Тестикулярная вакцина как противоопухолевое профилактическое средство

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке противоопухолевых иммунобиологических препаратов. Разработана противоопухолевая вакцина, включающая в себя тестикулярные (cancer/testis) антигены, полученные из сперматогенной ткани млекопитающего, дискордантного по отношению к человеку (например, барана). Получены два вида вакцины: корпускулярный и липосомный. Использованные в виде инъекций обе вакцины способны останавливать или тормозить опухолевый рост, что подтверждено на экспериментах с мышами. Липосомная вакцина также показала свою эффективность при применении peros. Поскольку тестикулярные антигены экспрессируются на разных типах рака, описанная вакцина может быть использована для профилактики развития различных онкологических заболеваний. Вакцину можно использовать как для профилактики развития рака у людей и животных, не страдающих опухолевыми заболеваниями, так и для профилактики развития рецидива опухолевого заболевания после циторедуктивного лечения. Вакцину можно получать и хранить в лиофилизированном виде. Вакцину можно использовать инъекционно или перорально. Вакцина направлена на профилактику или торможение развития злокачественного заболевания. 7 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к разработке противоопухолевых вакцин, содержащих ксеногенные тестикулярные (cancer/testis) антигены. Поскольку тестикулярные антигены являются общими для разных типов рака, такая вакцина может быть использована для профилактики развития различных онкологических заболеваний.

Хорошо известно, что опухолевая клетка отличается от нормальной клетки своим поверхностным рельефом, который формируется потенциально иммуногенными структурами (антигенами). Твердо установлено, что индуцируемые этими структурами иммунные реакции способны вызывать деструкцию опухолевых клеток, и что реактивность иммунной системы во многом определяет исход заболевания (обзор Seledtsov V. and vonDelwig A, 2021). Все опухолеассоциированные антигены могут быть разделены на две группы. Первая включает в себя вирусные и мутантные антигены. Эти антигены трудно выявляемы и являются высокоспецифичными (уникальными) для каждой опухоли. Вторая группа включает в себя дифференцировочные антигены, которые экспрессируются как на опухолевых, так и на нормальных клетках. Особняком в ряду таких дифференцировочных антигенов стоят тестикулярные антигены (продукты MAGEA1, MAGE-A3, MAGE-A4, NY-ESO-1, PRAME, CT83, SSX2 и др). Тестикулярные (cancer/testis) антигены высоко экспрессируются в опухолях различного происхождения (печень, молочная железа поджелудочная железа, кишка, легкие и др.) и практически не экспрессируются нормальными клетками, за исключением клеток яичка и плаценты. Продукты тестикулярных генов придают опухоли туморогенность и высокую ростовую активность. В этой связи, представляется важным то, что клетки 5 наиболее распространенных раков, включая рак легкого и рак молочной железы, характеризуются высокой экспрессией тестикулярных антигенов. По сути, тестикулярные антигены являются универсальными, высокоспецифичными опухолевыми маркерами, наиболее подходящими для использования в качестве противоопухолевых вакцинальных препаратов (обзоры Salmaninejad et al., 2016; Meng et al., 2021). Дифференцировочные антигены, в том числе и тестикулярные, являются эволюционно консервативными молекулами. Следствием этого является высокая степень гомологии между дифференцировочными антигенами человека и животных. С другой стороны, небольшие межвидовые структурные отличия этих антигенов придают им высокую иммуногенность и способность индуцировать перекрестную иммунологическую реактивность по отношению к гомологичным антигенам. Эффективность использования ксеногенных дифференцировочных антигенов для прерывания иммунной толерантности к опухоли была продемонстрирована как в экспериментальных, так и клинических исследованиях. Убедительно показано, что в сравнении с гомологичными антигенами, ксеногенные опухолеассоциированные антигены намного более эффективны в индукции противоопухолевых иммунных реакций (обзор Strioga et al., 2014), и что в достижении противоопухолевого эффекта полиантигенная вакцинация более эффективна в сравнении с моноантигенной вакцинацией (обзор Seledtsov V. and vonDelwig A, 2021).

Известна вакцина для стимуляции противоопухолевого иммунитета, представленная ксеногенными клетками, способными индуцировать иммунные реакции, направленные против широкого спектра опухолеассоциированных антигенов (RU 2192884, МПК A61K 39/00, опубл. 20.11.2002 г.).

Иммуногенность и противоопухолевая активность ксеногенных дифференцировочных антигенов были продемонстрированы в экспериментальных терапевтических мышиных моделях (Селедцов и соавт., 2021, Евразийский патент WO 2016/046651 2016.03.31).Важным преимуществом ксеногенных вакцин, получаемых из здоровых тканей, является неограниченность, воспроизводимость и генетическая стабильность сырья, используемого для их производства.

Задачей изобретения является создание доступной, удобной в использовании тестикулярной вакцины, предназначенной для индукции устойчивого адаптивного противоопухолевого иммунитета.

Техническим результатом изобретения является профилактика или торможение развития злокачественного заболевания.

Технический результат изобретения достигается вакциной для индукции адаптивного противоопухолевого иммунитета, состоящей из тестикулярных антигенов, полученных из сперматогенной ткани млекопитающего, дискордантного по отношению к человеку.

Согласно изобретению вакцина может содержать тестикулярные антигены в корпускулярном виде.

Согласно изобретению вакцина может содержать тестикулярные антигены, заключенные в липосомы.

Согласно изобретению указанные антигены можно получать из сперматогенной ткани половозрелого барана.

Согласно изобретению вакцину можно использовать для профилактики развития рака у людей и животных, не страдающих опухолевыми заболеваниями.

Согласно изобретению вакцину можно использовать для профилактики развития рецидива опухолевого заболевания после циторедуктивного лечения.

Согласно изобретению вакцину можно получать и хранить в лиофилизированном виде.

Согласно изобретению вакцину можно использовать инъекционно.

Согласно изобретению вакцину можно использовать per os.

Ксеногенная тестикулярная полиантигенная вакцина имеет следующие очевидные достоинства и преимущества над ранее описанными противоопухолевыми вакцинами.

1. Вакцина содержит полный набор тестикулярных (cancer/testis) антигенов и способна индуцировать поликлональный иммунный ответ, направленный против различных опухолей. Это означает, что тестикулярная вакцина является универсальной противоопухолевой вакциной.

2. Вакцина не содержит в своем составе тканеспецифичных дифференцировочных антигенов, экспрессирующихся в нормальных клетках взрослого организма (исключение клетки яичка). Это исключает связанный с вакцинацией риск развития тяжелых аутоиммунных заболеваний и иммуноопосредованных расстройств.

3. Вакцина готовится из нормальной сперматогенной ткани, намного менее подверженной мутагенезу и вирусному заражению в сравнении с опухолевыми клеточными линиями, являющимися сырьевым материалом для приготовления большинства ранее описанных вакцин.

4. Вакцина высокоиммунногенна и способна индуцировать иммунный ответ без использования иммуноадъювантов.

5. Технология получения вакцины высокоэкономична и не ограничена количеством сырья (яички животных).

6. Вакцина не содержит опухолевый или генетически модифицированный материал. Это исключает риск туморогенного влияния вакцины на нормальные клетки.

7. Вакцина может быть стандартизована по физическим и биологическим свойствам в соответствии с международными требованиями.

8. Вакцина удобна для транспортировки и хранения. Препарат представляет собой лиофилизированный порошок, готовый к применению после его суспендирования в физиологическом растворе.

9. Липосомальная вакцина может быть использована в виде капель под язык или пищевой добавки.

Согласно современным представлениям, помещение антигенов в липосомы способствует их проникновению в цитоплазму клеток в обход фагоцитарного механизма и стимулирует, тем самым, их иммуногенную презентацию в комплексе с продуктами главного комплекса гистосовместимости I класса. Такая антигенная презентация эффективно индуцирует генерацию цитотоксических Т-лимфоцитов. Настоящее изобретение указывает на то, что помещение вакцинальных ксеногенных тестикулярных антигенов в липосомы значительно повышает их противоопухолевую активность.

Вакцину изготавливают следующим образом.

Для приготовления корпускулярного вакцинального препарата сперматогенную ткань половозрелого барана фрагментировали ножницами и затем суспендировали в холодном фосфатном буфере, мягко выдавливая клетки из фрагментов ткани при помощи стеклянного гомогенизатора. Суспензию клеток выдерживали в течение 7 мин для осаждения крупных агрегатов. Далее клетки переносили в пробирку, промывали холодным солевым раствором посредством центрифугирования. Отмытые клетки инкубировали в 0,1% глутаральдегиде (об./об.) при комнатной температуре в течение 30 мин. После фиксации клетки тщательно промывали и далее подвергали лиофилизации. После достижения вакуума 10^-2 bar продукт выдерживали 2 часа при рабочем охлаждении полок. Затем доводили температуру продукта до минус 15°С (при температуре полок, примерно, 0°С), после чего подогревали полки со скоростью 3-5°С/час. При достижении температуры продукта 20°С проводили досушивание продукта в течение не менее 10 часов.

Для приготовления липосомальной вакцины сперматогенную ткань половозрелого барана тщательно гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в охлажденной дистиллированной воде (из расчета 1 г ткани на 3-5 мл воды). Полученный гомогенат подвергали трехкратной процедуре замораживания-оттаивания, после чего гомогенат центрифугировали (1500 g, 40 мин при 4°C) для осаждения разрушенных клеток. Содержащую тестикулярные антигены надосадочную жидкость хранили в замороженном состоянии. Раствор липидов готовили следующим образом. Липоид С-100 (41,18±0,01 г) и витамин Е (0,56±0,01 г) добавляли в колбу с органическим растворителем (13,45 мл хлороформа + 28,76 мл этанола), содержащим с холестерол (4,5±0,01 г). После растворения веществ объем раствора доводили этиловым спиртом до 432 мл. Липидную пленку формировали в ротационном испарителе. В круглодонную колбу загружали липидный раствор. Колбу погружали в водяную баню (40±1°С), задавали скорость вращения колбы 142 об/мин. Удаление органического растворителя из раствора смеси липидов проводили при остаточном давлении 10-30 мм рт.ст. По мере испарения органического растворителя скорость вращения колбы снижали в диапазоне: 142-97 - 60-20 об/мин. В момент концентрирования смеси до гелеобразного состояния скорость вращения повышали до 100 об/мин. Для полного удаления растворителя из липидной пленки колбу присоединяли к вакуумному (водоструйному) насосу на 10-15 мин. Далее липидную пленку гидратировали в 500 мл солевого раствора (натрия хлорид - 8,01 г; лактоза моногидрат - 91,34 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 4,52 г; натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный - 0,56 г), который смешивали с 500 мл водного раствора, содержащего тестикулярные антигены, при скорости вращения колбы 142 об/мин и при температуре водяной бани 40±1°С. Согласно данным конфокальной микроскопии размер сформированных липосом варьировался в диапазоне 50-200 нм. Полученный липосомальный раствор замораживали при -45±5°С и подвергали лиофилизации.

В экспериментах с изготовленными вакцинами использовали мышей C57BL/6(B6; H-2b), самцов в возрасте от 4 до 6 месяцев.

Опухолевые линии B16 (меланома, В6, Н-2b) и LLC (карциномы, В6, Н-2b) были получены из Российского онкологического центра им Н.Н. Блохина и сохранялись посредством культивирования в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки , 2 мМ L-глутамина и антибиотики.

Каждая экспериментальная группа состояла из 10 животных. В опытных группах мышей иммунизировали 3 раза (2 раза подкожно и 1 раз внутримышечно) с недельными интервалами ксеногенной корпускулярной или липосомальной вакциной в дозе 10⁷ клеток/мышь или 10 мг/мышь, соответственно. Контрольным мышам инъецировали клетки гомологичной (мышиной) сперматогенной ткани или физиологический раствор. Через 14 дней после последней инъекции мышам имплантировали подкожно опухолевые клетки B16 или LLC (2 x10⁵/мышь)

В других экспериментах мышей кормили пищевой пастой смешанной с липосомальным вакцинальным препаратом в соотношении 1:1 в течение 30 дней до имплантации им клеток LLC. Контрольные мыши получали пасту без добавления вакцины.

Каждый вариант опыта, включал в себя не менее 2 однотипных экспериментов. Выживаемость мышей отслеживали ежедневно. Мертвых животных вскрывали, чтобы удостовериться в том, что причиной смерти стал опухолевый процесс. Для статистической оценки общей выживаемости использовали метод Каплана-Мейера. Значение P<0,05 рассматривали как статистически значимое.

Результаты экспериментов проиллюстрированы графиками фиг.1-3.

На фиг.1 показана кривая выживаемости мышей-опухоленосителей, вакцинированных ксеногенными тестикулярными антигенами инъекционно. Мыши C57BL6 были иммунизированы ксеногенной корпускулярной (СV) или липосомальной (LV) вакциной 3 раза с недельными интервалами. Контрольная группа включала в себя животных, инъецированных гомологичными (мышиными) тестикулярными антигенами. На фиг.2 показана продолжительность жизни мышей, которым через 14 дней после последней инъекции имплантировали клетки меланомы B16 (А) или карциномы LLC (Б). Выживаемость мышей оценивали ежедневно.

На фиг.3 показана кривая выживаемости мышей-опухоленосителей, вакцинированных peros. Мыши C57BL6 получали заключенные в липосомы вакцинальные антигены peros в течение 1 месяца до имплантации им опухоли LLC. Контрольная группа мышей-опухоленосителей не получала вакцину. Выживаемость мышей оценивали ежедневно.

Пример 1.

Профилактическая вакцинация мышей корпускулярным препаратом приводила к заметному торможению роста как меланомы B16 (фиг.1), так и карциномы LLC (фиг.2). Опухоль LLC вообще не развилась у 50% вакцинированных животных (время наблюдения 6 месяцев). В сравнении с корпускулярной вакциной, липосомальная вакцина показала заметно большую противоопухолевую эффективность в обеих экспериментальных моделях. В частности, вакцинация липосомальным препаратом обеспечила выживаемость 80% мышей (фиг.2). Все выявленные различия в выживаемости между контрольными и опытными животными были высоко достоверны. Важно, что вакцинация мышей гомологичными (мышиными) тестикулярными антигенами не приводила к формированию противоопухолевого иммунитета и не оказывала влияние на выживаемость мышей-опухоленосителей. Следует отметить, что как меланома B16, так и карцинома LLC характеризуются агрессивным ростом и, как правило, трудно поддаются каким-либо терапевтическим воздействиям.

Пример 2.

В другой серии экспериментов мыши получали липосомальную тестикулярную вакцину peros в виде специальной пасты в течение 1 месяца до имплантации им опухоли LLC. Контрольные мыши получали пасту без вакцины. Как показано на фиг.3, поедание мышами вакцинальных антигенов приводило к очевидному торможению роста опухоли, формированию у них устойчивой противоопухолевой защиты. У половины вакцинированных таким образом мышей опухоль не сформировалась на протяжении всего периода наблюдения (6 месяцев). Эти данные ясно показывают возможность эффективного профилактического применения липосомальной тестикулярной вакцины в таблетированной или капельной формах.

Таким образом, предложенное изобретение позволяет получить из нормальной сперматогенной ткани животного доступную, удобную в использовании, универсальную тестикулярную вакцину для индукции адаптивного противоопухолевого иммунитета.

1. Вакцина для индукции противоопухолевого иммунитета, состоящая из тестикулярных антигенов, полученных из сперматогенной ткани половозрелого барана, дискордантного по отношению к человеку, при этом для приготовления вакцины сперматогенную ткань половозрелого барана фрагментируют и затем суспендируют в холодном фосфатном буфере, мягко выдавливая клетки из фрагментов ткани при помощи стеклянного гомогенизатора, суспензию клеток выдерживают в течение 7 минут, далее клетки переносят в пробирку, промывают холодным солевым раствором посредством центрифугирования, отмытые клетки инкубируют в 1% глутаральдегиде (об./об.) при комнатной температуре в течение 30 мин, после фиксации клетки тщательно промывают и далее подвергают леофилизации.

2. Вакцина для индукции противоопухолевого иммунитета, состоящая из тестикулярных антигенов, полученных из сперматогенной ткани половозрелого барана, дискордантного по отношению к человеку, при этом для приготовления вакцины сперматогенную ткань половозрелого барана тщательно гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе в охлажденной дистиллированной воде из расчета 1 г ткани на 3-5 мл воды, полученный гомогенат подвергают трехкратной процедуре замораживания-оттаивания, после чего гомогенат центрифугируют при 1500 g, 40 мин при 40°С, содержащую тестикулярные антигены надосадочную жидкость хранят в замороженном состоянии.

3. Вакцина по пп. 1, 2, отличающаяся тем, что используется для профилактики развития рака у людей и животных, не страдающих опухолевыми заболеваниями.

4. Вакцина по пп. 1, 2, отличающаяся тем, что используется для профилактики развития рецидива опухолевого заболевания после циторедуктивного лечения.

5. Вакцина по пп. 1, 2, отличающаяся тем, что получена и хранится в лиофилизированном виде.

6. Вакцина по пп. 1, 2, отличающаяся тем, что используется инъекционно.

7. Вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что используется перорально.