Способ получения из ahnfeltia tobuchiensis агарозы, используемой в качестве основы питательных сред

Изобретение относится к области микробиологии для использования в качестве основы питательных сред. Способ осуществляют следующим образом. Подготавливают водоросли Ahnfeltia tobuchiensis. Осуществляют трехкратную экстракцию химическим соединением кальция, в качестве которого используют 1,5%-ный водный раствор окиси кальция температурой 90-100°С. Длительность каждого этапа экстракции составляет 1-2 ч. Отделяют экстракты на каждом этапе и смешивают их. Очищают и желируют полученный экстракт. Сформированный гель из водоросли измельчают, промывают настаиванием в дистиллированной воде и высушивают. Полученный агар заливают дистиллированной водой до его концентрации 5-10 % по массе, расплавляют на водяной бане, последовательно замораживают и оттаивают. После чего желируют и сформированный из агара гель прессуют при давлении 50-100 Па в течение 6-8 ч. Прессованный гель из агара заливают перекисью водорода в количестве 2 % по массе и выдерживают в течение 2 ч при температуре 30°С и рН 9. Полученную агарозу измельчают и прессуют при давлении 50-100 Па в течение 6-8 ч. Сформированный из агарозы коагель измельчают и сушат до постоянной массы при давлении 120-130 Па. Изобретение обеспечивает снижение трудоемкости за счет уменьшения количества и длительности этапов, обеспечение высокой эффективности извлечения целевых продуктов, повышение безопасности производства за счет использования более экологичного реагента, расширение области применения, повышение качества готового продукта, обусловленное низким содержанием сульфатов. 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к технологиям переработки агароносных водорослей и может быть использовано для получения агарозы, используемой в микробиологии в качестве основы питательных сред.

В последние годы биополимеры морских водорослей, такие как агар и агароза, вызывают значительный интерес с точки зрения их использования в фармакологии и медицине, привлекая значительное внимание из-за практически неисчерпаемости ресурсов и естественной доступности. Кроме того, их универсальные свойства, такие как нетоксичность, биосовместимость, биоразлагаемость и гибкость, обеспечивают значительную эффективность использования при многофункциональных приложениях.

Мировым биотехнологическим природным ресурсом агара в основном являются морские красные водоросли семейства Gracilariaceae (порядок Gelidiales). Однако активное использование этих водорослей во многих странах мира для промышленного производства агара привело к истощению их запасов и значительному росту мировых цен на микробиологический агар.

В дальневосточных морях РФ сосредоточены значительные ресурсы других красных водорослей - семейства Ahnfeltiaceae род Ahnfeltia (в частности, его дальневосточного вида - A. tobuchiensis), активный вылов которых в промысловых зонах может быть увеличен за счет сбора штормовых выбросов. В настоящее время в РФ производство микробиологического агара и агарозы из анфельции отсутствует, а биотехнологический потенциал этой водоросли недооценен, несмотря на наличие запаса этого ценного сырья и наличие потребностей внутреннего рынка, что в условиях интенсификации процесса импортозамещения приобретает особую актуальность.

Агар был первым гидрофильным коллоидом, обнаруженным в морских водорослях. Этот биополимер является составным компонентом опорной структуры клеточных стенок красных водорослей и экстрагируется из них после кипячения. Полученный агаровый биополимер представляет собой смесь полисахаридов агарозы и агаропектина. В водных растворах агар образует плотный студень. В результате глубокой переработки и очистки агара, а также удаления агаропектина получается агароза (линейный полисахарид, состоящий из повторяющихся звеньев 1,3-связанной β-D-галактозы и 1,4-связанной 3,6-ангидро-α-L-галактозы, составляющий до 70% состава), которая может быть использована для аффинной хроматографии или в качестве основы питательных сред для культивирования бактерий с научными и клиническими целями (Бурова Н.В., Подкорытова А.В. Физико-химическая характеристика агара из красных водорослей рода Ahnfeltia: рекомендации по его применению // Известия КГТУ,2020; 56:73-87; Egorov A.M., Vakhabov A.Kh., Chernyak V.Ya. Isolation of agarose and granulation of agar and agarose gel. J. Chromatography A 1970; 46:143-148; Martău G.A., Mihai M., Vodnar D.C. The Use of Chitosan, Alginate, and Pectin in the Biomedical and Food Sector-Biocompatibility, Bioadhesiveness, and Biodegradability. Polymers. 2019; 11:1837).

Микробиологи используют агар для приготовления питательных сред для выращивания бактерий более 120 лет. Л. Пастер произвел революцию в микробиологии в 1890-х годах, предложив использовать этот биополимер для культивирования микроорганизмов в виде отдельных колоний и их последующего изучения. Но в последние десятилетия было выявлено несоответствие между общим количеством засеянных и количеством культивируемых бактериальных клеток на чашках с питательными средами, приготовленными на основе агара из морских водорослей. Этот феномен, который в дальнейшем стал проблемой, был определен микробиологами как «большой аномалией подсчета на чашках» («great plate count anomaly»). Природа этого феномена долгое время была нераспознанной и остается в настоящее время не в полной мере определенной (Tanaka T, Kawasaki K, Daimon S, Kitagawa W, Yamamoto K, Tamaki H, Tanaka M, Nakatsu CH, Kamagata Y. A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability. Appl Environ Microbiol. 2014; 80(24):7659-7666).

Изучение причин этого феномена привело к открытию ряда факторов, которые ингибируют рост бактерий. В частности, присутствие фосфатов, которые опосредуют нежелательные химические реакции между компонентами агара в процессе автоклавирования, снижали ростовые характеристики питательных сред, что было подтверждено экспериментами, которые провели Т. Tanaka и др. в 2014 г.

В отличие от агар-агара, агароза содержит меньше заряженных химических групп, в том числе сульфатов, и обладает ярко выраженными гелеобразующими свойствами, образуя гель высокой прочности.

В отличие от синтетических аналогов, агароза, полученная из красных водорослей, уже при температуре 84-96°С плавится и превращается в прозрачную жидкость. Динамическая вязкость расплавленного 1% раствора агарозы составляет 10-15 Па⋅с, что примерно соответствует 50% раствора сахарозы при 20-22°С. Растворы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерезисом они затвердевают, образуя гель, при значительно более низких температурах (30-42°С). Такая особенность облегчает манипуляции с расплавленной агарозой - можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают до 50-55°С и уже при этой температуре дозируют и заливают в чашки Петри или пробирки, что удобно при использовании в питательных средах углеводов и исключает возникновение тепловых деформаций при застывании геля (Martău G.A., Mihai M., Vodnar D.C. The Use of Chitosan, Alginate, and Pectin in the Biomedical and Food Sector-Biocompatibility, Bioadhesiveness, and Biodegradability. Polymers (Basel). 2019; 11:1837; Zhang C, An D, Xiao Q, Chen FQ, Zhang YH, Weng HF, Xiao AF. Convenient Agarose Preparation with Hydrogen Peroxide and Desulfation Process Analysis. Mar Drugs. 2021; 19(6):297).

Известен способ получения агара особой очистки из Анфельции тобучинской, включающий последовательную смену ряда технологических операций:

- замачивание на 24 часа водоросли в известковом растворе (1-2% СаО) в соотношении к массе воздушно-сухой анфельции 1:12-1:15;

- после промывания проводят 7-кратное экстрагирование агара при 1,0-1,2 атм (1-е экстрагирование - без добавления СаО; 2-4-е экстрагирование - с добавлением известкового раствора, 5-7-е экстрагирование - с добавлением воды температурой 85-90°С); полный цикл автоклавирования составляет 29 ч, слив экстракта (температурой 90°С) в отстойник проводят через каждые 9-10 ч при продолжительности отстаивания 4 ч;

- экстракт агара сепарируют и охлаждают до температуры 60°С;

- гелеобразование из экстракта в желировочном аппарате в течение 2 ч;

- разрезание геля и промывка в 2-2,5-кратном объеме водопроводной водой температурой 18-20°С при периодической смене воды (слива в канализацию) и общей продолжительности промывки геля 30-36 ч;

- после слива последней порции воды и стекания геля в течение 2-4 ч его подают в реакторы плавления для получения раствора агара температурой 85-90°С, где охлаждают до температуры 55-60°С, а затем проводят осаждение неагаровых примесей путем сепарирования раствора при температурах 50-55°С и 80°С, а для осаждения примесей используют карбонат кальция;

- гелеобразование из экстракта в желировочном аппарате до температуры 20-22°С, после чего гель отжимают прессованием, измельчают, сушат и обезвоживают прессованием («Сборник технологических инструкций по обработке водорослей». Приказ Министерства рыбного хозяйства СССР (Дальрыба) 466, от 19 июня, 1985 г., с. 18-21, ТУ 9284-095-00472012-97).

При этом готовый продукт содержит 0,3-0,5% сульфатов.

В качестве ближайшего аналога принят способ получения высокоочищенного агара и агарозы из красной водоросли Анфельции тобучинской, включающий подготовку водоросли Ahnfeltia tobuchiensis, ее трехкратную экстракцию химическим соединением кальция, отделение экстрактов на каждом этапе, их смешивание, очистку и желирование, промывание полученного геля водой и его сушку (см. патент РФ № 2189990, МПК C08B 37/12, 2002 г.).

При этом готовый продукт содержит 0,3-0,7% сульфатов.

Недостатком известных аналогов являются высокая трудоемкость технологии, обусловленная многоэтапностью и длительностью, и ограниченная область применения в микробиологии, обусловленная высоким содержанием сульфатов в готовом продукте.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка технологии получения агарозы, которая подходит для приготовления питательных сред, используемых для культивирования бактерий.

Технический результат, который достигается при решении поставленной задачи, выражается в следующем:

- снижение трудоемкости за счет уменьшения количества и длительности этапов;

- обеспечение высокой эффективности извлечения целевых продуктов;

- повышение безопасности производства за счет использования более экологичного реагента;

- расширение области применения, поскольку готовый продукт подходит для приготовления питательных сред, используемых для культивирования бактерий;

- повышение качества готового продукта, обусловленное низким содержанием сульфатов.

Поставленная задача решается тем, что способ получения из Ahnfeltia tobuchiensis агарозы, используемой в качестве основы питательных сред, включающий подготовку водоросли Ahnfeltia tobuchiensis, ее трехкратную экстракцию химическим соединением кальция, отделение экстрактов на каждом этапе, их смешивание, очистку и желирование, промывание полученного геля водой и его сушку, отличается тем, что в качестве химического соединения кальция используют 1,5%-ный водный раствор окиси кальция температурой 90-100°С, а длительность каждого этапа экстракции составляет 1-2 ч, полученные экстракты смешивают, очищают, желируют, сформированный гель из водоросли Ahnfeltia tobuchiensis измельчают, промывают настаиванием в дистиллированной воде и высушивают, полученный агар заливают дистиллированной водой до его концентрации 5-10% по массе, расплавляют на водяной бане, последовательно замораживают и оттаивают, после чего желируют и сформированный из агара гель прессуют при давлении 50-100 Па в течение 6-8 ч, далее прессованный гель из агара заливают перекисью водорода в количестве 2% по массе и выдерживают в течение 2 ч при температуре 30°С и рН 9, после чего полученную агарозу измельчают, прессуют при давлении 50-100 Па в течение 6-8 ч, и сформированный из агарозы коагель измельчают и сушат до постоянной массы при давлении 120-130 Па.

Кроме того, при подготовке Ahnfeltia tobuchiensis промытые водоросли замачивают в воде температурой 60-80°С при гидромодуле 1:15, периодически перемешивая, и через 1 ч воду сливают через сито.

Кроме того, гидромодуль на первом этапе экстракции равен 1:10, а на последующих - 1:15.

Кроме того, гидромодуль на всех этапах экстракции равен 1:15.

Кроме того, отделение экстрактов на каждом этапе осуществляют путем фильтрации.

Кроме того, смесь экстрактов очищают путем центрифугирования.

Кроме того, промытый гель из водоросли Ahnfeltia tobuchiensis высушивают путем прессования с последующей сушкой при температуре 70°С до постоянной массы.

Кроме того, расплавленную на водяной бане смесь агара с водой замораживают и оттаивают до тех пор, пока она не станет прозрачной.

Кроме того, сформированный из агарозы коагель сушат в сублимированной вакуумной сушилке.

Сопоставительный анализ совокупности существенных признаков предлагаемого технического решения и совокупности существенных признаков прототипа и аналогов свидетельствует о его соответствии критерию «новизна».

При этом отличительные признаки формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.

Признак «в качестве химического соединения кальция используют 1,5%-ный водный раствор окиси кальция температурой 90-100°С, а длительность каждого этапа экстракции составляет 1-2 ч», а также признаки зависимых пунктов формулы со второго по четвертый описывают тип используемого экстрагента и режимные характеристики экстракции, влияющие на эффективность извлечения и качество готового продукта.

Температура экстрагента 90-100°С увеличивает выход сухих веществ из сырья в экстрагент на 1% (Polysaccharides and Their Derivatives, 2nd ed., Academic Press, New York 1973, рр. 122-134), что подтверждается относительной плотностью экстракта.

С дальнейшим увеличением температуры вязкость экстрактов, которая связана с межмолекулярными взаимодействиями отталкивания молекул всех компонентов экстракта, изменяется двухфазно: сначала повышается, а затем снижается и в значительной степени зависит от химического состава агаропектина, который у A. tobuchiensis содержит значительное количество заряженных сложноэфирных групп сульфата галактана, а также органические кислоты.

Силы взаимодействия снижают плотность молекул и повышают вязкость экстракта, с увеличением температуры звенья молекул высокомолекулярных соединений колеблются более энергично и вязкость экстракта уменьшается, что наблюдается при Т > 100°С. Кроме того, при повышении температуры скорость молекулярной диффузии увеличивается за счет увеличения кинетической энергии молекул и снижения вязкости экстрагента.

Сокращение времени экстракции в целом и длительности каждого этапа экстракции в частности основано на зарубежной публикации (Polysaccharides and Their Derivatives, 2nd ed., Academic Press, New York 1973, рр. 122-134).

Эмпирические исследования авторов показали, что через 1-2 ч экстракции значимых изменений физических параметров экстракта (коэффициент динамической вязкости и относительной плотности) не происходит вследствие незначительного перехода сухих веществ в жидкую фазу - экстрагент (не более 0,2%).

Зарубежный опыт показывает, что диффузия агара из разрушенных клеток происходит в течение первого часа. Удлинение времени экстрагирования приводит к тому, что в экстрагент переходят балластные вещества (в том числе сульфатсодержащие), что приводит к снижению качества конечного продукта - агарозы (Yousefi M.K., Islami H.R., Filizadeh Y. Effect of extraction process on agar properties of Gracilaria corticata (Rhodophyta) collected from the Persian Gulf. Phycologia 2013; 52(6):481-487).

Учитывая вышесказанное, длительность каждого этапа экстракции 1-2 ч обеспечивает оптимальные условия перехода экстрактивных веществ из сырья в экстрагент.

При гидромодуле 1:10, 1:15 создаются оптимальные условия для повышения экстракции агара и снижения выделения из водоросли неагаровых примесей, что способствует освобождению молекулы агара от отрицательно заряженных низкомолекулярных фракций и сульфатных групп.

Увеличение расхода экстрагента в данном случае будет компенсироваться увеличением качества конечного продукта за счет снижения содержания сульфатов. Следовательно, уменьшение гидромодуля в заявляемом способе (в сравнении с ближайшим аналогом) приводит к повышению экономичности и эффективности процесса экстракции.

Признаки «экстракты смешивают, очищают, желируют, сформированный гель из водоросли Ahnfeltia tobuchiensis измельчают, промывают настаиванием в дистиллированной воде и высушивают» и признаки пятого и шестого зависимых пунктов формулы описывают технологию получения агара из экстрактов.

Признаки «агар заливают дистиллированной водой до его концентрации 5-10% по массе, расплавляют на водяной бане, последовательно замораживают и оттаивают, после чего желируют и сформированный из агара гель прессуют при давлении 50-100 Па в течение 6-8 ч» описывают технологию очистки агара от примесей и его последующее желирование, при этом содержание сульфатов в очищенном агаровом экстракте в виде прессованного геля составляет 0,55-0,62%.

Признаки «прессованный гель из агара заливают перекисью водорода в количестве 2% по массе и выдерживают в течение 2 ч при температуре 30°С и рН 9, полученную агарозу измельчают, прессуют при давлении 50-100 Па в течение 6-8 ч, и сформированный из агарозы коагель измельчают и сушат до постоянной массы при давлении 120-130 Па» и признаки седьмого и восьмого зависимых пунктов формулы описывают технологию десульфатирования агара с получением из него агарозы.

Перекись водорода (Н₂О₂) в сравнении с реагентами, используемыми для щелочной (известковой) обработки сырья, является более экологичным реагентом, который широко применяется в медицине.

В биотехнологии известен отбеливающий эффект Н₂О₂ на агар, который существенно увеличивает качество агара (An D., Xiao Q., Zhang C., Cai M., Zhang Y., Weng H., Chen F., Xiao A. Preparation, characterization, and application of high-whiteness agar bleached with hydrogen peroxide. Food Hydrocoll. 2021; 113:106520). Кроме того, Н₂О₂ часто используется в качестве десульфуратора при добыче нефти для предотвращения загрязнение атмосферы диоксидом серы (Julião D., Mirante F., Ribeiro S.O., Gomes A.C., Valenca R., Ribeiro J.C., Pillinger M., Castro B., Goncalves S., Balula S.S. Deep oxidative desulfurization of diesel fuels using homogeneous and SBA-15-supported peroxophosphotungstate catalysts. Fuel. 2019; 241:616-624).

Как показали исследования, при очистке агара с помощью Н₂О₂ максимальный эффект десульфирования наблюдается при рН 9,0, при котором гидроксильный радикал HO• является основным активным компонентом (Zhang C, An D, Xiao Q, Chen FQ, Zhang YH, Weng HF, Xiao AF. Convenient Agarose Preparation with Hydrogen Peroxide and Desulfation Process Analysis. Mar Drugs. 2021; 19(6):297).

Эмпирически и в результате анализа литературных данных авторами установлено, что максимальный эффект десульфатирования (59%) при концентрации Н₂О₂ 2% по массе достигается при инкубации в течение 2 ч при температуре 30°С, а содержание сульфата в конечном продукте составляет 0,28-0,30%.

Признаки первого зависимого пункта формулы описывают процедуру подготовки Ahnfeltia tobuchiensis к экстракции.

На фиг.1 представлена блок-схема осуществления заявляемого способа получения из Ahnfeltia tobuchiensis агарозы.

На фиг.2 приведен вид колоний Y. pseudotuberculosis (48-часовая культура) по примеру 4:

а - выросшая на экспериментальной дифференциально-диагностической питательной среде;

б - выросшая на контрольной дифференциально-диагностической питательной среде Серова.

На фиг.3 представлен вид колоний, сформированных бактериями культуры Y. pseudotuberculosis штамм 512-Ib по примеру 5 через 48 ч:

а - выросшие на контрольной селективной среде CIN;

б - выросшие на экспериментальной питательной среде.

Заявляемый способ осуществляют на стандартном оборудовании в несколько этапов.

I. Подготовка сырья.

Слоевища (таллом) красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis очищают и промывают в водопроводной воде, далее промытые водоросли замачивают в водопроводной воде (рН 6,5±0,5) температурой 60-80°С на 1 ч при гидромодуле 1:15, периодически перемешивая.

Окись кальция при взаимодействии с водой образует щелочь - гидроксид кальция (Са(ОН)₂), реакция носит экзотермический характер, повышая температуру смеси до 100-110°С и рН смеси до 9-10.

Рекомендуемый режим наиболее приемлем, т.к. анфельция хорошо разваривается, в результате чего достигается максимальное извлечение агара, а по истечении указанного времени водорослевый остаток отделяют путем фильтрации через сито (0,25).

II. Экстракция.

Подготовленную водоросль Ahnfeltia tobuchiensis трехкратно экстрагируют 1,5%-ным водным раствором окиси кальция температурой 90-100°С, на первом этапе гидромодуль равен 1:10 или 1:15, а на последующих - 1:15, причем длительность каждого этапа экстракции составляет 1-2 ч и на каждом этапе осуществляют отделение экстрактов фильтрацией.

III. Получение агара.

Полученные экстракты смешивают, очищают центрифугированием, желируют, сформированный гель из водоросли Ahnfeltia tobuchiensis измельчают на кубики размером 3-5 см, промывают настаиванием в дистиллированной воде и высушивают путем прессования с последующей сушкой при температуре 70°С до постоянной массы.

IV. Очистка и желирование агара.

Агар заливают дистиллированной водой до его концентрации 5-10% по массе, расплавляют на водяной бане, последовательно замораживают и оттаивают до прозрачности смеси, желируют и сформированный из агара гель прессуют при давлении 50-100 Па в течение 6-8 ч.

V. Десульфатирование агара

Прессованный гель из агара заливают перекисью водорода в количестве 2% по массе и выдерживают в течение 2 ч при температуре 30°С и рН 9.

Полученную агарозу измельчают, обезвоживают прессованием на гидравлическом прессе при давлении 50-100 Па в течение 6-8 ч.

Далее полученный коагель измельчают и сушат в сублимированной вакуумной сушилке при остаточном давлении 120-130 Па.

Готовый продукт - агарозу хранят во флаконах в сухом месте для последующего применения в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред.

Примеры осуществления способа приведены в таблице 1.

Таблица 1

Примеры получения агарозы из Ahnfeltia tobuchiensis

Название параметра	Пример 1	Пример 2	Пример 3
Температура 1,5%-ного водного раствора окиси кальция	90°С	95°С	100°С
Гидромодуль и длительность экстракции: 1-ый этап 2-й этап 3-й этап	1:10; 1,5 ч 1:15; 2 ч 1:15; 1 ч	1:15; 2 ч 1:15; 1 ч 1:15; 1,5 ч	1:10; 1 ч 1:15; 1,5 ч 1:15; 2 ч
Концентрация агара по массе	5	10	8
Давление прессования геля из агара	100 Па	75 Па	50 Па
Длительность прессования геля из агара	6 ч	7 ч	8 ч
Давление прессования агарозы	50 Па	100 Па	75 Па
Длительность прессования агарозы	8 ч	6 ч	7 ч
Давление сушки коагеля из агарозы	125 Па	120 Па	130 Па

Характеристики готового продукта приведены в таблице 2.

Таблица 2

Характеристики агарозы, полученной из Ahnfeltia tobuchiensis

Характеристика готового продукта	Пример 1	Пример 2	Пример 3
Содержание сульфатов	0,28%	0,30%	0,29%
Прозрачность	87%	85%	90%

Использование агарозы в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред поясняется дополнительными примерами.

Пример 4.

По стандартной технологии приготовили экспериментальную дифференциально-диагностическую питательную среду следующего состава: глюкоза 0,5 г; мочевина 0,25 г; молибденовокислый аммоний 0,1 г; сода безводная 0,1 г; 30% водный раствор сухой желчи 2,0 мл; 1,6% водный раствор конго-рот 0,8 мл; 1% водный раствор генцианвиолета 0,1 мл; сухая агароза, полученная заявляемым способом, 3,5 г; дистиллированная вода 100,0 мл.

В качестве контроля использовали среду Серова, приготовленную традиционным способом (Серов ГД, Знаменский ВА, Вишняков АК. Дифференциальная среда для выделения микроба псевдотуберкулеза // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1968; 6:146-149).

На контрольную и экспериментальные питательные среды был посеян клинический штамм 512-Ib Yersinia pseudotuberculosis (коллекция НИИ ЭМ им. Г.П. Сомова).

После инкубации 48 ч был проведен анализ культуральных, морфологических и тинкториальных свойств выросших микроорганизмов (см. фиг.2), который показал идентичность скорости роста, характеристики колоний и выросших иерсиний.

Пример 5.

По стандартной технологии приготовили экспериментальную питательную среду следующего состава: пептон 20,0 г; дрожжевой экстракт 2,0 г; натрия хлорид 1,0 г; натрия пируват 2,0 г; магния сульфат 0,01 г; натрия дезоксихолат 0,5 г; маннит 20,0 г; нейтральный красный 0,03 г; кристаллический фиолетовый 0,001 г; сухая агароза, полученная заявляемым способом, 3,5 г; рН 7,4±0,2.

В качестве контроля использовали селективную среду CIN, приготовленную согласно инструкции фирмы-изготовителя (Yersinia Selective Agar Base, HiMedia Laboratories).

На контрольную и экспериментальные питательные среды был посеян клинический штамм 512-Ib Yersinia pseudotuberculosis (коллекция НИИ ЭМ им. Г.П. Сомова).

После инкубации 48 ч был проведен анализ культуральных, морфологических и тинкториальных свойств выросших микроорганизмов (см. фиг.3), который показал, что полученная по заявляемому способу агароза в качестве основы питательного агара для культивирования и изучения бактерий по ростовым характеристикам, морфологическим признакам колоний не уступает агару особой очистки, используемому в коммерческих отечественном и зарубежном питательных средах.

1. Способ получения из Ahnfeltia tobuchiensis агарозы, используемой в качестве основы питательных сред, включающий подготовку водоросли Ahnfeltia tobuchiensis, ее трехкратную экстракцию химическим соединением кальция, отделение экстрактов на каждом этапе, их смешивание, очистку и желирование, промывание полученного геля водой и его сушку, отличающийся тем, что в качестве химического соединения кальция используют 1,5%-ный водный раствор окиси кальция температурой 90-100°С, а длительность каждого этапа экстракции составляет 1-2 ч, полученные экстракты смешивают, очищают, желируют, сформированный гель из водоросли Ahnfeltia tobuchiensis измельчают, промывают настаиванием в дистиллированной воде и высушивают, полученный агар заливают дистиллированной водой до его концентрации 5-10 % по массе, расплавляют на водяной бане, последовательно замораживают и оттаивают, после чего желируют и сформированный из агара гель прессуют при давлении 50-100 Па в течение 6-8 ч, далее прессованный гель из агара заливают перекисью водорода в количестве 2 % по массе и выдерживают в течение 2 ч при температуре 30^оС и рН 9, после чего полученную агарозу измельчают, прессуют при давлении 50-100 Па в течение 6-8 ч, и сформированный из агарозы коагель измельчают и сушат до постоянной массы при давлении 120-130 Па.

2. Способ получения из Ahnfeltia tobuchiensis агарозы по п.1, отличающийся тем, что при подготовке Ahnfeltia tobuchiensis промытые водоросли замачивают в воде температурой 60-80°С при гидромодуле 1:15, периодически перемешивая, и через 1 ч воду сливают через сито.

3. Способ получения из Ahnfeltia tobuchiensis агарозы по п.1, отличающийся тем, что гидромодуль на первом этапе экстракции равен 1:10, а на последующих – 1:15.

4. Способ получения из Ahnfeltia tobuchiensis агарозы по п.1, отличающийся тем, что гидромодуль на всех этапах экстракции равен 1:15.

5. Способ получения из Ahnfeltia tobuchiensis агарозы по п.1, отличающийся тем, что отделение экстрактов на каждом этапе осуществляют путем фильтрации.

6. Способ получения из Ahnfeltia tobuchiensis агарозы по п.1, отличающийся тем, что смесь экстрактов очищают путем центрифугирования.

7. Способ получения из Ahnfeltia tobuchiensis агарозы по п.1, отличающийся тем, что промытый гель из водоросли Ahnfeltia tobuchiensis высушивают путем прессования с последующей сушкой при температуре 70°С до постоянной массы.

8. Способ получения из Ahnfeltia tobuchiensis агарозы по п.1, отличающийся тем, что расплавленную на водяной бане смесь агара с водой замораживают и оттаивают до тех пор, пока она не станет прозрачной.

9. Способ получения из Ahnfeltia tobuchiensis агарозы по п.1, отличающийся тем, что сформированный из агарозы коагель сушат в сублимированной вакуумной сушилке.