 гетеродимер-связанных биспецифических белковых комплексов, которые могут составить 5000 уникальных пар.

В отличие от указанного способа, некоторые способы предыдущего уровня техники требуют совместной экспрессии биспецифических фрагментов и, следовательно, для получения 10000 комплексов требуется проведение 10000 процессов трансфекции, экспрессии и очистки.

Однако при желании А-Х и В-Y можно можно экспрессировать в одной клетке.

Партнеры по связыванию X и Y обладают сродством друг к другу и действуют как биологический эквивалент velcro® или металлического стержня и магнита, удерживая компоненты комплекса вместе. Предпочтительно это означает, что слитые белки А-X и Y-B можно легко собрать в биспецифический белковый комплекс путем простого смешивания указанных слитых белков. Таким образом, биспецифическая белковый комплекс настоящего изобретения имеет модульную структуру, которая обеспечивает легкую сборку двух разных белков с получением широких панелей биспецифических белковых комплексов с разными сочетаниями антигенной специфичности, например, в виде решетки. Это позволяет проводить эффективный и систематический скрининг большого числа биспецифических белковых комплексов с целью детекции аддитивной, синергической или новой биологической функции.

То, что Х и Y обладают специфичностью в отношении друг друга, значительно снижает их способность к образованию гомодимеров. Х и Y вместе называют здесь связывающейся парой или партнерами по связыванию. В одном варианте осуществления Х не обладает высоким сродством к другим компонентам X. В одном варианте осуществления Y не обладает высоким сродством к другим компонентам Y. Предпочтительно неспособность X и Y образовывать гомодимеры препятствует образованию нежелательных моноспецифических белковых комплексов, повышая выход целевых биспецифических белковых комплексов, и устраняет потребность в обременительных стадиях очистки, требующихся для удаления моноспецифических белковых комплексов.

Это позволяет осуществить быструю сборку биспецифических белковых комплексов со значениями выхода и/или чистоты, которые невозможно эффективно достичь с помощью большинства известных способов, в частности, способов предыдущего уровня техники, обычно требующих многочисленных стадий очистки. В настоящем изобретении выход биспецифического комплекса, как правило, составляет 75% или выше.

Дополнительным преимуществом биспецифических белковых комплексов является возможность проведения скрининга, позволяющего тестировать биспецифические белковые комплексы, в состав которых входят белки (в том числе антигены, связанные с составляющими белками) не имеющие известных функциональных связей, или функционирующие в разных потенциально несвязанных путях, например, два белка, которые функционируют в двух разных путях и, например, которые по мнению специалиста в данной области обычно не контактируют друг с другом, с целью идентификации аддитивной, синергетический и/или новой функции.

Кроме того, можно одновременно исследовать несколько участков, отвечающих за связывание (например, вариабельных участков) с конкретным антигеном или эпитопом, чтобы выявить нюансы биологической функции. Это позволяет исследовать и оптимизировать сочетания последовательностей вариабельных участков, направленных на конкретную пару антигенов.

Данный способ позволяет получать результаты, не зависящие от предвзятых идей и технических предубеждений, касающихся биологической функции. Такой подход является потенциально очень эффективным.

Предпочтительно компоненты Х и Y позволяют легко и быстро собрать мультиплекс, содержащий биспецифические белковые комплексы, состоящие из разных сочетаний слитых белков.

В одном варианте осуществления белки А и В представляют собой антитела или фрагменты антител. Если антитела или фрагменты антител удерживаются вместе в виде комплекса посредством X и Y, образуется биспецифический комплекс антител.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 приведена схематическая диаграмма, демонстрирующая основные клеточные сигнальные пути, участвующие в активации Т-клеток.

На фиг. 2 приведена схематическая диаграмма, демонстрирующая структуру и сборку биспецифического белкового комплекса настоящего изобретения.

На фиг. 3 приведена таблица, иллюстрирующую матрицу 4×4 для функционального скрининга с использованием биспецифического антитела настоящего изобретения. С помощью данной матрицы можно собрать 16 разных биспецифических белковых комплексов и эффективно проанализировать их на синергетическую функцию.

На фиг. 4 приведена схематическая диаграмма, демонстрирующая типичные биспецифические комплексы антител настоящего изобретения. На диаграмме показано, как два разных фрагмента Fab соединяют с получением биспецифического комплекса антител посредством высокоаффинного взаимодействия между партнерами по связыванию, присоединенными к фрагментам Fab.

На фиг. 5 приведен график, демонстрирующий результаты анализа методом проточной цитометрии, которые демонстрируют, что два фрагмента Fab, специфичные в отношении двух разных антигенов-мишеней, сохраняют свою специфичность и способны взаимодействовать со своими соответствующими антигенами-мишенями одновременно, если два фрагмента Fab соединены с получением биспецифического комплекса антитела настоящего изобретения. Результаты также демонстрируют, что рассоединение партнеров по связыванию, присоединенных к фрагментам Fab, не влияет на способность Fab-фрагментов специфически связываться с их соответствующими антигенами-мишенями. Контроль с отсутствием образования комплексов демонстрирует отсутствие связывания, если оба специфических фрагмента гибридизуются с пептидом (Y:Y).

Закрашенная площадь=[Fab против антигена 5-пептид 'GCN4']:[Fab против антигена 6-пептид 'GCN4']:[биотинилированный антиген 6]:[FITC-STREP]. Контроль с отсутствием образования комплекса.

Тонкая линия=[Fab против антигена 5-ScFv '52SR4']: [Fab против антигена 6-пептид 'GCN4']:[биотинилированный антиген 6]:[FITC-STREP]

Жирная линия=[Fab против антигена 5-пептид 'GCN4']: [Fab против антигена 6-ScFv '52SR4']:[биотинилированный антиген 6]:[FITC-STREP]

На фиг. 6 приведены график с кривой BIAcore и таблица, демонстрирующие высокое сродство партнеров по связыванию друг к другу. Связывание Fab A-scFv '52SR4' с пептидом 'GCN4' детектируют с помощью чипа.

На фиг. 7 приведена гистограмма относительной интенсивности ингибирования фосфорилированного Akt под действием биспецифических и двухвалентных сочетаний антител, специфичных к антигену 3, антигену 1, антигену 4 и антигену 2.

На фиг. 8 приведена гистограмма относительной интенсивности ингибирования фосфорилированного PLCg2 под действием биспецифических и двухвалентных сочетаний антител, специфичных к антигену 3, антигену 1, антигену 4 и антигену 2.

На фиг. 9 приведена гистограмма относительной интенсивности ингибирования экспрессии CD86 под действием биспецифических и двухвалентных сочетаний антител, специфичных к антигену 3, антигену 1, антигену 4 и антигену 2.

На фиг. 10 приведена гистограмма относительной интенсивности ингибирования фосфорилированного Akt под действием биспецифических антител, двухвалентных антител или смеси антител, специфичных к антигену 1 и антигену 2, а также отдельных контрольных фрагментов Fab'.

На фиг. 11 приведена гистограмма относительной интенсивности ингибирования фосфорилированного Akt под действием биспецифических антител, двухвалентных антител или смеси антител, специфичных к антигену 3 и антигену 2.

На фиг. 12 приведена гистограмма относительной интенсивности ингибирования фосфорилированного PLCg2 под действием биспецифических антител, двухвалентных антител или смеси антител, специфичных к антигену 3 и антигену 2.

На фиг. 13 приведен график, демонстрирующий результаты титриметрического анализа влияния биспецифического сочетания, направленного против антигена 3 и против антигена 2, на уровень общего IkB в В-клетках, стимулированных антителом против IgM.

На фиг. 14 приведен график, демонстрирующий результаты титриметрического анализа влияния биспецифического сочетания, направленного против антигена 3 и против антигена 2, на экспрессию CD86 в В-клетках, стимулированных антителом против IgM.

На фиг. 15 приведена гистограмма относительной интенсивности ингибирования фосфорилированного Akt под действием биспецифических антител, двухвалентных антител или смеси антител, специфичных к антигену 4 и антигену 2.

На фиг. 16 приведена гистограмма относительной интенсивности ингибирования фосфорилированного PLCg2 под действием биспецифических антител, двухвалентных антител или смеси антител, специфичных к антигену 4 и антигену 2.

На фиг. 17 приведен график, демонстрирующий результаты титриметрического анализа влияния биспецифического сочетания, направленного против антигена 4 и против антигена 2, на экспрессию CD86 в В-клетках, стимулированных антителом против IgM.

На фиг. 18 приведен график с наложенными кривыми сигнала А280, полученными методом гель-хроматографии в эксперименте 1 примера 11. Показаны следующие кривые: контроль Fab-X (VR4247), контроль Fab-Y (VR4248) и комплекс Fab-X (VR4247) и Fab-Y (VR4248) с молярным соотношением компонентов 1:1 и концентрацией 500 мкг/мл. Детекцию осуществляют путем измерения поглощения при 280 нм.

На фиг. 19 приведен график с наложенными кривыми сигнала А214, полученными методом гель-хроматографии в эксперименте 2 примера 11. Показаны следующие кривые: контроль Fab-X (VR4130), контроль Fab-Y (VR4131) и комплекс Fab-X (VR4130) и Fab-Y (VR4131) с молярным соотношением компонентов 1:1 и концентрацией 500 мкг/мл. Детекцию осуществляют путем измерения поглощения при 214 нм.

На фиг. 20 приведен график с наложенными кривыми сигнала А214, полученными методом гель-хроматографии в эксперименте 2 примера 11. Все показанные кривые соответствуют смесям Fab-X (VR4130)/Fab-Y (VR4131) с молярным соотношением компонентов 1:1 и концентрацией 500 мкг/мл, 50 мкг/мл и 5 мкг/мл, как показано. Детекцию осуществляют путем измерения поглощения при 214 нм.

На фиг. 21 приведена таблица, демонстрирующая результаты анализа перекрестной специфичности к антигенам. Результаты приведены в виде процента ингибирования (имеющего отрицательное значение при активации) фосфорилирования Syk и представляют собой среднее значение результатов анализа нескольких сочетаний V-участков.

На фиг. 22 приведена таблица, демонстрирующая результаты анализа перекрестной специфичности к антигенам. Результаты приведены в виде процента ингибирования (имеющего отрицательное значение при активации) фосфорилирования PLCg2 и представляют собой среднее значение результатов анализа нескольких сочетаний V-участков.

На фиг. 23 приведена таблица, демонстрирующая результаты анализа перекрестной специфичности к антигенам. Результаты приведены в виде процента ингибирования (имеющего отрицательное значение при активации) фосфорилирования AKT и представляют собой среднее значение результатов анализа нескольких сочетаний V-участков.

На фиг. 24 приведен график, демонстрирующий процент ингибирования фосфорилирования Syk, PLCg2 и AKT для каждого сочетания V-участков, направленных против антигена 2 в Fab-Х, объединенного с антигеном 3 в Fab-Y.

На фиг. 25 приведен график, демонстрирующий процент ингибирования фосфорилирования Syk, PLCg2 и AKT для каждого сочетания V-участков, направленных против антигена 3 в Fab-Х, объединенного с антигеном 2 в Fab-Y.

На фиг. 26 приведен график, демонстрирующий процент ингибирования фосфорилирования Syk, PLCg2 и AKT для каждого сочетания V-участков, направленных против антигена 2 в Fab-Х, объединенного с антигеном 4 в Fab-Y.

На фиг. 27 приведен график, демонстрирующий процент ингибирования фосфорилирования Syk, PLCg2 и AKT для каждого сочетания V-участков, направленных против антигена 4 в Fab-Х, объединенного с антигеном 2 в Fab-Y.

На фиг. 28 приведен график, демонстрирующий процент ингибирования экспрессии CD71 в В-клетках, индуцированной антителом против IgM, под действием антиген3-Fab'-X и антиген2-Fab'-Y, с использованием сочетания либо в виде очищенных Fab', либо в составе супернатанта, полученного после временной экспрессии.

Кружки - Очищенные антиген2Fab-Y+антиген3Fab-X, IC₅₀ 0,3224 нМ

Квадраты - Суп. после врем. экспресси, содержащий антиген2-Y+антиген3-X, IC₅₀ 0,2640 нМ

Треугольники - Супернатант контрольных клеток, трансфицированных пустым вектором

На фиг. 29 приведен график, демонстрирующий процент ингибирования анти-IgM-индуцированного фосфорилирования р38 в В-клетках под действием антиген3-Fab'-X и антиген2-Fab'-Y, с использованием сочетания либо в виде очищенных Fab', либо в составе супернатанта, полученного после временной экспрессии.

Кружки - Очищенные антиген2Fab-Y+антиген3Fab-X, IC₅₀ 0,1413 нМ

Квадраты - Суп. после врем. экспресси, содержащий антиген2-Y+антиген3-X, IC₅₀ 0,1861 нМ

Треугольники - Супернатант контрольных клеток, трансфицированных пустым вектором

Обозначения, используемые на фиг. 30-33:

1. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6066); 2. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6078); 3. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6079); 4. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6080); 5. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6082); 6. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6067); 7. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6068); 8. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6070); 9. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6071); 10. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6073); 11. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6075); 12. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6076); 13. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6077); 14. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6069); 15. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6072); 16. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6074); 17. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (VR6081); 18. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (TSUP-24117); 19. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (TSUP-24432); 20. Супернатант клеток, трансфицированных пустым вектором, 1; 21. Супернатант клеток, трансфицированных пустым вектором, 2; 22. Антиген2Fab-Y (VR4447)+Антиген3Fab-X (4126), очищенные.

На фиг. 30 приведен график, демонстрирующий результаты анализа ингибирования фосфорилирования под действием очищенных антиген2-специфического Fab-Y (VR4447) в сочетании с антиген3-специфическим Fab-X, полученных путем временной экспрессии в IgM-стимулированных В-клетках UCB_Cone_172.

На фиг. 31 приведен график, демонстрирующий результаты анализа ингибирования фосфорилирования под действием очищенных антиген2-специфического Fab-Y (VR4447) в сочетании с антиген3-специфическим Fab-X, полученных путем временной экспрессии в IgM-стимулированных В-клетках UCB_Cone_173.

На фиг. 32 приведены результаты анализа ингибирования фосфорилирования под действием очищенных антиген2-специфического Fab-Y (VR4450) в сочетании с антиген3-специфическим Fab-X, полученных путем временной экспрессии в IgM-стимулированных В-клетках UCB_Cone_172.

На фиг. 33 приведены результаты анализа ингибирования фосфорилирования под действием очищенных антиген2-специфического Fab-Y (VR4450) в сочетании с антиген3-специфическим Fab-X, полученных путем временной экспрессии в IgM-стимулированных В-клетках UCB_Cone_172.

На фиг. 34 показаны значения процента ингибирования анти-IgM-индуцированного фосфорилирования PLCγ2 в В-клетках под действием антиген3- и антиген2-специфического Fab-Kd-Fab или BYbe.

На фиг. 35 показаны значения процента ингибирования анти-IgM-индуцированного фосфорилирования P38 в В-клетках под действием антиген3- и антиген2-специфического Fab-Kd-Fab или BYbe.

На фиг. 36 показаны значения процента ингибирования анти-IgM-индуцированного фосфорилирования Akt в В-клетках под действием антиген3- и антиген2-специфического Fab-Kd-Fab или BYbe.

На фиг. 37 показаны значения процента ингибирования анти-IgM-индуцированной экспрессии CD71 в В-клетках под действием антиген3- и антиген2-специфического Fab-Kd-Fab или BYbe.

На фиг. 38 показаны значения процента ингибирования анти-IgM-индуцированной экспрессии CD40 в В-клетках под действием антиген3- и антиген2-специфического Fab-Kd-Fab или BYbe.

На фиг. 39 показаны значения процента ингибирования анти-IgM-индуцированной экспрессии CD86 в В-клетках под действием антиген3- и антиген2-специфического Fab-Kd-Fab или BYbe.

На фиг. 40 показаны ингибирование экспрессии CD27 в В-клетках под действием VR4447/VR4126 BYbe и VR4447/VR4126/VR645 BYbe/альбумин.

На фиг. 41 показаны ингибирование экспрессии CD71 в В-клетках под действием VR4447/VR4126 BYbe и VR4447/VR4126/VR645 BYbe/альбумин.

На фиг. 42 показаны ингибирование экспрессии CD86 в В-клетках под действием VR4447/VR4126 BYbe и VR4447/VR4126/VR645 BYbe/альбумин.

На фиг. 43 показаны ингибирование экспрессии CD27 в В-клетках под действием VR4447/VR4130 BYbe и VR4447/VR4130/VR645 BYbe/альбумин.

На фиг. 44 показаны ингибирование экспрессии CD71 в В-клетках под действием VR4447/VR4130 BYbe и VR4447/VR4130/VR645 BYbe/альбумин.

На фиг. 45 показаны ингибирование экспрессии CD86 в В-клетках под действием VR4447/VR4130 BYbe и VR4447/VR4130/VR645 BYbe/альбумин.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Термин "биспецифическиЙ белковый комплекс", используемый в данном описании, относится к молекуле, содержащей два белка (А и В, называемые здесь компоненты биспецифического комплекса, или их еще называют здесь первый белковый компонент и второй белковый компонент биспецифического комплекса, соответственно), которые удерживаются вместе посредством гетеродимерного связующего фрагмента. В одном варианте осуществления один из белков, или оба белка содержат связывающий домен, например, один из белков, или оба белка представляют собой антитела или их фрагменты (в частности, фрагмент Fab или Fab', такие комплексы также называют Fab-Kd-Fab).

"Слитые белки", в соответствии с данным описанием, содержат белковый компонент А или В, гибридизованный с партнером по связыванию Х или Y (в зависимости от обстоятельств). В одном варианте осуществления слитый белок представляет собой трансляционный белок, экспрессированный с помощью рекомбинантных методов из генетической конструкции, например, экспрессированный в организме хозяина из ДНК-конструкции. В контексте настоящего описания одной из ключевых характеристик слитого белка, является то, что он может экспресасироваться в виде "отдельного белка/элемента" в клетке (конечно, в случае слитых белков, содержащих фрагмент Fab/Fab', существует две цепи, однако в целях настоящего описания они рассматриваются как один белок с одной цепью, причем тяжелую цепь обычно гибридизуют по C-концу с X или Y, по обстоятельствам, необязательно через линкер, как описано ниже).

Функция гетеродимерного связующего фрагмента X:Y заключается в удерживании белков А и В в непосредственной близости друг от друга так, чтобы могла осуществляться синергетическая функция А и В, или чтобы можно было идентифицировать такую функцию, например, с помощью способа, описанного в настоящем документе.

Термин "гетеродимерный связующий фрагмент", используемый в данном описании, относится к связующему фрагменту, содержащему два разных партнера по связыванию X и Y, между которыми может возникать взаимодействие: (например, связывание), и которые обладают сродством друг к другу, которое является достаточным, чтобы удерживать вместе два партнера по связыванию. В одном варианте осуществления X и/или Y не способны образовывать гомодимеры.

Термины гетеродимер-связанный и гетеродимерный связующийфрагмент используются здесь как взаимозаменяемые.

В одном варианте осуществления используемый здесь термин "неспособный образовывать гомодимеры" означает, что образование гетеродимеров X-Y является более предпочтительным, чем образование гомодимеров, например, гетеродимеры являются более стабильными, например, термодинамически более стабильными, чем гомодимеры. В одном варианте осуществления связывающее взаимодействие между Х и Y является одновалентным.

В одном варианте осуществления взаимодействие Х-Y является более предпочтительным, чем взаимодействие X-X или Y-Y. Это приводит к уменьшению образования гомодимеров X-X или Y-Y при смешивании слитых белков А-X и B-Y. Как правило, после смешивания указанных белков в молярном соотношении 1:1 образуется более 75% гетеродимера.

При желании можно провести стадию очистки (например, одностадийную очистку), например, методом колоночной хроматографии, например, для очистки слитых белковых элементов и/или биспецифических белковых комплексов настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления стадию очистки проводят после экспрессии одного или каждого слитого белка, хотя, как правило, уровни агрегатов являются низкими. Таким образом, в одном варианте осуществления перед смешиванием in vitro слитый белок (слитые белки) получают по существу в чистом виде. Термин "по существу в чистом виде" в соответствии с данным описанием означает, что содержание мономера слитого белка составляет 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%.

В одном варианте осуществления очистку слитого белка или слитых белков не проводят.

В одном варианте осуществления каждый слитый белковый элемент экспрессируют в отдельном эксперименте/цикле.

В одном варианте осуществления перед смешиванием с целью получения биспецифического белкового комплекса очистку слитого белка или слитых белков не проводят. В одном варианте осуществления очистку слитого белка или слитых белков не проводят до и/или после смешивания.

В одном варианте осуществления после образования биспецифического белкового комплекса очистка не требуется.

В одном варианте осуществления после смешивания, как правило, при отсутствии дополнительной очистки, по меньшей мере, 50% композиции составляет целевой биспецифический белковый комплекс, например, по меньшей мере, 60, 65, 70, 75, 80% композиции составляет целевой биспецифический белковый комплекс.

В одном варианте осуществления отношение слитых белков А-Х к B-Y, используемых на стадии смешивания in vitro способа настоящего изобретения, составляет от 0,8:1 до 3:1, например, 1,5:1 или 2:1.

В одном варианте осуществления отношение, в частности молярное отношение, слитых белков B-Y к А-Х, используемых на стадии смешивания in vitro способа настоящего изобретения, составляет от 0,8:1 до 3:1, например, 1,5:1 или 2:1.

В одном варианте осуществления отношение A-X к B-Y, используемое на стадии смешивания in vitro составляет 1:1, в частности, оно представляет собой молярное отношение 1:1.

Настоящее изобретение также относится к способу получения биспецифического комплекса настоящего изобретения, включающему в себя смешивание слитых белков А-Х и В-Y, например, в молярном соотношении 1:1.

В одном варианте осуществления смешивание осуществляют in vitro.

В одном варианте осуществления смешивание происходит в клетке, например, в клетке-хозяине.

В одном варианте осуществления смешивание происходит in vivo, т.е. слитые белки А-Х и В-Y взаимодействуют друг с другом в организме индивидуума, образуя гетеродимерный связующий фрагмент, и, как следствие, биспецифический белковый комплекс.

В одном варианте осуществления Х и Y являются полностью специфичными в отношении друг друга и не связываются с любыми другими пептидами/белками, присутствующими в клетке или в организме индивидуума. Этого можно достичь, например, путем гарантирования того, что Х и Y в природе не присутствуют в клетке-мишени или в организме индивидуума-мишени. Этого можно достичь, например, путем выбора X или Y, полученного от вида или организма, отличного от индивидуума (например, дрожжевого белка), и гарантирования того, что другой компонент является специфичным к нему. Предпочтительно это предотвращает связывание слитых белков A-X и/или B-Y с нежелательной мишенью и, как следствие, появление нежелательных побочных эффектов.

В одном варианте осуществления один (или, по меньшей мере, один) из партнеров по связыванию не способен образовывать гомодимер, например, в результате введения в его аминокислотную последовательность мутаций, приводящих к устранению или сведению к минимуму способности к образованию гомодимеров.

В одном варианте осуществления оба партнера по связыванию не способны образовывать гомодимеры, например, в результате введения в аминокислотную последовательность одного из партнеров мутаций, приводящих к устранению или сведению к минимуму способности к образованию гомодимеров, и применения специфичного к нему VHH.

Неспособность образовывать гомодимеры или агрегаты, в соответствии с данным описанием означает, что гомодимеры или агрегаты образуются на низком уровне, или совсем не образуются. Низкий уровень, в соответствии с данным описанием означает, что, например, после смешивания, или экспрессии, или очистки образуется 5% или менее, например, 4, 3, 2, 1, 0,5% или менее агрегатов.

Небольшие количества агрегатов, присутствующих в препаратах слитых белков или гетеродимер-связанных биспецифических белковых комплексов, как правило, оказывают минимальное влияние на способ скрининга настоящего изобретения. Таким образом, в одном варианте осуществления способа настоящего изобретения очистку слитого белка (белков) и/или биспецифического белкового комплекса (комплексов) не проводят, в частности, после стадии смешивания.

В одном варианте осуществления: обозначает связывающее взаимодействие, основанное на силах притяжения, например, вандерваальсовых силах, таких как водородные связи и электростатические взаимодействия, в частности, образующиеся при наличии специфичности антитела к антигену (такому как пептид).

В одном варианте осуществления: обозначает ковалентную связь, образованную в результате определенного химического взаимодействия, такого как клик-химия. В одном варианте осуществления: не является ковалентной связью. В одном варианте осуществления для получения биспецифических белковых комплексов настоящего изобретения не используют химические реакции конъюгации/присоединения.

В данном описании термин "образование комплекса" относится к взаимодействию, включающему в себя связывающее взаимодействие или химическое взаимодействие, которое является достаточно специфичным и сильным, когда слитые белковые компоненты A-X и B-Y приходят в контакт в условиях, подходящих для сборки комплекса, и обеспечивает удерживание слитых белков вместе.

В данном описании термин "удерживаемые вместе" относится к удерживанию компонентов (слитых белков) в непосредственной близости друг от друга, так, чтобы после образования связи X:Y комплекс можно было бы обработать, как если бы он представлял собой одну молекулу, и чтобы во многих случаях комплекс вел себя и действовал как одна молекула. В одном варианте осуществления удерживание делает комплекс пригодным для применения в раскрытом здесь способе, то есть, пригодным для применения, по меньшей мере, в одном функциональном скрининге.

Термин "специфичность", в соответствии с данным описанием, относится, например, к способности партнеров взаимодействовать, например, Х:Y, или к способности А и антигена, или В и антигена распознавать только друг друга, или взаимодействовать друг с другом с более высоким сродством, чем с соединениями, не являющимися партнерами, например, со сродством, которое, по меньшей мере, в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 раз превышает, например, фоновый уровень связывания с посторонним белком, не являющимся партнером.

Специфичность в отношении к X и Y, в соответствии с данным описанием, относится к способности партнеров по связыванию Х и Y при взаимодействии распознавать только друг друга, или взаимодействовать друг с другом со значительно более высоким сродством, чем с соединениями, не являющимися партнерами, например, со сродством, которое, по меньшей мере, в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 раз превышает сродство к другим соединениям.

В одном варианте осуществления связывающее взаимодействие является обратимым. В одном варианте осуществления связывающее взаимодействие является по существу необратимым.

Термин "по существу необратимый", в соответствии с данным описанием, относится к низкой скорости распада (константе диссоциации) комплекса антитела или его связывающего фрагмента.

В одном варианте осуществления связывающее взаимодействие между Х и Y характеризуется низкой константой диссоциации.

Примеры значений низкой константы диссоциации включают в себя 1-9×10^-2с^-1 или менее, например, 1-9×10^-3с^-1, 1-9×10^-4с^-1, 1-9×10^-5с^-1, 1-9×10^-6с^-1 или 1-9×10^-7с^-1. Особенно подходящие значения константы диссоциации включают в себя 2×10^-4с^-1 или менее, например, 1×10^-5с^-1, 1×10^-6с^-1 или 1×10^-7с^-1.

Не желая быть связанными с какой-либо теорией, авторы полагают, что низкая константа диссоциации (также называемая скоростью распада) свидетельствует о стабильности молекул, достаточной для того, чтобы использовать биспецифический белковый комплекс, например, в анализах функционального скрининга.

В одном варианте осуществления сродство X и Y друг к другу составляет 5 нМ или выше, например 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ или выше.

В одном варианте осуществления, сродство X и Y друг к другу составляет 900 пМ или выше, например, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 или 50 пМ или выше.

В другом варианте осуществления сродство X и Y друг к другу составляет 10 пМ или выше, например, 9, 8, 7, 6 или 5 пМ.

Значение сродства рассчитывают с использованием скоростей ассоциации и диссоциации комплекса. Термин "сродство", в соответствии с данным описанием, относится к общей силе всех нековалентных взаимодействий между одним связывающим участком молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, пептидом). Сродство молекулы к партнеру по связыванию, как правило, характеризуется константой диссоциации (KD). Сродство можно измерить с помощью традиционных методдов, известных в данной области, включающих в себя методы, описанные в данном документе, такие как методы поверхностного плазмонного резонанса, в частности, BIAcore.

Однако способность удерживать вместе компоненты комплекса характеризуется не только сродством. Не желая быть связанными с какой-либо теорией, авторы полагают, что в действительности данную способность обуславливают три важных компонента: скорость ассоциации, скорость диссоциации и сродство. Для расчета сродства используют скорость ассоциации и скорость диссоциации. Так, если скорость ассоциации является низкой, а скорость диссоциации высокой, то сродство будет низким и не достаточным для того, чтобы удерживать вместе компоненты биспецифического белкового комплекса. Однако низкая скорость ассоциации может компенсироваться низкой скоростью диссоциации, давая в результате подходящее сродство. В некоторых вариантах осуществления высокая скорость ассоциации может быть достаточной, чтобы удерживать вместе компоненты комплекса.

Если партнеры по связыванию (X и Y), используемые для получения комплекса, имеют низкую скорость ассоциации, для образования комплекса после смешивания компонентов может потребоваться дополнительное время.

Если сродство между партнерами по связыванию является достаточно высоким, биспецифический белковый комплекс может выполнять желательную биологическую функцию, даже если сродство белков (А и В), входящих в состав биспецифического белкового комплекса, позволяет им лишь слабо связываться с их мишенями. И наоборот, если белки (А и В) способны прочно связываться с мишенями, это может пзволить комплексу выполнять такую же биологическую функцию, даже если сродство партнеров по связыванию (X и Y) друг к другу является низким. Другими словами, существует "тройная" взаимосвязь, свидетельствующая о том, что более высокое сродство между партнерами по связыванию может компенсировать более низкое сродство к мишеням, и наоборот.

В одном варианте осуществления сродство белка А к его лиганду или антигену составляет примерно 100 нМ или выше, например, 50 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 250 пМ, 200 пМ, 100 пМ или выше, в частности, сродство связывания может составлять 50 пМ или выше.

В одном варианте осуществления сродство белка В к его лиганду или антигену составляет примерно 100 нМ или выше, например, 50 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 250 пМ, 200 пМ, 100 пМ или выше, в частности, сродство связывания может составлять 50 пМ или выше.

В одном варианте осуществления взаимодействие между константным доменом тяжелой цепи, таким как CH1, и константным доменом легкой цепи, таким как CKappa, вносит вклад в образование и/или стабильность биспецифического комплекса настоящего изобретения. Таким образом, для получения биспецифических комплексов настоящего изобретения полезно использовать фрагменты Fab или Fab'.

В одном варианте осуществления биспецифический комплекс настоящего изобретения не содержит компонент с эффекторной функцией, например, комплекс не содержит константный домен, отличный от CH1 и CKappa или CLambda, в частности, не содержит константные домены, независимо выбранные из группы, включающей в себя CH2, CH3, CH4 и их сочетания. В одном варианте осуществления биспецифический комплекс настоящего изобретения не содержит участок Fc.

В одном варианте осуществления описанный здесь способ используют для скрининга наивной фаговой библиотеки с целью получения из библиотеки слитых белков настоящего изобретения.

Биспецифические белковые комплексы настоящего изобретения можно использовать в любом подходящем способе применения, включающем в себя функциональный скрининг. Этот новый формат особенно подходит для мультиплексного функционального скрининга с целью выявления белковых мишеней на основе функции и оптимальных эпитопов указанных белковых мишеней, на которые может быть направлена биспецифическая терапия. Кроме того, если белки А и В представляют собой антитела или их связывающие фрагменты, биспецифические белковые комплексы также можно использовать для мультиплексного функционального скрининга с целью идентификации оптимальных пар вариабельных участков, которые можно использовать для получения терапевтических средств на основе биспецифических антител.

Термин "мультиплекс" в данном описании относится к популяции соединений, используемых для тестирования, и включает в себя:

по меньшей мере, двухкомпонентные слитые белки (А-X и Y-B), объединенные с получением, по меньшей мере, одного гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса и, по меньшей мере, один соответствующий биологический компаратор в таком же или в другом формате, или

по меньшей мере, два гетеродимер-связанных биспецифических белковых комплекса и, необязательно, по меньшей мере, один соответствующий биологический компаратор в таком же или другом формате.

Очевидно, что, если компаратор используют в другом формате, этот формат должен подходить для тестирования в функциональном анализе in vitro, используемом в описании. В одном примере компаратор, входящий в состав мультиплекса, представляет собой одновалентную смесь А-Х и В-X или двухвалентный моноспецифический комплекс A-X-Y-A.

В одном варианте осуществления мультиплекс содержит от 1 до сотен тысяч гетеродимер-связанных биспецифических белковых комплексов, например, от 2 до 500000 указанных комплексов, от 2 до 100000, или от 2 до 10000 комплексов, в частности, полученных путем смешения в матрице 2 на 100 первого и второго слитых белков (A-X и B-Y). В одном варианте осуществления мультиплекс содержит, например, от 2 до 1000, от 2 до 900, от 2 до 800, от 2 до 700, от 2 до 600, от 2 до 500, от 2 до 400, от 2 до 300, от 2 до 200, от 2 до 100, от 2 до 90, от 3 до 80, от 4 до 70, от 5 до 60, от 6 до 50, от 7 до 40, от 8 до 30, от 9 до 25, от 10 до 20 или 15 биспецифических белковых комплексов. Пример такой матрицы можно найти на фиг. 3.

В одном варианте осуществления число гетеродимер-связанных биспецифических белков в указанном мультиплексе составляет n², где n равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более.

Мультиплекс может находиться в виде массива, например, в микротитрационном планшете, где каждая лунка микропланшета может содержать другой биспецифический белковый комплекс. Биспецифические белковые комплексы могут быть связаны с твердой поверхностью подложки, например, они могут быть присоединены к гранулам, или они могут быть суспендированы в жидкой форме (такой как раствор или среда), например, в лунке или в капельке.

В одном варианте осуществления в мультиплексе каждый "А" представляет собой другой белок, предпочтительно, антитело или его связывающий фрагмент, способный связываться с антигеном-мишенью, и каждый "B" представляет собой другой белок, предпочтительно, антитело или его связывающий фрагмент, способный связываться с антигеном-мишенью.

В одном варианте осуществления мультиплекс предоставляется в виде матрицы, как описано ниже, например, 8×8, 16×16 или 16×20, что соответствует 64, 256 или 320 образцам, соответственно.

Термин "матрица" в данном описании относится к двумерному графику или массиву, где одна переменная, такая как белок А (входящий в состав A-X), варьирует вдоль одной оси, такой как ось Х (горизонтальная ось), а другая переменная, такая как белок B (входящий в состав B-Y), варьирует вдоль другой оси, такой как ось Y (вертикальная ось). Такая схема расположения помогает проводить систематическую оценку разных сочетаний (перестановок) переменных.

В одном варианте осуществления мультиплекс предоставляется в 96-луночных планшетах и число анализируемых образцов может быть кратно числу лунок в таких планшетах, т.е. оно может составлять 96, 192, 384 и т.д.

Расположение в виде матрицы является особенно предпочтительным для эффективного скрининга биологической функции биспецифических белковых комплексов настоящего изобретения. На фиг. 3 показан пример такой матрицы, с помощью которой первые 4 слитых белка можно легко объединить с 4 другими слитыми белками с получением 16 биспецифических белковых комплексов.

Для специалиста в данной области должно быть очевидно существование других вариантов матрицы скрининга, например, первый белок (А), входящий в состав первого слитого белка (A-X), можно использовать неизменным, тогда как второй белок (B), входящий в состав второго слитого белка (В-Х), можно варьировать. Такую схему можно использовать для быстрого скрининга большого числа разных вторых белков с целью выявления синергизма по отношению к заранее выбранному первому белку.

В другом варианте осуществления белок А варьирует вдоль одной оси с изменением вариабельных участков антитела белка А таким образом, что каждый вариант антитела остается специфичным к одному и тому же антигену, но содержит другое сочетание вариабельных участков. Белок В может либо оставаться неизменным, либо он может варьировать в такой же манере, или с изменением антигенной специфичности (поперек матрицы, или вниз по матрице).

Предпочтительно с помощью такой матрицы скрининга можно детектировать небольшие различия в синергической функции, если биспецифические белковые комплексы обладают специфичностью к одним и тем же антигенам, но содержат разные сочетания вариабельных участков.

В одном варианте осуществления в каждой лунке может присутствовать "общий" первый слитый белок (А-Х) настоящего изобретения. Затем в каждую лунку можно добавить разные вторые слитые белки (B-Y) настоящего изобретения. В результате специфического связывающего взаимодействия двух партнеров по связыванию (X и Y) происходит физическое соединение двух слитых белков с образованием биспецифических белковых комплексов. Это приводит к образованию мультиплекса, содержащего биспецифические белковые комплексы, способные связываться с общим первым антигеном-мишенью (связывающимся с А), и также способные связываться со вторым антигеном-мишенью (связывающимся с В), который может быть другим для каждого биспецифического белкового комплекса.

В одном варианте осуществления слитые белки В-Y содержат разные вариабельные участки, специфичные к тому же антигену-мишени, что позволяет оптимизировать вариабельные участки и/или эпитопы данного антигена-мишени, связывающегося с B, при объединении с вариабельными участками A-X.

"Общий" первый слитый белок, в соответствии с данным описанием, относится к слитому белку, в котором компонент А или В связывает одни и те же белки или эпитопы, в частности, где компоненты А или В, входящие в состав всех слитых белков, объединенных термином "общий", являются полностью идентичными, т.е. общий первый слитый белок всегда содержит одну и ту же последовательность вариабельного участка.

Специалисту в данной области также известны разные вариации описанных выше схем, с помощью которых можно легко регулировать желательную специфичность биспецифических белковых комплексов в каждом положении мультиплекса. Это позволяет проводить эффективный скрининг разных сочетаний биспецифических белковых комплексов при использовании таких мультиплексов в функциональных анализах. В одном варианте осуществления для определения переменных, применяющихся в матрице, используют факториальный дизайн.

В одном варианте осуществления способ настоящего изобретения позволяет проводить анализ с высокой пропускной способностью.

В одном варианте осуществления множество биспецифических белковых комплексов тестируют одновременно или практически одновременно.

Термин "одновременно" в данном описании означает, что образцы/молекулы/комплексы анализируют в одном анализе, например, в одном "цикле". Преимущество такого анализа может заключаться в том, что обычно реагенты, используемые для данного цикла, относятся к одной партии, имеют одинаковую концентрацию, один источник клеток и т.д., и поэтому имеют одинаковые свойства. Кроме того, условия окружающей среды, в которых проводят анализ, такие как температура и влажность, по всей вероятности, будут похожи.

В одном варианте осуществления термин "одновременно" относится к сопутствующему анализу, в котором выходной сигнал регистрируют с помощью прибора, по существу, в то же время. Этот сигнал может потребовать деконволюции для интерпретации полученных результатов.

Предпочтительно тестирование нескольких биспецифических белковых комплексов позволяет проводить более эффективный скрининг большого числа биспецифических белковых комплексов и идентифицировать новые и интересные взаимосвязи.

В одном варианте осуществления несколько биспецифических белковых комплексов тестируют с использованием мультиплекса, описанного выше, подвергая их одному или нескольким функциональным анализам. Соответственно, настоящее изобретение предлагает способ детекции синергической биологической функции в гетеродимер-связанном биспецифическом белковом комплексе формулы A-X:Y-B

где X:Y представляет собой гетеродимерный связующий фрагмент;

: обозначает связывающее взаимодействие между X и Y;

А и В представляют собой белковые компоненты биспецифического комплекса, присутствующие в нем в виде гибридов с X и Y соответственно, причем указанный способ включает в себя следующие стадии:

(i) тестирование активности в функциональном анализе части или всего мультиплекса, содержащего, по меньшей мере, один гетеродимер-связанный биспецифический белковый комплекс; и

(ii) анализ результата (результатов) функционального анализа с целью идентификации или детекции синергической биологической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса; и

где Y представляет собой антиген, а Х представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, специфичный к Y, или X представляет собой антиген, а Y представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, специфичный к X.

В данном описании термин "биологическая функция" относится к активности, присущей тестируемому биологическому соединению, или являющейся его целью, такой как природная активность клетки, белка и т.п. В идеале наличие биологической функции можно определить с помощью функционального анализа in vitro, включающего в себя анализы с использованием клеток млекопитающих, таких как живые клетки, такие как B- или Т-клетки, или тканей ex vivo. Природная функция, в соответствии с данным описанием, также включает в себя аберрантные функции, например, функции, связанные с заболеваниями, такими как рак.

В данном описании термин соответствующий "биологический компаратор" относится к соединению, подходящему для оценки активности в том же анализе, который используют для биспецифического белкового комплекса, чтобы установить наличие какие-либо изменений, или новой активности или функции. Подходящий компаратор для A-X:Y-B может включать в себя очищенный белок (в том числе рекомбинантный белок) в природном виде, или присутствующий в том же формате, что и биспецифический комплекс, например, где А и В имеют такую же природу, такой как A-X:Y-A или B-X:Y-B, т.е. представляющий сбой двухвалентный моноспецифический комплекс. Альтернативно в качестве компаратора можно использовать слитые белки А-Х и В-Y в незакомплексованной форме, по отдельности или в виде незакомплексованной смеси, такой как смесь A-Х и В-Х или смесь A-Y и B-Y. Кроме того, можно использовать несколько компараторов разных форматов (в частности, описанных в настоящем документе). Специалист в данной области может выбрать и использовать соответствующий контроль/компаратор на основе общедоступных знаний или информации, которую можно найти в литературе.

В данном описании термин "синергетическая функция" или "синергическая биологическая функция" относится к биологической активности, или уровню биологической активности, или влиянию на биологическую функцию или активность, которые:

отсутствуют при использовании отдельных белковых слитых компонентов до применения биспецифического комплекса (и могут включать в себя активность, возникающую в результате воздействия сочетания антител на указанные антигены, которые не находятся в биспецифическом формате, однако в особенности данный термин относится к активности, наблюдающейся только тогда, когда два связывающих домена связаны между собой в биспецифическом формате) или

уровень которых выше или ниже уровня, наблюдаемого при отдельном использовании первого и второго белков биспецифического белкового комплекса настоящего изобретения, например, данный термин относится к активности, наблюдающейся только при использовании биспецифической формы.

Следовательно, термин "синергический" включает в себя новую биологическую функцию или новую активность. Синергическая функция, в соответствии с данным описанием, как правило, включает в себя не только специфичность, т.е. активность, основанную лишь на связывании, но, как правило, и в некоторой степени ингибирование, активацию, передачу сигнала и т.п. после связывания.

Термины "новая биологическая функция" или "новая активность", в соответствии с данным описанием относятся к биологической функции или активности, которая не проявляется, или отсутствует, до тех пор, пока два или более синергических соединения (белок А и белок В) не объединят (в виде биспецифического комплекса, или иным образом), либо они относятся к ранее неидентифицированной функции.

Более высокий уровень, в соответствии с данным описанием, означает повышение активности, включающее в себя повышение от нулевого уровня, например, некоторую активность биспецифического комплекса, если отдельные незакомплексованные компоненты данного комплекса не проявляют активность в соответствующем функциональном анализе, также называют здесь новой активностью или новой биологической функцией. Более высокий уровень, в соответствии с данным описанием, также включает в себя уровень, превышающий аддитивную функцию биспецифического комплекса в соответствующем функциональном анализе по сравнению с уровнем, наблюдающимся при применении отдельных незакомплексованных компонентов биспецифического комплекса (тестируемых отдельно или в сочетании со связанными компонентами), например, увеличение соответствующей активности может составлять 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300% или более.

В одном варианте осуществления незакомплексованные белки вместе имеют такую же активность, как и биспецифический комплекс, причем эта активность или функция была ранее неизвестна. В контексте настоящего описания это также считается новой синергической функцией.

В одном варианте осуществления синергетическая функция представляет собой повышенную функцию.

В одном варианте осуществления синергетическая функция представляет собой пониженную функцию.

В соответствии с данным описанием, пониженная функция биспецифического комплекса в соответствующем функциональном анализе, которая означает снижение или отсутствие активности по сравнению с применением отдельных незакомплексованных компонентов биспецифического комплекса, которые не проявляют активности в соответствующем функциональном анализе, также называют здесь новой активностью или новой биологической функцией (например, проявляемой природным белком, т.е. рекомбинантным выделенным белком, который не входит в состав слитого белка, и не является частью какого-либо другого комплекса, отличного от комплекса, который содержит in vivo активный домен или фрагмент указанного белка), которая при анализе отдельного белка или смеси белков в тех же условиях, может быть, например, на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300% или более ниже соответствующей активности. Уменьшение активности более чем на 100% относится к приращению положительной активности в другом направлении, например, если соединение является агонистом, снижение активности более чем на 100% может сделать соединение антагонистом, и наоборот.

В одном варианте осуществления активность биспецифического комплекса ниже, чем сумма известных функций белка А и белка B.

В некоторых вариантах осуществления биспецифические белковые комплексы настоящего изобретения просто проявляют аддитивную биологическую функцию. Аддитивная биологическая функция, в соответствии с данным описанием, представляет собой функцию, которая равна сумме функций каждого из компонентов А и В по отдельности, при тестировании в одинаковых условиях. Аддитивная функция может представлять собой новую функцию, если активность или функция ранее не была известна или идентифицирована.

Скрининг проводят с использованием любого подходящего анализа, известного в данной области техники, в зависимости от целевой функции, которую нужно идентифицировать.

В одном варианте осуществления функциональный анализ, используемый в способе настоящего изобретения, проводят in vitro или ex vivo.

В данном описании термин "функциональный анализ" относится к анализу, который можно использовать для определения одного или нескольких желательных свойств или активностей биспецифических белковых комплексов, комплексов антител или смесей антител в соответствии с условиями анализа. Подходящие функциональные анализы могут включать в себя анализы связывания, анализы апоптоза, анализы антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC), анализы комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), анализы ингибирования клеточного роста или пролиферации (цитостатический эффект), анализы гибели клеток (цитотоксический эффект), анализы передачи сигналов в клетках, анализы продукции цитокинов, продукции и переключения изотипов антител, анализы клеточной дифференциации, анализы образования колоний, анализы хемотаксиса, анализы клеточной адгезии, анализы клеточной миграции, анализы клеточного цикла, метаболические анализы (анализы функций целых клеток и органелл), анализы, проводимые для измерения ингибирования связывания патогена с клеткой-мишенью, анализы, проводимые для измерения секреции фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) или других секретируемых молекул, анализы бактериостаза, бактерицидной активности, нейтрализации вирусов, анализы, проводимые для измерения привлечения компонентов иммунной системы к участку, в котором связываются антитела, включающие в себя методы гибридизации in situ, методы с использованием меток и т.п.

В одном варианте осуществления анализы in vivo проводят с использованием животных моделей, таких как мышиные модели опухолей, модели аутоиммунных заболеваний, инфицированные вирусами или бактериями модели грызунов или приматов и т.п.

Специалист в данной области может выбрать функциональный анализ, подходящий для исследуемых мишеней/белков. Однако комплексы можно подвергать ряду "стандартных" анализов без предварительного выбора анализов, предположительно соответствующих попытке идентифицировать новые функциональные возможности.

В контексте биспецифических комплексов антител, эффективность биспецифических комплексов антител настоящего изобретения можно сравнить с эффективностью отдельных антител или смесей антител (или фрагментов) в таких моделях с помощью методов, хорошо известных рядовым специалистам в данной области техники.

Например, биспецифические комплексы антител можно тестировать на способность ингибировать пролиферацию, влиять на жизнеспособность или метаболическую активность клеток (например, с использованием красителя, такого как аламар синий, или путем регистрации люминесценции, генерируемой люциферазой, которая экспрессируется в клетках), или вызывать апоптоз раковых клеток, где указанные способности представляют собой биологические функции, которые включают в себя свойства, отличные от способности связываться с антигеном.

С использованием функциональных анализов, тесно связанных с конкретным представляющим интерес заболеванием, способы настоящего изобретения позволяют идентифицировать потенциальные терапевтические антитела, способные связываться с известными или неизвестными молекулами-мишенями. Таким образом, с помощью способов настоящего изобретения можно идентифицировать новые молекулы-мишени, и/или непосредственно идентифицировать потенциальные терапевтические антитела. Предпочтительно способ настоящего изобретения не ограничивается каким-либо конкретным анализом (анализами), и предоставляет пользователю полную свободу в выборе наиболее подходящего функционального анализа в зависимости от потребностей.

Для скрининга биспецифических комплексов антител на желательную биологическую функцию можно использовать разные стратегии. Например, среду, содержащую антитела, можно непосредственно подвергать скринингу на биологическую активность. Альтернативно перед скринингом на биологическую активность антитела можно присоединить к покрытым гранулам, или микротитрационным планшетам. Кроме того, слитый белок можно очистить с использованием маркера His, улавливаемого на стадии очистки с применением никеля. Такие стратегии позволяют повысить локальные концентрации антител, что приводит к получению более четких результатов функциональных анализов.

Чтобы повысить надежность результатов, функциональные анализы можно повторять несколько раз по мере необходимости, в присутствии или в отсутствии разных образцов конкретных биспецифических комплексов антител. Для выявления статистически значимых результатов и, следовательно, идентификации биспецифических комплексов антител с биологическими функциями можно использовать разные статистические анализы, известные специалистам в данной области.

При выборе функционального анализа для скрининга квалифицированный специалист может установить подходящий порог, превышение которого идентифицированной активностью считается "попаданием". Если используют несколько функциональных анализов, пороговое значение для каждого анализа можно установить на подходящем уровне, чтобы обеспечить управляемую частоту "попаданий". В одном примере частота "попаданий" может составлять 3-5%. В одном примере набор критериев, используемый при поиске пар антигенов, которые ингибируют функцию В-клеток, может включать в себя, по меньшей мере, 30% ингибирование, по меньшей мере, двух фосфо-показаний в анализе активации B-клеток.

Для получения биспецифических белковых комплексов настоящего изобретения можно использовать описанные ниже белковые и пептидные компоненты.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере, один из первого партнера по связыванию, Х, и второго партнера по связыванию, Y, связывающей пары независимо друг от друга выбраны из пептида и белка; например, первый партнер по связыванию или второй партнер по связыванию представляет собой пептид.

Подходящие пептиды могут быть выбраны из группы, включающей в себя GCN4, Fos/Jun (человеческий и мышиный Fos имеют номера Uniprot P01100 и P01101, соответственно, а человеческий и мышиный jun имеют номера Uniprot 05412 и 05627, соответственно), HA-маркер, который соответствуют аминокислотам от 98 до 106 гемагглютинина гриппа человека, полигистидин (His), c-myc и FLAG. В настоящем изобретении можно использовать и другие пептиды, причем особенно предпочтительными являются пептиды, применяющиеся в качестве аффинных маркеров для очистки белков, поскольку такие пептиды обладают способностью связываться с их партнерами по связыванию с высоким сродством.

В одном варианте осуществления пептид отличается от E5B9.

Термин "пептид", используемый в данном описании, относится к короткому полимеру из аминокислот, соединенных пептидными связями, где пептид содержит от 2 до 100, например, от 5 до 99, например, от 6 до 98, от 7 до 97, от 8 до 96, или от 5 до 25 аминокислот. В одном варианте осуществления пептид, используемый в настоящем описании, представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую 50 или менее, например, 40, 30, 20, 10 или менее аминокислотных остатков. Пептиды, используемые в настоящем описании, должны иметь достаточную длину, чтобы быть пригодными для целей, в которых они используются, например, если пептид представляет собой линкер, он должен быть достаточно длинным, чтобы позволить фрагменту, с которым он связан, выполнять его биологическую функцию; альтернативно, если пептид является партнером по связыванию, он должен обладать способностью специфически связываться с другим соединением, таким как антитело.

В одном варианте осуществления другой партнер по связыванию связывающей пары (чередующиеся первый или второй партнеры по связыванию) представляет собой белок.

Белок, в соответствии с данным описанием, представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую 100 аминокислот или более. В одном варианте осуществления используемый здесь термин "белок" относится к аминокислотной последовательности, имеющей вторичную или третичную структуру.

Термины полипептид и белок используются здесь как взаимозаменяемые. Однако полипептид обычно представляет собой белок с простой структурой, такой как небольшая вторичная и/или третичная структура.

В одном варианте осуществления различие между пептидом и белком заключается в наличии или отсутствии вторичной структуры и/или третичной структуры, причем пептид не имеет вторичной структуры, а аминокислотная последовательность, имеющая вторичную структуру и/или третичную структуру, считается белком.

В одном варианте осуществления белок представляет собой антитело или фрагмент антитела.

Термин "антитело", используемый в данном описании, относится к молекуле иммуноглобулина, способной специфически связываться с антигеном-мишенью, таким как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид, пептид, и т.д., посредством, по меньшей мере, одного антиген-распознающего участка (также называемого здесь связывающий участок), расположенного в вариабельном домене молекулы иммуноглобулина.

Используемый здесь термин "молекула антитела" включает в себя антитела и их связывающие фрагменты.

Используемый здесь термин "фрагменты антител" относится к связывающим фрагментам антител, включающим в себя, без ограничения, Fab, модифицированный Fab, Fab', модифицированный Fab', F(аb')2, Fv, однодоменные антитела, ScFv, би-, три- или тетравалентные антитела, бис-ScFv, диатела, триатела, тетратела, а также их эпитопсвязывающие фрагменты (см., например, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Способы конструирования и производства указанных фрагментов антител хорошо известны в данной области (см., например, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181). Другие фрагменты антител, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают в себя фрагменты Fab и Fab', описанные в международных патентных заявках WO05/003169, WO05/003170 и WO05/003171. Поливалентные антитела могут быть мультиспецифичными, например, биспецифичными или моноспецифичными (см., например, W092/22853, WO05/113605, WO2009/040562 и WO2010/035012).

Используемый здесь термин "связывающий фрагмент" относится к фрагменту, способному связывать целевой пептид или антиген с достаточным сродством, чтобы охарактеризовать фрагмент как специфичный к пептиду или антигену.

Термин "фрагмент Fab", используемый в данном описании, относится к фрагменту антитела, который состоит из фрагмента легкой цепи, содержащего домен VL (вариабельный домен легкой цепи) и константный домен легкой цепи (CL), и фрагмента тяжелой цепи, содержащего домен VH (вариабельный домен тяжелой цепи) и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. В одном примере последовательности тяжелой цепи фрагмента Fab "заканчиваются" цистеином CH1, образующим межцепочечную связь. В одном варианте осуществления фрагмент Fab, используемый для получения слитого белка настоящего изобретения, такого как A-X и/или В-Y, является одновалентным.

Фрагмент Fab', в соответствии с данным описанием, представляет собой фрагмент Fab, дополнительно содержащий весь шарнирный участок, или его часть. В одном варианте осуществления фрагмент Fabʹ, используемый для получения слитого белка настоящего изобретения, такого как A-X и/или В-Y, является одновалентным.

Используемый здесь термин "одноцепочечный Fv", или сокращенно "ScFv", относится к фрагменту антитела, который содержит домены антитела VH и VL, соединенные (например, посредством пептидного линкера) с образованием одной полипептидной цепи. В данном формате константные участки тяжелой и легкой цепи отсутствуют. Одноцепочечные Fv, в соответствии с данным описанием, включают в себя варианты, стабилизированные дисульфидными связями, и в данном случае помимо пептидного линкера между вариабельными участками присутствует дисульфидная связь.

Дисульфид-стабилизированные ScFv позволяют устранить склонность некоторых вариабельных участков к динамическому "дыханию", которое связано с разделением и воссоединением вариабельных участков.

Термин "однодоменное антитело", в соответствии с данным описанием, относится к фрагменту антитела, состоящему из одного мономерного вариабельного домена антитела. Примеры однодоменных антител включают в себя VH, или VL, или VHH.

В одном варианте осуществления связывающий фрагмент антитела и/или биспецифический комплекс антитела не содержат Fc-участок. Используемый здесь термин "не содержат Fc-участок" подразумевает отсутствие низших константных доменов, таких как CH2, CH3 и CH4. Однако могут присутствовать такие константные домены, как CH1, CKappa/CLambda.

В одном варианте осуществления тяжелая цепь антитела содержит домен CH1, а легкая цепь антитела содержит домен CL, каппа или лямбда.

В одном варианте осуществления тяжелая цепь антитела содержит домен CH1, домен СН2 и домен СН3, а легкая цепь антитела содержит домен CL, каппа или лямбда.

В одном варианте осуществления первый белок, A, и/или второй белк, B, входящий в состав биспецифического белкового комплекса, представляет собой антитело или фрагмент антитела. Такой биспецифический белковый комплекс также можно называть биспецифический комплекс антител.

Используемый здесь термин "биспецифический комплекс антител" относится к биспецифическому белковому комплексу, содержащему, по меньшей мере, два связывающих участка антитела, где входящие в состав комплекса антитела, фрагменты или те и другие, образуют комплекс посредством гетеродимерного связующего фрагмента.

Биспецифический комплекс антител обычно представляет собой молекулу, содержащую, по меньшей мере, два антиген-связывающих участка, где связывающие участки обладают разной специфичностью.

В одном варианте осуществления два указанных белка (например, антитела, фрагменты или сочетание антитела и фрагмента) направлены на один антиген, например, они связываются с двумя разными эпитопами на одном антигене-мишени, что называют здесь бипаратопной биспецифичностью.

В другом варианте осуществления два указанных белка (например, антитела, фрагменты или сочетание антитела и фрагмента), могут обладать специфичностью к разным антигенам, например, они могут связываться с двумя разными антигенами-мишенями.

В следующем варианте осуществления два белка являются идентичными, т.е. связываются с одним эпитопом на одном антигене-мишени и, следовательно, комплекс является моноспецифичным.

В одном варианте осуществления каждое антитело, или каждый фрагмент, используемые для получения биспецифического комплекса антител настоящего изобретения, содержит один связывающий участок, т.е. каждый связывающий участок является одновалентным для каждого антигена-мишени.

Полноразмерное антитело или фрагмент антитела, используемые для получения слитых белков (А-Х или В-Y), могут быть моноспецифичными, одновалентными, поливалентными или биспецифическими.

Предпочтительно использовать два биспецифических антитела или фрагмента антител, что позволяет получить биспецифический комплекс антител настоящего изобретения с потенциальной специфичностью до 4-х разных антигенов (т.е. комплекс может быть тетраспецифическим). Это позволяет исследовать эффекты типа авидности.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, используемые для получения первого слитого белка (A-X), представляют собой моноспецифическое антитело или моноспецифический фрагмент антитела, такой как одновалентный Fab, Fab', ScFv, Fv, VHH и т.п.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, используемые для получения второго слитого белка (B-Y), представляют собой моноспецифическое антитело или моноспецифический фрагмент антитела, такой как одновалентный Fab, Fab', ScFv и т.п.

Используемый здесь термин "моноспецифичный" относится к способности связывать только один антиген-мишень.

Используемый здесь термин "моновалентный" относится к антителу или фрагменту антитела, содержащему один связывающий участок и, следовательно, способному связываться только с одним антигеном-мишенью.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, используемые для получения первого слитого белка (А-Х), являются поливалентными, то есть содержат два или более связывающих доменов.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, используемые для получения второго слитого белка (B-Y), являются поливалентными, то есть содержат два или более связывающих доменов.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, используемые для получения первого слитого белка (А-Х), являются одновалентными, и антитело или фрагмент антитела, используемые для получения второго слитого белка (В-Х), являются одновалентными.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, используемые для получения первого слитого белка (А-Х), являются одновалентными, а антитело или фрагмент антитела, используемые для получения второго слитого белка (B-Y), являются поливалентными.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, используемые для получения первого слитого белка (А-Х), являются поливалентными, а антитело или фрагмент антитела, используемые для получения второго слитого белка (В-Y), являются одновалентными.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, используемые для получения первого слитого белка (А-Х), являются поливалентными, и антитело или фрагмент антитела, используемые для получения второго слитого белка (B-Y), являются поливалентными.

В одном варианте осуществления А-Х или В-Y не является слитым белком, содержащим два scFv, один из которых специфичен к антигену CD33, другой специфичен к антигену CD3, или альтернативно, они не образуют формат биспецифического комплекса, специфичного к двум указанным антигенам.

В одном варианте осуществления А-Х или В-Y не является слитым белком, содержащим ScFv (или, альтернативно, антитело другого формата), специфичный к CD3, связанному с пептидом E5B9.

Используемый здесь термин "связывающий домен или участок" относится к части антитела, которая вступает в контакт с эпитопом/антигеном и принимает участие в формировании связывающего взаимодействия. В одном варианте осуществления связывающий домен содержит, по меньшей мере, один вариабельный домен, или его производное, например, пару вариабельных доменов или их производных, такую как родственная пара вариабельных доменов или их производных.

В одном варианте осуществления связывающий домен содержит 3 CDR, в частности, если связывающий домен представляет собой доменное антитело, такое как VH, VL или VHH. В одном варианте осуществления связывающий домен содержит два вариабельных домена, 6 CDR и каркасный участок, причем указанные элементы вместе вносят вклад в специфичность связывающего взаимодействия антитела или связывающего фрагмента с антигеном/эпитопом.

Используемый здесь термин "родственный пара" относится к паре тяжелой и легкой цепей, выделенных из организма хозяина в виде предварительно образованной пары. Это определение не включает в себя вариабельные домены, выделенные из библиотеки, в которой исходные пары, полученные из организма хозяина, не сохраняются. Родственные пары могут быть предпочтительными, поскольку они зачастую являются аффинно зрелыми в организме хозяина и, следовательно, могут иметь высокое сродство к антигену, к которому они специфичны.

Используемый здесь термин "производное природного домена" относится к соединению, в котором одна, две, три, четыре или пять аминокислот природной последовательности заменены или удалены, например, с целью оптимизации свойств домена, такой как устранение нежелательных свойств, но с сохранением характерного признака (признаков) домена. Примеры модификаций включают в себя удаление участков гликозилирования, присоединения якорей GPI, или остатков лизина, контактирующих с растворителем. Такие модификации можно осуществить путем консервативной замены соответствующих аминокислотных остатков.

В одном варианте осуществления биспецифические комплексы антител настоящего изобретения или входящие в их состав антитела/фрагменты подвергают процессингу с целью улучшения сродства к антигену-мишени или антигенам-мишеням. Такие варианты можно получить с помощью ряда методов аффинного созревания, включающих в себя введение мутаций в CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), перетасовку цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), использование мутаторных штаммов E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), перетасовку ДНК (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), метод фагового дисплея (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) и ПЦР с имитацией полового размножения (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (выше) описывают указанные методы созревания аффинности.

В одном варианте осуществления первое антитело или первый фрагмент антитела (А) является специфичным к первому антигену, а второе антитело или второй фрагмент антитела (B) специфичен ко второму антигену, где первый и второй антигены являются разными. Предпочтительно биспецифический комплекс антител может быть специфичным к двум разным антигенам. Это делает возможным связывание комплекса антител с двумя разными антигенами, каждый из которых расположен на другом объекте, в результате чего два объекта располагаются в непосредственной физической близости друг к другу.

Альтернативно первое антитело или первый фрагмент антитела (А) может быть специфичным к первому эпитопу, а второе антитело или второй фрагмент антитела (B) может быть специфичным ко второму эпитопу, где первый и второй эпитопы находятся на одном антигене. Это может значительно повысить авидность биспецифического комплекса антител к антигену вследствие наличия множественных взаимодействий между антигеном и биспецифическим комплексом антител.

В одном варианте осуществления первое антитело (А), или второе антитело (В), или и первое и второе антитела, входящие в состав биспецифического комплекса антител настоящего изобретения, могут представлять собой IgG, необязательно содержащий неактивный или активный участок Fc.

В одном варианте осуществления первый (A) или второй (B) фрагмент антитела выбран из группы, включающей в себя: антиген-связывающий фрагмент (Fab), Fab', одноцепочечный вариабельный фрагмент (ScFv) и однодоменное антитело (sdAb), такое как VHH.

В одном варианте осуществления первое антитело/первый фрагмент (А), второе антитело/второй фрагмент (B), или и первое и второе антитело/фрагмент биспецифического комплекса антител настоящего изобретения может представлять собой Fab.

В одном варианте осуществления первое антитело/первый фрагмент (А), второе антитело/второй фрагмент (B), или и первое и второе антитело/фрагмент биспецифического комплекса антител настоящего изобретения может представлять собой Fab'.

В одном варианте осуществления первое антитело/первый фрагмент (А), второе антитело/второй фрагмент (B), или и первое и второе антитело/фрагмент биспецифического комплекса антител настоящего изобретения может представлять собой ScFv.

В одном варианте осуществления первое (A) или второе (B) антитело/фрагмент, или и первое, и второе антитело/фрагмент биспецифического комплекса антител настоящего изобретения может/могут представлять собой VHH.

Для удобства биспецифические белковые комплексы настоящего изобретения обозначают здесь здесь A-X:Y-B. Однако данное обозначение не предназначается для ограничения структуры слитых белков А-Х и В-Y, поскольку эксперименты, проведенные авторами изобретения, показывают, что партнеры по связыванию Х и Y можно поменять местами, например, с получением А-Y и B-X, без неблагоприятного влияния на способ. Таким образом, А и В, а также X и Y являются номинальными маркерами, используемыми для облегчения объяснения способа настоящего изобретения.

Используемый здесь термин "присоединенный" относится к присоединению или соединению, непосредственному, или опосредованному линкером, таким как пептидный линкер, примеры которого приведены ниже. Непосредственное присоединение осуществляют с помощью химических реакций гибридизации (например, путем образования пептидной связи) или конъюгации.

Используемый здесь термин "партнер по связыванию" относится к одному компоненту способной к связыванию пары.

В одном варианте осуществления партнеры по связыванию связываются с высоким сродством, составляющим 5 нМ или выше, например, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 пМ или выше.

Используемый здесь термин "способная к связыванию пара" относится к двум партнерам по связыванию, способным специфически связываться друг с другом. Примеры способной к связыванию пары включают в себя пептид и специфичное к нему антитело, или его связывающий фрагмент, или фермент и лиганд, или фермент и ингибитор этого фермента.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (Х) выбирают из группы, включающей в себя: полноразмерное антитело, Fab, Fab', Fv, dsFv, scFv и sdAb, где примеры sdAb включают в себя VH, или VL, или V_HH.

Если Х представляет собой антитело, или его связывающий фрагмент, то Y представляет собой белок или пептид, предпочтительно пептид.

В одном варианте осуществления второй партнер по связыванию (Y) выбирают из группы, включающей в себя: полноразмерное антитело, Fab, Fab', Fv, dsFv, scFv и sdAb, где примеры sdAb включают в себя VH, или VL, или V_HH.

Если Y представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, то Х представляет собой белок или пептид, предпочтительно пептид.

В одном варианте осуществления, если А представляет собой антитело или его фрагмент, первый партнер по связыванию (X) присоединяют к С-концу тяжелой или легкой цепи первого антитела или фрагмента антитела, например, первый партнер по связыванию (Х) присоединяют к С-концу тяжелой цепи первого антитела или фрагмента антитела (A).

В другом варианте осуществления, если В представляет собой антитело или его фрагмент, второй партнер по связыванию (Y) присоединяют к С-концу тяжелой или легкой цепи второго антитела или фрагмента антитела, например, второй партнер по связыванию (Y) присоединяют к С-концу тяжелой цепи второго антитела или фрагмента антитела (B).

В одном варианте осуществления Х присоединяют к С-концу тяжелой цепи антитела или его фрагмента (белка А) и Y присоединяют к С-концу тяжелой цепи антитела или его фрагмента (белка В).

В одном варианте осуществления Х присоединяют через линкер (такой как ASGGGG, SEQ ID NO: 71, или ASGGGGSG, SEQ ID NO: 72), или любой другой подходящий линкер, известный в данной области, или описанный здесь ниже, к С-концу тяжелой цепи антитела или его фрагмента (белка А), и Y присоединяют через линкер (например, ASGGGG, SEQ ID NO: 71, или ASGGGGSG, SEQ ID NO: 72) к С-концу тяжелой цепи антитела или его фрагмента (белка В).

Примеры подходящей способной к связыванию пары (X или Y), могут включать в себя GCN4 (SEQ ID NO: 1, или последовательность, не содержащая маркер HIS, аминокислоты 1-38 последовательности SEQ ID NO: 1), или его вариант, и 52SR4 (SEQ ID NO: 3, или последовательность, не содержащая маркер HIS, аминокислоты 1-243 последовательности SEQ ID NO: 3), или его вариант, который является специфичным к ScFv GCN4.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (обозначаемый Х) представляет собой GCN4 (например, описанный в SEQ ID NO: 1), или его фрагмент или вариант (например, не содержащий маркер HIS), а второй партнер по связыванию (обозначаемый Y) представляет собой scFv или VHH, специфичный к GCN4 (например, описанный в SEQ ID NO: 3), или его вариант.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (обозначаемый Х) представляет собой sFv или VHH, специфичный к GCN4 (например, описанному в SEQ ID NO: 3), или его вариант, а второй партнер по связыванию (обозначаемый Y) представляет собой GCN4 (например, описанный в SEQ ID NO: 1), или его фрагмент или вариант.

Варианты GCN4 содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1. Варианты GCN4 содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, или последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 2 в жестких условиях.

Подходящим scFv, специфичным к GCN4, является 52SR4 (SEQ ID NO: 3), или его вариант. Варианты 52SR4 содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80%, или на 85%, или на 90%, или на 95%, или на 98%, или на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. Варианты 52SR4 также содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80%, или на 85%, или на 90%, или на 95%, или на 98%, или на 99% идентичную последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, или последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 4 в жестких условиях.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что одноцепочечное антитело 52SR4 и пептид GCN4 представляют собой способную к связыванию пару, которую можно использовать для получения биспецифических белковых комплексов настоящего изобретения.

Альтернативно в качестве X и Y можно использовать любое подходящее антитело/фрагмент и его антиген (например, пептид). Предпочтительно такая пара Х и Y обеспечивает содержание гетеродимера более 75% после объединения A-X и Y-B в молярном соотношении 1:1.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (X) и второй партнер по связыванию (Y) представляют собой белки.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (Х) представляет собой фермент, или его активный фрагмент, а второй партнер по связыванию (Y) представляет собой лиганд, или наоборот.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (Х) представляет собой фермент, или его активный фрагмент, а второй партнер по связыванию (Y) представляет собой ингибитор этого фермента, или наоборот.

Термин "активный фрагмент", в соответствии с данным описанием, относится к аминокислотному фрагменту полноразмерной аминокислотной последовательности соединения, который по существу сохраняет биологическую активность соединения, или имеет соответствующую биологическую активность, составляющую, например, более 50%, например, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% от активности соединения.

В другом варианте осуществления первый партнер по связыванию Х представляет собой глутатион (GSH), а второй партнер по связыванию Y представляет собой глутатион-S-трансферазу (GST), или наоборот.

В другом варианте осуществления Х представляет собой Fos, а Y представляет собой Jun, или наоборот.

В другом варианте осуществления Х представляет собой His, а Y представляет собой антитело против His, или наоборот.

В другом варианте осуществления способная к связыванию пара включает в себя в качестве Х пептид, связывающий кальмодулин, а в качестве Y кальмодулин, или наоборот.

В другом варианте осуществления Х представляет собой мальтоза-связывающий белок, а Y представляет собой антитело против мальтоза-связывающего белка или его фрагмент, или наоборот.

В качестве партнеров по связыванию также можно использовать и другие сочетания фермент-лиганд. Кроме того, можно использовать аффинные маркеры, традиционно прменяющиеся в данной области для очистки белков, поскольку они способны связываться со своими партнерами по связыванию с высоким сродством.

Термин "идентичность", в соответствии с данным описанием, указывает на то, что в аналогичных положениях выровненных последовательностей находятся одинаковые аминокислотные остатки. Термин "подобие", в соответствии с данным описанием, указывает на то, что в аналогичных положениях выровненных последовательностей находятся аминокислотные остатки подобного типа. Например, вместо лейцина может присутствовать изолейцин или валин. Другие аминокислоты, часто используемые для замены друг на друга, включают в себя, без ограничения:

- фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи);

- лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты, содержащие основные боковые цепи);

- аспартат и глутамат (аминокислоты, содержащие кислотные боковые цепи);

- аспарагин и глутамин (аминокислоты, содержащие амидные боковые цепи); и

- цистеин и метионин (аминокислоты с серосодержащими боковыми цепями).

Степени идентичности и подобия можно легко вычислить (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST™, программное обеспечение NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).

В одном варианте осуществления первый или второй партнер по связыванию (Х или Y) представляет собой белок или пептид.

В одном варианте осуществления первый и второй слитые белки содержат один или несколько пептидных линкеров. Линкеры могут находиться в разных положениях слитых белков. Например, линкер можно ввести между партнером по связыванию и присоединенным к нему белком.

В одном варианте осуществления линкер представляет собой пептидный линкер.

Термин "пептидный линкер" в данном описании относится к пептиду, содержащему аминокислотную последовательность. Специалистам в данной области известен целый ряд подходящих пептидных линкеров.

В одном варианте осуществления партнеры по связыванию, участвующие в образовании биспецифических белковых комплексов, соединяются с соответствующими белками посредством пептидных линкеров.

В одном варианте осуществления слитый белок представляет собой трансляционный гибрид, то есть слитый белок, экспрессированный в клетке-хозяине, содержащей генетическую конструкцию, обеспечивающую экспрессию слитого белка.

В одном варианте осуществления изобретения слитый белок получают путем присоединения тяжелой цепи А к Х, и/или тяжелой цепи В к Y, необязательно через пептидный линкер.

В одном варианте осуществления длина пептидного линкера составляет 50 аминокислот или менее, например, 20 аминокислот или менее.

Как правило, предпочтительно экспрессировать слитый белок с помощью рекомбинантных методов, в которых прямая пептидная связь или пептидный линкер формируются клеткой-хозяином.

В одном варианте осуществления линкер имеет последовательность, выбранную из последовательностей 5-72 или PPP.

Таблица 1. Шарнирные линкерные последовательности

SEQ ID NO:	ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
5	DKTHTCAA
6	DKTHTCPPCPA
7	DKTHTCPPCPATCPPCPA
8	DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
9	DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
10	DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
11	DKTHTCCVECPPCPA
12	DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
13	DKTHTCPSCPA

Таблица 2. Гибкие линкерные последовательности

SEQ ID NO:	ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
14	SGGGGSE
15	DKTHTS
16	(S)GGGGS
17	(S)GGGGSGGGGS
18	(S)GGGGSGGGGSGGGGS
19	(S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
20	(S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
21	AAAGSG-GASAS
22	AAAGSG-XGGGS-GASAS
23	AAAGSG-XGGGSXGGGS -GASAS
24	AAAGSG- XGGGSXGGGSXGGGS -GASAS
25	AAAGSG- XGGGSXGGGSXGGGSXGGGS-GASAS
26	AAAGSG-XS-GASAS
27	PGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHY
28	ATTTGSSPGPT
29	ATTTGS
30	GS
31	EPSGPISTINSPPSKESHKSP
32	GTVAAPSVFIFPPSD
33	GGGGIAPSMVGGGGS
34	GGGGKVEGAGGGGGS
35	GGGGSMKSHDGGGGS
36	GGGGNLITIVGGGGS
37	GGGGVVPSLPGGGGS
38	GGEKSIPGGGGS
39	RPLSYRPPFPFGFPSVRP
40	YPRSIYIRRRHPSPSLTT
41	TPSHLSHILPSFGLPTFN
42	RPVSPFTFPRLSNSWLPA
43	SPAAHFPRSIPRPGPIRT
44	APGPSAPSHRSLPSRAFG
45	PRNSIHFLHPLLVAPLGA
46	MPSLSGVLQVRYLSPPDL
47	SPQYPSPLTLTLPPHPSL
48	NPSLNPPSYLHRAPSRIS
49	LPWRTSLLPSLPLRRRP
50	PPLFAKGPVGLLSRSFPP
51	VPPAPVVSLRSAHARPPY
52	LRPTPPRVRSYTCCPTP-
53	PNVAHVLPLLTVPWDNLR
54	CNPLLPLCARSPAVRTFP

(S) является не обязательным в последовательностях 17-20.

Примеры жестких линкеров включают в себя пептидные последовательности GAPAPAAPAPA (SEQ ID NO: 69), РРРР (SEQ ID NO: 70) и PPP.

Другие линкеры показаны в таблице 3:

SEQ ID NO:	ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
55	DLCLRDWGCLW
56	DICLPRWGCLW
57	MEDICLPRWGCLWGD
58	QRLMEDICLPRWGCLWEDDE
59	QGLIGDICLPRWGCLWGRSV
60	QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK
61	EDICLPRWGCLWEDD
62	RLMEDICLPRWGCLWEDD
63	MEDICLPRWGCLWEDD
64	MEDICLPRWGCLWED
65	RLMEDICLARWGCLWEDD
66	EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG
67	RAPESFVCYWETICFERSEQ
68	EMCYFPGICWM

В одном аспекте изобретение предлагает способ получения биспецифического белкового комплекса настоящего изобретения, включающий в себя следующие стадии:

(a) получение первого слитого белка (А-Х), содержащего первый белок (А), присоединенный к первому партнеру по связыванию (Х) связывающейся пары;

(b) получение второго слитого белка (B-Y), содержащего второй белок (В), присоединенный ко второму партнеру по связыванию (Y) связывающейся пары; и

(c) смешивание первого (A-X) и второго (B-Y) слитых белков, полученных на стадиях a) and b).

Обычно смешивание A-X и B-Y на стадии (с) проводят в молярном соотношении 1:1.

В одном варианте осуществления каждый из слитых белков, входящих в состав комплексов настоящего изобретения, получают путем экспрессии в клетке-хозяине или в клетках-хозяевах в ходе эксперимента по проведению экспрессии.

В одном аспекте изобретение предлагает способ получения биспецифического белкового комплекса настоящего изобретения, включающий в себя следующие стадии:

(a) экспрессия первого слитого белка (А-Х), содержащего первый белок (А), присоединенный к первому партнеру по связыванию (Х) связывающейся пары;

(b) экспрессия второго слитого белка (B-Y), содержащего второй белок (В), присоединенный ко второму партнеру по связыванию (Y) связывающейся пары;

где слитые белки (A-X) и (B-Y) экспрессируются в одной клетке-хозяине, или в разных клетках-хозяевах.

Термин "разные клетки-хозяева" в данном описании относится к отдельным клеткам, включающим в себя клетки одного типа (в том числе одного клона).

В одном варианте осуществления экспрессия представляет собой временную экспрессию. Использование временной экспрессии имеет большое преимущество в сочетании с возможностью получать биспецифические комплексы, не прибегая к очистке. Она позволяет быстро осуществлять получение биспецифических белковых комплексов, поскольку временная трансфекция значительно проще и требует меньше ресурсов, чем стабильная трансфекция.

В одном варианте осуществления экспрессия представляет собой стабильную экспрессию, т.е. ДНК, кодирующую представляющий интерес слитый белок, стабильно интегрируют в геном клетки-хозяина.

В одном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий А-Х, и полинуклеотид, кодирующий B-Y, в составе одной или разных полинуклеотидных последовательностей трансфицируют в клетку как часть функционального анализа, в котором белки экспрессируются в клетке и/или высвобождается из нее. В частности, полинуклеотиды временно трансфицируют в составе одной или разных плазмид.

Смешивание A-X и B-Y, как правило, осуществляют в условиях, обеспечивающих взаимодействие X и Y. В одном варианте осуществления слитые белки инкубируют в среде для культивирования клеток в условиях культивирования клеток, например, слитые белки инкубируют в течение 90 минут при 37°/5% CO₂.

В одном варианте осуществления слитые белки настоящего изобретения смешивают в водной среде, например, один слитый белок может быть связан с твердой поверхностью, такой как гранула или планшет, а другой слитый белок может быть введен с ним в контакт в водном растворе/водной суспензии. Использование твердой фазы позволяет легко отмывать избыток компонентов и реагентов. В одном варианте осуществления гибриды не присоединяют к твердой фазе, а просто смешивают в жидкости/растворе/среде. Так, в одном варианте осуществления А-Х и В-Y смешивают в виде свободных белков в водной среде.

Предпочтительно способ настоящего изобретения можно использовать для получения комплексов, образованных гетерогенными парами (т.е. первым слитым белком [A-X] и вторым слитым белком [B-Y]), с минимизацией взаимодействий между гомогенными парами (т.е. между двумя первыми слитыми белками [A-X] или двумя вторыми слитыми белками [B-Y]). Таким образом, способ настоящего изобретения позволяет получать большое число биспецифических белковых комплексов при минимальном содержании или отсутствии гомодимерных комплексов. Преимуществом конструкций и способа настоящего изобретения является то, что отношение A-X к B-Y контролируется свойствами A-X и B-Y и, в частности, можно использовать молярное соотношение 1:1. Данный элемент контролирования является существенным улучшением по сравнению с некоторыми способами предшествующего уровня техники.

В одном варианте осуществления способ настоящего изобретения включает в себя дополнительную стадию переноса пары вариабельных участков (в частности, двух пар вариабельных участков), идентифицированных как обладающие синергетической активностью, в альтернативный биспецифический формат, при необходимости с предварительной гуманизацией указанных вариабельных участков, который является альтернативным терапевтическим форматом, и/или форматом с более продолжительным периодом полужизни, подходящим для тестирования в анализах, проводимых в течение более длительного периода времени (например, в течение недели или дольше).

Поливалентные форматы включают в себя форматы, известные в данной области и описанные в настоящем документе, такие как DVD-Ig, FabFv, например, раскрытые в WO2009/040562 и WO2010/035012, диатела, триатела, тетратела и т.д.

Другие примеры би- и полиспецифичных форматов (в том числе терапевтических форматов) включают в себя диатела, триатела, тетратела, тандем scFv, тандем scFv-Fc, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, РаЬ-scFv, Fab'-scFv, diFab, diFab', одноцепочечное диатело, одноцепочечное диатело-Fc, scFv-Fc-scFv, одноцепочечное диатело-CH3, IgG-scFv, scFv-IgG, V-IgG, IgG-V, DVD-Ig и DuoBody.

Термин "диатело", в соответствии с данным описанием, относится к двум парам Fv: VH/VL и другой паре VH/VL, которые содержат два линкера между Fv, которые соединяют VH первого Fv с VL второго Fv и VL первого Fv с VH второго Fv.

Термин "триатело", в соответствии с данным описанием, относится к формату, аналогичному формату диатела, но содержащему три пары Fv и три линкера между Fv.

Термин "тетратело", в соответствии с данным описанием, относится к формату, аналогичному формату диатела, но содержащему четыре пары Fv и четыре линкера между Fv.

Термин "тандем scFv", в соответствии с данным описанием, относится к двум scFv (каждый из которых обычно содержит линкер), связанным друг с другом через один линкер таким образом, что между Fv существует один линкер.

Термин "тандем scFv-Fc", используемый в данном описании, относится к двум тандемными scFv, причем каждый из них присоединен, например, посредством шарнирного участка, к N-концу домена СН2 фрагмента -СН2СН3 константного домена.

Термин "FabFv", используемый в данном описании, относится к фрагменту Fab, содержащему вариабельный участок, присоединенный к C-концу каждого из нижеследующих участков: CH1 тяжелой цепи и CL легкой цепи. Данный формат может быть представлен в виде пегилированной версии.

Fab'Fv, в соответствии с данным описанием, является аналогичным FabFv, но вместо фрагмента Fab он содержит Fab'. Данный формат может быть представлен в виде пегилированной версии.

FabdsFv, в соответствии с данным описанием, представляет собой FabFv, в котором дисульфидные связи между Fv стабилизируют присоединенные к С-концу вариабельные участки. Данный формат может быть представлен в виде пегилированной версии.

Fab-scFv, в соответствии с данным описанием, представляет собой молекулу Fab, к которой по C-концу легкой или тяжелой цепи присоединен scFv.

Fab'-scFv, в соответствии с данным описанием, представляет собой молекулу Fab', к которой по C-концу легкой или тяжелой цепи присоединен scFv.

Термин DiFab, в соответствии с данным описанием, относится к двум молекулам Fab, соединенным по С-концам тяжелых цепей.

Термин DiFab', в соответствии с данным описанием, относится к двум молекулам Fab', соединенным посредством одной или нескольких дисульфидных связей в шарнирных участках.

В соответствии с данным описанием одноцепочечное диатело представляет собой диатело, содержащее линкер между фрагментами Fv так, что полученная молекула содержит три линкера и образует нормальный scFv, в котором концы VH и VL соединены с одним из вариабельных участков другой пары Fv.

Одноцепочечное диатело-Fc, в соответствии с данным описанием, представляет собой два одноцепочечнох диатела, каждое из котрых присоединяется, например, посредством шарнирного участка, к N-концу домена СН2 фрагмента -СН2СН3 константного домена.

scFv-Fc-scFv, в соответствии с данным описанием, содержит четыре scFv, один из которых присоединен к N-концу и к С-концу как тяжелой, так и легкой цепи фрагмента -СН2СН3.

Одноцепочечное диатело-СН3, в соответствии с данным описанием, содержит две молекулы одноцепочечного диатела, каждая из которых присоединена, например, посредством шарнирного участка, к домену СН3.

IgG-scFv, в соответствии с данным описанием, представляет собой полноразмерное антитело, содержащее scFv на C-конце каждой из тяжелых цепей или каждой из легких цепей.

scFv-IgG, в соответствии с данным описанием, представляет собой полноразмерное антитело, содержащее scFv на N-конце каждой из тяжелых цепей или каждой из легких цепей.

V-IgG, в соответствии с данным описанием, представляет собой полноразмерное антитело, содержащее вариабельный домен на N-конце каждой из тяжелых цепей или каждой из легких цепей.

IgG-V, в соответствии с данным описанием, представляет собой полноразмерное антитело, содержащее вариабельный домен на C-конце каждой из тяжелых цепей или каждой из легких цепей.

DVD-Ig (также известный как IgG, содержащий двойной V-домен) представляет собой полноразмерное антитело, содержащее 4 дополнительных вариабельных домена, по одному на N-конце каждой тяжелой цепи и каждой легкой цепи.

Duobody или "обмен Fab-плечей", в соответствии с данным описанием, представляет собой биспецифический формат антитела IgG, который получают путем введения рекомбинантными методами соответствующих и комплементарных аминокислотных замен в константные домены (как правило, СН3) двух разных моноклональных антител, что приводит, после смешивания указанных антител, к образованию гетеродимеров. В результате замены остатков рекомбинантными методами пара тяжелая/легкая цепь первого антитела будет предпочтитльно гибридизоваться с парой тяжелая:легкая цепь второго антитела.

В случае присутствия домены константного участка биспецифического комплекса антител или молекулы антитела настоящего изобретения, можно выбрать с учетом предполагаемой функции комплекса или молекулы антитела, такой как, например, эффекторная функция, которая может потребоваться. Например, домены константного участка могут представлять собой домены человеческих IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. В частности, если молекула антитела предназначена для терапевтического применения и необходимы эффекторные функции антитела, можно использовать домены константных участков человеческих IgG, особенно изотипов IgG1 и IgG3. Альтернативно, если молекула антитела предназначена для терапевтического применения, а эффекторные функции антитела не требуются, можно использовать изотипы IgG2 и IgG4. Следует принять во внимание, что также можно использовать варианты последовательностей указанных доменов константного участка. Например, можно использовать молекулы IgG4, в которых серин в положении 241 заменен на пролин, как описано в Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108. Соответственно, в одном варианте осуществления, если антитело относится к изотипу IgG4, оно может содержать мутацию S241P.

Специалистам в данной области также должно быть известно, что антитела могут подвергаться разным посттрансляционным модификациям. Тип и степень этих изменений часто зависят от линии клетки-хозяина, используемой для экспрессии антитела, а также от условий культивирования. Такие модификации могут включать в себя изменение гликозилирования, окисление метионина, образование дикетопиперазина, изомеризацию аспартата и дезамидирование аспарагина. Часто встречающейся модификацией является утрата карбокси-концевого основного остатка (например, лизина или аргинина) в результате действия карбоксипептидазы (как описано в Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Соответственно, С-концевой лизин тяжелой цепи антитела может отсутствовать.

Настоящее изобретение также предлагает композицию, содержащую один или несколько биспецифических белковых комплексов, описанных выше, причем композиция преимущественно содержит гетеродимерные биспецифических комплексы настоящего изобретения, например, при минимальном содержании или отсутствии примесей гомодимерных комплексов.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 65%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% слитых белков в композиции находятся в виде биспецифического белкового комплекса.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере, 60% слитых белков в композиции находятся в виде биспецифического белкового комплекса.

В одном варианте осуществления полученные комплексы не требуют дополнительных стадий очистки, и, следовательно, композиции содержат неочищенные биспецифические комплексы.

В одном варианте осуществления полученные комплексы требуют одну стадию очистки, например, методом колоночной хроматографии.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя, по меньшей мере, одну стадию очистки, например, после экспрессии слитого белка настоящего изобретения и перед смешиванием слитых белков.

В одном аспекте настоящее изобретение предлагает слитый белок, гетеродимер-связанный биспецифический белковый комплекс, композицию, содержащую слитый белок или указанный биспецифический белковый комплекс, мультиплекс, массив, библиотеку, как определено в настоящем описании.

В одном варианте осуществления биспецифический белковый комплекс находится в растворе или в суспензии.

В одном варианте осуществления биспецифические белковые комплексы фиксируются на твердой поверхности носителя.

В одном варианте осуществления мультиплекс находится в виде массива, например, в микропланшете, таком как 96- или 384-луночный планшет. Такие массивы можно легко использовать в анализах скрининга для идентификации биспецифических белковых комплексов с желательной активностью.

В другом варианте осуществления биспецифические белковые комплексы конъюгируют с гранулами.

Описанный выше слитый белок является компонентом биспецифического белкового комплекса настоящего изобретения. В одном из аспектов настоящее изобретение предлагает слитый белок, описанный в настоящем документе.

В следующем аспекте изобретение предлагает библиотеку, содержащую два или более слитых белков, определенных выше.

Термин "библиотека", используемый в данном описании, относится к двум или более биспецифическим комплексам антител настоящего изобретения, или нескольким слитыми белкам настоящего изобретения, которые можно объединить с получением, по меньшей мере, двух разных биспецифических комплексов антител настоящего изобретения. Как указано в данном описании, термин "библиотека" используется в самом широком смысле и может также включать в себя подбиблиотеки.

Предпочтительно библиотека может содержать ряд разных слитых белков, в состав которых входит либо первый партнер по связыванию (X), либо второй партнер по связыванию (Y) конкретной способной к связыванию пары. В одном варианте осуществления часть библиотеки содержит белки/антитела/фрагменты, каждый из которых соединен с партнером по связыванию X, а остальная часть библиотеки содержит те же белки/антитела/фрагменты, каждый из которых соединен с партнером по связыванию Y. Это позволяет легко объединить два любых слитых белка с получением биспецифического белкового комплекса настоящего изобретения, поскольку один слитый белок содержит первый партнер по вязыванию связывающейся пары, а другой слитый белок содержит второй партнер по связыванию связывающейся пары.

В одном варианте осуществления биспецифические белковые комплексы настоящего изобретения пригодны для терапевтического применения и разработки новых методов лечения заболеваний. Таким образом, в следующем аспекте изобретение предлагает описанный выше биспецифический белковый комплекс для применения в терапии. Биспецифические белковый комплекс можно использовать для лечения ряда заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания и рак.

С дугой стороны, можно сконструировать биспецифические белковые комплексы настоящего изобретения, которые содержат первое антитело или первый фрагмент антитела, специфичные к Т-лимфоцитам, и второе антитело или второй фрагмент антитела, специфичные к конкретному раковому антигену. Такие биспецифические комплексы антител настоящего изобретения предпочтительно могут обладать более высокой цитотоксической активностью, чем обычные моноклональные антитела.

Биспецифические белковые комплексы настоящего изобретения также можно успешно использовать для ингибирования функции В-клеток, чтобы контролировать иммунные и аутоиммунные реакции при разных аутоиммунных заболеваниях.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, включающему в себя введение биспецифического белкового комплекса настоящего изобретения.

В одном аспекте изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую один или несколько биспецифических белковых комплексов настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления изобретение предлагает слитый белок, полученный, или который можно получить с помощью способа настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления изобретение предлагает биспецифический комплекс антител, полученный, или который можно получить с помощью способа настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления изобретение предлагает биспецифическую или мультиспецифическую молекулу антитела, содержащую сочетания вариабельных участков, идентифицированные с помощью способа настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления изобретение предлагает композицию, такую как фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок, биспецифический комплекс антител или биспецифическую/полиспецифическую молекулу антитела, полученную с помощью способа настоящего изобретения.

Композиция может содержать разные компоненты, включающие в себя фармацевтически приемлемые носители, наполнители и/или разбавители. Композиция может необязательно содержать другие молекулы, способные изменять характеристики популяции антител настоящего изобретения, например, путем уменьшения, стабилизации, замедления, модуляции и/или активации функции антител. Композиция может находиться в виде твердой или жидкой формы, и может, в числе прочего, находиться в виде порошка, таблетки, раствора или аэрозоля.

Настоящее изобретение также предлагает фармацевтическую или диагностическую композицию, содержащую биспецифический белковый комплекс настоящего изобретения в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями, разбавителями или носителями. Соответственно, изобретение предлагает применение биспецифического белкового комплекса настоящего изобретения в способе лечении и для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения патологического состояния или расстройства.

Патологическое состояние или расстройство, например, может быть выбрано из группы, включающей в себя инфекции (вирусные, бактериальные, грибковые и паразитарные), эндотоксический шок, связанный с инфекцией, артрит, такой как ревматоидный артрит, астму, такую как тяжелая астма, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), воспалительную болезнь органов таза, болезнь Альцгеймера, воспалительную болезнь кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, болезнь Пейрони, глютеновую болезнь, заболевания желчного пузыря, пилонидальную болезнь, перитонит, псориаз, васкулит, хирургические спайки, инсульт, диабет типа I, болезнь Лайма, менингоэнцефалит, аутоиммунный увеит, опосредованные иммунной системой воспалительные заболевания центральной и периферической нервной системы, такие как рассеянный склероз, волчанка (такая как системная красная волчанка) и синдром Гийена-Барра, атопический дерматит, аутоиммунный гепатит, фиброзирующий альвеолит, болезнь Грейвса, IgA нефропатия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, болезнь Меньера, пузырчатка, первичный билиарный цирроз, саркоидоз, склеродермия, гранулематоз Вегенера, другие аутоиммунные заболевания, панкреатит, травма (операция), реакция трансплантат против хозяина, отторжение трансплантата, заболевание сердца, включающее в себя ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероз, внутрисосудистое свертывание, резорбцию кости, остеопороз, остеоартрит, периодонтит, гипохлоргидрию и рак, такой как рак молочной железы, рак легкого, рак желудка, рак яичников, печеночно-клеточный рак, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак пищевода, рак головы и шеи и рак почки, включающий в себя почечно-клеточную карциному, рак предстательной железы, рак печени, меланому, саркому, миелому, нейробластому, плацентарную хориокарциному, рак шейки матки, рак щитовидной железы, а также их метастатические формы.

Настоящее изобретение также предлагает фармацевтическую композицию, содержащую биспецифический белковый комплекс настоящего изобретения в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями, разбавителями или носителями. Соответственно, изобретение предлагает применение биспецифического белкового комплекса настоящего изобретения для применения в способе лечения и в производстве лекарственного средства.

Композицию обычно поставляют как часть стерильной фармацевтической композиции, которая, как правило, содержит фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может дополнительно содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.

Настоящее изобретение также относится к способу получения фармацевтической или диагностической композиции, включающему в себя добавление и смешивание молекулы антитела или биспецифического комплекса антитела настоящего изобретения с одним или несколькими из фармацевтически приемлемого наполнителя, разбавителя или носителя.

Термин "фармацевтически приемлемый наполнитель" в данном описании относится к носителю, раствору или вспомогательному средству, используемому для получения фармацевтически приемлемой композиции с целью улучшения желательных характеристик композиций настоящего изобретения. Наполнители хорошо известны в данной области и включают в себя буферы (такие как цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер и бикарбонатный буфер), аминокислоты, мочевину, спирты, аскорбиновую кислоту, фосфолипиды, белки (например, сывороточный альбумин), ЭДТА, хлорид натрия, липосомы, маннит, сорбит и глицерин. Растворы или суспензии могут быть заключены в липосомы или биоразлагаемые микросферы. Композицию, как правило, получают в виде практически стерильной формы, используя стерильные способы промышленного получения.

Указанный способ может включать в себя получение и стерилизацию путем фильтрации забуференного растворителя, используемого для получения композиции, асептическое суспендирование антитела в стерильном забуферном растворителе и распределение композиции в стерильные сосуды с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области техники.

Фармацевтически приемлемый носитель не должен сам по себе индуцировать продукцию антител, вредных для индивидуума, получающего композицию, и не должен быть токсичным. Подходящие носители могут представлять собой большие, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полипептиды, липосомы, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.

Можно использовать фармацевтически приемлемые соли, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты.

Фармацевтически приемлемые носители, используемые для получения терапевтических композиций, могут также содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Применение таких носителей позволяет получать фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензий, для приема внутрь.

Биспецифические белковые комплексы настоящего изобретения могут быть доставлять распределенными в растворителе, например, в виде раствора или суспензии. Их можно суспендировать в физиологически приемлемом растворе, таком как физиологический раствор, фармакологически приемлемый растворитель или буферный раствор. Известные в данной области буферные растворы могут содержать от 0,05 мг до 0,15 мг эдетата динатрия, от 8,0 мг до 9,0 мг NaCl, от 0,15 мг до 0,25 мг полисорбата, от 0,25 мг до 0,30 мг безводной лимонной кислоты и от 0,45 мг до 0,55 мг цитрата натрия на 1 мл воды, с достижением рН приблизительно от 4,0 до 5,0. Как указано выше, для получения суспензии можно использовать, например, лиофилизированное антитело.

Подробное описание фармацевтически приемлемых носителей можно найти в Remington's Фармацевтические Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

Биспецифический комплекс антител (или биспецифическая/полиспецифическая молекула антитела настоящего изобретения) может быть единственным активным ингредиентом в фармацевтической или диагностической композиции, или он может входить в состав композиции в сочетании с другими активными ингредиентами, включающими в себя другие антитела, такие как антитело против TNF, антитело против IL-1β, антитело против Т-клеток, антитело против IFNγ или антитело против LPS, или отличные от антител соединения, такие как ксантины. Другие подходящие активные ингредиенты включают в себя антитела, способные повышать переносимость композиции, такие как антитело против CD3 или антитело против CD4.

В следующем варианте осуществления антитело, фрагмент или композицию настоящего изобретения используют в сочетании с другим фармацевтически активным средством, включающим в себя кортикостероиды (такие как флутиказона пропионат) и/или агонисты бета-2 (такие как сальбутамол, сальметерол или формотерол), или ингибиторы роста и пролиферации клеток (такие как рапамицин, циклофосфамид, метотрексат), или, альтернативно, ингибиторы CD28 и/или CD40. В одном варианте осуществления ингибитор представляет собой низкомолекулярное соединение. В другом варианте осуществления ингибитор представляет собой антитело, специфичное к мишени.

Фармацевтические композиции соответственно содержат терапевтически эффективное количество биспецифического комплекса антител настоящего изобретения (или биспецифической/полиспецифической молекулы антитела настоящего изобретения).

Термин "терапевтически эффективное количество" в данном описании относится к количеству терапевтического средства, необходимому для лечения, улучшения или предотвращения целевого заболевания или состояния, или для достижения детектируемого терапевтического или профилактического эффекта. Первоначально терапевтически эффективное количество любого антитела можно определить с помощью анализов, проводимых либо на клеточных культурах, либо на животных моделях, таких как модели, полученные с использованием грызунов, кроликов, собак, свиней или приматов. Животную модель также можно использовать для определения подходящего диапазона концентраций и способа введения. Такую информацию впоследствии можно использовать для определения подходящих для людей доз и способов введения.

Точное терапевтически эффективное количество для человека зависит от тяжести болезненного состояния, общего состояния здоровья, возраста, массы и пола индивидуума, его диеты, времени и частоты введения, сочетания (сочетаний) лекарственных средств, чувствительности, а также от толерантности к терапии/ответа на терапию. Указанное количество можно определить с помощью рутинных экспериментов, относящихся к сфере компетенции клинициста. Как правило, терапевтически эффективное количество составляет от 0,01 мг/кг до 50 мг/кг, например, от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг. Альтернативно оно может составлять от 1 до 500 мг в день, например, от 10 до 100, 200, 300 или 400 мг в день. Фармацевтические композиции удобно представлять в виде стандартных лекарственных форм, содержащих заранее определенное количество активного средства настоящего изобретения.

Композиции можно вводить пациенту сами по себе или в сочетании (например, путем одновременного, последовательного или раздельного введения) с другими средствами, лекарствами или гормонами.

Доза, в которой вводят молекулу антитела настоящего изобретения, зависит от природы состояния, подлежащего лечению, степени присутствующего воспаления, а также от того, используется ли молекула антитела профилактически или для лечения существующего состояния.

Частота введения дозы зависит от периода полужизни молекулы антитела и продолжительности ее эффекта. Если молекула антитела имеет короткий период полужизни (например, от 2 до 10 часов) может потребоваться прием одной или нескольких доз в день. Альтернативно, если молекула антитела имеет большой период полужизни (например, от 2 до 15 дней), может потребоваться введение только одной дозы один раз в день, один раз в неделю или даже один раз в 1 или 2 месяца.

В настоящем описании рН конечной композиции не равен значению изоэлектрической точки антитела или его фрагмента, например, может быть целесообразным использовать значение рН композиции 7, если pI составляет 8-9 или выше. Не желая быть связанными с теорией, авторы полагают, что в конечном счете это может привести к повышению стабильности конечной композиции, например, вследствие того, что антитело или его фрагмент остается в растворе.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно вводить с помощью любого числа способов, включающих в себя, без ограничения, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, интратекальное, внутрижелудочковое, трансдермальное, чрескожное (например, см. WO98/20734), подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, энтеральное, местное, сублингвальное, интравагинальное или ректальное введение. Для введения фармацевтических композиций настоящего изобретения также можно использовать безыгольные шприцы.

Непосредственную доставку композиций обычно осуществляют путем подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной инъекции, или путем инъекции в интерстициальное пространство ткани. Композиции также можно вводить в определенную представляющую интерес ткань. Введение дозы можно осуществлять однократно или многократно.

Если продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может находиться в виде суспензии, раствора или эмульсии в масляной или водной среде, и может содержать вспомогательные средства, такие как суспендирующие, консервирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно биспецифический белковый комплекс (или биспецифическая/полиспецифическая молекула антитела настоящего изобретения) может находиться в виде сухой формы, предназначенной для разведения перед применением соответствующей стерильной жидкостью. Если композиция предназначена для введения через желудочно-кишечный тракт, она должна содержать средства, которые защищают антитело от деградации, но которые высвобождают биспецифический белковый комплекс, как только он абсорбируется из желудочно-кишечного тракта.

Композиция настоящего изобретения может находиться в виде распыляемой формы, например, в виде емкостей однократной дозы (например, запечатанных пластиковых контейнеров или флаконов), упакованных в оболочку из фольги. Каждый флакон содержит однократную дозу в объеме, например, 2 мл забуференного растворителя/раствора.

Термин "вариант" в данном описании относится к пептиду или белку, полученному в результате, по меньшей мере, одного изменения в аминокислотной последовательности или в нуклеотидной последовательности соответствующего пептида или белка дикого типа. Вариант может быть, по меньшей мере, на 80%, или на 85%, или на 90%, или на 95%, или на 98%, или на 99% идентичным соответствующему пептиду или белку дикого типа. Однако идентичность варианта может составлять менее 80%, при условии, что вариант обладает практически такой же функцией, что и соответствующий пептид или белок дикого типа.

Антигены включают в себя рецепторы клеточной поверхности, такие как Т-клеточные или В-клеточные сигнальные рецепторы, костимуляторные молекулы, ингибиторы контрольных точек, рецепторы естественных клеток-киллеров, иммуноглобулиновые рецепторы, рецепторы семейства TNFR, рецепторы семейства В7, молекулы адгезии, интегрины, рецепторы цитокинов/хемокинов, раковые антигены, рецепторы, распознающие патогены, рецепторы комплемента, рецепторы гормонов или растворимые молекулы, такие как цитокины, хемокины, лейкотриены, факторы роста, гормоны, ферменты или ионные каналы, а также их эпитопы, фрагменты и формы, полученные в результате посттрансляционной модификации.

В одном варианте осуществления биспецифический белковый комплекс обладает специфичностью к одному или двум рецепторам клеточной поверхности.

В одном варианте осуществления биспецифический белковый комплекс обладает специфичностью к одному или двум цитокинам или хемокинам.

Антитела или фрагменты против пары мишеней, идентифицированные с помощью способа настоящего изобретения, можно включить в любой формат, подходящий для применения в виде лабораторного реагента, аналитического реагента или терапевтического средства.

Таким образом, в одном аспекте изобретение охватывает применение антител, их фрагментов или сочетаний, в виде пар в любом из описанных выше форматов.

Изобретение также охватывает композиции, такие как фармацевтические композиции, содержащие указанные новые форматы, обладающие специфичностью к конкретным антигенам.

В другом аспекте изобретение включает в себя применение форматов и композиций в способе лечения.

В одном варианте осуществления биспецифический белковый комплекс настоящего изобретения можно использовать для функционального изменения активности представляющего интерес антигена или представляющих интерес антигенов. Например, биспецифический белковый комплекс может непосредственно или косвенно нейтрализовать активность, препятствовать или способствовать активности указанного антигена или указанных антигенов.

Настоящее изобретение также предлагает набор, например, содержащий:

a) один или несколько слитых белков (A-X), состоящих из первого антитела или фрагмента антитела (A), присоединенного к первому партнеру по связыванию (X) связывающейся пары; и

b) один или несколько слитых белков (B-Y), состоящих из второго антитела или фрагмента антитела (B), присоединенного ко второму партнеру по связыванию (Y) связывающейся пары, где последний является специфичным к первому партнеру по связыванию;

например, где первый партнер по связыванию (X) представляет собой пептид или полипептид, а второй партнер по связыванию (Y) представляет собой антитело или фрагмент антитела, специфичный к пептиду или полипептиду;

где второй партнер по связыванию Y специфичен к первому партнеру по связыванию X, и второй партнер по связыванию, например, антитело или фрагмент антитела, специфичен к нему; причем специфическое взаимодействие (такое как связывающее взаимодействие) двух партнеров по связыванию приводит к образованию гетеродимерного связующего фрагмента, который физически соединяет два слитых белка, описанных в пунктах a) и b), с получением биспецифического белкового комплекса; и

где слитый белок (слитые белки) находится/находятся в виде закомплесованной или не закомплесованной формы.

Предпочтительно набор может содержать биспецифические белковые комплексы настоящего изобретения, или слитые белки, которые находятся в виде закомплесованной или не закомплесованной формы. В первом случае биспецифические белковые комплексы готовы к применению "сразу из упаковки", что обеспечивает удобство и простоту применения, тогда как в последнем случае биспецифические белковые комплексы можно собрать в соответствии с потребностями пользователя путем объединения разных слитых белков.

В другом варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению.

В следующем варианте осуществления набор также содержит один или несколько реагентов для проведения одного или нескольких функциональных анализов.

В одном варианте осуществления, описанные здесь слитые белки, биспецифические белковые комплексы, мультиплексы, матрицы, библиотеки, композиции и др. предназначены для применения в качестве лабораторных реагентов.

В другом аспекте изобретение предлагает нуклеотидную последовательность, например, ДНК-последовательность, кодирующую описанный здесь слитый белок и/или a биспецифический белковый комплекс.

В одном варианте осуществления изобретение предлагает нуклеотидную последовательность, например, ДНК-последовательность, кодирующую биспецифический белковый комплекс настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления изобретение предлагает нуклеотидную последовательность, например, ДНК-последовательность, кодирующую биспецифическую или полиспецифическую молекулу антитела настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему указанную выше нуклеотидную последовательность.

Термин "вектор" в данном описании относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать связанную с ней другую нуклеиновую кислоту. Примером вектора является "плазмида", которая представляет собой циклическую двухцепочечную петлю ДНК, в которую можно лигировать другие сегменты ДНК. Другим примером вектора является вирусный вектор, где другие сегменты ДНК лигируют в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, содержащие бактериальную точку начала репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) можно интегрировать в геном клетки-хозяина, после чего они могут реплицироваться наряду с геномом хозяина. В настоящем описании термины "плазмида" и "вектор" могут использоваться как взаимозаменяемые, поскольку плазмида представляет собой наиболее часто используемую форму вектора.

Общие способы, с помощью которых можно конструировать векторы, способы трансфекции и способы культивирования хорошо известны специалистам в данной области. Их описание можно найти в "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing.

Термин "селектируемый маркер" в данном описании относится к белку, экспрессия которого позволяет идентифицировать клетки, трансформированные или трансфицированные вектором, содержащим маркерный ген. В данной области известен широкий ряд маркеров селекции. Например, селектируемый маркерный ген, как правило, придает клетке-хозяину, в которую введен вектор, устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат. Селектируемый маркер также может представлять собой соединение, которое можно идентифицировать визуально, такое как, например, флуоресцентный маркер. Примеры флуоресцентных маркеров включают в себя родамин, FITC, TRITC, Alexa Fluors и их конъюгаты.

Изобретение также предлагает клетку-хозяина, содержащую один или несколько векторов клонирования или экспрессии, в состав которых входит одна или несколько ДНК-последовательностей, кодирующих антитело настоящего изобретения. Любую подходящую клетку-хозяина/векторную систему можно использовать для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих молекулы антител настоящего изобретения. Также можно использовать бактериальные, например, E. coli, и другие микробиальные системы, или эукариотические системы, например, системы экспрессии на основе клеток-хозяев млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева млекопитающих включают в себя CHO, миеломные или гибридомные клетки.

Настоящее изобретение также предлагает способ получения слитого белка настоящего изобретения, включающий в себя культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор настоящего изобретения, в условиях, подходящих для проведения экспрессии белка, управляемой последовательностью ДНК, кодирующей молекулу настоящего изобретения, и выделение молекулы.

Биспецифические белковые комплексы настоящего изобретения, обладающие специфичностью к конкретному сочетанию антигенов, можно использовать для получения наборов для диагностики/детекции. Например, наборы могут содержать биспецифические комплексы антител, специфичные к двум антигенам, присутствующим на клетках одного типа, причем положительный диагноз может быть вынесен только в случае успешной детекции обоих антигенов. Применение биспецифических комплексов антител настоящего изобретения позволяет достичь гораздо более высокой специфичности детекции, чем в случае использования двух отдельных антител или фрагментов антител в виде незакомплексованной формы.

В одном варианте осуществления биспецифические комплексы антител фиксируют на твердой поверхности. Твердая поверхность может представлять собой, например, чип или планшет ELISA.

Изобретение также предлагает применение биспецифического белкового комплекса настоящего изобретения в качестве средства детекции, позволяющего детектировать присутствие первого и второго пептида в образце.

Биспецифические комплексы антител настоящего изобретения можно конъюгировать, например, с флуоресцентным маркером, который облегчает детекцию связанных комплексов антитело-антиген. Такие биспецифические комплексы антител можно использовать для проведения иммунофлуоресцентной микроскопии. Альтернативно биспецифические комплексы антител также можно использовать для проведения анализов методом вестерн-блоттинга или ELISA.

В одном варианте осуществления изобретение предлагает способ очистки антитела (в частности, антитела настоящего изобретения, или его фрагмента).

В одном варианте осуществления изобретение предлагает способ очистки слитого белка или биспецифического белкового комплекса настоящего изобретения, включающий в себя следующие стадии: проведение анионообменной хроматографии в несвязывающем режиме, в котором примеси остаются на колонке, а антитело выходит в несвязанной фракции. Данную стадию можно проводить, например, при pH примерно 6-8.

Способ может дополнительно включать в себя начальную стадию улавливания с использованием катионообменной хроматографии, проводимой, например, при pH от 4 до 5.

Способ может дополнительно включать в себя другие хроматографические стадии, гарантирующие отделение связанных с продуктом и способом примесей от потока продукта.

Способ очистки также может включать в себя одну или несколько стадий ультрафильтрации, таких как стадии концентрирования и диафильтрации.

Предполагается, что используемый выше термин "очищение от" относится к достижению чистоты, составляющей, по меньшей мере, 90%, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% по массе или более.

В контексте данного описания термин "содержащий" интерпретируют как "включающий в себя".

Предполагается, что аспекты настоящего описания, включающие в себя определенные элементы, также охватывают альтернативные варианты осуществления, "включающие в себя" или "по существу включающие в себя" родственные элементы.

Используемые здесь позитивные варианты осуществления могут служить основой для исключения некоторых аспектов изобретения.

Описания способов, связанных с биспецифическими комплексами, в равной степени относятся к самим комплексам, и наоборот.

Пункты:

1. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса формулы A-X:Y-B,

где X:Y представляет собой гетеродимерный связующий фрагмент,

A и B представляют собой белковые компоненты биспецифического комплекса, присутствующие в нем в виде гибридов с X и Y соответственно, причем указанный способ включает в себя следующие стадии:

(i) тестирование части или всего мультиплекса, содержащего, по меньшей мере, один гетеродимер-связанный биспецифичный белок, на активность с помощью функционального анализа; и

(ii) анализ результатов функционального анализа с целью детекции синергической биологической функции биспецифического белкового комплекса.

2. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по пункту 1, где способ дополнительно включает в себя первую стадию получения мультиплекса, образованного гетеродимер-связанными биспецифическими белковыми комплексами.

3. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по пункту 1 или 2, где X представляет собой пептид или белок и Y представляет собой пептид или белок, являющий специфическим партнером по связыванию с X.

4. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по пункту 3, где сродство связывания гетеродимерного связующего фрагмента составляет 5 нМ или выше.

5. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по пункту 4, где сродство связывания гетеродимерного связующего фрагмента составляет 900 пМ или выше, например, 800, 700, 600, 500, 400 или 300 пМ.

6. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по пункту 3, где X представляет собой антитело или его связывающий фрагмент.

7. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по пункту 6, где X представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, включающей в себя Fab, Fabʹ, одноцепочечный Fv и однодоменное антитело, такое как VHH.

8. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по пункту 7, где X представляет собой одноцепочечный Fv.

9. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по пункту 8, где одноцепочечный Fv является специфичным к пептиду GCN4.

10. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по пункту 9, где одноцепочечный Fv представляет собой 52SR4.

11. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по одному из пунктов 3-10, где Y представляет собой пептид.

12. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по пункту 11, где пептид содержит в длину от 5 до 25 аминокислот.

13. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по одному из пунктов 1-12, где A представляет собой антитело или его связывающий фрагмент.

14. Способ детекции синергической функции гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса по одному из пунктов 1-13, где B представляет собой антитело или его связывающий фрагмент.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где мультиплекс включает в себя, по меньшей мере, один биологический компаратор, соответствующий, по меньшей мере, одному гетеродимер-связанному биспецифическому белку.

16. Способ по любому из пунктов 1-15, где несколько биспецифических белковых комплексов тестируют одновременно.

17. Биспецифический белковый комплекс, имеющий формулу A-X:Y-B, где:

A-X представляет собой первый слитый белок;

Y-B представляет собой второй слитый белок;

X:Y представляет собой гетеродимерный связующий фрагмент;

A представляет собой первый белковый компонент биспецифического комплекса;

B представляет собой втрой белковый компонент биспецифического комплекса;

X представляет собой первый партнер по связыванию связующей пары;

Y представляет собой второй партнер по связыванию связующей пары; и

: обозначает взаимодействие (такое как связывающее взаимодействие) между X и Y.

18. Биспецифический белковый комплекс по пункту 17, где связывающее взаимодействие между X и Y характеризуется низкой константой диссоциации.

19. Биспецифический белковый комплекс по пункту 18, где константа диссоциации находится в диапазоне 1-9×10^-3с^-1 или менее, например, она может составлять 1-9×10^-3с^-1, 1-9×10^-4с^-1, 1-9×10^-5с^-1, 1-9×10^-6с^-1 или 1-9×10^-7sс^-1.

20. Биспецифический белковый комплекс по пункту 19, где константа диссоциации составляет 1×10^-4с^-1 или менее, например 1×10^-5с^-1, 1×10^-6с^-1 или 1×10^-7с^-1.

21. Биспецифический белковый комплекс по любому из пунктов 17-20, где сродство X и Y друг к другу составляет 5 нМ или выше, например, 900 пМ или выше, например, 800, 700, 600, 500, 400 или 300 пМ.

22. Биспецифический белковый комплекс по любому из пунктов 17-21, где Y представляет собой пептид или белок.

23. Биспецифический белковый комплекс по пункту 22, где пептид представляет собой GCN4.

24. Биспецифический белковый комплекс по любому из пунктов 16-23, где X представляет собой антитело или фрагмент антитела.

25. Биспецифический белковый комплекс по пункту 24, где фрагмент антитела выбран из группы, включающей в себя: Fab, Fabʹ, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) и однодоменное антитело (sdAb), такое как VHH.

26. Биспецифический белковый комплекс по пункту 25, где фрагмент антитела представляет собой scFv.

27. Биспецифический белковый комплекс по пункту 26, где scFv представляет собой 52SR4.

28. Биспецифический комплекс по любому из пунктов 17-27, где X или Y представляет собой пептид, причем пептид отличается от пептидного эпитопа, обозначаемого E5B9.

29. Биспецифический белковый комплекс по пункту 17, где пара партнеров по связыванию выбрана из следующих пар:

(i) X представляет собой глутатион (GSH), а Y представляет собой глутатион S-трансферазу (GST),

(ii) X представляет собой Fos, а Y представляет собой Jun,

(iii) X представляет собой FLAG, а Y представляет собой антитело против FLAG, или его фрагмент,

(iv) X представляет собой His, а Y представляет собой антитело против His, и

(v) X представляет собой мальтоза-связывающий белок, а Y а Y представляет собой антитело против мальтоза-связывающего белка, или его фрагмент.

30. Биспецифический белковый комплекс по любому из пунктов 17-29, где A выбран из группы, включающей в себя антитело, фрагмент антитела, лиганд, рецептор, ингибитор и фермент, например, он может представлять собой антитело или фрагмент антитела.

31. Биспецифический белковый комплекс по любому из пунктов 17-30, где B выбран из группы, включающей в себя антитело, фрагмент антитела, лиганд, рецептор, ингибитор и фермент, например, он может представлять собой антитело или фрагмент антитела.

32. Биспецифический белковый комплекс по любому из пунктов 30 или 31, где A и/или B представляет собой антитело или фрагмент антитела, специфичные к рецептору клеточной поверхности.

33. Биспецифический белковый комплекс по любому из пунктов 29-30, где A и/или B представляет собой антитело или фрагмент антитела, специфичные к цитокину или хемокину.

34. Биспецифический белковый комплекс по любому из пунктов 30-34, где X присоединен к C-концу тяжелой или легкой цепи первого антитела или фрагмента антитела, например, где X присоединен к C-концу тяжелой цепи первого антитела или связывающего фрагмента антитела.

35. Биспецифический белковый комплекс по любому из пунктов 31-35, где Y присоединен к C-концу тяжелой или легкой цепи второго антитела связывающего фрагмента антитела, например где Y присоединен к C-концу тяжелой цепи второго антитела или фрагмента антитела.

36. Биспецифический белковый комплекс по любому из пунктов 17-36, где A представляет собой антитело или связывающий фрагмент антитела, специфичные к первому антигену, а B представляет собой антитело или фрагмент антитела, специфичные ко второму антигену, где первый и второй антигены являются разными.

37. Композиция, содержащая один или несколько биспецифических белковых комплексов по любому из пунктов 17-37.

38. Композиция по пункту 38, где, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% слитых белков находятся в виде биспецифического белкового комплекса.

39. Композиция по пункту 39, где, по меньшей мере, 60% слитых белков находятся в виде биспецифического белкового комплекса.

40. Мультиплекс биспецифических белковых комплексов, включающий в себя:

по меньшей мере два биспецифических белковых комплекса по любому из пунктов 19-37, где биспецифические белковые комплексы обладают разной специфичностью.

41. Мультиплекс по пункту 41, где биспецифические белковые комплексы находятся в растворе или фиксируются на поверхности твердой подложки.

42. Мультиплекс по пункту 42, где мультиплекс находится в виде массива или матрицы, например, в микропланшете, таком как 96-луночный планшет или 384-луночный планшет.

43. Мультиплекс по любому из пунктов 41-43, где биспецифические белковые комплексы конъюгированы с гранулами.

44. Слитый белок A-X или B-Y по любому из пунктов 1-37.

45. Библиотека, содержащая два или более слитых белков, определенных в одном из пунктов 1-37.

46. Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, определенный в одном из пунктов 1-37.

47. Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность по пункту 46.

48. Биспецифический белковый комплекс по любому из пунктов 17-37, или композиция по любому из пунктов 38-40, для применения в терапии.

49. Способ лечения пациента, включающий в себя введение биспецифического белкового комплекса по любому из пунктов 7-36, или композиции по любому из пунктов 37-39.

50. Набор, содержащий:

a) один или несколько слитых белков A-X; и

b) один или несколько слитых белков B-Y;

X:Y представляет собой гетеродимерный связующий фрагмент;

A представляет собой первый белковый компонент биспецифического комплекса;

B представляет собой второй белковый компонент биспецифического комплекса;

X представляет собой первый партнер по связыванию связующей пары, такой как пептид или белок;

Y представляет собой второй партнер по связыванию связующей пары, такой как пептид или белок, специфичный к X;

где X и Y не способны к образованию гомодимеров, образуя в результате специфического связывающего взаимодействия между X и Y гетеродимерный связующий фрагмент, который физически соединяет два гибрида с образованием биспецифического белкового комплекса; и

где слитый белок (слитые белки), входящий в состав набора, находится в виде закомплексованной или незакомплексованной формы.

51. Набор по пункту 51, дополнительно содержащий инструкции по использованию.

52. Набор по пункту 50 или 51, дополнительно содержащий один или несколько реагентов для проведения одного или нескольких функциональных анализов.

Все упоминающиеся здесь литературные источники специально включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Список литературы

1. Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. Hanes J, Jermutus L, Weber-Bornhauser S, Bosshard HR, Plückthun A. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14130-14135

2. Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of a Peptide-binding Single Chain Antibody Fragment (scFv) with Low Picomolar Affinity. Zhand C, Spinelli S, Luginbuhl B, Amstutz P, Cambillau C, Pluckthun A. (2004) J. Biol. Chem. 279, 18870-18877

3. Antigen recognition by conformational selection. Berger C, Weber-Bornhauser S, Eggenberger Y, Hanes J, Pluckthun A, Bosshard H. R. (1999) F.E.B.S. Letters 450, 149-153

ПРИМЕРЫ

Общие способы, используемые в некоторых примерах

Общий способ 1: Человеческие PBMC, полученные после афереза тромбоцитов, хранят в виде замороженных аликвот. Перед проведением анализа клетки оттаивают, промывают DMEM (Life Technologies) и оставляют акклиматизироваться при 37°C в атмосфере 5% CO₂.

Общий способ 2: FabʹA-X и FabʹB-Y инкубируют вместе в течение 90 минут (при 37°C/5%CO₂) и затем смешивают с 2,5×10⁵ PBMC в 96-луночных планшетах с V-образным дном. PBMC инкубируют с биспецифическими (FabʹA-X и FabʹB-Y) или бивалентными (такими как FabʹA-X и FabAʹ-Y) сочетаниями еще 90 минут. После завершения инкубации B-клетки активируют путем добавления 200 нМ F(abʹ)₂ козлиного антитела против человеческого IgM (Southern Biotechnology) в течение 8 минут при 37°C. Сигнальную реакцию останавливают путем добавления равного объема буфера Cytofix (BD Biosciences). Затем планшеты оставляют стоять при комнатной температуре в течение 15 минут и центрифугируют при 500 g в течение 5 минут. Избыточный супернатант отбрасывают, оставляя клеточный осадок, который ресуспендируют в проточном буфере и промывают еще раз. Затем клетки ресуспендируют в охлажденном на льду буфере Perm III (BD Biosciences) в течение 30 минут, после чего дважды промывают проточным буфером.

Общий способ 3: Клетки активируют, как описано в общем способе 2, и окрашивают меченным флуоресцентной меткой антителом против CD20 (BD Biosciences), антителом против фосфо-Akt, которое распознает модифицированный остаток серина в положении 473, антителом против фосфо-PLCg2, которое распознает модифицированный остаток тирозина в положении 759, и антителом против IĸB, антитело которое распознает общий IĸB. Затем содержимое планшетов ресуспендируют и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. После этого планшеты промывают еще два раза и ресуспендируют в 25 мкл проточного буфера. Клеточную экспрессию CD20, Akt и PLCg2 измеряют с помощью проточного цитометра Intellicyt HTFC™.

Пример 1. Конструирование биспецифического комплекса антител настоящего изобретения FabB-GCN4(7P14P):52SR4-FabA

На фиг. 2 и 4 показан типичный биспецифический комплекс антител настоящего изобретения. Биспецифический комплекс антител состоит из первого и второго слитых белков.

Первый слитый белок (A-X) содержит фрагмент Fab (Fab A (также обозначаемый Fab#1), специфичный к антигену 6, который присоединяют к X, scFv (клон 52SR4 SEQ ID NO: 3), через пептидный линкер ASGGGG, SEQ ID NO: 71, присоединенный к C-концу домена CH1 фрагмента Fab, и домен V_L scFv. Сам scFv также содержит пептидный линкер, расположенный между доменами V_L и V_H.

Второй слитый белок (B-Y) содержит фрагмент Fab (Fab B [также обозначаемый Fab#2], специфичный к антигену 5). Однако, в отличие от первого белка, фрагмент Fab присоединен к Y, пептид GCN4 (клон 7P14P, SEQ ID NO: 1), через пептидный линкер ASGGGG, SEQ ID NO: 71, присоединенный к домену CH₁ фрагмента Fab.

scFv, X, является специфичным и комплементарным по отношению к партнеру по связыванию Y, GCN4. В результате, после приведения двух слитых белков в контакт друг с другом, возникает нековалентное связывающее взаимодействие между scFv и пептидом GCN4, физически удерживающее два слитых белка в виде биспецифического комплекса антител.

Одноцепочечное антитело (scFv) 52SR4 получают путем конструирования рибосомного дисплея библиотеки scFv VL-линкер-VH, полученной из селезенок мышей, иммунизированных GCN4(7P14P) (ссылка 1), с последующим пэннингом. В другой публикации, 2004, описано аффинное созревание 52SR4 до указанного уровня 5 пМ, опять же, с использованием рибосомного дисплея рандомизированной библиотеки (ссылка 2).

Пептид GCN4 получают из фактора транскрипции дрожжей GCN4 путем включения остатков пролина в положения 7 и 14, следовательно, GCN4(7P14P) остается в мономерном состоянии при связывании scFv, как описано в публикации Berger et al, 1999 (ссылка 3).

Нуклеотидные последовательности, кодирующие пептид GCN4 и scFv 52SR4, клонируют в отдельных векторах ниже векторов экспрессии тяжелой цепи Fab собственного производства, которые содержат CH₁, и которые сконструированы с целью получения VH-участков антитела.

Затем VH-участки из антитела против антигена 6 и антитела против антигена 5 клонируют отдельно в двух указанных векторах, кодирующих тяжелые цепи.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие пептид GCN4 и scFv 52SR4, отдельно клонируют в первом и втором векторах, соответственно ниже векторов экспрессии легкой цепи Fab собственного производства, которые содержат CK, и которые сконструированы с целью получения VL-участков антитела.

VL-участки из антитела против антигена 6 и антитела против антигена 5 антитело клонируют отдельно в одной рамке считывания с CK в векторе экспрессии легкой цепи собственного производства с целью совместной экспрессии соответствующего вектора, кодирующего тяжелую цепь, сконструированного для экспрессии Fab-scFv, и пептидов Fab.

Затем векторы секвенируют, чтобы подтвердить успешное проведение клонирования и последующую отдельную экспрессию клетками Fab-scFv и пептидов Fab, содержащих V-участки из антитела против антигена 6 и антитела против антигена 5, соответственно. Антигены 5 и 6, указанные в примере 1, отличаются от меченных антигенов 5 и 6, используемых в последующих примерах в применении к форматам больших матриц.

Пример 2. Демонстрация методом проточной цитометрии взаимодействия scFv:пептид, приводящего к образованию нековалентного биспецифического комплекса антител, который может соединяться с двумя антигенами-мишенями одновременно

На фиг. 5 приведены результаты анализа методом проточной цитометрии, демонстрирующие антигенную специфичность двух разных биспецифических комплексов антител, образованных посредством связывающего взаимодействия scFv:пептид.

Первый биспецифический комплекс антител конструируют с использованием двух следующих слитых белков:

Fab антитела против антигена 5-scFv (52SR4); и

Fab антитела против антигена 6-пептид (GCN4)

Второй биспецифический комплекс антител конструируют с использованием двух следующих слитых белков:

Fab антитела против антигена 5-пептид (GCN4); и

Fab антитела против антигена 6-scFv (52SR4)

Следовательно, два биспецифических комплекса антител содержат одинаковые фрагменты Fab и одинаковые партнеры по связыванию (т.е. 52SR4 и GCN4). Различие между двумя биспецифическими комплексами антител заключается в том, к какому партнеру по связыванию присоединен конкретный фрагмент Fab.

Контрольную смесь, которая не образует комплекс, получают из следующих слитых белков:

Fab антитела против антигена 5:GCN4; и

Fab антитела против антигена 6:GCN4

Чтобы продемонстрировать способность биспецифических комплексов антител связываться с антигеном 5, комплексы инкубируют с клетками Jurkat, которые экспрессируют антиген 5. Чтобы продемонстрировать способность биспецифических комплексов антител связываться с антигеном 6, комплексы, уже связанные с антигеном 5 на клетках Jurkat, приводят в контакт с биотинилированным антигеном 6. Затем биотинилированный антиген 6 детектируют с помощью флуоресцентно меченного стрептавидина.

Затем клетки Jurkat пропускают через проточный цитометр Facscalibur, где содержащие флуоресцентную метку клетки Jurkat, связанные с биспецифическим комплексом антител, который, в свою очередь, связан с антигеном 6, что свидетельствует о способности биспецифического комплекса антител связываться одновременно с антигеном 5 и антигеном 6, могут отделяться от клеток Jurkat, инкубированных с двумя слитыми белками, способными связываться с антигеном 5 и антигеном 6, гибридизованными с пептидом, не способным образовывать комплекс.

График FACS, приведенный на фиг. 5, демонстрирует наличие значительных сдвигов для обоих биспецифических комплексов антител (тонкая и жирная линии ниже и выше закрашенного фонового пика), свидетельствуя о том, что биспецифические комплексы антител могут успешно связываться с обоими антигенами-мишенями, и что способность связываться с обоими антигенами-мишенями сохраняется независимо от того, связан ли конкретный фрагмент Fab с scFv, или с пептидом.

Последующее улавливание пептида или scFv, соответственно гибридизованного по C-концу с Fab антитела против антигена 6, позволяет также улавливать биотинилированный антиген 6, который детектируют в последнем слое флуоресцентно меченным стрептавидином. Соответственно, результаты, отображенные в графике FACS, демонстрируют, что биспецифические комплексы антител настоящего изобретения способны успешно связываться с двумя разными антигенами-мишенями одновременно.

Антигены 5 и 6, указанные в примере 2, отличаются от меченных антигенов 5 и 6, используемых в последующих примерах в применении к форматам больших матриц.

Пример 3. Демонстрация взаимодействия scFv:пептид методом Biacore

На фиг. 6 показана кривая, полученная методом поверхностного плазмонного резонанса, которая демонстрирует сродство взаимодействия scFv:пептид (т.е. 52SR4:GCN4). Анализ методом поверхностного плазмонного резонанса проводят с использованием Biacore 3000 (GE Healthcare). Все эксперименты проводят при 25°C. Стрептавидин (собственного производства) иммобилизуют на сенсорном чипе CM5 (GE Healthcare) путем присоединения через аминогруппу с достижением конечного уровня примерно 1750 единиц ответа. Буфер HBS-N (10 мМ HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl; GE Healthcare) используют в качестве подвижного буфера для иммобилизации и улавливания пептида. Для ввода используют объем раствора биотин-пептида GCN4 в HBS-N (10 нМ, МВ 4360), равный 5 мкл, позволяющий достичь улавливания на иммобилизованном стрептавидине, соответствующего примерно 6 единицам ответа. Подвижный буфер меняют на буфер HBS-EP+ (10 мМ HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% (об/об) поверхностно-активного вещества P20; GE Healthcare), чтобы провести измерение кинетики связывания scFv против GCN4 (52SR4). Трехкратные серийные разведения Fab-scFv (собственного производства), начиная от 30 нМ, или буферный контроль HBS-EP+, пропускают над иммобилизованным пептидом GCN4 (3 мин ассоциация, 15 мин диссоциация) о скоростью потока 30 мкл/мин. Поверхность регенерируют после каждого введения со скоростью потока 10 мкл/мин путем двух серийных инъекций по 60 сек 2 М гуанидин-HCl. Кривые связывания, полученные с использованием двойных контролей и вычитанием фона, анализируют с помощью программного обеспечения 3000 BIAEval (версия 4.1) посредством стандартных процедур. Кинетические параметры определяют с использованием алгоритма модели связывания 1:1. Результаты демонстрируют, что сродство scFv к пептиду составляет 516 пМ.

Пример 4. Получение Fab-A (Fab-scFv [A-X]) и Fab-B (Fab-пептид [B-Y) для функциональных анализов

Стратегия клонирования: ДНК, кодирующую вариабельный участок антитела, получают путем синтеза методом ПЦР, или путем генного синтеза последовательности ДНК с фланкирующими участками рестрикции. В качестве указанных участков используют HindIII и XhoI для вариабельных участков тяжелых цепей и HindIII и BsiWI для вариабельных участков легких цепей. Данные участки обеспечивают возможность лигирования вариабельного участка тяжелой цепи в два вектора, кодирующие тяжелые цепи (pNAFH, содержащий FabB-Y, и pNAFH, содержащий FabA-X), поскольку они содержат комплементарные участки рестрикции. Вариабельный участок лигируют выше (или по 5ʹ-концу) мышиных константных участков и пептида Y (GCN4), или scFv X (52SR4), получая полноразмерную рамку считывания. Легкие цепи клонируют в стандартных, собственного производства, векторах, кодирующих константные участки мышиной цепи каппа (pMmCK или pMmCK S171C), с использованием, опять же, комплементарных участков рестрикции. Вектор pMmCK S171C используют в том случае, если вариабельный участок получен из кролика. События клонирования подтверждают секвенированием с использованием праймеров, которые фланкируют полноразмерную открытую рамку считывания.

Культивирование CHOSXE: Суспензию клеток CHOSXE заранее адаптируют к среде CDCHO (Invitrogen), содержащей 2 мМ (100x) глютамакс. Клетки поддерживают в фазе логарифмического роста, встряхивая при 140 об/мин на шейкере-инкубаторе (Kuner AG, Birsfelden, Switzerland) и культивируют при 37°C в атмосфере 8% CO₂.

Трансфекция методом электропорации: Перед трансфекцией определяют число и жизнеспособность клеток с помощью цитометра CEDEX (Innovatis AG. Bielefeld, Germany), нужное число клеток (2×10⁸ клеток/мл) переносят в центрифужные конические пробирки и центрифугируют при 1400 об/мин в течение 10 минут. Осажденные клетки ресуспендируют в стерильном сбалансированном солевом растворе Эрла и центрифугируют при 1400 об/мин еще 10 минут. Супернатант отбрасывают, а осадки ресуспендируют с получением желательной плотности клеток.

ДНК-вектор разводят до конечной концентрации 400 мкг на 2×10⁸ клеток/мл, 800 мкл полученного разведения вносят пипеткой в кюветы (Biorad) и проводят электропорацию, используя систему для электропорации собственного производства.

Fab-A (Fab-scFv [A-X]) и Fab-B (Fab-пептид [B-Y]) трансфицируют отдельно. Трансфицированные клетки переносят непосредственно в колбы Эрленмейера 1×3 л, содержащие среду ProCHO 5, обогащенную 2 мМ глутамаксом и антибиотическим антимитотическим раствором (100×) (1 к 500), после чего клетки инкубируют в шейкере-инкубаторе Kuhner при 37^°C, 5% CO2, встряхивая при 140 об/мин. Через 24 часа после трансфекции добавляют пищевую добавку 2 г/л ASF (AJINOMOTO), температуру уменьшают до 32°C и культивируют в течение еще 13 дней. На четвертый день к культуре добавляют 3 мМ бутират натрия (натриевая соль н-масляной кислоты, Sigma B-5887).

На 14 день культуры переносят в пробирки и после центрифугирования в течение 30 минут при 4000 об/мин супернатант отделяют от клеток. Оставшиеся супернатанты фильтруют через фильтр SARTOBRAN® P Millipore с размером пор 0,22 мкм и затем через золотые фильтры Gamma 0,22 мкм. Конечные уровни экспрессии определяют методом ВЭЖХ на G-белке.

Крупномасштабная (1,0 л) очистка: Fab-A и Fab-B очищают путем аффинного улавливания с использованием систем AKTA Xpress и колонок HisTrap Excel, заполненных никель-содержащей смолой (GE Healthcare). Культуральные супернатанты стерилизуют фильтрованием через фильтры 0,22 мкм, при необходимости значение pH доводят до нейтрального слабой кислотой или слабым основанием, после чего супернатанты загружают на колонки. Стадию повторного промывания с использованием 15-25 мМ имидазола проводят для вытеснения с никель-содержащей смолы любых слабо связанных белков клеток-хозяев/соединений, неспецифически связывающих His. Элюирование проводят с использованием 10 мМ фосфата натрия, pH 7,4,+1 M NaCl+250 мМ имидазол и собирают фракции объемом 2 мл. После одного объема колонки элюирование приостанавливают на 10 минут, чтобы сузить пик и затем уменьшают общий объем элюирования. Самые чистые фракции объединяют, заменяют буфер на PBS (Sigma), pH 7,4, и фильтруют через фильтр 0,22 мкм. Полученные объединенные фракции анализируют путем измерения A280, методом SE-ВЭЖХ (метод G3000), методом SDS-PAGE (восстанавливающим и не восстанавливающим), а также на эндотоксин с использованием системы PTS Endosafe.

Пример 5. Применение Fab-A (Fab-scFv [A-X]) и Fab-B (Fab-пептид [B-Y]) в формате гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса для выбора функциональных бивалентных и биспецифических антиген-направленных сочетаний на основании ингибирования сигнального пути Akt (как показателя активации B-клеток)

Человеческие PBMC получают по общему способу 1. В это же время получают массивы биспецифических или бивалентных антител путем разведения эквимолярных (200 нМ) количеств Fabʹ-A (Fab-scFv) и Fabʹ-B (Fab-пептид), обладающих разной антигенной специфичностью, а именно, специфичностью к клеточным поверхностным белкам антигену 3, антигену 1, антигену 4 и антигену 2, в DMEM, содержащей 10% телячьей сыворотки и 2 мМ глутамин. Данный массив показан в таблице 4.

Таблица 4: Возможный массив биспецифических and бивалентных сочетаний антител, специфичных к антигену 3, антигену 1, антигену 4 и 2.

Fab A (A-X)	Fab B (B-Y)
Антиген 3-Y	Антиген 1-Y	Антиген 4-Y	Антиген 2-Y
Антиген 3-X	3-X:Y-3	3-X:Y-1	3-X:Y-4	3-X:Y-2
Антиген 1-X	1-X:Y-3	1-X:Y-1	1-X:Y-4	1-X:Y-2
Антиген 4-X	4-X:Y-3	4-X:Y-1	4-X:Y4	4-X:Y-2
Антиген 2-X	2-X:Y-3	2-X:Y-1	2-X:Y-4	2-X:Y-2

где X представляет собой scFv (52SR4), а Y представляет собой пептид (GCN4)

FabʹA-X и FabʹB-Y инкубируют с PMBC по общему способу 2 с последующей очисткой по способу примера 4.

Затем клетки окрашивают флуоресцентно меченным антителом против CD20 (BD Biosciences) и флуоресцентно меченным антителом против фосфо-Akt, которое распознает модифицированный остаток серина в положении 473 последовательности белка. Содержимое планшетов ресуспендируют и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Затем планшеты промывают еще два раза и ресуспендируют в 25 мкл проточного буфера. Экспрессию CD20 и Akt в клетках измеряют с помощью проточного цитометра Intellicyt HTFC™.

С помощью пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) идентифицируют B-клетки как отличающиеся от других клеточных популяций и рассчитывают среднее геометрическое уровней Akt для каждой лунки. Затем все данные выражают в виде процента ингибирования максимального ответа (только антитело против IgM) минус фоновый уровень (только клетки). Относительный эффект сочетаний антитела против антигена 3 (VR0982), антитела против антигена 1 (VR4247), антитела против антигена 4 (VR4248) и антитела против антигена 2 (VR4246) показан в таблице 5 (↓=ингибирование, ↑=стимуляция и ↔=отсутствие эффекта). Число стрелок указывает на интенсивность активности.

Таблица 5: Таблица относительной интенсивности ингибирования фосфорилированного Akt под действием биспецифических и бивалентных сочетаний антител, специфичных к антигенам 3, 1, 4 и 2

Fab A (A-X) специфичный к	Fab B (B-Y)
Антиген 3-Y	Антиген 1-Y	Антиген 4-Y	Антиген 2-Y
Антиген 3-X	↑↑	Не тестировали	↑↑	↓↓↓
Антиген 1-X	↔	↔	↔	↓↓↓↓
Антиген 4-X	Не тестировали	Не тестировали	Не тестировали	Не тестировали
Антиген 2-X	↓↓↓	↓↓↓	↓↓	↔

где X представляет собой scFv (52SR4), а Y представляет собой пептид (GCN4)

Полученные результаты также показаны на гистограмме (фиг. 7): в виде средних значений с планками погрешностей, демонстрирующими доверительный интервал для вероятности 95%. Результаты демонстрируют, что сочетания Fab против антигена 3 (VR0982) и Fab против антигена 2 (VR4246), Fab против антигена 1 (VR4247) и Fab против антигена 2 (VR4246), а также Fab против антигена 4 (VR4248) и Fab против антигена 2 (VR4246) могут полностью ингибировать экспрессию фосфо-Akt в B-клетках, стимулированных антителом против IgM. И наоборот, сочетания Fab против антигена 3 (VR0982) и Fab против антигена 3 (VR0982), а также Fab против антигена 3 (VR0982) и Fab против антигена 4 (VR4248) вызывают повышение уровня экспрессии фосфо-Akt. Все другие тестируемые сочетания не оказывают эффекта.

Пример 6. Применение формата гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса для выбора функциональных бивалентных и биспецифических антиген-направленных сочетаний на основании ингибирования сигнального пути PLCg2 (как показателя активации B-клеток).

Человеческие PBMC получают по общему способу 1. В это же время получают массивы биспецифических или бивалентных антител путем разведения эквимолярных (200 нМ) количеств Fabʹ-A (Fab-scFv [A-X]) и Fabʹ-B (Fab-пептид [B-Y]), обладающих специфичностью к клеточным поверхностным белкам антигену 3, антигену 1, антигену 4 и антигену 2, в DMEM, содержащей 10% телячьей сыворотки и 2 мМ глутамин. Данный массив показан в таблице 6.

FabʹA-X и FabʹB-Y инкубируют по общему способу 2.

Клетки окрашивают флуоресцентно меченным антителом против CD20 (BD Biosciences) и флуоресцентно меченным антителом против фосфо-PLCg2, которое распознает модифицированный остаток тирозина в положении 759 последоватлеьности белка. Содержимое планшетов ресуспендируют и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Затем планшеты промывают дважды и ресуспендируют в 25 мкл проточного буфера. Экспрессию CD20 и PLCg2 в клетках измеряют с помощью проточного цитометра Intellicyt HTFC™.

С помощью пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) идентифицируют B-клетки как отличающиеся от других клеточных популяций и рассчитывают среднее геометрическое уровней PLCg2 для каждой лунки. Затем все данные выражают в виде процента ингибирования максимального ответа (только антитело против IgM) минус фоновый уровень (только клетки). Относительный эффект сочетаний антител против антигена 3, антигена 1, антигена 4 и антигена 2 показан в таблице 6 (↓=ингибирование, ↑=стимуляция и ↔=отсутствие эффекта). Число стрелок указывает на интенсивность активности.

Таблица 6: Таблица относительной интенсивности ингибирования фосфорилированного PLCg2 под действием биспецифических и бивалентных сочетаний антител, специфичных к антигенам 3, 1, 4 и 2

Fab A (A-X) специфичный к	Fab B (B-Y)
Антиген 3-Y	Антиген 1-Y	Антиген 4-Y	Антиген 2-Y
Антиген 3-X	↑	Не тестировали	↑↑	↓↓↓
1-X	↔	↔	↔	↓↓
4-X	Не тестировали	Не тестировали	Не тестировали	Не тестировали
2-X	↓↓↓	↓↓	↓↓↓	↔

где X представляет собой scFv, а Y представляет собой пептид

Полученные результаты также показаны на гистограмме (фиг. 8) в виде средних значений с планками погрешностей, демонстрирующими доверительный интервал для вероятности 95%. Результаты демонстрируют, что сочетания Fab против антигена 3 (VR0982) и Fab против антигена 2 (VR4246), Fab против антигена 1 (VR4247) и Fab против антигена 2 (VR4246), а также Fab против антигена 4 (VR4248) и Fab против антигена 2 (VR4246) могут полностью ингибировать экспрессию фосфо-PLCg2 в B-клетках, стимулированных антителом против IgM. И наоборот, сочетания Fab против антигена 3 (VR0982) и Fab против антигена 3 (VR0982), а также Fab против антигена 3 (VR0982) и Fab против антигена 4 (VR4248) вызывают повышение уровня экспрессии фосфо-PLCg2. Сочетание Fab против антигена 1 и Fab против антигена 1 не оказывает эффекта.

Пример 7. Применение формата гетеродимер-связанного биспецифического белкового комплекса для выбора функциональных бивалентных и биспецифических антиген-направленных сочетаний на основании ингибирования экспрессии CD86 (как показателя активации B-клеток).

Человеческие PBMC получают по общему способу 1. В это же время получают массивы биспецифических или бивалентных антител путем разведения эквимолярных (200 нМ) количеств Fabʹ-A (Fab-scFv) и Fabʹ-B (Fab-пептид), обладающих специфичностью к клеточным поверхностным белкам антигену 3, антигену 1, антигену 4 и антигену 2, в DMEM, содержащей 10% телячьей сыворотки и 2 мМ глутамин. Данный массив показан в таблице 7.

FabʹA-X и FabʹB-Y инкубируют вместе в течение 90 минут (при 37°C и 5%CO₂), после чего смешивают с 2,5×10⁵ PBMC в 96-луночных планшетах с V-образным дном. Затем PBMC инкубируют с биспецифическими или бивалентными сочетаниями в течение еще 90 минут. По окончании данного периода B-клетки активируют путем добавления 200 нМ козлиного F(abʹ)2 против человеческого IgM (Southern Biotechnology) с последующей инкубацией в течение 24 часов при 37°C. Затем планшеты помещают на лед и промывают один раз охлажденным на льду проточным буфером (PBS+1% BSA+0,01% NaN₃). Клетки окрашивают флуоресцентно меченным антителом против CD19 (BD Biosciences) и флуоресцентно меченным антителом против CD86 и инкубируют на льду в течение 1 часа в темноте. Затем планшеты промывают еще два раза и ресуспендируют в 25 мкл проточного буфера. Экспрессию CD19 и CD86 в клетках измеряют с помощью проточного цитометра Intellicyt HTFC™.

С помощью пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) идентифицируют B-клетки как отличающиеся от других клеточных популяций и рассчитывают среднее геометрическое уровней CD86 для каждой лунки. Затем все данные выражают в виде процента ингибирования максимального ответа (только антитело против IgM) минус фоновый уровень (только клетки). Относительный эффект сочетаний Fab против антигена 3 (VR0982), Fab против антигена 1 (VR4247), Fab против антигена 4 (VR4248) и Fab против антигена 2 (VR4246) показан в таблице 7 (↓=ингибирование, ↑=стимуляция и ↔=отсутствие эффекта). Число стрелок указывает на интенсивность активности.

Таблица 7: Таблица относительной интенсивности ингибирования экспрессии CD86 в B-клетках под действием биспецифических и бивалентных сочетаний антител, специфичных к антигенам 3, 1, 4 и 2

Fab A (A-X) специфичный к	Fab B (B-Y)
Антиген 3-Y	Антиген 1-Y	Антиген 4-Y	Антиген 2-Y
Антиген 3-X	↑	Не тестировали	↔	↓↓↓
Антиген 1-X	↔	↔	↑↑	↔
Антиген 4-X	Не тестировали	Не тестировали	Не тестировали	Не тестировали
Антиген 2-X	↓↓↓	↓	↓↓↓↓	↓↓

где X представляет собой scFv (52SR4), а Y представляет собой пептид (GCN4)

Полученные результаты также показаны на гистограмме (фиг. 9) в виде средних значений с планками погрешностей, демонстрирующими доверительный интервал для вероятности 95%. Результаты демонстрируют, что сочетания Fab против антигена 3 (VR0982) и Fab против антигена 2 (VR4246), Fab против антигена 1 (VR4247) и Fab против антигена 2 (VR4246), Fab против антигена 4 (VR4248) и Fab против антигена 2 (VR4246), а также Fab против антигена 2 (VR4246) и Fab против антигена 2 (VR4246) могут ингибировать экспрессию CD86 на B-клетках, стимулированных антителом против IgM. И наоборот, сочетания Fab против антигена 3 (VR0982) и Fab против антигена 3 (VR0982), а также Fab против антигена 1 (VR4247) и Fab против антигена 4 (VR4248) вызывают повышение уровня экспрессии CD86. Все другие тестируемые сочетания не оказывают эффекта.

Пример 8. Ингибиторный эффект Fab против антигена 1 (VR4247) и Fab против антигена 2 (VR4246) может воспроизводиться только в том случае, если антитела располагаются в биспецифический ориентации.

Человеческие PBMC получают по общему способу 1. В это же время получают массивы биспецифических или бивалентных антител, или их смеси, путем разведения эквимолярных (200 нМ) количеств FabʹA-X (Fab-scFv) и/или FabʹB-Y (Fab-пептид), обладающих специфичностью к клеточным поверхностным белкам, антигену 1 и антигену 2, в DMEM, содержащей 10% телячьей сыворотки и 2 мМ глутамин. Кроме того, добавляют отдельные fab (Fabʹ-X и Fabʹ-Y), используемые в качестве контролей. Данные сочетания показаны в таблице 8.

Таблица 8: Матрица биспецифических или бивалентных Fabʹ, смесей Fabʹ или отдельных Fabʹ, специфичных к антигену 1 и антигену 2

Fab A (A-X) специфичный к	Fab B (B-Y)
-	Антиген 1-Y	Антиген 2-Y	Антиген 2-X
Антиген 1-X	1-X	1-X:Y-1	1-X:Y-2	1-X X-2
Антиген 2-X	2-X	2-X:Y-1	2-X:Y-2	-
Антиген 1-Y	1-Y	-	1-Y Y-2	-
Антиген 2-Y	2-Y	-	-	-

где X представляет собой scFv (52SR4), а Y представляет собой пептид (GCN4)

FabʹA-X и/или FabʹB-Y инкубируют по общему способу 2.

Клетки окрашивают флуоресцентно меченным антителом против CD20 (BD Biosciences) и флуоресцентно меченным антителом против фосфо-Akt, которое распознает модифицированный остаток серина в положении 473 последовательности белка. Затем содержимое планшетов ресуспендируют и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. По завершении данного периода планшеты промывают еще два раза и ресуспендируют в 25 мкл проточного буфера. Экспрессию CD20 и Akt в клетках измеряют с помощью проточного цитометра Intellicyt HTFC™.

С помощью пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) идентифицируют B-клетки как отличающиеся от других клеточных популяций и рассчитывают среднее геометрическое уровней Akt для каждой лунки. Затем все данные выражают в виде процента ингибирования максимального ответа (только антитело против IgM) минус фоновый уровень (только клетки). На фиг. 10 показано, что только биспецифическое сочетание Fab против антигена 1 (VR4247) и Fab против антигена 2 (VR4246), но не другие сочетания, может подулировать уровни фосфо-Akt в B-клетках (данные приведены в виде средних значений с планками погрешностей, соответствующими 95% доверительным интервалам).

Пример 9. Ингибиторный эффект антитела против антигена 3 (VR0982) и антитела против антигена 2 (VR4246) может воспроизводиться только в том случае, если антитела располагаются в биспецифический ориентации.

Человеческие PBMC получают по общему способу 1. В это же время получают сочетания биспецифических или бивалентных антител, или их смеси, путем разведения эквимолярных (200 нМ) количеств Fabʹ-X (Fab-scFv) и/или Fabʹ-Y (Fab-пептид), обладающих специфичностью к клеточным поверхностным белкам, антигену 1 и антигену 2, в DMEM, содержащей 10% телячьей сыворотки и 2 мМ глутамин. Данные сочетания показаны в таблице 9.

Таблица 9: Матрица биспецифических или бивалентных антител, или смесей антител, специфичных к антигенам 3 и 2

Fab A (A-X) специфичный к	Fab B (B-Y)
Антиген 3-Y	Антиген 2-Y	Антиген 2-X
Антиген 3-X	3-X:Y-3	3-X:Y-2	3-X X-2
Антиген 2-X	2-X:Y-3	2-X:Y-2	-
Антиген 3-Y	-	3-Y Y-2	-

где X представляет собой scFv (52SR4), а Y представляет собой пептид (GCN4)

FabʹA-X и/или FabʹB-Y инкубируют по общему способу 2.

Клетки окрашивают по общему способу 3.

С помощью пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) идентифицируют B-клетки как отличающиеся от других клеточных популяций и рассчитывают среднее геометрическое уровней Akt и PLCg2 для каждой лунки. Затем все данные выражают в виде процента ингибирования максимального ответа (только антитело против IgM) минус фоновый уровень (только клетки). На фиг. 11 и 12 показано, что только биспецифическое сочетание антител против антигена 3 и антигена 2, но не смеси антител против антигена 3 (VR0982) и против антигена 2(VR4246), способно ингибировать экспрессию фосфорилированных Akt и PLCg2 (данные приведены в виде средних значений с планками погрешностей, соответствующими 95% доверительным интервалам).

Чтобы подтвердить ингибирование, наблюдающееся под действием биспецифического сочетания против антигена 3 и против антигена 2, данное сочетание наряду со смесью антител против антигена 3 (VR0982) и против антигена 2 (VR4246) титруют и измеряют ингибирование общего внутриклеточного IkB (показатель передачи сигнала) и CD86 (маркер активации через 24 часа) в B-клетках.

Как можно видеть на фиг. 13, сочетание антитело против антигена 3-X/антитело против антигена 2-Y, но не сочетание антитело против антигена 3-X/антитело против антигена 2-X (т.е. простая смесь несвязанных антител), способно ингибировать активацию сигнала NF-kB после стимуляции антителом против IgM, измеряемую по уровню общего белка IkB. Значение IC₅₀, полученное путем экстраполяции с подгонкой 4-параметрической логистической кривой с помощью Graphpad Prism 6, составляет 7,5 нМ (данные приведены в виде средних значений с планками погрешностей, соответствующими стандартным отклонениям). Кроме того, титрование демонстрирует, что только сочетание антитело против антигена 3-X/антитело против антигена 2-Y, но не сочетание антитело против антигена 3-X/антитело против антигена 2-X, способно ингибировать экспрессию CD86, индуцированную в B-клетках антителом против IgM, через 24 часа (см. фиг. 14). Значение IC₅₀, полученное путем экстраполяции с подгонкой 4-параметрической логистической кривой с помощью Graphpad Prism 6, составляет 10,3 нМ (данные приведены в виде средних значений с планками погрешностей, соответствующими стандартным отклонениям).

Пример 10. Ингибиторный эффект антитела против антигена 4 и антитела против антигена 2 может воспроизводиться только в том случае, если антитела располагаются в биспецифический ориентации.

Человеческие PBMC получают по общему способу 1. В это же время получают сочетания биспецифических или бивалентных антител, или их смеси, путем разведения эквимолярных (200 нМ) количеств FabʹA-X (Fab-scFv) и/или FabʹB-Y (Fab-пептид), обладающих специфичностью к клеточным поверхностным белкам, антигену 4 и антигену 2, в DMEM, содержащей 10% телячьей сыворотки и 2 мМ глутамин. Данные сочетания показаны в таблице 10.

Таблица 10: Матрица биспецифических или бивалентных антител, или смесей антител, специфичных к антигенам 4 и 2

(A-X) Fab A	(B-Y) Fab B
антиген 2-X	антиген 2-Y
антиген 4-Y	2-X:Y-4	4-Y Y-2
антиген 2-X	-	2-X:Y-2

где X представляет собой scFv (52SR4), а Y представляет собой пептид (GCN4)

FabʹA-X и/или FabʹB-Y инкубируют по общему способу 2. Клетки окрашивают по общему способу 3.

С помощью пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) идентифицируют B-клетки как отличающиеся от других клеточных популяций и рассчитывают среднее геометрическое уровней Akt и PLCg2 для каждой лунки. Затем все данные выражают в виде процента ингибирования максимального ответа (только антитело против IgM) минус фоновый уровень (только клетки).

На фиг. 15 и 16 показано, что только биспецифическое сочетание антитела против антигена 4 (VR4248) и антитела против антигена 2 (VR4246), но не смеси антитела против антигена 4 (VR4248) и антитела против антигена 2 (VR4246), способно ингибировать экспрессию фосфорилированных Akt и PLCg2 (данные приведены в виде средних значений с планками погрешностей, соответствующими 95% доверительным интервалам).

Чтобы подтвердить ингибирование, наблюдающееся под действием биспецифического сочетания антитела против антигена 4 (VR4248) и антитела против антигена 2 (VR4246), данное сочетание титруют в аналитической системе для измерения экспрессии CD86 в B-клетках, индуцированной антителом против IgM.

Как можно видеть на фиг. 17, титрование демонстрирует, что сочетание антитело против антигена 4-X/антитело против антигена 2-Y способно ингибировать экспрессию CD86, индуцированную в B-клетках антителом против IgM, через 24 часа. Значение IC₅₀, полученное путем экстраполяции с подгонкой 4-параметрической логистической кривой с помощью Graphpad Prism 6, составляет 4,7 нМ (данные приведены в виде средних значений с планками погрешностей, соответствующими стандартным отклонениям).

Пример 11. Характеристика биспецифического комплекса

Очистка реагентов для функционального скрининга: Форматы Fab-X (Fab-scFv-His) и Fab-Y (Fab-пептид-His), используемые для функционального скрининга, очищают после стандартной экспрессии в CHO. Осветленные супернатанты клеточной культуры стерилизуют фильтрованием через фильтры 0,22 мкм с использованием Stericup на 1 л. Измеряют pH и при необходимости доводят его значение до 7,4. Полученные супернатанты загружают со скоростью 5 мл/мин на колонки объемом 5 мл HisTrap Nickel Excel (GE Healthcare), уравновешенные 10 мМ фосфатом натрия, 0,5 M NaCl, pH 7,4. Колонки промывают раствором, содержащим 15 мМ имидазол, 10 мМ фосфат натрия, 0,5 М NaCl, pH 7,4, после чего элюируют раствором, содержащим 250 мМ имидазол, 10 мМ фосфат натрия, 0,5 М NaCl, pH 7,4. Элюирование отслеживают путем измерения поглощения при 280 нм и собирают фракции, соответствующие пику элюирования. Указанные фракции анализируют методом гель-хроматографии на TSKgel G3000SWXL; 5 мкм, колонка 7,8×300 мм, элюируя в изократическом режиме 0,2 M раствором фосфата, pH 7,0, со скоростью 1 мл/мин, с детекцией путем измерения поглощения при 280 нм. Образцы, имеющие достаточную степень чистоты, концентрируют до концентрации >1 мг/мл и подвергают диафильтрации против PBS pH 7,4 (Sigma Aldrich Chemicals), используя концентраторы Amicon Ultra-15 с мембраной, обеспечивающей отсечение по молекулярной массе 10 кДа, и с центрифугированием при 4000 g в роторе со свободно подвешенными стаканами. Если качество продукта является недостаточным, фракции, элюированные с никелевой колонки, концентрируют и наносят на колонку XK16/60 или XK16/60 Superdex200 (GE Healthcare), уравновешенную PBS, pH 7,4 (Sigma Aldrich Chemicals). Колонки элюируют в изократическом режиме, используя PBS, pH 7,4 (Sigma Aldrich Chemicals), со скоростью 1 мл/мин или 2,6 мл/мин, соответственно. Фракции собирают и анализируют методом гель-хроматографии на TSKgel G3000SWXL; 5 мкм, колонка 7,8×300 мм, элюируя в изократическом режиме 0,2 M раствором фосфата, pH 7,0, со скоростью 1 мл/мин, с детекцией путем измерения поглощения при 280 нм. Выбранные фракции объединяют и концентрируют до концентрации >1 мг/мл, используя концентратор Amicon Ultra-15 с мембраной, обеспечивающей отсечение по молекулярной массе 10 кДа, и с центрифугированием при 4000 g в роторе со свободно подвешенными стаканами.

Анализ образования биспецифического комплекса в растворе

Эксперимент 1

Очищенный Fab-X (VR4247) и очищенный Fab-Y (VR4248) смешивают в молярном соотношении один к одному с общей концентрацией белка 500 мкг/мл и инкубируют в течение ночи при температуре окружающей среды. Контроли содержат отдельные компоненты смеси в той же концентрации, в которой они присутствуют в смеси. 100 мкл образца и каждого контроля вводят на колонку TSKgel G3000SWXL; 5 мкм, 7,8×300 мм и элюируют в изократическом режиме 0,2 M раствором фосфата, pH 7,0 со скоростью 1 мл/мин. Детекцию осуществляют путем измерения поглощения при 280 нм (см. фиг. 18).

Гель-хроматограммы, приведенные на фиг. 18, демонстрируют, что контроль Fab-X (VR4247) дает основной пик, составляющий 92% от общей площади пиков, и характеризующийся временем удерживания 8,610 метрических минут. Контроль Fab-Y (VR4248) дает основной пик, составляющий 94% от общей площади пиков, и характеризующийся временем удерживания 10,767 метрических минут. По значениям времени удерживания, измеренным для контрольных соединений Fab-X и Fab-Y, определяют кажущуюся молекулярную массу, составляющую 95 кДа и 35 кДа, соответственно, с помощью стандартной кривой, полученной с использованием значений врмени удерживания стандартов для гель-фильтрации BioRad (151-1901), элюируемых в тех же условиях. Полученные значения кажущейся молекулярной массы согласуются с ожидаемыми значениями кажущейся молекулярной массы для молекул Fab-scFv и Fab-пептид. Основной пик смеси Fab-X (VR4247)/Fab-Y (VR4248) имеет время удерживания 9,289 метрических минут. По времени удерживания определяют кажущуюся молекулярную массу 187 кДа, как описано выше. Указанное значение кажущейся молекулярной массы согласуется со значением кажущейся молекулярной массы, ожидаемым для пары Fab-X (VR4247) с Fab-Y (VR4248). Основной пик также составляет 84% от общей площади пиков, свидетельствуя о том, что большая часть Fab-X (VR4247) и Fab-Y (VR4248) образует биспецифический белковый комплекс 1:1. Небольшое дополнительное плечо и пик, который элюируется после основного пика, соответствуют исходным соединениям Fab-X (VR4247) и Fab-Y (VR4248).

Эксперимент 2

Очищенные Fab-X (VR4130) и Fab-Y (VR4131) смешивают в молярном соотношении один к одному, с достижением концентрации общего белка 500 мкг/мл. Аликвоты полученной смеси разводят PBS, pH 7,4, до концентрации 50 мкг/мл и 5 мкг/мл. Также получают контрольные образцы, содержащие отдельные компоненты смеси в той же концентрации, в котрой они находятся в смеси с концентрацией общего белка 500 мкг/мл. Все смеси и контроли инкубируют в течение ночи при температуре окружающей среды. Аликвоты всех образцов и контролей объемом 100 мкл вводят на колонку TSKgel G3000SWXL; 5 мкм, 7,8×300 мм, и элюируют в изократическом режиме 0,2 M раствором фосфата, pH 7,0, со скоростью 1 мл/мин. Детекцию проводят путем измерения поглощения при 214 нм (см. фиг. 19, фиг. 20 и таблицу 11).

Гель-хроматограммы, приведенные на фиг. 19, демонстрируют, что контроль Fab-X (VR4130) дает основной пик, составляющий 91% от общей площади пиков, и характеризующийся временем удерживания 8,634 метрических минут. Контроль Fab-Y (VR4131) дает основной пик, составляющий 97% от общей площади пиков, и характеризующийся временем удерживания 9,361 метрических минут. По значениям времени удерживания, измеренным для контрольных соединений Fab-X и Fab-Y, определяют кажущуюся молекулярную массу, составляющую 109 кДа и 55 кДа, соответственно, с помощью стандартной кривой, полученной с использованием значений врмени удерживания стандартов для гель-фильтрации BioRad (151-1901), элюируемых в тех же условиях. Полученные значения кажущейся молекулярной массы согласуются с ожидаемыми значениями кажущейся молекулярной массы для молекул Fab-scFv и Fab-пептид. Основной пик смеси Fab-X (VR4130)/Fab-Y (VR4131) имеет время удерживания 8,016 метрических минут. По времени удерживания определяют кажущуюся молекулярную массу 198 кДа, как описано выше. Указанное значение кажущейся молекулярной массы согласуется со значением кажущейся молекулярной массы, ожидаемым для пары Fab-X (VR4130) с Fab-Y (VR4131). Основной пик также составляет 82% от общей площади пиков, свидетельствуя о том, что большая часть Fab-X (VR4130) и Fab-Y (VR4131) образует комплекс 1:1. Два небольших пика, которые элюируются после основного пика, соответствуют исходным соединениям Fab-X (VR4130) и Fab-Y (VR4131).

На фиг. 20 приведены гель-хроматограммы для смесей Fab-X (VR4130)/Fab-Y (VR4131) 1:1 концентрацией 500 мкг/мл, 50 мкг/мл и 5 мкг/мл. Все кривые являются подобными и имеют соответствующие образцам пики с близкими значениями времени удерживания, относительной высоты пиков и площади под кривой. Значения процентов площадей под кривыми сравнивают в таблице 11, где % каждого пика остается фактически постоянным при разбавлении смеси. Это свидетельствует о том, что комплекс Fab-X/Fab-Y 1:1 остается в виде комплекса при всех тестируемых концентрациях. 75% Fab-X и Fab-Y присутствуют в виде комплекса 1:1, даже если смесь разбавляют до 5 мкг/мл, что эквивалентно концентрации комплекса 40 нМ.

Таблица 11: Значения процентов площадей под кривыми гель-хроматограмм для смесей Fab-X (VR4130)/Fab-Y (VR4131) с молярным соотношением 1:1 при концентрации 500 мкг/мл, 50 мкг/мл и 5 мкг/мл. Пики детектируют путем измерения поглощения при 214 нм.

Концентрация	% Площади под кривой
мкг/мл	нМ	Комплекс Fab-X (VR4130)/Fab-Y (VR4131) 1:1	Fab-X (VR4130)	Fab-Y (VR4131)
500	4000	82%	4%	5%
50	400	81%	11%	3%
5	40	75%	21%	3%

Следовательно, результаты данных экспериментов свидетельствуют о том, что высокая доля слитых белков Fab-X и Fab-Y образует целевые биспецифические комплексы, в виде мономеров остается их незначительная часть, а образование гомодимеров не наблюдается.

Пример 12: Матричный скрининг больших панелей гетеродимер-связанных белковых комплексов с целью идентификации новых мишеней биспецифических антител.

Введение: После успешного подтверждения формата биспецифического комплекса и способа скрининга в предыдущих примерах, скрининг расширяют для охвата большего числа пар антигенов. Получают набор пар вариабельных (V) участков антител против 23 разных антигенов, экспрессирующихся на B-клетках. Используя формат Fab-Kd-Fab [т.е. A-X:Y-B, где A и B представляют собой фрагменты Fab], получают массив гетеродимер-связанных белковых комплексов, содержащий множество сочетаний V-участков для каждого из 315 разных сочетаний пар антигенов. Указанные сочетания подвергают скринингу на способность модулировать сигнальный путь BCR (B-клеточного рецептора) с помощью высокопроизводительного анализа методом проточной цитометрии, чтобы выбрать новые пары мишеней для воздействия на них биспецифического антитела.

Иммунизация: ДНК, кодирующую выбранные антигены, получают путем генного синтеза или из коммерческих источников и клонируют в векторе экспрессии, содержащем сильный конститутивный промотор. Затем плазмидную ДНК трансфицируют в кроличьи фибробласты Rab-9 (ATCC® CRL-1414™), используя систему электропорации собственного производства. Через двадцать четыре часа клетки проверяют на экспрессию антигена методом проточной цитометрии, аликвоты замораживают в жидком азоте и хранят до применения. Иммунизацию проводят, используя до 6 антигенов на одного кролика, либо путем совместной экспрессии на одной клетке, либо путем получения смесей однократно или многократно трансфицированных клеток. Кроликов иммунизируют 3 дозами клеток.

Обнаружение антител: Культуры B-клеток получают по способу, описанному в Zubler et al. (1985). Коротко говоря, B-клетки, полученные из селезенки или PBMC иммунизированных кроликов, культивируют при плотности примерно 2000-5000 клеток на лунку в 96-луночных планшетах для культивирования тканей со штрих-кодом, содержащих 200 мкл/лунку среды RPMI 1640 (Gibco BRL), дополненной 10% FCS (PAA laboratories ltd), 2% HEPES (Sigma Aldrich), 1% L-глутамина (Gibco BRL), 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco BRL), 0,1% β-меркаптоэтанола (Gibco BRL), 3% супернатанта культуры активированных спленоцитов, и гамма-облученные мутантные клетки мышиной тимомы EL4 (5×10⁴/лунку) в течение семи дней при 37°C в атмосфере 5% CO₂.

Присутствие антиген-специфических антител в супернатантах культур B-клеток определяют с помощью гомогенного флуоресцентного анализа связывания, используя клетки HEK293, совместно трансфицированные антигенами, которые использовались для иммунизации кроликов. Скрининг проводят путем переноса 10 мкл супернатанта из 96-луночных планшетов для культивирования тканей со штрих-кодом в 384-луночные аналитические планшеты с черными стенками со штрих-кодом, содержащие клетки HEK293, трансфицированные целевым антигеном (примерно 3000 клеток/лунку), используя жидкостный обработчик Matrix Platemate. Связывание детектируют с помощью конъюгата козьего антитела против кроличьих IgG с Fcγ-специфическим Cy-5 (Jackson). Планшеты прочитывают с помощью системы для детекции клеток Applied Biosystems 8200.

После первичного скрининга положительные супернатанты помещают на 96-луночные рабочие планшеты со штрих-кодом с помощью робота, выбирающего нужные образцы, Aviso Onyx, и затем B-клетки в планшетах для культур клеток замораживают при -80°C. Затем рабочие планшеты подвергают скринингу путем гомогенного флуоресцентного анализа связывания с использованием клеток HEK293, трансфицированных отдельно антигенами и гранулами Superavidin™ (Bangs Laboratories), покрытыми рекомбинантным белком в качестве источника антигена. Анализ проводят с целью определения антигенной специфичности в каждой лунке.

Чтобы выделить гены вариабельных участков антител из ряда представляющих интерес лунок, проводят стадию деконволюции с целью идентификации антиген-специфичных B-клеток в конкретной лунке, которая содержит гетерогенную популяцию B-клеток. Идентификацию можно осуществить путем обнаружения очагов флуоресценции (Clargo et al., 2014.Mabs 2014 Jan 1: 6(1) 143-159; EP1570267B1). Коротко говоря, иммуноглобулин-секретирующие B-клетки из положительных лунок смешивают с клетками HEK293, трансфицированными либо антигеном-мишенью, либо стрептавидиновыми гранулами (New England Biolabs), покрытыми биотинилированным антигеном-мишенью, и конъюгатом козьего антитела против кроличьего фрагмента Fcγ с FITC в конечном разведении 1:1200 (Jackson). После стационарной инкубации при 37°C в течение 1 часа антиген-специфичные B-клетки можно идентифицировать по наличию флуоресцентного ореола вокруг таких B-клеток. Ряд указанных отдельных клонов B-клеток, идентифицированных с помощью микроскопа Olympus, отбирают с помощью микроманипулятора Eppendorf и помещают в пробирку для ПЦР. Метод с обнаружением очагов флуоресценции также используют для идентификации антиген-специфичных B-клеток из гетерогенной популяции B-клеток, полученной непосредственно из костного мозга иммунизированных кроликов.

Гены вариабельных участков антител выделяют из отдельных клеток методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), используя праймеры, специфичные к вариабельным участкам тяжелых и легких цепей. Проводят два цикла ПЦР, используя гнездовую двойную ПЦР для включения участков рестрикции по 3ʹ и 5ʹ концам, обеспечивающих клонирование вариабельного участка в векторах млекопитающих, обеспечивающих экспрессию мышиного Fab-X и Fab-Y (VH) или мышиной цепи каппа (VL). Конструкции тяжелых и легких цепей для векторов экспрессии Fab-X и Fab-Y совместно трансфицируют в клетки HEK-293, используя Fectin 293 (Life Technologies), или в клетки Expi293, используя Expifectamine (Life Technologies), и проводят экспрессию рекомбинантного антитела в 6-луночных планшетах для тканевых культур в объеме 5 мл. После экспрессии в течение 5-7 дней собирают супернатанты. Супернатанты тестируют с помощью гомогенного флуоресцентного анализа связывания на клетках HEK293, трансфицированных антигеном и гранулами Superavidin™ (Bangs Laboratories), покрытыми рекомбинантным белком, или на клетках HEK, трансфицированных антигеном. Анализ проводят, чтобы подтвердить специфичность клонированных антител.

Мелкомасштабная продукция Fab A-X и Fab B-Y (мелкомасштабная (50 мл) трансфекция Expi293)

Клетки Expi293 субкультивируют обычным способом в среде для экспрессии Expi293™ до достижения конечной концентрации 0,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл и инкубируют в инкубаторе с орбитальным встряхиванием (Multitron, Infors HT) при 120 об/мин, 8% CO₂ и 37°C.

В день трансфекции измеряют жизнеспособность и концентрацию клеток с помощью автоматического цитометра (Vi-CELL, Beckman Coulter). Чтобы достичь конечной концентрации 2,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, соответствующий объем клеточной суспензии добавляют в стерильную встряхиваемую колбу Эрленмейера объемом 250 мл и доводят до объема 42,5 мл путем добавления свежей, предварительно нагретой среды для экспрессии Expi293™, на каждые 50 мл смеси для трансфекции.

Чтобы получить комплексы липид-ДНК для каждой трансфекции всего 50 мкг плазмидных ДНК, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь, разводят в среде Opti-MEM® I (LifeTechnologies) до общего объема 2,5 мл и 135 мкл реагента ExpiFectamine™ 293 (LifeTechnologies) разводят в среде Opti-MEM® I до общего объема 2,5 мл. Все разведенные образцы осторожно перемешивают и инкубируют в течение не более 5 минут при комнатной температуре, после чего каждый раствор ДНК добавляют к соответственно разведенному реагенту ExpiFectamine™ 293 с получением общего объема 5 мл. Смеси ДНК-реагент ExpiFectamine™ 293 осторожно перемешивают и инкубируют в течение 20-30 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить образование комплексов ДНК-реагент ExpiFectamine™ 293.

После завершения инкубации комплекса ДНК-реагент ExpiFectamine™ 293, 5 мл комплекса ДНК-реагент ExpiFectamine™ 293 добавляют в каждую встряхиваемую колбу. Встряхиваемые колбы инкубируют в инкубаторе с орбитальным встряхиванием (Multitron, Infors HT) при 120 об/мин, 8% CO₂ и 37°C.

Примерно через 16-18 часов после трансфекции в каждую встряхиваемую колбу добавляют 250 мкл усилителя трансфекции ExpiFectamine™ 293 1 (LifeTechnologies) и 2,5 мл усилителя трансфекции ExpiFectamine™ 293 2 (LifeTechnologies).

Клеточные культуры собирают через 7 дней после трансфекции. Клетки переносят в центрифужные пробирки объемом 50 мл (Falcon), центрифугируют в течение 30 мин при 4000 об/мин и затем стерилизуют фильтрацией через фильтр Stericup 0,22 мкм (Merck Millipore). Осветленные и стерилизованные фильтрованием супернатанты хранят при 4°C. Конечные уровни экспрессии определяют методом ВЭЖХ с использованием белка G.

Мелкомасштабная (50 мл) очистка: Fab-X и Fab-Y очищают по отдельности путем аффинного улавливания, используя мелкомасштабную вакуумную систему очистки. Коротко говоря, 50 мл культуральных супернатантов стерилизуют фильтрованием через фильтр 0,22 мкм и затем добавляют 500 мкл гранул Ni-сефарозы (GE Healthcare). Смесь супернатанта с гранулами перемешивают переворачиванием в течение примерно одного часа, после чего супернатант удаляют с помощью вакуума. Гранулы промывают раствором для промывания 1 (50 мМ фосфат натрия, 1 M NaCl, pH 6,2) и раствором для промывания 2 (0,5 M NaCl). Для элюирования используют 50 мМ ацетат натрия, pH 4,0,+1M NaCl. В элюированных фракциях буфер заменяют на PBS (Sigma), pH7,4, и фильтруют через фильтр 0,22 мкм. Полученные объединенные фракции анализируют путем измерения поглощения A280, методом SE-UPLC (BEH200), методом SDS-PAGE (восстанавливающим и не восстанавливающим), а также на эндотоксин, используя систему PTS Endosafe.

Анализы, используемые для скрининга

Донорные PBMC быстро оттаивают с помощью водяной бани, установленной на 37°C, и осторожно переносят в пробирку Falcon объемом 50 мл. Затем их разбавляют по каплям до 5 мл средой для анализа, чтобы минимизировать осмотический шок. После этого клетки осторожно разбавляют до 20 мл, и затем, добавляя в качестве разбавителя конечную среду, доводят объем до 50 мл. Клетки центрифугируют при 500 g в течение 5 минут, супернатант удаляют, а клетки ресуспендируют в 1 мл среды. Затем клетки считают, разбавляют до концентрации 1,66×10⁶ клеток/мл и распределяют по 30 мкл на лунку в планшет TC с V-образным дном, с получением конечной концентрации, используемой в анализе, 5,0×10⁴ клеток/лунку. После этого планшет с клетками накрывают и хранят до применения в инкубаторе при 37°C, 5% CO₂, давая клеткам отдохнуть в течение, по меньшей мере, 1 часа.

Реагенты Fab-X и Fab-Y смешивают в эквимолярном соотношении при 5x конечной используемой в анализе концентрации в среде для анализа и инкубируют в течение 90 мин при 37°C, 5% CO₂. Образцы получают в 96-луночном полипропиленовом планшете с U-образным дном, который инкубируют в накрытом состоянии.

10 мкл смеси 5x Fab-KD-Fab добавляют в соответствующие экспериментальные лунки, содержащие клетки, перемешивают путем встряхивания при 1000 об/мин в течение 30 сек и инкубируют в течение 90 мин при 37°C, 5% CO₂.

Клетки стимулируют путем добавления 10 мкл антитела против человеческого IgM. Конечная, используемая в анализе, концентрация стимула варьирует в зависимости от результатов анализа панели, три смеси антител, A, B и C (описанные ниже), используют в анализе в конечной концентрации 50 мкг/мл (смеси A и C) или 25 мкг/мл (смесь B). Затем содержимое аналитических планшетов осторожно перемешивают при 1000 об/мин в течение 30 сек и инкубируют при 37^°C, 5% CO₂ в течение 5 мин (смеси антител A и C) или 2 мин (смесь антител B). Анализ останавливают путем добавления во все лунки 150 мкл охлажденного на льду BD CytoFix с последующей инкубацией в течение 15 мин при КТ. Фиксированные клетки центрифугируют при 500 g в течение 5 мин, чтобы осадить клетки, и удаляют супернатант, используя устройство для мойки планшетов BioTek ELx405. Осадок ресуспендируют путем перемешивания содержимого планшета на вортексе при 2400 об/мин в течение 30 сек. Затем клетки пермеабилизируют при 4°C путем добавления 100 мкл охлажденного на льду буфера для пермеабилизации III BD Cell в течение 30 мин. Затем клетки промывают 100 мкл буфера FACS и центрифугируют при 500 g в течение 5 мин. Супернатант снова удаляют с помощью ELx405, который затее используют для быстрого распределения 200 мкл буфера FACS, чтобы отмыть оставшийся буфер для пермеабилизации. Клетки снова центрифугируют при 500 g, после чего супернатант удаляют путем переворачивания. Во время предшествующей стадии центрифугирования получают смесь антител в буфере FACS держат ее в защищенном от света месте. Затем клетки ресуспендируют путем перемешивания на вортексе (2400 об/мин, 30 сек) и добавляют 20 мкл смеси антител во все лунки, после чего планшет встряхивают в течение 30 сек при 1000 об/мин. Затем клетки инкубируют в течение 60 мин при КТ в темноте.

Клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS путем центрифугирования при 500 g с удалением супернатанта после каждой стадии. По завершению промывания клетки ресуспендируют путем перемешивания на вортексе в течение 30 сек при 2400 об/мин и затем добавляют последние 20 мкл буфера FACS. Планшет (планшеты) прочитывают на приборе Intellicyt HTFC/iQue.

Буфер FACS=PBS+1% BSA+0,05% NaN₃+2 мМ EDTA

Смесь антител A=1:2 CD20 PerCp-Cy5.5 (BD Biosciences)+1:5 PLCγ2 AF88+1:10 Akt AF647+1:50 ERK1/2 PE (разведенная буфером FACS).

Смесь антител B=1:2 CD20 PerCp-Cy5.5 (BD Biosciences)+1:5 Syk PE+1:5 BLNK AF647 (разведенная буфером FACS).

Смесь антител C=1:5 CD20 PerCp-Cy5.5 (Biolegend)+1:5 PLCγ2 AF488+1:10 Akt AF647+1:5 Syk PE (разведенная буфером FACS).

Реагент	Поставщик	Номер по каталогу
Антитело против человеческого IgM	Southern Biotech	2022-14
CytoFix	BD Biosciences	554655
Буфер Perm III	BD Biosciences	558050
Антитело против Akt (pS473) AF647	BD Biosciences	561670
Антитело против SYK (pY348) PE	BD Biosciences	558529
Антитело против PLCγ2 (pY759) AF488	BD Biosciences	558507
Антитело против BLNK(pY84) AF647	BD Biosciences	558443
Антитело против ERK1/2 (pT202/pY204) PE	BD Biosciences	561991
Антитело против человеческого CD20 PerCp-Cy5.5	BD Biosciences	558021
Антитело против человеческого CD20 AF488	BD Biosciences	558056
Антитело против человеческого CD20 PerCp-Cy5.5	Biolegend	340508
Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS)	Fisher Scientific	10562765
RPMI 1640	Life Technologies	31870
Фетальная телячья сыворотка (FCS)	Life Technologies	16140
Глутамакс	Life Technologies	35050
Пенициллин/стрептомицин (P/S)	Life Technologies	15070
EDTA	Sigma	03690
Азид натрия (NaN3)	Sigma	S2002
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Sigma	A1470

Сочетания Fab-X+Fab-Y подвергают скринингу, используя смеси антител A и B, или только смесь C. Все скрининги проводят на колбочковых клетках, полученных от 2 разных доноров крови. Данные получают и анализируют с помощью коммерчески доступного программного обеспечения. Всего 2500 сочетаний Fab-X+Fab-Y подвергают сринингу против 315 разных сочетаний антигенов.

Результаты

В данном примере рассчитывают процент ингибирования индукции фосфорилирования каскадных белков сигнального пути BCR под действием каждого сочетания Fab-Kd-Fab [т.е. A-X:Y-B, где A и B представляют собой фрагменты Fab] с целью поиска новых сочетаний антигенов, ингибирующих функцию B-клеткок, причем за критерий положительного результата для сочетания принимают, по меньшей мере, 30% ингибирование, по меньшей мере, двух значений фосфорилирования под действием, по меньшей мере, одного сочетания V-участков. В соответствии с данным порогом, требуемому критерию удовлетворяют 11 новых пар сочетаний антигенов из 315 тестируемых пар. Это соответствует степени "попадания" 3,5%, что свидетельствует о важном значении скрининга большого числа сочетаний для поиска желательной активности.

На фиг. 21-23 показаны результаты перекрестной специфичности в отношении массива антигенов. Приведенные значения выражают процент ингибирования (имеют отрицательное значение при активации) фосфорилирования Syk, PLCg2 и AKT, соответственно, и представляют собой средние значения, полученные путем анализа нескольких сочетаний V-участков. В результате тестирования 315 разных сочетаний антигенов можно видеть, что влияние разных сочетаний антител на сигнальный путь BCR сильно варьирует, от интенсивного ингибирования, например, антигена 2 в Fab-X, объединенного с антигенами 3 и 4 в Fab-Y (ингибирование 69,66% и 70,4% фосфо-Syk, фиг. 21) до активации, например, антигена 6 в X и антигена 11 в Y (минус 118,10% фосфо-Syk, фиг. 21).

Каждое значение, представляющее собой значение среднего %, приведенное на фиг. 21-23, показано для антигена 2 в Fab-X и антигена 3 в Fab-Y на фиг. 24. В данном случае анализируют 23 разных сочетаний разных V-участков антител. Такое же сочетание антигенов, но в другой ориентации, т.е. антиген 2 в Fab-Y и антиген 3 в Fab-X, показано на фиг. 25. В данном случае анализируют 9 разных сочетаний разных V-участков антител. Все V-участки вызывают ингибирование, однако данный способ также можно успешно использовать для выбора оптимальных сочетаний V-участков.

Подобным образом, каждое значение, представляющее собой значение среднего %, приведенное на фиг. 21-23, показано для антигена 2 в Fab-X и антигена 4 в Fab-Y на фиг. 26. В данном случае анализируют 10 разных сочетаний разных V-участков антител. Такое же сочетание антигенов, но в другой ориентации, т.е. антиген 2 в Fab-Y и антиген 4 в Fab-X, показано на фиг. 27. В данном случае анализируют 6 разных сочетаний разных V-участков антител. Опять же, все V-участки вызывают ингибирование, однако с помощью данного способа можно идентифицировать и выбрать оптимальные сочетания V-участков.

Пример 13. Анализ временно экспрессированных гетеродимер-связанных белковых комплексов с целью определения, действительно ли с помощью скрининга массива FabA-X:Y-FabB можно идентифицировать новые мишени биспецифических антител, не прибегая к очистке белка

Введение: V-участки против 2 разных антигенов, 2 и 3, ингибирующие B-клеточный сигнальный путь как биспецифическое антитело, которые были идентифицированы с использованием формата Fab-Kd-Fab [FabA-X:Y-FabB] и скрининга массива гетеродимер-связанных белковых комплексов, временно экспрессируют в виде FabA-X и FabB-Y. Сравнивают активность временно экспрессированных (без последующей очистки) и сочетания очищенных FabA-X и FabB-Y, чтобы определить, можно ли проводить скрининг массива, используя непосредственно продукты временной экспрессии вместо очищенных компонентов.

Иммунизация: Получение антиген-экспрессирующих клеток и иммунизацию кроликов проводят по способу, описанному в примере 12.

Обнаружение антител

Культуры B-клеток получают по способу, описанному в примере 12.

Скрининг антиген-специфичных антител в супернатантах культур B-клеток и стадию деконволюции с целью идентификации антиген-специфичных B-клеток проводят по способу, описанному в примере 12.

Гены вариабельных участков антител выделяют из отдельных клеток методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), используя праймеры, специфичные к вариабельным участкам тяжелых и легких цепей. Проводят два цикла ПЦР, используя гнездовую двойную ПЦР для включения участков рестрикции по 3ʹ и 5ʹ концам, обеспечивающих клонирование вариабельного участка в векторах млекопитающих, обеспечивающих экспрессию мышиного Fab-X и Fab-Y (VH) или мышиной цепи каппа (VL). Затем проводят тройную ПЦР с целью получения отдельных транскрипционно активных ПЦР-фрагментов (TAP), кодирующих тяжелые и легкие цепи, с использованием сочетания амплифицированных вариабельных участков, фрагмента человеческого промотора CMV и кроличьего константного участка тяжелой цепи гамма 1 или фрагмента кроличьего константного участка каппа. Полученные ДНК-фрагменты используют непосредственно для рекомбинантной экспрессии кроличьего полноразмерного антитела IgG в клетках HEK-293 с использованием 293Fectin (Life Technologies) или в клетках Expi293 с использованием Expifectamine (Life Technologies).

Полученные рекомбинанатные антитела подвергают скринингу на способность связываться с антигеном с помощью гомогенного флуоресцентного анализа связывания на клетках HEK293, трансфицированных антигеном и гранулами Superavidin™ (Bangs Laboratories), покрытыми рекомбинантным белком. После подтверждения специфичности с использованием полученных путем временной экспрессии TAP, гены антител клонируют в векторах, обеспечивающих экспрессию Fab-X и Fab-Y. Конструкции, кодирующие тяжелые и легкие цепи, совместно трансфицируют в клетки HEK-293, используя Fectin 293 (Life Technologies), или в клетки Expi293, используя Expifectamine (Life Technologies), и проводят экспрессию рекомбинантного антитела в 6-луночных планшетах для тканевых культур в объеме 5 мл. После экспрессии в течение 5-7 дней собирают супернатанты. Супернатанты тестируют с помощью гомогенного флуоресцентного анализа связывания на клетках HEK293, трансфицированных антигеном и гранулами Superavidin™ (Bangs Laboratories), покрытыми рекомбинантным белком, или на клетках HEK, трансфицированных антигеном. Анализ проводят, чтобы подтвердить специфичность клонированных антител.

Получение супернатантов, содержащих продукты временной экспрессии Fab-X и Fab-Y

Для получения супернатантов, содержащих продукты временной экспрессии Fab-X и Fab-Y, проводят трасфекцию клеток Expi293 по способу, описанному в примере 12.

Получение очищенных Fab-X и Fab-Y

Суспензию клеток CHOSXE заранее адаптируют к среде CDCHO (Invitrogen), содержащей 2 мМ (100x) глютамакс. Клетки поддерживают в фазе логарифмического роста, встряхивая при 140 об/мин на шейкере-инкубаторе (Kuner AG, Birsfelden, Switzerland) и культивируют при 37°C в атмосфере 8% CO₂.

Перед трансфекцией определяют число и жизнеспособность клеток с помощью цитометра CEDEX (Innovatis AG. Bielefeld, Germany), нужное число клеток (2×10⁸ клеток/мл) переносят в центрифужные конические пробирки и центрифугируют при 1400 об/мин в течение 10 минут. Осажденные клетки ресуспендируют в стерильном сбалансированном солевом растворе Эрла и центрифугируют при 1400 об/мин еще 10 минут. Супернатант отбрасывают, а осадки ресуспендируют с получением желательной плотности клеток.

ДНК-вектор разводят до конечной концентрации 400 мкг на 2×10⁸ клеток/мл, 800 мкл полученного разведения вносят пипеткой в кюветы (Biorad) и проводят электропорацию, используя систему для электропорации собственного производства.

Трансфицированные клетки переносят непосредственно в колбы Эрленмейера 1×3 л, содержащие среду ProCHO 5, обогащенную 2 мМ глутамаксом и антибиотическим антимитотическим раствором (100×) (1 к 500), после чего клетки культивируют в шейкере-инкубаторе Kuhner при 37°C, 5% CO₂, встряхивая при 140 об/мин. Через 24 часа после трансфекции добавляют пищевую добавку 2 г/л ASF (AJINOMOTO), температуру уменьшают до 37°C и культивируют в течение еще 13 дней. На четвертый день к культуре добавляют 3 мМ бутират натрия (натриевая соль н-масляной кислоты, Sigma B-5887).

На 14 день культуры переносят в пробирки и после центрифугирования в течение 30 минут при 4000 об/мин супернатант отделяют от клеток. Оставшиеся супернатанты фильтруют через фильтр SARTOBRAN® P Millipore с размером пор 0,22 мкм и затем через золотые фильтры Gamma 0,22 мкм. Конечные уровни экспрессии определяют методом ВЭЖХ на G-белке.

Fab-A и Fab-B очищают путем аффинного улавливания с использованием систем AKTA Xpress и колонок HisTrap Excel, заполненных никель-содержащей смолой (GE Healthcare). Культуральные супернатанты стерилизуют фильтрованием через фильтры 0,22 мкм, при необходимости значение pH доводят до нейтрального слабой кислотой или слабым основанием, после чего супернатанты загружают на колонки. Стадию повторного промывания с использованием 15-25 мМ имидазола проводят для вытеснения с никель-содержащей смолы любых слабо связанных белков клеток-хозяев/соединений, неспецифически связывающих His. Элюирование проводят с использованием 10 мМ фосфата натрия, pH 7,4,+1 M NaCl+250 мМ имидазол и собирают фракции объемом 2 мл. После одного объема колонки элюирование приостанавливают на 10 минут, чтобы сузить пик и затем уменьшают общий объем элюирования. Самые чистые фракции объединяют, заменяют буфер на PBS (Sigma), pH 7,4, и фильтруют через фильтр 0,22 мкм. Полученные объединенные фракции анализируют путем измерения A280, методом SE-ВЭЖХ (метод G3000), методом SDS-PAGE (восстанавливающим и не восстанавливающим), а также на эндотоксин с использованием системы PTS Endosafe.

Функциональные анализы

Анализ маркеров активации: Антиген 2-специфичный Fabʹ-Y и антиген 3-специфичный Fabʹ-X, либо очищенные, либо в составе супернатанта, содержащего продукты временной экспрессии, инкубируют вместе в течение 60 минут (при 37°C и 5% CO₂) в эквимолярных концентрациях. Сочетания титруют, начиная с исходной молярности 185 нМ, с серийными разведениями 1:4. В анализе также используют пустой супернатант, проводя титрование от чистого образца. В лунки 96-луночных планшетов с V-образным дном добавляют 1,5×10⁵ PBMC и затем титруемые сочетания Fabʹ-X и Fabʹ-Y или пустой супернатант. Сочетания и клетки инкубируют вместе в течение 90 минут. По завершении данного периода B-клетки активируют путем добавления 12,5 мкг/мл козьего F(abʹ)₂ против человеческого IgM (Southern Biotechnology) с последующей инкубацией в течение 24 часов при 37°C и 5% CO₂.

В лунки добавляют 100 мкл охлажденного на льду буфера FACS (PBS+1% BSA+0,1% NaN₃+2 мМ EDTA), затем планшеты герметично закрывают, покрывают водным льдом и держат в течение примерно 15 минут, после чего центрифугируют при 500 g в течение 5 минут при 4°C. Избыток супернатанта отделяют от клеточных осадоков и затем планшеты встряхивают при 2000 об/мин в течение 30 секунд.

Клетки окрашивают смесью флуоресцентно меченных антител против CD19, против CD20 и против CD71 (BD Biosciences). Планшеты быстро встряхивают и инкубируют в течение 1 часа на водном льду в темноте. По завершении данного периода планшеты промывают дважды и ресуспендируют в 20 мкл буфера FACS. Экспрессию CD19, CD20 и CD71 в клетках измеряют с помощью проточного цитометра Intellicyt iQUE® Screener.

С помощью пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) идентифицируют B-клетки как отличающиеся от других клеточных популяций и рассчитывают среднее геометрическое уровней CD71 для каждой лунки. Затем все данные выражают в виде процента ингибирования максимального ответа (только антитело против IgM) минус фоновый уровень (только клетки).

Анализ PhosFlow: Антиген 2-специфичный Fabʹ-Y и антиген 3-специфичный Fabʹ-X, либо очищенные, либо в составе супернатанта, содержащего продукты временной экспрессии, инкубируют вместе в течение 60 минут (при 37°C и 5% CO₂) в эквимолярных концентрациях. Сочетания титруют, начиная с исходной молярности 185 нМ, с серийными разведениями 1:4. В анализе также используют пустой супернатант, проводя титрование от чистого образца. В лунки 96-луночных планшетов с V-образным дном добавляют 5,0×10⁴ PBMC и затем титруемые сочетания Fabʹ-X и Fabʹ-Y или пустой супернатант. Сочетания и клетки инкубируют вместе в течение 90 минут. По завершении данного периода B-клетки активируют путем добавления 25 мкг/мл козьего F(abʹ)₂ против человеческого IgM (Southern Biotechnology) с последующей инкубацией в течение 15 мин при 37°C и 5% CO₂. Реакцию передачи сигнала останавливают путем добавления равного объема буфера Cytofix (BD Biosciences). После этого планшеты держат при комнатной температуре в течение 15 минут и затем центрифугируют при 500 g в течение 5 минут. Избыток супернатанта отделяют от клеточного осадка, который ресуспендируют в буфере FACS (PBS+1% BSA+0,01% NaN₃+2 мМ EDTA) и промывают еще один раз. Затем клетки ресуспендируют в охлажденном на льду буфере Perm III (BD Biosciences), держат в течение 30 минут и промывают дважды проточным буфером.

Клетки окрашивают флуоресцентно меченным антителом против CD20 (BD Biosciences) и антителом против фосфорилированного p38, которое распознает консервативный участок двойного фосфорилирования pT180/pY182. Затем содержимое планшетов ресуспендируют и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. По завершении данного периода планшеты промывают еще два раза и ресуспендируют в 20 мкл буфера FACS. Экспрессию CD20 и фосфо-p38 в клетках измеряют с помощью проточного цитометра Intellicyt iQUE^®.

С помощью пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) идентифицируют B-клетки как отличающиеся от других клеточных популяций и рассчитывают среднее геометрическое уровней p38 для каждой лунки. Затем все данные выражают в виде процента ингибирования максимального ответа (только антитело против IgM) минус фоновый уровень (только клетки).

Результаты

Анализ маркеров активации: Как можно видеть на фиг. 28, результаты демонстрируют, что сочетание антигена 3 с антигеном 2, как в виде очищенных соединений, так и в составе супернатанта, содержащего продукты временной экспрессии, способно ингибировать экспрессию CD71 на B-клетках, стимулированных антителом против IgM.

Анализ PhosFlow: Результаты, приведенные на фиг. 29, демонстрируют, что сочетание антигена 3 с антигеном 2, как в виде очищенных соединений, так и в составе супернатанта, содержащего продукты временной экспрессии, способно ингибировать фосфорилирование p38 в B-клетках, стимулированных антителом против IgM.

Удивительная способность к образованию биспецифических комплексов настоящего изобретения непосредственно в культурах, временно экспрессирующих компоненты комплексов, не требующая очистки, позволяет проводить скрининг биспецифических комплексов даже с более высокой пропускной способностью, чем при использовании очищенных компонентов.

Пример 14 - Скрининг временно экспрессированных V-участков против антигена 3 в виде Fab-X с использованием очищенного антитела против антигена 2 Fab-Y в гетеродимер-связанных белковых комплексах с целью выбора оптимальных V-участков антител против антигена 3

Введение: Новые V-участки против антигена 3, которые ингибируют B-клеточные сигнальные пути в виде биспецифического антитела в сочетании с антиген 2-специфичными V-участками, идентифицируют, используя матричный скрининг гетеродимер-связанных белковых комплексов. V-участки против антигена 3 временно экспрессируют в виде Fab-X и объединяют с очищенным антителом против антигена 2 Fab-Y. Измеряют ингибирование активации сигнального пути в B-клетках, чтобы выбрать наиболее активные V-участки против антигена 3 и антигена 2.

Получение антиген-экспрессирующих клеток и иммунизацию кроликов проводят по способу, описанному в примере 12.

Обнаружение антител: Культуры B-клеток получают по способу, описанному в примере 12.

Скрининг антиген-специфичных антител в супернатантах культур B-клеток и стадию деконволюции с целью идентификации антиген-специфичных B-клеток проводят по способу, описанному в примере 12.

Дополнительные вариабельные участки идентифицируют, используя метод обнаружения очагов флуоресценции в культуре B-клеток, полученных непосредственно из селезенки и костного мозга иммунизированных мышей. Коротко говоря, клетки с конечной плотностью от 4×10⁵ до 8×10⁵ клеток/мл смешивают со стрептавидиновыми гранулами (New England Biolabs), покрытыми биотинилированным антигеном, и конъюгатом козьего антитела против мышиного фрагмента Fcγ с FITC в конечном разведении 1:1200 (Jackson). После стационарной инкубации при 37°C в течение 1 часа антиген-специфичные B-клетки можно идентифицировать по наличию флуоресцентного ореола вокруг таких B-клеток. Ряд указанных отдельных клонов B-клеток, идентифицированных с помощью микроскопа Olympus, отбирают с помощью микроманипулятора Eppendorf и помещают в пробирку для ПЦР.

Гены вариабельных участков антител выделяют из отдельных клеток методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), используя праймеры, специфичные к вариабельным участкам тяжелых и легких цепей. Проводят два цикла ПЦР, используя гнездовую двойную ПЦР для включения участков рестрикции по 3ʹ и 5ʹ концам, обеспечивающих клонирование вариабельного участка в векторах млекопитающих, обеспечивающих экспрессию мышиного Fab-X и Fab-Y (VH) или мышиной цепи каппа (VL). Указанные векторы совместно трансфицируют в клетки HEK-293, используя Fectin 293 (Life Technologies), или в клетки Expi293, используя Expifectamine (Life Technologies), и проводят экспрессию в течение 6 дней. Супернатанты тестируют с помощью гомогенного флуоресцентного анализа связывания на клетках HEK293, трансфицированных антигеном и гранулами Superavidin™ (Bangs Laboratories), покрытыми рекомбинантным белком, или на клетках HEK, трансфицированных антигеном. Анализ проводят, чтобы подтвердить специфичность клонированных антител.

Кроме супернатантов, содержащих полученный в результате временной экспрессии Fab-X, получают используемые в качестве отрицательного контроля пустые супернатанты с помомщью такого же способа, но с использованием нерелевантной контрольной ДНК.

Уровни экспрессии Fab-X определяют методом ВЭЖХ с использованием белка G.

Получение очищенного Fab-Y: Очищенный Fab-Y получают по способу, описанному в примере 13.

Функциональный анализ

Функциональный анализ проводят по способу, описанному в примере 12, за исключением того, что вместо 3 разных смесей антител используют только одну смесь с аналитическими концентрациями и условиями инкубации, применяющимися в примере 12 для смеси антител A.

Смесь антител=1:3 CD20 PerCp-Cy5.5+1:5 PLCγ2 AF88+1:10 Akt AF647+1:5 p38 MAPK PE (разведенные буфером FACS).

Результаты

Как можно видеть на фиг. 30-33, результаты демонстрируют, что сочетание разных, полученных путем временной экспрессии, мышиных V-участков против антигена 3, входящих в состав Fab-X, с 2 разными очищенными V-участками против антигена 2 (VR447 и VR4450), входящими в состав Fab-Y, может ингибировать активацию B-клеток до разных уровней и, следовательно, с помощью скрининга можно выбрать оптимальные V-участки. Сочетания, содержащие полученный путем временной экспрессии Fab-X, сравнивают со стандартным сочетанием, содержащим очищенный Fab-X (VR4126).

Пример 15. Сравнение активности комплекса, одновременно специфичного к антигену 2 и к антигену 3, в формате скрининга Fab-Kd-Fab с активностью молекулярно связанного биспецифического формата BYbe.

Введение: Чтобы подтвердить, что активность целевой пары, идентифицированной в скрининге с использованием гетеродимер-связанного комплекса Fab-Kd-Fab, может транслироваться в подобную желательную активность в альтернативном терапевтическом молекулярно связанном формате, получают формат BYbe, обладающий специфичностью к антигену 2 (VR4447) и к антигену 3 (VR4130). Указанный формат BYbe состоит из V-участков против антигена 3 (VR4130), присутствующих в виде дисульфид-стабилизированного (ds) одноцепочечного (sc)-Fv, гибридизованного с Fab против антигена 2 (VR4447).

Методы:

Функциональный скрининг проводят по способу, описанному в примере 13, за исключением очистки BYbe.

Форматы BYbe для функционального скрининга (Fab-dsscFv [scFv с C-конца тяжелой цепи Fab]) очищают следующим способом. Очищенные супернатанты клеточных культур стандартных expiHEK или экспрессирующих CHO стерилизуют фильтрованием через фильтр 0,22 мкм. Фильтрованные супернатанты загружают со скоростью 2 мл/мин на колонки GammabindPlus Sepharose XK26 объемом 50 мл (GE Healthcare), уравновешенные PBS pH 7,4 (Sigma Aldrich Chemicals). После загрузки колонки промывают PBS pH 7,4 и затем элюируют 0,1 M глицин/HCl, pH 2,7. Элюирование отслеживают путем измерения поглощения при 280 нм, собирают фракции, соответствующие пикам, и нейтрализуют их, используя 1/25 объема 2M Tris/HCl pH 8,5. Нейтрализованные образцы концентрируют, используя концентратор Amicon Ultra-15 с мембраной, обеспечивающей отсечение по молекулярной массе 10 кДа (BYbe), и с центрифугированием при 4000 g в роторе со свободно подвешенными стаканами. Концентрированные образцы наносят на колонку XK16/60 или XK26/60 с Superdex200 (GE Healthcare), уравновешенную PBS pH 7,4. Колонки элюируют в изократическом режиме PBS, pH 7,4, со скоростью 1 мл/мин или 2,6 мл/мин, соответственно. Фракции собирают и анализируют методом гель-хроматографии на TSKgel G3000SWXL; 5 мкм, колонка 7,8×300 мм, элюируя в изократическом режиме 0,2 M раствором фосфата, pH 7,0, со скоростью 1 мл/мин, с детекцией путем измерения поглощения при 280 нм. Выбранные мономерные фракции объединяют и концентрируют до концентрации >1 мг/мл, используя концентратор Amicon Ultra-15 с мембраной, обеспечивающей отсечение по молекулярной массе 10 кДа, и с центрифугированием при 4000 g в роторе со свободно подвешенными стаканами. Полученные образцы анализируют: концентрацию определяют путем измерения A280 с помощью сканирующего УФ-видимого спектрофотометра (Cary 50Bio); % мономеров определяют методом гель-хроматографии на колонке TSK gel G3000SWXL; 5 мкм, 7,8×300 мм, элюируя в изократическом режиме 0,2 M фосфатом, pH 7,0, со скоростью 1 мл/мин, с детекцией путем измерения поглощения при 280 нм; методом восстанавливающего и невосстанавливающего SDS-PAGE, проводимого в 4-20% трис-глицине на 1,5 мм гелях (Novex) при 50 мА (на гель) в течение 53 минут; и на эндотоксин, используя переносную систему тестирования Charles Riverʹs EndoSafe® с картриджами для тестирования, содержащими лизат амебоцитов Limulus (LAL).

Функциональные анализы

Анализ маркеров активации: Антиген 2-специфичный Fabʹ-Y и антиген 3-специфичный Fabʹ-X инкубируют вместе в течение 60 минут (при 37°C и 5% CO₂) в эквимолярных концентрациях. Сочетания титруют, начиная с исходной молярности 100 нМ, с серийными разведениями 1:4. Антиген 2- и 3-специфичные BYbe также титруют, начиная с исходной молярности 100 нМ, с серийными разведениями 1:4. В лунки 96-луночных планшетов с V-образным дном добавляют 1,5×10⁵ PBMC и затем титруемые сочетания Fabʹ-X и Fabʹ-Y или титруемые BYbe. Сочетания Fabʹ-X и Fabʹ-Y или BYbe инкубируют с клетками в течение 90 минут. По завершении данного периода B-клетки активируют путем добавления 25 мкг/мл козьего F(abʹ)₂ против человеческого IgM (Southern Biotechnology) с последующей инкубацией в течение 24 часов при 37°C и 5% CO₂.

В лунки добавляют 100 мкл охлажденного на льду буфера FACS (PBS+1% BSA+0,1% NaN₃+2 мМ EDTA), затем планшеты герметично закрывают, покрывают водным льдом и держат в течение примерно 15 минут, после чего центрифугируют при 500 g в течение 5 минут при 4°C. Избыток супернатанта отделяют от клеточных осадоков и затем планшеты встряхивают при 2000 об/мин в течение 30 секунд.

Клетки окрашивают смесью флуоресцентно меченных антител против CD19, против CD20, против CD71, против CD40 и против CD86 (BD Biosciences). Планшеты быстро встряхивают и инкубируют в течение 1 часа на водном льду в темноте. По завершении данного периода планшеты промывают дважды и ресуспендируют в 20 мкл буфера FACS. Экспрессию CD19, CD20, CD71, CD40 и CD86 в клетках измеряют с помощью проточного цитометра Intellicyt iQUE® Screener.

С помощью пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) идентифицируют B-клетки как отличающиеся от других клеточных популяций и рассчитывают среднее геометрическое уровней CD71, CD40 и CD86 для каждой лунки. Затем все данные выражают в виде процента ингибирования максимального ответа (только антитело против IgM) минус фоновый уровень (только клетки).

Анализ PhosFlow: Антиген 2-специфичных Fabʹ-Y and Антиген 3-специфичных Fabʹ-X инкубируют вместе в течение 60 минут (при 37°C и 5% CO₂) в эквимолярных концентрациях. Сочетания титруют, начиная с исходной молярности 100 нМ, с серийными разведениями 1:4. Антиген 2- и 3-специфичные BYbe также титруют, начиная с исходной молярности 100 нМ, с серийными разведениями 1:4. В лунки 96-луночных планшетов с V-образным дном добавляют 5,0×10⁴ PBMC и затем титруемые сочетания Fabʹ-X и Fabʹ-Y или титруемые BYbe. Сочетания Fabʹ-X и Fabʹ-Y или BYbe инкубируют с клетками в течение 90 минут. По завершении данного периода B-клетки активируют путем добавления 25 мкг/мл козьего F(abʹ)₂ против человеческого IgM (Southern Biotechnology) с последующей инкубацией в течение 15 минут при 37°C и 5% CO₂. Реакцию передачи сигнала останавливают путем добавления равного объема буфера Cytofix (BD Biosciences). После этого планшеты держат при комнатной температуре в течение 15 минут и затем центрифугируют при 500 g в течение 5 минут. Избыток супернатанта отделяют от клеточного осадка, который ресуспендируют в буфере FACS (PBS+1% BSA+0,01% NaN₃+2 мМ EDTA) и промывают еще один раз. Затем клетки ресуспендируют в охлажденном на льду буфере Perm III (BD Biosciences), держат в течение 30 минут и промывают дважды проточным буфером.

Клетки окрашивают флуоресцентно меченными антителом против CD20 (BD Biosciences) и антителами против фосфорилированного PLCγ2, против фосфорилированного Akt и против фосфорилированного p38 (BD Biosciences). Затем содержимое планшетов ресуспендируют и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. По завершении данного периода планшеты промывают еще два раза и ресуспендируют в 20 мкл буфера FACS. Экспрессию CD20, а также фосфо-PLCγ2, фосфо-Akt и фосфо-p38 в клетках измеряют с помощью проточного цитометра Intellicyt iQUE^®.

С помощью пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) идентифицируют B-клетки как отличающиеся от других клеточных популяций и рассчитывают среднее геометрическое уровней PLCγ2, Akt и p38 для каждой лунки. Затем все данные выражают в виде процента ингибирования максимального ответа (только антитело против IgM) минус фоновый уровень (только клетки).

Результаты

Анализ PhosFlow: Результаты, приведенные на фиг. 34, демонстрируют, что формат Fab-Kd-Fab или BYbe, обладающий специфичностью к антигену 3 и к антигену 2, может ингибировать фосфорилирование PLCγ2 в B-клетках, стимулированных антителом против IgM. Результаты, приведенные на фиг. 35, демонстрируют, что формат Fab-Kd-Fab или BYbe, обладающий специфичностью к антигену 3 и к антигену 2, может ингибировать фосфорилирование P38 в B-клетках. стимулированных антителом против IgM. Результаты, приведенные на фиг. 36, демонстрируют, что формат Fab-Kd-Fab или BYbe, обладающий специфичностью к антигену 3 и к антигену 2, может ингибировать фосфорилирование Akt в B-клетках стимулированных антителом против IgM.

Анализ маркеров активации: Как можно видеть на фиг. 37, результаты демонстрируют, что формат Fab-Kd-Fab или BYbe, обладающий специфичностью к антигену 3 и к антигену 2, может ингибировать экспрессию CD71 на B-клетках, стимулированных антителом против IgM. Результаты, приведенные на фиг. 38, демонстрируют, что формат Fab-Kd-Fab или BYbe, обладающий специфичностью к антигену 3 и к антигену 2, может ингибировать экспрессию CD40 на B-клетках, стимулированных антителом против IgM. Результаты, приведенные на фиг. 39, демонстрируют, что формат Fab-Kd-Fab или BYbe, обладающий специфичностью к антигену 3 и к антигену 2, может ингибировать экспрессию CD86 на B-клетках, стимулированных антителом против IgM.

Пример 16. Сравнение активности молекулярно связанного биспецифического формата Bybe, специфичного к антигену 2 и к антигену 3, с активностью формата, дополнительно содержащего домен, связывающий альбумин, обеспечивающий увеличение периода полужизни in vivo .

Введение: Чтобы подтвердить, что активность целевой пары, идентифицированной в скрининге с использованием гетеродимер-связанного комплекса Fab-Kd-Fab, может транслироваться в подобную желательную активность в потенциальном терапевтическом молекулярно связанном формате, обладающим специфичностью к альбумину, обеспечивающей увеличение периода полужизни in vivo, фрагмент антитела против альбумина гибридизуют с легкой цепью Fab против антигена 3 формата BYbe, описанного в примере 15. Получают формат Bybe, обладающий специфичностью к антигену 2 (VR4447) и к антигену 3 (VR4130 VR4126), который либо содержит, либо не содержит фрагмент против альбумина (VR0645).

Описание конструкций, используемых в данном эксперименте.

Название конструкции	Специфичность Fab	Тяжелая цепь	Легкая цепь
VR4447/VR4126 BYbe	Антиген 2	Антиген 3	Нет
VR4447/VR4126/VR645) BYbe/Альбумин	Антиген 2	Антиген 3	Альбумин
VR4447/VR4130 BYbe	Антиген 2	Антиген 3	Нет
VR4447/VR4130/VR645) BYbe/Альбумин	Антиген 2	Антиген 3	Альбумин

Методы

Очистка BYbe для функционального скрининга:

Форматы BYbe для функционального скрининга (Fab-dsscFv [scFv с C-конца тяжелой цепи Fab]) очищают следующим способом. Осветленные супернатанты клеточных культур стандартных expiHEK или экспрессирующих CHO стерилизуют фильтрованием через фильтр 0,22 мкм. Фильтрованные супернатанты загружают со скоростью 2 мл/мин на колонки GammabindPlus Sepharose XK26 объемом 50 мл (GE Healthcare), уравновешенные PBS pH 7,4 (Sigma Aldrich Chemicals). После загрузки колонки промывают PBS pH 7,4 и затем элюируют 0,1 M глицин/HCl, pH 2,7. Элюирование отслеживают путем измерения поглощения при 280 нм, собирают фракции, соответствующие пикам, и нейтрализуют их, используя 1/25 объема 2M Tris/HCl pH 8,5. Нейтрализованные образцы концентрируют, используя концентратор Amicon Ultra-15 с мембраной, обеспечивающей отсечение по молекулярной массе 10 кДа или 30 кДа, и с центрифугированием при 4000 g в роторе со свободно подвешенными стаканами. Концентрированные образцы наносят на колонку XK16/60 или XK26/60 с Superdex200 (GE Healthcare), уравновешенную PBS pH 7,4. Колонки элюируют в изократическом режиме PBS, pH 7,4, со скоростью 1 мл/мин или 2,6 мл/мин, соответственно. Фракции собирают и анализируют методом гель-хроматографии на TSKgel G3000SWXL; 5 мкм, колонка 7,8×300 мм, элюируя в изократическом режиме 0,2 M раствором фосфата, pH 7,0, со скоростью 1 мл/мин, с детекцией путем измерения поглощения при 280 нм. Выбранные мономерные фракции объединяют и концентрируют до концентрации >1 мг/мл, используя концентратор Amicon Ultra-15 с мембраной, обеспечивающей отсечение по молекулярной массе 10 кДа или 30 кДа, и с центрифугированием при 4000 g в роторе со свободно подвешенными стаканами. Полученные образцы анализируют: концентрацию определяют путем измерения A280 с помощью сканирующего УФ-видимого спектрофотометра (Cary 50Bio); % мономеров определяют методом гель-хроматографии на колонке TSK gel G3000SWXL; 5 мкм, 7,8×300 мм, элюируя в изократическом режиме 0,2 M фосфатом, pH 7,0, со скоростью 1 мл/мин, с детекцией путем измерения поглощения при 280 нм; методом восстанавливающего и невосстанавливающего SDS-PAGE, проводимого в 4-20% трис-глицине на 1,5 мм гелях (Novex) при 50 мА (на гель) в течение 53 минут; и на эндотоксин, используя переносную систему тестирования Charles Riverʹs EndoSafe® с картриджами для тестирования, содержащими лизат амебоцитов Limulus (LAL).

100 нМ раствор каждого очищенного белка конструкции предварительно инкубируют с человеческими PBMC, полученными от пяти разных доноров, в течение 60 мин при 37°C/5%CO₂ в среде RMPI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 2 мМ глутамакс (среда R10). Через 60 мин клетки стимулируют 25 мкг/мл козьего антитела против IgM, полученного специально для стимуляции B-клеток. Через 24 часа планшеты помещают на лед, чтобы предотвратить любую последующую активацию клеток, и затем промывают один раз охлажденным на льду буфером для проточной цитометрии (PBS+1%BSA+0,01%NaN₃). Весь супернатант удаляют и клеточные осадки ресуспендируют. Клетки помещают на лед и добавляют смесь антител против CD19, CD20, CD27, CD71 и CD86. Клетки инкубируют в течение 60 мин и затем дважды промывают буфером для проточной цитометрии. Значения связывания антител против CD27, CD71 и CD86 с CD19/CD20-положительными B-клетками получают с помощью проточного цитометра iQUE с высокой пропускной способностью. Программное обеспечение Forecyt используют для получения гистограмм и средних геометрических значений интенсивности связывания антител против CD27, CD71 и CD86 с B-клетками. Полученные данные импортируют в Excel и определяют значения процента ингибирования для каждого сочетания. Затем данные импортируют в Graphpad Prism и получают диаграмму с прямоугольниками и усиками для каждого сочетания, где среднее значение обозначено ʹ+ʹ.

На фиг. 40 показано ингибирование экспрессии CD27 на B-клетках, индуцированное VR4447/VR4126 BYbe и VR4447/VR4126/VR645 BYbe/альбумин. У всех пяти тестируемых доноров оба соединения вызывают подобные уровни ингибирования антитело против IgM-индуцированного CD27. На фиг. 41 показано ингибирование экспрессии CD71 на B-клетках, индуцированное VR4447/VR4126 BYbe и VR4447/VR4126/VR645 BYbe/альбумин. У всех пяти доноров оба соединения вызывают подобные уровни ингибирования антитело против IgM-индуцированного CD71. На фиг. 42 показано ингибирование экспрессии CD86 на B-клетках, индуцированное VR4447/VR4126 BYbe и VR4447/VR4126/VR645 BYbe/альбумин. У всех пяти доноров оба соединения вызывают подобные уровни ингибирования антитело против IgM-индуцированного CD86.

Последовательности GCN4(7P14P)

ASGGGRMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGERHHHHHH SEQ ID NO: 1, где жирным шрифтом выделены необязательные аминокислоты, а курсивом выделены аминокислоты, составляющие связующую последовательность

GCTAGCGGAGGCGGAAGAATGAAACAACTTGAACCCAAGGTTGAAGAATTGCTTCCGAAAAATTATCACTTGGAAAATGAGGTTGCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAACGCCATCACCATCACCATCAC SEQ ID NO: 2

Последовательность 52SR4 ds scFv

DAVVTQESALTSSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYASWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSDHWVFGCGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQSPGKCLEWLGVIWGDGITDYNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLTVSSAAAHHHHHHEQKLISEEDL SEQ ID NO: 3

GATGCGGTGGTGACCCAGGAAAGCGCGCTGACCAGCAGCCCGGGCGAAACCGTGACCCTGACCTGCCGCAGCAGCACCGGCGCGGTGACCACCAGCAACTATGCGAGCTGGGTGCAGGAAAAACCGGATCATCTGTTTACCGGCCTGATTGGCGGCACCAACAACCGCGCGCCGGGCGTGCCGGCGCGCTTTAGCGGCAGCCTGATTGGCGATAAAGCGGCGCTGACCATTACCGGCGCGCAGACCGAAGATGAAGCGATTTATTTTTGCGTGCTGTGGTATAGCGACCATTGGGTGTTTGGCTGCGGCACCAAACTGACCGTGCTGGGTGGAGGCGGTGGCTCAGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGCGGGTCTGGCGGCGGCGGCAGCGATGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGGCGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTCTCCTGACCGATTATGGCGTGAACTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAATGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGGGCGATGGCATTACCGATTATAACAGCGCGCTGAAAAGCCGCCTGAGCGTGACCAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGAGCGGCGATAGCGCGCGCTATTATTGCGTGACCGGCCTGTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGCGGCCGCCCATCACCATCACCATCACGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAAGATCTGTAATAG SEQ ID NO: 4

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<110> UCB Pharma

<120> НОВЫЙ БИСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ФОРМАТ, ПОДХОДЯЩИЙ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СКРИНИНГЕ

С ВЫСОКОЙ ПРОПУСКНОЙ СПОСОБНОСТЬЮ

<130> G0221_WO01

<160> 72

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 44

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность GCN4(7P14P)

<400> 1

Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu

1 5 10 15

Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys

20 25 30

Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His

35 40

<210> 2

<211> 132

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая SEQ ID NO: 1

<400> 2

gctagcggag gcggaagaat gaaacaactt gaacccaagg ttgaagaatt gcttccgaaa 60

aattatcact tggaaaatga ggttgccaga ttaaagaaat tagttggcga acgccatcac 120

catcaccatc ac 132

<210> 3

<211> 262

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность 52SR4 ds scFv

<400> 3

Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp

85 90 95

His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro

130 135 140

Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Leu Leu Thr

145 150 155 160

Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu

165 170 175

Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala

180 185 190

Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val

195 200 205

Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr

210 215 220

Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His Glu Gln Lys Leu

245 250 255

Ile Ser Glu Glu Asp Leu

260

<210> 4

<211> 792

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая SEQ ID NO: 3

<400> 4

gatgcggtgg tgacccagga aagcgcgctg accagcagcc cgggcgaaac cgtgaccctg 60

acctgccgca gcagcaccgg cgcggtgacc accagcaact atgcgagctg ggtgcaggaa 120

aaaccggatc atctgtttac cggcctgatt ggcggcacca acaaccgcgc gccgggcgtg 180

ccggcgcgct ttagcggcag cctgattggc gataaagcgg cgctgaccat taccggcgcg 240

cagaccgaag atgaagcgat ttatttttgc gtgctgtggt atagcgacca ttgggtgttt 300

ggctgcggca ccaaactgac cgtgctgggt ggaggcggtg gctcaggcgg aggtggctca 360

ggcggtggcg ggtctggcgg cggcggcagc gatgtgcagc tgcagcagag cggcccgggc 420

ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt acctgcaccg tgagcggctt tctcctgacc 480

gattatggcg tgaactgggt gcgccagagc ccgggcaaat gcctggaatg gctgggcgtg 540

atttggggcg atggcattac cgattataac agcgcgctga aaagccgcct gagcgtgacc 600

aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg aaaatgaaca gcctgcagag cggcgatagc 660

gcgcgctatt attgcgtgac cggcctgttt gattattggg gccagggcac caccctgacc 720

gtgagcagcg cggccgccca tcaccatcac catcacgaac agaaactgat tagcgaagaa 780

gatctgtaat ag 792

<210> 5

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 5

Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 6

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 7

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ala

<210> 8

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 8

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

20 25

<210> 9

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 9

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu

1 5 10 15

Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr

20 25 30

<210> 10

<211> 31

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 10

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His

1 5 10 15

Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr

20 25 30

<210> 11

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 11

Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

<210> 12

<211> 26

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 12

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp

1 5 10 15

Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala

20 25

<210> 13

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 13

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 14

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

1 5

<210> 15

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 15

Asp Lys Thr His Thr Ser

1 5

<210> 16

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 16

Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 17

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 18

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 18

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 19

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 19

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Ser

20

<210> 20

<211> 26

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 20

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 21

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 21

Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ser

1 5 10

<210> 22

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 22

Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser

1 5 10 15

<210> 23

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 23

Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ala Ser Ala Ser

20

<210> 24

<211> 26

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 24

Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser

20 25

<210> 25

<211> 31

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 25

Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser

20 25 30

<210> 26

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 26

Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser

1 5 10

<210> 27

<211> 28

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 27

Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr

1 5 10 15

Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr

20 25

<210> 28

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 28

Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr

1 5 10

<210> 29

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 29

Ala Thr Thr Thr Gly Ser

1 5

<210> 30

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 30

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 31

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 31

Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu

1 5 10 15

Ser His Lys Ser Pro

20

<210> 32

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 32

Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

1 5 10 15

<210> 33

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 33

Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 34

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 34

Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 35

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 35

Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 36

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 36

Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 37

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 37

Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 38

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 38

Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 39

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 39

Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val

1 5 10 15

Arg Pro

<210> 40

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 40

Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu

1 5 10 15

Thr Thr

<210> 41

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 41

Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr

1 5 10 15

Phe Asn

<210> 42

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 42

Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu

1 5 10 15

Pro Ala

<210> 43

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 43

Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile

1 5 10 15

Arg Thr

<210> 44

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 44

Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala

1 5 10 15

Phe Gly

<210> 45

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 45

Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu

1 5 10 15

Gly Ala

<210> 46

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 46

Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro

1 5 10 15

Asp Leu

<210> 47

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 47

Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro

1 5 10 15

Ser Leu

<210> 48

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 48

Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg

1 5 10 15

Ile Ser

<210> 49

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 49

Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg

1 5 10 15

Pro

<210> 50

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 50

Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe

1 5 10 15

Pro Pro

<210> 51

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 51

Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro

1 5 10 15

Pro Tyr

<210> 52

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 52

Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr

1 5 10 15

Pro

<210> 53

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 53

Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn

1 5 10 15

Leu Arg

<210> 54

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий линкер

<400> 54

Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr

1 5 10 15

Phe Pro

<210> 55

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 55

Asp Leu Cys Leu Arg Asp Trp Gly Cys Leu Trp

1 5 10

<210> 56

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 56

Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp

1 5 10

<210> 57

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 57

Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Gly Asp

1 5 10 15

<210> 58

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 58

Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp

1 5 10 15

Glu Asp Asp Glu

20

<210> 59

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 59

Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp

1 5 10 15

Gly Arg Ser Val

20

<210> 60

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 60

Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp

1 5 10 15

Gly Arg Ser Val Lys

20

<210> 61

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 61

Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp

1 5 10 15

<210> 62

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 62

Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu

1 5 10 15

Asp Asp

<210> 63

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 63

Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp

1 5 10 15

<210> 64

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 64

Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp

1 5 10 15

<210> 65

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 65

Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu

1 5 10 15

Asp Asp

<210> 66

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 66

Glu Val Arg Ser Phe Cys Thr Arg Trp Pro Ala Glu Lys Ser Cys Lys

1 5 10 15

Pro Leu Arg Gly

20

<210> 67

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 67

Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu

1 5 10 15

Arg Ser Glu Gln

20

<210> 68

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 68

Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met

1 5 10

<210> 69

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептидная последовательность

<400> 69

Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala

1 5 10

<210> 70

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептидная последовательность

<400> 70

Pro Pro Pro Pro

1

<210> 71

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 71

Ala Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 72

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 72

Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5

<---

1. Биспецифический белковый комплекс для использования в скрининге синергической биологической функции, имеющий формулу A-X:Y-B где:

A-X представляет собой слитый белок;

Y-B представляет собой второй слитый белок;

X:Y представляет собой гетеродимерный связующий фрагмент;

: обозначает связывающее взаимодействие между X и Y;

А представляет собой первый белковый компонент биспецифического белкового комплекса, выбранный из фрагмента Fab или Fab';

В представляет собой второй белковый компонент биспецифического белкового комплекса, выбранный из фрагмента Fab или Fab';

где один из X или Y представляет собой scFv, специфичный к пептиду GCN4, представленному SEQ ID NO: 1 или аминокислотами 1-38 SEQ ID NO: 1; где scFv представляет собой 52SR4, представленный SEQ ID NO: 3 или аминокислотами 1-243 SEQ ID NO: 3, и где один из X или Y представляет собой пептид GCN4, представленный SEQ ID NO: 1 или аминокислотами 1-38 SEQ ID NO: 1.

2. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где A представляет собой фрагмент Fab.

3. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где B представляет собой фрагмент Fab.

4. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где X присоединен, необязательно через линкер, к C-концу тяжелой цепи фрагмента Fab или Fab'.

5. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где Y присоединен, необязательно через линкер, к C-концу тяжелой цепи фрагмента Fab или Fab'.

6. Биспецифический белковый комплекс по п. 1, где A и/или B является специфичным к антигену, выбранному из группы, включающей в себя: рецепторы клеточной поверхности, такие как Т-клеточные или В-клеточные сигнальные рецепторы, костимуляторные молекулы, ингибиторы контрольных точек, рецепторы естественных клеток-киллеров, иммуноглобулиновые рецепторы, рецепторы семейства TNFR, рецепторы семейства В7, молекулы адгезии, интегрины, рецепторы цитокинов/хемокинов, GPCR, рецепторы факторов роста, киназа-содержащие рецепторы, тканеспецифические антигены, раковые антигены, рецепторы, распознающие патогены, рецепторы комплемента, рецепторы гормонов, или растворимые молекулы, такие как цитокины, хемокины, лейкотриены, факторы роста, гормоны, ферменты и ионные каналы.