Способ создания живого штамма энтерококка l3-sars на основе биологически активного штамма е. faecium l3

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ создания рекомбинантного штамма энтерококка L3-SARS на основе биологически активного штамма Е. faecium L3, отличается тем, что проводят электропорацию культуры энтерококков Enterococcus faecium L3 рекомбинантной плазмидной ДНК pentF-sarsS, имеющей SEQ ID No: 1, и выбирают клон энтерококка L3-SARS, экспрессирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2. Представлена рекомбинантная плазмида pentF-sarsS, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 1, предназначенная для получения клона энтерококка L3-SARS, экспрессирующего белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2. Изобретение решает задачу расширения арсенал технических средств для создания вакцин. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, вирусологии, микробиологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве живых вакцин для профилактики и лечения инфекций, вызванных коронавирусом.

В настоящий момент разработку вакцины для профилактики и терапии инфекции, вызванной SARS-CoV-2 ведут по всему миру вследствие лавинообразного развития эпидемического процесса, вызванного принципиально новым вариантом коронавируса SARS-CoV-2. Переход эпидемии в разряд глобальной пандемии, ограниченные знания относительно биологии и эволюционного потенциала нового варианта коронавируса приводит к необходимости разрабатывать множественные варианты средств профилактики и лечения нового вирусного заболевания.

Успехи биоинформатики, молекулярной биологии позволяют за рекордно короткие сроки определить перспективные с точки зрения индукции иммунного ответа антигены возбудителя, достижения генной инженерии и биотехнологии - создать разнообразные вакцинные препараты. Необходимость быстрой разработки средств борьбы ускоряет процедуру лицензирования и облегчает введение в практику принципиально новых вакцинных платформ, как это происходит, например, с РНК, ДНК вакцинами или вакцинами на основе ослабленных вирусов.

Коронавирусы (Coronaviridae) - семейство вирусов, включающее на январь 2020 года более 60 видов РНК-содержащих патогенных вирусов, объединенных в четыре подсемейства, которые поражают человека и животных. Название связано со строением вируса, который имеет шиловидные отростки. Они напоминают солнечную корону и содержат рецептор-связывающие белки, на которые реагируют трансмембранные рецепторы клеток. Коронавирусы имеют сходную организацию генома, представленного цепочкой из положительной цепи однонитевой РНК из 25-30 тысяч нуклеотидов.

Коронавирус человека впервые был выделен в 1965 году от больных ОРВИ Д. Тиррелом из носоглотки при остром рините, позже в 1975 году Э. Каул и С. Кларк выделили коронавирус из испражнений при детском энтероколите. В последующее время коронавирусы почти не привлекали внимание исследователей, пока в Китае в 2002-2003 годах не была зафиксирована вспышка атипичной пневмонии или тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС, SARS). Заболевание было вызвано вирусом SARS-CoV, бета-коронавирусом В.

В результате болезнь распространилась на другие страны, всего заболело 8273 человека, 775 умерло (летальность 9,6%). Вирус MERS-CoV, бета-коронавирус С, является возбудителем ближневосточного респираторного синдрома (MERS), первые случаи которого были зарегистрированы в 2012 году [Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - СПб: Спец Лит, 2008]. В 2015 году в Южной Корее произошла вспышка ближневосточного респираторного синдрома, в ходе которой заболело 183 человека, умерло 33.

В декабре 2019 года в Китае началась вспышка пневмонии, вызванная ранее неизвестным бета-коронавирусом, обозначенным как SARS-CoV-2. Вскоре данная вспышка преобразовалась в эпидемию, которая распространилась и на другие страны мира, превратившись в пандемию, приведшую к заболеванию более 20 миллионов человек в мире и смерти миллиона человек.

Источниками коронавирусных инфекций может быть как больной человек, так и различные животные, как промежуточные хозяева. Наиболее вероятным исходным хозяином SARS-CoV-2 были летучие мыши. Возможные механизмы передачи: воздушно-капельный, воздушно-пылевой, фекально-оральный, контактный. Заболеваемость растет зимой и ранней весной. В структуре ОРВИ госпитализированных больных коронавирусная инфекция составляет в среднем 12%. Бета-коронавирусы, разрушая клетки эпителия различных органов, провоцируют возникновение заболеваний, наиболее характерным и тяжелым вариантом которых является развитие двухсторонней пневмонии, блокирующей функцию дыхания, том числе со смертельным исходом.

SARS-CoV-2 использует поверхностный S-белок для прикрепления к своему рецептору - ангиотензинпревращающему ферменту 2 (АСЕ2), как и вирус SARS-CoV (атипичной пневмонии) [Xintian Xu, Ping Chen, Jingfang Wang, Jiannan Feng, Hui Zhou. // SCIENCE CHINA Life Sciences, 2020].

РНК вируса имеет 5'-метилированное начало и 3'-полиаденилированное окончание. Это позволяет вирусу инициировать сборки своих белков и копий в рибосоме клетки, которая не в состоянии отличить РНК вируса от РНК для белков самой клетки.

РНК коронавирусов состоят из 26-30 тысяч пар оснований. Это означает, что коронавирусы обладают крупнейшей несегментированной РНК, то есть являются сложнейшими по структуре среди всех известных вирусов. Геном вируса состоит из 30000 нуклеотидов и кодирует два репликативных полипротеина ppla и pplab, из которых в следующий проход репликации/трансляции формируется копия РНК вируса, а также 8 отдельных мРНК-шаблонов для белков вирусов, которые бесконечно их генерируют [Thiel V. Coronaviruses: Molecular and Cellular Biology. Caister Academic Press (2007); King, Andrew M.Q.; Adams, Michael J.; Carstens, Eric В.; Lefkowitz, Elliot J, Virus Taxonomy, 2012]. Генерация белков вируса из мРНК происходит в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи. После получения РНК вируса и необходимых его белков вирусные нуклеокапсиды собираются из геномной РНК вируса и N-белка в цитоплазме. Вирионы затем высвобождаются из инфицированной клетки через экзоцитоз. После выхода вирионов из клетки она погибает.

Ученые из Китая расшифровали и опубликовали 12 января 2020 года в международной базе данных геном нового коронавируса. Сейчас разработка вакцины идет в инициативном порядке. В настоящий момент разработку вакцины от коронавируса SARS-CoV-2 ведут по всему миру.

Одним из альтернативных подходов к созданию вакцин как против вирусов гриппа, так и против коронавирусов, является встраивание консервативных последовательностей вирусных белков в пробиотические векторы. То есть, альтернативой использованию химических адъювантов для вакцинации является применение так называемых живых вакцин на основе пробиотиков. Живые вакцины применяют, как правило, однократно, вводят подкожно, накожно или внутримышечно, а некоторые вакцины перорально и ингаляционно. Главным преимуществом живых вакцин является то, что они активируют все компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный прочный иммунный ответ.

Пробиотики - препараты, оказывающие общее благотворное влияние на организм человека (чаще всего молочнокислые бактерии). Установлено, что некоторые пробиотики являются эффективными неспецифическими стимуляторами выработки специфических иммуноглобулинов против различных инфекций [Vintini Е.О., Medina M.S., ВМС Immunol. 12: 46 (2011), Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact. 10: 17-24 (2011)]. Пробиотики стали использоваться в качестве векторов, в часть из которых успешно внесены плазмидные конструкции, обеспечивающие экспрессию антигенов патогенных бактерий ME Y., Luo Y., Huang X., Song F., LiuG. Microbiology, 158: 498-504 (2012), DeAzevedoM., Karczzewski J., Lefeure F. Et al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011)].

Пробиотические микроорганизмы рассматриваются в настоящее время как хорошая основа для получения рекомбинантных живых вакцин, экспрессирующих вакцинные антигены возбудителей актуальных инфекций Vintini Е.О., Medina M.S., ВМС Immunol., 12: 46 (2011); Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact. 10: 17-24 (2011); ME Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. Et al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011), [Lei H. et al. Virology. T. 476: 189-195 (2015)].

В 2015 г. Хан Л. со своими коллегами создали химерную конструкцию на основе бактерии Lactococcus lactis, содержащую на своей поверхности NA вируса гриппа А, и показали, что она способна защищать мышей от инфекции вирусами гриппа [Lei Н. et al. Virology. Т. 476: 189-195, (2015)]. Таким образом, они показали, что такая химерная конструкция может быть кандидатом для создания универсальной противогриппозной вакцины.

Известен пробиотический штамм Enterococcus faecium L3 ND-79 ВНИИСХМ, предназначенный для изготовления лечебно-профилактических средств и продуктов питания лечебно-профилактического назначения, обладающий устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, более выраженным антагонизмом к патогенным бактериям, высокой жизнеспособностью и высоким уровнем продукции витаминов группы "В" и фолиевой кислоты; известный штамм положен в основу заявляемого изобретения [патент РФ №2220199 на штамм энтерококков Enterococcus faecium L3 для изготовления лечебно-профилактических средств].

Известен способ, основанный на введении bac гена патогенных СГВ в хромосомную ДНК в области кодирования белков пилей пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 с последующей экспрессией в пилях белка Вас, кодируемого этим геном. Пили энтерококков выступают за пределы бактериальных клеток и способны проникать сквозь капсулу, которая экранирует большинство бактериальных белков-антигенов. Пили состоят из белковых мономеров, способных к агрегации. За счет этого процесса может увеличиваться доза чужеродного антигена, встроенного в белок пилей. Последнее должно способствовать увеличению титров антител, специфичных к встраиваемому в структуру поверхностного белка энтерококка полипептидного фрагмента штамма патогенного СГВ.

Способ введения гена патогенных стрептококков в пили пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 интересен тем, что рекомбинантный белок экспрессируется не в цитоплазме, а на поверхности бактерии [патент РФ №2640250 «Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях», авторы - Суворов А.Н. и др.].

Известно, что штамм Enterococcus faecium L3 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, способностью восстанавливать микробиоценоз кишечника на фоне дисбиотических состояний [Yermolenko Е., Suvorov А., Chernush A., et al. International Congress Series, 1289: 363-366 (2006)], а также оказывать иммуномодулирующее действие на организм хозяина [Tarasova Е., Yermolenko Е., Donets V., Sundukova Z., Bochkareva A., Borschev I., Suvorova M., Ilyasov. I., Simanenkov V., Suvorov A. The influence of probiotic enetrococci on the microbiota and cytokines expression in rats with dysbiosis induced by antibiotics// Beneficial Microbes. -2010 - Т. 1. - №3. - C. 265-270].

Осуществлено физическое картирование штамма Enterococcus faecium L3 [Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al. Prebiotics and probiotics potential for human health, 104-112, (2011)].

В экспериментах на здоровых самках мышей показано, что интравагинальное введение высоких доз штамма Enterococcus faecium L3 не только не оказывает токсического действия на организм, но не влияет на состояние слизистой оболочки влагалища [Суворов А., Алехина Г., Пигаревский П. и др. Гастробюллетень, 4: 29-31, (2001)] и способствует экспрессии IL-10 клетками слизистой оболочки влагалища крыс с экспериментальным вагинитом, вызванном S.agalactiae и Staphylococcus aureus [Tarasova Е., Yermolenko Е., Donets V., Sundukova Z., Bochkareva A., Borschev I., Suvorova M., Ilyasov I., Simanenkov V., Suvorov A. The influence of probiotic enetrococci on the microbiota and cytokines expression in rats with dysbiosis induced by antibiotics // Beneficial Microbes. - 2010. - Т. 1. - №3. - C. 265-270].

В штамме Enterococcus faecium L3, как и у других грамположительных бактерий, имеются пили, которые представляют собой фимбрии длиной 0,3-3 μm и диаметром 2-10 nm [Telford JL, Barocchi MA, Margarit I, Rappuoli R, Grandi G. Pili in gram-positive pathogens. Nat Rev Microbiol. -2006- T.4, №7-C. 509-519. doi: 10.1038/nrmicro1443. PMID: 16778837]. Это длинные белок-подобные полимеры, тянущиеся на поверхности бактерий, представляют собой субъединицы белка пилина, соединенные ковалентной связью. Они играют большую роль в адгезии колонизации хозяина. Пили являются высокоиммуногенными структурами, которые находятся под селективным давлением иммунных реакций хозяина [Danne С, Dramsi S. Pili of gram-positive bacteria: roles in host colonization. Res Microbiol. 2012 Nov-Dec; 163(9-10):645-58. doi: 10.1016/j.resmic.2012.10.012. Epub 2012 Oct 29. PMID: 23116627].

Принцип модификации пилей энтерококков вакцинными антигенами является приоритетным подходом при создании эффективных живых вакцин благодаря экспозиции целевого антигена на поверхности энтерококка.

Известен способ создания живой вакцины за счет введения генов патогенных стрептококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях, и живая вакцина на основе модифицированного штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumonie [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Кулешевич Е.В., Леонтьева Г.Ф., Крамская Т.А, Патент РФ №2701733]. Недостатком указанного способа является сложность конструирования такой вакцины за счет большого количества стадий, необходимых для создания суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и химерного гена Streptococcus pneumonie - pspf.

Упомянутый недостаток устраняется в заявляемом способе создания живой вакцины за счет замены химерного гена Streptococcus pneumoniae - pspf на фрагмент гена sarsS методом клонирования, что сокращает получение вакцины в отличие от прототипа, а также позволяет создавать любые другие вакцинные кандидаты на этой платформе.

Существенно, что созданный вакцинный кандидат в отличие от вакцины-прототипа, предназначен для обеспечения специфической профилактики заболеваний, вызванных вирусом SARS-Cov-2, а не Streptococcus pneumoniae.

Ближайшим аналогом (прототипом) настоящего изобретения является способ создания живой вакцины L3-COVID-19 против коронавирусной инфекции SARS-Cov-2 на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Бормотова Е.А., Леонтьева Г.Ф., Крамская Т.А., Дешева Ю.А., 2021].

Настоящее изобретение отличается тем, что был синтезирован другой фрагмент гена, кодирующего S-белок коронавируса SARS-Cov-2, в связи с появлением новых штаммов коронавируса.

Заявляемый способ реализуется следующим образом. Выбирают последовательности второго фрагмента гена S-белка коронавируса SARS-Cov-2-sars, как показано ниже:

В выбранной последовательности были изменены аминокислоты:

• K417N (лизин-аспарагин), G на С

• Е484К (глут-лизин), G на А,

• N5 01Y (аспарагин-тирозин) А на Т.

Для клонирования использовали синтезированную последовательность фрагмента гена sarsS2, приведенную ниже:

Техническим результатом заявляемого изобретения является значительное упрощение способа получения живой вакцины против коронавирусной инфекции. Указанный технический результат достигается тем, что в способе создания живой вакцины против коронавирусной инфекции SARS-Cov-2 на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 (по патенту РФ №2220199), модифицированного в результате электропорации культуры энтерококков штамма Enterococcus faecium L3 рекомбинантной плазмидной ДНК pentF-pspf SEQ ID No: l (по патенту РФ №2701733), в соответствии с заявленным изобретением, в плазмиде pentF-sarsS, участок pspf заменен на фрагмент гена шиловидного белка SARS-CoV-2, при этом ДНК pentF-sarsS кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2, которая выполняет функцию шиловидного белка вируса SARS-CoV-2, способного осуществлять стимуляцию гуморального и клеточного иммунитета в отношении вируса SARS-CoV-2.

При этом задача генетической части работы состояла в осуществлении интеграции участка ДНК вируса в структуру гена поверхностного белка пробиотика без нарушения открытой рамки считывания и повреждения участков кодирования компонентов, участвующих в процессинге поверхностного белка PilF.

В изобретении, использованном в качестве прототипа, согласно известному способу на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3, была сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому, в области, кодирующей ген пилей, участком химерного гена pspf, сконструированного на основе генов патогенности Streptococcus pneumoniae. Штамм Enterococcus faecium L3-PSPF+ был получен в результате трансформации плазмидой pentF-pspf штамма Enterococcus faecium L3.

Интраназальное введение вакцины Enterococcus faecium L3-PSPF+стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интраназальной летальной пневмококковой инфекции у мышей линии СВА было показано, что трехкратная интраназальная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной пневмококковой инфекции.

В изобретении, использованном в качестве второго прототипа согласно известному способу на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 была сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому, в области, кодирующей ген пилей, участком фрагмента гена SARS-CoV-2. Штамм Enterococcus faecium L3- COVID 19, был получен в результате трансформации плазмидой pentF-covid19 штамма Enterococcus faecium L3.

При реализации заявленного способа создания живой вакцины на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 был использован другой синтезированный фрагмент ДНК шиловидного белка коронавируса, который был смоделирован авторами патента, а затем синтезирован компанией Евроген. При этом в плазмиде pentF-pspf участок гена pspf был заменен на фрагмент гена шиловидного белка.

Таким образом, конечной технической задачей заявленного изобретения является создание живой вакцины на основе биологически активного штамма Enterococcus faecium L3 за счет замещения в структуре его гена пилей на участок гена коронавируса SARS-CoV-2. Создание такой вакцины против инфекции, вызываемой коронавирусом, основано на введении участка ДНК, кодирующего антигенный фрагмент иммуногенных эпитопов вируса SARS-CoV-2, в структуру гена пилей пробиотика.

Реализация указанной технической задачи поясняется конкретными примерами введения гена sarsS коронавируса в хромосомную ДНК в области, кодирующей ген пилей, пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях иммуногенного участка шиповидного белка SARS-CoV-2:

а) получение слитого гена entF - sarsS и его клонирование

б) выявление бактериальных клонов, содержащих ген слитого белка L3-SARS хромосоме

Конструирование живой вакцины на основе биологически активного пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 за счет включения в его пили антигена SARS-CoV-2 позволило объединить в одном препарате эффективность полезных свойств пробиотика и специфического антигенного стимула.

Для получения слитого гена entF-sarsS и его клонирования были сконструированы ДНК-праймеры, представленные в таблице 1, в которой в графе 1 приведены названия праймеров, в графе 2 приведена их ориентация по отношению к положительной цепочке ДНК, а в графе 3 приведены нуклеотидные последовательности, которые были сконструированы в соответствии с направлением цепочки ДНК последовательность от 5' к 3'.

Нуклеотидные последовательности в графе 3 с названиями (в графе 1), с участками, выделенными подчеркиванием, указывают на соответствующие им сайты гидролиза рестрикционными эндонуклеазами.

Фрагмент гена sarsS был синтезирован с последующим клонированием в векторную плазмидную ДНК pAL2-T, фирмой Евроген. Для удобства последующего клонирования сайты рестрикции для NdEI и EcoRI были вставлены во фрагмент гена sarsS при его синтезе.

Для настоящей конструкции была использована рекомбинантная плазмидная ДНК pentF-pspf представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf описанная в предыдущей заявке на изобретение [патент РФ 2701733 «Создание живой вакцины на основе штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumonie», (2018)].

Из плазмидной ДНК pentF-pspf удаляли вставку гена пневмококка pspf и заменяли ее на вставку гена sarsS. Для этого плазмидную ДНК pentF-pspf гидролизовали ферментами NdEI и EcoRI, сайты для которых ограничивают последовательность гена pspf. Такие же сайты рестрикции были заложены в синтезированный фрагмент гена sarsS. Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования. Плазмидная ДНК pAL2-T, содержащая фрагмент гена sarsS, была гидролизована ферментами NdEI и EcoRI. Клонирование рестрицированного фрагмента, кодирующего SARS-Cov-2, осуществляли, используя верхний фрагмент после гидролиза плазмиды pentF-pspf. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК рестрикты выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему E.coli DH5α. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина. В результате трансформации было получено 5 клонов. Из этих клонов были выделены плазмидные ДНК. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdEI и EcoRI (фиг. 1).

Продукты ПЦР плазмидной ДНК, полученные с праймерами CS1 и CS2, и SeqF и CS2 были просеквенированы. Результаты сиквенса показали правильность последовательности плазмидной ДНК, которая содержала нужные фрагменты ДНК энтерококка и ДНК коронавируса (перечень последовательностей SEQ ID No: 1).

Таким образом, в результате клонирования были получена плазмида pentF-sarsS с прогнозируемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину.

В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой было получено 2 трансформанта. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами CS1 и CS2. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали оба трансформанта (фиг. 2).

Для определения интеграции плазмидной ДНК pentF-sarsS в хромосомную ДНК энтерококка была проведена амплификация ДНК, выделенных из 2 клонов с праймерами В1 и CS2. Интеграция плазмидной ДНК pentF-sarsS в хромосомную ДНК энтерококка была обнаружена у обоих трансформантов (фиг. 3). Секвенирование ДНК, выделенной из одного из положительных клонов, обозначенного, как L3-SARS, было проведено с праймерами, соответствующими последовательности гена sarsS (праймер CS2) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер В1) для подтверждения интеграции плазмидной ДНК pentF-sarsS в хромосомную ДНК энтерококка (перечень последовательностей SEQ ID No: 1).

Клон L3-SARS, экспрессирующий ген L3-SARS белка, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.

Ниже приведены конкретные примеры, подтверждающие экспериментально проведение стадий получения живой вакцины против коронавирусной инфекции

Пример 1. Синтез фрагмента ДНК коронавируса и его клонирование в плазмидный вектор pAL2-T

Синтез фрагмента ДНК коронавируса и его клонирование в плазмидный вектор pAL2-T было проведено фирмой Евроген. Для удобства последующего клонирования сайты рестрикции для NdEI и EcoRI были вставлены во фрагмент гена sarsS при его синтезе.

Пример 2. Получение слитого гена entF- sarsS и его клонирование.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pentF-pspf, представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf описанная в предыдущей заявке на патент RU 2701733(13) С1 «Создание живой вакцины на основе штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumonie», (2018)] была использована для создания слитого гена entF-sarsS. Для этого из плазмидной ДНК pentF-pspf вырезали вставку гена пневмококка pspf проведя гидролиз плазмидной ДНК pentF-pspf ферментами NdEI и EcoRI. Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования.

Плазмидная ДНК pAL2-T, содержащая фрагмент гена sarsS, была гидролизована ферментами NdEI и EcoRI (фиг. 1). Клонирование рестрицированного фрагмента гена, кодирующего L3-SARS, осуществляли, используя верхний фрагмент после гидролиза плазмиды pentF-pspf. Продукты гидролиза рестрикионными эндонуклеазами были разделены с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК гидролизаты выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему E.coli DH5α. Среда для отбора клонов E.coli с плазмидой содержала 500 мкг/мл эритромицина. В результате трансформации было получено 5 клонов. Из этих клонов были выделены плазмидные ДНК. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdEI и EcoRI (фиг. 1).

На фиг. 1 представлена электрофореграмма рестрицированных плазмид NdEI и EcoRI. На указанной иллюстрации цифрами обозначены:

1 - плазмидная ДНК pAL2-T, содержащая фрагмент гена sarsS

2 - плазмидная ДНК pentF- sarsS

3 - 100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).

Пример 3. Трансформация энтерококков методом электропорации.

Для электропорации энтерококков культуру Enterococcus faecium L3 сеяли в 3 мл бульона Tood-Hewitt (ТНВ) («HiMedia», Индия) и выращивали в течение ночи при 37°С, затем пересевали в 50 мл бульона ТНВ 1 мл ночной культуры и выращивали ее до оптической плотности при длине волны 650 нм 0.3. После этого культуру помещали в лед и затем отмывали трижды в 20 мл 10% глицерола при температуре 4°С, полученный осадок суспендировали в 0.5 мл стерильного раствора глицерола, переосаждали и конечный осадок ресуспендировали в 0.3 мл того же раствора, разлили по 50 мкл в пробирки и проводили электропорацию в кювете с расстоянием между электродами 1 мм при напряжении 2100 В. Во льду к клеткам добавляли ДНК (полученную интегративную плазмиду pentF-sarsS плазмиду, 300 нг). Оптимальная продолжительность импульса составила 4-5 миллисекунд. После проведения разряда тока в кювету добавляли 1 мл ТНВ, инкубировали 1 час и высевали на чашки с селективной средой, которая содержала 10 мкг/мл эритромицина. Затем ожидали появления трансформантов через 24 часа.

В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой было получено 3 трансформанта. Они были проверены в реакции ПНР с праймерами CS1 и CS2. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали два трансформанта (фиг. 2).

На фиг. 2 показана электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов с праймерами CS1 и CS2

1, 2, 3 - продукты ПЦР ДНК из полученных 2 клонов.

4 - продукт ПЦР плазмидной ДНК pentF-sarsS

5 - 100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).

Была проведена амплификация ДНК, выделенных из 2 клонов для определения интеграции плазмидной ДНК pentF-sarsS в хромосомную ДНК энтерококка с праймерами В1 и CS2. Интеграция плазмидной ДНК pentF-sarsS в хромосомную ДНК энтерококка была обнаружена у обоих трансформантов (фиг. 3).

На фиг. 3, представлена электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов с праймерами В1 и К2, где цифрами обозначены:

1, 2 - продукты ПЦР ДНК из полученных 2 клонов.

3 - 100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).

Секвенирование ДНК, выделенной из одного из положительных клонов, обозначенного, как L3-SARS, было проведено с праймерами, соответствующими последовательности гена sarsS (праймер CS2) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер В1) для подтверждения интеграции плазмидной ДНК pentF-sarsS в хромосомную ДНК энтерококка (перечень последовательностей SEQ ID No: 1).

На фиг. 4 показана нуклеотидная последовательность, показывающая интеграцию плазмидной ДНК pentF-sarsS в хромосомную ДНК энтерококка. Жирным шрифтом выделены последовательности праймеров В1 и CS2.

Этот клон энтерококков, L3-SARS экспрессирующий ген L3-SARS белка, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>	ФГБНУ "ИЭМ"
<120>	Живая вакцина Enterococcus faecium L3-SARS против коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3
<140>
<141>
<150>
<151>
<160>	1
<170>
<210>	1
<211>	1620
<212>	Нуклеотидная последовательность
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Нуклеотидная последовательность, экспрессированная в системе
<400>	1

Atgagagcag ctggtattga gttgaatgat acatttctat ctatttacag tttaaatgga 60

cagtatcagc aacgtgtgtc ttggtataat gacaataatg aatctgtcgg tgaacgtaat 120

attgatatga gagaatttgt tgggtatgaa aaaatgggta gcttacctta ttttgtcaca 180

acagatacag catgtgcaga atacaaagct cctgcgttat caacaaacaa tttaacttca 240

aaagtagtgg gaggacgtgc agaaaaggct tatagctcga atgatcattt caccgatgtt 300

gtaggagctg atacttatca cagaagtggt gtaacgtata cgcttcaagg cgcttcccca 360

acattcatga ttggcgcaaa tacgaatagt atgatgttta gctttgatac tgcattgcta 420

tggacaccac aaccatcgaa gcctacaaaa gaagtgttta acaaagctaa tactgaagag 480

gcagcacaca atattgacaa aaaagtgatt ccacaaggat cagatgttta ctatcatatt 540

catcaaaagt ttgatgcatt aacagtcaac acaatgaaca aatacaaatc atttaaaatc 600

actgatacct ttgacagcaa aaattttgat atggtatcgg atgggaaaaa ctatgatggc 660

gcattg cata tggattattc tgtcctatat aattccgcat cattttccac ttttaagtgt 720

tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat ctctgcttta ctaatgtcta tgcagattca 780

tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa atcgctccag ggcaaactgg aaacattgct 840

gattataatt ataaattacc agatgatttt acaggctgcg ttatagcttg gaactctaac 900

aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat aattacctgt atagattgtt taggaagtct 960

aatctcaaac cttttgagag agatatttca actgaaatct atcaggccgg tagcacacct 1020

tgtaatggtg ttaaaggttt taattgttac tttcctttac aatcgtatgg tttccaaccc 1080

acttatggtg ttggttacca accatacaga gtagtagtac tttcttttga acttctacat 1140

gcaccagcaa ctgtttgtgg acctaaaaag tctactaatt tggaattcta cgaaaaaaac 1200

ctgaaagaat acaccgacaa gctggataaa ctcgagaaag gttctgcgcg agtgatagat 1260

atgagtacag gaaaagatat tacttcagaa ggtacactaa cctatgatag caatttaaga 1320

acgctgaaat gggaagcttc cgctgatttc ttaagtaaaa atcttttaga tggacgagaa 1380

attcaactga tatttacagc taaaactcca ctacagtcag aaaaaaatat tgataaccaa 1440

gccgtagcag cagtagagaa tgtttctaat aaaacgaatg ttgtaacaat tggtgttgat 1500

cctaacttac cacaagtcat tgttcctaga acaggttcta cacatttagt aacaatttta 1560

gtggttagct tagtattact tgtgttagct actcttagtt atgtggctct gaagttcaat 1620

<210>	2
<211>	540
<212>	Аминокислотная последовательность
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Аминокислотная последовательность
<400>	2

Met Arg Ala Ala Gly Ile Glu Leu Asn Asp Thr Phe Leu Ser Ile Tyr

5 10 15

Ser Leu Asn Gly Gln Tyr Gln Gln Arg Val Ser Trp Tyr Asn Asp Asn

20 25 30

Asn Glu Ser Val Gly Glu Arg Asn Ile Asp Met Arg Glu Phe Val Gly

35 40 45

Tyr Glu Lys Met Gly Ser Leu Pro Tyr Phe Val Thr Thr Asp Thr Ala

50 55 60

Cys Ala Glu Tyr Lys Ala Pro Ala Leu Ser Thr Asn Asn Leu Thr Ser

65 70 75 80

Lys Val Val Gly Gly Arg Ala Glu Lys Ala Tyr Ser Ser Asn Asp His

85 90 95

Phe Thr Asp Val Val Gly Ala Asp Thr Tyr His Arg Ser Gly Val Thr

100 105 110

Tyr Thr Leu Gln Gly Ala Ser Pro Thr Phe Met Ile Gly Ala Asn Thr

115 120 125

Asn Ser Met Met Phe Ser Phe Asp Thr Ala Leu Leu Trp Thr Pro Gln

130 135 140

Pro Ser Lys Pro Thr Lys Glu Val Phe Asn Lys Ala Asn Thr Glu Glu

145 150 155 160

Ala Ala His Asn Ile Asp Lys Lys Val Ile Pro Gln Gly Ser Asp Val

165 170 175

Tyr Tyr His Ile His Gln Lys Phe Asp Ala Leu Thr Val Asn Thr Met

180 185 190

Asn Lys Tyr Lys Ser Phe Lys Ile Thr Asp Thr Phe Asp Ser Lys Asn

195 200 205

Phe Asp Met Val Ser Asp Gly Lys Asn Tyr Asp Gly Ala Leu His Met

210 215 220

Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys

225 230 235 240

Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val

245 250 255

Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala

260 265 270

Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp

275 280 285

Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser

290 295 300

Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser

305 310 315 320

Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala

325 330 335

Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro

340 345 350

Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro

355 360 365

Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr

370 375 380

Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Glu Phe Tyr Glu Lys Asn

385 390 395 400

Leu Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Asp Lys Leu Glu Lys Gly Ser Ala

405 410 415

Arg Val Ile Asp Met Ser Thr Gly Lys Asp Ile Thr Ser Glu Gly Thr

420 425 430

Leu Thr Tyr Asp Ser Asn Leu Arg Thr Leu Lys Trp Glu Ala Ser Ala

435 440 445

Asp Phe Leu Ser Lys Asn Leu Leu Asp Gly Arg Glu Ile Gln Leu Ile

450 455 460

Phe Thr Ala Lys Thr Pro Leu Gln Ser Glu Lys Asn Ile Asp Asn Gln

465 470 475 480

Ala Val Ala Ala Val Glu Asn Val Ser Asn Lys Thr Asn Val Val Thr

485 490 495

Ile Gly Val Asp Pro Asn Leu Pro Gln Val Ile Val Pro Arg Thr Gly

500 505 510

Ser Thr His Leu Val Thr Ile Leu Val Val Ser Leu Val Leu Leu Val

515 520 525

Leu Ala Thr Leu Ser Tyr Val Ala Leu Lys Phe Asn

530 535 540

1. Способ создания рекомбинантного штамма энтерококка L3-SARS на основе биологически активного штамма Е. faecium L3, отличающийся тем, что проводят электропорацию культуры энтерококков Enterococcus faecium L3 рекомбинантной плазмидной ДНК pentF-sarsS, имеющей SEQ ID No: 1, и выбирают клон энтерококка L3-SARS, экспрессирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2.

2. Рекомбинантная плазмида pentF-sarsS, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 1, предназначенная для получения клона энтерококка L3-SARS, экспрессирующего белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2.