Комбинированная терапия из антитела к прогастрину и иммунотерапии для лечения рака

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена комбинация для лечения рака, содержащая моноклональное антитело к прогастрину и ингибитор иммунной контрольной точки. Ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело к PD1. Также предложена фармацевтическая композиция, содержащая указанную комбинацию. Изобретение обеспечивает увеличенную терапевтическую эффективность против рака. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 2 пр.

 

Иммунотерапия была фактором, изменяющим правила игры, в области терапии рака. Раковые заболевания человека несут множество соматических мутаций генов и эпигенетически измененных генов, продукты которых потенциально распознаются как чужеродные антигены. Опухолевые клетки избегают эндогенного иммунного ответа посредством индукции толерантности среди опухолеспецифичных Т-клеток. Для обеспечения того, чтобы воспалительный иммунный ответ не был бы постоянно активированным после того, как опухолевые антигены стимулировали ответ, действуют или активируются многие контроли или «контрольные точки». Данные иммунные контрольные точки, главным образом, представлены связыванием рецепторов Т-клеток с лигандами на клетках в микроокружении, окружающем опухоль, образуя иммунологические синапсы, которые затем регулируют функцию Т-клетки.

Один подход для запуска противоопухолевых иммунных ответов назывался «блокадой контрольной точки», что относится к блокаде иммуно-ингибирующих путей, активируемых раковыми клетками. Разработки в терапии на основе иммунных контрольных точек прогрессируют с захватывающей дыхание скоростью. Главный рубеж был преодолен с получением новых молекул, действующих на иммунную систему (защитную систему организма против патогена) и эффективных при определенных раковых заболеваниях. Применение данных новых молекул позволило наблюдать регрессию опухоли у некоторых пациентов с меланомой кожи. Недавние одобрения нескольких блокаторов ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) пути антигена-4-CD80/CD86 (ипилимумаб/ервой) и пути PD-1-PD-L1/PD-L2, таких как ниволумаб (опдиво), пембролизумаб (кейтруда) или атезолизумаб (тецентрик), провозгласило ингибиторы иммунной контрольной точки (IC) - (ICI) - в качестве ключевого компонента продвинутого лечения рака.

Однако даже при меланоме большинство пациентов демонстрируют только ограниченный или временный ответ, тогда как такие обычные раковые заболевания, такие как рак молочной железы, простаты или толстой кишки, отвечают только спорадически. Кроме того, аденокарцинома поджелудочной железы и колоректальная аденокарцинома в общем и целом остаются устойчивыми к данным способам лечения, особенно к блокаде одного агента - PD-1. Несмотря на наблюдения надежных ответов на антитела, блокирующие контрольные точки, таким образом, очевидно то, что не все пациенты даже в пределах данных поднаборов раковых заболеваний, отвечающих на иммунотерапию, демонстрируют регрессию опухоли.

Следовательно, все еще имеется потребность в идентификации дополнительных путей, которые обеспечивают либо агонизм, либо дополнительное ингибирование существующих путей ингибиторов иммунных контрольных точек.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения показали то, что комбинация молекулы, связывающейся с прогастрином, и ингибитора иммунной контрольной точки приводит к большей терапевтической эффективности против рака. А именно, авторы данного изобретения показали то, что введение моноклонального антитела к прогастрину в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки, таким как антитело к PD-1, значительно увеличивает выживание мышей с ксенотрансплантатом линий клеток колоректального рака. Это иллюстрируется медианным временем выживания, которое значимо увеличивается по сравнению с одной из каждой терапий. Кроме того, комбинация указанного моноклонального антитела к прогастрину и ингибитора иммунной контрольной точки приводит к более чем в два раза большему уровню экспрессии интерферона-γ.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к комбинации, содержащей молекулу, связывающуюся с прогастрином, и ингибитор иммунной контрольной точки. Предпочтительно данное изобретение относится к комбинации молекулы, связывающейся с прогастрином, и ингибитора иммунной контрольной точки.

Ингибиторы иммунных контрольных точек

Термин «ингибитор контрольной точки» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле, такой как, например, маленькая молекула, растворимый рецептор или антитело, которое нацелено на иммунную контрольную точку и блокирует функцию указанной иммунной точки. Более конкретно, «ингибитор контрольной точки» в том виде, в котором данный термин используется в данном документе, представляет собой молекулу, такую как, например, маленькая молекула, растворимый рецептор или антитело, которая блокирует определенные белки, образованные некоторыми типами клеток иммунной системы, такими как Т-клетки, и некоторыми раковыми клетками. Такие белки, «иммунные контрольные точки» или «белки иммунных контрольных точек» в том виде, в котором они используются в данном документе, регулируют функцию Т-клеток в иммунной системе. А именно, они помогают поддерживать под контролем иммунные ответы и могут мешать Т-клеткам убивать раковые клетки. Указанные белки иммунных контрольных точек достигают данного результата посредством взаимодействия со специфичными лигандами, которые шлют сигнал в Т-клетку и по существу выключают или ингибируют функцию Т-клетки. Ингибирование данных белков приводит к восстановлению функции Т-клеток и иммунного ответа на раковые клетки. Примеры белков контрольных точек включают CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4 (принадлежит к семейству молекул CD2 и экспрессируется на всех клетках NK (природный киллер), γ и Т-клетках памяти CD8+ (αβ)), CD 160 (также именуемый BY55), CGEN-15049, киназ CHK1 и CHK2, IDO1, A2aR и разные лиганды семейства В-7, но не ограничиваются ими.

В первом воплощении ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор любого из CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4 (принадлежит к семейству молекул CD2 и экспрессируется на всех клетках NK, γδ и Т-клетках памяти CD8+ (αβ)), CD 160 (также именуемого BY55), CGEN-15049, киназ CHK1 и CHK2, IDO1, A2aR и любого из разных лигандов семейства В-7.

Термин «ингибитор» или «антагонист» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле, которая способна ингибировать или иным образом уменьшать одну или более чем одну биологическую активность белка-мишени, такого как любой один из белков иммунных контрольных точек, описанных выше. В некоторых воплощениях ингибитор белка иммунной контрольной точки (например, предложенное в данном документе антагонистическое антитело) может, например, действовать посредством ингибирования или уменьшения иным образом путей активации и/или клеточной сигнализации клетки, экспрессирующей указанный белок иммунной контрольной точки (например, Т-клетки), ингибируя, посредством этого, биологическую активность данной клетки относительно биологической активности в отсутствие данного антагониста.

Типичные ингибиторы иммунной контрольной точки включают антитело к CTLA-4 (например, ипилимумаб), антитело к LAG-3 (например, BMS-986016), антитело к В7-Н3, антитело к В7-Н4, антитело к Tim3 (например, TSR-022, MBG453), антитело к BTLA, антитело к KIR, антитело к A2aR, антитело к CD200, антитело к PD-1 (например, пембролизумаб, ниволумаб, цемиплимаб, пидилизумаб), антитело к PD-L1 (например, атезолизумаб, авелумаб, дурвалумаб, BMS 936559), антитело к VISTA (например, JNJ 61610588), антитело к CD28, антитело к CD80 или CD86, антитело к B7RP1, антитело к В7-Н3, антитело к HVEM, антитело к CD137 (например, урелумаб), антитело к CD137L, антитело к ОХ40 (например, 9 В12, PF-04518600, MEDI6469), антитело к OX40L, антитело к CD40 или CD40L, антитело к GAL9, антитело к IL-10, слитый белок внеклеточного домена лиганда PD-1, например, PDL-1 или PD-L2, и IgG1 (например, АМР-224), слитый белок внеклеточного домена лиганда ОХ40, например, OX40L и IgG1 (например, MEDI6368), лекарственного средства IDO1 (например, эпакадостат) и лекарственного средства A2aR. Целый ряд ингибиторов иммунных контрольных точек был одобрен или находится в настоящее время в клинических испытаниях. Такие ингибиторы включают ипилимумаб, пембролизумаб, ниволумаб, цемиплимаб, пидилизумаб, атезолизумаб, авелумаб, дурвалумаб, BMS 936559, JNJ 61610588, урелумаб, 9 В12, PF-04518600, BMS-986016, TSR-022, MBG453, MEDI6469, MEDI6383 и эпакадостат.

Примеры ингибиторов иммунных контрольных точек перечисляются, например, в Marin-Acevedo et al., Journal of Hematology & Oncology 11: 8, 2018; Kavecansky and Pavlick, AJHO 13(2): 9-20, 2017; Wei et al., Cancer Discov 8(9): 1069-86, 2018.

Предпочтительно ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор CTLA-4, LAG-3, Tim3, PD-1, PD-L1, VISTA, CD1 37, ОХ40 или IDO1.

В некоторых воплощениях данный ингибитор представляет собой низкомолекулярное лекарственное средство. В некоторых воплощениях данный ингибитор представляет собой растворимый рецептор. В некоторых воплощениях данный ингибитор представляет собой антитело.

Термин «низкомолекулярное лекарственное средство» используется в данном документе в широком смысле для названия органического, неорганического или металлоорганического соединения, типично имеющего молекулярную массу меньше, чем примерно 1000. Низко молекулярные лекарственные средства по изобретению охватывают олигопептиды и другие биомолекулы, имеющие молекулярную массу меньше, чем примерно 1000.

«Растворимым рецептором» в данном документе называется пептид или полипептид, содержащий внеклеточный домен рецептора, но не его трансмембранный или цитоплазматический домены.

Подразумевается то, что термин «антитело» в том виде, в котором он используется в данном документе, включает поликлональные и моноклональные антитела. Антитело (или «иммуноглобулин») состоит из гликопротеина, содержащего по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (или домен) (сокращается в данном документе как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена: СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращается в данном документе как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен - CL. Области VH и VL могут дополнительно подразделяться на области гипервариабельности, названные «областями, определяющими комплементарность» (CDR) или «гипервариабельными областями», которые, главным образом, отвечают за связывание эпитопа антигена, и которые вкрапляются в области, которые являются более консервативными, именуемые каркасными областями (FR). Способ идентификации CDR в пределах легких и тяжелых цепей антитела и определения их последовательности хорошо известен специалисту. Во избежание сомнений, в отсутствие какого-либо указания в тексте на противоположное, выражение CDR означает гипервариабельные области тяжелых и легких цепей антитела при определении посредством IMGT, где уникальная нумерация IMGT дает стандартизированное ограничение каркасных областей и областей, определяющих комплементарность, CDR1-IMGT: 27-38, CDR2.

Уникальная нумерация IMGT была определена для сравнения вариабельных доменов, какими бы ни были рецептор антигена, тип цепи или вид [Lefranc М.-Р., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc М.-Р., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., , C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. При уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют то же самое положение, например, цистеин 23 (1-ый CYS), триптофан 41 (КОНСЕРВАТИВНЫЙ-TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2-ой CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT дает стандартизированное отграничение каркасных областей (FR1-IMGT:положения 1-26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 и FR4-IMGT: 118-128) и областей, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: 27-38, CDR2-IMGT: 56-65 и CDR3-IMGT: 105-117. Поскольку пробелы представляют незанятые положения, длины CDR-IMGT (показанные между скобками и разделенные точками, например [8.8.13]) становятся критически важной информацией. Уникальная нумерация IMGT используется в 2D (двумерных) графических представлениях, обозначенных IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] и в 3D (трехмерных) структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, организованных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими разные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента. Антитела могут быть разных изотипов (а именно: IgA, IgD, IgE, IgG или IgM).

«Поликлональное антитело» представляет собой антитело, которое продуцируется среди или в присутствии одного или более чем одного другого неидентичного антитела. В общем, поликлональные антитела продуцируются из В-лимфоцита в присутствии нескольких других В-лимфоцитов, продуцирующих неидентичные антитела. Обычно поликлональные антитела получают непосредственно от иммунизированного животного.

Термин «моноклональное антитело» обозначает антитело, происходящее из почти гомогенной популяции антител, где данная популяция содержит идентичные антитела, за исключением нескольких возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут находиться в минимальных пропорциях. Моноклональное антитело возникает в результате роста одного клона клеток, таких как гибридома, и отличается тяжелыми цепями одного класса и подкласса и легкими цепями одного типа.

В некотором воплощении ингибитор представляет собой антагонистическое антитело, т.е. антитело, которое ингибирует или уменьшает одну или более чем одну биологическую активность антигена, как, например, одного из белков иммунных контрольных точек, описанных в данном документе. Некоторые антагонистические антитела существенно или полностью ингибируют одну или более чем одну биологическую активность указанного антигена. Термин «ингибировать» или его грамматический эквивалент, при использовании в контексте антитела, относится к антителу, которое подавляет, ограничивает или уменьшает биологическую активность антигена, с которым связывается данное антитело. Ингибирующий эффект антитела может представлять собой эффект, который приводит к измеряемому изменению в биологической активности антигена.

В одном воплощении ингибитор иммунной контрольной точки выбран в группе, состоящей из ипилимумаба, пембролизумаба, ниволумаба, цемиплимаба, пидилизумаба, атезолизумаба, авелумаба, дурвалумаба, BMS 936559, JNJ 61610588, урелумаба, 9 В12, PF-04518600, BMS-986016, TSR-022, MBG453, MEDI6469, MEDI6383 и эпакадостата.

В одном воплощении ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор CTLA-4, PD-1 или PD-L1. В предпочтительном воплощении указанный ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело к любого из CTLA-4, PD-1 или PD-L1. Более предпочтительно, указанное антитело представляет собой антагонистическое антитело. Даже более предпочтительно указанное антагонистическое антитело выбрано среди ипилимумаба, пембролизумаба, ниволумаба, цемиплимаба, пидилизумаба, атезолизумаба, авелумаба и дурвалумаба.

В одном воплощении ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор PD-1. В предпочтительном воплощении указанный ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело к PD-1. Более предпочтительно указанное антитело представляет собой антагонистическое антитело. Даже более предпочтительно, ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой пембролизумаб, ниволумаб, цемиплимаб или пидилизумаб.

Антитела к hPG

Прогастрин (PG) продуцируется клетками колоректальных опухолей, и полагают, что он стимулирует пролиферацию данных клеток посредством запуска пути трансдукции сигнала, который блокирует нормальные процессы дифференциации клеток, включая процессы, которые приводят к гибели клеток. Исчерпание транскрипта гена гастрина, который кодирует прогастрин, индуцирует дифференциацию клеток и программируемую гибель клеток в опухолевых клетках в моделях CRC (колоректальный рак) in vitro и in vivo, уменьшая пролиферацию опухолевых клеток. Не намереваясь быть связанными какой-либо теорией действия, полагают, что антитела к hPG посредством связывания с PG блокируют или ингибируют его способность взаимодействовать с его партнером(рами) по сигнализации. Это, в свою очередь, ингибирует путь трансдукции сигнала в клетках колоректальных опухолей, что в противном случае приводило бы к пролиферации.

Человеческий пре-прогастрин - пептид из 101 аминокислоты (ссылка аминокислотной последовательности: ААВ19304.1) - представляет собой первичный продукт трансляции гена гастрина. Прогастрин (PG) образуется отщеплением первых 21 аминокислот (сигнального пептида) от препрогастрина. 80-аминокислотная цепь прогастрина подвергается дальнейшему процессингу посредством расщепляющих и модифицирующих ферментов до нескольких биологически активных гормональных форм гастрина: гастрина 34 (G34) и гастрина 34 с глициновым удлинением (G34-Gly), содержащего аминокислоты 38-71 прогастрина, гастрина 17 (G17) и гастрина 17 с глициновым удлинением (G17-Gly), содержащего аминокислоты 55-71 прогастрина.

Термин «прогастрин» обозначает пептид прогастрина млекопитающего и, в частности, человеческий прогастрин. Во избежание сомнений, без какого-либо конкретного определения, выражение «человеческий прогастрин» или «hPG» относится к человеческому PG последовательности SEQ ID NO 1. А именно: человеческий прогастрин содержит N-концевой домен и С-концевой домен, которые не присутствуют в биологически активных гормональных формах гастрина, упомянутых выше. Предпочтительно последовательность указанного N-концевого домена представлена SEQ ID NO 2. В другом предпочтительном воплощении последовательность указанного С-концевого домена представлена SEQ ID NO 3.

«Молекулой, связывающей прогастрин» в данном документе называется любая молекула, которая связывается с прогастрином, но не связывается с гастрином-17 (G17), гастрином-34 (G34), гастрином 17 с глициновым удлинением (G17-Gly) или гастрином 34 с глициновым удлинением (G34-Gly) и С-концевым фланкирующим пептидом (CTFP). Молекула, связывающаяся с прогастрином, по настоящему изобретению может представлять собой любую молекулу, связывающуюся с прогастрином, такую как, например, молекула антитела или молекула рецептора. Предпочтительно молекула, связывающаяся с прогастрином, представляет собой антитело к прогастрину (антитело к hPG) или его антигенсвязывающий фрагмент.

Под терминами «связывающий», «связывается» или тому подобными подразумевается то, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, который при физиологических условиях является относительно стабильным. Способы определения того, связываются ли две молекулы, являются хорошо известными в данной области и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и тому подобные. В конкретном воплощении указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с прогастрином с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза больше, чем его аффинность в отношении связывания с неспецифичной молекулой, такой как BSA (бычий сывороточный альбумин) или казеин. В более конкретном воплощении указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается только с прогастрином.

В более конкретном воплощении настоящее антитело к hPG распознает эпитоп прогастрина, где указанный эпитоп включает аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности N-концевой части прогастрина, где указанная аминокислотная последовательность может включать остатки 10-14 hPG, остатки 9-14 hPG, остатки 4-10 hPG, остатки 2-10 hPG или остатки 2-14 hPG, где аминокислотная последовательность hPG представляет собой SEQ ID NO 1.

В более конкретном воплощении антитело к hPG распознает эпитоп прогастрина, где указанный эпитоп включает аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности С-концевой части прогастрина, где указанная аминокислотная последовательность может включать остатки 71-74 hPG, остатки 69-73 hPG, остатки 71-80 hPG (SEQ ID NO 40), остатки 76-80 hPG или остатки 67-74 hPG, где аминокислотная последовательность hPG представляет собой SEQ ID NO 1.

В более конкретном воплощении антитело к hPG имеет аффинность в отношении прогастрина по меньшей мере 5000 нМ, по меньшей мере 500 нМ, 100 нМ, 80 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 7 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,1 нМ, 50 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 1 пМ или по меньшей мере 0,1 пМ при определении таким способом, как описано в данном документе.

Предпочтительно антитело к hPG представляет собой нейтрализующее антитело к hPG.

Выражение «нейтрализующее антитело к hPG» означает антитело, которое связывается с PG и блокирует PG-зависимую сигнализацию, приводя к ингибированию PG-индуцированных ответов в опухолевых клетках и, в частности, в опухолевых клетках CRC. Ингибирование PG-индуцированных ответов раковых клеток может опосредоваться репрессией дифференциации клеток, репрессией гибели клеток и/или стимулированием пролиферации клеток.

В конкретном воплощении указанное антитело, связывающееся с прогастрином, или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из следующих: поликлональные антитела, моноклональные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела, камелизированные антитела, антитела IgA1, антитела IgA2, антитела IgD, антитела IgE, антитела IgG1, антитела IgG2, антитела IgG3, антитела IgG4 и антитела IgM.

В другом конкретном воплощении антитело, связывающееся с прогастрином, было получено способом иммунизации, известным специалисту в данной области, где в качестве иммуногена используется пептид, аминокислотная последовательность которого содержит всю аминокислотную последовательность прогастрина или ее часть. Более конкретно, указанный иммуноген содержит пептид, выбранный среди следующих:

- пептид, аминокислотная последовательность которого содержит или состоит из аминокислотной последовательности полноразмерного прогастрина и, в частности, полноразмерного человеческого прогастрина SEQ ID NO 1,

- пептид, аминокислотная последовательность которого соответствует части аминокислотной последовательности прогастрина и, в частности, полноразмерного человеческого прогастрина SEQ ID NO 1,

- пептид, аминокислотная последовательность которого соответствует части или полной аминокислотной последовательности N-концевой части прогастрина и, в частности, пептидам, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO 2), и

- пептид, аминокислотная последовательность которого соответствует части или полной аминокислотной последовательности С-концевой части прогастрина и, в частности, пептидам, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEQ ID №3),

- пептид, аминокислотная последовательность которого соответствует части аминокислотной последовательности С-концевой части прогастрина и, в частности, пептидам, содержащим аминокислотную последовательность FGRRSAEDEN (SEQ ID NO 40), соответствующую аминокислотам 71-80 прогастрина.

Специалисту будет понятно то, что такую иммунизацию можно использовать для получения либо поликлональных, либо моноклональных антител в зависимости от того, что является желательным. Способы получения каждого из данных типов антител хорошо известны в данной области. Специалист, таким образом, легко выберет и применит способ получения поликлональных и/или моноклональных антител против любого данного антигена.

Примеры моноклональных антител, которые были получены с использованием иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность "SWKPRSQQPDAPLG", соответствующую аминокислотной последовательности 1-14 человеческого прогастрина (N-концевое окончание), включают моноклональные антитела, обозначенные как: mAb3, mAb4, mAb16, mAb19 и mAb20, как описано в следующих Таблице 1 - Таблице 4, но не ограничиваются ими. Были описаны другие моноклональные антитела, хотя и не ясно, действительно ли данные антитела связываются с прогастрином (WO 2006/032980). Экспериментальные результаты картирования эпитопов показывают то, что mAb3, mAb4, mAb16, mAb19 и mAb20 действительно специфично связываются с эпитопом в пределах указанной N-концевой аминокислотной последовательности hPG. Поликлональные антитела, специфично распознающие эпитоп в пределах N-конца прогастрина, представленного SEQ ID NO 2, были описаны в данной области (см., например, WO 2011/083088).

Примеры моноклональных антител, которые могут быть получены посредством применения иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность "QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN", (С-концевая часть прогастрина), соответствующую аминокислотной последовательности 55-80 человеческого прогастрина, включают антитела, обозначенные как mAb8 и mAb13 в следующих Таблице 5 и 6, но не ограничиваются ими. Экспериментальные результаты картирования эпитопов показывают то, что mAb13 действительно специфично связывается с эпитопом в пределах указанной С-концевой аминокислотной последовательности hPG.

Другие примеры включают моноклональные и/или поликлональные антитела к hPG, полученные с использованием иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 40.

Термины «антитела к N-концу hPG» и «антитела к С-концу hPG» обозначают антитела, связывающиеся с эпитопом, содержащим аминокислоты, расположенные в N-концевой части hPG, или с эпитопом, содержащим аминокислоты, расположенные в С-концевой части hPG соответственно. Предпочтительно термин «антитела к N-концу hPG» относится к антителам, связывающимся с эпитопом, расположенным в домене прогастрина, последовательность которого представляется SEQ ID NO 2. В другом предпочтительном воплощении термин «антитела к С-концу hPG» относится к антителам, связывающимся с эпитопом, расположенным в домене прогастрина, последовательность которого представляется SEQ ID NO 3.

Термин «эпитоп» относится к области антигена, которая связывается антителом. Эпитопы могут быть определены как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы, в общем, представляют собой поднабор структурных эпитопов, и они имеют те аминокислоты, которые непосредственно способствуют аффинности взаимодействия. Эпитопы также могут быть конформационными. В некоторых воплощениях эпитопы могут включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи Сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в некоторых воплощениях они могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда. Определение эпитопа, связанного антителом, может осуществляться любой методикой картирования эпитопов, известной специалисту в данной области. Эпитоп может содержать разные аминокислоты, которые последовательно располагаются в пределах аминокислотной последовательности белка. Эпитоп также может содержать аминокислоты, которые не располагаются последовательно в пределах аминокислотной последовательности белка.

В конкретном воплощении указанное антитело представляет собой моноклональное антитело, выбранное в группе, состоящей из следующих:

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 4, 5 и 6 соответственно или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 4, 5 и 6 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 7, 8 и 9, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 7, 8 и 9 соответственно,

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 10, 11 и 12, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 10, 11 и 12, соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 13, 14 и 15, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 13, 14 и 15 соответственно,

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 16, 17 и 18, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 16, 17 и 18, соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 19, 20 и 21, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 19, 20 и 21 соответственно,

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 22, 23 и 24, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 22, 23 и 24, соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 25, 26 и 27, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 25, 26 и 27 соответственно,

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 28, 29 и 30, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 28, 29 и 30, соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 31, 32 и 33, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 31, 32 и 33, соответственно, и

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 34, 35 и 36, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 34, 35 и 36, соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 37, 38 и 39, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 37, 38 и 39 соответственно. В контексте настоящего изобретения «процентная доля идентичности» или «% идентичности» между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот означает процентную долю идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, полученную после оптимального выравнивания, причем данная процентная доля является чисто статистической, и различия между двумя данными последовательностями распределяются по их длине случайно. Сравнение двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот традиционно проводится посредством сравнения последовательностей после их оптимального выравнивания, причем указанное сравнение может проводиться по отрезку или посредством применения «окна выравнивания». Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться, помимо сравнения вручную, посредством способов, известных специалисту в данной области.

Для аминокислотной последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную и 98%-ную идентичность с эталонной аминокислотной последовательностью, предпочтительные примеры включают примеры, содержащие эталонную последовательность, определенные модификации, а именно: делецию, присоединение или замену по меньшей мере одной аминокислоты, усечение или удлинение. В случае замены одной или более чем одной последовательной или непоследовательной аминокислоты, предпочтительными являются замены, в которых замененные аминокислоты заменяются «эквивалентными» аминокислотами. Здесь подразумевается то, что выражение «эквивалентные аминокислоты» указывает любые аминокислоты, которые вероятно заменяются одной из структурных аминокислот, однако, без модификации биологических активностей соответствующих антител и тех конкретных примеров, определенных ниже.

Эквивалентные аминокислоты могут быть определены либо по их структурной гомологии с аминокислотами, которые они заменяют, либо по результатам сравнительных анализов биологической активности между разными антителами, которые вероятно будут генерироваться.

В более конкретном воплощении указанное антитело представляет собой моноклональное антитело, выбранное в группе, состоящей из следующих:

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 41 и легкую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 42;

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 43 и легкую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 44;

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 45 и легкую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 46;

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 47 и легкую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 48;

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 49 и легкую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 50; и

- моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 51 и легкую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 52.

В конкретном воплощении антитело по настоящей комбинации представляет собой химерное антитело.

Термин «химерное антитело» в том виде, в котором он используется в данном документе, представляет собой антитело, в котором константная область или ее часть изменяется, заменяется или обменивается таким образом, что вариабельная область связывается с константной областью другого вида или принадлежащей другому классу или подклассу антитела. Термин «химерное антитело» также относится к антителу, в котором вариабельная область или ее часть изменяется, заменяется или обменивается таким образом, что константная область связывается с вариабельной областью другого вида или принадлежащей к другому классу или подклассу антитела.

В другом конкретном воплощении антитело настоящей комбинации представляет собой гуманизированное антитело.

Выражение «гуманизированное антитело» в том виде, в котором оно используется в данном документе, означает антитело, которое содержит области CDR, полученные из антитела, происходящего не от человека, причем другие части молекулы данного антитела происходят из одного или нескольких человеческих антител. Кроме того, некоторые остатки отрезка скелета (называемые FR в отношении Каракаса) могут быть модифицированы для сохранения аффинности связывания, согласно методикам, известным специалисту в данной области (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986). Целью гуманизации является уменьшение иммуногенности ксеногенного антитела, такого как мышиное антитело, для введения человеку при поддержании полной аффинности связывания антигена и специфичности антитела.

Гуманизированные антитела по изобретению или их фрагменты могут быть получены методиками, известными специалисту в данной области (как, например, методиками, описанными в документах Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992). Такие гуманизированные антитела являются предпочтительными для их применения в способах, включающих постановку диагнозов in vitro или предупредительное и/или терапевтическое лечение in vivo. Специалисту в данной области также известны другие методики гуманизации. В самом деле, антитела могут быть гуманизированы с использованием множества методик, включающих прививку CDR (ЕР 0451261; ЕР 0682040; ЕР 0939127; ЕР 0566647; US 5530101; US 6180370; US 5585089; US 5693761; US 5639641; US 6054297; US 5886152 и US 5877293), венирование или изменение поверхности (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Padlan Е. А., 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:969-973) и перетасовку цепи (патент США №5565332). Человеческие антитела могут быть получены целым рядом способов, известных в данной области, включающих способы фагового дисплея. См. также патенты США №4444887, 4716111, 5545806 и 5814318; и заявки на международные патенты с номерами публикации WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741.

В более конкретном воплощении указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело, выбранное в группе, состоящей из следующих:

- гуманизированное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 4, 5 и 6, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 4, 5 и 6, соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 7, 8 и 9, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 7, 8 и 9 соответственно,

- гуманизированное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 10, 11 и 12, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 10, 11 и 12, соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 13, 14 и 15, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 13, 14 и 15 соответственно,

- гуманизированное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 16, 17 и 18, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 16, 17 и 18, соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 19, 20 и 21, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 19, 20 и 21 соответственно,

- гуманизированное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 22, 23 и 24, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 22, 23 и 24, соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 25, 26 и 27, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 25, 26 и 27 соответственно,

- гуманизированное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 28, 29 и 30, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 28, 29 и 30, соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 31, 32 и 33, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 31, 32 и 33, соответственно, и

- гуманизированное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 34, 35 и 36, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 34, 35 и 36, соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, предпочтительно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 37, 38 и 39, соответственно, или последовательностей с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO 37, 38 и 39 соответственно, где указанное антитело также содержит константные области легкой цепи и тяжелой цепи, происходящие из человеческого антитела.

В другом более конкретном воплощении указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело, выбранное в группе, состоящей из следующих:

- гуманизированное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO 53 и вариабельную область легкой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO 54;

- гуманизированное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO 55 и вариабельную область легкой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO 56;

- гуманизированное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи аминокислотной последовательности, выбранной между SEQ ID NO 57, 58 и 59, и вариабельную область легкой цепи аминокислотной последовательности, выбранной между SEQ ID NO 60, 61 и 62;

- гуманизированное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи аминокислотной последовательности, выбранной между SEQ ID NO 63, 64 и 65, и вариабельную область легкой цепи аминокислотной последовательности, выбранной между SEQ ID NO 66, 67 и 68;

- гуманизированное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи аминокислотной последовательности, выбранной между SEQ ID NO 69 и 71, и вариабельную область легкой цепи аминокислотной последовательности, выбранной между SEQ ID NO 70 и 72; и

- гуманизированное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи аминокислотной последовательности, выбранной между SEQ ID NO 75 и 76, и вариабельную область легкой цепи аминокислотной последовательности, выбранной между SEQ ID NO 77 и 78;

где указанное антитело также содержит константные области легкой цепи и тяжелой цепи, происходящие из человеческого антитела.

Более предпочтительно, указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO 71, и вариабельную область легкой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO 72, причем указанное антитело также содержит константные области легкой цепи и тяжелой цепи, происходящие из человеческого антитела.

Даже более предпочтительно, указанное антитело содержит тяжелую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 73, и легкую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 74.

Фрагменты антитела

Фрагменты антитела, а именно: его антигенсвязывающие фрагменты, также охватываются данным изобретением.

«Фрагменты антитела» содержат часть полноразмерного антитела, обычно его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fv и Scfv; диатела; линейные антитела; минитела (Olafsen et al. (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323), фрагменты, продуцированные экспрессионной библиотекой Fab, антиидиотипические (анти-Id) антитела, CDR (область, определяющая комплементарность) и эпитопсвязывающие фрагменты любого описанного в данном документе, которые иммуноспецифично связываются с антигенами раковых клеток, вирусными антигенами или микробными антигенами; молекулы одноцепочечного антитела; и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антитела.

Термин «антигенсвязывающий домен» антитела (или «антигенсвязывающий фрагмент») относится к одному или более чем одному фрагменту антитела, который сохраняет способность специфично связываться с антигеном (например, hPG). Было показано то, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых в пределах термина «антигенсвязывающий домен» антитела, включают: (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, CL и СН1; (ii) фрагмент F(ab')2 - двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов V_H и СН1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V_L and V_H одного плеча антитела, (v) однодоменный фрагмент или dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена V_H; и (vi) выделенную область, определяющую комплементарность (CDR), или (vii) комбинацию двух или более чем двух выделенных CDR, которые возможно могут соединяться синтетическим линкером. Кроме того, несмотря на то, что два домена фрагмента Fv - V_L и V_H - кодируются отдельными генами, они могут соединяться с использованием способов генной инженерии синтетическим линкером, который позволяет делать их в виде одной белковой цепи, в которой области V_L и V_H формируют пару с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426 и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Также подразумевается то, что такие одноцепочечные антитела охватываются в пределах термина «антигенсвязывающий домен» антитела.

Данные антигенсвязывающие фрагменты получают с использованием традиционных методик, известных специалистам в данной области, и данные фрагменты подвергают скринингу на применимость таким же самым способом, что и интактные антитела. Антигенсвязывающие части могут быть получены методиками генной инженерии или ферментативным, или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов.

Производные антитела

Антитела к hPG по настоящему изобретению могут быть дополнительно модифицированы так, чтобы содержать дополнительные небелковые группировки, которые известны в данной области и легкодоступны. В частности, в данный документ включаются моноклональные антитела к hPG, которые являются дериватизированными, ковалентно модифицированными или конъюгированными с другими молекулами для применения в диагностических и терапевтических приложениях. Например, но не в качестве ограничения, дериватизированные антитела включают антитела, которые были модифицированы, например, посредством гликозилирования, ацетилирования, ПЭГилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расщеплением, связыванием с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Любые из многочисленных химических модификаций могут осуществляться известными методиками, включающими специфичное химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д., но не ограничивающимися ими. Кроме того, данное производное может содержать одну или более чем одну неклассическую аминокислоту.

Предпочтительно подходящими группировками для дериватизации антитела являются водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси, но не ограничиваются ими. Данный полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и если присоединяется больше, чем один полимер, они могут быть одинаковыми или разными молекулами. В общем, число и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, может определяться на основе соображений, включающих конкретные свойства или функции антитела, подлежащие улучшению, будет ли производное антитела использоваться в терапии при определенных условиях и т.д., но не ограничивающихся ими.

В конкретном примере антитела к hPG по настоящему раскрытию могут присоединяться к группировкам поли(этиленгликоля) (ПЭГ). В конкретном примере антитело представляет собой фрагмент антитела, и группировки ПЭГ присоединяются через любую доступную аминокислотную боковую цепь или функциональную группу концевой аминокислоты, расположенную во фрагменте антитела, например, любую свободную амино, имино, тиольную, гидроксильную или карбоксильную группу. Такие аминокислоты могут встречаться во фрагменте антитела в природе или могут быть сконструированы в данном фрагменте с использованием способов генной инженерии. См., например, патент США №5219996. Можно использовать многие сайты для присоединения двух или более чем двух молекул ПЭГ. Группировки ПЭГ могут быть ковалентно связанными через тиольную группу по меньшей мере одного остатка цистеина, расположенного в данном фрагменте антитела. Когда тиольная группа используется в качестве точки присоединения, можно использовать подходящим образом активированные эффекторные группировки, например, селективные в отношении тиола производные, такие как производные малеимидов и цистеина.

В конкретном примере конъюгатом антитела к hPG является модифицированный фрагмент Fab', который является ПЭГилированным, т.е. имеет ПЭГ (поли(этиленгликоль)), ковалентно присоединенный к нему, например, согласно способу, раскрытому в ЕР0948544. См. также Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997); Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998) и Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545. ПЭГ может быть присоединен к цистеину в шарнирной области. В одном примере фрагмент Fab', модифицированный ПЭГ, имеет малеимидную группу, ковалентно связанную с одной тиольной группой в модифицированной шарнирной области. Остаток лизина может быть ковалентно связан с малеимидной группой, и к каждой из аминогрупп на остатке лизина может быть присоединен метоксиполи(этиленгликолевый) полимер, имеющий молекулярную массу приблизительно 20000 Да. Общая молекулярная масса ПЭГ, присоединенного к фрагменту Fab', может, следовательно, составлять приблизительно 40000 Да.

В другом воплощении предложены конъюгаты антитела и небелковой группировки, которые могут селективно нагреваться под воздействием излучения. В одном воплощении данная небелковая группировка представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны и включает, но не ограничивается, длинами волн, которые не вредят обычным клеткам, но которые нагревают небелковую группировку до температуры, при которой умерщвляются ближние клетки к антителу-небелковой группировке.

Иммуноконъюгаты

В другом аспекте в данном изобретении также предложены иммуноконъюгаты (взаимозаменяемо именуемые «конъюгаты антитело-лекарственное средство» или «ADC»), содержащие антитело к hPG, как описано в данном документе, причем указанное антитело конъюгируется с одним или более чем одним цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство, лекарственное средство, средство, ингибирующее рост, токсин (например, белковый токсин, ферментативно активный токсин бактериального, грибного, растительного или животного поисхождения, или их фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат).

Иммуноконъюгаты использовали для местной доставки цитотоксических средств, т.е. лекарственных средств, которые умерщвляют или ингибируют рост, или пролиферацию клеток при лечении рака (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; патент США №4975278). Иммуноконъюгаты обеспечивают целевую доставку лекарственной группировки в опухоль и внутриклеточное накопление в ней, где системное введение неконъюгированных лекарственных средств может приводить к неприемлемым уровням токсичности для нормальных клеток, а также для раковых клеток, которые стараются устранить (Baldwin et al, Lancet (Mar. 15, 1986) pp.603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp.475-506. Сообщали, что полезными в данных стратегиях являются и поликлональные антитела, и моноклональные антитела (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87). Лекарственные средства, используемые в данных способах, включают дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al., (1986) выше). Токсины, используемые в конъюгатах антитело-токсин, включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, низко молекулярные токсины, такие как гелданамицин (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтансиноиды (ЕР 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) и калихеамицин (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Данные токсины могут оказывать их цитотоксические эффекты посредством механизмов, включающих связывание с тубулином, связывание с ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксические лекарственные средства имеют тенденцию к тому, чтобы быть неактивными или менее активными при конъюгировании с большими антителами или лигандами белковых рецепторов.

В некоторых воплощениях иммуноконъюгат содержит антитело и химиотерапевтическое средство или другой токсин. Полезные в получении иммуноконъюгатов химиотерапевтические средства описываются в данном документе (например, выше). Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут использоваться, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модессина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 г. Доступен целый ряд радиоизотопов для получения радиоконъюгированных антител. Примеры включают 212Bi, 131I, 131In, 90Y и 186Re. Конъюгаты антитела и цитотоксического средства получают с использованием целого ряда бифункциональных агентов для связывания белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCI), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидил суберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), бис-диазониевые производные (такие как бис-(п-диазониябензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано в Vitetta et ah, Science, 238: 1098 (1987).

Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой типичный хелатор для конъюгирования радиоизотопа с антителом. См. W094/11026.

В данном документе также рассматриваются конъюгаты антитела и одного или более чем одного низкомолекулярного токсина, такого как калихеамицин, майтансиноиды, доластатины, ауростатины, трихотецен и СС 1065, и производные данных токсинов, которые имеют активность токсина.

Иммуноконъюгат по изобретению может дополнительно содержать линкер.

Термины «линкер», «линкерное звено» или «связка» означают химическую группировку, содержащую ковалентную связь или цепь атомов, которые ковалентно присоединяют связывающий белок к по меньшей мере одному цитотоксическому средству.

Линкеры могут быть получены с использованием множества бифункциональных агентов, связывающих белки, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)цикпогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCI), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидил суберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), бис-диазониевые производные (такие как бис-(п-диазониябензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой типичный хелатор для конъюгирования цитотоксических средств с системой адресования. Другими сшивающими реактивами могут быть BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые имеются в продаже (например, у Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, III., США).

Линкер может быть «нерасщепляемым» или «расщепляемым».

Нуклеиновые кислоты и экспрессионные системы

Настоящее раскрытие охватывает полинуклеотиды, кодирующие гены легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина для антител, а именно: антител к hPG, векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, способные продуцировать антитела по данному раскрытию.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к одному или более чем одному полинуклеотиду, кодирующему антитело, а именно: антитело, способное к специфичному связыванию с прогастрином, как описано выше.

В первом воплощении предложен полинукпеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела к hPG, описанного выше. Предпочтительно указанная тяжелая цепь содержит три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 4, 5 и 6. Более предпочтительно указанная тяжелая цепь включает тяжелую цепь, содержащую вариабельную область последовательности SEQ ID NO 14. Даже более предпочтительно указанная тяжелая цепь имеет полную последовательность SEQ ID NO 16.

В другом воплощении данный полинукпеотид кодирует легкую цепь антитела к hPG, описанного выше. Предпочтительно указанная легкая цепь содержит три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID NO 7, 8 и 9. Более предпочтительно указанная легкая цепь включает легкую цепь, содержащую вариабельную область последовательности SEQ ID NO 15. Даже более предпочтительно указанная легкая цепь имеет полную последовательность SEQ ID NO 17.

Согласно данному изобретению для экспрессии антитела по изобретению можно использовать целый ряд систем экспрессии. В одном аспекте такие системы экспрессии представляют собой носители, посредством которых интересующие кодирующие последовательности могут быть получены и затем очищены, но также представляют собой клетки, которые могут экспрессировать антитело IgG in situ при временной трансфекции подходящими кодирующими нуклеотидными последовательностями.

Согласно данному изобретению предложены векторы, содержащие полинуклеотиды, описанные выше. В одном воплощении данный вектор содержит полинукпеотид, кодирующий тяжелую цепь интересующего антитела (например, антитела к hPG). В другом воплощении указанный полинукпеотид кодирует легкую цепь интересующего антитела (например, антитела к hPG). Согласно данному изобретению также предложены векторы, содержащие полинуклеотидные молекулы, кодирующие слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител и их зонды.

Для того, чтобы экспрессировать тяжелую и/или легкую цепь интересующего антитела (например, антитела к hPG), полинуклеотиды, кодирующие указанные тяжелую и/или легкую цепи, вставляют в экспрессионные векторы таким образом, что гены связываются функциональным образом с транскрипционными и трансляционными последовательностями.

«Связанные функциональным образом» последовательности включают и последовательности контроля экспрессии, которые являются смежными с интересующим геном, и последовательности контроля экспрессии, которые действуют удаленно или на расстоянии для контроля интересующего гена. Термин «последовательность контроля экспрессии» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полинукпеотидным последовательностям, которые являются необходимыми для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Последовательности контроля экспрессии включают подходящие последовательности инициации транскрипции, терминации, последовательности промотора и энхансера; сигналы эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые усиливают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые увеличивают стабильность белка; и, если это желательно, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Природа таких контрольных последовательностей отличается, в зависимости от организма-хозяина; у прокариот такие контрольные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции; у эукариот обычно такие контрольные последовательности включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Подразумевается то, что термин «контрольные последовательности» включает, как минимум, все компоненты, присутствие которых является важным для экспрессии и процессинга, и также может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является полезным, например, лидерные последовательности и последовательности партнеров слияния.

Подразумевается то, что термин «вектор» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он был связан. Одним типом вектора является «плазмида» - данный термин относится к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный репликатор и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, посредством этого, реплицируются вместе с геномом хозяина.

Некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они связаны функциональным образом. Такие векторы называются в данном документе «рекомбинантными экспресс ионными векторами» (или просто «экспрессионными векторами»). В общем, экспрессионные векторы, используемые в методиках генной инженерии, находятся в виде плазмид. В настоящем описании изобретения термины «плазмида» и «вектор» могут использоваться взаимозаменяемо, так как плазмида является чаще всего используемой формой вектора. Однако подразумевается то, что данное изобретение включает такие формы экспрессионных векторов, как бактериальные плазмиды, YAC (искусственные дрожжевые хромосомы), космиды, ретровирус, эписомы, полученные из EBV (вирус Эпштейна-Барр), и все другие векторы, которые специалист будет знать как удобные для обеспечения экспрессии тяжелой и/или легкой цепей интересующего антитела (например, антитела к hPG). Специалисту будет известно то, что полинуклеотиды, кодирующие тяжелые и легкие цепи, могут быть клонированы в разные векторы или в тот же самый вектор. В предпочтительном воплощении указанные полинуклеотиды клонируются в два вектора.

Полинуклеотиды по изобретению и векторы, содержащие данные молекулы, можно использовать для трансформации подходящей клетки-хозяина. Подразумевается то, что термин «клетка-хозяин» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к клетке, в которую был введен рекомбинантный экспрессионный вектор для того, чтобы экспрессировать интересующее антитело (например, антитело к hPG). Следует понимать то, что подразумевается то, что такие термины относятся не только к конкретной клетке субъекта, но также и к потомству такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут происходить определенные модификации либо из-за мутации, либо из-за влияний окружающей среды, такое потомство, на самом деле, может не быть идентичным родительской клетке, но все еще включается в пределы объема термина «клетка-хозяин» в том виде, в котором он используется в данном документе.

Трансформация может осуществляться любым известным способом введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Такие способы хорошо известны специалисту в данной области и включают опосредованную декстраном трансформацию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию, опосредованную полибреном, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинукпеотида в липосомы, биолистическую инъекцию или прямую микроинъекцию ДНК в ядра.

Клетка-хозяин может быть сотрансфицирована одним или более чем одним экспрессионным вектором. Например, клетка-хозяин может быть трансфицирована вектором, кодирующим и тяжелую цепь, и легкую цепь интересующего антитела (например, антитела к hPG), как описано выше. В качестве альтернативы, клетка-хозяин может быть трансформирована первым вектором, кодирующим тяжелую цепь интересующего антитела (например, антитела к hPG), и вторым вектором, кодирующим легкую цепь указанного антитела. Для экспрессии рекомбинантных терапевтических иммуноглобулинов обычно используются клетки млекопитающих, особенно для экспрессии целых рекомбинантных антител. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки НЕК293 (клетки эмбриональной почки человека 293) или СНО (клетки яичника китайского хомяка), в сочетании с вектором, содержащим сигнал экспрессии, такой как сигнал, несущий промоторный элемент главного промежуточного раннего гена от человеческого цитомегаловируса, представляют собой эффективную систему для экспрессии гуманизированного антитела к hPG по изобретению (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).

Кроме того, может быть выбрана клетка-хозяин, которая модулирует экспрессию вставленных последовательностей или модифицирует и подвергает процессингу генный продукт конкретным желательным способом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг белковых продуктов могут быть важными для функции белка. Разные клетки-хозяева имеют характеристики и специфические механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Выбирают подходящие линии клеток или системы хозяев для обеспечения правильной модификации и процессинга интересующего экспрессируемого антитела. Следовательно, можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным аппаратом для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают клетки СНО, COS (клетки почки обезьяны), HEK293, NS/0, BHK (клетки почки детенышей хомяка), Y2/0, 3Т3 или миеломы, но не ограничиваются ими (все данные линии клеток доступны в общедоступных депозитариях, таких как Национальная коллекция культур микроорганизмов, Париж, Франция, или Американская коллекция типовых клеточных культур, Manassas, VA, США).

Для долговременной продукции рекомбинантных белков с высоким выходом предпочтительной является стабильная экспрессия. В одном воплощении данного изобретения можно сконструировать линии клеток, которые стабильно экспрессируют антитело. Скорее, чем применение экспрессионных векторов, которые содержат вирусные репликаторы, клетки-хозяева трансформируются ДНК под контролем подходящих регуляторных элементов экспрессии, включающих промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и другие подходящие последовательности, известные специалисту в данной области, и селектируемый маркер. После введения чужеродной ДНК генетически модифицированным клеткам можно давать расти в течение одних-двух суток в обогащенной среде, и затем они переводятся на селективную среду. Селектируемый маркер на рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к селекции и позволяет клеткам стабильно интегрировать данную плазмиду в хромосому и размножать ее в линии клеток. В данной области известны другие способы конструирования стабильных линий клеток. В частности, были разработаны способы сайт-специфичной интеграции. Согласно данным способам трансформированная ДНК под контролем подходящих регуляторных элементов экспрессии, включающих промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и другие подходящие последовательности, интегрируется в геном клетки-хозяина в специфическом сайте-мишени, который ранее был подвергнут расщеплению (Moele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104(9): 3055-3060; US 5792632; US 5830729; US 6238924; WO 2009/054985; WO 03/025183; WO 2004/067753).

Можно использовать целый ряд систем селекции согласно данному изобретению, включая гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., Cell 11:223, 1977), гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48: 202, 1992), глутаматсинтазную селекцию в присутствии метионинсульфоксимида (Adv Drug Del Rev, 58: 671, 2006, и сайт в интернете или литература Lonza Group Ltd.) и гены аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., Cell 22: 817, 1980) в клетках tk, hgprt или aprt соответственно. Также можно использовать устойчивость к антиметаболитам в качестве основы селекции в отношении следующих генов: dhfr, который придает устойчивость к метотрексату (Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 357, 1980); gpt, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072,1981); neo, который придает устойчивость к аминогликозиду, G-418 (Wu et al., Biotherapy 3: 87, 1991); и hygro, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre et al., Gene 30: 147, 1984). Для отбора желательного рекомбинантного клона можно традиционно использовать способы, известные в области генной инженерии, и такие способы описываются, например, в Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993). Уровни экспрессии антитела могут быть увеличены посредством амплификации вектора. Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей антитело, является амплифицируемым, увеличение уровня ингибитора, присутствующего в культуре, будет увеличивать число копий маркерного гена. Поскольку амплифицированная область ассоциирована с геном, кодирующим антитело IgG по изобретению, продукция указанного антитела также будет возрастать (Crouse et al., Mol Cell Biol 3: 257, 1983). Существуют альтернативные способы осуществления экспрессии гена по изобретению, и они известны специалисту в данной области. Например, модифицированный белок с цинковыми пальцами может быть сконструирован таким образом, что он приобретает способность к связыванию с регуляторными элементами экспрессии выше гена по изобретению; экспрессия указанного сконструированного белка с цинковыми пальцами (ZFN) в клетке-хозяине по изобретению приводит к увеличению продукции белка (см., например, Reik et al., Biotechnol. Bioeng., 97(5): 1180-1189, 2006). Кроме того, ZFN может стимулировать интеграцию ДНК в заданное геномное положение, приводя к высокоэффективному сайтспецифичному добавлению гена (Moehle et al, Proc Natl Acad Sci USA, 104: 3055, 2007).

Интересующее антитело (например, антитело к hPG) может быть получено выращиванием культуры трансформированных клеток-хозяев при необходимых условиях культивирования для экспрессии желательного антитела. Полученное в результате экспрессированное антитело можно затем очищать из культуральной среды или клеточных экстрактов. Растворимые формы интересующего антитела (например, антитела к hPG) могут быть выделены из супернатанта культуры. Его затем можно очищать любым способом, известным в области очистки молекулы иммуноглобулина, например, хроматографией (например, ионообменная, аффинная, в частности, на основе аффинности белка А в отношении Fc и так далее), центрифугированием, дифференциальной растворимостью или любой другой стандартной методикой очистки белков. Подходящие способы очистки будут очевидными обычному специалисту в данной области.

Другой аспект данного изобретения, таким образом, относится к способу получения антитела (например, антитела к hPG), описанному в данном документе, включающему следующие стадии:

а) выращивание вышеописанной клетки-хозяина в культуральной среде при подходящих условиях культивирования; и

б) выделение антитела (например, антитела к hPG) из культуральной среды или из указанных культивируемых клеток.

Фармацевтические композиции

Комбинация моноклональных антител к hPG и ингибиторов иммунной контрольной точки может быть приготовлена в композициях. Возможно, данные композиции могут содержать одно или более чем одно дополнительное терапевтическое средство, как, например, третьи терапевтические средства, описанные ниже. Данные композиции обычно будут поставляться как часть стерильной фармацевтической композиции, которая обычно будет включать фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.В другом аспекте согласно данному изобретению, таким образом, предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело к hPG, ингибитор иммунной контрольной точки и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

Данная композиция может находиться в любой подходящей форме (в зависимости от ее желательного способа введения пациенту). Термин «осуществление введения» в том виде, в котором он используется в данном документе, подразумевает способ предоставления субъекту дозировки соединения (например, антитела к hPG и/или ингибитора иммунной контрольной точки, как описано выше) или композиции (например, фармацевтической композиции, например, фармацевтической композиции, содержащей антитело к hPG и/или ингибитор иммунной контрольной точки, как описано выше). Композиции, используемые в способах, описанных в данном документе, могут вводиться, например, интравитреально (например, посредством интравитреальной инъекции), посредством глазных капель, внутримышечно, внутривенно, внутрикожно, чрескожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, в область поражения, интракраниально, внутрисуставно, в предстательную железу, интраплеврально, внутритрахеально, интратекально, интраназально, интравагинально, интраректально, местно, внутриопухолево, перитонеально, подкожно, под конъюнктиву, интравезикулярно, на слизистую, интраперикардиально, внутрипупочно, в глаз, внутриглазнично, перорально, местно, чрескожно, посредством ингаляции, посредством инъекции, посредством имплантации, посредством инфузии, посредством непрерывной инфузии, посредством локализованной перфузии, непосредственно омывающей клетки-мишени, посредством катетера, посредством лаважа, в кремах или в жидких композициях. Композиции, используемые в способах, описанных в данном документе, также можно вводить системно или локально. Способ введения может варьировать, в зависимости от разных факторов (например, вводится соединение или композиция, и лечится тяжесть состояния, заболевания или расстройства). Самый подходящий путь введения в любом данном случае будет зависеть от конкретного антитела, субъекта и природы и тяжести заболевания или физического состояния субъекта. Антитело к hPG и/или ингибитор иммунной контрольной точки могут быть приготовлены в виде водного раствора и введены подкожной инъекцией.

Фармацевтические композиции могут быть с удобством представлены в формах стандартных доз, содержащих заданное количество антитела к hPG и/или ингибитора иммунной контрольной точки на дозу. Такая единица может содержать, например, но без ограничения, от 5 мг до 5 г, например, от 10 мг до 1 г или от 20 до 50 мг.Фармацевтически приемлемые носители для применения в данном раскрытии могут принимать широкий спектр форм, в завсимости, например, от состояния, подлежащего лечению, или пути введения.

Фармацевтические композиции по данному раскрытию могут быть приготовлены для хранения в виде лиофилизированных препаратов или водных растворов посредством смешивания антитела, имеющего желательную степень чистоты, с возможными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами, типично применяемыми в данной области (которые все называются в данном документе «носителями»), т.е. буферизующими агентами, стабилизаторами, консервантами, изотонирующими добавками, неионными детергентами, антиоксидантами и другими разнообразными добавками. См., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). Такие добавки должны быть нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях.

Буферизующие агенты помогают поддерживать рН в интервале, который приближается к физиологическим условиям. Они могут присутствовать в концентрации, варьирующей от примерно 2 мМ до примерно 50 мМ. Подходящие буферизующие агенты для применения в настоящем раскрытии включают и органические, и неорганические кислоты и их соли, как, например, цитратные буферы (например, смесь мононатрия цитрат-динатрия цитрат, смесь лимонная кислота-тринатрия цитрат, смесь лимонная кислота-мононатрия цитрат и т.д.), сукцинатные буферы (например, смесь янтарная кислота-мононатрия сукцинат, смесь янтарная кислота-гидроксид натрия, смесь янтарная кислота-динатрия сукцинат и т.д.), тартратные буферы (например, смесь винная кислота-тартрат натрия, смесь винная кислота-тартрат калия, смесь винная кислота-гидроксид натрия и т.д.), фумаратные буферы (например, смесь фумаровая кислота-мононатрия фумарат, смесь фумаровая кислота-динатрия фумарат, смесь мононатрия фумарат-динатрия фумарат и т.д.), глюконатные буферы (например, смесь глюконовая кислота-натрия глюконат, смесь глюконовая кислота-гидроксид натрия, смесь глюконовая кислота-калия глюконат и т.д.), оксалатные буферы (например, смесь щавелевая кислота-натрия оксалат, смесь щавелевая кислота-натрия гидроксид, смесь щавелевая кислота-калия оксалат и т.д.), лактатные буферы (например, смесь молочная кислота-натрия лактат, смесь молочная кислота-гидроксид натрия, смесь молочная кислота-калия лактат и т.д.) и ацетатные буферы (например, смесь уксусная кислота-натрия ацетат, смесь уксусная кислота-гидроксид натрия и т.д.). Кроме того, можно использовать фосфатные буферы, гистидиновые буферы и соли триметиламина, такие как Tris.

Можно добавлять консерванты для задержки микробного роста и можно добавлять в количествах, варьирующих от 0,2% до 1% (масс/об.). Подходящие консерванты для применения в настоящем раскрытии включают фенол, бензиловый спирт, мета-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, октадецилдиметилбензиламмония хлорид, бензалкония галогениды (например, хлорид, бромид и йодид), гексаметония хлорид и алкилпарабены, такие как метил-или пропилпарабен, кате хин, резорцин, циклогексанол и 3-пентанол. Можно добавлять изотонирующие добавки, иногда известные как «стабилизаторы», для обеспечения изотоничности жидких композиций по настоящему раскрытию, и они включают многоатомные сахароспирты, например, трехатомные или высшие сахароспирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит.Термин «стабилизаторы» относится к широкой категории эксципиентов, которые могут варьировать по функции от объемообразующего агента до добавки, которая солюбилизирует терапевтическое средство или помогает предупреждать денатурацию или прилипание к стенке контейнера. Типичными стабилизаторами могут быть многоатомные сахароспирты (перечисленные выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.д., органические сахара или сахароспирты, такие как лактоза, трегалоза, стахиоза, маннит, сорбит, ксилит, рибит, миоинозит, галактит, глицерин и тому подобые, включая цикпитолы, такие как инозит; полиэтиленгликоль; полимеры аминокислот; серосодержащие восстановители, такие как мочевина, глутатион, тиоктовая кислота, натрия тиогликолят, тиоглицерин, а-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные полипептиды (например, пептиды из 10 остатков или меньше); белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза, глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза, трисахариды, такие как раффиноза, и полисахариды, такие как декстран. Стабилизаторы могут присутствовать в интервале от 0,1 до 10000 массовых частей на часть массы активного белка.

Могут быть добавлены неионные поверхностно-активные вещества или детергенты (также известные как «смачивающие средства») для помощи в солюбилизации терапевтического средства, а также в защите данного терапевтического средства против агрегации, индуцированной встряхиванием, что также допускает воздействие на препарат поверхностного сдвигового усилия без вызова денатурации белка. Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (20, 80 и т.д.), полоксамеры (184, 188 и т.д.), плюроники-полиолы, моноэфиры полиоксиэтиленсорбитана (TWEEN®-20, TWEEN®-80 и т.д.). Неионные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в интервале от примерно 0,05 мг/мл до примерно 1,0 мг/мл, например, от примерно 0,07 мг/мл до примерно 0,2 мг/мл.

Дополнительные разнородные эксципиенты включают объемообразующие агенты (например, крахмал), хелаторы (например, EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота)), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метионин, витамин Е) и сорастворители.

Настоящее изобретение дополнительно направлено на фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере:

i) одно антитело к hPG и

ii) ингибитор иммунной контрольной точки

в качестве комбинированных продуктов для одновременного, раздельного или последовательного применения.

Термин «одновременное применение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к введению двух соединений композиции согласно данному изобретению в одной и идентичной фармацевтической форме.

Термин «раздельное применение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к введению двух соединений композиции согласно данному изобретению в то же самое время в отличных фармацевтических формах.

Термин «последовательное применение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к последовательному введению двух соединений композиции согласно данному изобретению, каждого в отличной фармацевтической форме.

Композиции антител к hPG и ингибиторов иммунной контрольной точки могут вводиться одиночно, в виде смесей одного или более чем одного моноклонального антитела к hPG и/или одного или более чем одного ингибитора иммунной контрольной точки, в смеси или комбинации с другими полезными средствами для лечения рака, а именно: CRC, или дополнительно к другой терапии против рака, а именно: CRC. Примеры подходящей комбинации и дополнительных терапий приводятся ниже.

Настоящим раскрытием охватываются фармацевтические наборы, содержащие нейтрализующие антитела к hPG (включающие конъюгаты антител) и ингибиторы иммунной контрольной точки, описанные в данном документе. Данный фармацевтический набор представляет собой упаковку, содержащую нейтрализующее антитело к hPG и/или ингибитор иммунной контрольной точки (например, либо в лиофилизированной форме, либо в виде водного раствора) и одно или более чем одно из следующего:

- третье терапевтическое средство, например, как описано ниже;

- устройство для введения нейтрализующего антитела к hPG и/или ингибитора иммунной контрольной точки, например, шприц-ручка, игла и/или шприц; и

- вода или буфер фармацевтического уровня качества для ресуспендирования антитела, если данное антитело и/или ингибитор находится в лиофилизированной форме.

Каждая единичная доза антитела к hPG и/или ингибитора иммунной контрольной точки может быть упакована отдельно, и набор может содержать одну или более чем одну единичную дозу (например, две единичные дозы, три единичные дозы, четыре единичные дозы, пять единичных доз, восемь единичных доз, десять единичных доз или больше). В конкретном воплощении каждая одна или более чем одна единичная доза содержится в шприце или шприце-ручке.

Эффективные дозировки

Комбинации антител к hPG и ингибиторов иммунных контрольных точек обычно будут использоваться в эффективном количестве для достижения намеченного результата, например, в эффективном количестве для лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом. Фармацевтические композиции, содержащие антитела к hPG и/или ингибиторы иммунных контрольных точек, могут вводиться пациентам (например, человеческим субъектам) в терапевтически эффективных дозировках.

Термин «терапевтически эффективная дозировка» означает количество активного соединения или конъюгата, которое вызывает желательный биологический ответ у субъекта. Такой ответ включает облегчение симптомов заболевания или расстройства, которое лечат, предупреждение, ингибирование или задержку рецидива симптома заболевания или самого заболевания, увеличение продолжительности жизни субъекта по сравнению с отсутствием лечения, или предупреждение, ингибирование или задержку в прогрессировании симптома заболевания или самого заболевания. Более конкретно, «терапевтически эффективная» дозировка в том виде, в котором данный термин используется в данном документе, представляет собой количество, которое дает терапевтическую пользу. Терапевтически эффективная дозировка также представляет собой дозировку, при которой любые токсические или вредные эффекты данного средства перевешиваются терапевтически полезными эффектами. В контексте терапии CRC термин «терапевтическая польза» означает любое облегчение рака, включая любое одно из или комбинацию остановки или замедления прогрессирования рака (например, от одной стадии рака до следующей), остановку или отсрочку усугубления или ухудшения симптомов или признаков рака, уменьшение тяжести рака, индуцирование ремиссии рака, ингибирование пролиферации опухолевых клеток, размера опухоли или числа опухолей, или уменьшение сывороточных уровней PG.

Определение данного эффективного количества целиком находится в пределах возможностей специалистов в данной области, особенно в свете подробного раскрытия, предоставленного в данном документе. Токсичность и терапевтическую эффективность соединения или конъюгата можно определять стандартными фармацевтическими процедурами в культурах клеток и в экспериментальных животных. Эффективное количество настоящей комбинации или другого терапевтического средства, подлежащего введению субъекту, будет зависеть от стадии, категории и состояния множественной миеломы, и характеристик субъекта, таких как общее состояние здоровья, возраст, пол, масса тела и переносимость лекарственного средства. Эффективное количество настоящей комбинации или другого терапевтического средства, подлежащего введению, также будут зависеть от пути введения и лекарственной формы. Количество и интервал дозировки могут корректироваться индивидуально для предоставления уровней активного соединения в плазме, которые являются достаточными для поддержания желательных терапевтических эффектов.

Количество введенной комбинации антитела к hPG и ингибитора иммунной контрольной точки будет зависеть от целого ряда факторов, включающих природу и стадию CRC, который лечат, форму, путь и место введения, терапевтическую схему (например, используется ли другое терапевтическое средство), возраст и состояние конкретного субъекта, которого лечат, чувствительность пациента, которого лечат, к антителам против hPG и/или ингибиторам иммунных контрольных точек. Подходящая дозировка может быть легко определена специалистом в данной области. В конечном счете, подходящие дозировки, подлежащие применению, будет определять лечащий врач. Эту дозировку можно повторять так часто, как это необходимо. Если развиваются побочные эффекты, количество и/или частоту дозировки можно изменять или уменьшать согласно нормальной клинической практике. Правильная дозировка и схема лечения может быть установлена посредством отслеживания прогресса терапии с использованием традиционных методик, известных специалистам в данной области.

Эффективные дозировки могут исходно оцениваться из анализов in vitro. Например, исходная доза для применения у животных может быть приготовлена для достижения циркулирующей в крови или сыворотке концентрации гуманизированного антитела к hPG, которая находится на уровне или выше аффинности связывания антитела к прогастрину при измерении in vitro. Подобным образом, исходная доза для применения у животных может быть приготовлена для достижения циркулирующей в крови или сыворотке концентрации ингибитора иммунной контрольной точки, которая находится на уровне или выше аффинности связывания данного ингибитора в отношении соответствующего белка иммунной контрольной точки при измерении in vitro. Осуществление расчета дозировок для достижения таких циркулирующих концентраций в крови или сыворотке, принимающее во внимание биодоступность конкретного антитела, целиком находится в пределах возможностей специалистов. Для руководства читатель отсылается к Fingl & Woodbury, "General Principles" в Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Глава 1, последнее издание, Pagamonon Press, и к ссылкам, процитированным там.

Исходные дозировки могут быть оценены из данных in vivo, таких как на животных моделях. Полезные животные модели для анализирования эффективности соединений для лечения CRC хорошо известны в данной области. Дополнительно животные модели CRC описываются в Примерах ниже. Обычные специалисты могут традиционными способами адаптировать такую информацию для определения подходящих дозировок для введения человеку.

Эффективная доза комбинации антитела к hPG и ингибитора иммунной контрольной точки, как описано в данном документе, может варьировать от примерно 0,001 до примерно 75 мг/кг на одно (например, болюсное) введение, многие введения или непрерывное введение, или для достижения сывороточной концентрации 0,01-5000 мкг/мл сывороточной концентрации на одно (например, болюсное) введение, многие введения или непрерывное введение, или любого эффективного интервала или значения в данных пределах, в зависимости от состояния, которое лечат, пути введения и возраста, массы и состояния субъекта. В определенном воплощении каждая доза может варьировать от примерно 0,5 мкг до примерно 50 мкг на килограмм массы тела, например, от примерно 3 мкг до примерно 30 мкг на килограмм массы тела.

Количество, частота и продолжительность введения будут зависеть от целого ряда факторов, таких как возраст, масса и состояние заболевания пациента. Терапевтическая схема для введения может продолжаться в течение от 2 недель до бесконечности, в течение от 2 недель до 6 месяцев, от 3 месяцев до 5 лет, от 6 месяцев до 1 или 2 лет, от 8 месяцев до 18 месяцев или тому подобное. Возможно данная терапевтическая схема обеспечивает повторное введение, например, один раз в сутки, дважды в сутки, каждые двое суток, трое суток, пять суток, одну неделю, две недели или один месяц. Повторное введение может осуществляться в той же самой или в другой дозе. Данное введение можно повторять один раз, дважды, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять раз, десять раз или более. Терапевтически эффективное количество комбинации антитела к hPG и ингибитора иммунной контрольной точки может вводиться в виде одной дозы или на протяжении курса терапевтической схемы, например, на протяжении курса, продолжающегося неделю, две недели, три недели, один месяц, три месяца, шесть месяцев, один год или дольше.

Терапевтические способы

Способность настоящих комбинаций антител к hPG и ингибиторов иммунных контрольных точек блокировать PG-зависимые ответы, включающие пролиферацию клеток, и улучшать ответ на иммунотерапию делает их полезными для лечения рака. Соответственно, один аспект настоящего изобретения, таким образом, относится к настоящей комбинации антитела к hPG и ингибитора иммунной контрольной точки в качестве лекарственного средства.

В другом аспекте согласно настоящему раскрытию предложены способы лечения рака у пациента, нуждающегося в этом. А именно, раковые заболевания, которые можно лечить комбинацией по изобретению, представляют собой раковые заболевания, которые зависят от прогастрина для роста и/или пролиферации. Предпочтительно зависимый от прогастрина рак представляет собой колоректальный рак (CRC). В общем, данные способы включают введение пациенту терапевтически эффективного количества комбинации антитела к hPG и ингибитора иммунной контрольной точки, описанной в данной документе. В другом воплощении согласно настоящему раскрытию предложена комбинация антитела к hPG и ингибитора иммунной контрольной точки, описанная в данной документе, для применения в лечении CRC.

«Субъектом» или «пациентом», которому вводится настоящая комбинация антитела к hPG и ингибитора иммунной контрольной точки, предпочтительно является млекопитающее, такое как непримат (например, корова, свинья, лошадь, кошка, собака, крыса и т.д.) или примат (например, обезьяна или человек). Субъект или пациент может представлять собой человека, такого как взрослый пациент или педиатрический пациент.

Подходящими пациентами для комбинированной терапии антителом к hPG/ингибитором иммунной контрольной точки являются пациенты, у которых диагностирован CRC. CRC может быть любого типа и на любой клинической стадии проявления. Подходящие субъекты включают пациентов с опухолями CRC (операбельными или неоперабельными), пациентов, опухоли которых были хирургически удалены или резецированы, пациенты с опухолью CRC, содержащей клетки, несущие мутацию в онкогене, таком как, например, RAS или APS, пациенты, которые получали или получают другую терапию против CRC в комбинации с или дополнительно к терапии гуманизированным антителом к hPG. Другая терапия против CRC включает химиотерапевтическое лечение, лучевую терапию, хирургическую резекцию и лечение одним или более чем одним терапевтическим антителом, как подробно описано ниже.

Согласно другим воплощениям комбинации антител к hPG и ингибиторов иммунных контрольных точек, как раскрыто в данном документе, вводятся в композиции субъекту, нуждающемуся в предупреждении метастатического колоректального рака, в терапевтически эффективном количестве. Такие субъекты включают субъектов, определенных как имеющие первичный колоректальный рак, но у которых не известно, что рак распространился в удаленные ткани или органы, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях данных способов антитела к hPG представляют собой гуманизированные антитела к hPG.

Согласно другим воплощениям комбинации антител к hPG и ингибиторов иммунных контрольных точек, как раскрыто в данном документе, вводятся в композиции в терапевтически эффективном количестве субъекту, нуждающемуся в предупреждении рецидива метастатического колоректального рака. Такие субъекты включают субъектов, которых ранее лечили от первичного или метастатического колоректального рака, причем после лечения такой рак, по-видимому, исчез, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях данных способов антитела к hPG представляют собой гуманизированные антитела к hPG.

Согласно другим воплощениям комбинации антител к hPG и ингибиторов иммунных контрольных точек, как раскрыто в данном документе, вводятся в композиции в терапевтически эффективном количестве субъекту, нуждающемуся в ингибировании роста стволовых клеток колоректального рака. Такие субъекты включают субъектов, имеющих колоректальный рак, рост или метастазы которого, по меньшей мере частично, приписываются к присутствию в его пределах раковых стволовых клеток, но не ограничиваются ими. Согласно другим воплощениям предложены способы предупреждения или ингибирования роста стволовых клеток колоректального рака посредством приведения в контакт таких стволовых клеток с эффективным количеством композиции антитела к PG/ингибитора иммунной контрольной точки для предупреждения или ингибирования роста таких клеток. Такие способы могут осуществляться in vitro или in vivo. В некоторых воплощениях данных способов антитела к hPG представляют собой гуманизированные антитела к hPG.

Комбинированную терапию антителом к hPG/ингибитором иммунной контрольной точки можно объединять с или дополнять одним или более чем одним другим лечением. Другие лечения включают, без ограничения, химиотерапевтическое лечение, лучевую терапию, хирургическую резекцию и терапию антителами, как описано в данном документе.

Комбинированная терапия антителом к hPG/ингибитором иммунной контрольной точки может быть дополнительной к другому лечению, включая хирургическую резекцию.

Комбинированная терапия в том виде, в котором она предложена в данном документе, включает введение пациенту по меньшей мере двух средств, первое из которых представляет собой комбинацию антитела к hPG/ингибитора иммунной контрольной точки, и второе из которых представляет собой другое терапевтическое средство. Согласно данному воплощению изобретение относится к комбинации антитела к hPG/ингибитора иммунной контрольной точки, описанной выше, для лечения CRC, где указанная комбинация вводится с указанным другим терапевтическим средством. Комбинация антитела к hPG/ингибитора иммунной контрольной точки и другого терапевтического средства может вводиться одновременно, последовательно или раздельно.

Термин «терапевтическое средство» охватывает биологические средства, такие как антитело, пептид, белок, фермент и химиотерапевтические средства. Терапевтическое средство также охватывает иммуноконъюгаты средств, связывающихся с клетками (СВА), и химических соединений, такие как конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC). Лекарственное средство в конъюгатах может представлять собой цитотоксическое средство, такое как цитотоксическое средство, описанное в данном документе.

Говорят, что комбинация антитела к hPG/ингибитора иммунной контрольной точки и другое терапевтическое средство вводятся последовательно, в том виде, в котором это выражение используется в данном документе, если они вводятся пациенту в те же самые сутки, например, на протяжении того же самого посещения пациента. Последовательное введение может происходить с разделением во времени 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 часов. В отличие от этого, говорят, что комбинация по данному раскрытию и другое терапевтическое средство вводятся раздельно, если они вводятся пациенту в разные сутки, например, комбинация по данному раскрытию и другое терапевтическое средство могут вводиться с 1-суточными, 2-суточными или 3-суточными, однонедельными, 2-недельными или месячными интервалами. В способах по настоящему раскрытию введение комбинации по данному раскрытию может предшествовать или следовать после введения другого терапевтического средства.

В качестве неограничивающего примера, настоящая комбинация и другое терапевтическое средство могут вводиться сопутствующе в течение определенного периода времени, с последующим вторым периодом времени, в который введение гуманизированного антитела к hPG по данному раскрытию и другого терапевтического средства чередуется.

Комбинированные терапии по настоящему раскрытию могут приводить к более чем аддитивному или синергическому эффекту, дающему терапевтическую пользу, когда ни комбинация антитела к hPG/ингибитора иммунной контрольной точки, ни другое терапевтическое средство не вводятся в количестве, которое одно является терапевтически эффективным. Таким образом, такие средства могут вводиться в меньших количествах, уменьшая возможность и/или тяжесть нежелательных эффектов.

В предпочтительном воплощении другое терапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство. Термин «химиотерапевтическое средство» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к веществу, которое, при введении субъекту, лечит или предупреждает развитие рака в организме данного субъекта.

Химиотерапевтические средства включают алкилирующие средства, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы митоза, ингибиторы функции хроматина, антиангиогенные средства, антиэстрогены, антиандрогены или иммуномодуляторы, но не ограничиваются ими.

Термин «алкилирующее средство» относится к любому веществу, которое может сшивать или алкилировать любую молекулу, предпочтительно нуклеиновую кислоту (например, ДНК) в клетке. Примеры алкилирующих средств включают азотистый иприт, такой как мехпорэтамин, хлорамбукол, мелфален, хлоргидрат, пипобромен, преднимустин, динатрия фосфат или эстрамустин; оксазофорины, такие как циклофосфамид, альтретамин, трофосфамид, сульфофосфамид или ифосфамид; азиридины или имин-этилены, такие как тиотепа, триэтиленамин или альтетрамин; нитрозомочевину, такую как кармустин, стрептозоцин, фотемустин или ломустин; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, треосульфан или импросульфан; триазены, такие как дикарбазин; или комплексы платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин.

Термин «антиметаболиты» относится к веществам, которые блокируют рост и/или метаболизм клеток, препятствуя определенным активностям, обычно синтезу ДНК. Примеры антиметаболитов включают метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтордезоксиуридин, капецитабин, цитарабин, флударабин, цитозинарабинозид, 6-меркаптопурин (6-МР), 6-тиогуанин (6-TG), хпордезоксиаденозин, 5-азацитидин, гемцитабин, кладрибин, дезоксикоформицин и пентостатин.

Термин «противоопухолевые антибиотики» относится к соединениям, которые могут предотвращать или ингибировать синтез ДНК, РНК и/или белка. Примеры противоопухолевых антибиотиков включают доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, валрубицин, митоксантрон, дактиномицин, митрамицин, пликамицин, митомицин С, блеомицин и прокарбазин.

«Ингибиторы митоза» предотвращают нормальное развитие клеточного цикла и митоза. В общем, ингибировать митоз способны ингибиторы микротрубочек или таксоиды, такие как паклитаксел и доцетаксел. Алкалоиды барвинка, такие как винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин, также способны ингибировать митоз.

Термин «ингибиторы функции хроматина» или «ингибиторы топоизомеразы» относятся к веществам, которые ингибируют нормальную функцию белков, моделирующих хроматин, таких как топоизомераза I или топоизомераза II. Примеры ингибиторов функции хроматина включают, для топоизомеразы I, камптотецин и его производные, такие как топотекан или иринотекан, и, для топоизомеразы II, этопозид, этопозида фосфат и тенипозид.

Термин «антиангиогенное средство» относится к любому лекарственному средству, соединению, веществу или агенту, который ингибирует рост кровеносных сосудов. Типичные антиангиогенные средства включают, но ни в коей мере не ограничиваются следующими: разоксин, маримастат, батимастат, приномастат, таномастат, иломастат, CGS-27023A, галофугинон, COL-3, неовастат, BMS-275291, талидомид, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламин, эндостатин, SU5416, SU6668, интерферон-альфа, EMD121974, интерлейкин-12, IM862, ангиостатин и витаксин.

«Антиэстроген» или «антиэкстрогенное средство» относится к любому веществу, которое уменьшает, оказывает антагонистический эффект или ингибирует действие эстрогена. Примерами антиэкстрогенных средств являются тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, анастрозол, летрозол и экземестан.

«Антиандрогены» или «антиандрогенные средства» относятся к любому веществу, которое уменьшает, оказывает антагонистический эффект или ингибирует действие андрогена. Примерами антиандрогенов являются флутамид, нилутамид, бикалутамид, спиронолактон, ципротерона ацетат, финастерид и цимитидин.

«Иммуномодуляторы» представляют собой вещества, которые стимулируют иммунную систему.

Примеры иммуномодуляторов включают интерферон, интерлейкин, такой как алдеслейкин, ОСТ-43, денилейкина дифлитокс и интерлейкин-2, факторы некроза опухолей, такие как тазонермин или другие иммуномодуляторы, такие как лентинан, сизофиран, роквинимекс, пидотимод, пегадемаза, тимопентин, поли I:С или левамизол в сочетании с 5-фторурацилом.

Относительно дополнительных подробностей, специалист в данной области мог бы обратиться к руководству, редактированному "Association des Enseignants de Chimie " и названному "Traite de chimie vol. 6, antitumouraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003.

В качестве химических агентов или цитотоксических средств также можно упомянуть все ингибиторы киназ, такие как, например, гефитиниб или эрлотиниб.

В общем, примеры подходящих химиотерапевтических средств включают следующие: 1-дегидротестостерон, 5-фторурацила декарбазин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, актиномицин D, адриамицин, альдеслейкин, алкилирующие средства, аллопуринол натрия, алтретамин, амифостин, анастрозол, антрамицин (АМС), антимитотические средства, цис-дихлордиамина платина (II) (DDP) цисплатин), диаминодихлорплатина, антрациклины, антибиотики, антиметаболиты, живая BCG (внутрипузырная), бетаметазона натрия фосфат и бетаметазона ацетат, бикалутамид, блеомицина сульфат, бусульфан, кальция лейковорин, калихеамицин, капецитабин, карбоплатин, ломустин (CCNU), кармустин (BSNU), хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, колхицин, конъюгированные эстрогены, циклофосфамид, циклотосфамид, цитарабин, цитохалазин В, цитоксан, дакарбазин, дактиномицин, дактиномицин (ранее актиномицин), даунирубицина HCI, даунорубицина цитрат, денилейкин-дифтитокс, дексразоксан, дибромманнит, дигидроксиантрациндион, доцетаксел, долазетрона мезилат, доксорубицина HCI, дронабинол, L-аспарагиназа Е, coli, эметин, эпоэтин-а, L-аспарагиназа Erwinia, этерифицированные эстрогены, эстрадиол, эстрамустина натрия фосфат, бромистый этидий, этинилэстрадиол, этидронат, этопозид цитророрум фактор, этопозида фосфат, филграстим, флоксуридин, флуконазол, флударабина фосфат, фторурацил, флутамид, фолиновая кислота, гемцитабина HCI, глюкокортикоиды, гозерелина ацетат, грамицидин D, гранисетрона HCI, гидроксимочевина, идарубицина HCI, ифосфамид, интерферон альфа-2а, иринотекана HCI, летрозол, лейковорин кальция, лейпролида ацетат, левамизола HCI, лидокаин, ломустин, майтанзиноид, меклорэтамина HCI, медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат, мелфалана HCI, меркаптипурин, месна, метотрексат, метилтестостерон, митрамицин, митомицин С, митотан, митоксантрон, нилутамид, октреотида ацетат, ондансетрона HCI, оксалиплатин, паклитаксел, динатрия паминдронат, пентостатин, пилокарбина HCI, плимицин, полифепросан 20 с имплантом кармустина, порфимер натрия, прокаин, прокарбазина HCI, пропранолол, ритуксимаб, сарграмостин, стрептозоцин, тамоксифен, таксол, тегафур, тенипозид, тенопозид, тестолактон, тетракаин, тиотепа, хлорамбуцил, тиогуанин, тиотепа, топотекана HCI, торемифена цитрат, трастузумаб, третиноин, валрубицин, винбластина сульфат, винкристина сульфат и винорелбина тартрат, но не ограничиваются ими.

Комбинации антитела к hPG/ингибитора иммунной контрольной точки, раскрытые в данном документе, могут вводиться пациенту, нуждающемуся в лечении колоректального рака, получающему комбинацию химиотерапевтических средств. Типичные комбинации химиотерапевтических средств включают 5-фторурацил (5FU) в комбинации с лейковорином (фолиновая кислота или LV); капецитабин в комбинации с урацилом (UFT) и лейковорином; тегафур в комбинации с урацилом (UFT) и лейковорином; оксалиплатин в комбинации с 5FU или в комбинации с капецитабином; иринотекан в комбинации с капецитабином; митомицин С в комбинации с 5FU, иринотеканом или капецитабином. Также возможно применение других комбинаций химиотерапевтических средств, раскрытых в данном документе.

Как известно в релевантной области, в клинических испытаниях были стандартизированы химиотерапевтические схемы против колоректального рака с использованием комбинаций разных химиотерапевтических средств. Такие схемы частно известны посредством сокращений и включают 5FU Mayo, 5FU Roswell Park, LVFU2, FOLFOX, FOLFOX4, FOLFOX6, bFOL, FUFOX, FOLFIRI, IFL, XELOX, CAPOX, XELIRI, CAPIRI, FOLFOXIRI. См., например, Chau, I., et al., 2009, Br. J. Cancer 100:1704-19 и Field, K., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:3806-15, которые обе включаются посредством ссылки.

Комбинации антитела к hPG/ингибитора иммунной контрольной точки также можно объединять с другими терапевтическими антителами. Соответственно, комбинированную терапию антителом к hPG/ингибитором иммунной контрольной точки можно объединять с или вводить дополнительно к другому моноклональному антителу, такому как, например, но не в качестве ограничения, моноклональное антитело к EGFR (рецептор EGF (эпидермальный фактор роста)) или моноклональное антитело к VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). Конкретные примеры антител к EGFR включают цетуксимаб и панитумумаб. Конкретный пример антитела к VEGF представляет собой бевацизумаб.

Согласно данному воплощению данное изобретение относится к комбинации антитела к hPG/ингибитора иммунной контрольной точки, описанной выше, для лечения CRC, где указанная комбинация вводится с химиотерапевтическим средством. Комбинация антитела к hPG/ингибитора иммунной контрольной точки и химиотерапевтического средства может вводиться одновременно, последовательно или раздельно.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в области, к которой принадлежит данное изобретение.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: мышам BALB/cAnNRj имплантировали линию клеток колоректальной карциномы - CT26.WT - и обрабатывали одним из контрольного антитела, антитела к PD-1, антитела к PG или комбинацией антитела к PD-1 и антитела к PG: (А) график выживания Каплана-Мейера; (В) медианное время выживания (в сутках).

Фиг. 2: анализ кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция) экспрессии IFNγ у мышей BALB/cAnNRj, которым ксенотрансплантировали линию клеток колоректальной карциномы - CT26.WT - и обрабатывали их одним из контрольного антитела, антитела к PD-1, антитела к PG или комбинацией антитела к PD-1 и антитела к PG.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Мышам BALB/cAnNRj подкожно в бок имплантировали 0,5 М клеток CT26.WT (ATCC-CRL-2638) на мышь в сутки 1. Мышей рандомизировали в индивидуальные группы обработки (п равно 15 мышей на группу), как указано:

Группа контроль: 15 мышей, которым внутрибрюшинно инъецировали NaCI (5 мл/кг) плюс крысиный IgG2A (10 мг/кг - 5 мл/кг) дважды в неделю.

Группа анти-PG: 15 мышей, которым внутрибрюшинно инъецировали NaCI (5 мл/кг) плюс антитело к PG (30 мг/кг - 5 мл/кг) дважды в неделю.

Группа анти-РР-1: 15 мышей, которым внутрибрюшинно инъецировали NaCI (5 мл/кг) плюс антитело к PD1 (10 мг/кг - 5 мл/кг) дважды в неделю.

Группа 4 анти-PG+ анти-РР1: 15 мышей, которым внутрибрюшинно инъецировали антитело к PG (30 мг/кг - 5 мл/кг) плюс антитело к PD1 (10 мг/кг - 5 мл/кг) дважды в неделю.

Антитело к PG представляет собой Mab8, CDR, V_H и V_L которого описываются в Таблице 5.

Антитело к PD-1 представляет собой моноклональное антитело 29F.1A12 (полученное от BioXCell, 10 Technology Dr, Suite 2B West Lebanon, NH 03784, США).

Животных наблюдали и взвешивали дважды в неделю в то же самое время, что и измеряли объемы опухоли с использованием цифрового циркуля. Размер опухоли рассчитывали с использованием следующей формулы: V=длина × ширина² / 2, где длина представляет наибольший диаметр опухоли и ширина представляет перпендикулярный диаметр опухоли. Животных умерщвляли либо в конце исследования, либо когда опухоли достигали объема 1500 мм³, если наблюдалось изъязвление опухоли, если потеря массы тела превышала 20%, или если наблюдали значительные ухудшения здоровья мыши. Умерщвление посредством смещения шейных позвонков осуществляли после газовой анестезии (изофлуран).

На Фиг. 1 показано выживание по Каплану-Мейеру для каждой группы. Логранговый критерий (Мантеля-Кокса) демонстрирует статистическое увеличение выживания между группой комбинации (анти-PG + анти-PDI) и одиночной обработкой (анти-PG или анти-PDI) с увеличением медианы выживания от 15 до 20 суток (плюс 33%, р меньше 0,0001), подтверждая превосходную активность данной комбинации по сравнению с каждой из монотерапий.

Пример 2

Мышам BALB/cAnNRj подкожно в бок имплантировали 0,5 М клеток CT26.WT (ATCC-CRL-2638) на мышь в сутки 1. Мышей рандомизировали в индивидуальные группы обработки (п равно 15 мышей на группу), как указано:

Группа контроль: 15 мышей, которым внутрибрюшинно инъецировали NaCI (5 мл/кг) плюс крысиный IgG2A (10 мг/кг - 5 мл/кг) дважды в неделю.

Группа анти-PG: 15 мышей, которым внутрибрюшинно инъецировали NaCI (5 мл/кг) плюс антитело к PG (30 мг/кг - 5 мл/кг) дважды в неделю.

Группа анти-РР-1: 15 мышей, которым внутрибрюшинно инъецировали NaCI (5 мл/кг) плюс антитело к PD1 (10 мг/кг - 5 мл/кг) дважды в неделю.

Группа 4 анти-PG + анти-PD1: 15 мышей, которым внутрибрюшинно инъецировали антитело к PG (30 мг/кг - 5 мл/кг) плюс антитело к PD1 (10 мг/кг - 5 мл/кг) дважды в неделю.

Через одну неделю после начала обработки 4 мышей на группу умерщвляли, и выделяли опухоль для экстракции РНК и осуществления кПЦР для измерения экспрессии интерферона-гамма (IFNγ). В самом деле, в нескольких публикациях было продемонстрировано то, что ингибиторы CTLA-4 и PD-1, а также другие терапии с блокадой иммунных контрольных точек приводят к увеличению продукции IFNγ. На Фиг. 2 показано то, что антитело к PD1 индуцирует продукцию IFNγ в настоящей мышиной модели, как и ожидается (кратность увеличения 3,2). Интереснее то, что большее увеличение продукции IFNγ наблюдали с использованием комбинированной терапии антителами против PG плюс против PD1 (кратность увеличения 6), подтверждая превосходную активность данной комбинации по сравнению с каждой из монотерапий.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PROGASTRINE ET CANCERS S.а r.l.

<120> КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ ИЗ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ПРОГАСТРИНА

И ИММУНОТЕРАПИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

<130> B375304PCTD37823

<150> US 62/594,755

<151> 20171205

<160> 78

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 80

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly Thr Gly

1 5 10 15

Ala Asn Arg Asp Leu Glu Leu Pro Trp Leu Glu Gln Gln Gly Pro Ala

20 25 30

Ser His His Arg Arg Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val

35 40 45

Ala Asp Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu

50 55 60

Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn

65 70 75 80

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Amino acids 1-14 N-terminal extremity of human progastrin

<400> 2

Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Amino acids 55-80 C-terminal extremity of human progastrin

<400> 3

Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp

1 5 10 15

Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn

20 25

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 4

Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 5

Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 6

Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gln Tyr

1 5

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 7

Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 8

Lys Val Ser

1

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 9

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 10

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Trp

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 11

Phe Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 12

Ala Thr Asp Gly Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 13

Gln Ser Leu Val His Ser Ser Gly Val Thr Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 14

Lys Val Ser

1

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 15

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 16

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 17

Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 18

Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 19

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 20

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 20

Leu Val Ser

1

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 21

Trp Gln Gly Thr His Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 22

Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala

1 5

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Страница 5seq listing

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 23

Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr

1 5

<210> 24

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 24

Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 25

Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr

1 5

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 26

Val Lys Lys Asp Gly Ser His

1 5

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 27

Gly Val Gly Asp Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val

1 5 10

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 28

Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Ala

1 5

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 29

Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr

1 5

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 30

Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe

1 5 10

<210> 31

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 31

Lys Ser Leu Arg His Thr Lys Gly Ile Thr Phe

1 5 10

<210> 32

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 32

Gln Met Ser

1

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 33

Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 34

Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 35

Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr

1 5

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 36

Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr

1 5

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 37

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 38

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 38

Leu Val Ser

1

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 39

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr

1 5

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Amino acids 71-80 C-terminal extremity of human progastrin

<400> 40

Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn

1 5 10

<210> 41

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 41

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105  110

Val Ser Ser

115

<210> 42

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 42

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 43

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 43

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Страница 10seq listing

Trp Ile Glu Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Phe Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asp Gly Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105  110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 44

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 44

Asp Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Ser Gly Val Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 45

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 45

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105  110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 46

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 46

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Arg Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 47

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 47

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105  110

Gln Gly Thr Ile Val Thr Val Ser Ser

115  120

<210> 48

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 48

Gln Leu Ala Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Ser Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met

35 40 45

Glu Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly His Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser

65 70 75 80

Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp

85 90 95

Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

100 105  110

Thr Val Leu

115

<210> 49

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105  110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 50

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr

20 25 30

Lys Gly Ile Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 51

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105  110

Ser Ser

<210> 52

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 52

Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 53

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 53

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Arg Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105  110

Val Ser Ser

115

<210> 54

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 54

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 55

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Страница 17seq listing

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Phe Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asp Gly Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105  110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 56

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Ser Gly Val Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 57

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105  110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105  110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 60

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 60

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 61

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 61

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 62

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 62

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 63

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 63

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105  110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115  120

<210> 64

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 64

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105  110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115  120

<210> 65

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 65

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105  110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115  120

<210> 66

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 66

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met

35 40 45

Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp

85 90 95

Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

100 105  110

Glu Ile Lys

115

<210> 67

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 67

Страница 24seq listing

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Ala Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met

35 40 45

Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp

85 90 95

Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

100 105  110

Glu Ile Lys

115

<210> 68

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 68

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met

35 40 45

Glu Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp

85 90 95

Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

100 105  110

Glu Ile Lys

115

<210> 69

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105  110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 70

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 70

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr

20 25 30

Lys Gly Ile Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 71

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 71

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105  110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 72

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 72

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr

20 25 30

Lys Gly Ile Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 73

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 73

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105  110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120  125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135  140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155  160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170  175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185  190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200  205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215  220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235  240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250  255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265  270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280  285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295  300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315  320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330  335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345  350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360  365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375  380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395  400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410  415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425  430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440  445

<210> 74

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 74

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr

20 25 30

Lys Gly Ile Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105  110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120  125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135  140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155  160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170  175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185  190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200  205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210  215

<210> 75

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 75

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105  110

Ser Ser

<210> 76

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 76

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105  110

Ser Ser

<210> 77

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 77

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105  110

<210> 78

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic peptide

<400> 78

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105  110

38

<---

1. Комбинация для лечения рака, содержащая моноклональное антитело к прогастрину (анти-hPG) и ингибитор иммунной контрольной точки, где указанное антитело к hPG содержит тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 28, 29 и 30, соответственно, и легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 31, 32 и 33, соответственно, и где указанный ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело к PD1.

2. Комбинация по п. 1, в которой указанное антитело к hPG выбрано из одноцепочечных антител, камелизированных антител, химерных антител, антител IgA1, антител IgA2, антител IgD, антител IgE, антител IgG1, антител IgG2, антител IgG3, антител IgG4 и антител IgМ.

3. Комбинация по п. 1 или 2, в которой указанное антитело к hPG представляет собой антитело к С-концу прогастрина.

4. Комбинация по любому из пп. 1-3, в которой указанное антитело к hPG представляет собой нейтрализующее антитело.

5. Комбинация по любому из пп. 1-4, в которой указанное антитело к hPG представляет собой моноклональное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 49, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 50.

6. Комбинация по любому из пп. 1-4, в которой указанное антитело к hPG представляет собой гуманизированное антитело.

7. Комбинация по п. 6, в которой указанное антитело к hPG представляет собой гуманизированное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO 69 и 71, и вариабельную область легкой цепи аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO 70 и 72, причем указанное антитело также содержит константные области легкой цепи и тяжелой цепи, происходящие из человеческого антитела.

8. Комбинация по п. 6 или 7, в которой указанное антитело к hPG содержит вариабельную область тяжелой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO 71 и вариабельную область легкой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO 72, причем указанное антитело также содержит константные области легкой цепи и тяжелой цепи, происходящие из человеческого антитела.

9. Комбинация по любому из пп. 6-8, в которой указанное антитело к hPG содержит тяжелую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 73 и легкую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO 74.

10. Комбинация по любому из пп. 1-9, в которой указанное антитело к PD1 представляет собой пембролизумаб, ниволумаб, цемиплимаб или пидилизумаб.

11. Комбинация по любому из пп. 1-10 для применения в качестве лекарственного средства.

12. Комбинация по любому из пп. 1-10 для применения в лечении колоректального рака.

13. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая комбинацию по любому из пп. 1-10, фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

14. Фармацевтическая композиция по п. 13 для одновременного, раздельного или последовательного применения.